6. πεpτnκψκ Ενώ η πλειονότητα των ευκαρυωτυ ών οργανισμών αναπαράγονται με φυλετικό τρόπο, υπάρχει μια μικρή κατηγορία διαφορετικών και ενδιαφερόντων οργανισμών που παρεκκλίνουν από το γενικό κανόνα, καθώς αναπαράγονται χρησιμοποιώντας εναλλακτικούς τρόπους. Εν συντομία, αυτές οι αναπαραγωγικές στρατηγικές εκτείνονται από την εναλλαγή του φυλετικού και ταυ αψυλετικαϋ τρόπου κατά ταν κύκλο ζωής του οργανισμού έως την αυστηρή κλωνική αναπαραγωγή κατά την οποία δε συμβαίνει ανασυνδυασμός. H αφυλετική αναπαραγωγή Πιστεύεται ότι είναι σπάνια στο ζωικό βασίλειο. Γενικά, οι αψυλετικοί οργανισμοί θεωρούνται εξελικτικά αδιέξοδα γιατί έρχονται αντιμέτωποι με σημαντικά μειονεκτήματα, τόσο άμεσα όσο και έμμεσα, που απειλούν την εξελικτική τους συνέχεια. Ωστόσο, διάφοροι γενετικοί παράγοντες Που σχετίζονται με την αφυλετική αναπαραγωγή, όπως για παράδειγμα η Πολυπλοει&ία, μπορούν πιθανόν να ανανεώσουν τη γουιδι ακη δεξαμενή των κλωνικών στελεχών συμβάλλοντας Θετικά στην προσαρμογή τους. Στην παρούσα εργασία, η Arternia χρησιμοποιήθηκε ως οργανισμόςμοντελο για του έλεγχο των βαθμών πλοειδίας, τη σύσταση των Παρθενογενετικών πληθυσμών καθώς και τη προέλευση και το βαθμό της κλωνικής ποικιλότητας των παρθενομενετικων στελεχών. Επιπλέον, έγινε προσδιορισμός ταυ φαινομένου της παρθενογένεσης και της πολυπλαειδίας μέσα στο γένος, λαμβάνοντας υπόψη τις φυλογενετικές σχέσεις και τα γεωγραφικά ΠροτυΠα των Παρθεναγενετικών πληθυσμών και των συγγενι κών τους αμψιγονικών ειδών. Το γένος Arterniα περιλαμβάνει οργανισμούς που ανήκουν σεα καρκινοειδή και ειδικότερα στην τάξη των ανοστράκωυ, αι οποίοι έχουν παγκόσμια εξάπλωση (εκτός της Ανεαρκτικής), και είναι ευρύτερα γνωστοί ως αγαρίδες της αλμης.. Μέχρι ταν προηγούμενο αιώνα, οι περισσότερες μελέτες που είχαν γίνει αφορούσαν τη βιολογία και την οικολογία της Artemio. Αν και είναι περισσότερο γνωστή μια τη χρήση της ως ζωντανή τροφή μια Θαλάσσιους οργανισμούς και οργανισμούς του γλυκού νερού, από εξελικτικής άποψης, αυτό τα είδος είναι εξίσου συναρπαστικό. Δύο διαφορετικοϊ τρόποι αναπαραγωγής μπορούν να ανι.χιαευτούν: η φυλετική αναπαραγωγή και η παρθενογένεση, Πιο αναλυτικά, το γένος Artemia περιλαμβάνει έξι καλά χαρακτηρισμένα αμψιγονικά είδη και έναν μεγάλο αριθμό παρθενογενετυεών
στελεχών, τα οποία εμφανίζουν διαφορετικούς βαθμούς πλοειδίας (2η - 5η). Οσον αφορά τα παρθενογενευκά στελέχη, τα πολυπλαειδή βεωρούνπαι απομικτικά σε αντϊθεση με τα αυτομικτικά διπλοειδή στελέχη. Επίσης, άλα τα άτομα Artemia, ανεξάρτητα από ταν τρόπο αναπαραγωγής τους, μπορούν να παράγουν ναυπλίους (ωοζωοτοκια) η εγκυσταμενα διαπαυσιακά έμβρυα, τις κύστεις (ωοτοκία). H απελευθέρωση των ναυπλϊων επιτρέπει τη ταχεία ανάπτυξη του πληθυσμού όταν αι συνθήκες τα επιτρέπουν, ενώ, όταν πάψουν να είναι ευνοίκές. τη ωοτοκία εξασφαλίζει την επιβίωση του πληθυσμού. Επιπλέον, οι κύστεις μπορούν να μεταφερθούν μέσω των ζωικών οργανισμών, του ανέμου ή ταυ ανθρώπου, επιτρέαταντας την εξάτιλωση του οργανισμού σε άλλα ενδιαιτήματα (παθητική μεταφορά). Τέλος, η συσσώρευση των κύστεων στον πυθμένα των υδατασυλλαγών έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία : :τραπεζών με διαπαυσιπκές μορφές. Προηγούμενες μελέτες, που εϊχαν εστιάσει στις φυλογενετικές σχέσεις μέσα στο γένος Arternia, αποκάλυψαν άτι τα τρία ασιατικά αμφιγανικά είδη εμπλέκονται στην εμφάνιση της παρθεναμένεσης. Ωστόσο, δεν υπάρχουν δεδομένα που να αποκαλύπτουν το μηχανισμό που οδήγησε στην εγκατάλειψη! απώλεια του φυλετικοϋ τρόπου αναπαραγωγής ή στα πρότυπα που περιγράφουν την κατανομή τους. Στην παρούσα εργασία, η εφαρμογη γιο πρώτη φορά της κυτταρομεψτας ραης με τους μικροδορυφαρικούς δεϊκτες, καθώς α συνδυασμός τους με την ανάλυση ενός τμήματος του μιτοχονδριακού DNA, προσέφερε νέες πληροφορίες σχετικά με το φαινόμενα της παρθευαγένεσης στα μένος Artemύε. H σχετική ποσότητα ταυ DNA υπολογϊστηκε με την κυτταραμετρία ροής. Συνολικά ελέγχθηκαν 29 πληθυσμοί (23 παρθενογενετικοϊ και δ αμψιγανικαί), που κατανέμονται παγκοσμίως, μετρώντας τη μέση ένταση του φθορισμού κάθε άγνωστου δείγματος με το μέσο όρο της έντασης που μετρήθηκε στους πληθυσμαϋς που είναι χαρακτηρισμένοι κυτταρογενετικά. D γενετικός χαρακτηρισμός των παρθενσγενετικών πληθυσμών (23 πληθυσμοί, 475 δείγματα) βασίστηκε στην ανάλυση πέντε μικραδαρυψορικών τόπων. Από τα αποτελέσματα 7ης γενοτυπησης υπολογίστηκαν αι συχνότητες των αλληλομσρψων και α7 δεϊκεες κλωνικής ποικιλομορφϊας (δείκτες Simρsοn και Shannon, δεϊκτης ομοιομορφϊας). Για την εξέταση και τα χαρακτηρισμό της τάσης ομαδοποίησης των παρατηρούμενων κλώνων, εφαρμόστηκε η ανάλυση κύριων συνιστωσιάν (ΡCΑ), με την οποία μειώνεται η πολυπλοκότητα των δεδομένων, καθώς και η ομαδοποίηση Κ-μέσων για την εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με τη γενετική δομή ταν πληθυσμών. Επιπλέον,
υηαλογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις: α) μεταξύ των ατόμων, ώστε να υηαλογιστοϋν και να συγκριθούν σι μέσες γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ των ομάδων που συγκροτ.οϋν τα άτομα της ίδιας πλοει δί ας. και β1 μεταξύ των ττληθυσμών, γι α iiiv κατασκευή φυλαγενετικών δέντρων. Τέλος, ελέγχθηκε η συσχέτιση σε πληθυσμιακό εττίπεδα των γενετικών αηοστάσεων με τις γεωγραφικές απαστάσεις εφαρμόζοντας τη δοκιμασία Mantel. Ενα τμημα ταυ μιτοχονδριακοϋ γονιδίαυ για τηυ υηομονάδα Ι της κυταχρι,μ,κης οξειδάσης αλληλουχήθηκε ώστε; α} να υπολογιστεί η γενετική ποικιλομορφία μεταξύ των πληθυσμίαν με βάση τις ακολαυθίες i-iou βρέθηκαν σε αυτούς, β) να συγκριθούν οι γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ των ομάδων που συγκροτούν τα άτομα της lδιας πλοειδιας, και γ1 για να επι βε.βαι ωθεi η μητρική προέλευση των ατόμων. Επίσης, ο δείκττης αυτός χρησλμοποιηθηκε και για τη μελέτη των ψυλαγενετιιιών σχέσεων μέσα στο γένος Ατ-terniα εφαρμόζοντας διαψορετικές μεθόδους (MT - μέγι στη ψει δωλάτητα, ML - μέγιστη πιθανοφάνεια, BΙ - ανάλυση κατά Bayes). Όλα τα αμψιγονικά είδη εμφάνισαν μία κορυφή στα ιστογράμματα κατανομής συχνοτήτων, ενώ ο αριθμός των καρυψrαν ταυ εκάστοτε παρθενογενετικού nληθυσμού κυμάνθηκε από 1 έως 3. Ειδικότερα, 9 από τους 23 πληθυσμούς βρέθηκαν να είναι μικτοί. Συνολικά ανιxνεύτηκαν 164 σύνθετοι γενότυποι οι οποίοι ενεάχθηκαν σε 31 κλήνους. Οι περισσότεροι κλώνοι ήταν διπλοειδείς (2[1/31} ενώ 2 και 9 κλώνοι, αντίστριχα. ήταν τριπλαευδείς και τετ ραπλοειδε{ς. Η μεγαλύτερη κλωνική ηαικιλάτητα παρατηρήθηκε σε εκείνους τους πληθυσμούς που αποτελούνταν κατά κύριο λόγο ή αποκλειστικά από διπλοειδείς κλτδνους, με εξαίρεση τον πληθυσμό του Μεγάλου Εμβόλου {Ελλάδα) στον οποίο βρέθηκαν κλώναι και των τριών Πλοειδιών. C δείκτης της ομοιομορφίας έλαβε τιμές κοντά στο πάνω άκρα της κατανομής του, υηαδεικνϋαντας άτι η κατανομή των κλώνων είναι αρκετά ομοιόμορψη. Οι γενετικές αποστάσεις ενεός και μεταξύ των ομάδων που συγκροτούν τα άτομα της ί δι ας πλοει δί ας, καθώς και η PCA, έδειξαν ότι : α) τα τριπλαειδή και τα τετραπλοειδή στελέxη συγκρατούν διακριτές {62,2 Ι ) και αρκετά συμmικνωμένες (57,3 Ι κατ 263% μέση γενετική απόσταση, αντίστοιχα) ομάδες, ενδεικτικό της χαμηλής γενετικής τους ποικιλότητας, και β) αι διπλοεδείς κλώνοι είναι πολύ δι ασκοπρισμένοι (77,9 Ι μέση γενετική απόσταση μεταξύ τους), Προτείνοντας ότι περιέχουν ένα σημαντικό ποσοστό γενετικής παικιλαμορψίας, και σχεδάν ι σαπέχουν από τις άλλες δύο ομάδες πολυπλοειδών στελεχών {46,1 Ι αηό τα τριττλαειδή και 42,2% από τα
τετραπλοει5ή). Η χρηση της μεθόδου της ομαδοπόίησης Κ-μέσων επέτρεψε την ταξινόμηση των τταρθεναγενετ7κήν ατόμων σε πέντε ομάδες {Κ1 - Κ5). Ηια αναλυτικά, η ομάδα Κ1, η οιτοία αποτελείται από διπλοειδή και τετραττλοειδή στελέχη, συναντάται κατά μήκος της κατανομής που καλύrπει η δειγματόλητμία, με εξαίρεση τό νότιο τμημα του Παλαιού Κόσμου και το βόρειο τμήμα της Ανατολικής λεκάνης της Μεσογείου. Σε αυτές τις ττεριοχές συναντάται ως επί το πλε,στο ή ατεοκλειστικά η ομάδα Κ3, η οrεο,α αποτελείται από τριπλοειδή στελέχη. Οι άλλες τρεις ομάδες {Κ2 = τετραπλαειδή, Κ4 = διrελοειδή, Κ5 = τετρατελοειδή) κατανέμονται μόνα στην Ανατολική λεκάνης της Μεσογείου. Συνολικά, υπάρχει σημανεική συσχέτιση μεταξύ των γενετικών και των γεωγραφικών αποστάσεων (r = 0,325, p = 0,006. Το σύνολα δεδομένων του μιτοχονδριακηύ δείκτη ττεριείχε 50 ακολουθίες από παρθεναγενετικά άτομα, 9 αηά αντιπροσώπους όλων των αμφιγονικών ειδών Arterniα Stτeptocetahalus doroth.a και μια ακόλουθία του οργανισμού 60 ακολουθίες συνολικά). Αυτές αι ακόλαυθϊες έδωσαν 22 αnλοτύιτους εκ των οποίων 13 ανήκαν σε ιταρθενογενετικά άτομα (δ σε διπλοειδή, 5 σε τριπλοειδή. και 2 σε τετραττλοειδή). Οι περισσότερόι τεαρθενογενετικοί απλότυτεοι βρέθηκαν μάνα σε ένα συγκεκριμένο πληθυσμό και μόνο 4 από αυτούς βρέθηκαν σε περισσότερους από δύο πληθυσμούς. Τα μεγαλύτερα ποσοστό ιτόικιλομσρψίας παρατηρήθηκε. μεταξύ των διπλοειδών και ακολούθησαν οι τρυτλοειδείς, ενώ η γενετική απόσταση μεταξύ των τετραrελοειδέ ν ήταν σχεδόν μηδενική. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έδειξαν ότι τα τριπλοειδή είναι πολύ κοντά στci διπλοειδή 1.5 l0 ), ενώ η απόσταση των δύο αυτών ομάδων από τα τετραπλοεiδή εϊναι σχεδόν ίση (26,1% από τα διrελοειδή και 25,7 ió από τα τριπλοειδή). Όλα τα δέντρα που κατασκευάστηκαν ~ΙbiP, ML, BΙ} αποκάλυψαν την Ιδια βασική τοηολόγία. Η A. per.sirnilis είναι τα πιο αρχέγονο είδος και ακολουθούν τα είδη Α sai&ia και Α_ frιmcάseαraιi.. Τα άλλα Τρία αμψιγονικά είδη μαζί με τα ιταρθενογενετ,κά στελέχη συγκροτούν τέσσερις ομάδες: η πρώτη αγ[οτελεlται από τα αμψιγονικό είδος Α. siπica και όλα τα τετραττλοειδή στελέxη, η δεύτερη από το είδος Α urmia,na. και 3 Παρθενογενετικους αττλοτύπους, ενώ τα υπόλοιπα διττλαειδή και τριπλοειδή ιταρθενογενετικά στελέχτη συνθέτόυν την τρίτη ομάδα. Τέλος, η τέταρτη ομάδα περιέχει μόνο αττλότύπόυς που ανήκουν στο είδος Α_ tlbetiana. Η παρούσα διατρι βή αντιττρασωπεϋει μια λεπτομερή διερεύνηση της ιτληθυσμιακής δομής και της ηόικιλότητας των αψυλετικά αναε[αραγόμενων στελεχών ταυ γένους Artemki. Ο συνδυασμός της κυτταραμετρίας ροής, η
μενοτϋπηση των μικροδορυφορικών δεικτών και η αλληλαύχιση του μιταχονδριακού δεiκτη, προσέφερε. στοιχεία για τη γενετική σύσταση των παρθενογενετικών πληθυσμών αυτού του ασττάνδυλαυ Οργανισμού. Η κυτεαρομετρία ροής και η ανάλυση των μικροδορυφορικών δεικτών απέδειξαν ότι οι παρθεναμενετικαί πληθυσμοί μπορεί να απατελούνται από στελέχη διαψορετ,κής πλοειδίας 2η - 4nj και ότι μπορεί να είναι μανακλr.,νικοί ή πολυκλωνικοί, Στη δεύτερη π,ερίπτωση αι κλώνοι μπορεί να είναι της ίδιας ή δι αψορ ετι κή ς πλοειδίας. Με βάση τη δειγματαληψία, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υπαστηρίζουν ότι: α η Πολυπλοειδία εμφανίστηκε. περισσότερες από μία φορές στο γένος Artεmzα, με τα τριπλοειδή και τα τετραπλοειδή να έχουν ανεξάρτητη προέλευση από διαφορετικά άτομα, και β) τα διπλοειδή παρθενογενετικά στελέχη εμφανίστηκαν δύο φορές. Ειδικότερα, τα τριπλοειδή φαίνεται να έχαυν προκύψει από έναν διττλαειδή Παρfiενογενετικό πρόγονο και μοιράζονται, εττίσης, έναν κοινό πρόγονο με τα είδος Α. zεrmίαnα, ενώ τα τετραπλοειδή στελέχη μοιράζονται κοινό πρόγονο με το είδος Α sanaca. Επιπλέον' τα διnλοειδή συγκρατούν δύο εξελικτικές γραμμές. ενδεικτικό της πολυφυλετικής του ς προέλευσης, Όσον αφορά την προέλευση της παρθεναμένεσης, η παρούσα εργασία προσφέρει οτοιχεία που υποστηρίζουν ότι η Arteστiα δεν αποτελεί ξενιστή της Wolbachia. α έλεγχος τόσο παρθεναγενετικά όσο και αμψιμονικά αναπαραγόμενων ατόμων δεν αττακάλυψε μόλυνση με τα βακτήριο {δεν ενισχύθηκε τμήμα του γονιδίου της μεγάλης ριβοσωμικής υπαμονάδας του βακτηρίου με ειδικούς για αυτό εκκινητέςj. Για αυτό, η πιθανότητα να έχει η Παρθενογένεση στην Artemia μολυσματική προέλευση είναι αττειροελάχιστη. Αντίθετα, η υ βρι δική jπρωτογενώς} και η μεταδατική (δευτεραγενώς} προέλευση είναι αι πιο πιθανοί μηχανισμοί που οδήγησαν στην εγκατάλειψη/στα Χάσιμο της φυλετικής ανατταραγειγής και στην εμψάνιστη της πολυπλοειδίας. Ωστόσο ο μηχανισμός της αυτόματης προέλευσης δεν μπορεί να ατταρριψθεί. Η παρατηρούμενη κατανομή των παρθενογενετικών στελεχών και των αμφιμανικών ειδών, εξηγείται καλύτερα με το φαινόμενο της γεωγραφικής παρθενογένεσης, αψού οι δι πλοειδείς κλώνοι εμφανίζουν την ευρϋτερη κατανομή. Ωστόσο, κάθε διπλοειδής κλώνος, υποστηρίζοντας την υπόθεση του αμενοτύπου στενής οικαθέσηςρ, βρέθηκε περιορισμένος σε έναν πληθυσμό, ενώ κάθε τριπλοειδής και αρκετοί από τους τετραπλ.οειδείς κλώνους, υποστηρίζουν την υπόθεση του : :γενοτύπου ευρείας οικοθέσηςμ, αφού βρέθηκαν σε
ηερισσότερους αιτά έναν πληθυσμους. Σ3 παρατηρούμενη κατανομή των αφυλετικά αναπαραγόμενων στελεχών εϊναι πιθανώς αποτέλεσμα πολλών παραγόντων. Το σύνολο των διηλαεδών και των τριηλοεδών στελεχών φαίνεται να έχαυν διαψαρετικό κέντρο προέλευσης από τα τετραηλοειδή στελέχη, όπως προκϋπτει από την μη επtκαλυητόμενη κατανομή των στενά συγγενικών αμψιγανικών ειδών τους. Ωστόσο κυτταραλογικοϊ (αυτόμιξη - απόμιξη), οικολογικοί π.χ. αλατότητα, θερμακρασία), δημογραφικαί (π x. κατειλημμένα: : ή«κενά# ενδιαιτήματα), και ιστορικοί ηαράγοντες έχουν συμβάλει στη διαμόρφωση της παρατηροϋμενης εικόνας.