Άσκηση 11: Ηλεκτροφόρηση μακρομορίων Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι να γνωρίσουν οι εκπαιδευόμενοι την ηλεκτροφόρηση, μια από τις βασικότερες τεχνικές για τον διαχωρισμό και την απομόνωση νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών. Η τεχνική και στις δύο κατηγορίες ενώσεων βασίζεται στην κινητικότητα των μορίων αναλόγως του μεγέθους τους καθώς αυτά κινούνται μέσα σε πήκτωμα κι ενώ εφαρμόζεται στα άκρα του ένα ηλεκτρικό πεδίο. Στο εισαγωγικό μέρος της άσκησης παρουσιάζονται οι αρχές της ηλεκτροφόρησης και περιγράφονται οι τεχνικές της ηλεκτροφόρησης DNA και πρωτεϊνών, σε πηκτώματα αγαρόζης και πολυακρυλαμιδίου, αντίστοιχα, καθώς και ορισμένες παραλλαγές και εφαρμογές των τεχνικών αυτών. Στο πρακτικό μέρος, οι φοιτητές εκπαιδεύονται στην τεχνική της ηλεκτροφόρησης DNA σε πήκτωμα αγαρόζης, χρησιμοποιώντας διάφορα μίγματα DNA, προκειμένου να κατανοήσουν τον τρόπο με τον οποίο η μορφή των μορίων επηρεάζει την κίνησή τους και κατ επέκταση τον διαχωρισμό τους κατά την ηλεκτροφόρηση. Η άσκηση επιτρέπει στους εκπαιδευόμενους να κατανοήσουν τις φυσικές ιδιότητες (φορτίο, μέγεθος) των δύο κατηγοριών μακρομορίων (DNA, πρωτεϊνών) και τις ερευνητικές δυνατότητες που δημιουργούνται από την ικανότητα διαχωρισμού και απομόνωσης των επιμέρους συστατικών των αντιστοίχων μιγμάτων. Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010) Βιολογία (τόμος I), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: 978-960-524-306-7, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 5: Δομή και λειτουργία των μεγάλων βιολογικών μορίων και στο Κεφάλαιο 20: Βιοτεχνολογία. 1. Εισαγωγικό μέρος Πολλές από τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους για τη μελέτη των μακρομορίων περιλαμβάνουν μία τεχνική που ονομάζεται ηλεκτροφόρηση. Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης ανακαλύφθηκε το 1937 από τον Σουηδό βιοχημικό Arne Tiselius (1902-1971) και έκτοτε χρησιμοποιείται ευρύτατα για τον διαχωρισμό μακρομορίων, όπως νουκλεϊνικών οξέων και πρωτεϊνών. Η βασική ιδέα της ηλεκτροφόρησης είναι αρκετά απλή. Στηρίζεται στην αρχή της κίνησης φορτισμένων σωματιδίων κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Μέσα σε ένα ηλεκτρικό πεδίο τα φορτισμένα σωματίδια κινούνται προς τον ένα ή τον άλλο πόλο με ταχύτητες διαφορετικές, ανάλογα με το φορτίο τους και αντιστρόφως ανάλογα με το μέγεθός τους. Έτσι, τα περισσότερο φορτισμένα και μικρότερα μόρια απομακρύνονται περισσότερο από το αρχικό σημείο, ενώ τα μεγαλύτερα και λιγότερο φορτισμένα μόρια απομακρύνονται λιγότερο, οπότε επέρχεται διαχωρισμός παρόμοιος με τη χρωματογραφία (βλέπε Άσκηση 6). Ο ρυθμός μετακίνησης εξαρτάται και από διάφορους άλλους παράγοντες, όπως η διαμόρφωση του μορίου, η θερμοκρασία, το είδος του χρησιμοποιούμενου μέσου, η ιοντική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος και το μέγεθος της εφαρμοζόμενης τάσης. Κατά την ηλεκτροφόρηση διοχετεύεται ηλεκτρικό ρεύμα μέσω ηλεκτροδίων σε ένα μέσο (πήκτωμα ή χαρτί), πάνω στο οποίο έχει τοποθετηθεί σε ένα σημείο το προς ανάλυση δείγμα. Σε μια τέτοια διάταξη τα θετικά φορτισμένα ιόντα (κατιόντα) θα προχωρήσουν προς τον αρνητικό πόλο (κάθοδο), ενώ τα αρνητικά φορτισμένα ιόντα (ανιόντα) προς τον θετικό πόλο (άνοδο). Στον πιο διαδεδομένο τύπο ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται ένα πήκτωμα (gel) αποτελούμενο από κάποιο πολυμερές, π.χ. έναν πολυσακχαρίτη (αγαρόζη, άμυλο ή πολυακρυλαμίδιο). Το πήκτωμα λειτουργεί ως ένας μοριακός ηθμός ο οποίος διαχωρίζει νουκλεϊκά οξέα και πρωτεΐνες με βάση το μέγεθος, το ηλεκτρικό φορτίο και άλλες φυσικές ιδιότητες των μορίων. Κατά τον διαχωρισμό τους τα μακρομόρια διατάσσονται υπό μορφή ζωνών μέσα στο πήκτωμα, γι αυτό και η τεχνική συχνά αναφέρεται ως ηλεκτροφόρηση ζώνης σε πήκτωμα. Σε έναν άλλο τύπο ηλεκτροφόρησης, τα μακρομόρια διαχωρίζονται με βάση την ίδια σχέση, η όλη διαδικασία όμως γίνεται σε αδρανή υλικά, όπως χαρτί ή οξική κυτταρίνη (ηλεκτροφόρηση ζώνης σε χαρτί). Η ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται ευρέως στο κλινικό εργαστήριο και αποτελεί πολύτιμο διαγνωστικό εργαλείο στις βιοιατρικές επιστήμες. Για παράδειγμα, μετά από ηλεκτροφόρηση DNA μπορεί να εξακριβωθεί η γενετική ταυτότητα ενός οργανισμού, ενώ η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του ορού στον άνθρωπο - 137 -
χρησιμεύει στην ανίχνευση πρωτεϊνών παθολογικής προέλευσης και στη διάγνωση διαφόρων ασθενειών, όπως του νεφρωσικού συνδρόμου, της ηπατοκυτταρικής νόσου κ.α. 1.1. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού, χαρακτηρισμού και απομόνωσης τμημάτων DNA και αυτό γιατί είναι απλή, γρήγορη στην εφαρμογή και αρκετά ευαίσθητη. Τα νουκλεϊκά οξέα κινούνται στο πήκτωμα αγαρόζης υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Συγκεκριμένα, όταν το πήκτωμα βρίσκεται σε ηλεκτρικό πεδίο τα νουκλεϊκά οξέα, τα οποία είναι φορτισμένα αρνητικά σε ουδέτερο ph λόγω των φωσφορικών ομάδων που βρίσκονται στον φωσφοδιεστερικό σκελετό, κινούνται προς την άνοδο με ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το μέγεθός τους (τα μόρια μικρότερου μήκους κινούνται ταχύτερα από τα μόρια μεγαλύτερου μήκους) (Εικ. 11.1). Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός μορίων μεγέθους 100bp 50Kb, ακόμη και μορίων που διαφέρουν μεταξύ τους ως προς 50bp. Η συγκέντρωση της αγαρόζης καθορίζει το μέγεθος των πόρων που σχηματίζονται στο πήκτωμα, άρα και το μέγεθος των κομματιών DNA που μπορούν να διαχωριστούν κινούμενα μέσα από αυτούς. Για τον διαχωρισμό πάντως τμημάτων DNA με διαφορά μεγέθους μερικών βάσεων προτιμάται η χρήση πηκτωμάτων πολυακρυλαμίδης, καθώς σ αυτά επιτυγχάνεται η δημιουργία πόρων με μικρότερο μέγεθος. Το DNA απομονώνεται από έναν οργανισμό ή ιστό, κόβεται σε κομμάτια με ένα ή συνδυασμό περισσότερων ενζύμων (ενδονουκλεάσες περιορισμού) και το μείγμα των κομματιών (θραυσμάτων) αυτών τοποθετείται σε ένα πήκτωμα αγαρόζης, στα άκρα του οποίου εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο. Καθώς μετακινούνται, τα διαφορετικά μόρια DNA σχηματίζουν χαρακτηριστικές ζώνες σε διαφορετικές περιοχές του πηκτώματος, ανάλογα με την ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA (Εικ. 11.1). Δηλαδή, με την ηλεκτροφόρηση επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός ενός μίγματος γραμμικών μορίων DNA σε ζώνες, κάθε μια από τις οποίες περιέχει ισομήκη μόρια DNA. Οι ζώνες δεν είναι ορατές κατά την πορεία της ηλεκτροφόρησης, γίνονται όμως ορατές με προσθήκη στο πήκτωμα μιας χρωστικής που δεσμεύεται στο DNA (βρωμιούχο αιθίδιο) και φθορίζει όταν εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) (Εικ. 11.2). Εικόνα 11.1 Διαδραστική απεικόνιση του ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού γραμμικών μορίων DNA. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιείται και για τον ποσοτικό προσδιορισμό δειγμάτων DNA σε σχέση με κάποιον ποσοτικοποιημένο μάρτυρα (ο οποίος περιέχει κομμάτια DNA γνωστού μεγέθους και συγκέντρωσης), για τον προσδιορισμό της καθαρότητας και της ποιότητας του DNA και για τη σύγκριση ποσοτήτων δειγμάτων DNA ή RNA μεταξύ τους. Η ποσοτικοποίηση στηρίζεται στην οπτική εκτίμηση του φθορισμού που παράγεται από τα μόρια του βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) υπό υπεριώδες φως. Το EtBr ενσωματώνεται στα μόρια των νουκλεϊκών οξέων σε ποσότητα ανάλογη της συγκέντρωσής τους. Έτσι, μέσω της σύγκρισης του φθορισμού που εκπέμπεται από το άγνωστο δείγμα με τον φθορισμό που εκπέμπει το δείγμα γνωστής συγκέντρωσης και μεγέθους (σύγκριση της έντασης της ζώνης του υπό εξέταση μορίου DNA σε σχέση με την ένταση των ζωνών του DNA αναφοράς), επιτυγχάνεται η ποσοτικοποίηση του άγνωστου δείγματος. - 138 -
Επιπλέον, τα μόρια του DNA είναι δυνατόν να απομονωθούν ανέπαφα από το πήκτωμα και επομένως, η ηλεκτροφόρηση ενός μείγματος θραυσμάτων DNA αποτελεί παράλληλα και έναν τρόπο παρασκευής μεμονωμένων θραυσμάτων υψηλής καθαρότητας, υπό την προϋπόθεση βέβαια ότι οι ζώνες διαχωρίζονται στο πήκτωμα επαρκώς η μία από την άλλη. Όταν τα αρχικά μόρια DNA έχουν πολύ μεγάλο μέγεθος, όπως π.χ. συμβαίνει όταν αναλύονται δείγματα γονιδιωματικού DNA, τότε τα θραύσματα που παράγονται από την επεξεργασία με περιοριστικές ενδονουκλεάσες (βλέπε παρακάτω) είναι πάρα πολλά, οπότε δεν σχηματίζονται ευδιάκριτες ζώνες κατά την ηλεκτροφόρησή τους, αλλά ένα μεγάλο συνεχές ίχνος. Εικόνα 11.2 Μετά από έκθεση του πηκτώματος σε UV, το EtBr που είναι δεσμευμένο στο DNA παράγει ένα ροζ φθορίζον χρώμα, αποκαλύπτοντας τις χαρακτηριστικές ζώνες που σχηματίζουν τα γραμμικά μόρια DNA κατά την ηλεκτροφόρηση. Όπως προκύπτει και από τα παραπάνω, μία εφαρμογή της ηλεκτροφόρησης είναι η ανάλυση των θραυσμάτων περιορισμού ενός μορίου DNA, χάρη στη οποία μπορούμε να αποκτήσουμε χρήσιμες πληροφορίες για το συγκεκριμένο μόριο. Κατά την ανάλυση αυτή, το μόριο DNA υφίσταται αρχικά επεξεργασία με ενδονουκλεάσες περιορισμού, δηλαδή ένζυμα που αναγνωρίζουν και πέπτουν (κόβουν) το δίκλωνο μόριο DNA σε ειδικές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού μπορούν να θεωρηθούν σαν «μοριακά ψαλίδια» που ψαλιδίζουν το DNA σε συγκεκριμένες θέσεις του μορίου. Τα θραύσματα που προκύπτουν από τον τεμαχισμό του αρχικού μορίου DNA (θραύσματα περιορισμού) διαχωρίζονται στη συνέχεια με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Όταν ηλεκτροφορείται μείγμα θραυσμάτων περιορισμού, το πρότυπο ζωνών που προκύπτει είναι χαρακτηριστικό για το συγκεκριμένο μόριο DNA και για το συγκεκριμένο περιοριστικό ένζυμο. Το γεγονός αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο όταν θέλουμε να συγκρίνουμε διαφορετικά μόρια DNA, λόγου χάρη δύο αλληλόμορφα ενός γονιδίου. Κάθε ενδονουκλεάση περιορισμού αναγνωρίζει μία συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων (που ονομάζεται αλληλουχία αναγνώρισης) και αλλαγές στην αλληλουχία αυτή, ακόμη και ενός μόνο ζεύγους βάσεων, θα είχαν ως αποτέλεσμα το ένζυμο να μην κόβει στη συγκεκριμένη θέση. Επομένως, αν οι νουκλεοτιδικές διαφορές δύο αλληλομόρφων εντοπίζονται στην αλληλουχία αναγνώρισης ενός περιοριστικού ενζύμου, τότε από την πέψη του DNA με το αντίστοιχο περιοριστικό ένζυμο θα προκύψουν δύο διαφορετικά μείγματα θραυσμάτων DNA, ένα για κάθε αλληλόμορφο, που ηλεκτροφορούμενα σε πήκτωμα θα εμφανίσουν δύο διαφορετικά πρότυπα ζώνωσης (βλέπε Εικόνα 11.7). Η ανάλυση των θραυσμάτων περιορισμού ενός μορίου DNA συνήθως συνδυάζεται με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR) που χρησιμοποιείται για να πολλαπλασιαστεί με ακρίβεια ένα συγκεκριμένο τμήμα - αλληλουχία στόχος - ενός δείγματος DNA (π.χ. τμήμα ενός γονιδίου). Η PCR είναι μία in vitro μέθοδος πολλαπλασιασμού μιας αλληλουχίας DNA μέσω ενζυμικής αναπαραγωγής του DNA χωρίς τη χρήση ζωντανών μικροοργανισμών. Ο πολλαπλασιασμός του DNA είναι απαραίτητος, αφού για να γίνει ανάλυση των μεταλλάξεων ή των πολυμορφισμών σε μοριακό επίπεδο είναι απαραίτητες αρκετά μεγάλες ποσότητες του DNA. Απομονωμένα τμήματα DNA θα ήταν αδύνατο να μελετηθούν επαρκώς χωρίς τη μέθοδο της PCR. Με την PCR μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέχρι και δισεκατομμύρια φορές, δεδομένου ότι είναι γνωστή η νουκλεοτιδική της αλληλουχία. Επομένως, με την εφαρμογή της PCR και της ανάλυσης των θραυσμάτων περιορισμού γίνεται δυνατή η «γενετική ταυτοποίηση», η ταυτοποίηση δηλαδή τμημάτων του DNA που περιέχονται σε κάθε έμβιο ον. Έτσι, από τη μοναδικότητα που παρέχει το DNA για κάθε άνθρωπο, μπορεί να εξακριβωθεί η ταυτότητά του. - 139 -
1.2. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Τα πηκτώματα που χρησιμοποιούνται ευρύτατα σήμερα για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών είναι τα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου, μιας και παρέχουν καλύτερα αποτελέσματα σε σύγκριση με την αγαρόζη. Η χρήση πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου ενδείκνυται πάντως και στην περίπτωση διαχωρισμού και απομόνωσης τμημάτων DNA μικρού μήκους ή RNA. Το πήκτωμα σχηματίζεται με πολυμερισμό μονομερούς ακρυλαμιδίου, που οδηγεί στον σχηματισμό μακριών αλυσίδων πολυακρυλαμιδίου που ενώνονται μεταξύ τους με μόρια Ν,Ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδης (bis). Ο πολυμερισμός επιτυγχάνεται με τη βοήθεια δύο πολυμεριστικών παραγόντων: του υπερθειϊκού αμμωνίου (ammonium persulfate, APS) και του TEMED (N,N,N,N -τετραμεθυλο-1,2-διαμινοαιθάνιο), το οποίο καταλύει τον σχηματισμό ελεύθερων ριζών από το APS. Έτσι, σχηματίζεται ένα πλέγμα με μέγεθος πόρων που κυμαίνεται αφενός ανάλογα με την ολική συγκέντρωση ακρυλαμιδίου και bis και, αφετέρου, ανάλογα με τη σχετική συγκέντρωση του bis ως προς το ακρυλαμίδιο. Γενικά, πηκτώματα με μικρή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου είναι μαλακά και επειδή έχουν μεγαλύτερους πόρους χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό μακρομορίων μεγάλου μοριακού βάρους. Πηκτώματα με συγκέντρωση μεγαλύτερη από 12% είναι σκληρότερα και περισσότερο εύθραυστα, έχουν μικρούς πόρους και χρησιμοποιούνται για διαχωρισμό ουσιών μικρού σχετικά μοριακού βάρους. Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός γίνεται κυρίως με βάση διαφορές στο φορτίο (ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικής εστίασης), στη μάζα ή σε διάφορες άλλες φυσικές ιδιότητες των μορίων. Πολύ συχνά τα μακρομόρια αποδιατάσσονται πριν την ηλεκτροφόρηση, αλλά και κατά την ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιούνται αποδιατακτικοί παράγοντες. Τέτοιοι αποδιατακτικοί παράγοντες είναι για τις πρωτεΐνες το δωδεκυλοθειικό νάτριο (sodium dodecyl sulfate, SDS) και για τα νουκλεϊκά οξέα το φορμαμίδιο. Το SDS είναι ένα ανιονικό απορρυπαντικό που αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες ξεδιπλώνοντας πλήρως κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο πολυπεπτιδικής αλυσίδας-sds που είναι φορτισμένο αρνητικά. Η αποδιάταξη ολοκληρώνεται με θέρμανση και προσθήκη μερκαπτοαιθανόλης ή διθειοθρεϊτόλης, που ανάγουν τους δισουλφιδικούς δεσμούς οι οποίοι αναπτύσσονται ανάμεσα σε δύο ομάδες -SH κυστεϊνών της ίδιας ή δύο διαφορετικών πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Τα σύμπλοκα SDS-αποδιαταγμένης πρωτεΐνης ηλεκτροφορούνται με κατεύθυνση από την κάθοδο προς την άνοδο (Εικ. 11.3). Σε μία τυπική ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται κυρίως με βάση τη μάζα τους. Πρωτεΐνες που αποτελούνται από περισσότερες από μία πολυπεπτιδικές αλυσίδες διαχωρίζονται με το SDS στις υπομονάδες τους και με την ηλεκτροφόρηση μπορεί να προσδιοριστεί το μοριακό βάρος της κάθε μίας. Εικόνα 11.3 Αποδιάταξη πρωτεϊνών (αριστερά) και SDS- ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (δεξιά). - 140 -
Η ηλεκτροφόρηση γίνεται είτε σε μικρά κυλινδρικά σωληνάκια (σε περιπτώσεις ισοηλεκτρικής εστίασης) είτε σε επίπεδη επιφάνεια. Τα δείγματα των πρωτεϊνών «φορτώνονται» είτε στην επιφάνεια των σωλήνων, είτε στα πηγάδια που δημιουργούνται σε πήκτωμα επίπεδης ηλεκτροφόρησης με τη βοήθεια ειδικής χτένας που τοποθετείται όσο το πήκτωμα δεν έχει ακόμη στερεοποιηθεί. Η επίπεδη ηλεκτροφόρηση έχει το πλεονέκτημα ότι όλα τα δείγματα διαχωρίζονται στο ίδιο πήκτωμα, συνεπώς στις ίδιες συνθήκες συγκέντρωσης ακρυλαμιδίου, θερμοκρασίας κ.λπ., κι έτσι είναι περισσότερο αξιόπιστη η ποιοτική και ποσοτική σύγκριση των ζωνών μεταξύ τους. Μία παραλλαγή αυτού του τύπου ηλεκτροφόρησης είναι η ασυνεχής ηλεκτροφόρηση, όπου το πήκτωμα αποτελείται από δύο μέρη που διαφέρουν ως προς το μέγεθος των πόρων, έχουν ρυθμιστεί σε διαφορετικά ph και όπου διαφέρουν τα ρυθμιστικά διαλύματα του πηκτώματος και των ηλεκτροδίων. Το μίγμα που πρόκειται να διαχωριστεί μετακινείται από ένα πήκτωμα με μεγάλους πόρους (πήκτωμα «πακεταρίσματος») σε ένα πήκτωμα με μικρότερους πόρους που ακολουθεί (πήκτωμα διαχωρισμού) (Εικ. 11.4). Το πήκτωμα πακεταρίσματος δεν διαχωρίζει τις πρωτεΐνες αλλά μάλλον τις «συμπυκνώνει» σε μία μικρή ζώνη, γεγονός που εξασφαλίζει ότι οι πρωτεΐνες κάθε δείγματος θα φθάσουν ταυτόχρονα στο κυρίως πήκτωμα διαχωρισμού. Κάτω από την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου, οι πρωτεΐνες μετακινούνται μέσα από τους πόρους του πηκτώματος διαχωρισμού σε απόσταση αντιστρόφως ανάλογη με τη μάζα τους. Οι μικρές πρωτεΐνες μετακινούνται εύκολα διαμέσου του πηκτώματος, ενώ οι μεγάλες μένουν στην κορυφή κοντά στο σημείο εκκίνησης (Εικ. 11.4). Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής διαδρομής, οι πρωτεΐνες στο πήκτωμα εμφανίζονται με χρώση κυανού του Coomassie (Coomassie Brilliant Blue), χρώση αργύρου ή άλλες ειδικές χρώσεις. Εναλλακτικά, οι πρωτεΐνες μπορούν να ανιχνευτούν με ραδιενεργή σήμανση και εμφάνισή τους σε φιλμ αυτοραδιογραφίας. Η SDS-ηλεκτροφόρηση είναι γρήγορη, ευαίσθητη και έχει μεγάλη διαχωριστική (αναλυτική) ικανότητα. O διαχωρισμός πρωτεϊνών σε σύστημα SDS-PAGE χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του μοριακού βάρους και της σχετικής ποσότητας πρωτεϊνικών μορίων σε ένα δείγμα, αλλά και για τον καθορισμό της κατανομής πρωτεϊνών σε διάφορα βιοχημικά εκχυλίσματα ιστών και κυττάρων. Είναι επίσης απαραίτητο βήμα για άλλες τεχνικές, όπως το ανοσοαποτύπωμα Western και η δυσδιάστατη ηλεκτροφόρηση. Ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρκής εστίασης: Πρόκειται για μία παραλλαγή της ηλεκτροφόρησης ζώνης σε πηκτώματα ακρυλαμιδίου, η οποία χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό μιγμάτων πρωτεϊνών και προηγείται του αποδιατακτικού διαχωρισμού σε δυσδιάστατες ηλεκτροφορήσεις. Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση διαφορές των πρωτεϊνών στο ισοηλεκτρικό τους σημείο, δηλαδή το σημείο εκείνο στο οποίο το άθροισμα των θετικών και αρνητικών φορτίων είναι ίσο με το μηδέν. Μια κλίση ph δημιουργείται με τη βοήθεια αμφολυτών, ουσιών μικρού μοριακού βάρους οι οποίες συμπεριφέρονται συγχρόνως ως βάσεις και ως οξέα καθώς περιέχουν τόσο όξινες όσο και βασικές ομάδες. Κάτω από την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου οι πρωτεΐνες κινούνται και εστιάζονται σε ph ίσο με το ισοηλεκτρικό τους σημείο. Εικόνα 11.4 Επίπεδη, ασυνεχής SDS-ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Διακρίνεται ο τρόπος «φόρτωσης» των δειγμάτων και η κατεύθυνση μετακίνησης των πρωτεϊνών. - 141 -
2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων 2.1.1. Συσκευές συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης, τροφοδοτικό ηλεκτροφόρησης, αναλυτικός ζυγός, φούρνος μικροκυμάτων, μικροφυγόκεντρος, τράπεζα λάμπας υπεριώδους, UV-B (312nm), αυτόματες ρυθμιζόμενες μικροπιπέτες (Ρ20, Ρ200). 2.1.2. Υλικά αγαρόζη, κωνική φιάλη των 250 ml, ογκομετρικοί κύλινδροι των 100 και 1000 ml, πλαστικά σωληνάρια των 1,5 ml, πλαστικά ρύγχη (tips) των 2-20 και 20-200 μl, χειρουργικά γάντια, προστατευτικά γυαλιά, δείγματα DNA, μάρτυρας μοριακών μεγεθών (100bp DNA ladder). 2.1.3. Διαλύματα ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 5x (τελικής συγκέντρωσης: Tris-Βorate 45mM, EDTA 1mM, ph 8,0), διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) 10 mg/ml, διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων 10x (τελικής συγκέντρωσης: 0,25% κυανό της βρωμοφαινόλης, 0,25% κυανολικό ξυλένιο, 50% γλυκερόλη), υπερκαθαρό (δισαποσταγμένο) νερό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για την παρασκευή 1 L stock διαλύματος ΤΒΕ 5x, διαλύουμε 54 g Tris-base και 27,5 g βορικού οξέος σε 900 ml αποσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, προσθέτουμε 20 ml διαλύματος EDTA 0,5M και αφού ρυθμίσουμε το ph σε 8,0 (προσθέτοντας πυκνό HCl) συμπληρώνουμε με νερό τον όγκο μέχρι τα 1000 ml. Ακολουθήσετε σχολαστικώς όλες τις οδηγίες ασφαλείας που θα σας δοθούν στο εργαστήριο. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι επικίνδυνη καρκινογόνος ουσία, γι αυτό θα πρέπει να χειρίζεστε όλα τα υλικά που περιέχουν το αντιδραστήριο αυτό με ιδιαίτερη προσοχή. Όσα υλικά (π.χ. κωνικές φιάλες) αδειάζουν ή δεν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν ξανά στο πλαίσιο της άσκησης θα τοποθετούνται σε ειδικούς χώρους που θα σας υποδειχθούν. 2.2. Πειραματική διαδικασία 2.2.1. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Στην άσκηση θα πραγματοποιήσετε ηλεκτροφόρηση δειγμάτων DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5%, τα οποία στη συνέχεια θα ανιχνεύσετε μετά από έκθεση του πηκτώματος στο υπεριώδες φως. - 142 -
Θα χρησιμοποιήσετε 5 δείγματα με διαφορετικά είδη DNA που θα σας δοθούν από τους υπεύθυνους της άσκησης (1 δείγμα γονιδιωματικού DNA μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, 2 δείγματα προϊόντων αντιδράσεων PCR και 2 δείγματα θραυσμάτων περιορισμού που προκύπτουν μετά από κατεργασία προϊόντων αντιδράσεων PCR με ενδονουκλεάσες περιορισμού). Η επιλογή των δειγμάτων γίνεται με σκοπό να κατανοήσετε τον τρόπο με τον οποίο η μορφή των μορίων επηρεάζει την κίνησή τους και κατ επέκταση τον διαχωρισμό τους κατά την ηλεκτροφόρηση. Α. Κατασκευή του πηκτώματος αγαρόζης 1. Σε μία κωνική φιάλη των 250 ml προσθέστε 1,5 g αγαρόζης και 100 ml ρυθμιστικού διαλύματος ΤΒΕ 1x. Τοποθετήστε τη φιάλη στο φούρνο μικροκυμάτων και θερμάνετε σε μέτρια προς υψηλή ισχύ έως ότου η αγαρόζη διαλυθεί πλήρως (Εικ. 11.5). ΠΡΟΣΟΧΗ: Εάν αφήσετε την αγαρόζη να βράσει υπάρχει κίνδυνος να «φουσκώσει» και να χυθεί. Εφαρμόστε επαναλαμβανόμενα μικρά διαστήματα θέρμανσης και ανάδευση μεταξύ των διαστημάτων. 2. Αφήστε για λίγο την αγαρόζη να κρυώσει (στους ~60 o C) και στη συνέχεια προσθέστε με αυτόματη ρυθμιζόμενη μικροπιπέτα 5 μl διαλύματος EtBr, ώστε η τελική του συγκέντρωση να είναι 0,5 μg/ml. Ανακινήστε προσεκτικά τη φιάλη ώστε να διαλυθεί πλήρως το EtBr στην αγαρόζη. 3. Χύστε το διάλυμα της αγαρόζης στο κατάλληλα συναρμολογημένο καλούπι (δίσκο) της συσκευής ηλεκτροφόρησης (ο τρόπος συναρμολόγησης θα σας υποδειχθεί) και αφήστε την αγαρόζη να πήξει (Εικ. 11.5). Προτού χύσετε την αγαρόζη, βεβαιωθείτε ότι ο δίσκος βρίσκεται σε οριζόντια θέση και ότι έχετε τοποθετήσει σωστά τη χτένα για τη δημιουργία των πηγαδιών, στα οποία θα «φορτώσετε» στη συνέχεια τα προς ηλεκτροφόρηση δείγματα. 4. Αφού στερεοποιηθεί η αγαρόζη, τοποθετήστε τον δίσκο με το πήκτωμα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και προσθέστε στη συσκευή διάλυμα ΤΒΕ 1x έως ότου καλυφθεί το πήκτωμα κατά ~0,5 cm. Αφαιρέστε προσεκτικά τη χτένα φροντίζοντας να παραμείνουν ανέπαφα τα πηγάδια. Εικόνα 11.5 Προετοιμασία ενός πηκτώματος αγαρόζης για ηλεκτροφόρηση DNA. - 143 -
Β. Προετοιμασία και τοποθέτηση των δειγμάτων DNA 5. Προσθέστε στα πλαστικά σωληνάρια με τα δείγματα DNA που θα ηλεκτροφορηθούν τον κατάλληλο όγκο διαλύματος φόρτωσης 10x. Αναδέψτε καλά και φυγοκεντρήστε τα δείγματα σύντομα (για 4-5 sec) σε μικροφυγόκεντρο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο όγκος του δείγματος που θα «φορτώσετε» σε κάθε πηγάδι δεν ξεπερνά τα 40 μl, οπότε αναμείξτε κάθε δείγμα DNA που σας έχει δοθεί (όγκου 10 μl) με 4 μl διαλύματος φόρτωσης 10x και συμπληρώστε μέχρι τα 40 μl με δισαποσταγμένο νερό. Το διάλυμα φόρτωσης περιέχει τις χρωστικές κυανού της βρωµοφαινόλης και κυανόλη του ξυλενίου προκειμένου η ηλεκτροφόρηση να παρακολουθείται στο ορατό φως, καθώς και 50% γλυκερόλη προκειμένου το δείγμα να «βυθίζεται» στον πυθμένα των πηγαδιών του πηκτώματος. 6. Χρησιμοποιώντας αυτόματη μικροπιπέτα, «φορτώστε» τα δείγματα που προετοιμάσετε (40 μl), καθώς και ένα δείγμα πρότυπων μοριακών μεγεθών (θα σας δοθεί), στα πηγάδια του πηκτώματος (Εικ. 11.6). Μην παραλείψετε να κρατήστε σημειώσεις για τη σειρά με την οποία έχετε τοποθετήσει τα δείγματα στα πηγάδια. Γ. Ηλεκτροφόρηση και ανίχνευση του DNA 7. Συνδέστε τη συσκευή ηλεκτορφόρησης με το τροφοδοτικό και εφαρμόστε σταθερή τάση 100 Volt για τουλάχιστον 1 ώρα (Εικ. 11.6). Βεβαιωθείτε ότι όταν κλείνει το κύκλωμα τα δείγματα DNA κινούνται με κατεύθυνση από την κάθοδο ( ) προς την άνοδο (+) περνώντας μέσα από το πήκτωμα της αγαρόζης (Εικ. 11.1). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και ως δείκτες της μετανάστευσης χρησιμεύουν οι χρωστικές κυανού της βρωµοφαινόλης και κυανόλη του ξυλενίου. 8. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, εκθέστε το πήκτωμα σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) χρησιμοποιώντας την τράπεζα λάμπας υπεριώδους. Παρατηρήστε τις ζώνες που εμφανίζονται και φωτογραφήστε το πήκτωμα (εφόσον διατίθεται το κατάλληλο σύστημα φωτογράφησης) προκειμένου να αποτυπώσετε τα αποτελέσματά σας. ΕΡΩΤΗΣΗ: Πώς διαφέρουν τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα ζωνών για τα 5 διαφορετικά δείγματα DNA που χρησιμοποιήσατε και τι συμπέρασμα μπορείτε να βγάλετε από αυτά; Εικόνα 11.6 «Φόρτωση» των δειγμάτων DNA και ηλεκτροφόρηση. 2.2.2. Μελέτη ηλεκτροφορήματος DNA και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων Στην Εικόνα 11.7 απεικονίζονται τα αποτελέσματα δύο διαφορετικών ηλεκτροφορήσεων (Α και Β) μετά από έκθεση των πηκτωμάτων αγαρόζης στο υπεριώδες φως και φωτογράφησή τους: - 144 -
στο ηλεκτροφόρημα αριστερά (Α) βλέπετε την ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% των προϊόντων της αντίδρασης PCR και των θραυσμάτων περιορισμού ενός γενετικού πολυμορφισμού στον άνθρωπο (πολυμορφισμός LMNA 1908C/T) και στο ηλεκτροφόρημα δεξιά (Β), την ανάλυση σε πήκτωμα 4% αγαρόζης των προϊόντων PCR και των θραυσμάτων περιορισμού ενός άλλου γενετικού πολυμορφισμού στον άνθρωπο (MC3R 241G/A). Εικόνα 11.7 Ανάλυση προϊόντων PCR και θραυσμάτων περιορισμού σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% (Α) και 4% (Β) για τους πολυμορφισμούς LMNA 1908C/T και MC3R 241G/A, αντίστοιχα. Το πρώτο πηγάδι κάθε πηκτώματος (θέση 1) φέρει μάρτυρα μοριακών μεγεθών, ο οποίος αποτελείται από μείγμα κομματιών DNA γνωστού μεγέθους (100bp DNA ladder). Παρατηρήστε προσεκτικά τα δύο ηλεκτροφορήματα και απαντήστε στις παρακάτω ερωτήσεις: 1. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα του μάρτυρα μοριακών μεγεθών στη θέση 1, εκτιμήστε το μέγεθος σε bp όλων των έντονων ζωνών DNA στα δύο ηλεκτροφορήματα. 2. Το ηλεκτροφορητικό πρότυπο ζωνών του μάρτυρα μοριακών μεγεθών (100bp DNA ladder) στη θέση 1 διαφέρει σημαντικά στις δύο ηλεκτροφορήσεις. Γιατί συμβαίνει αυτό; Ποιοι άλλοι παράγοντες θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανάλυση των ζωνών ενός δείγματος DNA σε μία ηλεκτροφόρηση; 3. Ανιχνεύεται DNA σε όλα τα δείγματα; Τι συμπέρασμα μπορείτε να βγάλετε αναφορικά με την ποσότητα του DNA στη θέση 6, συγκριτικά μ αυτή στις άλλες θέσεις της ηλεκτροφόρησης Α; Εξηγήστε. 4. Τα δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν στις παραπάνω αναλύσεις, καθώς και αυτά που αναλύσατε εσείς, είχαν λόγο OD 260 /OD 280 ~1,80, ήταν δηλαδή απαλλαγμένα από ανεπιθύμητες προσμίξεις, όπως - 145 -
RNA και πρωτεΐνες (βλέπε Άσκηση 10). Πως πιστεύετε ότι θα επηρεαζόταν η μεταναστευτικότητα των μορίων του DNA στο πήκτωμα της αγαρόζης αν τα δείγματα ήταν λιγότερο «καθαρά»; 5. Δεδομένου ότι η μετακίνηση των δειγμάτων έγινε κατά τη φορά που δείχνει το βέλος, τι θα συνέβαινε εάν οι πόλοι της συσκευής ηλεκτροφόρησης είχαν συνδεθεί ανάποδα; 2.3. Παρατηρήσεις Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία (τόμος I). Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο Κρήτης. ISBN: 978-960-524-306-7, - 146 -