ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΕΤΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΤΗΣ ΔΙΗΘΗΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΟΠΑΘΩΝ ΟΓΚΩΝ ΤΟΥ Κ.Ν.Σ. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΟΣ ΝΕΥΡΟΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: καθηγητής κ. ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΑΡΑΚΗΣ ΠΑΤΡΑ 2009

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Θέμα: ΜΕΛΕΤΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΤΗΣ ΔΙΗΘΗΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΟΠΑΘΩΝ ΟΓΚΩΝ ΤΟΥ Κ.Ν.Σ. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΟΣ ΝΕΥΡΟΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Βαράκης Ιωάννης Επιβλέπων Καθηγητής 2. Παπαδάκη Ελένη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ανατομικής 3. Γκατζούνης Γεώργιος Επίκουρος Καθηγητής Νευροχειρουργικής

ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: 1.Βαράκης Ιωάννης Επιβλέπων Καθηγητής 2.Παπαδάκη Ελένη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ανατομικής 3.Γκατζούνης Γεώργιος Επίκουρος Καθηγητής Νευροχειρουργικής 4.Mαραζιώτης Θεόδωρος Καθηγητής Νευροχειρουργικής 5.Κωστόπουλος Γεώργιος Καθηγητής Φυσιολογίας-Νευροφυσιολογίας 6.Σωτηροπούλου-Μπονίκου Γεωργία. Αν. Καθηγήτρια Ανατομικής 7.Ασημακοπούλου Μάρθα Αν. Καθηγήτρια Ανατομικής 1

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Με την ευκαιρία της ολοκλήρωσης της διδακτορικής μου διατριβής θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλους όσους με βοήθησαν και μου συμπαραστάθηκαν στην προσπάθειά μου αυτή. Ευχαριστώ θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή και δάσκαλό μου κύριο Ιωάννη Βαράκη για τις πολυτιμότατες συμβουλές του και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Θεωρώ τον εαυτό μου ιδιαίτερα τυχερό, διότι από νωρίς στα φοιτητικά μου χρόνια γνώρισα τον καθηγητή κ. Βαράκη και η συνεργασία μαζί του όλο αυτό το διάστημα επηρέασε βαθιά τη μέχρι τώρα πορεία μου. Εκφράζω τις ατελείωτες ευχαριστίες μου προς τη διευθύντρια του Εργαστηρίου Ανατομικής Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κυρία Ελένη Παπαδάκη, για την αμέριστη και ακούραστη στήριξή της και τις πολύτιμες συμβουλές της οποιαδήποτε στιγμή συνάντησα δυσκολία. Χωρίς την βοήθειά της θα ήταν δύσκολη η ολοκλήρωση της διατριβής μου. Ευχαριστώ το δάσκαλό μου στη Νευροχειρουργική επίκουρο καθηγητή κύριο Γεώργιο Γκατζούνη για την υπομονετική και καθημερινή στήριξη και κατανόησή του στην εκπαίδευσή μου στη Νευροχειρουργική. Θέλω θερμά να ευχαριστήσω τον διευθυντή μου και καθηγητή Νευροχειρουργικής κ. Μαραζιώτη Θεόδωρο για την κατανόησή του, και τις πολύτιμες συμβουλές του όλο αυτό το διάστημα της εκπαίδευσής μου. Τέλος θέλω να ευχαριστήσω το προσωπικό του Εργαστηρίου της Ανατομίας για την στήριξη που μου παρείχε αυτό το διάστημα. Γεώργιος Κληρονόμος

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Εισαγωγή... 2 Γενικό Μέρος Κεφάλαιο 1 1.1 Στοιχεία Ιστολογίας. Νευρικού ιστού... 5 1.2 Στοιχεία Εμβρυϊκής ανάπτυξης του νευρικού συστήματος... 9 1.3 Aρχέγονα νευρικά κύτταρα στον πλήρως ανεπτυγμένο εγκέφαλο...13 1.4 Νεοπλάσματα του Νευρικού συστήματος...15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Παθογενετικοί μηχανισμοί στην ανάπτυξη των γλοιωμάτων.... 25 2.1 Κυτταρική προέλευση των γλοιωμάτων 25 2.2 Η θεωρία των brain tumor stem cells...27 2.3 Mοριακοί και γενετικοί μηχανισμοί στην ανάπτυξη των αστροκυττωμάτων 31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 3.1 Διηθητική ικανότητα των γλοιωμάτων... 57 3.2 Ρύθμιση της διηθητικής ικανότητας των αστροκυττωμάτων 59 3.3 Ένζυμα που συμμετέχουν στην διάσπαση της εξωκυττάριας ουσίας... 65 3.4 Ο ρόλος του NF-κB στη διηθητική ικανότητα των Αστροκυττωμάτων... 73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη ING-4 και ο ρόλος της στη διηθητική ικανότητα των αστροκυττωμάτων.... 76 4.1Κύρια χαραχτηριστικά της οικογένειας των ING πρωτεϊνών.... 76 4.2 Πρωτεΐνες της οικογένειας ING συμμετέχουν σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες... 79

4.3 Λειτουργίες της ING-4... 82 Ρόλος της ING-4 στην αγγειογένεση και την κυτταρική μετανάστευση...82 4.4 Ο ρόλος του ING-4 στο μονοπάτι του NF-κB...83 4.5 Ο ρόλος του ING-4 στο μονοπάτι του HIF-1α...85 4.6 ο ρόλος του ING-4 στην αναδιάταξη της χρωματίνης... 85 Ειδικό μέρος Σκοπός της μελέτης... 88 Υλικό Μέθοδοι... 89 Γενικά για τις ανοσοιστοχημικές μεθόδους 92 Αξιολόγηση ανοσοιστοχημικής χρώσεως... 102 Αποτελέσματα.105 Συζήτηση των αποτελεσμάτων... 127 Βιβλιογραφία... 132 1

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα αστροκυττώματα αποτελούν τη συχνότερη ομάδα νεοπλασμάτων του κεντρικού νευρικού συστήματος. Συνιστούν μία ετερογενή ομάδα σε ότι αφορά τη βιολογική τους συμπεριφορά και την πρόγνωσή τους και παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί στην κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών τους, συνεχίζουν να αποτελούν μια από τις επιθετικότερες μορφές καρκίνου. Ένα από τα βασικότερα χαρακτηριστικά των αστροκυττωμάτων είναι η διηθητική τους ικανότητα δηλαδή η κυτταρική μετακίνηση ( cell locomotion) και η αποδόμηση στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας (extracellular matrix degradation) που είναι απαραίτητη για να επιτευχθεί η διήθηση. Η ιδιότητα της κυτταρικής διήθησης καθιστά τα νεοπλάσματα αυτά ιδιαιτέρως καταστροφικά για το νευρικό ιστό και επιπλέον δυσχεραίνει τη θεραπεία τους. Τόσο η χειρουργική αντιμετώπιση όσο και η ακτινοθεραπεία καθίστανται μη επαρκείς για την ριζική αντιμετώπιση των όγκων αυτών. Η παρούσα μελέτη έχει ως σκοπό την μοριακή μελέτη του φαινομένου της κυτταρικής διήθησης και εντοπίζεται κυρίως στους μηχανισμούς διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας. Είναι γεγονός ότι τα τελευταία χρόνια μεγάλη ερευνητική προσπάθεια συντελείται προς την κατεύθυνση αυτή και πολλοί από τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στη διαδικασία αποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας αρχίζουν να αποσαφινίζονται. Όμως καθώς η έρευνα προχωρά όλο και περισσότερα δεδομένα αναδεικνύονται γεγονός που υποδηλώνει την πολυπλοκότητα του φαινομένου. Ένα σχετικά πρόσφατα ταυτοποιημένο μόριο η ογκοκατασταλτική πρωτείνη ING-4 ( Inhibition of growth) πιστεύεται ότι είναι πιθανόν να εμπλέκεται στον έλεγχο της αποδόμησης στοιχείων της εξωκυττάριας ουσίας. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν τον ρυθμιστικό ρόλο του ING-4 στο μεταγραφικό παράγοντα NF-κB ο οποίος είναι γνωστό ότι αποτελεί κύριο ρυθμιστή της έκφρασης των ενζύμων διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας MMP-2, MMP-9 (matrix metalloproteases 2,9) και του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης u-pa (urokinase-type plasminogen activator). Στη μελέτη αυτή γίνεται εκτίμηση των 2

επιπέδων έκφρασης της πρωτείνης ING-4 της p65 υπομονάδας του NF-κB και των ενζύμων MMP-2, MMP-9 και του u-pa με τη χρήση της ανοσοιστοχημικής τεχνικής σε τομές παραφίνης ληφθείσες από 101 περιστατικά αστροκυττωμάτων του ανθρώπου όλων των βαθμίδων διαφοποίησης. Η γνώση του επιπέδου έκφρασης των μορίων αυτών στα αστροκυττώματα καθώς και η μεταξύ τους συσχέτιση αφενώς μεν θα συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών που ελέγχουν την κυτταρική διήθηση, αφετέρου πιθανόν να αποτελέσει χρήσιμη γνώση για μελλοντικό σχεδιασμό θεραπειών περιορισμού του φαινομένου αυτού. 3

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1.1 Στοιχεία ιστολογίας του νευρικού ιστού. Τα κυτταρικά στοιχεία που συνιστούν το νευρικό ιστό προέρχονται εμβρυολογικά από το νευροεξώδερμα και διακρίνονται στα νευρικά κύτταρα ή νευρώνες και τα κύτταρα της γλοίας (αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα, επενδυτικά κύτταρα). Τα μικρογλοιακά κύτταρα ανήκουν στο σύστημα μονοπυρήνων μακροφάγων και προερχόμενα από το μυελό των οστών αποικίζουν το νευρικό ιστό κατά τα τελικά στάδια της κυήσεως. Οι νευρώνες ποικίλουν σε ότι αφορά το μέγεθος, τη μορφολογία τους και τα λειτουργικά τους χαρακτηριστικά. Ένας τυπικός νευρώνας αποτελείται από το κυτταρικό σώμα, το οποίο είναι και το τροφικό του κέντρο και τις αποφυάδες. Ο νευράξονας, η μακρύτερη αποφυάδα, ονομάζεται αλλιώς νευρική ίνα και είναι υπεύθυνος για την μετάδοση των νευρικών ώσεων από το κυτταρικό σώμα προς το μετασυναπτικό νευρώνα ενώ οι δενδρίτες, μικρότεροι σε μέγεθος και διακλαδούμενοι αποτελούν μαζί με το κυτταρικό σώμα την υποδεκτική περιοχή του νευρώνα. Τα σώματα των νευρώνων διατάσσονται σε ομάδες, στήλες ή στοιβάδες διατηρώντας αυστηρή σωματοτοπία καθ όλα τα επίπεδα του κεντρικού νευρικού συστήματος και συνιστούν τη φαιά ουσία. Οι νευράξονες ομαδοποιούνται σχηματίζοντας δεμάτια δηλαδή σύνολα νευραξόνων με κοινή αρχή και τέλος και κοινή λειτουργία τα οποία συνιστούν τη λευκή ουσία του κεντρικού νευρικού συστήματος. Οι ποικίλοι τρόποι αντίδρασης των νευρώνων σε καταστάσεις βλάβης του νευρικού ιστού αντανακλούν τον υψηλό βαθμό μεταβολικής και λειτουργικής πολυπλοκότητάς τους. Έτσι σε καταστάσεις βλάβης του άξονα εμφανίζεται κεντρική χρωματόλυση (διάσπαση των σωματίων του Nissl) στο περικάρυο, διόγκωση του κύτταρου και απώθηση του πυρήνα προς την περιφέρεια, ενώ σε πλήρη διατομή το περιφερικό τμήμα εμφανίζει μείωση της διαμέτρου και απώλεια μυελίνης αλλοιώσεις 5

γνωστές ως βαλλεριανή εκφύλιση (Wallerian degeneration). Άλλοι χαρακτηριστικοί τρόποι αντίδρασης του νευρικού κυττάρου αφορούν στην συσσώρευση λιπιδίων στο κυτταρόπλασμα και σε διαταραχές της οργάνωσης του κυτταροσκελετού σε εκφυλιστικές καταστάσεις. Τα αστροκύτταρα αποτελούν τα μεγαλύτερα από τα κύτταρα της γλοίας. Έχουν σφαιρικό κεντρικά τοποθετημένο πυρήνα και πολλές αποφυάδες. Διακρίνονται σε πρωτοπλασματικά αστροκύτταρα που εντοπίζονται στη φαιά ουσία και ινώδη που εντοπίζονται στη λευκή ουσία. Οι αποφυάδες των αστροκυττάρων έρχονται σε άμεση επαφή με το αγγειακό τοίχωμα συμβάλλοντας έτσι στη δημιουργία του αιματοεγκεφαλικού φραγμού ενώ δημιουργούν ένα αφοριστικό πέταλο στην επιφάνεια του εγκεφάλου κάτω από την χοριοειδή μήνιγγα. Ο ρόλος τους είναι κυρίως στηρικτικός και τροφικός ενώ τα τελευταία χρόνια διαφαίνεται ολοένα και περισσότερο η συμβολή τους στην ομοιόσταση του ιοντικού νευρωνικού περιβάλλοντος και στη συναπτική διαβίβαση. Σε καταστάσεις βλάβης τα αστροκύτταρα υπερτρέφονται και σε κάποιο βαθμό υπερπλάσονται δημιουργώντας τη γλοίωση αναπληρώνοντας έτσι το έλλειμμα που άφησε η βλάβη. Τα ολιγοδενδροκύτταρα είναι μικρότερα σε μέγεθος από τα αστροκύτταρα και έχουν βραχύτερες και λιγότερες αποφυάδες από αυτά. Βρίσκονται τόσο στη φαιά ουσία κοντά στο σώμα του νευρικού κυττάρου όσο και στη λευκή ουσία κατά μήκος της πορείας και μεταξύ των αξόνων των νευρικών κυττάρων. Είναι υπεύθυνα για τη δημιουργία του ελύτρου της μυελίνης δημιουργώντας έτσι μια συμβιωτική σχέση με τους νευρώνες. Κάθε ολιγοδενδροκύτταρο είναι υπεύθυνο για τη μυελίνωση περισσοτέρων του ενός νευραξόνων. Τα επενδυματικά κύτταρα καλύπτουν την κοιλιακή επιφάνεια του νευρικού συστήματος διατηρώντας την επιθηλιακή τους διάταξη. Τα περισσότερα διαθέτουν κροσσούς βοηθώντας έτσι στη διακίνηση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού ενώ η έλλειψη αποφρακτικών ζωνών επιτρέπει στις ουσίες του ΕΝΥ να διέρχονται στον υποκείμενο νευρικό ιστό. Ένας ιδιαίτερος τύπος επενδυτικού κυττάρου το τανυκύτταρο που βρίσκεται στο έδαφος της τρίτης κοιλιάς και χαρακτηρίζεται από μια μακριά 6

αποφυάδα που εκτείνεται στον παρακείμενο νευρικό ιστό, πιστεύεται πως παίζει ρόλο στη μεταφορά χημικών σωμάτων από το ΕΝΥ προς περιοχές κάτωθεν του επενδύματος. Τέλος, τα μικρογλοιακά κύτταρα προερχόμενα από το σύστημα των μονοπυρήνων μακροφάγων εμφανίζουν επίμηκες σχήμα με αποφυάδες και επιμήκη πυρήνα. Διαθέτουν φαγοκυτταρικές ιδιότητες ενώ ενεργοποιούνται σε καταστάσεις βλάβης του νευρικού ιστού απομακρύνοντας τα κατεστραμμένα κυτταρικά στοιχεία. Βρίσκονται τόσο στη φαιά όσο και στη λευκή ουσία. Τα τελευταία χρόνια γίνεται πολύς λόγος για την εξωκυττάρια ουσία του νευρικού συστήματος. Ενώ μέχρι πρόσφατα θεωρείτο ότι η εξωκυττάρια ουσία στον εγκέφαλο ήταν ελάχιστη και περιοριζόμενη κυρίως γύρω από τα αγγεία σήμερα πιστεύεται ότι αποτελεί έως και το 20% του όγκου του εγκεφάλου. Η κατανομή της δεν είναι ομοιόμορφη και διακρίνονται διαφορές τόσο στη ποσότητα όσο και στη σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας. Στον παρακάτω πίνακα (1.1.1) παρουσιάζονται οι κυριότερες περιοχές εντόπισης της εξωκυττάριας ουσίας και η σύσταση τους. Πίνακας 1.1.1 Περιοχές εντόπισης εξωκυττάριας ουσίας Περιαγγειακός Χώρος (Βασική μεμβράνη) Κύρια συστατικά Κολλαγόνο IV, λαμινίνη, ινοδονεκτίνη, βιντρονεκτίνη Κάτωθεν της χοριοειδούς Μήνιγγας (subpial) Κολλαγόνο Ι, ΙΙΙ, ΙV, λαμινίνη, ινοδονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες Κάτωθεν του επενδύματος και των Χορειοδών πλεγμάτων Κολλαγόνο Ι, ΙΙΙ, ΙV, λαμινίνη, ινοδονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες Εγκεφαλικό παρέγχυμα Υαλουρονικό οξύ, θειική χονδροιτίνη, θειική ηπαράνη, θειική κερατάνη 7

Η εξωκυττάρια ουσία πιστεύεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του εγκεφάλου στις διεργασίες μετανάστευσης των αρχέγονων κυττάρων και στον καθορισμό της πορείας του αναπτυσσόμενου νευράξονα κατά τη δημιουργία των συνδέσεων (axon pathfinding). Ο ρόλος της όμως είναι σημαντικός και στον ώριμο εγκέφαλο τόσο σε φυσιολογικές διεργασίες όπως η μνήμη (εγκατάσταση του Long term pontensiation) όσο και σε παθολογικές καταστάσεις (εκφυλιστικές, απομυελινωτικές νόσους). Ιδιαίτερη σημασία δε φαίνεται να λαμβάνει στις διεργασίες μετανάστευσης και διήθησης των νεοπλασματικών κυττάρων των όγκων του εγκέφαλου 1. 8

1.2 Στοιχεία εμβρυϊκής ανάπτυξης του νευρικού συστήματος Είναι γνωστό ότι το νευρικό σύστημα προέρχεται από τη νευρική πλάκα, μια κεντρική περιοχή του εξωδέρματος, η οποία στα περιφερικά όριά της λόγω της έντονης πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας των κυττάρων «πτυχώνεται» δημιουργώντας τη νευρική αύλακα. Καθώς τα χείλη της νευρικής αύλακας διογκώνονται και συμπλησιάζουν στη μέση γραμμή αρχίζει να δημιουργείται ο νευρικός σωλήνας. Ο νευρικός σωλήνας παραμένει ανοιχτός στο κεφαλικό και ουραίο άκρο του στα αρχικά στάδια της ανάπτυξής του τα οποία και ονομάζονται αντίστοιχα πρόσθιος και οπίσθιος νευροπόρος και η σύγκλεισή του ολοκληρώνεται την 27 η περίπου ημέρα με το κλείσιμο του οπισθίου νευροπόρου. Σχήμα 1.2.1 Καθώς τα χείλη της νευρικής αύλακας συμπλησιάζουν προς τη μέση γραμμή ξεχωρίζει μια ομάδα κυττάρων και «αποκόπτεται» από το νευρικό σωλήνα. Αυτή η ομάδα κυττάρων του νευροεξωδέρματος συνιστά τη νευρική ακρολοφία από την οποία θα προέλθει το περιφερικό νευρικό σύστημα. Το κεντρικό νευρικό σύστημα προέρχεται από τη διαφοροποίηση τμημάτων του νευρικού σωλήνα, μια διαδικασία που συντελείται σε δύο άξονες: τον κεφαλοουραίο και τον κοιλιακό ραχιαίο άξονα. Η διαφοροποίηση κατά μήκος του κεφαλοουραίου άξονα είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη του προσθίου, του μέσου του οπισθίου εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού ενώ η διαφοροποίηση κατά μήκος του 9

κοιλιοραχιαίου άξονα θα οδηγήσει στη δημιουργία της εδαφιαίας και οροφιαίας περιοχής του νευρικού σωλήνα. Η θέση την οποία κατέχει ένα συγκεκριμένο κύτταρο στο σύστημα των δύο αξόνων πιστεύεται ότι είναι καθοριστική για την περαιτέρω πορεία του στις διαδικασίες της διαφοροποίησης. Αυτό συμβαίνει διότι η θέση του κυττάρου καθορίζει την έκθεσή του σε συγκεκριμένους διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται είτε από καθορισμένες περιοχές του αναπτυσσόμενου νευρικού σωλήνα, είτε από περιοχές του παρακείμενου μεσοδέρματος. Οι κυριότεροι παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για τη διαφοροποίηση κατά τον κοιλιακό ραχιαίο άξονα ανήκουν στις οικογένειες των Hedgehog και Bone Morphogenetic Protein (BMP) και ευθύνονται για τη διαμόρφωση της κοιλιακής και οροφιαίας περιοχής του νευρικού σωλήνα αντίστοιχα. Στον κεφαλοουραίο άξονα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο οι FGF, Wnt, sonic hedgehog και τα ρετινοειδή ενώ οι σημαντικότερες περιοχές έκκρισης αυτών είναι ο ισθμός (μια σημαντική περιοχή μεταξύ μέσου και οπισθίου εγκεφάλου), η zona limitans intrathalamica και το παρακείμενο μεσόδερμα (σχήμα1.2.2). Η έκθεση μιας περιοχής του νευρικού σωλήνα μια δεδομένη χρονική στιγμή σε συγκεκριμένο συνδυασμό και συγκέντρωση των παραγόντων αυτών έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση συγκεκριμένων κατηγοριών μεταγραφικών παραγόντων (ομοιοτικοί παράγοντες) που με τη σειρά τους επάγουν την μεταγραφή καθοριστικών για τη διαφοροποίηση γονιδίων. Η περιοχή αμέσως γύρω από το κοιλιακό σύστημα του αναπτυσσόμενου νευρικού σωλήνα (subventricular zone υποκοιλιακή ζώνη) είναι η περιοχή που εμφανίζεται κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του Κ.Ν.Σ. έντονη μιτωτική δραστηριότητα. Κύτταρα από την περιοχή αυτή μεταναστεύουν προς περιφερικότερα τμήματα του νευρικού σωλήνα είτε ακτινωτά, υποβοηθούμενα από τα radial glial cells, είτε εφαπτομενικά (tangential migration) δημιουργώντας το φλοιό, τα βασικά γάγγλια, τον οσφρητικό βολβό, τα οπτικά νεύρα κ.α. περιοχές του εγκεφάλου. 10

Σχήμα 1.2.2: α) Στον κοιλιοραχιαίο άξονα ο shh εκκρινόμενος από τη νωτιαία χορδή και ο ΒΜΡ από την οροφιαία πλάκα και το μεσόδερμα εγκαθιστούν συγκεκριμένο pattern έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων (Pax3, Pax7, Dbx2, Nkx6.1, Nkx2) της οικογένειας bhlh που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων καθοριστικών για τη διαφοροποίηση κινητικών (κοιλιακά) και αισθητικών (ραχιαία) νευρώνων. β) Καθορισμένες ομάδες κυττάρων στην περιοχή του ισθμού και της zona limitan intrathalamica εκκρίνουν διαλυτούς παράγοντες (FGF, Wnt, shh) σημαντικούς για τη διαφοροποίηση κατά τον κεφαλοουραίο άξονα. Κατά τη διάρκεια της μετανάστευσής τους υφίστανται τις διαδικασίες διαφοροποίησης προς τις διάφορες γλοιακές σειρές και τη νευρωνική σειρά (σχ.1.2.3.). Πολύπλοκες μοριακές αλλά και κυτταρικές αλληλεπιδράσεις ευθύνονται για την ρύθμιση των διαδικασιών πολλαπλασιασμού μετανάστευσης και διαφοροποίησης των αρχέγονων κυττάρων (σχήμα 1.2.4.) 2 11

Σχήμα 1.2.3 Ο Ψ άξονας παριστάνει το πάχος του νευρικού σωλήνα και ο Χ άξονας την πρόοδο του χρόνου έως τη γέννηση. Αρχέγονα κύτταρα υπό την επίδραση αυξητικών παραγόντων (FGF, EGF, κ.α.) πολλαπλασιάζονται, μεταναστεύουν και σταδιακά διαφοροποιούνται προς τις διάφορες γλοιακές σειρές και τη νευρωνική σειρά εκφράζοντας συγκεκριμένους μεμβρανικούς δείκτες για συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Σχήμα 1.2.4. Στο σχήμα αυτό παρουσιάζεται μία εγκάρσια διατομή του αναπτυσσόμενου νευρικού σωλήνα και φαίνεται η περιοχή της υποκοιλιακής ζώνης στην οποία κατά την εμβρυική ζωή παρατηρείται αυξημένος αριθμός κυτταρικών διαιρέσεων. Τα αρχέγονα νευρικά κύτταρα και τα πρόδρομα κύτταρα των νευρικών σειρών υπό την επίδραση του μικροπεριβάλλοντος αλλά και διαλυτών παραγόντων υφίσταται τις διαδικασίες διαφοροποίησης προς τις διάφορες σειρές νευρικών και γλοιακών κυττάρων. 12

1.3 Αρχέγονα νευρικά κύτταρα στον πλήρως ανεπτυγμένο εγκέφαλο. Στον εγκέφαλο του ενήλικου οργανισμού στην υποκοιλιακή ζώνη ιδίως της τρίτης κοιλίας και των πλαγίων κοιλιών καθώς και στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου εντοπίζονται τα πολυδύναμα νευρικά κύτταρα (Multipotent neuronal stem cells) (σχήμα 1.3.1). Τα αρχέγονα αυτά κύτταρα διατηρούν την πολλαπλασιαστική τους ικανότητα και πιστεύεται πως συμμετέχουν σε διαδικασίες αναγέννησης στον εγκέφαλο μεταναστεύοντας προς την περιοχή της βλάβης. Στο σχήμα 1.3.2. παρουσιάζονται τα στάδια διαφοροποίησης καθώς και οι σηματικότεροι μοριακοί μηχανισμοί ελέγχου της διαφοροποίησης και του πολλαπλασιασμού των αρχέγονων νευρικών κυττάρων 3. Τα τελευταία χρόνια ισχυροποιείται συνεχώς η άποψη ότι τα πολυδύναμα νευρικά κύτταρα είναι ο στόχος της κακοήθους εξαλλαγής που οδηγεί στην ανάπτυξη γλοιωμάτων, ενώ διαταραχές στους μοριακούς και γενετικούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση τους έχουν βρεθεί στους όγκους αυτούς. 4, 5 Σχήμα 1.3.1. Στα τοιχώματα της τρίτης κοιλίας, στα πλάγια τοιχώματα των πλαγίων κοιλιών καθώς και στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου παραμένουν στον ώριμο εγκέφαλο αρχέγονα κύτταρα του νευρικού ιστού τα οποία πιστεύεται ότι αποτελούν στόχο της κακοήθους εξαλλαγής 6. 13

Σχήμα 1.3.2 Στο παραπάνω διάγραμμα παρουσιάζονται οι οδοί διαφοροποίησης των αρχέγονων νευρικών κυττάρων προς τους ώριμους κυτταρικούς τύπους του νευρικού ιστού. Εμφανίζονται τα σημαντικότερα μοριακά μονοπάτια που διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στις διεργασίες πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. 14

1.4 Νεοπλάσματα του Κεντρικού Νευρικού συστήματος Τα νεοπλάσματα του κεντρικού νευρικού συστήματος διακρίνονται σε πρωτοπαθή και δευτεροπαθή ή μεταστατικά νεοπλάσματα, τα οποία είναι και συχνότερα. Τα πρωτοπαθή νεοπλάσματα συνιστούν μια ευρεία ομάδα με μεγάλη ποικιλία ως προς την ηλικία και θέση εμφάνισης, τη βιολογική συμπεριφορά, την πρόγνωση και τη θεραπεία. Προέρχονται από κακοήθη εξαλλαγή κυττάρων του νευρικού ιστού, των αγγείων, ή των περιβλημάτων (μηνίγγων) του εγκεφάλου. Επιδημιολογικά στοιχεία: Με βάση τα τελευταία δεδομένα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (2007) 7 τα πρωτοπαθή νεοπλάσματα του Κ.Ν.Σ. εμφανίζονται με συχνότητα 18 20 ανά 100.000 πληθυσμού και αποτελούν το 10% του συνόλου των νεοπλασιών. Το 10 20% των νεοπλασμάτων αυτών εμφανίζονται στα παιδιά αποτελώντας τον πρώτο σε συχνότητα συμπαγή όγκο της παιδικής ηλικίας και τον δεύτερο όλων των νεοπλασιών μετά τις λευχαιμίες. Στο 70% των περιπτώσεων οι όγκοι της παιδικής ηλικίας εντοπίζονται κάτωθεν του σκηνιδίου της παρεγκεφαλίδας, ενώ αντιθέτως το 70% των όγκων των ενηλίκων εντοπίζονται στο υπερσκηνίδιο επίπεδο. Η συχνότητα εμφάνισης των όγκων του εγκεφάλου κορυφώνεται στη μέση ηλικία ενώ παρουσιάζει μείωση τις τελευταίες 10/ετίες. Έως τη μέση ηλικία το 25% των όγκων είναι καλοήθεις ενώ το ποσοστό αυτό ανέρχεται στο 50% τις τελευταίες 10/ετίες της ζωής εξαιτίας της συχνότερης ανάπτυξης του μηνιγγιώματος και του σβανώματος. Πολύ μικρή υπεροχή στη συχνότητα ανάπτυξης ενδοκρανιακού πρωτοπαθούς όγκου εμφανίζουν οι άνδρες (55%) έναντι των γυναικών, η εμφάνιση όμως μηνιγγιώματος και σβανώματος είναι συχνότερη στις γυναίκες. Ταξινόμηση των νεοπλασμάτων του Κ.Ν.Σ.: Με βάση την τελευταία ταξινόμηση του παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας τα πρωτοπαθή νεοπλάσματα του Κ.Ν.Σ. ταξινομούνται στις κατηγορίες που 15

αναγράφονται στον πίνακα 1.4.1. Η ταξινόμηση αυτή βασίζεται εξ ολοκλήρου στα ιστολογικά χαρακτηριστικά των όγκων. Πίνακας 1.4.1 Ταξινόμηση των όγκων του Νευρικού συστήματος κατά W.H.O. 2007 16

Συνέχεια 17

Από τους πρωτοπαθείς όγκους του κεντρικού νευρικού συστήματος οι όγκοι νευροεπιθηλιακής αρχής αποτελούν τους πλέον συχνότερους σε ποσοστό 50 60%. Μεταξύ αυτών τα γλοιώματα είναι τα συχνότερα. Γλοιώματα είναι οι όγκοι με χαρακτηριστικά διαφοροποίησης αστροκυττάρων, ολιγοδενδροκυττάρων, επενδυματικών κυττάρων ή προδρόμων κυτταρικών μορφών τους. Τα αστροκυττώματα, τα ολιγοδενδρογλοιώματα και τα επενδυμώματα καθώς και μικτές μορφές συνιστούν την ομάδα των γλοιωμάτων. Τα αστροκυττώματα είναι τα συνηθέστερα 8. Σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας τα αστροκυττώματα ταξινομούνται σε τέσσερις βαθμίδες διαφοροποίησης με βάση τα ιστολογικά χαρακτηριστικά: κυτταροβριθεια, κυτταρικός πλειομορφισμός, πυρηνική ατυπία, αριθμός μιτώσεων, παρουσία νέκρωσης και μικροαγγειακό πολλαπλασιασμό. Έτσι τα grade II αστροκυττώματα ή διάχυτα αστροκυττώματα στα οποία συγκαταλέγονται τα ινώδη αστροκυττώματα, τα πρωτοπλασματικά αστροκυττώματα, και τα γεμιστοκυτταρικά αστροκυττώματα χαρακτηρίζονται από χαμηλή κυτταροβρίθεια και πυρηνική ατυπία ενώ δεν εμφανίζουν τα άλλα χαρακτηριστικά. Τα grade IIΙ (αναπλαστικά αστροκυττώματα) εκτός από την εντονότερη κυτταροβρίθεια και πυρηνική ατυπία εμφανίζουν και αυξημένο αριθμό μιτώσεων και τέλος στα grade IV (πολύμορφα γλοιοβλαστώματα) επιπροστίθεται η παρουσία νέκρωσης ή/και μικροαγγειακού πολλαπλασιασμού ως χαρακτηριστικό και διαγνωστικό ιστολογικό τους γνώρισμα 9. Στην ομάδα των grade I αστροκυττωμάτων ή πιλοκυτταρικών συγκαταλέγονται τα πολυμυξοειδικά αστροκυττώματα, το πλειομορφικό ξανθοαστροκύττωμα και το υποεπενδυματικό γιγαντοκυτταρικό αστροκύττωμα. Τα νεοπλάσματα αυτά είναι ιδιαίτερα σπάνια και χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερη βιολογική συμπεριφορά, ευνοϊκή πρόγνωση συνιστώντας ιδιαίτερη ομάδα 10. Ξεχωριστή κατηγορία κατάταξης αποτελεί στην τελευταία ταξινόμηση του W.H.O. η εγκεφαλική γλοιωμάτωση (gliomatosis cerebri) η οποία αποτελεί ιδιαίτερα 18

κακοήθη κατάσταση με υψηλό ποσοστό εμφάνισης γλοιώματος και δυσμενή πρόγνωση. Τα grade I και ΙΙ αστροκυττώματα χαρακτηρίζονται ως low grade νεοπλάσματα καλής διαφοροποίησης με καλύτερη πρόγνωση εν συγκρίσει με τα αναπλαστικά αστροκυττώματα (grade III) και τα πλέον αδιαφοροποίητα, επιθετικά πολύμορφα γλοιοβλαστώματα.(grade IV). Η ηλικία στην οποία εμφανίζονται συχνότερα τα grade ΙΙ αστροκυττώματα είναι η τρίτη δεκαετία της ζωής ενώ για τα αναπλαστικά αστροκυττώματα η 4 η δεκαετία. Το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εμφανίζεται σε μεγαλύτερες ηλικίες. Κύριο χαρακτηριστικό των αστροκυττωμάτων είναι η εξέλιξή τους από νεοπλάσματα καλής διαφοροποίησης σε περισσότερο κακοήθης μορφές όπως το αναπλαστικό αστροκύττωμα και το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα με μια διαδικασία που λαμβάνει χώρα σε διάστημα έως και 10 ετών. Η διεργασία αυτή που είναι γνωστή ως tumor progression είναι χαρακτηριστική για τα αστροκυττώματα και οφείλεται στη συσσώρευση όλο και περισσότερων γενετικών βλαβών, που οδηγούν στην απόκτηση κακοήθων χαρακτηριστικών (αποδιαφοροποίηση, αύξηση κυτταρικού πολλαπλασιασμού διηθητική ικανότητα). Είναι δυνατόν όμως να έχουμε την ανάπτυξη εξ αρχής (de novo) πολύμορφου γλοιοβλαστώματος χωρίς να αποτελεί εξέλιξη νεοπλάσματος χαμηλότερης βαθμίδας διαφοροποπίησης. Το νεόπλασμα αυτό (πρωτοπαθές πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εν αντιθέσει με το δευτεροπαθές) αναπτύσσεται σε άτομα μεγαλύτερης ηλικίας και είναι συχνότερο 11. Ιστολογικά δεν είναι δυνατόν να γίνει διάκρισή του από το δευτεροπαθές, διαφέρουν όμως στις γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις. Από τη στιγμή που θα εγκατασταθεί το δευτεροπαθές γλοιοβλάστωμα η κλινική του πορεία είναι το ίδιο δραματική με το πρωτοπαθές. Ένα επίσης χαρακτηριστικό των αστροκυττωμάτων είναι η ικανότητα τους να διηθούν το γειτονικό φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό γεγονός 19

Σχήμα 1.4.1 Δύο διαφορετικές οδοί δημιουργίας πολύμορφου γλοιοβλαστώματος το οποίο οδηγεί στην διασπορά καρκινικών κυττάρων σε απομακρυσμένες περιοχές από το σημείο δημιουργίας του όγκου. Η διήθηση του φυσιολογικού νευρικού ιστού συμβαίνει διαμέσου συγκεκριμένων ανατομικών δομών όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο σχετικό κεφάλαιο. Η διηθητική ανάπτυξη είναι ιδιαίτερα εμφανής στα κακής διαφοροποίησης νεοπλάσματα χωρίς να απουσιάζει όμως και από τα low grade και λόγω αυτού του χαρακτηριστικού τους ονομάζονται διάχυτα αστροκυττώματα (diffuse astrocytomas) 12. Λόγω του διηθητικού τρόπου ανάπτυξης τους τα αστροκυττώματα είναι ανθεκτικά στη χειρουργική θεραπεία και ακτινοθεραπεία ενώ η ανθεκτικότητά τους στα χημειοθεραπευτικά τα κατατάσσει στα πλέον χειρότερης πρόγνωσης νεοπλάσματα. Έτσι η μέση επιβίωση ασθενών με grade II αστροκύττωμα είναι 10 έτη, με αναπλαστικό αστροκύττωμα 2-3 έτη ενώ αυτών με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα σπάνια ξεπερνά τους 9-12 μήνες. 20

Σχήμα 1.4.2 Mακροσκοπική εμφάνιση πολύμορφου γλοιοβλαστώματος και low grade astrocytomas. Εμφανής είναι έντονη διηθητική ανάπτυξη η παρουσία νεκρώσεων και αιμορραγιών στο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα. α (low grade) β.(high grade) Σχήμα 1.4.3 Απεικόνιση στην MRI: Είναι χαρακτηριστική η απεικόνιση του καλής διαφοροποίησης γλοιώματος α. και του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος β. Στην περίπτωση του γλοιοβλαστώματος χαρακτηριστική είναι η παρουσία οιδήματος λόγω αυξημένης διατερατότητας των νεόπλαστων αγγείων και η παρουσία νέκρωσης. 21

Σχήμα 1.4.4 Ιστολογική εμφάνιση πιλοκυτταρικού αστρκυττώματος (αριστερά) και πολύμορφου γλοιοβλαστώματος (δεξιά). Είναι εμφανείς οι περιοχές νεκρώσεως στο πολύμορφο γλοιοβλάστωμα και η χαρακτηριστική διάταξη των κυττάρων του όγκου γύρω από αυτές. Προγνωστικοί παράγοντες για την εξέλιξη της νόσου Ο κυριότερος προγνωστικός παράγοντας για την πορεία της νόσου είναι η βαθμίδα ιστολογικής διαφοροποίησης (grade). Η πληροφορία αυτή αποτελεί σημαντικό προγνωστικό στοιχείο και λαμβάνεται σοβαρά υπόψιν στον καθορισμό του θεραπευτικού σχεδιασμού. Ευνοϊκοί προγνωστικοί παράγοντες αποτελούν η μικρή ηλικία, η καλή κατάσταση του ασθενούς, η απουσία νευρολογικών εκδηλώσεων, η θέση του όγκου και η μακροσκοπικά πλήρης εξαίρεση του όγκου. Η μεγάλη πρόοδος που έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια προς την κατεύθυνση της κατανόησης των μοριακών, γενετικών και επιγενετικών μηχανισμών ανάπτυξης των γλοιωμάτων οδηγεί σταδιακά σε νέες μεθόδους ταξινόμησης των όγκων αυτών και στην εισαγωγή νέων προγνωστικών παραγόντων (βλέπε επόμενο κεφάλαιο). Είναι γεγονός ότι η έρευνα στους μοριακούς μηχανισμούς της ανάπτυξης των αστροκυττωμάτων εκτός του ότι εισάγει σταδιακά νέους και ακριβέστερους τρόπους διάγνωσης, ανοίγει νέες θεραπευτικές προοπτικές για την αντιμετώπιση των όγκων αυτών. 22

Θεραπευτική αντιμετώπιση Η θεραπεία των αστροκυττωμάτων περιλαμβάνει την χειρουργική εξαίρεση του όγκου, την ακτινοθεραπεία και την χημειοθεραπεία 13. Η χειρουργική εξαίρεση του νεοπλάσματος αποτελεί τον ακρογωνιαίο λίθο στη θεραπεία των γλοιωμάτων. Πολλές φορές είναι αδύνατη η μακροσκοπικά πλήρης αφαίρεση του όγκου λόγω του ότι μπορεί να διηθεί σημαντικές δομές του εγκεφάλου, βλάβη στις οποίες επηρεάζει αρνητικά την νευρολογική έκβαση του ασθενούς και την ποιότητα ζωής του. Η χειρουργική θεραπεία έχει διπλό ρόλο στην αντιμετώπιση των ασθενών αυτών: πρώτον ανακουφίζει τον εγκέφαλο από τα πιεστικά φαινόμενα που προκαλεί η μάζα του όγκου και βελτιώνει την νευρολογική εικόνα του ασθενούς και δεύτερον η μακροσκοπικά πλήρης εξαίρεση του όγκου καθιστά αποτελεσματικότερες την ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία. Έχει αποδειχθεί ότι η χειρουργική εξαίρεση επί υγιών ορίων αυξάνει την επιβίωση του ασθενούς. Η ακτινοθεραπεία έχει θέση στην αντιμετώπιση των αστροκυττωμάτων και η αποτελεσματικότητά της αυξάνεται μετά την μακροσκοπικά πλήρη αφαίρεση του όγκου. Η ακτινοθεραπεία μπορεί να είναι στερεοτακτικά εντοπισμένη στην περιοχή του όγκου ή καθολική. Παράλληλα με την ακτινοθεραπεία ή συμπληρωματικά χορηγούνται σήμερα και χημειοθεραπευτικά σκευάσματα. Στο παρακάτω διάγραμμα εμφανίζεται το σχήμα χορήγησης χήμειο- και ακτινοθεραπείας. 23

Σχήμα 1.4.5. Στο παραπάνω διάγραμμα φαίνεται η τρέχουσα θεραπευτική προσέγγιση των γλοιωμάτων. Gliadel:carmustine, TMZ: temozolamide 24

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΓΛΟΙΩΜΑΤΩΝ 2.1 Κυτταρική προέλευση των γλοιωμάτων. Σύμφωνα με το περισσότερο διαδεδομένο σήμερα σύστημα ταξινόμησης των όγκων του Κ.Ν.Σ., αλλά και με παλαιότερα συστήματα, η ταξινόμηση των γλοιωμάτων βασίζεται πρωτίστως στα χαρακτηριστικά διαφοροποίησης των κυττάρων του όγκου. Έτσι διακρίνονται τα αστροκυττώματα, ολιγοδενδρογλοιώματα, επενδυμώματα καθώς και μικτοί όγκοι με βάση τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών κυττάρων. Το ερώτημα όμως που παραμένει αναπάντητο έως σήμερα αφορά στην κυτταρική προέλευση των όγκων αυτών σε ποιο κύτταρο δηλαδή συμβαίνει η κακοήθης εξαλλαγή. Τα τελευταία χρόνια έχει αποκαλυφθεί η παρουσία αρχέγονων κυττάρων (neural stem cells) καθώς και προδρομικών κυττάρων (glial progenitor cells) στον εγκέφαλο του ενηλίκου οργανισμού. Τα αρχέγονα νευρικά κύτταρα εντοπίζονται στην υποκοιλιακή ζώνη της τρίτης κοιλίας και των πλαγίων κοιλιών και στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου, ενώ τα προδρομικά γλοιακά κύτταρα είναι διάσπαρτα κυρίως στη λευκή αλλά και στη φαιά ουσία (σχήμα2.1.1). Τα αρχέγονα νευρικά κύτταρα είναι πολυδύναμα (multipotent) και έχουν τη δυνατότητα αυτοαναπαραγωγής και διαφοροποίησης προς κύτταρα νευρικών και γλοιακών σειρών 12. Τα προδρομικά γλοιακά κύτταρα προέρχονται από τα αρχέγονα κύτταρα, διατηρούν την ικανότητα αυτοαναπαραγωγής και βρίσκονται στην οδό διαφοροποίησης προς κύτταρα γλοιακών σειρών (αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα). Κατά τη διαδικασία της διααφοροποίησής τους αποκτούν συγκεκριμένους μοριακούς φαινότυπους εκφράζοντας χαρακτηριστικούς μοριακούς δείκτες επιφανείας. Τα τελευταία χρόνια 25

έχουν αποκαλυφθεί οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό και ρυθμίζουν την διαφοροποίηση των αρχέγονων και των προδρομικών κυττάρων. Έχει διαπιστωθεί ότι αυτοί οι μοριακοί μηχανισμοί βρίσκονται διαταραγμένοι στα γλοιώματα 13. Το γεγονός αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι τα αρχέγονα κύτταρα της υποκοιλιακής ζώνης ή τα προδρομικά γλοιακά κύτταρα θα μπορούσαν να αποτελούν στόχο κακοήθους εξαλλαγής λόγω του πολλαπλασιαστικού δυναμικού που έχουν. Η θεωρία αυτή παγιώνεται σήμερα όλο και περισσότερο λόγω της δυνατότητας που υπάρχει για απομόνωση και μελέτη in vitro των αρχέγονων και προδρομικών κυττάρων. Η κακοήθης εξαλαγή των αρχέγονων η προδρομικών γλοιακών κυττάρων κινητοποιεί μια ακολουθία κυτταρικών και μοριακών γεγονότων που καθιστά τα κυτταρα αυτά ευάλωτα στη συσσώρευση όλο και περισσοτέρων γενετικών βλαβών και τελικά στην πλήρη αποδιαφοροποίηση του κυττάρου 14. Η διαδικασία αυτή κινητοποιεί προγράμματα κυτταρικής μετανάστευσης, διήθησης και νεοαγγείωσης χαραχτηρισικά τα οποία είναι εμφανή στα γλοιώματα 15. Neural Stem Cells Glial progenitors GFAP+/Nestin+/CD133+ PDGFR+/NG2+/olig2+/A2B5+ multipontential oligodendrocyte lineage self renewing Phenotypic plasticity relatively few can revert located in S.V.Z. Capacity for self-renewal confined to a niche Abundant Widely distributed Potentially migratory Σχήμα 2.1.1 Στην υποκοιλιακή ζώνη των πλαγίων κοιλίων και στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου έχει πιστοποιηθεί στον ώριμο εγκέφαλο η υπάρξη αρχέγονων νευρικών κυττάρων (neural stem cells). Στα δεμάτια της λευκής ουσίας έχουν απομονωθεί πρόδρομα γλοιακά κύτταρα (glial progenitors) τα οποία αποτελούν το 4% του κυτταρικού πλυθησμού ενώ μικρότερος αριθμός έχει πιστοποιηθεί στη φαιά ουσία. 26

Σχήμα 2.1.2 Τα κύτταρα της υποκοιλιακής ζώνης είναι πολυδύναμα (multipotent) και έχουν τη δυνατότητα διαφοροποίησης προς νευρώνες όλων των ειδών και προς όλες τις σειρές των γλοιακών κυττάρων. Τα πρόδρομα γλοιακά κύτταρα διαφοροποιούνται προς αστροκύτταρα και ολιγοδενροκύτταρα ακολουθώντας διαφορετικές οδούς διαφοροποίησης. Στη διαδικασία επιλογής της οδού διαφοποποίησης σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν το μικροπεριβάλλον, διαλυτοί παράγοντες και η ενεργοποίηση εσωτερικών προγραμμάτων διαφοροποίησης. 2.2 H θεωρία των brain tumor stem cells. Τα τελευταία χρόνια υποστηρίζεται η άποψη της ύπαρξης των tumor stem cells σε πολλά νεοπλάσματα του ανθρώπου μεταξύ των οποίων και στα γλοιώματα. Τα glioma stem cells διαθέτουν ένα συνολο ιδιοτήτων που τους 27

επιτρέπουν να διαιρούνται συνεχώς και να αναπαράγουν όλα τα κυτταρικά στοιχεία του όγκου. Τελευταίες επιστημονικές έρευνες υποστηρίζουν την ύπαρξη tumor stem cells μεταξύ των νεοπλασματικών κυττάρων στα γλοιώματα με ιδιότητες που προσομοιάζουν στα αρχέγονα νευρικά κύτταρα (brain tumor stem-like cells) ή στα προδρομικά γλοιακά κύτταρα (brain tumor progenitor like cells) 16. Στο παρακάτω διάγραμμα (σχήμα 2.2.1) παρουσιάζονται συνοπτικά οι ιδιότητες των κυττάρων αυτών 17. Τα brain tumor stem cells έχουν διαταραγμένους τους μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης με αποτέλεσμα να συντελούν στη δημιουργία μιας άναρχα δομημένης μάζας κυττάρων που συνιστά τον νεοπλασματικό ιστό (σχήμα 2.2.2) 18,19. Brain Tumor Stem-Like Cells Non-migratory Confined to niche Slowly cycling Rare relative to Progenitor cells Self-renewing Symmetric or Asymmetric Division Capable of recapitulating all elements of tumor Brain tumor progenitor-like cells Migratory Non confined to niche More rapidly cycling Numerous relative to stem cells Self renewing Symmetric or asymmetric division Express markers of immature glia Plasic phenotype Σχήμα 2.2.1 Στο διπλανό διάγραμμα παρουσιάζεται η κατανομή και οι χαραχτηριστικές ιδιότητες των glioma stem like cells και των glioma progenitor-like cells 28

Σχήμα 2.2.2 Στο παραπάνω διάγραμμα εμφανίζονται οι διαδικασίες διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού των αρχέγονων νευρικών κυττάρων (α) και οι διεργασίες κακοήθους εξαλλαγής και δημιουργίας του όγκου (b). Τα brain tumor stem cells έχουν απωλέσει τους μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης με αποτέλεσμα να δημιουργουν μια άναρχα δομημένη μάζα κυττάρων που συνιστά την νεοπλασματική χωροεξεργασία. Η παρουσία των glioma stem cell (CD 133+) καθιστά τη θεραπεία των γλοιωμάτων δύσκολη και την πλήρη χειρουργική εξαίρεσή τους αδύνατη (σχήμα 2.2.3) 20. Σήμερα είναι δυνατή η απομόνωση των glioma stem cells και η μελέτη τους in vitro και σε ζωικά μοντέλα. Το γεγονός αυτό αφήνει ελπίδες για την εξεύρεση στοχευμένης θεραπείας για την εκρίζωση των γλοιωμάτων. 29

Σχήμα 2.2.3. Η χειρουργική θεραπεία αλλά και οι μέχρι σήμερα εφαρμοζόμενη ακτινιθεραπεία και χημειοθεραπεία οδηγούν σε μακροσκοπικά πλήρη αφαίρεση της χωροεξεργασίας. Παραμένουν όμως κάποια glioma stem cells είτε στην περικοιλιακή ζώνη, είτε σε εν τω βάθει περιοχές της λευκής ουσίας, είτε σε μικροεστίες (φωλιές) γύρω από τα αγγεία τα οποία ανθίσταται στις συμβατικές θεραπευτικές τεχνικές και ειναι υπεύθυνα για την επανεμφάνιση του όγκου. Η εκτενέστερη μελέτη της συμπεριφοράς και της μοριακής βιολογίας των tumor stem cells πιστεύεται ότι θα οδηγήσει στην επινόηση περισσότερο στοχευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων η εφαρμογή των οποίων μετά την μακροσκοπικά πλήρη χειρουργική εξαίρεση του όγκου θα οδηγήσει στην εκλεκτική εκρίζωση των κυττάρων αυτών και κατ επέκταση του όγκου. 30

2.3 Μοριακοί και γενετικοί μηχανισμοί στην ανάπτυξη των αστροκυττωμάτων. Παρότι εμφάνιση αστροκυττωμάτων έχει περιγραφεί στα πλαίσια κληρονομικών συνδρόμων τα νεοπλάσματα αυτά στην πλειονότητά τους είναι σποραδικά. Τα τελευταία χρόνια με την πρόοδο των μοριακών τεχνικών έχουν περιγραφεί πολλές μοριακές και γενετικές διαταραχές που εμπλέκονται στη δημιουργία και στη πρόοδο των αστροκυττωμάτων. Η πλειοψηφία των διαταραχών που έχουν έως σήμερα εντοπιστεί στα αστροκυττώματα αφορά μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου ή της απόπτωσης καθώς και μόρια που εμπλέκονται στην μεταναστευτική ικανότητα των γλοιακών κυττάρων. Πολλές επίσης από τις γενετικές βλάβες που απαντώνται στα αστροκυττώματα αφορούν μηχανισμούς που εμπλέκονται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των αρχέγονων κυττάρων του νευρικού ιστού. 21 Σύνδρομο Χρωμόσωμα Γονίδιο Όγκοι Κ.Ν.Σ. Άλλοι όγκοι Li Fraumeni 17 p13 P53 αστροκυττώματα αδενοκαρκίνωμα μαστού, μαλακών μορίων Νευρινωμάτωση τύπου Ι 17 p11 NF1 γλοιώματα οπτικού νεύρουνευροΐνώματα Φαιοχρωμοκύττωμα, Λευχαιμία σύνδρομο Turcot τύπου ΙΙ 3 p21, 7 p22 HMLH 1, HPSM 2 Αστροκυττώματα πολύποδες π. εντέρου / αδενοκαρκίνωμα οζώδης σκλήρυνση 9 q34, 16 p13 TSC 1 TSC2 Υποεπενδυματικά γλοιώματα Δερματικό αγγειοίνωμα, αμάρτωμα νεφρού. Σχήμα 2.3.1 Σύνδρομα που περιλαμβάνουν νεοπλάσματα Κ.Ν.Σ. Σύγχρονες μελέτες υποδεικνύουν ότι για την κακοήθη εξαλλαγή των γλοιακών κυττάρων δεν επαρκεί μία μόνο γενετική βλάβη αλλά απαιτείται η παρουσία συσσωρευμένων γενετικών βλαβών. Από τις πιο πρώιμες βλάβες στη διαδικασία της 31

γλοιοματογένεσης είναι η απώλεια ογκοκατασταλτικών γονιδίων-ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου ή των μονοπατιών μεταγωγής μιτογόνων σημάτων. Πολύ συχνές είναι επίσης και οι διαταραχές στους μεμβρανικούς υποδοχείς με δραστηριότητα κινάσης της τυροσίνης. Παρακάτω γίνεται μια σύντομη αναφορά στις κυριότερες μοριακές, γονιδιακές και χρωμοσωμικές βλάβες που απαντώνται στα αστροκυττώματα 22. Μεμβρανικοί υποδοχείς με δραστηριότητα κινάσης της τυροσίνης και ο ρόλος τους στα γλοιώματα. Η οικογένεια των μεμβρανικών υποδοχέων με δραστηριότητα κινάσης της τυροσίνης αριθμεί πάνω από είκοσι μέλη πολλά από τα γονίδια των οποίων εμφανίζονται ως ογκογονίδια σε πληθώρα νεοπλασμάτων. Σε ότι αφορά τα νεοπλάσματα του Κ.Ν.Σ. δύο από τους υποδοχείς αυτούς ο υποδοχέας του PDGF (PDGFRα και PDGFRβ) και ο υποδοχέας του EGF (EGFR) εμπλέκονται στους παθογενετικούς μηχανισμούς της ογκογένεσης. Και οι δύο αυτοί αυξητικοί παράγοντες έχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του εγκεφάλου. Ο ΕGF ενέχεται στην ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης των αρχέγονων νευρικών κυττάρων ενώ ο PDGF στη διαφοροποίηση των πρόδρομων γλοιακών κυττάρων. Η υπερέκφραση του PDGFR και του PDGF στα χαμηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα καθώς και του EGFR και EGF στα γλοιοβλαστώματα υποδηλώνει ότι τα μονοπάτια σηματοδότησης των υποδοχέων αυτών είναι κριτικής σημασίας στους αστροκυτταρικούς όγκους. Το αποτέλεσμα της πρόσδεσης του αυξητικού παράγοντα στον υποδοχέα οδηγεί σε διμερισμό και αυτοφοσφωρυλίωση του τελευταίου, αύξηση της δραστηριότητας κινάσης της τυροσίνης και δημιουργία θέσεων πρόσδεσης για ρυθμιστικές πρωτεΐνες με SH 2 περιοχές. Έτσι ξεκινά η ενεργοποίηση ενδοκυτταρίων βραχιόνων μεταγωγής σήματος όπως ο μονοπάτι Ras/MAPK (MAP Kinase) το 32

μονοπάτι της ΡΙ3-k/Αkt, η ενεργοποίηση της PLC-γ και η μεταγωγή μέσω JAK STAT δρόμου που έχουν ως αποτέλεσμα ενεργοποίηση του πολλαπλασιασμού και αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των γλοιακών κυττάρων. 23 PDGF/ PDGFR Ο ρόλος του PDGF φαίνεται πως είναι σημαντικός κατά την εμβρυϊκή ζωή για την ανάπτυξη του Κ.Ν.Σ. Κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης PDGF παράγεται από τα νευρικά κύτταρα και τα αστροκύτταρα ενώ ο PDGFRα εκφράζεται στα πρόδρομα γλοιακά και στα νευρικά κύτταρα. Στον εγκέφαλο του ενήλικα οργανισμού η έκφραση του PDGFRα περιορίζεται στα πολυδύναμα κύτταρα στην κοιλιακή ζώνη των πλαγίων, ενώ η έκφραση του PDGF είναι διάχυτη στους νευρώνες και τα αστροκύτταρα. Η έκφραση του PDGFRα στην υποκοιλιακή ζώνη υποδηλώνει το σημαντικό ρόλο του PDGF στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης καθώς και της μετανάστευσης των αρχέγονων κυττάρων τόσο κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, όσο και στον ενήλικα εγκέφαλο σε καταστάσεις αναγέννησης (μετά από τραύμα, ισχαιμία) όπου παρατηρείται μετανάστευση PDGFR(+) κυττάρων στην λευκή ουσία. Επιπλέον αναγνωρίζεται σήμερα ο ρόλος του PDGFRα στην μετανάστευση και διαφοροποίηση αρχέγονων κυττάρων σε νευρικά κύτταρα του οσφρητικού βολβού. Μελέτες σε καλώς διαφοροποιούμενα αστροκυττώματα έδειξαν αυξημένη έκφραση του PDGF/ PDGFR σε συνδυασμό με απώλεια της λειτουργίας της p53. Η ταυτόχρονη έκφραση του υποδοχέα και του προσδέτη δημιουργεί αυτοκρινή αγκύλη διέγερσης του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων η οποία σε συνδυασμό με την απώλεια λειτουργίας του p53 οδηγεί σε αυξημένη επιβίωσή τους. Η υπερέκφραση του PDGF και PDGFR στα χαμηλού βαθμού διαφοροποίησης αστροκυττώματα υποδηλώνει ότι τα μιτογόνα ερεθίσματα από τον PDGFR πιθανόν αποτελούν το εναρκτήριο γεγονός στη διαδικασία κακοήθους εξαλλαγής των αστροκυττωμάτων. Η συσσώρευση εν συνεχεία επιπρόσθετων γενετικών βλαβών 33

οδηγεί στην πρόοδο των καλώς διαφοροποιημένων αστροκυττωμάτων σε περισσότερο κακοήθεις όγκους όπως το αναπλαστικό αστροκύττωμα και το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα. EGF / EGFR Το γονίδιο του EGFR εμφανίζεται σε πολλά αντίγραφα (gene amplification) στο γονιδίωμα των νεοπλασματικών κυττάρων στο 50% των πρωτοπαθών γλοιοβλαστωμάτων και σε μικρό ποσοστό στα αναπλαστικά αστροκυττώματα. Η μικρή συχνότητα διαταραχών του EGF που παρατηρείται στα αναπλαστικά αστροκυττώματα υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση του EGFR μπορεί να είναι καθοριστική για την καθοδήγηση της νεοπλαστικής διεργασίας προς τον πλέον αδιαφοροποίητο όγκο, το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα. Εκτός από τη γονιδιακή ενίσχυση του EGFR, στο 40% των πρωτοπαθών γλοιοβλαστωμάτων εκφράζεται η μεταλλαγμένη του μορφή EGFR v ΙΙΙ η οποία λόγω του ότι παρουσιάζει έλλειψη σε ένα εξωκυττάριο τμήμα του, δεν απαιτεί την παρουσία του προσδέτη και είναι μονίμως ενεργοποιημένος. Επιπλέον ο ρυθμός ενδοκύττωσης και αποδόμησης του EGFR v ΙΙΙ είναι μειωμένος γεγονός που οδηγεί σε παράταση της δράσης του. Η παρουσία του EGFR v ΙΙΙ αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα δυσμενούς πρόγνωσης όπως υποστηρίζουν πρόσφατες μελέτες. Eκτός από τoν EGFR τα κύτταρα των γλοιοβλαστωμάτων εκφράζουν και τους προσδέτες EGR και TGF-α δημιουργώντας έτσι μια αυτοκρινή και παρακρινή διέγερση των κυττάρων του όγκου. Ο ρόλος του EGF και του EGFR στην εμβρυογένεση φαίνεται σημαντικός. Το peak της έκφρασης του FGFR συμπίπτει με το peak της γλοιογένεσης στην εμβρυϊκή και περιγεννητική περίοδο. Μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η κύρια δράση του ΕGF είναι η επίταση του πολλαπλασιασμού και επιβίωση των αρχέγονων κυττάρων και πιθανόν η διαφοροποίηση προς την αστροκυτταρική σειρά. Έχοντας τόσο σημαντική λειτουργία ο ΕGF δεν είναι παράλογο που διαταραχές στην σηματοδότησή του οδηγούν σε κακοήθη εξαλλαγή. 24 34

Τα ενδοκυττάρια μονοπάτια μεταγωγής σήματος κατόπιν ενεργοποίησης των υποδοχέων κινάσης της τυροσίνης (RTK). Σχήμα 2.3.2 Μονοπάτι των ΜΑΡ κινασών. Σχήμα 2.3.3 Μονοπάτι της ΡΙ3-k/Akt GSK: glucogen synthase kinase FKHR: forkhead/ winged helixprotein PDK pyravate dehydrogenase kinase. 35

Σχήμα 2.3.4 Ενεργοποίηση της PLC-γ CαΜΚ:Cα t2 /calmodulin dependent protein kinase DAG: Diacylglycerol, IP 3 : Inositol 1,4,5 triphashate. Σχήμα 2.3.5 Ενεργοποίηση του STAT δρόμου από τους RTKs Jak: Janns Kinase. 36

Σχήμα 2.3.6 Διμερισμός και ενεργοποίηση των RTKs μετά την πρόσδεση του κατάλληλου προσδέτη οδηγεί σε φοσφωρυλίωση του κυτταροπλασματικού τμήματος του RTK και αύξηση της δραστικότητας κινάσης Τyr. Η δημιουργία θέσεων πρόσθεσης προσαρμοστικών ρυθμιστικών πρωτεϊνών έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση πληθώρας σηματοδοτικών μορίων και ενζύμων που οδηγούν στην ενεργοποίηση των μονοπατιών μεταγωγής σήματος που φαίνονται στο σχήμα με τελικό αποτέλεσμα αύξηση του πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, διηθήσης και αγγειογέννεσης. Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 και ο ρόλος της στη γλοιωματογένεση. Μεταλλάξεις στο γονίδιο της p53 καθώς και απώλεια του χρωμοσώματος 17 p 13 (όπου εδράζεται το γονίδιο αυτό) παρατηρούνται με την ίδια συχνότητα σε καλής διαφοροποίησης αστροκυττώματα, σε αναπλαστικά αστροκυττώματα και σε δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η διαταραχή του p53 αποτελεί ένα από τα πρώιμα γεγονότα στη γλοιωματογένεση. Είναι γνωστό ότι το γονίδιο p53 είναι ογκοκατασταλτικό γονίδιο και η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί είναι σημαντική για τον έλεγχο 37

της ακεραιότητας του γενετικού υλικού ρυθμίζοντας την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στο σημείο G 1 -S. Σε καταστάσεις βλάβης του DNA η μεταγραφή του p53 αυξάνει μπλοκάροντας έτσι τον κυτταρικό κύκλο προκειμένου να δοθεί η δυνατότητα στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς να λειτουργήσουν, ενώ σε ακραίες περιπτώσεις οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση. Η λειτουργία της p53 επιτυγχάνεται με τη δράση της ως μεταγραφικός παράγοντας γονιδίων που σχετίζονται με τον έλεγχο στο G 1 -S σημείο, όπως είναι το γονίδιο της p21cip1 (ένας δυνητικός CDK-inhibitor) και γονιδίων με προαπτωτική δράση όπως το γονίδιο Bax. Η λειτουργία της p53 ρυθμίζεται από ένα σύνολο ρυθμιστικών πρωτεϊνών οι σημαντικότερες είναι η MDM- 2 και η p14 ARF. Η MDM-2 μειώνει την μεταγραφική δράση της p53 δεσμευόμενη στο ΝΗ 2 τελικό άκρο της και επίσης αυξάνει την αποδόμησή της από το σύστημα της ουβικουιτίνης. Έτσι, αύξηση της δραστηριότητας της MDM-2 οδηγεί σε σχετική έλλειψη της λειτουργίας της p53. Η πρωτεΐνη p14 ARF διαντιδρά με την MDM-2 και διευκολύνει την αποδόμηση της. Άρα απώλεια της p14 ARF οδηγεί σε αυξημένη δράση της MDM-2 και σχετική έλλειψη της λειτουργίας της p53. Το γεγονός ότι μεταλλάξεις ή ελλείψεις στο p53 γονίδιο παρατηρούνται από πολύ νωρίς στην διαδικασία της ογκογένεσης στο ΚΝΣ υποδηλώνει ότι η χαλάρωση των μηχανισμών ελέγχου στο G 1 S που επέρχεται μετά την απώλεια του p53, επιτρέπει τη συσσώρευση όλο και περισσότερων γενετικών βλαβών, οι οποίες οδηγούν σε περαιτέρω απορύθμιση του κυτταρικού κύκλου και αποδιαφοροποίηση με αποτέλεσμα την πρόοδο του όγκου σε πιο κακοήθης μορφές αστροκυττωμάτων. Το ποσοστό των μεταλλάξεων στο p53 και ελλείψεων στο 17 p στα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα είναι μικρότερο (10%) σε σχέση με αυτό στα δευτεροπαθή (>65%). Τα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό (50%) γονιδιακής ενίσχυσης για το γονίδιο MDM-2 και υψηλό ποσοστό (70%) βλαβών στο γονίδιο p14 ARF. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι δύο ιστοπαθολογικά μη διακριτές οντότητες το πρωτοπαθές και το δευτεροπαθές γλοιοβλάστωμα ενώ παρουσιάζουν διαφορές στη συχνότητα μεταλλάξεων σε συγκεκριμένα γονίδια ουσιαστικά οι βλάβες 38

αφορούν μονοπάτια που ελέγχουν τις ίδιες κυτταρικές λειτουργίες. (π.χ. ρύθμιση κυτταρικού κύκλου). 25 Το μονοπάτι του Rb και ο ρόλος του στα γεγονότα της γλοιωματογένεσης Η μετάβαση από τα καλώς διαφοροποιημένα αστροκυττώματα προς τα αναπλαστικά αστροκυττώματα χαρακτηρίζεται από αύξηση του αριθμού των μιτώσεων και σε καρυοτυπικό επίπεδο από απώλεια του χρωμοσώματος 9 p και 13 q και πολλές φορές ενίσχυση του 12 q. Σήμερα είναι πλέον γνωστό πως στις περιοχές αυτές εδράζονται γονίδια-κλειδιά για το μονοπάτι του Rb. Το γονίδιο του ρετινοβλαστώματος (RΒ) βρίσκεται στο 13 q14 χρωμόσωμα και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (prb 107-KD) με ρόλο κλειδί στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Η prb σε ηρεμούντα κύτταρα βρίσκεται σε κατάσταση υποφωσφορυλίωσης και δεσμεύει τον μεταγραφικό παράγοντα Ε 2 F, εμποδίζοντας έτσι τη μεταγραφή γονιδίων που είναι σημαντικά για την μίτωση σταματώντας τον κυτταρικό κύκλο στο όριο G 1 /S. Όταν η prb φωσφορυλιωθεί αποδεσμεύει τον Ε 2 F ώστε αυτός να δράσει ως μεταγραφικός παράγοντας και το κύτταρο εισέρχεται στη φάση S. Η φωσφορυλίωση του prb επιτυγχάνεται από τη δράση του συμπλέγματος cyclin D 1,2.3 /CDKs 2,4,6 καθώς και από την cyclin E/CDK2. Ανασταλτική δράση στη φωσφορυλίωση του prb γίνεται με την δράση των CDK Inhibitors (CKIs) όπως G 1 CDK4 και CDK6. Μιτογόνα ερεθίσματα τα οποία φθάνουν μέσω του δρόμου των ΜΑΡ κινασών οδηγούν σε αύξηση της μεταγραφής της κυκλίνης D 1 και επακολουθεί είσοδο του κύτταρου στη φάση S. Είναι αντιληπτό ότι μεταλλάξεις στην prb που την απενεργοποιούν, μεταλλάξεις που απενεργοποιούν τους CKI ή επιγενετικοί μηχανισμοί που μειώνουν τα επίπεδα των CKIs, καθώς και υπερέκφραση ή γονιδιακή ενίσχυση των D κυκλινών ή των CDK4, 6, οδηγούν σε μη ελεγχόμενη είσοδο του κυττάρου στην φάση S. Όλες οι παραπάνω διαταραχές έχουν παρατηρηθεί στα γλοιώματα. 39

Σε ότι αφορά το γονίδιο RB, μεταλλάξεις του έχουν περιγραφεί σε ποσοστό έως και 40% σε χαμηλής διαφοροποίησης αστροκυττώματα και οδηγούν σε απενεργοποίησή του. Το δεύτερο συστατικό του μονοπατιού του RB τα μέλη της οικογένειας των cyclin dependent kinase CDK 4 και 6 βρίσκονται διαταραγμένα σε ποσοστό έως και 15% στα κακοήθη γλοιώματα. Συγκεκριμένα το γονίδιο της CDK4 βρίσκεται στο 12 q χρωμόσωμα και παρουσιάζεται ενισχυμένο 10 έως 100 φορές. Το γονίδιο της CDK6 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 7 q και σε μικρό αριθμό περιπτώσεων όγκοι που δεν έχουν μεταλλάξεις στο Rb ή γονιδιακή ενίσχυση στο CDK4 παρουσιάζουν ενισχυμένο το γονίδιο CDK6, υποδηλώνοντας ότι τα τρία αυτά γονίδια δρουν ισότιμα λειτουργικά στην διεργασία της ογκογέννεσης. Δύο άλλα γονίδια που σχετίζεται με το μονοπάτι του Rb βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9 q και στον γενετικό τόπο ΙΝΚ4α που συχνά απουσιάζει στα αναπλαστικά αστροκυττώματα. Στην θέση αυτή υπάρχουν τα γονίδια ΙΝΚ4α και ΙΝΚ4b που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες p16 ΙΝΚ4b και p14 ARF αντίστοιχα. To μόριo p16 ΙΝΚ4b λειτουργεί ως CDKI αναστέλλοντας τη σύνδεση της ενεργοποιημένης κυκλίνης D 1 στην CDK4/6. Το αποτέλεσμα της δράσης του είναι η μειωμένη φοσφωρυλίωση του prb και έτσι η αναστολή της εισόδου του κυττάρου στη φάση S. Απώλεια της πρωτεΐνης αυτής οδηγεί σε υπερφωσφορυλίωση της prb αύξηση της δραστηριότητας του Ε 2 F και η μη ελεγχόμενη είσοδο του κυττάρου στην φάση S. Μεταλλάξεις στη γαμετική σειρά της ΙΝΚ/4α προδιαθέτει στην ανάπτυξη μελανώματος και αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος όχι όμως σε γλοιώματα. Ωστόσο απενεργοποίηση της p16 ΙΝΚ4b έχει βρεθεί σε ποσοστό 50 70% αναπλαστικών αστροκυττωμάτων και περίπου στο 90% των γλοιοβλαστωμάτων σποραδικών περιπτώσεων. Η απενεργοποίηση της p16 ΙΝΚ/4b συμβαίνει είτε λόγω ομόζυγης απώλειας του 9 p χρωμοσώματος είτε λόγω σημειακών μεταλλάξεων ή υπερμεθυλίωσης στην κωδικοποιήσα περιοχή του γονιδίου ΙΝΚ/4α. Η περιοχή του 9 p χρωμοσώματος είναι σημαντική και για ακόμη έναν λόγο. Από το γονίδιο ΙΝΚ4α χρησιμοποιώντας διαφορετικό πλαίσιο ανάγνωσης προέρχεται η πρωτεΐνη p14 ARF (από το Alternate Reading Frame). Η πρωτεΐνη ατή όπως 40