ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΑΛΛΟΙΩΣΕΩΝ:ΈΝΑ ΚΥΝΗΓΙ ΘΗΣΑΥΡΟΥ Σοφοκλέους Χριστάλενα, Μοριακή Βιολόγος Η επιγενετική αναφέρεται σε αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων, σταθερές κατά τη διάρκεια της ζωής ενός οργανισμού, που επέρχονται λόγω αλλαγών στα χρωμοσώματα, χωρίς όμως να διαφοροποιείται η αλληλουχία του DNA. Επιγενετικές αλλαγές παρατηρούνται σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης και συχνά ως αντίδραση σε περιβαλλοντικές αλλαγές, όπως η έκθεση σε τοξικές ουσίες ή το χρόνιο στρες. Επιγενετικοί μηχανισμοί γονιδιακής ρύθμισης διαμορφώνουν το επιγονιδίωμα («επιγενετικό κώδικα») και περιλαμβάνουν χημικές τροποποιήσεις όπως η μεθυλίωση DNA, η ακετυλίωση και απακετυλίωση των ιστονών καθώς και έκφραση noncoding RNAs (ncrnas/mirnas) που αλλοιώνουν την μεταγραφική διαδικασία σε ιστοειδικό ή κυτταροειδικό επίπεδο. (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Επιγενετικές τροποποιήσεις. Οδηγούν στη διαμόρφωση της χρωματίνης σε ανοικτή δομή προσβάσιμη στους μεταγραφικούς παράγοντες (ευχρωματίνη) και κλειστή δομή μη προσβάσιμη στους μεταγραφικούς παράγοντες (ετεροχρωματίνη). Μεθυλίωση DNA Αποτελεί τον πιο καλά χαρακτηρισμένο επιγενετικό δείκτη Σχετίζεται με μεταγραφική αποσιώπηση και Είναι σημαντική για την ρύθμιση των γονιδίων, την ανάπτυξη αλλά και την καρκινογένεση
Η μελέτη του προτύπου μεθυλίωσης DNA περιλαμβάνει πληθώρα διαφορετικών εργαστηριακών προσεγγίσεων που βασίζονται στη: 1. Δυνατότητα επεξεργασίας του DNA με Sodium Bisulfite (δι-θειώδες νάτριο) που επάγοντας την απαμίνωση των ελέυθερων κυτοσινων σε ουρακίλες ενώ οι 5-mC παραμένουν άθικτες μετατρέπει μια επιγενετική αλλαγή σε γενετική. Οι ουρακίλες πολλαπλασιάζονται ως θυμίνες κατά την διάρκεια ενός PCR ενώ οι άθικτες 5-m κυτοσίνες παραμένουν κυτοσίνες επιτρέποντας την διαφοροδιάκριση των δύο αλληλουχιών. Συνδυάζεται με πολλαπλασιασμό PCR και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμa αγαρόζης (Methylation Specific PCR), αλληλούχηση (direct sequencing), PCR πραγματικού χρόνου, MS-HRM (Hgh Resolution Melting Curve Analysis), τεχνολογία συνδυασμένη με μικροσυστοιχίες κ.α. 2. Χρήση περιοριστικών ενδονουκλεασών των οποίων η αλληλουχία στόχος καταργείται παρουσία μεθυλομάδων. Έτσι επιτρέπεται η δημιουργία τμημάτων DNA που είτε διαφεύγουν του πολλαπλασιασμού είτε δίνουν προϊόντα που διαφοροποιούνται με βάση το μέγεθος τους και ανιχνεύονται με μεθόδους περισσότερο ή λιγότερο αυτοματοποιημένες. Την πιο διαδεδομένη εφαρμογή αποτελεί το HUMARA τεστ (Human Androgen Receptor Assay) που επιτρέπει τη μελέτη του προτυπου μεθυλίωσης του χρωμοσωματος Χ καθώς και το Methylation Specific Multiple Ligaion Probe Analysis. Συχνά συνδυάζεται και με τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου και μικροσυστοιχιών 3. Δυνατότητα ανοσο-κατακρήμνισης μεθυλιωμένου DNA. Στηρίζεται στη χρήση ειδικών για 5-μεθυλκυτιδίνες αντισωμάτων και συνδυάζεται με μικροσυστοιχίες και αληλούχηση υψηλής ευκρίνειας. Μελέτη ιστονικών τροποποίησεων (Ιστονικός Κώδικας) Στηρίζεται στη χρήση αντισωμάτων ειδικών γα την αναγνώριση των διαφορετικών ιστονικών τροποποιήσεων. Η πιο ευρέως διαδεδομένη προσέγγιση περιλαμβάνει την ανοσοκατακρήμνιση της χρωματίνης (ChIP, Chromatin Immunoprecipitation) κατά την οποία πρωτεΐνες και DNA διασταυρώνονται και κατακερματίζονται για να ακολουθήσει επεξεργασία με αντισώματα ειδικά για μια τροποποίηση ή μια πρωτεΐνη πρόσδεσης στο DNA. Η πληθώρα των τεχνικών δυνατοτήτων μελέτης των επιγενετικών αλλοιώσεων οδήγησαν στην έναρξη πολλαπλών προγραμμάτων μελέτης του επιγονιδιώματος (με πρώτο το HEP, Human Epigenome Project το 2000) που επέτρεψαν τόσο το χαρακτηρισμό του
πολυεπίπεδου χαρακτήρα του επιγενετικού κώδικα όσο και την κατανόηση κάποιων από του μηχανισμούς που οδηγούν στην εκδήλωση νοσημάτων όπως: Α. Σύνδρομα γονιδιακής αποτύπωσης: Σύμφωνα με τη γονιδιακή αποτύπωση η οποία ρυθμίζεται από τα κέντρα γονιδιακής αποτύπωσης (Genomic Imprinting Center), συγκεκριμένες γενετικές θέσεις υπόκεινται σε μεθυλίωση σύμφωνα με την γονεϊκή τους προέλευση έτσι ώστε να εξασφαλίζεται μονοαλληλική έκφραση γονιδίων. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν τα σύνδρομα Angelman, Prader Willi, Beckwith-Wiedemann και Silver-Russell. Στα νοσήματα αυτά η επιγενετική αλλοίωση αφορά την παρουσία μόνο μεθυλιωμένων ή μόνο μη μεθυλιωμένων αλληλομόρφων (αντί για ένα μεθυλιωμένο και ένα μη μεθυλιωμένο) που προκαλείταιαπο διαφόρου τύπου μοριακές βλάβες: ελλείμματα, μονογονεική δισωμία και μεταλλάξεις στο κέντρο γονιδιακής αποτύπωσης. Το αποτέλεσμα είναι η μη φυσιολογική έκφραση γονιδίων (υπερέκφραση ή αποσιώπηση). Η εργαστηριακή επιβεβαίωση περιλαμβάνει την εφαρμογή MS- PCR, MS-MLPA (εικόνα 2), ΜS-HRM σε συνδυασμό με ανάλυση θραυσμάτων για τον χαρακτηρισμό της βλάβης. Εικόνα 2. Χαρακτηριστικό πρότυπο ανάλυσης MS-MLPA σε ασθενή με σ. Silver-Russel. Η απουσία προϊόντων για την περιοχή Η19DMR1C1 είναι ενδεικτική για την αλλαγή του προτύπου μεθυλίωσης της περιοχής Β. Νεοπλασίες Καρκίνος Οι επιγενετικές αλλοιώσεις που συναντώνται σε νεοπλασίες-καρκίνους αφορούν υπέρ ή υπό μεθυλίωση υποκινητών ή και άλλων γονιδιακών περιοχών με συνέπεια τη μη φυσιολογική έκφραση γονιδίων (έκφραση ογκογονιδίων και αποσιώπηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων). Συνήθως οφείλεται σε λάθη στη διαμόρφωση του επιγενετικού κώδικα λόγω σωματικών γενετικών μεταλλάξεων ή επιγενετικών μεταλλάξεων.
Γ. Φυλοσύνδετα νοσήματα με διαφοροποίηση του φαινοτύπου θήλεων-φορέων λόγω μη τυχαίας απενεργοποίησης του χρωμοσώματος Χ. Σύμφωνα με τους κλασικούς νόμους του Mendel στα φυλοσύνδετα νοσήματα παρατηρείται εκδήλωση νοσημάτων σε άρρενες ασθενείς επειδή φέρουν ένα μόνο χρωμόσωμα Χ στο οποίο εντοπίζεται η βλάβη ενώ τα θήλεα άτομα χαρακτηρίζονται ως φορείς που δεν αναμένεται να εκδηλώσουν συμπτώματα επειδή η παρουσία ενός δεύτερου χρωμοσώματος Χ λειτουργεί εξισορροπητικά. Σε περιπτώσεις όπου η φυσική διαδικασία απενεργοποίησης του ενός χρωμοσώματος Χ (θεωρία της Mary Lyon) δεν ολοκληρώνεται με τυχαίο τρόπο περιγράφονται κλινικές εκδηλώσεις ποικίλου βαθμού ακόμα και σε θήλεα άτομα. Σε φορείς φυλοσύνδετων νοσημάτων όπως η μυϊκή δυστροφία Duchenne και η αιμοροφιλία είναι δυνατό να παρατηρείται επιλεκτική αποσιώπηση του φυσιολογικού αλληλομόρφου χρωμοσώματος Χ. Σε αυτά τα περιστατικά παρατηρείται επιλεκτική αριθμητική υπεροχή των κυτττάρω (>>50% των κυττάρων) που εκφράζουν το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο και απώλεια εξισορρόπησης λόγω γενετικών ή επιγενετικών μεταλλάξεων στο μονοπάτι της διαδικασίας της απενεργοποίησης του χρωμοσώματος Χ. Η εργαστηριακή διερεύνηση περιλαμβάνει την εφαρμογή του ΗUMARA Test (Εικόνα 3) που χρησιμοποιεί την ευρύτερη περιοχή της πολυμορφικής τρινουλεοτιδικής αλληλουχίας CAG του εξωνίου 1 του υποδοχέα των ανδρογόνων η οποία υπόκειται σε μεθυλίωση και αντικατοπτρίζει το πρότυπο μεθυλίωσης των χρωοσωμάτων Χ. Εικόνα 3. Πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας CAG και κάθετη ηλεκτροφόρηση για διαχωρισμό θραυσμάτων μετά από πέψη με ειδικά για μεθυλίωση περιοριστικά ένζυμα που έχει σαν αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό των μεθυλιωμένων μόνο αλληλομόρφων. Παρουσία δύο διαφορετικών αληλομόρφων με 20 και 24 επαναλήψεις αντίστοιχα σε αναλογία 50:50, 70:30 και 99:1 Δ. Μονογονιδιακά σύνδρομα με επιπτώσεις στον επιγενετικό κώδικα Περιλαμβάνει τα σύνδρομα Rett και ATRX όπου η επιγενετική επίπτωση αφορά αλλαγές στο πρότυπο μεθυλίωσης γονιδίων, απώλεια μεταγραφικών παραγόντων πρόσδεσης σε μεθυλίωση και τροποποιήσεις ιστονών που οδηγούν σε απορύθμιση γονιδιακής έκφρασης. Τα σύνδρομα αυτά οφείλονται σε μεταλλάξεις γονιδίων που κωδικοποιούν για μεθυλοτρανσφεράσες (γονίδιο DNMT3B στο σύνδρομο ATRX), ή μεταγραφικούς παράγοντες (γονίδιο MECP2 στο σ. Rett) ή ακετυλάσες και αποακετυλάσες. Συνοπτικά στα σύνδρομα αυτά μία γενετική βλάβη έχει σαν αποτέλεσμα ως επιγενετική αλλοίωση.
E. Πολυπαραγοντικά xρόνια νοσήματα Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν τα νοσήματα: Άσθμα, αλλεργία, χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια Aυτισμός-ΔΑΦ, ψυχικά νοσήματα, νόσος Alzheimer, επιληψία Μεταβολικό σύνδρομο (παχυσαρκία,υπέρταση,σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2) Ρευματοειδής αρθρίτιδα, οστεοπόρωση, οστεοαρθρίτιδα Αυτοάνοσα νοσήματα (συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, Sjogren ) Καρκίνοι (προστάτη,ωοθηκών,ήπατος,κόλου ), λευχαιμίες, μυελοδυσπλασίες Kαρδιακά νοσήματα (στεφανιαία νόσος, διατατική μυοκαρδιοπάθεια,καρδιακή ανεπάρκεια) Στα νοσήματα αυτά φαίνεται ότι οι μηχανισμοί γονιδιακής απορρύθμισης ενεργοποιούνται από εξωγενείς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Η μελέτη τους είναι πολυεπίπεδη τόσο γονίδια στόχους (π.χ σε υποδοχείς κορτικοστεροειδών στην περίπτωση ψυχικών νοσημάτων) όσο και σε επίπεδο αναδιάταξης της χρωματίνης (ChIp-chip, ChIp-seq, σε global DNA methylation analysis, statistics & bioinformatics). Περισσότερες πληροφορίες αναμένονται από προοπτικές επιδημιολογικές μελέτες και μέτα-αναλύσεις (environment wide association studies, EWAS) ιδιαίτερα σε πληθυσμούς μονοζυγωτικών διδύμων όπου επειδή το γενετικό υπόβαθρο είναι το ίδιο επιτρέπεται η συσχέτιση με περιβαλλοντικές επιδράσεις. Το επιγενετικό προφίλ όπως διαμορφώνεται από τις αλληλεπιδράσεις γονιδιώματος και περιβαλλοντικών ερεθισμάτων είναι πιθανό να επιτρέψει την ανάπτυξη εξατομικευμένων στοχευμένων θεραπειών με την χρήση σκευασμάτων απακετυλίωσης ιστονών, απομεθυλίωσης του DNA και αναστολής των mirnas. Epigenetics, Understanding Histone & DNA modifications, New England Biolabs Epigenetics: www.sabiosciences.com Epigenetic Analysis, Applications &Technologies, Bio-Rad Biotechniques The International Journal for Life Science Methods, Vol55, No4 Oct 2013 p 181-197 WWW.NYAS.ORG Kanherkar RR et al. (2014) Epigenetics across the human lifespan. Front. Cell Dev. Biol. 2:49. "Epigenetic Therapies and Biomarkers" Pharmaceuticals Special Issue 2013