Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΕΤΟΙΜΑ ΠΡΟΣ ΧΡΗΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΣΕ ΠΛΑΚΕΣ PA-254570.06 Αναθ.: Nov 2013 ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖEΤΑΙ Το (ονομαζόμενο παλαιότερα MRSA Screen Agar) αναπτύχθηκε για την ανίχνευση του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη/οξακιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA, ORSA). Επειδή η μέθοδος ανίχνευσης του MRSA χρησιμοποιεί το ίδιο ενοφθάλμισμα με εκείνο της διαδικασίας εξέτασης ευαισθησίας σε αντιμικροβιακούς δίσκους Bauer-Kirby, η εξέταση ανίχνευσης οξακιλλίνης είναι δυνατό να εκτελεστεί με ευκολία σε απομονωμένα στελέχη ταυτόχρονα με εξετάσεις ευαισθησίας ρουτίνας. ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Μικροβιολογική μέθοδος. Η ανθεκτικότητα του S. aureus στην πενικιλλίνη παρατηρήθηκε αμέσως μετά την εμφάνιση της πενικιλλίνης στα τέλη της δεκαετίας του 1940. 1 Έως το τέλος της δεκαετίας του 1960, άρχισαν να απομονώνονται στις Η.Π.Α. τα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη/οξακιλλίνη στελέχη του S. aureus. 2 Τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί ανθεκτικότητας συμβάλλουν στην ανθεκτικότητα του S. aureus στη μεθικιλλίνη. Αυτοί είναι: (1) ο κλασικός τύπος, που ενέχει την παραγωγή μιας συμπληρωματικής πρωτεΐνης δέσμευσης της πενικιλλίνης (PBP), η οποία κωδικοποιείται από ένα χρωμοσωμικό γονίδιο meca, (2) η υπερπαραγωγή β-λακταμάσης και (3) η παραγωγή τροποποιημένων PBP, η οποία μειώνει τη συγγένεια των μικροοργανισμών για τα αντιβιοτικά β- λακτάμης. 3 Μια περιγραφή των χαρακτηριστικών που ενδέχεται να βοηθήσουν στη διαφοροποίηση των τριών τύπων ανθεκτικότητας στην οξακιλλίνη (μεθικιλλίνη) είναι δυνατό να βρεθεί στο Manual of Clinical Microbiology, η έκδ. 3 Στελέχη που διαθέτουν το γονίδιο mec (κλασική ανθεκτικότητα) είναι ανθεκτικά στις ανθεκτικές στην πενικιλλινάση πενικιλλίνες (PRP), όπως μεθικιλλίνη, οξακιλλίνη και ναφκιλλίνη, και είναι είτε ομοιογενή είτε ετερογενή στην έκφραση ανθεκτικότητάς τους. Με την ομοιογενή έκφραση, σχεδόν όλα τα κύτταρα εκφράζουν ανθεκτικότητα όταν υποβάλλονται σε πρότυπες in vitro εξετάσεις. Με την ετεροανθεκτική έκφραση, μερικά κύτταρα εμφανίζονται ευαίσθητα και άλλα ανθεκτικά. Συχνά, μόνον 1 στα 10 4 έως 1 στα 10 8 κύτταρα του πληθυσμού εξέτασης εκφράζει ανθεκτικότητα. Η ετερογενής έκφραση έχει περιστασιακά ως αποτέλεσμα ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (MIC) που εμφανίζονται ότι είναι οριακές, δηλ. MIC οξακιλλίνης 4 έως 8 µg/ml. Απομονωμένα στελέχη που παρουσιάζουν την κλασική ανθεκτικότητα είναι συνήθως ανθεκτικά σε άλλους παράγοντες όπως ερυθρομυκίνη, κλινδαμυκίνη, χλωραμφαινικόλη, τετρακυκλίνη, τριμεθοπρίμη-σουλφαμεθοξαζόλη, κινολόνες ή αμινογλυκοσίδες. 3 Η ανθεκτικότητα που μεσολαβείται από την υπερπαραγωγή β-λακταμάσης ή την παρουσία τροποποιημένων PBP έχει επίσης αποτέλεσμα οριακή ανθεκτικότητα. Απομονωμένα στελέχη που είναι ανθεκτικά είτε με υπερπαραγωγή β-λακταμάσης είτε με το μηχανισμό τροποποιημένων PBP συνήθως δεν παρουσιάζουν πολυφαρμακευτική ανθεκτικότητα. 3 Επιπλέον, αυτά τα απομονωμένα στελέχη δεν είναι πιθανό να αναπτυχθούν στην πλάκα ανίχνευσης άγαρ. 3-5 Ο ανθεκτικός στη μεθικιλλίνη πληθυσμός αναπτύσσεται βραδύτερα, προτιμά χαμηλότερη θερμοκρασία επώασης και υψηλή συγκέντρωση αλάτων. Το αποτελείται από άγαρ Mueller Hinton, το οποίο είναι ένα υλικό καλλιέργειας που έχει τυποποιηθεί για τη διαδικασία διάχυσης σε δίσκο για την εξέταση ευαισθησίας σε αντιμικροβιακά των αερόβιων βακτηριδίων. 6 Για τη βελτίωση της ανάπτυξης των ανθεκτικών στις PRP υποπληθυσμών προστίθεται χλωριούχο νάτριο. Για την ανίχνευση της ανθεκτικότητας στις PRP προτιμάται η οξακιλλίνη επειδή είναι πιο σταθερή και τα αποτελέσματα PA-254570.06-1 -
είναι πιο αξιόπιστα (δείτε τον πίνακα 2C [M100 (M2)] και τον πίνακα 2C στο έγγραφο M100 [M7] της CLSI). 7,8 ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Σύνθεση* ανά λίτρο κεκαθαρμένου νερού Εκχύλισμα βοείου κρέατος 2,0 g Οξακιλλίνη 0,006 Όξινο υδρόλυμα καζεΐνης 17,5 Άγαρ 17,0 Άμυλο 1,5 ph 7,3 ± 0,2 Χλωριούχο νάτριο 40,0 *Ρυθμισμένο ή/και συμπληρωμένο όπως απαιτείται, έτσι ώστε να πληρούνται τα κριτήρια απόδοσης. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ. Για επαγγελματική χρήση μόνον. Μη χρησιμοποιείτε τις πλάκες εάν παρουσιάζουν ενδείξεις μικροβιακής μόλυνσης, αποχρωματισμό, ξηρότητα, ρωγμές ή άλλα σημεία αλλοίωσης. Συμβουλευτείτε το έγγραφο ΓΕΝΙΚΕΣ Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ σχετικά με τις ασηπτικές διαδικασίες χειρισμού, τους βιολογικούς κινδύνους και την απόρριψη του χρησιμοποιημένου προϊόντος. ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣ Κατά την παραλαβή, φυλάσσετε τα τρυβλία στο σκοτάδι στους 2 έως 8 C, στην αρχική συσκευασία τους έως τη στιγμή της χρήσης τους. Αποφεύγετε την κατάψυξη και την υπερβολική θέρμανση. Τα τρυβλία είναι δυνατό να ενοφθαλμιστούν έως την ημερομηνία λήξης (δείτε την ετικέτα της συσκευασίας) και να επωαστούν στους συνιστώμενους χρόνους επώασης. Είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν τρυβλία από ανοιγμένες στοίβες 5 ή 10 τρυβλίων επί μία εβδομάδα, εφόσον φυλάσσονται σε καθαρό χώρο στους 2 έως 8 C. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΧΡΗΣΤΗ Ενοφθαλμίστε αντιπροσωπευτικά δείγματα με τις καλλιέργειες που παρατίθενται παρακάτω. Εναιωρήστε αρκετές καλά απομονωμένες αποικίες του υπό εξέταση μικροοργανισμού από μια καλλιέργεια σε πλάκα 18 έως 24 ωρών, σε ένα σωληνάριο BD Trypticase Soy Broth και ρυθμίστε τη θολερότητα σε πρότυπο θολερότητας 0,5 McFarland. Ενοφθαλμίστε σημειακά το με 10 μl του εναιωρήματος εξέτασης με χρήση μικροπιπέτας. Εναλλακτικά, εμποτίστε ένα βαμβακοφόρο στειλεό με το εναιώρημα εξέτασης και εξωθήστε τυχόν περίσσεια υγρού πιέζοντας απαλά πάνω στο εσωτερικό τοίχωμα του σωληναρίου. Επιστρώστε γραμμωτά σύροντας το στειλεό πάνω από μια περιοχή περίπου 2,5 cm. Συμπεριλάβετε μια πλάκα BD Trypticase Soy Agar II με 5% αίμα προβάτου (TSA II) ή BD Columbia Agar με 5% αίμα προβάτου ως μη εκλεκτική αναφορά ανάπτυξης. Επωάστε τις πλάκες στους 30-35 C σε αερόβιες συνθήκες. Μην υπερβαίνετε τους 35 C. Επωάστε τις πλάκες για ένα ολόκληρο 24ωρο. Στελέχη Αποτελέσματα ανάπτυξης Staphylococcus aureus ATCC 29213 Καμία ανάπτυξη στις 24 ώρες επώασης (ευαίσθητο) Staphylococcus aureus ATCC 43300 Μη ενοφθαλμισμένο Ανάπτυξη στις 24 ώρες επώασης (ανθεκτικό) Ανοικτό πορτοκαλί, διαυγές έως ελαφρώς αδιαφανές ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Παρεχόμενα υλικά (πλάκες Stacker 90 mm). Μικροβιολογικά ελεγμένο. Υλικά που δεν παρέχονται Βοηθητικά υλικά καλλιέργειας, αντιδραστήρια και εργαστηριακός εξοπλισμός, όπως απαιτείται. PA-254570.06-2 -
Τύποι δειγμάτων Αυτό το υλικό καλλιέργειας δεν προορίζεται για χρήση για την απομόνωση MRSA/ORSA από κλινικά δείγματα. Αντίθετα, το υλικό καλλιέργειας ενοφθαλμίζεται με καθαρές καλλιέργειες απομονωμένων στελεχών που ταυτοποιούνται συμπερασματικά ως Staphylococcus aureus (δείτε τις ενότητες ιαδικασία της εξέτασης και ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ). ιαδικασία της εξέτασης 1. Ταυτοποιήστε συμπερασματικά το απομονωμένο στέλεχος ως Staphylococcus aureus, π.χ. με εξέταση κοαγκουλάσης σε αντικειμενοφόρο πλάκα ή σωληνάριο (ή με πλήρη βιοχημική ταυτοποίηση). 2. Παρασκευάστε το ενοφθάλμισμα εναιωρώντας αρκετές καλά απομονωμένες αποικίες του απομονωμένου στελέχους εξέτασης S. aureus από μια καλλιέργεια σε πλάκα 18 έως 24 ωρών, σε ένα σωληνάριο κατάλληλου ζωμού, όπως ο ζωμός σόγιας Trypticase και ρυθμίστε τη θολερότητα σε πρότυπο θολερότητας 0,5 McFarland. 3. Ενοφθαλμίστε σημειακά το με 10 μl του εναιωρήματος εξέτασης με χρήση μικροπιπέτας. 4. Εναλλακτικά, εμποτίστε ένα στειλεό με το εναιώρημα εξέτασης και εξωθήστε τυχόν περίσσεια υγρού πιέζοντας απαλά πάνω στο εσωτερικό τοίχωμα του σωληναρίου. Επιστρώστε γραμμωτά σύροντας το στειλεό πάνω από μια περιοχή περίπου 2,54 cm. Συμπεριλάβετε μια πλάκα BD Trypticase Soy Agar II με 5% αίμα προβάτου (TSA II) ή BD Columbia Agar με 5% αίμα προβάτου ως μη εκλεκτικό έλεγχο ανάπτυξης. 5. Οι πλάκες εξέτασης και ελέγχου είναι δυνατό να διαιρεθούν σε διάφορους σφηνοειδείς τομείς, σημειώνοντας το κάτω μέρος της πλάκας. Σε κάθε πλάκα είναι δυνατό να εξεταστούν περισσότερα από ένα απομονωμένα στελέχη. Ωστόσο, χρησιμοποιείτε και επωάζετε κάθε πλάκα μόνο μία φορά. ΜΗΝ ΕΠΑΝΑΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΚΑΙ ΜΗΝ ΕΠΑΝΕΠΩΑΖΕΤΕ ένα υλικό. 6. Επωάζετε τις πλάκες στους 30-35 C επί ένα ολόκληρο 24ωρο. Μην υπερβαίνετε τους 35 C. Αποτελέσματα Μετά την επώαση, παρατηρήστε τις πλάκες για τυχόν ανάπτυξη. Σημειωτέον ότι οι πλάκες αυτού του υλικού καλλιέργειας πρέπει να επιθεωρούνται προσεκτικά. Επίσης, πολύ μικρές αποικίες, ακόμα και μία αποικία, υποδηλώνουν ότι το απομονωμένο στέλεχος είναι ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη (οξακιλλίνη). Η απουσία ανάπτυξης υποδηλώνει ότι ο μικροοργανισμός είναι ευαίσθητος στις PRP (μεθικιλλίνη, ναφκιλλίνη και οξακιλλίνη). Απομονωμένα στελέχη που αναπτύσσονται σε Oxacillin Screen Agar θα πρέπει να αναφέρονται ως ανθεκτικά σε όλους τους αντιμικροβιακούς παράγοντες β-λακτάμης, συμπεριλαμβανομένων των συνδυασμών αναστολέων β-λακτάμης/β-λακταμάσης και των κεφαλοσπορινών. Σημείωση: Ενημερωτικά συμπληρώματα στο έγγραφο M2 της CLSI ή αναθεωρημένες εκδόσεις, οι οποίες περιέχουν αναθεωρημένους πίνακες αντιμικροβιακών δίσκων και ερμηνευτικά πρότυπα, δημοσιεύονται περιοδικά. Για τις τρέχουσες συστάσεις θα πρέπει να συμβουλεύεστε τους πλέον πρόσφατους πίνακες. Είναι δυνατό να παραγγείλετε το πλήρες κείμενο του προτύπου και ενημερωτικά συμπληρώματα από την Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Τηλέφωνο: ++1-610-688-1100. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το είναι ένα πρότυπο υλικό για την ανίχνευση του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη/οξακιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA, ORSA). 3,6-8 Εσωτερικές μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει διαφορά στο μέγεθος του ενοφθαλμίσματος μεταξύ ενοφθαλμισμού με 10 µl του εναιωρήματος εξέτασης με χρήση μικροπιπέτας και του ενοφθαλμισμού της πλάκας με στειλεό. Η πιθανότητα της εμφάνισης του ανθεκτικού υποπληθυσμού είναι μεγαλύτερη σε ένα μεγάλο πληθυσμό βακτηριδιακών κυττάρων. Η ανίχνευση της ανθεκτικότητας, ειδικά με τον ετερογενώς ανθεκτικό πληθυσμό, βελτιώνεται με το μεγαλύτερο ενοφθάλμισμα που λαμβάνεται με χρήση μικροπιπέτας και ενοφθαλμισμό της πλάκας με 10 µl. 9 PA-254570.06-3 -
Οποιοδήποτε απομονωμένο στέλεχος αναπτυχθεί σε αυτό το υλικό θα πρέπει να εξετάζεται ποσοτικά με αραίωση σε ζωμό ή άγαρ ή με μοριακές μεθόδους (προσδιορισμός του γονιδίου meca) για την επιβεβαίωση της ανθεκτικότητας στην οξακιλλίνη και επίσης της ανθεκτικότητας σε άλλους αντιμικροβιακούς παράγοντες, οι οποίοι είναι χαρακτηριστικοί των MRSA, όπως η χλωραμφαινικόλη, η κλινδαμυκίνη, η ερυθρομυκίνη, η γενταμυκίνη και η τετρακυκλίνη. Αποτελέσματα απόδοσης 9 Σε μια επιτόπια δοκιμή σε ένα μεγάλο μητροπολιτικό νοσοκομείο, εξετάστηκαν 152 απομονωμένα στελέχη του S. aureus σε υλικό (ονομαζόμενο παλαιότερα MRSA Screen Agar) σε σύγκριση με μια διαδικασία αραίωσης σε άγαρ αναφοράς, για την ευαισθησία τους στη μεθικιλλίνη. ιαπιστώθηκε ότι συνολικά 121 απομονωμένα στελέχη ήταν ευαίσθητα και με τις δύο μεθόδους. Βρέθηκαν 30 απομονωμένα στελέχη που ήταν ανθεκτικά (MRSA) και με τις δύο μεθόδους. Το ένα απομονωμένο στέλεχος που απομένει αναπτύχθηκε στο υλικό MRSA Screen Agar αλλά ήταν ευαίσθητο στη μεθικιλλίνη. Έτσι, η ευαισθησία της εξέτασης ήταν 100% και η ειδικότητα 99,2%. Περιορισμοί της διαδικασίας Περιστασιακά, απομονωμένα στελέχη του S. aureus με οριακά ανθεκτικές τιμές MIC ενδέχεται να μην αναπτυχθούν εντός 24 ωρών. Συνιστάται η επιβεβαίωση τυχόν διφορούμενων αποτελεσμάτων που παρουσιάζονται στην πλάκα ανίχνευσης με μια πρότυπη εξέταση MIC. Αυτό το υλικό καλλιέργειας δεν πρέπει να χρησιμοποιείται για απομόνωση MRSA απευθείας από κλινικά δείγματα. ε συνιστάται η χρήση του υλικού για την ανίχνευση των ανθεκτικών στη μεθικιλλίνη/οξακιλλίνη, αρνητικών στην κοαγκουλάση, σταφυλόκοκκων. ΑΝΑΦΟΡΕΣ 1. Chain, E., H.W. Florey, and M.A. Jennings. 1949. Acquired resistance of micro-organisms to penicillin, p. 1111-1136. In H.W. Florey, E. Chain, N.G. Heatley, M.A. Jennings, A.G. Sanders, E.P. Abraham, and M.E. Florey (ed.), Antibiotics, vol. II. Oxford University Press, London. 2. Barrett, F.F., R.F. McGehee, Jr., and M. Finland. 1968. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus at Boston City Hospital. Bacteriologic and epidemiologic observations. N. Engl. J. Med. 279:444-448. 3. Swenson, J.M., J.B. Patel, and J.H. Jorgensen. 2007. Special phenotypic methods for detecting antibacterial resistance. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. L. Landry, and M.A. Pfaller (ed.). Manual of clinical microbiology, 9th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. 4. Leitch, C., and S. Boonlayangoor. 1994. Test to detect oxacillin (methicillin)-resistant staphylococci with an oxacillin screen plate, p. 5.5.1-5.5.7. In H.D. Isenberg (ed.), Clinical microbiology procedures manual, vol. 1 (suppl.1). American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA. 5. Haberberger, R.L., A. J. Kallen, T.J. Driscoll, and M.R. Wallace. 1998. Oxacillin-resistant phenotypes of Staphylococcus aureus. Lab. Med. 29: 302-305. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M7. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 7. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Disk diffusion supplemental tables: M100 (M2). CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 8. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). MIC testing supplemental tables: M100 (M7). CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 9. Data on file. BD Diagnostic Systems. Sparks, MD. USA ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ/ ΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ Αρ. κατ. 254570 Έτοιμα προς χρήση υλικά καλλιέργειας σε πλάκες, 10 πλάκες PA-254570.06-4 -
ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ Για περισσότερες πληροφορίες παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο της BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD PA-254570.06-5 -