ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραµµα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρµογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες Κατεύθυνση: Μοριακή Βιολογία και Κυτταρογενετική ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Κλωνοποίηση και χαρακτηρισµός των γονιδίων clusterin-1 και clusterin-2 στην ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss irideus)» C A A T T A G T G T A C A A T C C A G C C G G T A A T A C A G A T C G T T G G A A T C C A A A G C G G A C T T C G Αδαµαντία Λόντου Βιολόγος Επιβλέπων: Ιωάννης Κ. Ζαρκάδης Επίκουρος Καθηγητής Πάτρα 2006

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραµµα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρµογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες Κατεύθυνση: Μοριακή Βιολογία και Κυτταρογενετική ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Κλωνοποίηση και χαρακτηρισµός των γονιδίων clusterin-1 και clusterin-2 στην ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss irideus)» Αδαµαντία Λόντου Βιολόγος Επιβλέπων: Ιωάννης Κ. Ζαρκάδης Επίκουρος Καθηγητής Πάτρα 2006

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράµµατος: Εφαρµογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες, µε κατεύθυνση: Μοριακή Γενετική - Κυτταρογενετική, υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή κ. Ι. Κ. Ζαρκάδη και αποτελεί ένα τµήµα της έρευνας που διεξάγεται στο χώρο αυτό. Αυτή η εργασία δε θα µπορούσε να ολοκληρωθεί, χωρίς τη συµβολή των ανθρώπων του διδακτικού και ερευνητικού προσωπικού των προκλινικών εργαστηρίων της Ιατρικής, οι οποίοι από την πρώτη στιγµή µε περιέβαλαν µε αγάπη και έδειξαν προθυµία να µου µεταδώσουν τις γνώσεις τους, σε ένα περιβάλλον δηµιουργικό και ευχάριστο. Ένα µεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον επιβλέποντα καθηγητή µου κ. Γιάννη Ζαρκάδη, για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε µε την ανάθεση αυτής της εργασίας και για την πολύτιµη καθοδήγησή του και τις ιδέες του στο σχεδιασµό των πειραµάτων. Αλλά πάνω απ όλα τον ευχαριστώ, γιατί είναι για µένα πρότυπο ανθρώπου και επιστήµονα, που µε στήριξε ουσιαστικά και µε συµβούλεψε πατρικά, στις δύσκολες στιγµές της πορείας µου στο εργαστήριο και όχι µόνο. Ευχαριστώ πολύ την κα. Αδαµαντία Παπαχατζοπούλου, Λέκτορα και την κα. Ζωή Λυγερού, Επίκουρο Καθηγήτρια, αφενός για τη συµβολή και τις εύστοχες παρατηρήσεις τους, ως µέλη της εξεταστικής µου επιτροπής και αφετέρου για την εκτίµηση που έδειξαν στο πρόσωπό µου και την αισιοδοξία που µου ενέπνεαν. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα µέλη της ερευνητικής οµάδας τη φίλη µου Μαρία Χονδρού, µε την οποία µοιραστήκαµε προσωπικές και ερευνητικές εµπειρίες όλα τα χρόνια των σπουδών µας και τον Τάσο Παπαναστασίου, για την εποικοδοµητική και ευχάριστη συνεργασία που είχα µαζί τους. Η βοήθεια που µου προσέφεραν και η ενθάρρυνση που µου έδιναν ήταν πολύτιµες για µένα. Ακόµη, ευχαριστώ την Ντίνα Νικολακοπούλου, την Έρη Γεωργάκα και τον Πέτρο Κόκκινο για τις έµπειρες συµβουλές τους, καθώς και τον κ. Αντώνη Κόκκινο για την τεχνική του υποστήριξη. Τέλος, αισθάνοµαι την ανάγκη να ευχαριστήσω τα άλλα µέλη ΕΠ και τους µεταπτυχιακούς φοιτητές τόσο του Εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας, για την ηθική και υλική τους υποστήριξη, όσο και του Εργαστηρίου Φαρµακολογίας, που µε φιλοξένησε τον πρώτο χρόνο των σπουδών µου, και του Εργαστηρίου Βιολογικής Χηµείας για την ιδιαίτερη συµβολή του. Εύχοµαι σε όλους προσωπική ευτυχία και επιτυχία στους ερευνητικούς τους στόχους. Η εργασία αυτή αφιερώνεται στην οικογένειά µου, ως ελάχιστο δείγµα ευγνωµοσύνης για ό,τι έχουν κάνει για µένα. Χωρίς τη δική τους στήριξη, ίσως να µην είχα καταφέρει πολλά µέχρι τώρα. Αδαµαντία Λόντου Πάτρα, Νοέµβριος 2006 i

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ. 1 1.1 Ανοσία. 2 1.1.1 Φυσική Ανοσία..... 2 1.1.2 Προσαρµοστική Ανοσία... 3 1.2 Συµπλήρωµα... 4 1.2.1 Λειτουργίες Συµπληρώµατος.. 6 1.2.2 Συστατικά του συµπληρώµατος... 7 1.2.3 Οι οδοί ενεργοποίησης του συστήµατος του συµπληρώµατος. 10 Η κλασσική οδός.. 11 Η εναλλακτική οδός 12 Η οδός των λεκτινών 13 1.2.4 Η λυτική οδός.. 15 1.3 Εξέλιξη του Συπληρώµατος 17 1.3.1 Το συµπλήρωµα στους ιχθύες και την ιριδίζουσα πέστροφα. 19 1.4 Ρύθµιση του Συµπληρώµατος 21 1.5 Clusterin 24 1.5.1 Το γονίδιο. 24 1.5.2 Η πρωτεΐνη 25 1.5.3 Ρύθµιση και έκφραση της clusterin 27 1.5.4 Λειτουργικός ρόλος 30 1.5.5 Πιθανές κλινικές εφαρµογές της clusterin.. 34 1.5.6 Εξέλιξη της clusterin.. 35 1.6 Η ιριδίζουσα πέστροφα.. 35 1.7 Στόχος της εργασίας.. 37 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 39 2.Α ΥΛΙΚΑ 40 1 ιαλύµατα. 40 2 Θρεπτικά Υλικά 43 3 Ειδικά ιαλύµατα. 44 2.Β ΜΕΘΟ ΟΙ. 45 ii

1. Αποµόνωση νουκλεϊκών οξέων.. 45 1.1 Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA... 45 1.2 Αποµόνωση πλασµιδικού DNA (µέθοδος άλκαλι).. 46 1.3 Αποµόνωση πλασµιδικού DNA (mini preparation) µε προετοιµασµένα υλικά. 48 1.4 Αποµόνωση ζώνης DNA από πήκτωµα αγαρόζης.. 49 1.5 Αποµόνωση ολικού RNA από ιστό. 51 1.6 Συµπύκνωση RNA µετά από κατακρήµνιση.. 54 2. Ποσοτικός προσδιορισµός νουκλεϊκών οξέων. 55 2.1 Φωτοµετρικός προσδιορισµός.. 55 2.2 Προσδιορισµός µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης.. 56 3. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωµα αγαρόζης... 56 3.1 Ηλεκτροφόρηση DNA. 56 3.2 Ηλεκτροφόρηση RNA. 60 4. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) 62 5. Αντίδραση αντίστροφης µεταγραφάσης (RT-PCR)... 66 6. Κατάτµηση του DNA µε ένζυµα περιορισµού. 68 7. Αντίδραση συνδετάσης (ligation)... 70 8. Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων E.coli µε πλασµιδικό DNA.. 71 9. Υγρές καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων E.coli 73 10. Προσδιορισµός νουκλεοτιδικής αλληλουχίας DNA (Sequencing). 73 11. Σήµανση ανιχνευτή DNA (probe) µε τη µέθοδο των τυχαίων εκκινητών. 75 11.1 Αντίδραση σήµανσης 75 11.2 Καθαρισµός του σηµασµένου ανιχνευτή από τα µη ενσωµατωµένα νουκλεοτίδια... 76 12. Υβριδοποίηση νουκλεΐκών οξέων 77 12.1 Μεταφορά DNA σε φίλτρο και υβριδοποίηση (Southern blot)... 77 12.2 Mεταφορά RNA σε φίλτρο και υβριδοποίηση (Northern blot) 80 13. ιαλογή βιβλιοθήκης cdna.. 83 13.1 Ανάπτυξη βακτηριακού στελέχους Υ1090.... 83 13.2 ιαµόλυνση E.coli κυττάρων µε βακτηριοφάγους.. 84 13.3 Μεταφορά των βακτηριοφάγων σε φίλτρα. 84 13.4 Υβριδοποίηση των φίλτρων... 85 13.5 Επιλογή θετικών κλώνων..... 85 iii

13.6 Αποµόνωση µοναδικής πλάκας βακτηριοφάγων... 86 13.7 Έλεγχος των θετικών κλώνων. 86 14. Λογισµικά προγράµµατα ανάλυσης νουκλεοτιδικών και αµινοξικών αλληλουχιών. 86 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.. 90 3.1 ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ CLUSTERIN-1 ΣΤΗΝ ΙΡΙ ΙΖΟΥΣΑ ΠΕΣΤΡΟΦΑ 91 3.1.1 Αποµόνωση κλώνων cdna 91 1. Σχεδιασµός εκκινητών. 91 2. Κλωνοποίηση του 3 άκρου του cdna του γονιδίου TCLU-1. Αποµόνωση κλώνου #1 (850 bp) 92 3. Σχεδιασµός νέων εκκινητών 96 4. Αποµόνωση κλώνου #2 (527 bp) 97 5. Σύνθεση των κλώνων και δοµική µελέτη της συναγόµενης αµινοξικής αλληλουχίας 98 3.1.2 Αποµόνωση γονιδιωµατικών κλώνων.. 101 1. Επιλογή εκκινητών.. 101 2. Αποµόνωση κλώνου #1 (951 bp) 102 3. Αποµόνωση κλώνου #2 (2.043 bp). 104 4. Σύνθεση των κλώνων.. 106 3.1.3 Μελέτη του γονιδίου CLU-1 στο επίπεδο του γονιδιώµατος της πέστροφας 107 1.1.4 Μελέτη της ιστικής έκφρασης, σε επίπεδο mrna, του γονιδίου CLU-1 στην πέστροφα. Ανάλυση µε RT-PCR. 109 3.2 ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ CLUSTERIN-2 ΣΤΗΝ ΙΡΙ ΙΖΟΥΣΑ ΠΕΣΤΡΟΦΑ 111 3.2.1 Επιλογή εκκινητών.. 111 3.2.2 Αποµόνωση cdna κλώνου (373 bp). 111 3.2.3 Αποµόνωση γονιδιωµατικού κλώνου (596 bp).. 114 3.2.4 Μελέτη του γονιδίου CLU-2 στο επίπεδο του γονιδιώµατος της πέστροφας 116 3.2.5 Μελέτη της ιστικής έκφρασης, σε επίπεδο mrna, του γονιδίου CLU-2 στην πέστροφα. 118 3.3 ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΥΝΑΓΟΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΟΞΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ ΤΩΝ cdnas ΤΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ TCLU-1 ΚΑΙ TCLU-2 ME TA ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑ ΜΟΡΙΑ ΑΛΛΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΏΝ 120 iv

3.4 ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΗΣ CLUSTERIN.. 121 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 123 5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 129 ABSTRACT.. 131 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 134 v

1. Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η

1.1 ΑΝΟΣΙΑ Οι περισσότεροι ζωικοί οργανισµοί έχουν αναπτύξει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης µηχανισµούς άµυνας έναντι των παθογόνων παραγόντων. Το οργανωµένο σύνολο των µηχανισµών αυτών άµυνας ενός οργανισµού αποτελεί το ανοσοποιητικό του σύστηµα. Συγκροτείται από εξειδικευµένα µόρια, κύτταρα και όργανα, τα οποία συνεργάζονται προκειµένου να εξασφαλίσουν την προστασία του οργανισµού από παθογόνους εισβολείς (π.χ. ιούς, βακτήρια, µύκητες) και κατά συνέπεια να διατηρήσουν την υγεία του. Η αντίσταση που παρέχεται µέσω των µηχανισµών του ανοσοποιητικού συστήµατος ονοµάζεται ανοσία. ύο είναι οι βασικοί βραχίονες της ανοσίας: Η φυσική ή έµφυτη ανοσία (innate immunity) και η ειδική ή προσαρµοστική ανοσία (adaptive immunity). 1.1.1 Φυσική Ανοσία Η φυσική ανοσία υπάρχει σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισµούς. Είναι για τον οργανισµό η πρώτη γραµµή άµυνας, καθώς αντιµετωπίζει την είσοδο και τη διάδοση των παθογόνων µε φυσικούς φραγµούς. Οι φραγµοί αυτοί είναι: το δέρµα, οι βλεννογόνοι, οι εκκρίσεις και τα σωµατικά υγρά µε αντιβακτηριδιακές ιδιότητες (π.χ. το σίελο µε τη λυσοζύµη) και ακόµη οι διάφορες κινήσεις που διευκολύνουν την απόρριψη πολλών παθογόνων, όπως οι κινήσεις της αναπνευστικής και της πεπτικής οδού, ο βήχας και ο εµετός. Πέρα από τους φυσικούς φραγµούς, η φυσική ανοσία κινητοποιεί κι άλλους µηχανισµούς στην περίπτωση που κάποιοι µικροοργανισµοί εισέλθουν τελικά στο σώµα. Οι µηχανισµοί αυτοί είναι: Η φαγοκυττάρωση από τα φαγοκύτταρα του οργανισµού (ουδετερόφιλα, µονοκύτταρα αίµατος και µακροφάγα). Η οψωνινοποίηση. ιαδικασία που επιτελείται από τις λεγόµενες οψωνίνες, οι οποίες είναι πρωτεΐνες του πλάσµατος που προσδένονται σε βακτήρια και τα κάνουν πιο 2

δεκτικά στη φαγοκυττάρωση. Οψωνίνες αποτελούν και πολλά κλάσµατα των συστατικών του συµπληρώµατος. Φλεγµονή. Στη φλεγµονώδη διεργασία παρατηρείται συσσώρευση µορίων, όπως η οψωνίνες και χηµικών ουσιών, όπως η ισταµίνη, οι οποίες προσελκύουν χηµειοτακτικά λευκά αιµοσφαίρια και φαγοκύτταρα στην περιοχή της φλεγµονής. Λύση των παθογόνων µικροβίων. ιαµεσολαβείται από το σύστηµα του συµπληρώµατος το οποίο δηµιουργεί έναν πρωτεϊνικό πόρο στην κυτταρική µεµβράνη του µικροοργανισµού, µε αποτέλεσµα τη λύση και την άµεση εξουδετέρωσή του. Τα χαρακτηριστικά της φυσικής ανοσίας είναι τα εξής: 1) Είναι έµφυτη, δηλαδή υπάρχει από τη γέννηση. 2) Είναι µη ειδική, καθώς δρα έναντι ενός ευρέως φάσµατος παθογόνων. 3) εν αναπτύσσει ανοσολογική µνήµη λόγω επαναλαµβανόµενης επαφής του οργανισµού µε ορισµένο αντιγόνο. 4) Προηγήθηκε εξελικτικά της προσαρµοστικής και εκτιµάται ότι εµφανίστηκε µε τα πρωτοστόµια. 1.1.2 Προσαρµοστική Ανοσία Μετά την ενεργοποίηση της φυσικής ανοσίας, η δεύτερη γραµµή άµυνας των ανώτερων ζωικών οργανισµών είναι η προσαρµοστική ανοσία. Απαντάται µόνο στα σπονδυλωτά, µε εξαίρεση τους άγναθους ιχθύες [1]. Πρόκειται για ένα σύνολο πιο εξελιγµένων και πιο αποτελεσµατικών µηχανισµών του ανοσοποιητικού συστήµατος, σε σχέση µε αυτούς της φυσικής ανοσίας, µε τα εξής χαρακτηριστικά: 1) Είναι επίκτητος µηχανισµός άµυνας, δηλαδή αναπτύσσεται κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόµου. 2) Πρόκειται για ειδικό µηχανισµό ανοσίας, στον οποίο είτε παίζουν πρωτεύοντα ρόλο τα αντισώµατα, οπότε η ανοσία ονοµάζεται χυµική, είτε τα ενεργοποιηµένα Τ- 3

κύτταρα, οπότε η ανοσία ονοµάζεται κυτταρική. Βέβαια η ορολογική και η κυτταρολογική απόκριση είναι πάντα άρρηκτα συνδεδεµένες. 3) Παρέχει ανοσολογική µνήµη, η οποία συµβάλλει στην ταχύτερη και αποδοτικότερη απόκριση του οργανισµού σε ήδη «γνωστά» για αυτόν αντιγόνα. 4) Είναι εξελικτικά πρόσφατος µηχανισµός. Εκτιµάται ότι εµφανίστηκε µαζί µε τους χονδριχθύες. 1.2 ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ Το συµπλήρωµα πρωτοπεριγράφηκε από τον Ehrlich το 1899, ως ένας «θερµοευαίσθητος παράγοντας του ορού» που «συµπληρώνει» µη ειδικά την ειδική δράση των αντισωµάτων στη λύση των βακτηρίων. Αποτελεί εξαιρετικά συντηρηµένο µηχανισµό άµυνας [2] και η εµφάνισή του πιθανότατα συµπίπτει µε αυτή των δευτεροστοµίων, πριν από 800 εκατ. χρόνια περίπου [3]. Σήµερα είναι γνωστό ότι το συµπλήρωµα είναι ένα σύστηµα πρωτεϊνών και αποτελεί τον ακρογωνιαίο λίθο της φυσικής ανοσίας. Μάλιστα πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι εµπλέκεται και κατά την ενεργοποίηση της ειδικής ανοσίας [4,5]. Γνωρίζουµε ότι το συµπλήρωµα αποτελείται από 35 περίπου πρωτεΐνες, είτε διαλυτές είτε µεµβρανικές που εκφράζονται κυρίως, από ηπατοκύτταρα αλλά και µονοκύτταρα, ιστικά µακροφάγα και επιθηλιακά κύτταρα του γαστρεντερικού, νευρικού και ουροποιητικού συστήµατος. Οι περισσότερες από αυτές τις πρωτεΐνες βρίσκονται ως ανενεργά προένζυµα τα οποία ενεργοποιούνται µέσω πρωτεόλυσης πυροδοτώντας έναν καταρράκτη αντιδράσεων. Οι αντιδράσεις αυτές συγκροτούν τις τρεις οδούς ενεργοποίησης του συστήµατος του συµπληρώµατος, την κλασσική, την εναλλακτική και την λεκτινική οδό, που ενώ εκκινούν από διαφορετικά αίτια, καταλήγουν στη δηµιουργία του ίδιου συµπλόκου (ΜΑC) το οποίο επιφέρει λύση των παθογόνων µικροοργανισµών [6]. Παράλληλα, µια οµάδα από ρυθµιστικές πρωτεΐνες του πλάσµατος και της κυτταρικής µεµβράνης προστατεύει τα κύτταρα του ξενιστή από την αυτόλογη δράση του συµπληρώµατος. Οι ρυθµιστικές πρωτεΐνες παρεµβάλλονται σε όλα τα στάδια ενεργοποίησης του συµπληρώµατος. 4

Εικόνα 1.1: Συνοπτική απεικόνιση των τριών οδών ενεργοποίησης του συµπληρώµατος στα θηλαστικά. 5

1.2.1 Λειτουργίες Συµπληρώµατος Το σύστηµα του συµπληρώµατος επιτελεί τρεις ζωτικές λειτουργίες: 1. Συµµετέχει στην άµυνα εναντίον των λοιµώξεων. α) µέσω οψωνινοποίησης αντιγόνων και ανοσοσυµπλεγµάτων που προωθεί την φαγοκυττάρωσή τους. Η διαδικασία αυτή µεσολαβείται από υποδοχείς του συστήµατος στην επιφάνεια των φαγοκυττάρων. β) µέσω χηµειοταξίας και ενεργοποίησης των λευκοκυττάρων, παίζοντας το ρόλο αναφυλατοξινών. γ) µέσω λύσεως βακτηρίων και κυττάρων. 2. Συνδέει τη φυσική µε την προσαρµοστική ανοσία. α) ενισχύοντας την ανοσοβιολογική απάντηση µέσω αντισωµάτων. β) ενισχύοντας την ανοσοβιολογική µνήµη. γ) ρυθµίζοντας τους µηχανισµούς της προσαρµοστικής ανοσίας, αφού πρωτεΐνες του δεσµεύονται σε ειδικούς υποδοχείς της επιφάνειας των λεµφοκυττάρων και των θυλακοειδών δενδριτικών κυττάρων. 3. Βοηθά στην εναπόθεση άχρηστου υλικού. α) συµµετέχοντας στην απόσυρση ανοσοσυµπλεγµάτων από τους ιστούς του οργανισµού µετά το πέρας της ανοσοβιολογικής απόκρισης. β) συµµετέχοντας στην αποµάκρυνση κυττάρων που αποπίπτουν [5,7]. Ωστόσο, πέρα από τον παραδοσιακό ρόλο του συµπληρώµατος στην άµυνα του οργανισµού και την συµµετοχή του στην φλεγµονώδη αντίδραση, πρόσφατες µελέτες αποδίδουν στο συµπλήρωµα συµµετοχή και σε αναπτυξιακές διαδικασίες του οργανισµού. Φαίνεται να εµπλέκεται σε ρυθµιστικούς µηχανισµούς του κυττάρου, µέσω διαφορικής έκφρασης πολλών συστατικών του σε ιστούς και αναπτυξιακά στάδια. Η διαφοροποίηση κυττάρων στα πρώιµα στάδια ανάπτυξης, η διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων και η αναγέννηση ιστών και οργάνων αποτελούν λειτουργίες αναδυόµενες για το συµπλήρωµα [4]. 6

Ενεργοποίηση του συµπληρώµατος Αρχικά στάδια Τελικά στάδια Εικόνα 1.2: Η δράση του συµπληρώµατος στην άµυνα του οργανισµού. 1.2.2 Συστατικά του συµπληρώµατος Το συµπλήρωµα αποτελείται από πρωτεΐνες που κατανέµονται, ανάλογα µε τη λειτουργική τους εξειδίκευση, τόσο στο πλάσµα όσο και στην επιφάνεια των κυττάρων του αίµατος και άλλων ιστών. Τα συστατικά αυτά συνιστούν το 15% του κλάσµατος των σφαιρινών. Τα περισσότερα από τα συστατικά του συστήµατος παράγονται αρχικά σε ανενεργή, πρόδροµη µορφή και δρουν, είτε ως ένζυµα είτε ως υποδοχείς, µετά την ενεργοποίηση τους από άλλα µόρια. Η κατάτµηση ενός συστατικού του συστήµατος από το αντίστοιχό του ένζυµο αποµακρύνει ένα µικρό θραύσµα και το υπόλοιπο µόριο αντιδρά µε άλλα συστατικά του συστήµατος σχηµατίζοντας ενεργά σύµπλοκα. Κάποια από αυτά, µε την σειρά τους, θα δράσουν ως ένζυµα διαδοχικών αντιδράσεων. Συνολικά, η ενεργοποίηση του συστήµατος του συµπληρώµατος περιλαµβάνει έναν ενζυµικό καταρράκτη, στον οποίο το προϊόν της διάσπασης ενός προενζύµου αποτελεί το ένζυµο-καταλύτη της επόµενης αντίδρασης [8]. Τα µικρότερα θραύσµατα που αποµακρύνονται συνήθως δρουν ως αναφυλατοξίνες, συµµετέχοντας έτσι στην έναρξη της φλεγµονώδους αντίδρασης. Τελικά τα 7

πεπτιδικά θραύσµατα αλληλεπιδρούν προς σχηµατισµό συµπλόκων µε περαιτέρω ενζυµική ενεργότητα. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται όλες οι πρωτεΐνες που συµµετέχουν στον καταρράκτη των αντιδράσεων του συµπληρώµατος καθώς και οι ρυθµιστικές πρωτεΐνες που συντονίζουν την δράση του συστήµατος. Κάθε συστατικό χαρακτηρίζεται από ένα όνοµα (π.χ. MBL) ή έναν αριθµό (C1-9). Τα τµήµατα που προκύπτουν από την διάσπαση ενός συστατικού χαρακτηρίζονται ως α και β µε Τα β είναι τα µεγαλύτερα. Πίνακας 1.1: Οι πρωτεΐνες του συστήµατος του συµπληρώµατος. Κλασσική οδός. Πρόδροµο µόριο Ενεργό θραύσµα Λειτουργία C1q εσµεύεται σε συµπλέγµατα αντιγόνου-αντισώµατος C1(q,r,s) Ενεργοποιεί το C1r C1r Καταλύει την διάσπαση και ενεργοποίηση του C1s C1s Καταλύει την διάσπαση των C2 και C4, C2 C3 C4 C2a C2b C3a C3b C4a C4b Καταλύει την διάσπαση των C3 και C5, αφού ενωθεί µε το C4b (λειτουργία κοµβερτάσης) Άγνωστη Αναφυλατοξίνη- συµµετέχει στην φλεγµονώδη αντίδραση εσµεύεται στο C5 µετά την κατάτµηση από το C2b. Προσκολλάται στις κυτταρικές επιφάνειες και προάγει την οψωνινοποίηση και την ενεργοποίηση της κλασικής οδού. Aναφυλατοξίνη- συµµετέχει στην φλεγµονώδη αντίδραση. εσµεύεται στο C2 µετά την διάσπαση από το C1s. Προσκολλάται στις κυτταρικές επιφάνειες και προάγει την οψωνινοποίηση. Μετά την δέσµευσή του µε το C2a καταλύει την διάσπαση των C3 και C5 (λειτουργία κοµβερτάσης) Εναλλακτική οδός. Πρόδροµο µόριο Ενεργό θραύσµα Λειτουργία C3a Αναφυλατοξίνη- συµµετέχει στην φλεγµονώδη αντίδραση C3 C3b Προσκολλάται στις κυτταρικές επιφάνειες και προάγει την οψωνινοποίηση και την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού Βf εσµεύεται στις κυτταρικές επιφάνειες µέσω του C3b. ιασπάται από τον παράγοντα D. Παράγοντας B Βfa Άγνωστη 8

Bfb Μορφή που σταθεροποιείται από την προπερδίνη και µαζί µε το C3b ενεργοποιούν τα C3 και C5 (λειτουργία κοµβερτάσης). Παράγοντας D - ιασπά τον παράγοντα B µετά την δέσµευσή του στο C3b Λεκτινική οδός. Πρωτεΐνη MBL MASP1 MASP2 MASP3 Λειτουργία εσµεύεται σε υδατάνθρακες µικροβιακών κυττάρων και µαζί µε τις ΜASPs καταλύει την διάσπαση των C2 και C4. εσµεύεται στην MBL και καταλύει την διάσπαση του C2 Καταλύει απ ευθείας την διάσπαση του C3 εσµεύεται στην MBL και καταλύει την διάσπαση του C2 Καταλύει την διάσπαση του C4. Αδιευκρίνιστη. Τελικό σύµπλοκο λύσης της µεµβράνης (ΜΑC). C5 Πρωτεΐνη C5a Λειτουργία Αναφυλατοξίνη- συµµετέχει στην φλεγµονώδη αντίδραση C5b Ξεκινά την συγκρότηση του συµπλέγµατος λύσεως της µεµβράνης (MAC) C6 εσµεύεται στο C5b και αποτελεί υποδοχέα του C7. C7 C8 C9 Πρωτεΐνη C1 INH C4bp MCP Properdin Παράγοντας Ι Παράγοντας Η DAF CR1 εσµεύεται στο C5b6, εισέρχεται στην µεµβράνη και αποτελεί υποδοχέα του C8. εσµεύεται στο C5b67, ενεργοποιεί τον πολυµερισµό του C9. Πολυµερίζεται γύρω από το C5b678 και σχηµατίζει κανάλια που προκαλούν την λύση του κυττάρου. Ρυθµιστικές πρωτεΐνες. Λειτουργία Απενεργοποιεί τα C1r και C1s. Αποτελεί συµπαράγοντα του παράγοντα Ι στην κατάτµηση του C4b. Αποσταθεροποιεί την κοµβερτάση C3/C5 της κλασικής οδού. Αποτελεί συµπαράγοντα του παράγοντα Ι στην κατάτµηση του C4b. Αποσταθεροποιεί την εναλλακτική οδό. εσµεύει και σταθεροποιεί στην µεµβράνη το σύµπλεγµα C3bBb. Κατατέµνει τα C3b/ C4 παρουσία συµπαράγοντα Αποτελεί συµπαράγοντα του παράγοντα Ι στην κατάτµηση του C3b. Αποσταθεροποιεί την κοµβερτάση C3/C5 της εναλλακτικής οδού. Επιταχύνει την αποδόµηση της C3/C5 κοµβερτασης Λειτουργούν ως υποδοχείς για το C3b/C5b, ανασταλτικός ρόλος όµοιος των MCP και DAF. 9

CD59 Vitronectin Clusterin Απενεργοποιητές αναφυλατοξινών Aναστέλει την συγκρότηση του MAC στα κύτταρα του ξενιστή. Αναστέλλει το MAC Αναστέλλει το MAC Απενεργοποιούν τα C3α, C5a, C4α 1.2.3 Οι οδοί ενεργοποίησης του συστήµατος του συµπληρώµατος Η ενεργοποίηση του συµπληρώµατος επιτυγχάνεται µέσω τριών οδών: τη κλασσική (classical pathway), την εναλλακτική (alternative pathway) και την οδό των λεκτινών (lectin pathway). Το κλασικό και το εναλλακτικό ΚΛΑΣΙΚΗ ΛΕΚΤΙΝΙΚΗ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΗ µονοπάτι του συστήµατος Ο ΟΣ Ο ΟΣ Ο ΟΣ ενεργοποιούνται από σύµπλοκα αντιγόνου-αντισώµατος ή από τις επιφάνειες των µικρoβίων αντίστοιχα, ενώ στο λεκτινικό συµµετέχουν οι πρωτεΐνες MBL και MASP. Και οι τρεις οδοί οδηγούν στην ενεργοποίηση της λυτικής οδού και το σχηµατισµό του τελικού συµπλόκου λύσης της µεµβράνης (ΜAC), υπεύθυνου για την λύση των παθογόνων µικροοργανισµών [9]. Εικόνα 1.3: Το σύστηµα του συµπληρώµατος (µε κίτρινο χρώµα παριστάνονται τα ρυθµιστικά µόρια) 10

Η κλασσική οδός Η κλασσική οδός, το πρώτο µονοπάτι που µελετήθηκε, είναι µέρος της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης, διότι το έναυσµα για την ενεργοποίησή της αποτελεί ο σχηµατισµός ανοσολογικών συµπλόκων αντιγόνου αντισώµατος. Τα σύµπλοκα µπορεί να είναι είτε διαλυτά είτε προσδεδεµένα πάνω σε κύτταρο-στόχο. Ωστόσο έχει δειχτεί ότι η κλασσική οδός µπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί από πρωτεΐνες, όπως η C-reactive protein, ή ακόµη και απευθείας από κάποιους ιούς, βακτήρια και κύτταρα µολυσµένα από ιούς. Οι πρωτεΐνες που συµµετέχουν σε αυτή την οδό ονοµάζονται µε βάση την σειρά ανακάλυψής τους και όχι µε την σειρά που ενεργοποιούνται στην οδό. Εικόνα 1.4: Το πρώτο συστατικό του συµπληρώµατος C1. Το πρώτο συστατικό του συµπληρώµατος (C1) υπάρχει στον ορό ως ένα Ca 2+ -εξαρτώµενο πρωτεϊνικό σύµπλοκο, αποτελούµενο από 3 υποµονάδες: τη C1q (1 µόριο) και τις C1r και C1s (δύο µόρια) [10,11,12]. Η ενεργοποίηση της οδού ξεκινά όταν δεσµευµένες σε επιφάνειες µικροοργανισµών ανοσοσφαιρίνες ΙgM ή ΙgG δεσµεύουν το C1q µε την Fc περιοχή τους, γεγονός που οδηγεί σε αλλαγή της στερεοχηµικής διαµόρφωσης του συµπλόκου και τελικά στην ενεργοποίηση του C1s, της σερινοπρωτεάσης που αποκόπτεται από το σύµπλοκο[13]. H ενεργοποιηµένη πρωτεάση C1s αρχικά καταλύει την διάσπαση του C4 σε C4a και C4b (που δεσµεύεται οµοιοπολικά στην επιφάνεια των κυττάρων µέσω µιας ελεύθερης θειοεστερικής οµάδας που διαθέτει) και κατόπιν την διάσπαση του C2 σε C2a και C2b. Η διάσπαση του C2 από την σερινοπρωτεάση C1s, γίνεται µετά την πρόσδεση του C2 στο C4b. Ένα µόνο µόριο C1s µπορεί να καταλύσει την διάσπαση πολλών µορίων C4. Το ενζυµικό σύµπλοκο C4bC2a, που αποτελεί πια την κοµβερτάση του C3, καταλύει την διάσπαση του τρίτου συστατικού του συµπληρώµατος (C3) σε C3a και C3b. 11

Εικόνα 1.5: Η κλασσική οδός ενεργοποίησης του συµπληρώµατος. Το τρίτο συστατικό του συµπληρώµατος (C3) είναι µία από τις πρωτεΐνες που υπάρχει σε µεγάλη συγκέντρωση (1mg/ml) στον ορό και παίζει ένα κυρίαρχο ρόλο στην ενεργοποίηση του συµπληρώµατος [14,15]. Τα C4b και C3b δεσµεύονται στην επιφάνεια των κυττάρων µε οµοιοπολικό δεσµό µεταξύ µιας δικής τους θειοεστερικής οµάδας και µιας υδροξυλοµάδας ή µιας αµινοµάδας στην επιφάνεια του κυττάρου [16,17]. Μετά την δέσµευσή του, το C3b λειτουργεί σαν οψωνίνη (π.χ. προωθεί την φαγοκυττάρωση µε την δέσµευσή του σε ειδικούς υποδοχείς της επιφάνειας των φαγοκυττάρων) αλλά και µπορεί να ενωθεί µε το σύµπλοκο C4bC2a δηµιουργώντας την κοµβερτάση του C5 [18]. Η κοµβερτάση του C5 καταλύει την διάσπαση του C5 σε δύο θραύσµατα, τα C5a και C5b. Το µικρότερο θραύσµα C5a είναι µία αναφυλατοξίνη που συµµετέχει στην φλεγµονή προσελκύοντας φαγοκύτταρα στο σηµείο της µόλυνσης. Το µεγαλύτερο θραύσµα C5b ενώνεται µε το, ήδη δεσµευµένο στην επιφάνεια των µικροοργανισµών C3b, και επιτρέπει την έναρξη της αυτοσυγκρότησης του συµπλέγµατος λύσεως της µεβράνης (mebrane attact complex, MAC) από τα C6, C7, C8, C9 που δεσµεύονται διαδοχικά. Η σύνθεση του συµπλέγµατος οδηγεί στον σχηµατισµό καναλιών ή πόρων στην επιφάνεια των µικροοργανισµών, που οδηγεί τελικά στην λύση τους [19,20]. Η εναλλακτική οδός Σε αντίθεση µε την κλασσική οδό, η εναλλακτική οδός ενεργοποιείται άµεσα από ιούς, βακτήρια, µύκητες ή ακόµη και καρκινικά κύτταρα ενώ είναι ανεξάρτητη των αντισωµάτων. Η ενεργοποίηση πραγµατοποιείται όταν το θραύσµα C3b, που έχει προκύψει 12

από την διάσπαση του C3, δεσµεύεται σε υδροξυλοµάδες ή αµινοµάδες υδατανθράκων ή πρωτεΐνών στην επιφάνεια των µικροβίων. O παράγοντας Β (factor B), µια πρωτεΐνη οµόλογη του C2, δεσµεύεται στο προσκολληµένο C3b και ενεργοποιείται από µια άλλη σερινοπρωτεάση του πλάσµατος, τον παράγοντα D [21]. Εικόνα 1.6: Η εναλλακτική οδός ενεργοποίησης του συµπληρώµατoς O παράγοντας D καταλύει την διάσπαση του B στα θραύσµατα Βb και Βa [22]. Το σύµπλοκο C3bBb που προκύπτει δρα ως κοµβερτάση του C3 για την εναλλακτική οδό και σταθεροποιείται από µια γλυκοπρωτεΐνη του ορού, την προπερδίνη [23-26]. Ένα µόριο C3-κοµβερτάσης καταλύει την διάσπαση πολλών µορίων C3 ενώ µετατρέπεται σε C5-κοµβερτάση µε την προσθήκη ενός ακόµη µορίου C3b (C3bBbC3b). H διάσπαση του C5 από την αντίστοιχη κοµβερτάση οδηγεί στον σχηµατισµό ΜAC και στην λύση του κυττάρου [27-30]. Η οδός των λεκτινών Η οδός των λεκτινών οµοιάζει µε την κλασική οδό ενεργοποίησης αλλά διαφοροποιείται από αυτήν στον τρόπο µε την οποία γίνεται η ενεργοποίηση της. Αντί, η ενεργοποίηση να γίνει από συµπλέγµατα αντιγόνου-αντισώµατος, η οδός αυτή ξεκινά µε την δέσµευση ενός πρωτεϊνικού συµπλόκου, που αποτελείται από την mannose-binding 13

lectin (MBL) και τις σερινοπρωτεάσες MASP-1 και ΜΑSP-2 (mannose-binding lectin associated proteases 1 and 2), σε υδατάνθρακες της επιφάνειας των βακτηρίων [31,32]. Με αυτό τον τρόπο η ενεργοποίηση του συµπληρώµατος γίνεται από τους ίδιους τους µικροοργανισµούς και είναι ανεξάρτητη των µηχανισµών της προσαρµοστικής ανοσίας. Η δέσµευση της MBL στους υδατάνθρακες (συνήθως µαννόζες) της επιφάνειας των βακτηρίων ενεργοποιεί τις πρωτεάσες, οι οποίες καταλύουν την διάσπαση των συστατικών C2 και C4 του συµπληρώµατος. Τα θραύσµατα C2a και C4b σχηµατίζουν την κοµβερτάση του C3 (C4bC2a), η οποία επάγει την διάσπαση του C3 στα θραύσµατα C3a και C3b [33]. H δέσµευση του θραύσµατος C3b στην C3-κοµβερτάση, οδηγεί στον σχηµατισµό της κοµβερτάσης του C5, η οποία καταλύει την διάσπαση του C5. Η λεκτινική οδός, όπως και οι δύο προηγούµενες, οδηγεί στο σχηµατισµό του ΜΑC και στη λύση των βακτηρίων [34]. Εικόνα 1.7: Η λεκτινική οδός ενεργοποίησης του συµπληρώµατος 14

1.2.4 Η λυτική οδός Η λυτική οδός αποτελεί την κοινή κατάληξη και των τριών οδών ενεργοποίησης του συστήµατος του συµπληρώµατος. Η διαδικασία λύσεως ξεκινά µε την κατάτµηση του συστατικού C5 (190 KDa) από µία C5-κοµβερτάση [35]. Από τα παραγόµενα θραύσµατα, το µικρότερο C5a (11KDa) διαχέεται δρώντας ως αναφυλατοξίνη, ενώ το µεγαλύτερο C5b (180KDa) παραµένει συνδεδεµένο στην κυτταρική επιφάνεια. Τα συστατικά του συµπληρώµατος C5b έως και C9 συγκροτούν το σύµπλοκο λύσεως της µεµβράνης (mebrane attact complex-mac). Ο σχηµατισµός του ξεκινά µε την δέσµευση του µορίου C5b, στο, ήδη δεσµευµένο στην επιφάνεια του αντιγόνου, C3b. Αποτέλεσµα της δέσµευσης αυτής είναι η έκθεση της θέσεως του C5 στην οποία θα δεσµευτεί το µόριο C6 (128 KDa) [36]. Το C5b είναι εξαιρετικά ασταθές µόριο και απενεργοποιείται µέσα σε δύο λεπτά εκτός αν συνδεθεί πάνω του το C6 το οποίο θα σταθεροποιήσει τη δράση του. Το σύµπλοκο C5b6 παραµένει στενά συνδεδεµένο µε την κυτταρική µεµβράνη µέχρι να δεσµευτεί µε το C7 (121 KDa). Μόνο ένα µόριο C7 µπορεί να δεσµευτεί σε κάθε C5b6 µόριο. Το σύµπλοκο C5b67 εµφανίζει υψηλή λιποφιλικότητα και εισέρχεται στην υδρόφοβη φωσφολιπιδική στοιβάδα των βακτηρίων ή των ιών. Στη συνέχεια, µε το σύµπλοκο αυτό προσδένεται το συστατικό C8 (155 KDa). Συγκεκριµένα η γ-αλυσίδα του C8 εισέρχεται στη λιπιδική στοιβάδα της µεµβράνης και µε αυτόν τον τρόπο το σύµπλοκο C5b678 (C5b-8) παραµένει στενά και σταθερά συνδεδεµένο µε την κυτταρική µεµβράνη. Εικόνα 1.8: Το σύµπλοκο MAC 15

Ακολουθεί βαθµιαία προσθήκη έως και 15 µονοµερών C9 (79 KDa), καταλήγοντας στο σχηµατισµό ενός λυτικού «βύσµατος», το οποίο κυριολεκτικά διαπερνά την µεµβράνη του κυττάρου- στόχου, επιφέροντας το θάνατό του µέσω οσµωτικού σοκ. Εικόνα 1.9: Η λυτική οδός του συµπληρώµατος Αξίζει να σηµειωθεί ότι µικρής διαµέτρου πόροι αρχίζουν να σχηµατίζονται ήδη από το σύµπλοκο C5b678. όµως το ένατο συστατικό του συµπληρώµατος C9 προσδίδει στο σύµπλοκο C5b-8 την καταλυτική του δράση. Όσο πιο πολλά µόρια C9 πολυµερίζονται, τόσο αυξάνεται η λυτική δράση του συµπλόκου και µεγαλώνει η διάµετρος των πόρων, φτάνοντας τα 115Å µεσα στη λιπιδική διπλοστιβάδα [37]. Κάθε πόρος φέρει µία εξωτερική υδρόφοβη περιοχή µέσω της οποίας γίνεται η σύνδεση µε την κυτταρική µεµβράνη και ένα εσωτερικό υδρόφιλο κανάλι. Η δοµή των πόρων που ανοίγονται µοιάζει µε την δοµή των περφορινικών πόρων που δηµιουργούν τα κυτταροτοξικά Τ- λεµφοκύτταρα και τα κύτταρα natural killer σε κύτταρα εισβολείς [38]. Οι πόροι που δηµιουργούνται επιτρέπουν την παθητική ανταλλαγή µικρών διαλυτών µορίων, ιόντων και νερού, αλλά είναι πολύ µικροί ώστε να επιτρέπουν την έξοδο από το κυτταρόπλασµα µεγάλων µορίων, όπως πρωτεϊνών. Αυτή η διαδικασία την είσοδο νερού στα κύτταρα, οδηγώντας τα σε οσµωτική λύση. Ωστόσο κυτταρικός θάνατος µπορεί να είναι ανεξάρτητος της οσµωτικής λύσης και να οφείλεται στην παθητική είσοδο µεγάλων 16

ποσοτήτων ιόντων ασβεστίου στο κύτταρο η οποία διαταράσσει την οξεοβασική ισορροπία [39,40]. Εικόνα 1.10: Α, Β) Φωτογραφίες από ηλεκτρονικό µικροσκόπιο διάτρητης κυτταρικής µεµβράνης, λόγο δράσης του συµπλόκου MAC, C) Σχηµατική αναπαράσταση του λυτικού πόρου 1.3 ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Η καταγωγή του συστήµατος του συµπληρώµατος ως µηχανισµού της έµφυτης ανοσίας είναι παλιότερη από αυτήν της επίκτητης ανοσίας, µε ηλικία που φθάνει τα 600 700 εκ. χρόνια. Έχει πιστοποιηθεί η ύπαρξη συστατικών του συµπληρώµατος της εναλλακτικής και της λεκτινικής οδού σε άγναθους ιχθύες αλλά και σε κάποια ασπόνδυλα [41]. Ασπόνδυλοι οργανισµοί όπως ο αχινός, τα ασκίδια και τα κυκλοστόµια διαθέτουν µόρια που οµοιάζουν µε πρωτεΐνες του συµπληρώµατος των θηλαστικών (C3 και factor B) [42]. Έτσι εκτιµάται ότι η εµφάνιση του συµπληρώµατος συνέπεσε µε την εµφάνιση της σειράς των δευτεροστοµίων. ράση του συµπληρώµατος έχει πιστοποιηθεί και στην αρχαιότερη οµάδα σπονδυλωτών, στα άγναθα [43]. Το πρωτόγονο σύστηµα του συµπληρώµατος στους άγναθους ιχθύες είναι ένα από τα καλύτερα οργανωµένα συστήµατα εγγενούς ανοσίας. 17

Ωστόσο, και τα ασπόνδυλα και τα άγναθα έχουν έλλειψη ανοσοσφαιρινών, οπότε δεν διαθέτουν τα αντίστοιχα µονοπάτια της κλασικής οδού [41]. Η εµφάνιση µορίων που ανήκουν και στις τρεις οδούς ενεργοποίησης του συµπληρώµατος συνοδεύεται µε την εµφάνιση των χονδριχθύων [44]. Έτσι, το συµπλήρωµα για πρώτη φορά λειτουργεί σε αυτούς τους οργανισµούς και µε την κλασσική και τη λυτική οδό. Όλα τα υπόλοιπα σπονδυλωτά που ακολουθούν εξελιγκτικά: οστεϊχθύες, αµφίβια, ερπετά, πτηνά και θηλαστικά εµφανίζουν ένα αναπτυγµένο σύστηµα συµπληρώµατος που καταλήγει στη διαµόρφωση του τελικού συµπλόκου λύσης της µεµβράνης [45,46]. Φαίνεται ότι τα περισσότερα από τα συστατικά του συµπληρώµατος εµφανίστηκαν µετά το διπλασιασµό αρχέγονων γονιδίων τα οποία κωδικοποιούσαν οµάδες µορίων του συµπληρώµατος µε µια διαδικασία που κατέληξε στο σχηµατισµό διακριτών οδών ενεργοποίησης [47]. Αρθρόποδα Η Ε Ξ Ε Λ Ι Ξ Η Τ Η Σ Α Ν Ο Σ Ι Α Σ Οστεϊχθύες θηλαστικά Ουροχορδωτά Ε Ι Ι Κ Η Α Ν Ο Σ Ι Α Χονδριχθύες Μαλάκια Εχινόδερµα Σ Υ Σ Τ Η Μ Α Σ Υ Μ Π Λ Η Ρ Ω Μ Α Τ Ο Σ Κυκλόστοµοι Φ Υ Σ Ι Κ Η Α Ν Ο Σ Ι Α 900my 450my Εικόνα 1.11: Η εξέλιξη της ανοσίας κατά τη διάρκεια των γεωλογικών χρόνων 18

Επίσης, υπάρχουν στοιχεία που υποδηλώνουν ότι το συµπλήρωµα είναι παρόν σε όλη τη σειρά των δευτεροστοµίων, ενώ ρυθµιστικά µόρια έχουν αναγνωριστεί σε όλα τα είδη µετά τα πρωτοχορδωτά. Συνεπώς, φαίνεται οι µηχανισµοί ενεργοποίησης και ρύθµισης να αναπτύχθηκαν εκ παραλλήλου [1]. Ρυθµιστικά µόρια έχουν αναγνωριστεί σε όλα τα είδη, µετά τα πρωτοχορδωτά και φαίνεται να συνδράµουν στο πρωτόγονο σύστηµα συµπληρώµατος µαζί µε έναν οψωνικό υποδοχέα και τα συστατικά C3, fb, MASP για το σχηµατισµό ενός µονοπατιού πρώιµου στη σειρά των δευτεροστοµίων. 1.3.1 Το συµπλήρωµα στους ιχθύες και την ιριδίζουσα πέστροφα Το σύστηµα του συµπληρώµατος έχει µελετηθεί ευρύτατα στους οστεϊχθύες και πέρα από την οµοιότητα που παρουσιάζει σε σχέση µε το συµπλήρωµα των θηλαστικών, έχει και σηµαντικές διαφορές. Για παράδειγµα η µέγιστη θερµοκρασία ενεργοποίησής του είναι µικρότερη από την αντίστοιχη στα θηλαστικά, ενώ ο τίτλος των συστατικών της εναλλακτικής οδού είναι 5-10 φορές υψηλότερος στους οστεϊχθύες από ότι στα θηλαστικά. Για την κλασσσική οδό τα επίπεδα είναι παρόµοια. Η πιο αξιοσηµείωτη όµως διαφοροποίηση του συµπληρώµατος των ιχθύων σε σχέση µε των θηλαστικών είναι η παρουσία πολλαπλών ισοµορφών συστατικών, οι οποίες είναι προϊόντα διαφορετικών γονιδίων. Οι ισοµορφές αυτές διαφέρουν στη δοµή και στη λειτουργία τους [45,48,49]. Αυτή η µοναδικότητα που εµφανίζουν οι ιχθύες σε σχέση µε άλλους ασπόνδυλους ή σπονδυλωτούς οργανισµούς οδήγησε στη µελέτη της ιριδίζουσας πέστροφας (Oncorhynchus mykiss) ενός τετραπλοειδούς υπό διπλοειδοποίηση οστεϊχθύος. Ενώ σε όλα τα είδη που έχουν µέχρι σήµερα µελετηθεί η ενεργή µορφή του C3 εµφανίζεται ως παράγοντας ενός µόνο γονιδίου, για πρώτη φορά σε ένα είδος πιστοποιείται η ύπαρξη πολλαπλών µορφών λειτουργικά ενεργού C3, που είναι κεντρικό µόριο στο σύστηµα του συµπληρώµατος. Έχουν βρεθεί και χαρακτηρισθεί τέσσερις ισοµορφές του C3 στην πέστροφα [50]. Οι µορφές αυτές είναι προϊόντα διαφορετικών γονιδίων και διαφέρουν αρκετά στην ικανότητα δέσµευσής 19

τους σε επιφάνειες που ενεργοποιούν το συµπλήρωµα. Πολλαπλά C3 γονίδια έχουν βρεθεί µέχρι σήµερα σε όλα τα είδη οστεϊχθύων που έχουν µελετηθεί: Σε τετραπλοειδείς οργανισµούς όπως ο κυπρίνος, ο οποίος διαθέτει 5 γονίδια για το C3 και η ιριδίζουσα πέστροφα (rainbow trout) αλλά και σε διπλοειδείς οργανισµούς όπως το medaka και το zebrafish [51,52,53]. Οι πολλαπλές ισοµορφές του C3 δεν σχετίζονται µε τον τετραπλοειδή κυτταρογενετικό χαρακτήρα ορισµένων οστεϊχθύων αλλά εξηγούνται µέσω γονιδιακού διπλασιασµού και διαφοροποίησης γονιδίων σηµαντικών για το σύστηµα. Υποθέτουµε ότι η αξιοσηµείωτη ποικιλοµορφία έχει επιτρέψει σε αυτά τα σπονδυλωτά να επεκτείνουν την έµφυτη ικανότητά τους για ανοσοαπόκριση, δεδοµένου ότι η ειδική ανοσολογική απόκριση των ιχθύων είναι σχετικά φτωχή βασιζόµενη µόνο σε έναν τύπο αντισωµάτων (IgM) [1]. Τα αντισώµατα αυτά είναι χαµηλής συγγένειας και ετερογένειας και ο χρόνος απόκρισης είναι µεγαλύτερος από αυτόν των θηλαστικών. Η καθυστέρηση της ανοσολογικής απόκρισης θα ήταν µοιραία για τους οργανισµούς αυτούς που έχουν διαρκώς να αντιµετωπίσουν ένα ευρύ φάσµα παθογόνων µικροοργανισµών, στο ευµετάβλητο υγρό στοιχείο. Έτσι µε αυτήν την αξιοσηµείωτη ποικιλότητα στα βασικά συστατικά του συµπληρώµατος οι τελεόστεοι ιχθύες κατάφεραν να διευρύνουν τις ικανότητες ανοσοαναγνώρισης, γεγονός που όχι µόνο ενισχύει τις ικανότητες του ανοσοποιητικού συστήµατος, αλλά συµπληρώνει και τους περιορισµούς της προσαρµοστικής ανοσίας. Η παραπάνω ικανότητα υπήρξε καθοριστική για την επιβίωση των θαλάσσιων αυτών οργανισµών, µέσα στο ευµετάβλητο και ιδιαίτερα πλούσιο σε µικροοργανισµούς υγρό στοιχείο. εν είναι ξεκάθαρο σε ποια στιγµή κατά την διάρκεια της εξέλιξης έγιναν οι διπλασιασµοί των γονιδίων και η διαφοροποίησή τους που οδήγησε στην δηµιουργία των διαφορετικών ισοµορφών. Το µόνο που είναι γνωστό, είναι πως πολλά ασπόνδυλα διαθέτουν ένα σύστηµα που οµοιάζει µε ένα αρχέγονο συµπλήρωµα και το οποίο σχετίζεται µε την φαγοκυττάρωση αντιγόνων [54,55]. Τέλος, όσον αφορά την παρουσία της λυτικής οδού και του συµπλόκου MAC, καθώς και τη ρύθµισή του στην ιριδίζουσα πέστροφα, έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί τα γονίδια C6, C7, C8α, C8β, C8γ, C9 CD59 [56-62]. 20

1.4 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Η ικανότητα του συµπληρώµατος να σκοτώνει τους παθογόνους οργανισµούς και να διευκολύνει την απόσυρσή τους από την κυκλοφορία του αίµατος είναι αυστηρά ρυθµιζόµενη, διότι σε διαφορετική περίπτωση θα προξενούσε βλάβες στον ίδιο τον οργανισµό. Η σηµασία της ρύθµισης φαίνεται σε περιπτώσεις έλλειψης κάποιων ρυθµιστικών πρωτεϊνών που οδηγούν σε κατανάλωση των συστατικών του συµπληρώµατος και σε παθολογικά συµπτώµατα. Περίπου οι µισές από τις πρωτεΐνες του συµπληρώµατος συµµετέχουν στη ρύθµιση έχοντας την ικανότητα να ξεχωρίζουν τα ίδια από τα ξένα µόρια. Αυτό επιτυγχάνεται γιατί οι ιστοί του οργανισµού διαθέτουν µια σειρά πρωτεϊνών στην επιφάνειά τους που δεν αναγνωρίζονται κατά τη δράση του συµπληρώµατος. Οι οργανισµοί εισβολείς δεν διαθέτουν αυτές τις πρωτεΐνες και για το λόγο αυτό αποτελούν στόχο της δράσης του συµπληρώµατος. Η γενική αρχή της ρύθµισης περιλαµβάνει την παρεµπόδιση της καταστροφής κυττάρων και ιστών του ίδιου του οργανισµού και την ενεργοποίηση του συµπληρώµατος στην υγρή φάση. Προκειµένου να επιτευχθούν οι δύο αυτοί στόχοι η ρύθµιση γίνεται από µεµβρανικές και από διαλυτές στον ορό πρωτεΐνες [8,63]. 1. ιαλυτές στον ορό πρωτεΐνες: C1-INH, C4bp, Factor I, Factor H, clusterin και S-protein. 2. Μεµβρανικές πρωτεΐνες: CR1, DAF, MCP, CD59, υποδοχέας C1q Η ρύθµιση του συµπληρώµατος περιλαµβάνει την αναστολή ή αποσταθεροποίηση των ενεργών συµπλόκων ή την κινητοποίηση των διαδικασιών της πρωτεολυτικής λύσης των ενεργοποιηµένων συστατικών. Η ρύθµιση γίνεται σε σηµεία κλειδιά: στην έναρξη της ενεργοποίησης, στο σχηµατισµό των κονβερτασών (ανάπτυξη ενεργοποίησης) και στο σχηµατισµό του συµπλόκου λύσης των µεµβρανών. α) Έλεγχος κατά την έναρξη της ενεργοποίησης: Κατά την έναρξη της κλασικής οδού ενεργοποίησης, η ρύθµιση πραγµατοποιείται µε τη συµµετοχή του αναστολέα του C1(C1- INH, C1 inhibitor) [64]. Πρόκειται για µία σερινική γλυκοπρωτεΐνη 104 kd η οποία είναι µέλος της οικογένειας των αναστολέων των σερινοπρωτεάσεων (serine protease inhibitor, SERPINs), η οποία αναστέλλει την ικανότητα των µορίων C1s και C1r να πρωτεολύουν τα φυσικά τους υποστρώµατα. Η C1-INH εµποδίζει επίσης την τυχαία ενεργοποίηση του C1 η 21

οποία µπορεί να εµφανιστεί σε χαµηλά ποσά ακόµα και απουσία αντισωµάτων στην κυκλοφορία. β) Έλεγχος κατά την ανάπτυξη της ενεργοποίησης: Αυτό επιτυγχάνεται µε τον αυστηρό έλεγχο των κονβερτασών. Οι ρυθµιστικές πρωτεΐνες που επιτελούν τον έλεγχο αυτό χωρίζονται σε δύο µεγάλες κατηγορίες: Τις διαλυτές στον ορό πρωτεΐνες: C4b-binding protein (C4bp), Factor H, Factor I και τις διαµεµβρανικές πρωτεΐνες: membrane cofactor protein (MCP), decay accelerating factor (DAF), complement receptor type 1 (CR1), complement receptor type 2 (CR2).Τέλος, υπάρχει και µία άλλη πρωτεΐνη του πλάσµατος, η προπερδίνη, η οποία σε αντίθεση µε όλους τους άλλους αρνητικούς ρυθµιστές του συµπληρώµατος δρα ως θετικός ρυθµιστής σταθεροποιώντας τις δύο κονβερτάσες της εναλλακτικής οδού. Οι παραπάνω πρωτεΐνες εκτός από τον fi και την προπερδίνη, ανήκουν σε µία οικογένεια και παρουσιάζουν κοινά δοµικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά πρωτεϊνών που είναι γνωστές ως Regulators of Complement Activation (RCA). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες αυτές χαρτογραφούνται στο µακρύ βραχίονα του χρωµοσώµατος 1(1q3.2). Η πρωτεϊνική τους αλληλουχία απαρτίζεται από τις µονάδες µικρών οµόλογων επαναλήψεων, γνωστές και ως SCRs ή CCPs (Short Consensus Repeats ή Complement Control Protein modules). Οι µικρές αυτές οµόλογες επαναλήψεις αποτελούν τις θέσεις δέσµευσης του C3b και του C4b. Οι πρωτεΐνες RCA επιτελούν δύο φυσιολογικές λειτουργίες συµβάλλοντας στη ρύθµιση της δράσης του συµπληρώµατος: δράση ταχείας διάσπασης (decay-accelerating activity) και/η δράση συµπαράγοντα (cofactor activity). Η δράση ταχείας διάσπασης επιτυγχάνεται µέσω της αποσύνδεσης των συστατικών που συνθέτουν τις κονβερτάσες, ενώ η δράση συµπαράγοντα µέσω της πρωτελεολυτικής αποδόµησης του C3b και του C4b όπως αυτή κατευθύνεται από τον fi και µια συµπαραγοντική πρωτεΐνη µπορεί να δρα και ως συµπαράγοντας, αλλά και ως επιταχυντικός παράγοντας διάσπασης. γ) Ρύθµιση του συµπλόκου MAC: Η συγκρότηση του συµπλόκου MAC µπορεί να διακοπεί από τρία µόρια: το CD59, τη Βιτρονεκτίνη (Vitronectin) και την Κλαστερίνη (Clusterin). Η CD59, ή προτεκτίνη είναι µία µεµβρανική πρωτεΐνη (18-20 kda) που εκφράζεται σε ένα µεγάλο αριθµό κυτταρικών τύπων του ξενιστή που αναστέλλει το σχηµατισµό του 22

συµπλόκου λύσης µεµβρανών (MAC) πάνω στο ίδιο το κύτταρο στο οποίο είναι αγκυροβοληµένη. Συγκεκριµένα, η προτεκτίνη δεσµεύεται µε την β-αλυσίδα του µορίου C8 και µε την b-domain του C9, εµποδίζοντας τον πολυµερισµό του C9 [65]. Αποτελεί τον σηµαντικότερο προστατευτικό παράγοντα για τα φυσιολογικά κύτταρα του ξενιστή [66]. Η πρωτεΐνη-s ή Βιτρονεκτίνη (75-80 kd) είναι µια γλυκοπρωτείνη του ορού. εσµεύεται στα διαλυτά µόρια C5b-7 και εµποδίζει την διείσδυσή τους στις µεµβράνες των κυττάρων που βρίσκονται κοντά στην περιοχή όπου έχει ενεργοποιηθεί η δράση του συµπληρώµατος. Εποµένως µέσω της δράσης της εµποδίζει το σχηµατισµό του συµπλόκου λύσης των µεµβρανών [67,68]. Παρά το ότι τα µόρια C5b-7 διατηρούν ακόµα την ικανότητά τους να ενσωµατώνουν C8 και C9 µόρια. Η Κλαστερίνη είναι µια πολυλειτουργική γλυκοπρωτεΐνη µοριακού βάρους 80kD. Εκφράζεται από µια µεγάλη ποικιλία κυττάρων και ιστών και είναι διαλυτή. Όπως και η πρωτείνη-s, έτσι και η κλαστερίνη αναστέλλει τη συγκρότηση του MAC συµπλόκου µετά το στάδιο του C5b-7 [69]. Ειδικότερα δεσµεύεται µε το C7 µόριο, µε την β-αλυσίδα του C8 και µε την b- περιοχή του C9. Classical pathway Immune complexes (+) Lectin (MBL) pathway Microbial carbohydrates (+) Alternative pathway Activating surfaces (+) C1 (C1q, C1r, C1s) MBL + (MASP-1, MASP-2) C3b (-) C1INH C4bp f I (-) +C4 +C2 C3a +C3 DAF, CR1, (-) MCP, f I (-) C4b2a3b (+C5) C5a C3bBbC3b +fb +fd +C3 (-) C3a f H f I CD59 C5b (-) +C6 +C7 +C8 +C9 (-) Vitronectin Clusterin C5b-9 Εικόνα 1.12: Κοµβικά σηµεία ρύθµισης του συµπληρώµατος 23

1.5 CLUSTERIN Η clusterin πρωτοπεριγράφηκε το 1983 ως µία εκκρινόµενη γλυκοπρωτεΐνη στο σπερµατικό υγρό όρχεος κριαριού, που ενισχύει τη συνάθροιση ( clustering ) µιας ποικιλίας κυττάρων (όπως των ερυθρών αιµοσφαιρίων), in vitro [70]. Από τότε έχουν βρεθεί πολλές οµόλογες πρωτεΐνες σε διάφορα είδη από διαφορετικές ερευνητικές οµάδες που προσέδωσαν στη clusterin πολλά ονόµατα. Η πληθώρα των ονοµάτων αποτελεί και µια ένδειξη της πολυλειτουργικότητας του µορίου σε σηµείο που να χαρακτηρίζεται από ορισµένους ως «αίνιγµα». Τα επικρατέστερα ονόµατα στη βιβλιογραφία για την clusterin είναι: Apolipoprotein J (APO J), Serum Protein 40,40, Complement Lysis Inhibitor (CLI), Complement-associated Protein SP-40,40, Sulfated Glycoprotein 2 (SGP-2), Dimeric Acidic Glycoprotein (DAG), Glycoprotein III, Testosterone-Repressed Prostate Message 2 (TRPM-2). Ωστόσο, στο ιεθνές Συµπόσιο για την clusterin, που πραγµατοποιήθηκε στο Cambridge το 1992 συµφώνησαν στην ονοµασία Clusterin. 1.5.1 Το γονίδιο Το γονίδιο που κωδικοποιεί την clusterin στον άνθρωπο εδράζεται στο µικρό βραχίονα του 8 ου χρωµοσώµατος και πιο συγκεκριµένα στην περιοχή 2 και ζώνη 1 (8ρ21). Περιέχει 16.580 bp και είναι οργανωµένο σε 9 εξώνια και 8 εσώνια. Το µέγεθος των εξωνίων κυµαίνεται από 47 bp (exon I) µέχρι 412 bp (exon V), ενώ των εσωνίων από 207 bp (intron 8) µέχρι 4.377 bp (intron 6). Το σηµείο πρωτεολυτικής διάσπασης βρίσκεται µέσα στο εξώνιοv. Το γονίδιο της clusterin κωδικοποιεί δύο ισοµορφές, την 1 και τη 2. Το ένα προϊόν µεταγραφής περιλαµβάνει όλα τα εξώνια και περιέχει 2.859 bp που δίνουν πρωτεΐνη 501 αµινοξέων (ισοµορφή 1), ενώ το άλλο δεν περιλαµβάνει το πρώτο εξώνιο και περιέχει 2.979 bp που δίνουν πρωτεΐνη 449 αµινοξέων (ισοµορφή 2). Η 3 µη µεταφραζόµενες περιοχές (3 UTR) είναι όµοιες και για τα δύο µετάγραφα και περιέχουν 1324 bp, ενώ οι 5 µη µεταφραζόµενες περιοχές διαφέρουν κατά πολύ (30 bp για την 1 και 305 bp για τη 2 ισοµορφή). 24

5 3 Ισοµορφή 1 5 3 Ισοµορφή 2 Μη µεταφραζόµενη περιοχή Κωδική περιοχή Εικόνα 1.15: Οι δύο ισοµορφές του πρόδροµου mrna (pri-mrna) της clusterin του ανθρώπου. Η ισοµορφή 1 προέρχεται από τη µεταγραφή και των 9 εξωνίων, ενώ η 2 δεν περιλαµβάνει το πρώτο εξώνιο. 1.5.2 Η πρωτεΐνη Η clusterin είναι µια διαλυτή ετεροδιµερής γλυκοπρωτεΐνη 449 αµινοξέων (ισοµορφή 2 στον άνθρωπο) και µοριακού βάρους 75-80 kda. Έχει την τάση να συσσωµατώνεται σε υψηλού µοριακού βάρους πολυµερή. Αποτελείται από δύο υποµονάδες α και β µεγέθους 35-40 kda, οι οποίες συνδέονται µε µια αλυσίδα δισουλφιδικών δεσµών. Η πρόδροµη πρωτεΐνη αποτελείται από µία πολυπεπτιδική αλυσίδα και φέρει ένα πεπτίδιο οδηγό (signal peptide) 22 αµινοξέων. Το ώριµο προϊόν προκύπτει µετά από πρωτεολυτική πέψη του προδρόµου µορίου στις θέσεις Arg227 και Ser228, δίνοντας την α (23-227aa) και τη β υποµονάδα (228-449aa), πριν την έκκρισή του από το κύτταρο. H δευτεροταγής δοµή της clusterin περιέχει έναν πυρήνα µε πέντε δισουλφιδικές διασυνδέσεις, τρεις αµφιπολικές α έλικες και δύο περιελιγµένες α έλικες, οι οποίες 25

παρουσιάζουν δοµική οµοιότητα µε άλλες δοµές α έλικας, όπως η βαριά αλυσίδα της µυοσίνης. Το 30% της µοριακής της µάζας είναι υδατάνθρακες συνδεδεµένοι µε Ν. Κάθε αλυσίδα φέρει τρεις θέσεις γλυκοζυλίωσης και πέντε κυστεΐνες. Στο αµινοτελικό άκρο του µορίου υπάρχει µια περιοχή α έλικας που ακολουθείται από µια πλούσια σε κυστεΐνες TSP1 περιοχή (thrombospondin type 1 module) οµόλογη µε την αντίστοιχη περιοχή των συστατικών του MAC. Επίσης, η αµινοξική αλληλουχία, κυρίως στη περιοχή των δισουλφιδικών δεσµών είναι καλά διατηρηµένη µεταξύ των ειδών [71]. Εικόνα 1.13: Η δευτεροταγής δοµή της clusterin Τα πιο σηµαντικά δοµικά στοιχεία που αναγνωρίζονται στην πρωτεΐνη clusterin είναι η περιοχή κυστεϊνών, η οποία αντιστοιχεί στα εξώνια 6 και 7, η περιοχή πρόσδεσης ηπαρίνης στα εξώνια 8 και 9 και η περιοχή των αµφιπολικών ελίκων στα εξώνια 5 και 8. Το δοµικό µοτίβο που εµφανίζει η clusterin είναι απλό, δεν χαρακτηρίζει µια συγκεκριµένη οικογένεια και έχει την εξής µορφή για τις δύο αλυσίδες: 26

Εικόνα 1.14: Οι δοµικές περιοχές της clusterin Για την clusterin δεν υπάρχουν κρυσταλλογραφικά δεδοµένα, καθώς πρόκειται για µια πρωτεΐνη µε κολλώδη υφή από τη φύση της, οπότε είναι πολύ δύσκολο να κρυσταλλογραφηθεί. 1.5.3 Ρύθµιση και έκφραση της clusterin Η clusterin εκφράζεται σε όλους σχεδόν τους ιστούς των θηλαστικών και αποτελεί συστατική πρωτεΐνη για τα φυσιολογικά υγρά. Η συγκέντρωσή της στο πλάσµα φτάνει τα 100-300 µg/ml, ενώ στο σπέρµα είναι 10 φορές υψηλότερη. Απαντάται ακόµα στα ούρα, στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό και στο µητρικό γάλα. Όσον αφορά τα αιµοκύτταρα η clusterin περιέχεται στα µεγακαρυοκύτταρα και τα αιµοπετάλια, αρχικά στα α-κυστίδια. Πρωτογενείς θέσεις σύνθεσης είναι το ήπαρ, οι όρχεις, η επιδυδιµίδα, ο εγκέφαλος. ευτερογενώς, βρίσκεται σε πολλά όργανα, όπως στο στοµάχι, στον εγκέφαλο, στην καρδιά, στους πνεύµονες, στα νεφρά, στο πάγκρεας και αλλού. εν εκφράζουν την κλαστερίνη όλα τα κύτταρα σε έναν ιστό, π.χ. όχι οι κοιλίες αλλά οι κόλποι στην καρδιά, στην κορυφαία επιφάνεια πολλών κυττάρων [72]. 27

Όπως είναι εµφανές, η ποικιλία των ιστών στους οποίους κατανέµεται η clusterin είναι εντυπωσιακή. Αυτό δεν ισχύει µόνο για τον άνθρωπο, αλλά και για τους περισσότερους ζωικούς οργανισµούς. Το mrna της clusterin µπορεί να βρεθεί τόσο στον προστάτη του ποντικού, όσο και στα αµφιβληστροειδικά κύτταρα του ορτυκιού, για παράδειγµα. Επιπλέον, υπάρχουν δεδοµένα που δείχνουν ότι εκτός από τον δρόµο προς έκκριση, το µόριο της clusterin από τα ριβοσώµατα µέχρι το σύστηµα Golgi όπου γλυκοζυλιώνεται, µπορεί να ακολουθήσει και άλλη πορεία προς τα διάφορα κυτταρικά διαµερίσµατα, µε διαφορετικές µορφές, µη γλυκοζυλιωµένες. Το στρες µπορεί να επάγει ενδοκυτταρικές µορφές της clusterin. Μια ειδική πυρηνική µορφή της clusterin (nclu) δρα ως προαποπτωτικό σήµα, εµποδίζοντας την αύξηση και την επιβίωση του κυττάρου. Η nclu διαθέτει δύο περιοχές coiled-coil, µία στο αµινοτελικό άκρο, που δεν προσδένει την Ku70 (πρωτεΐνη που συνδέεται µε το DNA ) και µία στο καρβοξυτελικό άκρο, που προσδένει την Ku70 και είναι καθοριστική για τον κυτταρικό θάνατο. Εικόνα 1.16: Η έκφραση σε επίπεδο mrna της clusterin (SP-40), σε διάφορους ιστούς στον άνθρωπο. 28

Για ένα τέτοιο µόριο, όπως η clusterin, η ρύθµιση της έκφρασης αποκτά µεγάλη βαρύτητα. Ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου έχει αποκαλύψει πολλές περιοχές πρόσδεσης διαφόρων παραγόντων. Από την άλλη, µια συντηρηµένη περιοχή του υποκινητή, η λεγόµενη CLE (Clusterin Element) φαίνεται να σχετίζεται µε συντηρηµένες αλληλουχίες θερµοεπαγόµενων στοιχείων και να προσδένει τον µεταγραφικό παράγοντα HSF-1. Γεγονός που µπορεί να εξηγήσει επαγωγή απόκρισης σε κατάσταση στρες [73]. Ο υποκινητής περιέχει πολλά πιθανά ρυθµιστικά στοιχεία (AP-1, AP-2, Sp1, NF1) τα οποία είναι ικανά να επιτελούν τον πολύπλοκο ιστοειδικό έλεγχο του γονιδίου. Παράγοντες όπως ο TGFβ, ο NGF και ο EGF έχουν εµπλακεί στη διαµόρφωση της µεταγραφής του γονιδίου της clusterin. Για παράδειγµα, προσδιορίζεται η apolipoprotein J / clusterin στον πυρήνα των επιθηλιακών κυττάρων από τον TGFβ. Η έκφραση ρυθµίζεται ποικιλοτρόπως, ανάλογα µε τον τύπο του κυττάρου. Έτσι σε διαφορετικό κύτταρο µπορεί να έχουµε αύξηση ή µείωση της έκφρασης από παράγοντες, όπως ο TNFα, PDGF, FGFβ και ακόµη από εξωτερικά ερεθίσµατα, όπως θερµοκρασιακό στρες, οξειδωτικό στρες, έκθεση σε UVA ακτινοβολία, ιονίζουσα ακτινοβολία, ή από χηµειοθεραπευτικά φάρµακα [74]. Τα στοιχεία αυτά µπορούν να δρουν και συνεργατικά και να κάνουν τον υποκινητή ευαίσθητο σε περιβαλλοντικές αλλαγές. Ουσιαστικά η clusterin είναι εκκρινόµενη από πολλά κύτταρα, όπως τα επιθηλιακά και τα νευρικά, για τα κύτταρα όµως που χαρακτηρίζονται από εξωκυττάρια ρύθµιση των µοριακών µονοπατιών τους, η έκκριση εξαρτάται από το κατάλληλο εξωγενές ερέθισµα [75]. Πιο ειδικά, η έκφραση του γονιδίου της clusterin επάγεται από αυξητικούς παράγοντες καθώς και από ενδοτοξίνες και κυτταροκίνες στο ήπαρ. Επίσης, εκφράζεται έπειτα από στρεσσογόνους παράγοντες, όπως είναι το τοξικό ή ισχαιµικό τραύµα στον εγκέφαλο, στα νεφρά, στη καρδιά, στο ήπαρ, αλλά και µετά την απόπτωση σε ορισµένους ιστούς (πιθανός προαποπτωτικός ρόλος) [76]. ιάφορες µελέτες δείχνουν ότι η clusterin είναι αυξηµένη στον ορό µοντέλων µε αρτηριοσκλήρυνση, βρίσκεται στις αθηρωµατικές πλάκες και σε στάδια κάποιων νόσων, όπως στις πλάκες Alzheimer s, στη µελανοχρωµατική αµφιβληστροειδίτιδα, σε κύστεις των νεφρών, σε γλοιώµατα και στον καρκίνο του προστάτη [77]. Γενικά υπερεκφράζεται σε διάφορες νευροεκφυλιστικές νόσους, που συνήθως σχετίζονται µε την προχωρηµένη ηλικία και σε στάδια καρκινογένεσης και ογκογένεσης. Ενώ, παράλληλα συσσωρεύεται σε κύτταρα που βρίσκονται στο στάδιο αναστολής της 29

ανάπτυξης, δηλαδή γηράσκουν, πράγµα που µπορεί να σχετίζεται µε προδιάθεση στον καρκίνο [78]. Συνεπώς, η clusterin είναι ένα πολυσήµαντο µόριο ευαίσθητο στη µοριακή σηµατοδότηση, τόσο ανάλογα µε το είδος του κυττάρου, όσο και µε το αναπτυξιακό του στάδιο. 1.5.4 Λειτουργικός ρόλος Παρόλο που έχουν περάσει δύο δεκαετίες από τότε που ανακαλύφθηκε η clusterin, η λειτουργία της παραµένει άγνωστη. Η πληθώρα των ιστών στους οποίους κατανέµεται και οι πιθανές µορφές της σχετίζονται µε µια µεγάλη ποικιλία λειτουργιών. Σε αυτές τις λειτουργίες εξάλλου, οφείλονται και τα πολλά διαφορετικά ονόµατα µε τα οποία είναι γνωστή η clusterin. Οι πιο σηµαντικές είναι: Έλεγχος αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-υποστρώµατος, ανακύκλωση µεµβρανών, κυτταρική προσκόλληση, κυτταρικός πολλαπλασιασµός, ωρίµανση σπέρµατος, κυτταρική διαφοροποίηση και µορφογένεση [71]. Ρύθµιση απόπτωσης και γήρανσης. Η Apo J/Clusterin ανάλογα µε το είδος του κυττάρου ευνοεί ή όχι τον κυτταρικό θάνατο και αποτελεί βιοδείκτη in vitro και in vivo γήρανσης [75]. Ρόλος στην παθογένεια και τη θεραπεία των καρκίνων. Έχει δειχθεί ότι η clusterin εµπλέκεται στην καρκινική εξαλλαγή και στην ανάπτυξη αντοχής των καρκινικών κυττάρων σε διάφορους χηµειοθεραπευτικούς παράγοντες [80,81,82]. Μεταφορά λιπιδίων. Στον άνθρωπο, ένα κλάσµα της clusterin στο πλάσµα συνδέεται µε µόρια της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) [83]. Η clusterin εκκρίνεται από τα G2 ηπατικά κύτταρα ωs λιποπρωτεΐνη και η εξωγενής clusterin µπορεί να προάγει την εκροή της χοληστερόλης από τα µακροφάγα του ποντικού, in vitro. Προστασία κυττάρων σε καταστάσεις stress [84,85]. Για παράδειγµα, η clusterin προστατεύει τα κύτταρα από τον κυτταροτοξικό TNFα. Πρόσφατα δεδοµένα εµφανίζουν την 30