H Χρήση του DNA και της τεχνολογίας DNA-Barcoding για την μελέτη της βιοποικιλότητας και τη διάκριση των ειδών και των τοπικών ποικιλιών οσπρίων

H Χρήση του DNA και της τεχνολογίας DNA-Barcoding για την μελέτη της βιοποικιλότητας και τη διάκριση των ειδών και των τοπικών ποικιλιών οσπρίων Dr. Παναγιώτης Μαδέσης pmadesis@certh.gr Ι. Γανόπουλος, Ει. Μποσμαλή Κ. Πασέντσης, Α. Τσαυτάρης Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών

Φυτογενετικοί πόροι και τοπικές ποικιλίες Φυτογενετικοί πόροι είναι το σύνολο του γενετικού υλικού των φυτών (άγριων και καλλιεργούμενων). Αποτελούν τη βάση για την ανάπτυξη: της γεωργίας, της δασοπονίας και της ανθοκομίας. και συμβάλλουν στη βελτίωση: της διατροφής, της υγείας και του φυσικού περιβάλλοντος. Παίζουν σημαντικό ρόλο στη βελτίωση των καλλιεργούμενων ποικιλιών

Φυτογενετικοί πόροι και τοπικές ποικιλίες Σημαντικοί για την τοπική κοινωνία: προσαρμοσμένοι στις τοπικές συνθήκες και πολλές φορές έχουν ιδιαίτερη θρεπτική και οικονομική σημασία Σημαντικοί για την Βελτίωση γιατί αποτελούν την πηγή πολύτιμων γονιδίων για την δημιουργία νέων ποικιλιών Γενετική διάβρωση: έχουν χαθεί πάνω από 90% των ποικιλιών σίτου και λαχανοκομικών ειδών που υπήρχαν πριν 50 χρόνια

Όσπρια Πολύ σημαντική οικογένεια δεύτερη μετά από τα σιτηρά σε σχέση με την παραγωγή και την έκταση που καλλιεργούνται Τα φασόλια είναι το ποιο σημαντικό είδος από πλευράς οικονομικότητας Το ένα τρίτο της πρωτεΐνης και του επεξεργασμένου φυτικού ελαίου που καταναλώνει ο άνθρωπος προέρχεται από τα όσπρια Σημαντικά για την διατήρηση της καλής υγείας του ανθρώπου Σημαντικά για την αειφόρο γεωργία λόγω της αζωτοδέσμευσης Στην Ελλάδα καλλιεργούνται σημαντικές ποικιλίες ΠΟΠ και ΠΓΕ

Αναγνώριση και ταυτοποίηση των ειδών και των ποικιλιών Δείκτες Φαινοτυπικοί Βιοχημικοί DNA μοριακοί δείκτες Μικροδορυφόροι (SSR + HRM) Χλωροπλαστικοί (DNA Barcoding + HRM)

Τι είναι οι μικροδορυφόροι? Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες με ένα μοτίβο επανάληψης 1-6 Dinucleotide (CT)6 - CTCTCTCTCTCT Trinucleotide (CTG)4 - CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide (ACTC)4 - ACTCACTCACTCACTC Υποκατηγορίες Perfect repeat when repeat tract pure for one motif Compound SSR when repeat tract pure for two motifs Imperfect SSR if single base substitution Region of cryptic simplicity if complex but repetitive structure CTCTCTCTCTCT CTCTCTCACACA CTCTCTACTCTCT GTGTCACAGAGT

Απλές Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (SSRs)

Τι είναι το DNA barcoding ; (Γραμμωτός κώδικας DNA) Η παραγωγή μικρών αλληλουχιών DNA που επιτρέπουν την αναγνώριση ειδών ή την αναγνώριση συγκεκριμένων ειδών σε συγκεκριμένους τομείς του δέντρου της ζωής (ευκαριωτικούς οργανισμούς).

Τι είναι το DNA barcoding ; In 2003, Paul Hebert, researcher at the University of Guelph in Ontario, Canada, proposed DNA barcoding as a way to identify species. Barcoding uses a very short genetic sequence from a standard part of the genome the way a supermarket scanner distinguishes products using the black stripes of the Universal Product Code (UPC). Two items may look very similar to the untrained eye, but in both cases the barcodes are distinct. http://www.barcodeoflife.org/content/about/what-dna-barcoding

Xλωροπλάστης Τα φυτικά κύτταρα έχουν 3 γονιδιώματα Μιτοχόνδρια Πυρήνας

Χλωροπλαστικό γονιδίωμα Μικρό και συμπαγές 50-290 kbp Περιέχει 100-120 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες για τη φωτοσύνθεση και για την έκφραση αυτών Ο ρυθμός υποκατάστασης είναι 0.2-1 χ 10-9 Στον πυρήνα 5-30 χ 10-9 1:3:12 μιτοχονδριο:χλωροπλαστης:πυρήνας 155.943 bp 155.943 bp Sugiura et. al. 1986, 2005

Επιλογή μιας κατάλληλης για τα φυτά περιοχής για Barcoding Έχουν προταθεί 7 περιοχές rpoc1<rpob<atpf atph<rbcl<matk<psbk psbi<trnh psba; και 3 έχουν προεπιλεχθεί rbcl : είναι εύκολη στην χρήση αλλά με μικρή διαχωριστική ικανότητα matk : έχει μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα αλλά μικρότερη καθολικότητα trnh- psba : καλή καθολικότητα, μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα αλλά μεταβλητό μέγεθος και οι αλληλουχίες συχνά σταματούν από SSRs

HRM-Ηigh Resolution Melting Yψηλής διακριτικής ικανότητας καμπυλών τήξης Τεχνική που μετράει τη θερμοκρασία τήξης ενός ενισχυμένου προϊόντος. Μοναδική για κάθε προϊόν, υπάρχει η δυνατότητα παρακολούθησης της αύξησης του φθορισμού που σχετίζεται με το άνοιγμα του δίκλωνου DNA. Οι λαμβανόμενες καμπύλες HRM είναι ιδιαίτερα χαρακτηριστικές για κάθε ενισχυόμενο προϊόν και εξαρτώνται από το GC περιεχόμενο του, το μήκος του ενισχυόμενου προϊόντος καθώς και την αλληλουχία του.

Εφαρμογές του Barcoding 1) Έρευνα και καταγραφή της βιοποικιλότητας, π.χ., αναγνώριση δυνητικών νέων (μη χαρακτηρισμένων) ειδών 2) Διευκόλυνση αναγνώρισης ειδών που έχουν ήδη περιγραφεί : Συνδέει εξελικτικά στάδια, είδη; Διαφοροποίηση κρυπτικών ειδών Αναγνώριση φυτών και τροφίμων με ονομασία προέλευσης Αναγνώριση προσμίξεων σε ΠΟΠ τρόφιμα

DNA Barcoding Ταυτοποίηση ειδών Barcoding σημαντικών για τον ελληνικό χώρο οικογενειών (ψυχανθή, δενδροκομικά είδη κ.α) ΠΟΠ προϊόντα

Ψυχανθή

Διαχωριστική ικανότητα των Barcoding περιοχών στα ψυχανθή trnl=its2>rpoc Από τα 25 είδη oι περιοχές trnl και ITS2 διαχώρισαν και τα 25 ενώ η rpoc διαχώρισε τα 18/25

Είδη Ψυχανθών Χρησιμοποιώντας την περιοχή trnl και τη βοήθεια της Bar-HRM μεθόδου Διαχωρίζουμε τα έιδη των ψυχανθών Έχει ενδιαφέρον να σημειώσουμε ότι διαχωρίζονται τα είδη λαθουριού και Τα κουκιά Chloroplast trnl region

Είδη Ψυχανθών Με καμπύλη αναφοράς το είδος Phaseolus vulgaris διαχωρίζονται Τα είδη των ψυχανθών με τη βοήθεια της Περιοχής trnl barcoding region

Διαχωρισμός ποικιλιών με μικροδορυφόρους και την χρήση της HRM Με καμπύλη αναφοράς τα φασόλι πλακέ μεγαλόσπερμα Πρεσπών διαχωρίζονται όλες οι άλλες ποικιλίες με τη χρήση του Μικροδορυφόρου PM139

Χρησιμοποιώντας την περιοχή trnl και τη βοήθεια της Bar-HRM μεθόδου Ανιχνεύουμε προσμίξεις έως 1% λαθούρι μέσα σε φάβα Σαντορίνης Φάβα Σαντορίνης

Ποικιλίες Φακής Χρησιμοποιώντας μικροδορυφόρους και τη βοήθεια της Bar-HRM μεθόδου Ανιχνεύουμε προσμίξεις έως 1% Βίκο σε φακές Ενγκλουβής 2012

Ποικιλίες Φακής Φακή Εγκλουβής (94) 94 100 110 120 130 140 150 160 170 184 Lens esculentum rpoc contig (93) CTGCTTGAGCCTCCAAAGATAAAGGCACATGAACAGCCATTTGATCCCCATCAAAATCTGCATTGAACCCCTTACACACCAATGGATGTAA vicia sativa rpoc (93) CTGCTTGAGCCTCCAAAGATAAAGGCACATGAACAGCCATTTGATCCCCATCAAAGTCTGCATTGAATCCCTTACACACCAATGGATGTAA (185) 185 190 200 210 220 230 240 250 260 275 Lens esculentum rpoc contig(184) AGAAATAGCACGTCCTTCTACTAAAATGGGTTGAAATGCCTGTATGCCCAATCTATGCAAAGTAGGCGCTCTATTCAGCAATACTGGATGC vicia sativa rpoc(184) ACAAATAGCACGTCCTTCTACTAAAATGGGTTGAAATGCCTGTATGCCCAATCTATGCAAAGTAGGCGCTCTATTCAGCAATACTGGATGC Βικός rpoclens_vicia R rpoclens_vicia F Σε κόκκινο κύκλο παρατηρούμαι τις διαφορές σε επίπεδο DNA που επιτρέπουν τον διαχωρισμο του βίκου με την φακή

Συμπεράσματα Με τη βοήθεια της τεχνικής Barcoding μπορούμε να αναγνωρίσουμε φυτικά είδη Ο Συνδυασμός μικροδορυφόρων και της HRM μπορεί να διαχωρίσει και ποικιλίες του ίδιου είδους Η χρήση συγκεκριμένων περιοχών ή και ο συνδυασμός χλωροπλαστικών περιοχών δίνει υψηλά ποσοστά αναγνώρισης ειδών Με τη βοήθεια της τεχνικής Barcoding μπορεί να γίνει αποτύπωση της βιοποικιλότητας Αναγνώριση φυτών και τροφίμων με ονομασία προέλευσης Αναγνώριση προσμίξεων σε ΠΟΠ (και όχι μόνο) τρόφιμα

Ευχαριστίες ΙΝΕΒ Ι. Γανόπουλος, Ει. Μποσμαλή Κ. Πασέντσης Α. Τσαυτάρης Τράπεζα Γενετικού Υλικού Π. Ράλλη Θ. Τσιβελίκα ΕΛΓΟ ΔΗΜΗΤΡΑ Ινστιτούτο Κτηνοτροφικών Φυτών Και Βοσκών Δ. Βλαχοστέργιο Συνεταιρισμός Σαντορίνης "SANTO"

Ευχαριστώ