«Εντερόκοκκοι υδάτινου περιβάλλοντος: ταυτοποίηση, ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά και κλωνική ανάλυση»

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πρόγραµµα Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ιατρικές Ειδικότητες (ΚΚΙΕ) του τµήµατος Ιατρικής της Σχολής Επιστηµών Υγείας του Πανεπιστηµίου Πατρών ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΥΠΕΥΘΥΝΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: Μ. ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΥ «Εντερόκοκκοι υδάτινου περιβάλλοντος: ταυτοποίηση, ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά και κλωνική ανάλυση» Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Παναγιώτα Γραµµένου Ιατρός - Βιοπαθολόγος ΠΑΤΡΑ, 2005

Μέλη Επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής 1) κ. Παπαπετροπούλου Μαρία, Καθηγήτρια (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια) 2) κ. Αναστασίου Ευάγγελο, Καθηγητή (µέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής) 3) κ. Σπηλιοπούλου Ίρις, Αναπληρώτρια καθηγήτρια (µέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής) 4) κ. ηµητρακόπουλο Ο. Γεώργιο, Καθηγητή 5) κ. Γελαστοπούλου Ελένη, Επίκουρος καθηγήτρια 6) κ. Χριστοφίδου Μυρτώ, Επίκουρος καθηγήτρια 7) κ. Παληογιάννη Φωτεινή, Αναπληρώτρια καθηγήτρια

Στους γονείς µου

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Πρόλογος... 1 Γενικό Μέρος... 3 1. Ιστορική αναδροµή... 3 2. Ταξινόµηση... 4 3. Ιδιότητες... 6 3α. Φαινοτυπικοί & βιοχηµικοί χαρακτήρες... 7 4. Enterococcus faecalis... 9 4α. Λοιµογόνες ιδιότητες... 9 4α 1. Ανταλλαγή γενετικού υλικού στους εντερόκοκκους... 10 4α 2. ιείσδυση σε ιστούς του ξενιστή... 11 4β. Ένζυµα... 12 4γ. Τοξίνες... 12 4δ. Πρωτεΐνη συγκόλλησης... 14 4ε. Λιποτειχοϊκό οξύ... 14 4ζ. Φερορµόνες... 15 4η. Πρωτεάση, υαλουρονιδάση... 16 4θ. Εξωκυττάριο υπεροξείδιο... 16 4ι. Εξωκυττάρια πρωτεΐνη επιφάνειας... 16 4κ. Επιφανειακοί υδατάνθρακες... 17 5. Enterococcus faecium... 17 6. Λοιµώξεις από εντεροκόκκους... 19 7. Εντερόκοκκοι στο περιβάλλον... 20 i

7α. Επιβίωση και αντοχή στο δυσµενές περιβάλλον... 24 8. Αντοχή των εντεροκόκκων στα αντιβιοτικά... 26 8α. Ενδογενής αντοχή... 26 8α 1. β-λακτάµες... 27 8α 2. Αµινογλυκοσίδες... 27 8α 3. Γλυκοπεπτίδια... 28 8α 4. Σουλφοναµίδες και Τριµεθοπρίµη... 28 8β. Επίκτητη αντοχή... 29 8β 1. β-λακταµικά... 29 8β 2. Αµινογλυκοσίδες... 31 8β 3. Γλυκοπεπτίδια... 32 8γ. Πολλαπλή αντοχή... 34 Υλικά και Μέθοδοι... 36 1. Υλικά της µελέτης... 36 2. Αποµόνωση στελεχών... 36 3. Ταυτοποίηση στελεχών σε είδος... 40 4. Έλεγχος παραγωγής β-λακταµάσης... 42 5. Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά... 42 6. Αποµόνωση χρωµοσωµικού DNA... 44 7. Ανάλυση χρωµοσωµικού DNA ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)... 47 7α. Ένζυµα περιορισµού... 48 7β. Ανάλυση DNA µετά από επίδραση µε SmaΙ και PFGE... 50 ii

Αποτελέσµατα... 54 Ι. Αποµόνωση Στελεχών... 54 ΙΙ. Χαρακτηρισµός φαινοτύπου... 54 Α. Βιότυποι... 54 Β. Παραγωγή β-λακταµάσης... 57 Γ. Έλεγχος ευαισθησίας... 57 ΙΙΙ. Ανάλυση µε PFGE... 61 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 69 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 78 SUMMARY... 80 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 81 iii

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι εντερόκοκκοι θεωρούνται σηµαντικά, νοσοκοµειακά και εξωνοσοκο- µειακά παθογόνα βακτήρια και αποτελούν καλό δείκτη κοπρανώδους ρύπανσης του υδάτινου περιβάλλοντος. Αν και υπάρχει επαρκής πληροφόρηση για την αντοχή στα αντιβιοτικά των κλινικών στελεχών, υπάρχουν λίγα δεδοµένα για την διασπορά τους στο φυσικό περιβάλλον. Σε αυτή τη µελέτη η βιοτυπία, ο έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά και η ανάλυση του DNA µε ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) εφαρµόσθηκαν σε ένα σύνολο στελεχών εντεροκόκκων που αποµονώθηκαν από νερά αναψυχής και πόσιµα νερά. Έγινε επίσης σύγκριση µε κλινικά στελέχη νοσοκοµειακής προέλευσης. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Υγιεινής και στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Ιατρικού Τµήµατος του Πανεπιστηµίου Πατρών. Στην Καθηγήτρια Υγιεινής του Πανεπιστηµίου Πατρών κ. Μ. Παπαπετροπούλου, εκφράζω τη βαθύτατη ευγνωµοσύνη µου και τις θερµές ευχαριστίες µου για την ανάθεση του θέµατος, την ενθάρρυνση και συµπαράστασή της καθώς και για την ουσιαστική βοήθεια και επιστηµονική καθοδήγηση που µου παρείχε από την αρχή ως την τελική διαµόρφωση της µελέτης αυτής. Τον Καθηγητή Μικροβιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών κ. Γ.Ο. ηµητρακόπουλο ευχαριστώ θερµά για τις πολύτιµες συµβουλές, καθώς και για την φιλοξενία στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Ιατρικού Τµήµατος του Πανεπιστηµίου Πατρών. Την Αναπληρώτρια καθηγήτρια Μικροβιολογίας κ. Ι. Σπηλιοπούλου ευχαριστώ πολύ για τη συµπαράσταση και τη σηµαντική βοήθεια και επιστηµονική 1

καθοδήγηση στο πειραµατικό µέρος της µελέτης, καθώς και για τον πολύτιµο χρόνο που αφιέρωσε στην κριτική διόρθωση και επιµέλεια του κειµένου. Ευχαριστώ τον Καθηγητή Μικροβιολογίας κ. Ε. Αναστασίου για τη στενή παρακολούθηση της µελέτης καθώς και για την κριτική διόρθωση του κειµένου. Την Επίκουρο Καθηγήτρια κ. Μ. Χριστοφίδου ευχαριστώ πολύ για την συνεχή παρακολούθηση αυτής της µελέτης και τις πολύτιµες συµβουλές της. Ευχαριστώ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Φ. Παληογιάννη για τις χρήσιµες υποδείξεις της και την βοήθειά της. Τη Λέκτορα κ. Φ. Κολονίτσιου ευχαριστώ για το ενδιαφέρον της και την συµπαράσταση στην πορεία αυτής της µελέτης. Τις κ.κ. Ε. Σαζακλή Χηµικό και Β. Σίνη Βιολόγο ευχαριστώ πολύ για την πολύτιµη βοήθειά τους στο πειραµατικό µέρος της µελέτης. Τέλος, ευχαριστώ τη φίλη και συνάδελφο κ. Γ. Ροδοπούλου, Βιοπαθολόγο, για την συµπαράσταση αλλά και τη µεγάλη βοήθεια και συµβολή της στο συγγραφικό µέρος της µελέτης. 2

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Ιστορική Αναδροµή Το όνοµα εντερόκοκκος (enterocoque), χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1899 από τον Thiercelin στη Γαλλία, για να υποδηλώσει την εντερική προέλευση ενός νέου για την εποχή Gram-θετικού κόκκου (Thiercelin Μ.Ε., 1899). Ο Jay (1986) αναφέρει ότι ο Escherich υπήρξε ο πρώτος που το 1886 περιέγραψε ένα βακτήριο, που το ονόµασε Micrococcus ovalis, σήµερα αναγνωρισµένο ως Enterococcus faecalis. Τον ίδιο χρόνο µε την περιγραφή του Thiercelin, οι Mc Callum και Hastings (1899) περιέγραψαν µία περίπτωση ενδοκαρδίτιδας, που οφείλετο στον Micrococcus zymogenes (E. faecalis), ένα βακτήριο που ήταν πολύ ανθεκτικό και µπορούσε να επιβιώνει σε θερµοκρασίες υψηλότερες, από εκείνες που ήταν θανατηφόρες για πολλούς µικρόκοκκους (Breed et al., 1986). Oι Mc Callum και Hastings (1899) περιέγραψαν επίσης την αντοχή του µικροβίου στο καρβοξυλικό οξύ και στο χλωροφόρµιο. Το 1905, ο Gordon ανακοίνωσε την αποµόνωση «κοπρανωδών στρεπτοκόκκων» µαζί µε Bacillus coli σε ένα ζωµό που ήταν εκτεθειµένος στον αέρα και θεωρήθηκε ότι η πηγή ήταν αναµφίβολα κόπρανα αλόγων που µεταφέρονταν µε τις µπότες από τους δρόµους. Ένα χρόνο νωρίτερα, ο Houston (1904) είχε παρατηρήσει την αφθονία εντεροκόκκων στους υπονόµους και διατύπωσε την άποψη ότι θα µπορούσαν να αποτελέσουν χρήσιµο στοιχείο, για τον προσδιορισµό της µόλυνσης του νερού µε ανθρώπινα κόπρανα. 3

Έτσι, µέσα στην πρώτη 10ετία του αιώνα, τα περισσότερα από τα χαρακτηριστικά των εντεροκόκκων είχαν περιγραφεί, όπως π.χ. η σχετική αντοχή στα αντιβιοτικά, στην αποξήρανση, στις υψηλές θερµοκρασίες, αλλά και η επιβίωση στο περιβάλλον, η σχέση µε το γαστρεντερικό σύστηµα και µε τη µόλυνση του νερού από κόπρανα καθώς επίσης η δυνατότητα να προκαλούν σοβαρές λοιµώξεις. 2. Ταξινόµηση Το 1921, ο Dible πρότεινε να δοθούν τα ονόµατα Streptococcus faecalis και Enterococcus σε µια οµάδα στρεπτοκόκκων ανθεκτικών στη θερµότητα που αποµονώθηκαν από κόπρανα ανθρώπου. Η εργασία της Lancefield στα 1930, εξασφάλισε µία απλή µέθοδο ταξινό- µησης των στρεπτοκόκκων. Η κατάταξη των στρεπτοκόκκων µε την οροτυπία, αποτέλεσε ένα σπουδαίο µέσο ταξινόµησης από τότε που προτάθηκε για πρώτη φορά από την Lancefield το 1933 (Lancefield R.C., 1933). Οι στρεπτόκοκκοι φέρουν στο κυτταρικό τους τοίχωµα πολυσακχαριδικά αντιγόνα που ονοµάζονται C. Η ταξινόµηση της Lancefield αντικατοπτρίζει τη «χαρακτηριστική αντιγονικότητα» αυτών των πολυσακχαριδικών αντιγόνων και ορίζονται αλφαβητικά ως A, B, C, D, E, κ.λ.π., µε λιγότερη έµφαση στα βιοχηµικά και φυσικά χαρακτηριστικά. Οι περισσότεροι εντερόκοκκοι εκφράζουν το αντιγόνο D και ορίζονται σύµφωνα µε την Lancefield ως οµάδα D. Οι όροι «κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι» και εντερόκοκκοι έχουν χρησιµοποιηθεί ως συνώνυµα για αρκετά χρόνια. Το 1970, ο Kalina θεώρησε πως η κατάταξη των εντερόκοκκων στο γένος των στρεπτόκοκκων ήταν υπό αµφισβήτηση λόγω της µορφολογίας τους και των 4

αποτελεσµάτων των µελετών του Sherman. Ο Sherman, το 1937 προσπάθησε να ταξινοµήσει τους στρεπτόκοκκους µε βάση τα χαρακτηριστικά καλλιέργειας και αιµόλυσης. Αυτή η ταξινόµηση περιλαµβάνει µια κεντρική οµάδα, τους εντερόκοκκους, που φαίνεται να είναι εντερικής προέλευσης. Η σύγχυση ανάµεσα στους στρεπτόκοκκους εντερικής προέλευσης και βακτηρίων που ανήκουν στο γένος των εντεροκόκκων συνεχίζεται για πολλά χρόνια. Το 1984 η ταξινόµηση των στρεπτοκόκκων έχει υποστεί ριζική αλλαγή και έχουν χωρισθεί σε 3 γένη: Στρεπτόκοκκος, Εντερόκοκκος, και Λακτόκοκκος (Schleifer K.H., Kilpper Balz R., 1984). Oι Schleifer και Kilpper (1984), εφήρµοσαν τον υβριδισµό DNA-DNA, και διαπίστωσαν πως οι εντερόκοκκοι έχουν σηµαντική οµολογία και είναι ελάχιστα συγγενείς µε τους στρεπτόκοκκους ενώ ο S. faecalis και ο S. faecium αποτελούν ξεχωριστά είδη. Το 1990 οι Williams και συν. (1991) εφαρµόζοντας την ανάλυση της αλληλουχίας του 16SrRNA, ανακοίνωσαν την ταυτοποίηση των ακολούθων ειδών εντεροκόκκων. (Πίν. Ι). Πίν. Ι: Οµάδες µε γενετικά συγγενή είδη εντεροκόκκων σύµφωνα µε την αλληλουχία 16SrRNA Οµάδα faecium Οµάδα avium Οµάδα gallinarum Οµάδα cecorum ιαφορετικά είδη E. faecium E. mundii E. durans E. hirae E. avium E. malodoratus E. raffinosus E. pseudoavium E. gallinarum E. casseliflavus E. cecorum E. columbae E. faecalis E. dispar E. sulfureus E. solitarius E. saccharolyticus E. flavescens Απέδειξαν επίσης ότι υπάρχει χαµηλή οµολογία rrna µεταξύ E. faecalis και άλλων εντερόκοκκων γεγονός το οποίο διαχωρίζει τον E. faecalis από τα υπόλοιπα είδη του γένους. 5

3. Ιδιότητες Οι εντερόκοκκοι διαθέτουν αρκετά χαρακτηριστικά που τους επιτρέπουν να ταξινοµούνται ως ξεχωριστό γένος από άλλους gram-θετικούς καταλάσηαρνητικούς κόκκους. Αναπτύσσονται σε συνθήκες πολύ αντίξοες, όπως για παράδειγµα σε υλικά µε 6,5% NaCl ή 40% χολής βοός, σε 0,1% κυανούν του µεθυλενίου (bleu de méthylène), σε γάλα (lait de Sherman), σε ph 9,6, και σε θερµοκρασίες 10 ο έως 45 ο C. Αυτές οι ιδιότητες χρησιµοποιήθηκαν από τον Sherman για την ταξινόµηση το 1937. Το µεγαλύτερο µέρος των στελεχών επιζεί στη χαµηλή παστερίωση (30 σε 60 ο C) και σε παρατεινόµενη κατάψυξη, επίσης αναπτύσσονται σε υλικά που περιέχουν ορυκτά άλατα, όπως χλωριούχο βάριο (Laplace et el., 1996), και αντέχουν επί µακρόν σε αναερόβιες συνθήκες και σε ph < 5. Η διάσπαση των σακχάρων αποτελεί ένα ακόµη κριτήριο φαινοτυπικών διαφορών για την τυποποίηση των εντεροκόκκων. Η οξείδωση του υλικού παρουσία γλυκογόνου είναι συνήθως αρνητική για τους εντερόκοκκους και θετική για τους άλλους στρεπτόκοκκους, αντίθετα, η διάσπαση της L-αραβινόζης µπορεί να είναι θετική σε αρκετά είδη εντεροκόκκων αλλά δεν είναι στους στρεπτοκόκκους. εν υπάρχουν όµως φαινοτυπικά κριτήρια που να επιτρέπουν το διαχωρισµό του γένους των εντεροκόκκων από άλλα γένη gram- θετικών και καταλάση-αρνητικών βακτηρίων. Μερικά είδη δεν αναπτύσσονται σε συνθήκες που θεωρούνται απαραίτητες για το γένος. Π.χ., ο E. durans, δεν αναπτύσσεται στους 50 ο C όπως ο E. faecium (Farrow et al., 1983). O E. dispar δεν αναπτύσσεται σε 45 ο C και οι E. 6

cecorum και columbiae δεν πολλαπλασιάζονται στους 10 ο C (Devriese et al., 1993). 3α) Φαινοτυπικοί και βιοχηµικοί χαρακτήρες του είδους Τα κύτταρα του εντεροκόκκου είναι σφαιρικά ή ωοειδή. Το µέγεθος ποικίλει από 0,6-2 µm, έως 0,6-2,5 µm, δηµιουργούν αλυσίδες κοντές ή πιο µακριές και µερικές φορές παρουσιάζονται ως διπλόκοκκοι (Holt, 1994). ε διαθέτουν έλυτρο και βλεφαρίδες, είναι ακίνητα (εκτός των E. gallinarum και E. casseliflavus που σε ορισµένες συνθήκες είναι κινητά), (Farrow et al., 1983, Collins et al., 1986). ιασπούν ένα µεγάλο αριθµό υδατανθράκων (Πίν. ΙΙ). Αυτός ο καταβολισµός της γλυκόζης σε υλικά µε ph 4,2-4,6 οδηγεί στην παραγωγή κυρίως γαλακτικού οξέος [L(+)] χωρίς παραγωγή αερίου, πλην των ειδών Ε. malοdoratus και E. casseliflavus που παράγουν αέριο. Οι εντερόκοκκοι διαθέτουν ενζυµικό σύστηµα ικανό να αντιδράσει µε το Ο 2, όπως η οξειδάση του NADH και η οξειδάση της γλυκεροφωσφατάσης, που ανιχνεύθηκαν στον E. faecalis και στον E. faecium το 1962 (Hoskin et al., 1962). 7

Πίν. ΙΙ: Κυριότερες δοκιµασίες για το διαχωρισµό ειδών εντεροκόκκου ΕΙ ΟΣ Αιµόλυση Bes 6,5% Ara Ado Man Lac Raf Suc Sor Sac NaCl E. faecalis α, β, καµία + + - - + V/+ - + V/+ + E. faecium α, β, καµία + + + - V/+ + V/- V V V E. dispar α, καµία + + - - - + + + - + E. avium α, καµία V/+ + + + + + - + + + E. gallinarum α, β, + + + - + + V/+ + V/- + E. durans α, β, + + - - V/- + - - - - E. hirae - + + - - - + V V/+ - + E. mundii καµία + + + - + + V/+ + V + E. pseudoavium α V/+ + - + + + - + + - E. maleodoratus καµία + + - + + + + + + + Bes= υδρόλυση εσκουλίνης σε υλικό µε χολή, 6,5% NaCl= ανάπτυξη σε υλικό µε NaCl 6,5%, V= ποικίλλει η αντίδραση Αra= ιάσπαση Αραβινόζης, Ado= ιάσπαση Αδονιτόλης, Man= ιάσπαση Μαννιτόλης, V/+ συνήθης θετική Lac= ιάσπαση λακτόζης, Raf= ιάσπαση Ραφινόζης, Suc= ιάσπαση Σουκρόζης, V/- συνήθης αρνητική Sor= ιάσπαση Σορβιτόλης, Sac= ιάσπαση Σακχαρόζης 8

Τα στελέχη E. casseliflavus, E. flavescens και ο E. mundii παράγουν µια κίτρινη χρωστική. Η ορολογική τυποποίηση των εντεροκόκκων τους κατατάσσει στην οµάδα D κατά Lancefield, όµως και αυτός ο χαρακτήρας δεν είναι καθολικός σε όλα τα στελέχη. Ο E. cecorum, o E. columbae, o E. dispar και ο E. saccharolyticus δεν αντιδρούν µε τον αντι-d ορό (Devriese, 1993). 4. Enterococcus faecalis O E. faecalis διαθέτει όλες τις χαρακτηριστικές ιδιότητες του γένους, δεν διαθέτει έλυτρο, είναι ακίνητο βακτήριο ενώ η πεπτιδική αλυσίδα της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώµατος αποτελείται από L-Lys-D-Ala 2-3 αντί της L-Lys-D-Asp που είναι για τα άλλα είδη του γένους. Αυτή η ουσία C ή πολυσακχαριδικό αντιγόνο, ανιχνεύεται στο 80% των ανθρωπίνων στελεχών του E. faecalis (Devriese et al., 1993). Ο E. faecalis έχει περιεκτικότητα σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης στο DNA 37-40%. Το πρότυπο στέλεχος ATCC 19433, διαθέτει ένα ποσοστό GC 38,6% (Schleifer et Kilpper, 1984, Hall, L.M. et al., 1992). Τα περισσότερα στελέχη δεν αναπτύσσονται σε θερµοκρασία >45 ο C, δεν αναστέλλονται από το τελλουριώδες κάλιο (0,04%) και διασπούν το 2, 3, 5- Τριφενυλοτετραζόλιο. 4α) Λοιµογόνες ιδιότητες Ο έλεγχος της λοιµογόνου δύναµης των εντεροκόκκων αναφέρθηκε το 1899, την ίδια χρονιά που αποµονώθηκε ο µικροοργανισµός (Thiercelin, 1899). Η πρώτη συστηµατική µελέτη των ιδιοτήτων του λοιµογόνου παράγοντα του 9

εντεροκόκκου ήταν η µελέτη της κυτταρολυσίνης ή αιµολυσίνης από τον Todd, το 1934. 4.α 1. Ανταλλαγή γενετικού υλικού στους εντεροκόκκους Πολλοί εντεροκοκκικοί λοιµογόνοι παράγοντες εδράζονται σε πλασµίδια, που µεταφέρονται µε σύζευξη. Η ευκολία µε την οποία αυτά τα στοιχεία διασπείρονται οριζόντια µεταξύ στελεχών σε ένα φυσικό περιβάλλον, όπως στο γαστρεντερικό σύστηµα, προσδιορίζει τη συχνότητα µε την οποία παθογόνα χαρακτηριστικά και γονίδια αντοχής σε αντιβιοτικά διασπείρονται σε δυνητικά λιγότερο λοιµογόνο ενδογενή χλωρίδα (Clewell et al., 1990, Schaberg et al., 1986). Με τον ίδιο τρόπο, µηχανισµοί τροποποίησης γονιδίων που συµβαίνουν φυσικά, αποτελούν τη βάση έκφρασης της λοιµογόνου δράσης. Οι εντερόκοκκοι έχουν τη δυνατότητα ανταλλαγής του γενετικού υλικού µεταξύ τους ή και µε άλλα γένη βακτηρίων (Clewell et al., 1990). Αυτό γίνεται µέσω πλασµιδίων και τρανσποζονίων. Πλασµίδια που είναι υπεύθυνα για φερορµόνες είναι µοναδικά στους εντεροκόκκους. Αυτά τα πλασµίδια µεταφέρονται µε µεγάλη συχνότητα µεταξύ εντεροκόκκων που αποικίζουν στερεές ή υγρές επιφάνειες, και in vivo σε ανθρώπους και ζώα (Clewell, 1993). Πολλά πλασµίδια µεταφέρονται µε χαµηλή συχνότητα, σε ένα µεγάλο εύρος ξενιστών, όπως µεταξύ εντεροκόκκων, Streptococcus spp, Staphylococcus aureus, Lactobacillus spp, Bacillus subtilis και άλλων ειδών (Clewell, 1990). Τέλος, η ανταλλαγή γονιδίων συµβαίνει µεταξύ µεταθετών στοιχείων, των τρανσποζονίων (transposons), που βρίσκονται σε Gram-θετικά και Gram-αρνητικά βακτήρια (Scott, 1992). Ένα τρανσποζόνιο, το Tn1545, µεταφέρεται από 10

τον E. faecalis στη L. monocytogenes στο γαστρεντερικό σύστηµα των ποντικιών (Doucet-Populaire, 1991). Άλλος γνωστός µηχανισµός φυσικής ανταλλαγής γονιδίων για τους εντερόκοκκους, είναι αυτός µέσω µόλυνσης µε υπολοιµογόνους βακτηριοφάγους (Caprioli, 1975). 4.α 2. ιείσδυση σε ιστούς του ξενιστή Βακτηριαιµία και βακτηριακή µετατόπιση (translocation) Οι εντερόκοκκοι είναι σήµερα το τρίτο κατά σειρά αίτιο συχνότητας νοσοκοµειακής βακτηριαιµίας στις Η.Π.Α. (Webb M. et al., 2001). Ενώ πολλά περιστατικά οφείλονται σε απροσδιόριστες πηγές, όπως η ενδοφλέβια χρήση καθετήρων, τα αποστήµατα, ή οι ουρολοιµώξεις και ένα µεγάλο ποσοστό λοιµώξεων έχει ως πηγή το γαστρεντερικό σύστηµα (Alexander et al., 1990). Σύµφωνα µε το µοντέλο βακτηριακής µετατόπισης, βακτήρια του αυλού προσκολλώνται σε επιθηλιακά κύτταρα του γαστρεντερικού ή σε ενδοεπιθηλιακά µακροφάγα. Τα βακτήρια φθάνουν στα επιθηλιακά κύτταρα ή µεταναστεύουν µέσω των φαγοκυττάρων στους µεσεντέριους λεµφαδένες, πολλαπλασιάζονται και αιµατογενώς µεταφέρονται σε αποµακρυσµένες θέσεις (Vollaard et al.,1994). Μερικά παρεντερικώς χορηγούµενα αντιβιοτικά µε µικρή αντιεντεροκοκκική δράση, όπως οι κεφαλοσπορίνες, είναι γνωστό ότι προκαλούν προδιάθεση για εντεροκοκκική λοίµωξη (Zervos et al., 1988) και συνδέονται µε ανάπτυξη εντεροκοκκικής βακτηριαιµίας (Huycke et al., Axelrod et al., 1989). Οι Wells και συν. επεκτάθηκαν σε µελέτες που συνδέουν τη χρήση αντιβιοτικών µε αύξηση της ανάπτυξης εντεροκόκκων στο έντερο, και περιέ- 11

γραψαν ένα µοντέλο εντεροκοκκικής µετατόπισης σε ένα άθικτο εντερικό επιθήλιο ποντικιών (Wells et al., 1990). 4β) Ένζυµα Ο E. faecalis διαθέτει ένα ενζυµικό σύστηµα ικανό να αντιδράσει µε το οξυγόνο. Είναι η περίπτωση της NADH οξειδάσης και της οξειδάσης της γλυκεροφωσφατάσης, ένζυµα τα οποία διαθέτει και ο E. faecium (Hoskin et al., 1962, Huycke Μ. et al.,1997). Παράγει µια δισµουτάση του υπεροξειδίου, η οποία εξουδετερώνει την τοξικότητα του Ο 2 (Βritton et al., 1978). ιασπά την καζεΐνη, ενώ ζυµώνει τη λακτόζη γεγονός το οποίο συµβάλλει στην ωρίµανση ορισµένων τυριών (Ηegazi, 1989). O E. faecalis χρησιµοποιείται ως προζύµη για την επεξεργασία των τυριών cheddar και mozzarella (Coppolla et al., 1988). 4γ) Τοξίνες Η πρώτη συστηµατική µελέτη της λοιµογόνου δύναµης των εντεροκόκκων ήταν η µελέτη της κυτταρολυσίνης ή αιµολυσίνης από τον Todd (1934). Η παραγωγή κυτταρολυσίνης (cytolysin) από τον E. faecalis φαίνεται από την παρουσία διαυγούς ζώνης αιµόλυσης γύρω από τις αποικίες σε αιµατούχο άγαρ. Η παραγωγή αυτής της κυτταρολυσίνης σε ορισµένα υλικά και όχι σε όλα δεν είναι γνωστή και είναι το πρόβληµα που επιχειρούν να εξηγήσουν διάφορες µελέτες. Ερυθροκύτταρα από κουνέλια, ανθρώπους, άλογα και αγελάδες όχι όµως προβάτου, λύονται από την κυτταρολυσίνη του E. faecalis και µπορούν να χρησιµοποιούνται για την ταυτοποίηση αυτού του φαινοτύπου. Ο γενικός όρος κυτταρολυσίνη προτιµάται από τον ιστορικό όρο «αιµολυσίνη», επειδή τα 12

κύτταρα στόχος δεν είναι µόνο ερυθρά αιµοσφαίρια αλλά περιλαµβάνονται και άλλα ευκαρυωτικά ή προκαρυωτικά κύτταρα (Bassinger et al., 1968). Αυτές οι παρατηρήσεις αναπτύχθηκαν διεξοδικά από τον Stark (1960), όταν καθένα από 16 β-αιµολυτικά στελέχη βρέθηκε ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη των περισσοτέρων gram-θετικών, αλλά όχι gram-αρνητικών βακτηρίων (Stark et al., 1960). Oι Brock και συν., (1963) διαπίστωσαν επίσης πως η κυτταρολυτική και βακτηριολυτική δράση χάνονταν αυτόµατα από µερικά στελέχη E. faecalis µετά από έκθεση σε ακτινοβολία και επανέρχονταν µε αναστροφή. Μελέτες από τον Granato και Jackson (1960) και στις αρχές της 10ετίας του 70, έδειξαν ότι η κυτταρολυσίνη του E. faecalis υπήρχε στη φύση µε δυο συστατικά, το ένα ονοµάσθηκε L για τη λυσίνη και το άλλο Α για τον ενεργοποιητή. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η κυτταρολυσίνη του E. faecalis µοιάζει µε µια νέα γενιά αντιβιοτικών, µια οµάδα µικρών εκκρινόµενων πρωτεϊνών µε βακτηριοκτόνο ιδιότητα ενάντια gram-θετικών παθογόνων, όπως οι σταφυλόκοκκοι, στρεπτόκοκκοι, και τα προπιονοβακτηρίδια (Schnell et al., 1988, Eaton T.J. et al., 2001). Στελέχη τα οποία παράγουν την κυτταρολυσίνη έχει βρεθεί ότι προξενούν βαριές βλάβες σε µολυσµένους ιστούς και παρεγχυµατικά όργανα του ασθενούς, ακόµη και αν λαµβάνουν τη σωστή αντιµικροβιακή και αντιφλεγµονώδη θεραπεία. Έχει αποδειχθεί ότι τα στελέχη τα οποία παράγουν κυτταρολυσίνη έχουν ισχυρή λοιµογόνο ικανότητα. Ο κυτταρολυτικός φαινότυπος προσδιορίζεται στους εντερόκοκκους από δυνάµενα να µεταφερθούν πλασµίδια (Dunny et al., 1975, Ike Y., et al., 1987). Αρχικά, τα πλασµίδια που κωδικοποιούν τις κυτταρολυσίνες ανήκαν στην οµάδα IncHly (Colmar et al., 1987). Βρέθηκαν 13

όµως κυτταρολυτικά πλασµίδια και σε άλλες οµάδες ασυµβατότητας. Το πιο γνωστό πλασµίδιο που κωδικοποιεί την κυτταρολυσίνη είναι το pad1. 4δ) Πρωτεΐνη συγκόλλησης (Aggregation substance AS) Η πρωτεΐνη AS, είναι µια πρωτεΐνη επιφανείας του E. faecalis της οποίας η σύνθεση προάγεται από την παρουσία φυλετικών φερορµονών και ορού του ανθρώπου, συµβάλλει στη συγκόλληση των βακτηρίων, και εποµένως στη µεταφορά γενετικού υλικού µε σύζευξη. Σε πειράµατα in vitro έχει βρεθεί ότι παίζει ρόλο στην προσκόλληση του βακτηρίου στην επιφάνεια των ευκαριωτικών κυττάρων (Leonard B.A. et al.,1997). Από άλλους ερευνητές αποδείχθηκε ότι µπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή του καρδιακού µυός και του πνευµονικού παρεγχύµατος. Προάγει επίσης τη σύνδεση του E. faecalis στα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα και την ενδοκυττάρια επιβίωση των βακτηρίων (Hirt H. et al., 2000, Cucarella C. et al., 2001). Αυξάνει τον υδρόφοβο χαρακτήρα των βακτηρίων και αναστέλλει ή καθυστερεί το σχηµατισµό φαγολυσοσώµατος (Nallapareddy S.R. et al., 2000). H AS συνδέεται και σε κύτταρα του εντερικού επιθηλίου, ενώ φαίνεται ότι έχει συνεργική δράση µε την κυτταρολυσίνη όσον αφορά την παθογόνο δύναµη του E. faecalis. 4ε) Λιποτειχοϊκό οξύ Το λιποτειχοϊκό οξύ του κυτταρικού τοιχώµατος στον εντερόκοκκο ταυτίζεται µε το αντιγόνο D (Wicken et al., 1963). Συνδέει ερυθροκύτταρα ανθρώπου και το λιποτειχοϊκό οξύ του S. pyogenes (Beachey, et al., 1979). 14

Όταν συνδέεται µε ευκαρυωτικά κύτταρα, διατηρεί την αντιγονική του ιδιότητα, έτσι αυτά τα κύτταρα λύονται, όταν εκτεθούν σε πλάσµα µε την ενεργοποίηση του συµπληρώµατος (Hummell et al., 1986). Το λιποτειχοϊκό οξύ των Gram-θετικών βακτηρίων προάγει την παραγωγή ιντερλευκίνης-1β, ιντερλευκίνης-6, και TNF-α σε καλλιέργειες ανθρωπίνων µονοκυττάρων (Hummell D., 1986). Καθαρό λιποτειχοϊκό οξύ από E. faecalis αναστέλλει τη συσσώρευση βακτηρίων που προάγεται από φερορµόνες (Ehrengeed E., 1986). 4ζ) Φερορµόνες Οι φερορµόνες είναι µικρά πεπτίδια µε 7-8 αµινοξέα που εκκρίνονται από τον E. faecalis και προάγουν τη σύζευξη και τη µεταφορά πλασµιδιακού DNA µεταξύ των εντεροκόκκων (Muscholl-Silberhorn A.B., 1999). Είναι κωδικοποιη- µένα στο χρωµόσωµα και ονοµάζονται έτσι επειδή προσελκύουν κύτταρα-δότες που µεταφέρουν πλασµίδια. Τυπικά, πολλές φερορµόνες εκκρίνονται συνεχώς από ένα στέλεχος E. faecalis. Κάθε πλασµίδιο υπεύθυνο για φερορµόνες κωδικοποιεί ένα εκκρινόµενο πεπτίδιο, που δρα ως ανταγωνιστής της αντίστοιχης φερορµόνης. Μερικές φερορµόνες και οι αναστολείς τους παίζουν συµπληρω- µατικούς ρόλους στη χηµειοταξία ουδετεροφίλων, προκαλούν έκκριση ενζύµων και πνευµονική νόσο (Ember et al., 1989). Οι φερορµόνες cam373 και cpd1 θεωρούνται χηµειοτακτικοί παράγοντες (Tomita H., et al., 1997, Sannomiya et al., 1990). Oι φερορµόνες δρουν και ως επαγωγείς γονιδίων που κωδικοποιούν την παραγωγή τοξινών στους εντεροκόκκους (Dunny G.M., 1975). 15

4η) Πρωτεάση, υαλουρονιδάση Άλλα προϊόντα που συνδέονται µε τους εντερόκοκκους αλλά έχουν λιγότερο µελετηθεί είναι η πρωτεάση ή ζελατινάση και η υαλουρονιδάση. Οι εντερόκοκκοι που παράγουν υαλουρονιδάση περιγράφηκαν από τους Rosan & Williams (1964) σε µελέτες για µικροοργανισµούς που προκαλούν περιοδοντική νόσο (Nallapareddy S. et al., 2000). Στελέχη τα οποία δεν παράγουν τα ένζυµα αυτά, είναι λιγότερο παθογόνα σε πειραµατικά µοντέλα (Singh K. et al., 1998). 4θ) Εξωκυττάριο υπεροξείδιο (Superoxide) Η παραγωγή του εξωκυτταρίου υπεροξειδίου συνδέεται άµεσα µε στελέχη τα οποία προξενούν βακτηριαιµίες και εν τω βάθει λοιµώξεις (Huycke M.M., et al., 1997). 4ι) Εξωκυττάρια πρωτεΐνη επιφανείας (Extracellular Surface Protein, Esp) Η Esp µία πρωτεΐνη επιφανείας η οποία αρχικά είχε ανιχνευθεί µόνο σε στελέχη E. faecalis, πρόσφατα όµως βρέθηκε ότι συντίθεται και από στελέχη E. faecium (Shankar V. et al., 1999). Στελέχη τα οποία εκφράζουν την Esp προξενούν λοιµώξεις στον ανθρωπο κυρίως βακτηριαιµίες, ενώ ανιχνεύεται σπανιότερα σε στελέχη της φυσιολογικής µικροβιακής χλωρίδας. Σε µελέτες in vitro, φαίνεται ότι παίζει επίσης ρόλο στην προσκόλληση του βακτηρίου σε προσθετικά υλικά και καθετήρες προάγοντας τη δηµιουργία βιοµεµβρανών και εποµένως προστατεύοντας τα βακτήρια από την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή και από τα αντιβιοτικά (Joyanes P. et al., 2000, Alejandro Toledo et al., 2001). 16

4κ) Επιφανειακοί υδατάνθρακες οκιµασίες αναστολής της προσκόλλησης των βακτηρίων in vitro µε τη χρήση D-µαννόζης, D-γλυκόζης, L-φουκόζης και D-γαλακτόζης, εµπλέκουν τους επιφανειακούς υδατάνθρακες στη σύνδεση των βακτηρίων µε τα κύτταρα στις καλλιέργειες (Guzman et al., 1991, Xu.Y. et al., 2000). Η προσκόλληση που γίνεται µε τους υδατάνθρακες επιφανείας διευκολύνεται από µερικές προσκολλητίνες, όπως οι πρωτεΐνες As και Esp. Μια άλλη πιθανή τέτοια προσκολλητίνη είναι το λιποτειχοϊκό οξύ (Shankar V. et al., 1997). 5. E. faecium Το 1919, ο Orla-Jensen έδωσε το όνοµα Streptococcus faecium σε ένα βακτήριο που αποµόνωσε από κόπρανα. Ο ερευνητής, ανέφερε ότι «έχει πολύ µεγάλη αντοχή και κανένα στέλεχος απ όσα είχαµε δεν χάθηκε όλα τα χρόνια που το διατηρούσαµε, µπορεί να αναπτυχθεί σε ένα µεγάλο εύρος θερµοκρασίας, πρακτικά δηλ. µπορεί να επιβιώσει οπουδήποτε στον κόσµο», και διαπίστωσε ότι ο S. faecium αντέχει σε θερµοκρασίες 70-75 ο C (Orla-Jensen, 1919). Ο Sherman (1937) πίστευε ότι, ο S. faecium του Orla-Jensen (1919), ήταν ο S. faecalis, όµως ο S. faecium του Orla-Jensen (1919) διέφερε από τον S. faecalis σε πολλά σηµεία. Ο E. faecium αναπτύσσεται στους 50 ο C, ενώ τα περισσότερα στελέχη του Ε. faecalis δεν αναπτύσσονται σε Θ > 45 ο C και ακόµη ο E. faecium έχει µεγαλύτερη αντοχή σε αυξηµένη συγκέντρωση αλάτων. Ο E. faecium διασπά την αραβινόζη και µελιβιόζη, ενώ σπάνια διασπά την σορβιτόλη και τη γλυκερόλη. Ο E. faecium αναστέλλεται από το τελλουριώ- 17

δες κάλιο (0,04%), δε διασπά το 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride και έχει ανάγκη το φυλλικό οξύ (Skadhange, 1950). ιαθέτει τα ένζυµα οξειδάση του NADH και την οξειδάση της γλυκεροφωσφατάσης τα οποία έχει και ο Ε. faecalis (Hoskins et al., 1962). Πρόσφατα βρέθηκε ότι έχει και την ικανότητα σύνθεσης Esp και ζελατινάσης (Joyanes P. et al., 2000). Η µικροβιαιµία από E. faecium διαφέρει από τη µικροβιαιµία από Ε. faecalis και εµφανίζει µεγαλύτερη θνησιµότητα, προσβάλλει δε ανοσοκατασταλ- µένους ασθενείς που έχουν πάρει αντιβιοτικά (Webb M. et al., 2001, Torell E. et al., 2003). Το 1988, ο Warren, αναγνώρισε για πρώτη φορά ότι ο E. faecium προκαλεί συχνότερα από τον Ε. faecalis µικροβιαιµία σε ασθενείς που έχουν υποστεί µεταµόσχευση ήπατος, διαπίστωση που έχει επιβεβαιωθεί (Torell E. et al., 1999, Wade et al., 1995). Aν και οι εντερόκοκκοι µπορούν να αποικίσουν το στόµα, το γεννητικό σύστηµα του θήλεος και την ουρήθρα, και στα δυο φύλα, δεν είναι σίγουρο πως οι θέσεις αυτές αποτελούν κύριες περιοχές αποικισµού για τον E. faecium. Παρά τις πολλές µελέτες της χλωρίδας του εντέρου σε υγιείς ενήλικες, οι διαφορές µεταξύ των ανθρώπων κάνουν δύσκολη τη διαπίστωση αν ο Ε. faecalis είναι συχνότερος ένοικος του εντέρου από τον E. faecium ή το αντίθετο (Chenoweth et al., 1990). 18

6. Λοιµώξεις από εντερόκοκκους Οι εντερόκοκκοι, µέλη της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας ανθρώπων και ζώων, είναι υπεύθυνοι για σοβαρές νοσοκοµειακές λοιµώξεις. Αποτελούν σήµερα το δεύτερο κατά σειρά συχνότητας αίτιο λοίµωξης χειρουργικών τραυ- µάτων και νοσοκοµειακών ουρολοιµώξεων και το τρίτο αίτιο νοσοκοµειακών βακτηριαιµιών στις Η.Π.Α. (Low D.E. et al., 2001) ενώ σχετίζονται µε το 5% έως 15% των περιπτώσεων µικροβιακής ενδοκαρδίτιδας, (Donlan R.M. et al., 2002). Η φυσική δυνατότητα των εντεροκόκκων να αποκτούν, να συσσωρεύουν και να διασπείρουν εξωχρωµοσωµικά στοιχεία που κωδικοποιούν λοιµογόνες ιδιότητες ή γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά, δίνει πλεονεκτήµατα για την επιβίωσή τους κάτω από περιβαλλοντικό στρες και εν µέρει εξηγεί την αυξανό- µενη σηµασία τους ως νοσοκοµειακά παθογόνα (Murray et al., 1998). Προσβάλλουν κυρίως το ουροποιητικό, το ενδοκάρδιο, το αίµα, την κοιλιακή χώρα, τα χοληφόρα, ενώ προκαλούν λοιµώξεις µετά από εγκαύµατα και καθετηριασµούς (Eliopoulos G.M., 1992). Οι εντερόκοκκοι έγιναν γνωστοί ως αίτιο ενδοκαρδίτιδας πριν από έναν περίπου αιώνα και πρόσφατα αναγνωρίσθηκαν ως αίτιο νοσοκοµειακών λοιµώξεων και υπερλοιµώξεων σε ασθενείς που παίρνουν αντιβιοτικά, (Buers K.E. et al., 2001). Οι εντεροκοκκικές βακτηριαιµίες (πρωτοπαθείς ή δευτεροπαθείς) οδηγούν σε σήψη και θάνατο σε ποσοστό που φθάνει ως και 50% (Stoser V. et al., 1998). Συχνά αποικίζουν τους Τ σωλήνες (Kehr) και προκαλούν ηπατικές και χολαγγειακές λοιµώξεις σε ασθενείς µε µεταµόσχευση ήπατος (Murray, 1990). Από το γένος των εντεροκόκκων, συχνότερα αποµονώνεται ως αίτιο λοιµώξεων ο E. faecalis, ακολουθούµενος από τον E. faecium. Τα τελευταία όµως χρόνια παρατηρείται µια αυξανόµενη συχνότητα αποµόνωσης του E. 19

faecium από διάφορα κλινικά δείγµατα (Webb M.N. et al.,2001, Torell et al., 2003). Η εµφάνιση στα τέλη της δεκαετίας του 1980 στελεχών εντεροκόκκων ανθεκτικών στις πενικιλλίνες, αµινογλυκοσίδες και τα γλυκοπεπτίδια, άρχισε να αποτελεί σοβαρό πρόβληµα για τη θεραπευτική αντιµετώπιση της λοίµωξης. Η αντοχή των εντεροκόκκων στη βανκοµυκίνη επιταχύνθηκε τα τελευταία 5 µε 10 χρόνια. Ποσοστό 15% των αποµονωθέντων από νοσοκοµειακές βακτηριαιµίες εντεροκόκκων στις ΗΠΑ είναι ανθεκτικοί στη βανκοµυκίνη. Ο E. faecium είναι πολύ συχνότερα ανθεκτικός στη βανκοµυκίνη από τον E. faecalis (Bishoff W.E. et al., 1999). Παράγοντες κινδύνου για την απόκτηση ανθεκτικών στη βανκοµυκίνη εντεροκόκκων (Vancomycin Resistant Enterococci, VRE), περιλαµβάνουν την προηγηθείσα χρήση αντιβιοτικών, τη διάρκεια παραµονής στο νοσοκοµείο και τη σοβαρότητα της νόσου. Παράγοντες κινδύνου για βακτηριαιµία από VRE περιλαµβάνουν την ουδετεροπενία, τον αποικισµό του γαστρεντερικού και την αιµατολογική κακοήθεια. 7. Εντερόκοκκοι στο περιβάλλον Οι εντερόκοκκοι διασπείρονται στο περιβάλλον µε τα κόπρανα ανθρώπων και ζώων και µε οικιακά απόβλητα. Το 1905, ο Gordon ανακοίνωσε την αποµόνωση κοπρανωδών στρεπτοκόκκων µαζί µε «Bacillus coli» από ένα ζω- µό που ήταν εκτεθειµένος στον αέρα και θεωρήθηκε ότι η πηγή ήταν αναµφίβολα κόπρανα αλόγων, που µεταφέρονταν µε τις µπότες από τους δρόµους. Το 1904, ο Houston παρατήρησε αφθονία κοπρανωδών στρεπτοκόκκων στους υπονόµους και διατύπωσε την άποψη ότι θα µπορούσαν να 20

αποτελέσουν χρήσιµο στοιχείο για τον προσδιορισµό της µόλυνσης του νερού µε ανθρώπινα κόπρανα. Η αναγνώριση των εντεροκόκκων µαζί µε τα κολοβακτηριοειδή (coliforms) ως δείκτες µόλυνσης των νερών και των τροφίµων ήταν γνωστή από το πρώτο ήµισυ του αιώνα. Η επιλογή των εντεροκόκκων ως δείκτη µόλυνσης του νερού έγινε αναγκαία αργότερα (Buttiau, 1959), αφού τα κόπρανα των ανθρώπων και των χοίρων περιέχουν πάντα εντεροκόκκους, ενώ το 80-90% των δειγ- µάτων περιέχει κολοβακτηριοειδή. Εισερχόµενοι από την στοµατική κοιλότητα του ανθρώπου σε µικρό αριθµό 10 3 βακτήρια ανά gr τροφής (Jay, 1986), καθώς βρίσκονται στον εντερικό βιότοπο, πολλαπλασιάζονται και αποβάλλονται µε τα κόπρανα σε ποσότητες 10 5-10 8, πολλάκις έως και 10 9 /gr (Duncan H.E., et al, 1995). Η ανθεκτικότητα των εντεροκόκκων σε διαδικασίες απολύµανσης είναι περίπου διπλάσια από εκείνης της E. coli. Η γνώση σχετικά µε την πιθανή πηγή των διαφορετικών ειδών εντεροκόκκων, δίνει την προοπτική να είµαστε ικανοί να ανιχνεύουµε τις πηγές της µόλυνσης από κόπρανα και να διακρίνουµε ανάµεσα στην ανθρώπινη (αποχετευτικά απόβλητα) και τη ζωική µόλυνση. Στον Πίν. ΙΙΙ παρουσιάζεται η εντερική προέλευση ειδών του γένους εντεροκόκκου. Πίν. ΙΙΙ: Εντερική προέλευση ειδών του γένους εντεροκόκκου ΕΙ ΟΣ E. faecium E. faecalis E. durans E. avium E. gallinarum E. hirae E. cecorum E. columbae ΕΝΤΕΡΙΚΗ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ Άνθρωπος, βοοειδή, χοίροι, πτηνά Άνθρωπος, βοοειδή, χοίροι, πτηνά Άνθρωπος, χοίροι, πτηνά Άνθρωπος, βοοειδή, χοίροι, πτηνά Άνθρωπος, βοοειδή, χοίροι, πτηνά Άνθρωπος, βοοειδή, χοίροι, πτηνά Βοοειδή, χοίροι, πτηνά Βοοειδή, χοίροι, πτηνά 21

Τα είδη E. faecalis και E. faecium είναι αυτά που πιο συχνά αποµονώνονται από τον άνθρωπο. Ο Ε. faecium είναι το είδος που προέχει στα πτηνά και χοιρινούς. Από τα κόπρανα βοοειδών αποµονώνεται συχνότερα ο Ε. faecalis και ακολουθεί ο Ε. faecium (Devriese et al., 1992α). Τα φυτά και το έδαφος αποτελούν υπόστρωµα για τον E. casseliflavus, τον E. mundii και για τα είδη Ε. faecium και Ε. faecalis (Mund, 1982). O E. faecalis, συναντάται τυχαία µέσα στο γάλα και τα παράγωγά του (Batish et al., 1984). Χάρη στις ιδιότητες των εντεροκόκκων, δηλαδή την ανάπτυξη σε ένα µεγάλο φάσµα θερµοκρασίας, την ανθεκτικότητα στο αλάτι, τη διάσπαση της καζεΐνης και τη ζύµωση της λακτόζης, βρίσκονται σε σκεύη που έρχονται σε επαφή µε το γάλα και τα παράγωγά του και δεν καθαρίζονται καλά. Όµως, η ανάπτυξή τους είναι αργή σε θερµοκρασία δωµατίου και έτσι περιορίζεται η συχνότητα µόλυνσης. Η διατήρηση καλής ποιότητας τροφίµων και του νερού, αποτελεί µεγάλο σύγχρονο πρόβληµα, γι αυτό και τα νερά διαφορετικής προέλευσης υπόκεινται, µε το πέρασµα του χρόνου σε λεπτοµερή έλεγχο και µικροβιολογική ανάλυση (Ramos-Cormenzana et al., 1994, Sinton et al., 1994). Η έννοια των οργανισµών που λειτουργούν ως δείκτες στη µικροβιολογία του νερού έχει ήδη καθιερωθεί και έχει δώσει το πλαίσιο για την εκτίµηση της µικροβιολογικής ποιότητας του νερού. Η οµάδα των βακτηρίων «coli-forms» κολοβακτηριοειδή γενικά και ειδικά η E. coli έχει βρει παγκόσµια εφαρµογή ως δείκτη για τηνµόλυνση από κόπρανα (Waite, 1991). Πολλές άλλες οµάδες όµως 22

έχουν χρησιµοποιηθεί ως δείκτες για τη µόλυνση του νερού από κόπρανα, όπως εντερόκοκκοι, κλωστηρίδια (C. perfrigens), κ.α. Ο Ostrolenk το 1947, και ο Burton το 1949, αναφέρουν τουλάχιστον τρία πλεονεκτήµατα που διαθέτουν οι εντερόκοκκοι ως δείκτες µόλυνσης του νερού. Ι. εν πολλαπλασιάζονται στο νερό, ενώ αυτό συµβαίνει µερικές φορές µε τα κολοβακτηριοειδή. ΙΙ. Είναι σε µικρότερη συγκέντρωση στα κόπρανα απ ότι τα κολοβακτηριοειδή, (ελάχιστη σχέση 1:4), αυτή η σχέση αντανακλά τη µόλυνση από ανθρώπινα κόπρανα. ΙΙΙ. Επιζούν στο υδάτινο περιβάλλον για πιο µεγάλο χρονικό διάστηµα απ ότι τα κολοβακτηριοειδή, δηλώνουν έτσι µια παλιά µόλυνση. Στην Ελλάδα, οι πρώτες µικροβιολογικές εξετάσεις των θαλάσσιων νερών άρχισαν το 1957, η συστηµατική όµως εξέταση άρχισε το 1962, οπότε συστάθηκε ειδική επιτροπή του Υπουργείου Υγείας µε αυτό το αντικείµενο (Παπαπετροπούλου Μ., 1995). Η ρύπανση της θάλασσας µπορεί να προκληθεί είτε από απόρριψη λυµάτων σ αυτή ή απευθείας από τα σώµατα των κολυµβητών. Η αναγκαιότητα της χρησιµοποίησης αυτών των µετρήσεων έγινε όλο και πιο επιτακτική, καθώς µε την εξέλιξη της µικροβιολογίας και επιδηµιολογίας επιβεβαιώνονται οι υποψίες ότι υπάρχει σχέση µεταξύ της µόλυνσης των θαλάσσιων νερών µε κόπρανα και της εµφάνισης διαφόρων νόσων στους κολυµβητές. Οι λοιµώξεις των ανθρώπων που συνδέονται µε µικροβιακή ρύπανση της θάλασσας αποτελούν τις λεγόµενες θαλασσογενείς λοιµώξεις, λοιµώξεις δηλαδή των οποίων πηγή είναι η θάλασσα (Mosely, 1974). Έρευνα του ΕΡΑ (Environnemental Protection Agency), το 1983 έδειξε ότι ο κίνδυνος γαστρεντερίτιδας σε άτοµα που κολυµπούν σε νερά που έχουν 23

ρυπανθεί µε αστικά λύµατα εξαρτάται από την περιεκτικότητα των νερών αυτών σε εντερόκοκκο (Cabelli et al., 1984). Σ αυτές τις περιπτώσεις, η γαστρεντερίτιδα στον άνθρωπο εµφανίζεται µετά από έκθεση σε χαµηλές συγκεντρώσεις εντεροκόκκου, περίπου 10/100 ml νερού και σχετίζεται µε τη λήψη 1-5 εντεροκόκκων, από κατάποση 10-15 ml νερού που περιέχει 10 εντεροκόκκους/100 ml. ιατυπώθηκε επίσης η άποψη ότι τα κριτήρια για τα θαλάσσια νερά, δεν µπορεί να ισχύουν και για τα γλυκά νερά. Η µικροβιακή καταλληλότητα του πόσιµου νερού ελέγχεται µε την κατα- µέτρηση των µικροβιακών δεικτών. Οι δείκτες αυτοί είναι αλλόχθονοι µικροοργανισµοί οι οποίοι περνούν παροδικά µέσα στο υδάτινο οικοσύστηµα, προερχόµενοι συνήθως από το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου και των ζώων. Οι συχνότερα χρησιµοποιούµενοι σήµερα δείκτες είναι τα ολικά κολοβακτηριοειδή, τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή και οι κοπρανώδεις εντερόκοκκοι (Παπαπετροπούλου Μ., 1995). Επί πλέον, οι εντερόκοκκοι φαίνεται να είναι καλύτεροι δείκτες µόλυνσης των τροφίµων που διατηρούνται σε χαµηλές θερµοκρασίες (Burton, 1949). 7.α. Επιβίωση και αντοχή στο δυσµενές περιβάλλον Οι εντερόκοκκοι διαθέτουν µεγάλες αντιστάσεις έναντι σε ποικιλία δύσκολων συνθηκών και γενικά πιο µεγάλη ανθεκτικότητα από άλλα µεσόφιλα βακτήρια. Πέρα από τις φυσικές αντοχές, έχουν τη δυνατότητα να αυξάνουν τις αντιστάσεις όταν έρχονται αντιµέτωποι µε συνθήκες πίεσης (stress). 24

Η απάντηση στις δύσκολες συνθήκες, µπορεί να χαρακτηρισθεί ως φαινοτυπική προσαρµογή στις αλλαγές του περιβάλλοντος και είναι γρήγορη και παροδική. Τα βακτήρια έχουν την ικανότητα να αναπτύσσουν µηχανισµούς επιβίωσης σε συνθήκες «stress», όπως π.χ. αυτές που υφίστανται πολλά βακτήρια στο θαλάσσιο περιβάλλον όπως ακατάλληλη θερµοκρασία, επίδραση τοξικών ουσιών, ανταγωνισµός µε άλλα βακτήρια, έλλειψη οξυγόνου, εποχιακές και γεωγραφικές µεταβολές του θαλάσσιου νερού (Roszak, 1987). Το µικροβιακό κύτταρο βρίσκεται σε µια δυναµική κατάσταση και προσαρµόζεται εύκολα στις µεταβολές των περιβαλλοντικών συνθηκών µε ανάλογη προσαρµογή των γενετικών και φαινοτυπικών χαρακτήρων του, όπως, τροποποίηση της σύνθεσης των ενζύµων του και αλλαγή των πρωτεϊνών της κυτταροπλασµατικής του µεµβράνης (Harder W. et al., 1983). Oι Heinmets και συν. παρατήρησαν ότι η µεταβολική και βιοσυνθετική δραστηριότητα συνεχίζεται σε συνθήκες «stress», δε γίνεται όµως πολλαπλασιασµός των µικροβιακών κυττάρων (Heinmets F. et al., 1993). Αυτό το φαινόµενο αποκαλείται «µη ισόρροπη ανάπτυξη» και χαρακτηρίζεται από προαγωγή της σύνθεσης RNA και πρωτεϊνών, ενώ η σύνθεση του DNA παροδικά αναστέλλεται, οπότε η µικροβιακή µάζα αυξάνεται και έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση του µεγέθους του κυττάρου χωρίς να διαιρείται (Drlika K., 1984). Πλασµίδια και τρανσποζόνια, εξασφαλίζουν τα πλεονεκτήµατα των εντεροκόκκων να επιβιώνουν σε ασυνήθη περιβάλλοντα. Οι εντερόκοκκοι είναι βακτήρια που υπάρχουν παντού, από τον εντερικό σωλήνα στο έδαφος, από νερό ή κόπρανα σε έναν ιστό διασποράς όπου τα 25

βακτήρια εισέρχονται χάρις στις ιδιότητες προσκόλλησης που διαθέτουν (Kreft, 1992). Η ποικιλία των αντιδράσεων των εντεροκόκκων, βρίσκεται πίσω από τη µεγάλη διασπορά τους. Κοινό βακτήριο, απειλητικό για τον άνθρωπο, ο εντερόκοκκος, καταλαµβάνει σήµερα µια πρωταρχική θέση στην Μικροβιολογία και Επιδηµιολογία. 8. Αντοχή των εντεροκόκκων στα αντιβιοτικά Τα τελευταία χρόνια, οι εντερόκοκκοι αποκτούν αυξανόµενη αντοχή σε ένα ευρύ φάσµα αντιβιοτικών (Low D.E. et al., 2001). Η αύξηση των νοσοκοµειακών λοιµώξεων που προκαλούν οι εντερόκοκκοι ιδιαίτερα ο E. faecium οφείλεται τουλάχιστον εν µέρει σε µια µεγάλη ποικιλία ενδογενών και επίκτητων αιτιών αντοχής (Murray B.E., 1998). Η ανάπτυξη υψηλού επιπέδου αντοχής στις αµινογλυκοσίδες, στις πενικιλλίνες και στα γλυκοπεπτίδια (βανκοµυκίνη και τεϊκοπλανίνη) µεµονωµένα ή σε συνδυασµό µεταξύ τους έχει µεγάλη κλινική σηµασία. Κύριοι µηχανισµοί αντοχής στα αντιβιοτικά των εντεροκόκκων 8.α. Ενδογενής αντοχή Η ενδογενής αντοχή είναι µια συγγενής ιδιότητα ενός βακτηριακού γένους ή είδους. Οι εντερόκοκκοι, είναι ενδογενώς ανθεκτικοί στα β-λακταµικά αντιβιοτικά, τις αµινογλυκοσίδες και τις σουλφοναµίδες. 26

8.α 1 β-λακτάµες Η ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) της πενικιλλίνης G, αµπικιλλίνης, αµοξικιλλίνης, πιπερασιλλίνης και ιµιπενέµης για τους εντεροκόκκους είναι 10-100 φορές µεγαλύτερη από εκείνη των στρεπτόκοκκων. Η αντοχή των εντεροκόκκων σχετίζεται µε την παρουσία πρωτεϊνών που συνδέονται µε β-λακταµικά αντιβιοτικά (PBPs-Penicillin Binding Proteins), και εµφανίζουν ελαττωµένη τάση σύνδεσης µε αυτά (Williamson R. et al., 1985). Ειδικότερα, οι εντερόκοκκοι εκφράζουν την PBP5 µε πολύ χαµηλή συγγένεια προς τις β-λακτάµες. Επί πλέον τα δραστικά β-λακταµικά δεν είναι βακτηριοκτόνα για την πλειοψηφία των στελεχών. Χαµηλή βακτηριοκτόνος δράση παρατηρείται επίσης και σε άλλα αντιβιοτικά που δρουν στο κυτταρικό τοίχωµα, όπως τα γλυκοπεπτίδια. Η αντοχή στις κεφαλοσπορίνες είναι ακόµη µεγαλύτερη και καθιστά αυτά τα αντιβιοτικά αναποτελεσµατικά in vivo. 8.α 2. Αµινογλυκοσίδες Όλα τα στελέχη E. faecium παράγουν µια 6-ακετυλοτρανφεράση των αµινογλυκοσιδών, που κωδικοποιείται από το χρωµοσωµικό γονίδιο aac (6 )1, και τροποποιεί τις περισσότερες αµινογλυκοσίδες που υπάρχουν στο εµπόριο, όπως γενταµυκίνη, τοµπραµυκίνη, νετιλµικίνη, αµικασίνη και καναµυκίνη (Costa Υ. et al., 1993). Η χαµηλού επιπέδου αντοχή στις αµινογλυκοσίδες (MIC<500 mg/l) οφείλεται στην ύπαρξη φραγµού στη δίοδο του αντιβιοτικού ενδοκυττάρια. Η ταυτόχρονη χορήγηση πενικιλλίνης αυξάνει το ρυθµό πρόσληψης των αµινογλυκοσιδών και τις καθιστά δραστικές. 27

Ο συνδυασµός των β-λακταµικών ή των γλυκοπεπτιδίων µε τις αµινογλυκοσίδες εξασφαλίζει βακτηριοκτόνο συνέργεια, αν και η MIC των αµινογλυκοσιδών γενικά κυµαίνεται από 8 mg/l έως 64 mg/l. Αυτή η χαµηλού βαθµού αντοχή στις αµινογλυκοσίδες, είναι επίσης µια ενδογενής ιδιότητα των εντεροκόκκων. 8.α 3. Γλυκοπεπτίδια Χαµηλή ενδογενή αντοχή έναντι της βανκοµυκίνης, εµφανίζουν ορισµένα µερικά είδη εντεροκόκκου που δύσκολα αποµονώνονται, όπως οι E. gallinarum, o E. casseliflavus και ο E. flavescent (Reid et al., 2001). Τα γονίδια για την αντοχή στα γλυκοπεπτίδια vanc 1 για τον E. gallinarum και vanc 2 για τον E. casseliflavus και τον E. flavescent είναι ειδικά γι αυτά τα είδη (Clark N. et al., 1998). 8.α 4. Σουλφοναµίδες και Τριµεθοπρίµη Όταν εξετάζονται in vitro και σε κατάλληλες συνθήκες, όπως είναι τα υλικά χωρίς θυµιδίνη η οποία αναστέλλει τη δράση της κο-τριµοξαζόλης, οι εντερόκοκκοι είναι ευαίσθητοι σε αυτά τα αντιβιοτικά. Όµως, κάτω από ειδικές περιστάσεις, οι εντερόκοκκοι µπορούν να χρησιµοποιήσουν εξωγενές φυλλικό οξύ, που βρίσκεται στα ούρα µερικές φορές. Έτσι, µπορούν να ξεφύγουν της αναστολής ανάπτυξης από παράγοντες που ανταγωνίζονται το φυλλικό και µπορούν να αναπτύξουν αντοχή in vivo σε αυτά τα αντιβιοτικά. Αυτός ο µηχανισµός είναι υπό αµφισβήτηση, διότι έχει αποδειχθεί για τον E. faecium αλλά δεν είναι σαφές αν ισχύει για τον E. faecalis, αν και η κο-τριµοξαζόλη δεν 28

ήταν αποτελεσµατική στη θεραπεία πειραµατικής ενδοκαρδίτιδας από E. faecalis σε πειραµατόζωο (κουνέλι) (Grayson M.L. et al., 1990). 8β) Επίκτητη αντοχή 8.β 1 β-λακταµικά Η επίκτητη αντοχή στα β-λακταµικά αντιβιοτικά οφείλεται στη σύνθεση β- λακταµάσης ή στην τροποποίηση της ΡΒΡ που είναι ο στόχος του αντιβιοτικού. Αν και οι δυο µηχανισµοί έχουν ανιχνευθεί στον E. faecalis και στον E. faecium, δεν εκδηλώνονται στον ίδιο βαθµό. Τα στελέχη E. faecalis που παράγουν β- λακταµάση, αποµονώθηκαν για πρώτη φορά το 1981 στις ΗΠΑ και ταυτόχρονα στην Αργεντινή και στο Λίβανο (Murray B.E., 1992). H αντοχή που οφείλεται στη σύνθεση του ενζύµου, είναι σπάνια για τον E. faecium. Η αντοχή που οφείλεται στην παραγωγή β-λακταµάσης, είναι πλασµιδιακή και συχνά συνδέεται µε υψηλού βαθµού αντοχή στη γενταµυκίνη (Murray B.E., 1992). Η β-λακταµάση είναι µια πενικιλλινάση µε µεγάλου βαθµού οµολογία µε αυτή που είναι κωδικοποιηµένη στο γονίδιο blaz του S. aureus (Zscheck K. et al., 1991). Σε αντίθεση µε αυτή του S. aureus, η πενικιλλινάση του E. faecalis παράγεται συνεχώς, πιθανώς λόγω της απουσίας κατασταλτικής πρωτεΐνης. (Smith M.Ι. et al., 1992). Αν και έχει αναφερθεί διασπορά των εντεροκόκκων που παράγουν β-λακταµάση αυτού του τύπου, η αντοχή παρατηρείται σε περιορισµένη έκταση, και δεν έχει σχέση µε την αύξηση της αντοχής των εντεροκόκκων στην πενικιλλίνη. (Murray B.E., 1998). Αυτή η αύξηση οφείλεται κυρίως στη διασπορά των πενικιλλίνη-ανθεκτικών E. faecium που δεν παράγουν β-λακτα- 29

µάση. Η αντοχή αυτών των στελεχών οφείλεται στην τροποποίηση των PBP s, ειδικά στην υπερπαραγωγή µιας προϋπάρχουσας ΡΒΡ που έχει χαµηλή συγγένεια µε τα β-λακταµικά αντιβιοτικά. Αυτός ο µηχανισµός µελετήθηκε για πρώτη φορά στον E. hirae (Ligozzi et al., 1993). Στα στελέχη που αποµονώθηκαν στο εργαστήριο, ανιχνεύθηκε η ΡΒΡ5 µε χαµηλή συγγένεια και είχε σχέση µε το επίπεδο αντοχής στην πενικιλλίνη. Η MIC της πενικιλλίνης ήταν σχεδόν ίση µε αυτή των β-λακταµικών που απαιτείται για την αποδόµηση της PBP5 (Fontana et al., 1985). Αυτά τα στελέχη αναπτύσσονται φυσιολογικά παρουσία συγκεντρώσεων πενικιλλίνης που διασπούν όλες τις PBPs, εκτός από την ΡΒΡ5, γεγονός που αποδεικνύει ότι όταν η ΡΒΡ5 υπερπαράγεται, µπορεί να υποκαταστήσει όλες τις λειτουργίες που κάνουν όλες οι άλλες PBPs στο κύτταρο. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η αλληλουχία των αµινοξέων στην ΡΒΡ5 του E. hirae εµφανίζει 33% οµολογία µε την ΡΒΡ2α που είναι υπεύθυνη για την αντοχή στη µεθικιλλίνη στους σταφυλόκοκκους (El Kharroubi et al., 1991). Τα στελέχη που είναι πενικιλλίνη-ανθεκτικά µπορούν εύκολα να επιλεγούν in vitro ανάµεσα στα διάφορα είδη εντεροκόκκου, συµπεριλαµβανοµένου του E. faecalis (Al Obeid S. et al., 1990). Εν τούτοις, µόνο ένας περιορισµένος αριθµός πενικιλλίνη-ανθεκτικών κλινικών στελεχών έχει αναφερθεί, συµπεριλαµβανοµενου του E. faecium. Κλινικά στελέχη E. faecium παρουσιάζουν διαφόρου βαθµού αντοχή στην πενικιλλίνη, µε MIC από 8 mg/l έως 512 mg/l. Στα στελέχη E. faecium µε µεγάλη αντοχή, ο µηχανισµός της αντοχής στην πενικιλλίνη αποδίδεται στην υπερπαραγωγή της ΡΒΡ5. Περαιτέρω τροποποιήσεις στη δοµή της ΡΒΡ5 που οδηγούν σε µεγαλύτερη µείωση της πενικιλλινοδεσµευτικής ικανότητας, φαίνεται 30

πως είναι υπεύθυνες για τη µεγάλου βαθµού αντοχή στην πενικιλλίνη (Fontana et al., 1994). 8.β 2. Αµινογλυκοσίδες Οι εντερόκοκκοι αποκτούν αντοχή στις αµινογλυκοσίδες µε τρεις µηχανισµούς: α) µεταβολή στη θέση στόχο του ριβοσώµατος, β) παρέµβαση στη µεταφορά του αντιβιοτικού, και γ) ενζυµική διάσπαση του αντιβιοτικού. Οι πρώτοι δυο µηχανισµοί οφείλονται σε χρωµοσωµικές µεταλλάξεις, ενώ ο τρίτος µηχανισµός κωδικοποιείται σε πλασµίδια (Courvalin P. et al., 1990, Grayson M.L. et al., 1991). Σε κλινικά στελέχη εντεροκόκκου, η υψηλού βαθµού αντοχή (MIC > 1000 mg/l), οφείλεται σε ένζυµα που τροποποιούν τις αµινογλυκοσίδες. Σε ορισµένα στελέχη E. faecalis, η αντοχή στη στρεπτοµυκίνη µπορεί επίσης να οφείλεται σε ριβοσωµικές µεταλλάξεις (Eliopoulos et al., 1994, Leclercq R. et al., 1994). Ένζυµα τροποποιητικά των αµινογλυκοσιδών προκαλούν υψηλού βαθ- µού αντοχή στις αµινογλυκοσίδες και αντοχή στη συνέργεια µε τις πενικιλλίνες στους εντερόκοκκους και σταφυλόκοκκους (Joues R.N. et al., 1995). Πολλά ένζυµα έχουν περιγραφεί, όπως η αδενυλυτρανφεράση, η 3 φωσφοτρανσφεράση, 4 -νουκλεοτιδυλτρανσφεράση (σπάνια στους εντερόκοκκους) ή η 6 -ακετυλ-τρανσφεράση, 2 φωσφοτρανσφεράση (ΑΑC [6 ]-ΑΡΗ [2 ]. Το τελευταίο ένζυµο είναι µία πρωτεΐνη που έχει διπλή δράση και προκαλεί υψηλού βαθµού αντοχή, στη γενταµυκίνη και στις περισσότερες αµινογλυκοσίδες (Leclercq et al., 1997). 31

8.β 3. Γλυκοπεπτίδια Η επίκτητη αντοχή στη βανκοµυκίνη ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά το 1986 (Leclercq et al., 1988). Στελέχη εντεροκόκκου ανθεκτικά στη βανκοµυκίνη αναφέρθηκαν το 1988 (Leclercq et al., 1988). υο φαινότυποι, οι VanA και VanB µπορούν να διακριθούν µε βάση την αντιµικροβιακή δράση των γλυκοπεπτιδίων. Η αντοχή σε υψηλά επίπεδα στη βανκοµυκίνη (MIC 64 mg/l) και στην τεϊκοπλανίνη (MIC 16 mg/l) προσδιορίζει το φαινότυπο VanA (Leclercq et al., 1988). Η αντοχή αυτή οφείλεται συνήθως σε πλασµίδια. Τα στελέχη VanB έχουν αντοχή σε διάφορα επίπεδα βανκοµυκίνης (MIC 4 mg/l έως 1.000 mg/l) και είναι ευαίσθητα στην τεϊκοπλανίνη (Quintiliani R. et al., 1993). Αυτός ο διπλός τύπος φαινοτύπου οφείλεται στο γεγονός ότι η βανκοµυκίνη δρα ως επαγωγός, ενώ η τεϊκοπλανίνη όχι. Η χαµηλού και υψηλού βαθµού αντοχή µεταφέρεται µε σύζευξη σε ορισµένα στελέχη (Quintiliani R. et al., 1994). Η µεταφορά της αντοχής συνδέεται µε κινητοποίηση µεγάλου µεγέθους τρανσποζονίων (60-240 kb) από χρωµόσωµα σε χρωµόσωµα (Reynolds P.E., et al., 1994). H ανάλυση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στα γονίδια που ρυθµίζουν την αντοχή και τη λειτουργία των αντιστοίχων πρωτεϊνών στα στελέχη E. faecium BM 4147 τύπου VanA, µας έχουν δώσει πληροφορίες για το µηχανισµό αντοχής (Arthur M. et al., 1993). Τα υπεύθυνα για την αντοχή γονίδια µεταφέρονται µε το 10.8 kb transposon που ονοµάζεται Tn1546 (Quintiliani R. et al., 1996). Αυτό κωδικοποιεί 9 πολυπεπτίδια, τα δυο έχουν σχέση µε τη λειτουργία της µετάθεσης (ORF I και ORF II) ενώ τα άλλα επτά συνεργάζονται για την έκφραση της αντοχής στη βανκοµυκίνη (Arthur M. et al., 1997). Τα επτά πολύπεπτίδια που έχουν σχέση µε την αντοχή στην βανκοµυκίνη µπορούν να 32

χωριστούν σε τρεις λειτουργικές οµάδες: α) γονίδια που ρυθµίζουν την αντοχή στη βανκοµυκίνη (vanr και vans), β) γονίδια που ρυθµίζουν την αντοχή στα γλυκοπεπτίδια µε την παραγωγή ενός τροποποιηµένου στόχου (vanh, vana και vanx), και γ) βοηθητικές πρωτεΐνες που δεν είναι βασικές για την έκφραση της αντοχής στα γλυκοπεπτίδια (vany και vanz) (Arthur M. et al., 1997). Η διασπορά της αντοχής τύπου VanΑ στα κλινικά στελέχη φαίνεται ότι οφείλεται µάλλον στη διασπορά του Tn1546 ή άλλων σχετικών γονιδίων στα πλασµίδια που αυτοµεταφέρονται, παρά στην εξάπλωση ενός βακτηριακού κλώνου ή ενός µεµονωµένου πλασµιδίου (Woodford N. et al., 1998). Τα γονίδια van έχουν προσδιοριστεί µόνο στους εντερόκοκκους. Οι εντερόκοκκοι είναι γνωστό ότι µπορούν να ανταλλάξουν την αντοχή στην γενταµυκίνη ή στις µακρολίδες µε άλλα είδη Gram-θετικών οργανισµών µεσω πλασµιδίων που µεταφέρονται µε σύζευξη (Woodford N. et al., 1995, Hodel- Christian et al., 1991). Για το λόγο αυτό δεν είναι παράδοξο που µερικά πλασµίδια αντοχής στα γλυκοπεπτίδια έχουν πολλούς ξενιστές και µπορούν εύκολα να µεταφερθούν in vitro σε πολλά Gram-θετικά βακτήρια, όπως οι στρεπτόκοκκοι, ο Lactococcus lactis, η Listeria monocytogenes και ο S. aureus (Noble W. et al., 1992). Επιπλέον, οι εντερόκοκκοι τύπου VanA, είναι πολύ διαδεδοµενοι στη φύση και έχουν αποµονωθεί από κόπρανα υγιών φορέων, από ζώα και από φυτά που ποτίζονται µε απόνερα (Klare I., 1995, Ιversen, 2002). Η διασπορά του γονιδίου vanb είναι πιο περιορισµένη. Έχει βρεθεί στον E. faecium, στον E. faecalis και τελευταία και στον S. bovis (Ρoyart C. et al., 1997). Όταν αποκαλύπτονται GRE στελέχη (glycopeptide-resistant enterococci) σε νοσοκοµεία, αυτά ανήκουν συνήθως σε ένα κλώνο. Το γονίδιο vana έχει ανιχνευθεί στους εντερόκοκκους της φυσιολογικής µικροβιακής χλωρίδας των κο- 33