Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας

Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας

Απομόνωση και καλλιέργεια κυττάρων Χρήσιμες για περιπτώσεις στις οποίες τα κύτταρα δεν μπορούν να μελετηθούν στα πλαίσια του οργανισμού Τεχνικές απομόνωσης Τεχνικές καλλιέργειας

Fluorescence-activated cell sorting FACS https://www.youtube.com/watch?v=eixkrhxfz0a https://www.youtube.com/watch?v=ponw3i0qq1m https://www.youtube.com/watch?v=nafl4fxju1s

Fluorescence-activated Cell sorter, FACS

Δυσκολίες στην καλλιέργεια Τα περισσότερα είδη ανθρώπινων κυττάρων, αν καλλιεργηθούν εμφανίζουν κάποιες από τις ιδιότητες τους (μυϊκά-> ίνες, νευρικά-> νευράξονες, συνδετικού ιστού-> κολλαγόνο, κλπ) Παρ όλα αυτά, οι καλλιέργειες δεν διατηρούνται για πολλές γενιές (25-40)

Συνέχεια Στα περισσότερα κύτταρα δεν εκφράζεται το γονίδιο της τελομεράσης Σε διαδοχικές διαιρέσεις τα άκρα των χρωμοσωμάτων δεν αναπαράγονται με ακρίβεια Μετά από κάποιους κύκλους διαιρέσεων χάνονται κρίσιμες περιοχές και τα κύτταρα πεθαίνουν

Ποια είναι η λύση? Να βρεθεί τρόπος να φτιαχτούν κυτταρικές σειρές με τα επιθυμητά χαρακτηριστικά οι οποίες να μπορούν να διαιρούνται επ άπειρον (να έχουν τελομεράση) Τα κύτταρα αυτά λέγονται «αθανατοποιημένα» και μπορεί να προέρχονται από καρκινικές σειρές ή από αρχέγονα εμβρυϊκά κύτταρα

Κυτταρικές σειρές ανθρώπινων εμβρυικών αρχέγονων στελεχιαίων κυτταρων Embryonic stem cell lines, ES cells

Embryonic Stem Cell Lines Συλλέγονται από καλλιέργεια πρώιμων εμβρυϊκών κυττάρων Διαιρούνται συνέχεια Είναι αδιαφοροποίητα Με κατάλληλες συνθήκες μπορούν να διαφοροποιηθούν και να αποδώσουν κύτταρα από οποιονδήποτε ιστό

Human Embryonic Stem Cell Colony Stainier Lab

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA ή τεχνικές γενετικής ανάλυσης 1. Περιοριστικά ένζυμα (ενδονουκλεάσες) 2. Δημιουργία ανασυνδυασμένων τμημάτων 3. Συμπληρωματικό DNA (cdna) 4. Κλωνοποιηση γονιδίου-δημιουργία cdna βιβλιοθήκης 5. Γονιδιωματικές βιβλιοθήκες 6. Μοριακός υβριδισμός 7. Αποτύπωση κατά Southern 8. Αποτύπωση κατά Northern 9. Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR 10. Προσδιορισμός αλληλουχίας DNA 11. Ανίχνευση πολυμορφισμών 12. Ανίχνευση άγνωστων μεταλλάξεων Πήκτωμα αγαρόζης, στο οποίο έχουν διαχωριστεί με ηλεκτρο- φόριση τμήματα DNA, ενώ εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία. 16

1. Περιοριστικά ένζυμα (ενδονουκλεάσες) 2. Δημιουργία ανασυνδυασμένων τμημάτων 3. Συμπληρωματικό DNA (cdna) 4. Κλωνοποίηση γονιδίου 5. Γονιδιωματικές βιβλιοθήκες 6. Μοριακός υβριδισμός 7. Αποτύπωση κατά Southern 8. Αποτύπωση κατά Northern 9. Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR 10. Προσδιορισμός αλληλουχίας DNA 11.Ανίχνευση πολυμορφισμών 12. Ανίχνευση άγνωστων μεταλλάξεων 17

Φυγοκέντριση σε διαβάθμιση σουκρόζης

Διαχωρισμός μονόκλωνου DNA με φυγοκέντριση ισορροπίας σε διαβάθμιση πυκνότητας χλωριούχου καισίου Η παρουσία μονόκλωνου DNA παρασκευασμένου από βακτήρια τα οποία έχουν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό μέσο που περιέχει [ 14 N]NH 4 Cl ή [ 15 N]NH 4 Cl υποδεικνύεται με την ένδειξη 14 Ν ή 15 Ν αντίστοιχα.

Ηλεκτροφόρηση DNA Τα πηκτώματα αγαρόζης, αποτελούν το πλέον κλασσικό και απλό μέσο ηλεκτροφόρησης των νουκλεϊκών οξέων. Η ηλεκτροφόρηση διαχωρίζει τμήματα DNA σύμφωνα με το σχετικό μέγεθός τους. Τα τμήματα DNA «φορτώνονται» σε ένα πήκτωμα αγαρόζης, το οποίο τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης που περιέχει αγώγιμο υγρό ρυθμιστικό διάλυμα. Μεταξύ των ηλεκτροδίων σε κάθε άκρη της συσκευής διέρχεται ηλεκτρικό ρεύμα. Επειδή το DNA είναι πολυανιόν, όταν βρεθεί υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου κινείται προς τον θετικό πόλο. Στην πηκτή υπάρχει μια σειρά από οπές ή πηγαδάκια δειγμάτων και εκεί φορτώνεται το DNA. Η ταξινόμηση των θραυσμάτων διαφορετικού μεγέθους λαμβάνει χώρα σε μια πηκτή αγαρόζης. Η αγαρόζης είναι αμυλούχο συστατικό και προέρχεται από άλγη (φύκια). Μέσα στο πήκτωμα τα μακρά μόρια αμύλου σχηματίζουν μια τρισδιάστατη δομή πλέγματος με μικρούς πόρους τοποθετημένους τυχαία σε όλη τη γέλη. Μέσω αυτών των πόρων θα μεταναστεύσουν τα μόρια του DNA. Τα μικρότερα μόρια θα οδεύουν γρηγορότερα, μια και υπάρχει λιγότερη τριβή στο μόριο καθώς κινείται προς το θετικό πόλο. Τα μεγαλύτερα μόρια θα υστερούν, δεδομένου ότι δεν θα περάσουν μέσα από τους πόρους τόσο εύκολα. Έτσι το πήκτωμα αγαρόζης λειτουργεί ως μοριακό κόσκινο μέσω του οποίου τα μικρότερα τμήματα DNA μπορούν να κινηθούν ευκολότερα ενώ τα μεγαλύτερα δυσκολότερα. Κατά τη διάρκεια μιας χρονικής περιόδου, τα μικρότερα τμήματα θα κινηθούν μακρύτερα από τα μεγαλύτερα. Τα τμήματα ίδιου μεγέθους θα μείνουν μαζί και θα μεταναστεύουν ως ενιαίες ζώνες (μπάντες) DNA. Αξιοσημείωτο είναι ότι η ταχύτητα με τη οποία τα μόρια του DNA κινούνται προς την κάθοδο είναι αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθος τους και ευθέως ανάλογη με τον βαθμό υπερελίκωσής τους.

Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (α) Σε μια συσκευή ηλεκτροφόρησης όπως αυτή που παρουσιάζεται εδώ είναι δυνατόν να αναλυθούν πολλά δείγματα ταυτόχρονα. Ανάμεσα σε δύο γυάλινες πλάκες τοποθετείται ένα διάλυμα πολυακρυλαμίδης ή αγαρόζης σε υγρή μορφή το οποίο πήζει μέσα σε λίγη ώρα. Όσο ακόμα το διάλυμα βρίσκεται σε υγρή μορφή, στο πάνω μέρος τοποθετείται ένα χτενάκι. Μόλις το διάλυμα πήξει, το χτενάκι αφαιρείται και στις θέσεις όπου βρίσκονταν τα μικρά δόντια του δημιουργούνται πηγαδάκια στα οποία φορτώνονται τα δείγματα. Κατόπιν, η συσκευή συνδέεται με ένα τροφοδοτικό, οπότε τα αρνητικά φορτισμένα νουκλεϊκά οξέα ξεκινούν να μετακινούνται προς την άνοδο διερχόμενα από τους πόρους του πηκτώματος. Όταν η ηλεκτροφόρηση ολοκληρωθεί, αφαιρούνται οι γυάλινες πλάκες και το πήκτωμα εμβαπτίζεται σε ένα διάλυμα που περιέχει κάποια ουσία η οποία προσδένεται στο DNA και το καθιστά ορατό, λόγω της ιδιότητάς της να φθορίζει όταν διεγείρεται από ακτινοβολία κατάλληλου μήκους κύματος.

Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (β) Τα κομμάτια DNA που περιέχει κάθε δείγμα έχουν διαχωριστεί με βάση το μοριακό τους βάρος και εμφανίζονται με τη μορφή διακριτών ζωνών. Η λωρίδα στην οποία κινούνται τα μόρια ενός δείγματος καθώς μεταναστεύουν ονομάζεται «διαδρομή». Επομένως το πήκτωμα που απεικονίζεται εδώ έχει επτά διαδρομές. Σ.τ.Ε.: Στο διάλυμα της πολυακρυλαμίδης, προκειμένου να πήξει, προστίθεται μια χημική ουσία που επάγει τον πολυμερισμό της. Η αγαρόζη διαλύεται με θέρμανση και πήζει όταν κρυώσει και φτάσει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Αν και παλαιότερα χρησιμοποιούνταν κάθετα πηκτώματα αγαρόζης, όπως αυτό που παρουσιάζεται στην εικόνα, σήμερα τα τυπικά πηκτώματα αγαρόζης παρασκευάζονται σε οριζόντια εκμαγεία από πλεξιγκλάς και ηλεκτροφορούνται τοποθετημένα οριζόντια σε κατάλληλες συσκευές, χωρίς να χρειάζεται να στηρίζονται ανάμεσα σε δύο γυάλινες πλάκες.

Το βρωμιούχο αιθίδιο Ο δακτύλιος φενανθριδίνης (κόκκινο χρώμα) του βρομιούχου αιθιδίου παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του DNA. Όταν το δεσμευμένο στο DNA βρομιούχο αιθίδιο εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία, εκπέμπει φως στην περιοχή του πορτοκαλοκόκκινου (μήκος κύματος 590 nm). Έτσι τα μόρια του DNA καθίστανται ορατά.

Πήκτωμα αγαρόζης στο οποίο έχει ηλεκτροφορηθεί το γονιδίωμα του ιού SV40 (Simian Virus 40, ιός του πιθήκου 40) που βρίσκεται στη μορφή ομοιοπολικά κλειστού κυκλικού μορίου DNA. Τα δείγματα έχουν φορτωθεί στο πάνω μέρος του πηκτώματος. Η χαμηλότερη ζώνη της διαδρομής 1 περιέχει αρνητικά υπερελικωμένα μόρια DNA. Στις διαδρομές 2 και 3 έχει αναλυθεί το ίδιο δείγμα μετά από επεξεργασία, για 5 και 30 λεπτά αντίστοιχα, με μία τοποϊσομεράση τύπου Ι η οποία κόβει σε ένα σημείο τη μία αλυσίδα του DNA και μειώνει βαθμιαία τον βαθμό της υπερελίκωσής του.

Προσδιορισμός του μεγέθους τμημάτων DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (α) Μαζί με το δείγμα (δεξιά διαδρομή) ηλεκτροφορείται και ένας μάρτυρας μοριακού βάρους που περιέχει γνωστού μεγέθους τμήματα DNA (αριστερή διαδρομή). (β) Κατασκευάζεται μια γραφική παράσταση της απόστασης που διάνυσαν σε cm τα γνωστού μεγέθους τμήματα DNA σε σχέση με τον λογάριθμο του αριθμού των ζευγών βάσεων που τα αποτελούν. Τα σημεία που υποδεικνύονται με μαύρα τετράγωνα αφορούν τις ζώνες του μάρτυρα μοριακού βάρους, ενώ το σημείο που υποδεικνύεται με έναν πράσινο κύκλο αφορά την άγνωστου μεγέθους ζώνη του DNA δείγματος.

1. Περιοριστικά ένζυμα (ενδονουκλεάσες) 28

Κατασκευή ενός περιοριστικού χάρτη (α) Αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης πέψεων ενός γραμμικού μορίου DNA μεγέθους 6.000 bp με τα ένζυμα που υποδεικνύονται σε κάθε περίπτωση. (β) Ο περιοριστικός χάρτης του μορίου όπως προκύπτει από την ανάλυση των αποτελεσμάτων των τριών πέψεων.

2. Δημιουργία ανασυνδυασμένων τμημάτων και φορείς κλωνοποίησης Ο φορέας κλωνοποίησης μπορεί να είναι Βακτηριακά πλασμίδια Βακτηριοφάγοι Ρετροϊοί Τεχνητά χρωμοσώματα ζυμομύκητα (YACs) 31

3. Συμπληρωματικό DNA (cdna) Σύνθεση δίκλωνου cdna από πολυαδενυλιωμένο mrna με τη χρήση της αντίστροφης μεταγραφάσης, της RNάσης Η, της DNA πολυμεράσης Ι και της DNA λιγάσης. 32

4. Κλωνοποίηση γονιδίου Κλωνοποίηση cdna με τη χρήση συνδετών BamHI. 33

Παράδειγμα κλωνοποίησης Ένα περιοριστικό κομμάτι DNA που μπορεί να προέρχεται από οποιονδήποτε οργανισμό ενσωματώνεται σε κάποιον πλασμιδιακό φορέα που έχει κοπεί με το ίδιο ένζυμο. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο που σχηματίζεται χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό δεκτικών βακτηρίων. Μέσα στα βακτηριακά κύτταρα το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο αντιγράφεται και μεταβιβάζεται στους απογόνους τους. Το βακτηριακό χρωμόσωμα είναι περίπου 1.000 φορές μεγαλύτερο από το πλασμίδιο και δεν είναι σχεδιασμένο στην ίδια κλίμακα με αυτό.

5. Γονιδιωματικές βιβλιοθήκες Παραγωγή τμημάτων DNA κατάλληλου μεγέθους για την κατασκευή μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης, μέσω μερικής πέψης με ένζυμο περιορισμού. 35

6. Μοριακός υβριδισμός Υβριδισμός είναι η ικανότητα ενός μονόκλωνου DNA ή RNA να ενώνεται με μια συμπληρωματική μονόκλωνη αλληλουχία, ενώ δεν ενώνεται με μια άσχετη Ο ανιχνευτής DNA (probe) είναι συνήθως σημασμένος (με ραδιοϊσότοπο ή φθορίζουσα ουσία) 36

ΕΙΚΟΝΑ 4.12 Σήμανση του 5 άκρου ενός μορίου DNA με [ 32 P]

7. Αποτύπωση κατά Southern Ανάλυση κατά Southern γονιδιωματικού DNA με σκοπό τον εντοπισμό αλληλουχιών συμπληρωματικών προς ένα σημασμένο ιχνηθέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο cdna). Συσκευή ηλεκτροφόρησης πηκτώματος αγαρόζης (δεξιά) και τροφοδοτικό (αριστερά). 38

Ανάλυση κατά Southern γονιδιωματικού DNA με σκοπό τον εντοπισμό αλληλουχιών συμπληρωματικών προς ένα σημασμένο ιχνηθέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο cdna). Σε αυτό το θεωρητικό παράδειγμα, ο ιχνηθέτης υβριδοποιείται με τρία τμήματα DNA. Οι αντίστοιχες ζώνες καθίστανται ορατές μέσω αυτοραδιογραφίας ή χημειοφωταύγειας. 39

Αιμορροφιλία Α Έλλειψη στο γονίδιο του παράγοντα VIII (exons 23-25) Πέψη με SstI Southern Ανιχνευτής όλο το cdna 40

Αιμορροφιλία Α Σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο του παράγοντα VIII (TCGA->TTGA) Πέψη με TaqI Southern 41

Το στύπωμα κατά Southern επιτρέπει τον εντοπισμό ενός συγκεκριμένου κομματιού DNA σε ένα πήκτωμα Τα δείγματα DNA κόβονται με ένα ή περισσότερα περιοριστικά ένζυμα και κατόπιν υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Μετά την ηλεκτροφόρηση το πήκτωμα επωάζεται σε αλκαλικό διάλυμα που προκαλεί την αποδιάταξη των περιοριστικών κομματιών και κατόπιν εμβαπτίζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης, ώστε το ph να ξαναγίνει ουδέτερο. Τα αποδιαταγμένα μόρια DNA μεταφέρονται σε μια μεμβράνη η οποία επωάζεται με έναν ιχνηθέτη σημασμένο είτε με ραδιενέργεια είτε με κάποιον άλλο τρόπο. Όταν ο ιχνηθέτης είναι ραδιο-σημασμένος (όπως στο παράδειγμα αυτό), ακολουθεί αυτοραδιογραφία: ένα ακτι-νογραφικό φιλμ εκτίθεται στη μεμβράνη και μετά την εμφάνισή του οι θέσεις στις οποίες υπάρχουν μαύρες ζώνες υποδεικνύουν ποια από τα μόρια DNA που ηλεκτροφορήθηκαν υβριδοποιήθηκαν με τον ιχνηθέτη.

Στύπωμα κατά Southern γονιδιωματικού DNA από φυσιολογικό (Φ) ιστό και από όγκο (Ο) στην περίπτωση μιας ασθενούς με καρκίνο του μαστού Ενώ στο DNA από φυσιολογικό ιστό του μαστού εμφανίζονται δύο ζώνες, στο DNA του όγκου υπάρχει μόνο η μία, αυτή με το μεγαλύτερο μοριακό βάρος. Η δεύτερη αχνή ζώνη οφείλεται στην παρουσία μικρού αριθμού φυσιολογικών κυττάρων στο δείγμα του όγκου.

8. Αποτύπωση κατά Northern Ταυτοποίηση mrna Η θέση της ζώνης υποδηλώνει το μέγεθος Η ένταση της ζώνης υποδηλώνει την ποσότητα Ιστοειδικότητα στην έκφραση 44

Northern Γονίδιο ΜΝΚ Σύνδρομο Menkes, Φυλοσύνδετο RNA από ινοβλάστες 45

9. Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR 46

Σχηματική αναπαράσταση της PCR Κατά την PCR, το δίκλωνο DNA που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί (μπλε χρώμα) θερμαίνεται ώστε να αποδιαταχθεί. Στη συνέχεια, σε καθεμία από τις αποδιαταγμένες αλυσίδες προσδένεται ένα ολιγονουκλεοτίδιοεκκινητής. Τα 5 άκρα των εκκινητών οριοθετούν την αλλη-λουχία-στόχο που πρόκειται να πολλα-πλασιαστεί. Κατόπιν, η DNA πολυμεράση επεκτείνει τους εκκινητές, με αποτέλεσμα την αντιγραφή της αλληλουχίας-στόχου (το νεοσυντιθέμενο DNA αναπαρίσταται με κόκκινο χρώμα). Η παραπάνω διαδικασία τριών βημάτων, που συνιστά έναν κύκλο του πολλαπλασιασμού, επαναλαμβάνεται διαδοχικά κατά την PCR: (1) Το DNA θερμαίνεται, ώστε να αποδιαταχθεί, (2) οι εκκινητές προσδένονται στις αποδιαταγμένες αλυσίδες και (3) η DNA πολυμεράση συνθέτει DNA επεκτείνοντας

10. Προσδιορισμός αλληλουχίας DNA Αυτοραδιογράφημα ενός πηκτώματος αλληλούχισης. 48

Αποτελέσματα αυτοματοποιημένης αλληλούχισης με διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές. 49

Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση

11. Ανίχνευση πολυμορφισμών Κατηγορίες πολυμορφισμών DNA A. SNP (Single Nucleotide polymorphisms) B. STR (Short Tandem Repeats) C. VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) D. Πολυμορφισμοί μεγέθους περιοριστικών τμημάτων E. Microsatelites F. SSR (Simple Sequence Repeats) 51

Κατηγορίες πολυμορφισμών DNA A. RFLPs Πολυμορφισμοί μεγέθους περιοριστικών τμημάτων (restriction fragment length polymorphisms) B. VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats), minisatellites C. SSRs (Simple Sequence Repeats), ή STRs (Short Tandem Repeats) microsatellites D. SNPs (Single Nucleotide polymorphisms) E. Υβριδοποίηση με ASOs (Allele Specific Oligonucleotides) F. Amplification Refractory Mutation System (ARMS) 52

Α. Πολυμορφισμοί μεγέθους περιοριστικών τμημάτων, RFLPs Η αλλαγή βάσης σε θέση Περιοριστικής Ενδονουκλεάσης δεν είναι καθεαυτή υπεύθυνη για την ασθένεια δείκτης κληρονομούμενου χρωμοσώματος Κληρονόμηση αλληλόμορφων RFLPs κατά Mendel Οι πιο χρήσιμοι πολυμορφισμοί είναι αυτοί για τους οποίους τα περισσότερα άτομα είναι ετερόζυγα 53

Πολυμορφισμοί μεγέθους περιοριστικών τμημάτων RFLPs 5 3 2 54

Εικόνα 3.2 Οι πολυμορφισμοί μήκους τμημάτων περιορισμού (RFLP) κληρονομούνται με μεντελικό τρόπο. Τα τέσσερα αλληλόμορφα (Α, Β, Γ και Δ) ενός δείκτη περιορισμού απαντώνται σε όλους τους πιθανούς συνδυασμούς ανά ζεύγη και διαχωρίζονται ανεξάρτητα σε κάθε γενιά. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Ray White.

Β. Eν σειρά επαναλήψεις ποικίλου αριθμού (Variable number of Tandem Repeats, VNTRs) minisatelites Επαναλαμβανόμενη περιοχή μέχρι χιλιάδες bp => Συνήθως Southern Πιο σπάνια PCR 56

Αποτύπωμα DNA με σκοπό τον έλεγχο πατρότητας. (Μ.Μ.Β.: Μάρτυρας μοριακού βάρους.) 57

58

VNTRs στην Ιατροδικαστική Ένας ανιχνευτής 4 ανιχνευτές 59

VNTRs Επαναλαμβανόμενος ανιχνευτής Δακτυλικό αποτύπωμα (fingerprint) DNA διδύμων 60

C. SSRs (Simple Sequence Repeats) ή STRs (Short Tandem Repeats) βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις (microsatellites) Η βασική επαναλαμβανομένη αλληλουχία (μονάδα) αποτελείται από 2 ως 6 ζεύγη βάσεων Περισσότεροι από 10 000 Ταυτοποίηση γονιδίων (κλωνοποίηση βάση θέσης) 61

D. Single Nucleotide polymorphisms, SNPs Κωδικοί csnps Μη κωδικοί SNPs https://www.youtube.com/watch?v=9rpda2actog https://www.youtube.com/watch?v=5rajepxu0oq&nr=1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk3856/#info http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/snp_summary.cgi 62

Αναζήτηση SNPs- dbsnp βάση δεδομένων http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 63

Ανίχνευση SNPs I. RFLPs και διάγνωση με Southern ή PCR II. Υβριδοποίηση υψηλής αυστηρότητας με συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, ASOs (Allele Specific Oligonucleotides) III.Με μικροσυστοιχίες DNA 64

ΙΙΙ. Ανίχνευση SNP με DNA microarrays ή DNA chips ή oligonucleotiode arrays ή συστοιχείες ολιγονουκλεοτιδίων ή μικροσυστοιχίες DNA ή GeneChip arrays 65

Τί είναι οι μικροσυστοιχίες? Οι μικροσυστοιχίες είναι γυάλινα πλακίδια με συστοιχίες εκατοντάδων χιλιάδων ολιγονουκλεοτιδίων/ τμημάτων DNA, που αντιπροσωπεύουν γνωστά ή άγνωστα γονίδια, και στις οποίες μπορεί να υβριδοποιηθεί το DNA ή RNA προς μελέτη, αφού έχει πρώτα σημανθεί με φθορίζουσες χρωστικές 66

Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων κυμαίνονται σε πολύ ευρύ φάσμα Ιστοειδική έκφραση Συνήθως 10000-15000 γονίδια με Ιστοειδική έκφραση Άφθονο mrna (50%) προέρχεται από <100 διαφορετικά γονίδια (1000-10000 αντίγραφα /γονίδιο) Σπάνιο mrna (Πολύπλοκο mrna) (<10 αντίγραφα)

Ο αριθμός των γονιδίων που εκφράζονται μπορούν να μετρηθούν Με υψηλής Πυκνότητας μικροσυστοιχιες ολιγονουκλεοτιδιων gene microarrays

Εικόνα 3.32 Η τεχνολογία HDΑ επιτρέπει την παράλληλη μέτρηση της έκφρασης πολυάριθμων γονιδίων σε σύγκριση με το επίπεδο της έκφρασής τους σε ένα δείγμα αναφοράς ή μάρτυρα (π.χ. σε κύτταρα του άγριου τύπου). Στο συγκεκριμένο παράδειγμα, κάθε τετράγωνο αντιστοιχεί σε ένα γονίδιο του S. cerevisiae (το τετράγωνο επάνω αριστερά αντιστοιχεί στο πρώτο γονίδιο του χρωμοσώματος Ι και το τετράγωνο κάτω δεξιά στο τελευταίο γονίδιο του χρωμοσώματος XVI). Το επίπεδο έκφρασης σε σχέση με τον άγριο τύπο επισημαίνεται με κόκκινο (αν είναι χαμηλότερο), λευκό (αν είναι ίσο) ή μπλε (αν είναι υψηλότερο). Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Rick Young.

Αλληλούχιση του DNA με τη μέθοδο τερματισμού της αλυσίδας (διδεόξυ) Το μήκος των κομματιών DNA των οποίων η επιμήκυνση τερματίστηκε λόγω της προσθήκης στο άκρο τους ενός διδεοξυριβονουκλεοτιδίου υποδεικνύεται στα δεξιά του πηκτώματος. Η αλληλουχία της αλυσίδας που συντίθεται κατά την αντίδραση της αλληλούχισης συνάγεται από τα διδεοξυριβονουκλεοτίδια που προκάλεσαν τον τερματισμό των κομματιών DNA. Κάθε διδεοξυριβονουκλεοτίδιο είναι σημασμένο με μια συγκεκριμένη φθορίζουσα ουσία που το χαρακτηρίζει, ώστε να είναι δυνατός ο εντοπισμός του. Η αλληλουχία διαβάζεται από τα μικρότερα προς τα μεγαλύτερα κομμάτια (από το κάτω προς το πάνω μέρος του πηκτώματος) και στο παράδειγμα αυτό είναι 5 -GACGCTGCGA-3.

Κατασκευή ανασυνδυασμένων πλασμιδίων που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για τυφλή αλληλούχιση (shotgun) Περνώντας επανειλημμένα το διάλυμα του μεγα-λομοριακού DNA που πρόκειται να αλληλουχηθεί από μια λεπτή βελόνα, προκύπτουν πολλά, σχετικά μικρά, κομμάτια (μπλε χρώμα). Τα κομμάτια αυτά υφίστανται επεξεργασία με την DNA πολυμεράση του βακτηριοφάγου Τ4 που διαθέτει ενεργότητα 3 5 εξωνουκλεάσης, παρουσία των τεσσάρων τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοσιδίων. Έτσι συμπληρώνονται τα υπο-λειπόμενα 3 άκρα και αποικοδομούνται τα προ-εξέχοντα 3 άκρα. Στη συνέχεια, τα τμήματα DNA εντί-θενται σε έναν φορέα κλωνοποίησης και τα ανα-συνδυασμένα πλασμίδια χρησιμοποιούνται για τον μετασχηματισμό βακτηριακών κυττάρων. Στον φορέα, εκατέρωθεν της θέσης κλωνοποίησης, υπάρχουν χαρακτηριστικές αλληλουχίες (πράσινο χρώμα) οι οποίες αναγνωρίζονται από εμπορικά διαθέσιμους εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την αλληλούχιση των κλωνοποιημένων μορίων DNA.

Τεχνικές αλληλούχισης νέας γενιάς

Το πλακίδιο οπτικών ινών (β) Σχηματική απεικόνιση του πλακιδίου οπτικών ινών μέσα στη συσκευή αλληλούχισης νέας γενιάς GS FLX. Η συσκευή GS FLX αποτελείται από τρία μέρη: (i)ένα σύστημα ροής αντιδραστηρίων που περιλαμβάνει και τη θέση του πλακιδίου οπτικών ινών με τα 1,6 εκατομμύρια βοθρία, (ii)ένα σύστημα καταγραφής του φωτός που εκπέμπεται από τα βοθρία, (iii)(iii) έναν υπολογιστή με κατάλληλο λογισμικό που συλλέγει, αναλύει τα δεδομένα και τελικά συναρ-μολογεί τις αλληλουχίες που δια-βάζονται με βάση τις μεταξύ τους επικαλύψεις και προσδιορίζει τη συνολική αλληλουχία.

Οι αντιδράσεις της πυροαλληλούχισης (pyrosequencing)

3. Sequencing Ο προσδιορισμός της ακολουθίας ενός μορίου DNA Παλαιά βιοχημική τεχνική η οποία πλέον έχει αυτοματοποιηθεί Χρήση διδεοξυ-νουκλεοτιδίων τα οποία διακόπτουν την επιμήκυνση των κλώνων

Χρήση διδεοξυ-νουκλεοτιδίων

http://www.dnalc.org/view/15479-sanger-method-of-dna-sequencing-3d-animation-w https://www.youtube.com/watch?v=vk-hlmaitne https://www.youtube.com/watch?v=zeutx_o21eo

4. Σχολιασμός γονιδιωμάτων (annotation υπομνηματισμός) Εύρεση ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης Αναγνώριση ρυθμιστικών περιοχών Στα ευκαρυωτικά, είναι πιο πολύπλοκο θέμα λόγω ύπαρξης εξωνίων-ιντρονίων Πολύπλοκο πρόβλημα το οποίο περιλαμβάνει: oαναγνώριση ειδικών ακολουθιών oκατανομές μήκους oσυχνότητες εμφάνισης βάσεων

Κατανομή του μήκους Skovgaard et al, TRENDS in Genetics 17(8);

3. In situ υβριδισμός Η ανίχνευση μέσω του υβριδισμού της φυσιολογικής θέσης ενός μορίου νουκλεϊκού οξέος Η εύρεση της θέσης ενός γονιδίου στο χρωμόσωμα Η εύρεση της έκφρασης ενός γονιδίου σε κύτταρα ενός ιστού

Η πιο άμεση μέθοδος In situ υβριδοποίηση Μοριακός υβριδισμός μιας κλωνοποιημένης αλληλουχίας DNA με μεταφασικά χρωμοσώματα Ορατό σήμα ραδιενέργεια Φθορισμός με διαφορετικά χρώματα (FISH) Ο ανιχνευτής πρέπει να είναι αρκετά μεγάλο τμήμα DNA https://www.youtube.com/watch?v=nm8ai1ci9is

Μεταφασικοί πυρήνες Ανιχνεύσιμη διαφορά της τάξης των μεγαβάσεων Μεσοφασικοί πυρήνες (λιγότερη συσπείρωση του DNA) Ανιχνεύσιμη διαφορά 50-500 kb FISH ινιδίων (τεχνητό ξεδίπλωμα ινιδίων χρωματίνης) Ανιχνεύσιμη διαφορά λίγα kb

Δυο ανιχνευτές διαφορετικών χρωμάτων μπορούν να δείξουν απόσταση συγκεκριμένων περιοχώνγονιδίων

ViewRNA assay for detection of mir-133 microrna (green) and myogenin mrna (red) in differ Ryan Jeffs