LightCycler SeptiFast Test MG

ΓΙΑ ΧΡΗΣΗ ΜΕ: LightCycler SeptiFast Test MG Για χρήση με το LightCycler 2.0 Όργανο (σειριακός αριθμός 1415001 και μεγαλύτερος) Για in Vitro Διαγνωστική Χρήση. LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : 04 469 046 001 SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : 04 404 432 001 SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : 04 404 459 001 SeptiFast Software Set v2.0 REF : 05 164 443 001 ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ To LightCycler SeptiFast Test MG είναι μια in Vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ανίχνευση και την ταυτοποίηση του βακτηριακού και μυκητιακού DNA από μικροοργανισμούς που καθορίζονται στην Κύρια Λίστα SeptiFast Test (SML) σε ανθρώπινο αίμα με αντιπηκτικό K-EDTA, χρησιμοποιώντας το LightCycler 2.0 Όργανο. Η εξέταση χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με την κλινική παρουσίαση, τις καθιερωμένες μικροβιολογικές αναλύσεις και/ή άλλους εργαστηριακούς δείκτες ως βοήθημα στην αντιμετώπιση ασθενών με υποψία σηψαιμίας και άλλων περιπτώσεων βακτηριαιμίας/μυκητιαιμίας. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η σηψαιμία θεωρείται μία από τις κύριες αιτίες θνησιμότητας και νοσηρότητας στα νοσοκομεία, η οποία προκαλείται κυρίως από βακτηριαιμία και/ή μυκητιαιμία. Η άμεση έναρξη της κατάλληλης αντιβιοτικής θεραπείας αποτελεί παράγοντα αποφασιστικής σημασίας για τη μείωση της νοσηρότητας και της θνησιμότητας που σχετίζονται με τη σηψαιμία. Το ποσοστό των ασθενών που υποβλήθηκαν αρχικά σε θεραπεία με ανεπαρκή αντιβιοτικά σχήματα στις μονάδες εντατικής θεραπείας είναι σημαντικό και κυμαίνεται από 11% μέχρι και 46% (1,2,3). Στα νοσοκομεία, ο χρόνος που απαιτείται συνήθως για την ταυτοποίηση των βακτηριακών/μυκητιακών παθογόνων και της ευαισθησίας τους στα φάρμακα από καλλιέργειες αίματος, είναι τουλάχιστον 48 ώρες (1). Η γρήγορη ανίχνευση των παθογόνων με τη χρήση μοριακών διαγνωστικών εργαλείων διευκολύνει τη γρήγορη διάγνωση της βακτηριαιμίας/μυκητιαιμίας και την έγκαιρη χορήγηση της κατάλληλης αντιβιοτικής θεραπείας, ενώ ταυτόχρονα βοηθά στην ελάττωση της ακατάλληλης κατάχρησης αντιβιοτικών ευρέος φάσματος (4,5). Το LightCycler SeptiFast Test MG είναι σχεδιασμένο για την ανίχνευση μικροοργανισμών που προκαλούν περίπου το 90% όλων των περιπτώσεων βακτηριαιμίας (1,6). Ενώ οι μικροβιολογικές μέθοδοι ανιχνεύουν βιώσιμους μικροοργανισμούς, η συγκεκριμένη εξέταση ανιχνεύει τόσο βιώσιμους, όσο και μη βιώσιμους μικροοργανισμούς, καθώς επίσης και ελεύθερο μικροβιακό DNA. Τα είδη-στόχοι παρατίθενται στην Κύρια Λίστα SeptiFast Test (SML), στον Πίνακα 1. Τα είδη αυτά ανιχνεύτηκαν ως θετικά χρησιμοποιώντας το LightCycler SeptiFast Test MG κατά τη διάρκεια εσωτερικών μελετών και/ή κλινικών δοκιμών. Η αντιμετώπιση ορισμένων από αυτά τα είδη τις περισσότερες φορές είναι ανεπαρκής: Enterococcus spp., E. coli, Candida spp., Klebsiella spp (6). Επιπλέον, η έγκαιρη ταυτοποίηση ορισμένων από τα είδη-στόχους της λίστας SML είναι μεγάλης σημασίας, καθώς τα είδη αυτά προκαλούν μολύνσεις που είναι εξαιρετικά δύσκολες στη θεραπεία: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Σε ένα δείγμα είναι δυνατό να ανιχνευτούν περισσότερα από ένα είδη. Επομένως η PCR Πραγματικού Χρόνου αποτελεί ένα πρόσθετο εργαλείο για τη διευκόλυνση της έγκαιρης κλινικής εκτίμησης. Πίνακας 1: Κύρια λίστα SeptiFast Test (SML) Gram (-) Gram (+) Μύκητες Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) CoNS 1 Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. 2 Candida glabrata Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida krusei Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1 Staphylococci αρνητικοί στην κοαγκουλάση (είδη που απαρτίζουν την ομάδα CoNS παρατίθενται στον Πίνακα 8). 2 Τα είδη που απαρτίζουν την ομάδα Streptococcus spp. παρατίθενται στον Πίνακα 8. 3 Τα είδη που αναφέρονται συχνά ως A. calcoaceticus-a. baumannii (σύμπλοκο Acb) δεν ανιχνεύονται (8). Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου. 04802918001-06EL 1 Doc Rev. 6.0

ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το LightCycler SeptiFast Test MG βασίζεται σε 3 κύριες διαδικασίες: Προετοιμασία δείγματος με μηχανική λύση και καθαρισμό DNA Ενίσχυση PCR Πραγματικού Χρόνου του DNA στόχου σε 3 παράλληλες αντιδράσεις (θετικά κατά gram βακτήρια, αρνητικά κατά Gram βακτήρια και μύκητες) και ανίχνευση από ειδικούς ιχνηθέτες υβριδισμού Αυτόματη έκδοση αποτελεσμάτων μετά την ανάλυση κορυφής τήξης Προετοιμασία Δείγματος Η μηχανική λύση των δειγμάτων εκτελείται με τη χρήση του SeptiFast Lys Kit MG και του MagNALyser Οργάνου. Με το SeptiFast Prep Kit MG τα δείγματα που έχουν υποστεί λύση επωάζονται σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που απελευθερώνουν νουκλεϊκά οξέα και προστατεύουν το απελευθερωμένο DNA από DNAses στο αίμα. Σε κάθε δείγμα εισάγεται μια καθορισμένη ποσότητα Εσωτερικού Προτύπου Ελέγχου (IC), μαζί με το αντιδραστήριο λύσης. Το IC αποτελείται από μόρια συνθετικού δίκλωνου DNA με περιοχές δέσμευσης εκκινητή ίδιες με εκείνες των αλληλουχιών στόχου. Το IC περιλαμβάνει μοναδικές περιοχές δέσμευσης ιχνηθέτη H που επιτρέπουν τη διαφοροποίηση του ενισχυμένου IC από τον ειδικό για το στόχο κλώνο (amplicon). Μετά την προσθήκη δεσμευτικού ρυθμιστικού διαλύματος, το μίγμα μεταφέρεται σε μία στήλη περιστροφής με ένθετο φίλτρο από ίνες υάλου. Το ανθρώπινο γενομικό DNA και το βακτηριακό/μηκυτιακό DNA στόχος δεσμεύονται στην επιφάνεια των ινών υάλου. Οι μη δεσμευμένες ουσίες, όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ουσίες, απομακρύνονται με δύο βήματα πλύσης. Μετά την ολοκλήρωση των βημάτων πλύσης, τα νουκλεϊκά οξέα που προσροφήθηκαν εκλούονται σε υψηλή θερμοκρασία. Τα εκλούματα υποβάλλονται σε ανάλυση PCR. Ενίσχυση και Ανίχνευση PCR σε πραγματικό χρόνο Επιλογή Στόχου Η περιοχή της εσωτερικά μεταγραφόμενης αλληλουχίας διαχωριστή (spacer) (ITS) έχει επιλεγεί ως περιοχή στόχος για τη διαφοροποίηση των βακτηριακών και μυκητιακών ειδών. Παρέχει υψηλότερη αναλυτική ευαισθησία από τα απλά γονίδια αντιγραφής, καθώς στα γονιδιώματα των βακτηριών και των μυκήτων υπάρχουν πολλά οπερόνια. Επιπλέον, το ITS είναι περισσότερο ειδικό για κάθε είδος από τα ριβοσωμικά RNA και επομένως πιο κατάλληλο για τη διαφοροποίηση των ειδών. Βρίσκεται μεταξύ των αλληλουχιών 16S και 23S ριβοσωμικού DNA όλων των gram(+) και gram(-) βακτηρίων και μεταξύ των αλληλουχιών 18S και 5,8S ριβοσωμικού DNA όλων των μυκήτων. Ενίσχυση Πριν από την ενίσχυση PCR, μειώνεται ο κίνδυνος μόλυνσης του κλώνου (amplicon), με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-ν-γλυκοζυλάση). Το ένζυμο αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Τα επεξεργασμένα δείγματα προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης που περιέχει Taq πολυμεράση από τη μέθοδο "hot start" στα LightCycler Τριχοειδή (100 µl) MG, στα οποία πραγματοποιείται η ενίσχυση PCR. Κάθε στόχος του συγκεκριμένου είδους ενισχύεται με γενικούς ή ειδικούς εκκινητές. Ένα μίγμα στόχων ενισχύεται ταυτόχρονα στα Αντιδραστήρια Ελέγχου (RC). Ανίχνευση των Προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο από Ιχνηθέτες H Η ανίχνευση του κλώνου (amplicon) γίνεται με φθορισμό χρησιμοποιώντας ένα ειδικό ζεύγος Ιχνηθετών H. Αυτοί οι επισημασμένοι με φθορισμό ιχνηθέτες H υβριδοποιούνται σε μια εσωτερική αλληλουχία του ενισχυμένου θραύσματος κατά τη φάση υβριδισμού του κύκλου ενίσχυσης. Ο εκπεμπόμενος φθορισμός μετράται από το LightCycler 2.0 Όργανο σε ένα από τα τέσσερα διαφορετικά κανάλια ανίχνευσης. Μετά την ολοκλήρωση της ενίσχυσης, διεξάγεται ανάλυση της καμπύλης τήξης. Η θερμοκρασία τήξης T M εξαρτάται από το μήκος, την αλληλουχία και τον βαθμό ομολογίας μεταξύ του ιχνηθέτη και του DNA-στόχου. Οι ιχνηθέτες έχουν σχεδιαστεί για το διαχωρισμό, βάσει της θερμοκρασίας τήξης τους T M, των ειδών που ανιχνεύονται σε ένα κανάλι. Αυτόματη Ταυτοποίηση Ειδών και Ορών Ελέγχου Οι θερμοκρασίες τήξης (T M ) των δειγμάτων και των ορών ελέγχου αναλύονται από ειδικό λογισμικό ταυτοποίησης (SeptiFast Identification Software) και δημιουργείται μια αναφορά. Συνεπώς, οι χαμηλές συγκεντρώσεις των αρνητικών στην κοαγκουλάση Staphylococci (CoNS) και Streptococci που αντανακλούν το εύρος μολύνσεων ροής εργασιών δεν εμφανίζονται. Εάν υπάρχει θετικό αποτέλεσμα για Staphylococcus aureus, ενδέχεται να ακολουθήσει εξέταση ανθεκτικότητας meca. Για περισσότερες λεπτομέρειες ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 Εξετάσεις LM (Τύπος Δείγματος Λύσης) 100 x γυάλινα/κεραμικά σωματίδια SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Εξετάσεις [1] LB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Λύσης) < 50% Θειοκυανική γουανιδίνη 20% Triton X-100 Επιβλαβές 20 x 1500 µl [2] PK (Πρωτεϊνάση K) 2% Πρωτεϊνάση K Γλυκερόλη [3] BB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Δέσμευσης) < 50% Θειοκυανική γουανιδίνη 20% Triton X-100 Επιβλαβές Επιβλαβές 2 x 850 µl 10 x 1000 µl 04802918001-06EL 2 Doc Rev. 6.0

SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Εξετάσεις [4] IRB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Αφαίρεσης Αναστολέα) < 50% Γουανιδίνη HCl < 40% Αιθανόλη [5] WB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Πλύσης) < 0,2% Χλωριούχο νάτριο < 80% Αιθανόλη Επιβλαβές Πολύ εύφλεκτο 10 x 1800 µl 10 x 1600 µl [6] EB (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης) 10 x 400 µl Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI BET (Σωληνάρια Αφαίρεσης Αίματος) 1 x 50 FC (Στήλες Φίλτρου) 2 x 5 LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 Εξετάσεις [1a] RM 1a (Μίγμα Αντίδρασης 1a) 3 x 27 µl 3 U/µL Taq Πολυμεράση από μέθοδο FastStart < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) [1b] RM 1b (Μίγμα Αντίδρασης 1b) < 1% Brij < 0,1% Διάλυμα μαγνησίου < 0,1% dntp [2] DM G+ (Θετικό Κατά Gram Μίγμα Ανίχνευσης) < 0,001% εκκινητής, ιχνηθέτες για G+ < 1% Brij [3] DM G- (Αρνητικό Κατά Gram Μίγμα Ανίχνευσης) < 0,001% εκκινητής, ιχνηθέτες για G- < 1% Brij [4] DM F (Μύκητες Μίγματος Ανίχνευσης) < 0,001% εκκινητής, ιχνηθέτες για F < 1% Brij [5] RC G+ (Θετικό Κατά Gram Αντιδραστήριο Ελέγχου) < 0,001% Πρότυπο Ορού Ελέγχου DNA για G+ EDTA [6] RC G- (Αρνητικό Κατά Gram Αντιδραστήριο Ελέγχου) < 0,001% Πρότυπο Ορού Ελέγχου DNA για G- EDTA [7] RC F (Μύκητες Αντιδραστηρίου Ελέγχου) < 0,001% Πρότυπο Ορού Ελέγχου DNA για F EDTA [8] IC (Εσωτερικό Πρότυπο Ελέγχου) < 0,001% DNA στο Πρότυπο Ελέγχου Επεξεργασίας για G+, G-, F EDTA [9] NC (Αρνητικός Ορός Ελέγχου) < 35% Πολυαιθυλενογλυκόλη 10000 3 x 620 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 5 x 100 µl 10 x 1600 µl SeptiFast Software Set v2.0 P/N: 05 164 443 001 1 x SeptiFast Identification Software v2.0 SeptiFast Macro v2.0 SeptiFast meca Macro v1.0 SeptiFast MCC Macro v1.0 SeptiFast Proof Files v2.0 04802918001-06EL 3 Doc Rev. 6.0

ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Γενικές Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις Για in Vitro Διαγνωστική Χρήση. Η παρούσα εξέταση προορίζεται μόνο για χρήση με ανθρώπινο αίμα που έχει συλλεχτεί σε K-EDTA. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια χωρίς πούδρα μιας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. Μη συγκεντρώνετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. Μην αναμιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικά κιτ, εκτός εάν απαιτούνται για το Κύριο Μίγμα. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. Μη χρησιμοποιείτε κιτ μετά την ημερομηνία λήξης τους. Διατίθενται Δελτία Δεδομένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) κατόπιν ζήτησης από τον τοπικό αντιπρόσωπο της Roche. Τα δείγματα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους να γίνεται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως αυτές που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) και στο έγγραφο CLSI M29-A (9). Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας και τα γάντια με ένα αντιδραστήριο απολύμανσης DNA (π.χ. LTK-008 ). Βεβαιωθείτε ότι τα γάντια είναι ανθεκτικά στο αντιδραστήριο απολύμανσης DNA. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης κατά το χειρισμό αντιδραστηρίων. Αποφεύγετε την επαφή των αντιδραστηρίων αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Εάν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Εάν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. Αποφεύγετε την επαφή του Ρυθμιστικού Διαλύματος Λύσης (LB) και Δέσμευσης (BB) με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση τυχαίας επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού, διαφορετικά μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Αραιώστε τυχόν σταγόνες από αντιδραστήριο με νερό πριν τις σκουπίσετε. Αποφεύγετε την επαφή των ρυθμιστικών διαλυμάτων LB και BB με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικό). Το μίγμα αυτό ενδέχεται να παράγει ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. Η ροή των εργασιών στο εργαστήριο πρέπει να εκτελείται σε μονόδρομη κατεύθυνση, αρχίζοντας από την Περιοχή Προετοιμασίας Πριν από την Ενίσχυση και προχωρώντας προς την Περιοχή Προετοιμασίας Μετά την Ενίσχυση (Ενίσχυση/Ανίχνευση). Οι ενέργειες πριν από την ενίσχυση περιλαμβάνουν την προετοιμασία αντιδραστηρίου και την προετοιμασία δείγματος. Τα υλικά και ο εξοπλισμός πρέπει να προορίζονται αποκλειστικά για κάθε ενέργεια που προηγείται της ενίσχυσης και όχι για άλλες ενέργειες, ούτε να μεταφέρονται μεταξύ των περιοχών. Πρέπει να φοράτε γάντια σε κάθε περιοχή και να τα αλλάζετε πριν από την έξοδό σας από τη συγκεκριμένη περιοχή. Ο εξοπλισμός και τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία του αντιδραστηρίου δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για ενέργειες χειρισμού δειγμάτων και ορών ελέγχου ή για το χειρισμό με πιπέτα ή την επεξεργασία ενισχυμένου DNA ή άλλων πηγών DNA-στόχου. Τα υλικά και ο εξοπλισμός που χρησιμοποιούνται μετά την ενίσχυση πρέπει να παραμένουν πάντοτε στον ειδικό χώρο που προορίζεται για την επεξεργασία μετά την ενίσχυση. Η παρουσία του ενζύμου AmpErase στο Κύριο Μίγμα Εργασίας μειώνει τον κίνδυνο μόλυνσης του κλώνου (amplicon). Ωστόσο, η μόλυνση από θετικούς ορούς ελέγχου και θετικά δείγματα μπορεί να αποφευχθεί μόνο με τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές και με την προσεκτική τήρηση των διαδικασιών που περιγράφονται στο παρόν ένθετο συσκευασίας. Ειδικές Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις κατά τη Χρήση του LightCycler SeptiFast Test MG DNA από τους οργανισμούς στόχους του LightCycler SeptiFast Test MG υπάρχει στο περιβάλλον. Για την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων από ανίχνευση τέτοιου περιβαλλοντικού DNA (μόλυνση DNA), είναι απαραίτητο να καθιερωθεί μια ροή εργασιών χωρίς μολυσματικό DNA. Συγκεκριμένα, ο χειριστής μπορεί να αποτελεί πηγή μολυσματικού DNA, καθώς στο ανθρώπινο δέρμα και στην άνω αναπνευστική οδό υπάρχουν διάφοροι μικροοργανισμοί που επίσης αποτελούν οργανισμούς στόχους του LightCycler SeptiFast Test MG [π.χ., Streptococci και αρνητικοί στην κοαγκουλάση Staphylococci (CoNS)]. Οι ακόλουθες αρχές αποτελούν συστάσεις για την αποφυγή μόλυνσης του DNA. Αντιδραστήρια και Αναλώσιμα του LightCycler SeptiFast Test MG Τα αντιδραστήρια και τα αναλώσιμα του LightCycler SeptiFast Test MG έχουν σχεδιαστεί για την ελαχιστοποίηση των βακτηριακών μολύνσεων του DNA. Τα προϊόντα MG είναι σχεδιασμένα για την ανίχνευση υψηλής ευαισθησίας των βακτηριακών και μηκυτιακών νουκλεϊκών οξέων. Αναπτύχθηκαν διαδικασίες παρασκευής ιδιοσκευασμάτων για να εξαλείψουν τη μόλυνση του DNA που μπορεί να αλληλεπιδράσει με τέτοιες αναλύσεις. Αποφεύγετε το άσκοπο άνοιγμα και κλείσιμο των φιαλιδίων αντιδραστηρίων. Ένδυση και Γάντια Φοράτε γάντια χωρίς πούδρα κατά τη διάρκεια ολόκληρης της ροής εργασιών. Αποφεύγετε την έκθεση του δέρματος, φοράτε γάντια πάνω από τα μανίκια της εργαστηριακής ποδιάς. Αλλάξτε γάντια αμέσως, σε περίπτωση που μολυνθούν ή καθαρίστε τα με αντιδραστήριο απολύμανσης DNA (π.χ. LTK-008, τα γάντια πρέπει να είναι ανθεκτικά στο αντιδραστήριο). Όταν βάζετε τα γάντια, μην αγγίζετε την παλάμη και τα δάχτυλά τους. Φροντίδα Θαλάμου Νηματικής Ροής Καθαρίζετε τις επιφάνειες του χώρου εργασίας στο θάλαμο νηματικής ροής με αντιδραστήριο απολύμανσης DNA μετά από κάθε προετοιμασία δείγματος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Βεβαιωθείτε ότι ο εξοπλισμός είναι ανθεκτικός στο αντιδραστήριο απολύμανσης DNA. Καθαρίζετε όλες τις επιφάνειες στο εσωτερικό του θαλάμου νηματικής ροής ανά τακτά χρονικά διαστήματα (τοιχώματα, χώρο κάτω από τη πλάκα στη βάσης, πλάκα δαπέδου). Αν ο θάλαμος νηματικής ροής χρησιμοποιείται από πολλούς χειριστές, βεβαιωθείτε ότι δεν περιέχει DNA. Ενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV και τον αερισμό για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την εργασία. Απενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV κατά τη διάρκεια της εργασίας. Φροντίδα Σταθμού Εργασίας PCR Καθαρίζετε τις εξωτερικές επιφάνειες στο σταθμό εργασίας PCR με αντιδραστήριο απολύμανσης DNA, μετά από κάθε ρύθμιση της PCR. Καθαρίζετε όλες τις επιφάνειες μέσα στο σταθμό εργασίας PCR σε τακτά χρονικά διαστήματα. Ενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την εργασία. Βεβαιωθείτε ότι η ακτινοβολία UV είναι απενεργοποιημένη κατά τη διάρκεια της εργασίας. 04802918001-06EL 4 Doc Rev. 6.0

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αλλάξτε τη λάμπα UV για το θάλαμο νηματικής ροής και το σταθμό εργασίας PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Χειρισμός Συσκευών και Αναλώσιμων Αφήνετε, εάν είναι δυνατόν, τα ειδικά αναλώσιμα και τις συσκευές που χρησιμοποιούνται για το LightCycler SeptiFast Test MG στo θάλαμο νηματικής ροής. Ακτινοβολείτε όλα τα στοιχεία με ακτινοβολία UV για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την εργασία. Χρησιμοποιείτε μόνο αναλώσιμα που δεν περιέχουν DNA (βλ. ενότητα Απαιτούμενα Μη Παρεχόμενα Υλικά). Χρησιμοποιήστε τα μόνο μία φορά. Χρησιμοποιείτε το Εργαλείο Πωματισμού για να κλείσετε τα τριχοειδή (για οδηγίες χειρισμού, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή για το LightCycler 2.0 Όργανο). Σε περίπτωση θραύσης τριχοειδούς, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή για το LightCycler 2.0 Όργανο (κεφάλαιο "Συντήρηση"). Προφυλάξεις κατά τη διάρκεια διοχέτευσης με Πιπέτα Ανοίξτε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων, τα κιβώτια ακροφυσίων πιπέτας και τα κιβώτια τριχοειδών μόνο μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής. Μην χρησιμοποιείτε τα ίδια ακροφύσια πιπέτας και τριχοειδή έξω από το θάλαμο νηματικής ροής. Μην αγγίζετε τη στεφάνη ή το σπειροειδές τμήμα ενός ανοιχτού φιαλιδίου. Κατά τη διοχέτευση με πιπέτα, κρατήστε το φιαλίδιο κάτω από τη στεφάνη. Μην αγγίζετε τη στεφάνη ενός ανοιχτού τριχοειδούς. Τακτοποιήστε όλα τα στοιχεία που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια των διαδικασιών στο θάλαμο νηματικής ροής σε λογική σειρά (αποφύγετε τις περιττές κινήσεις με την πιπέτα). Εάν πέσουν σταγόνες, τερματίστε το τρέχον βήμα εργασίας και καθαρίστε αμέσως το χώρο εργασίας με αντιδραστήριο απολύμανσης DNA (π.χ. LTK-008 ). ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ SeptiFast Lys Kit MG Αποθηκεύστε στους 15 έως 25 C. Ανοίξτε τα φιαλίδια μόνο μία φορά. Μην τα επαναχρησιμοποιείτε. Μη χρησιμοποιείτε το προϊόν μετά την ημερομηνία λήξης του. SeptiFast Prep Kit MG Αποθηκεύστε στους 15 έως 25 C (μην καταψύχετε ή αποθηκεύετε στο ψυγείο). Ανοίξτε το PK (φιαλίδιο 2) έως και 3 φορές. Ανοίξτε τα άλλα φιαλίδια μόνο μία φορά και απορρίψτε τυχόν αντιδραστήρια που δεν χρησιμοποιούνται. Μη χρησιμοποιείτε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε μία ανάλυση εκχύλισης. Μη χρησιμοποιείτε το προϊόν μετά την ημερομηνία λήξης του. LightCycler SeptiFast Kit MG Αποθηκεύστε στους -15 έως -25 C. Αποθηκεύστε σε σκοτεινό χώρο. Αποθηκεύστε τα Κύρια Μίγματα (μίγματα [1a], [1b] και [2] ή [3] ή [4]) στους 2 έως 8 C έως και για 3 ημέρες. Αποθηκεύστε το RC μετά τη χρήση στους 2 έως 8 C έως και για 10 ημέρες ή ψύξτε αμέσως στους -15 έως -25 C μετά από κάθε χρήση. Ανοίξτε το RC έως και 6 φορές. Ανοίξτε τα άλλα φιαλίδια μόνο μία φορά και απορρίψτε τυχόν αντιδραστήρια που δεν χρησιμοποιούνται. Μη χρησιμοποιείτε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε μία ανάλυση PCR. Μη χρησιμοποιείτε το προϊόν μετά την ημερομηνία λήξης του. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 Εξετάσεις SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Εξετάσεις LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 Εξετάσεις SeptiFast Software Set v2.0 (παρέχεται μία φορά) P/N: 05 164 443 001 ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Πωλούνται από τη Roche LightCycler 2.0 Όργανο με Λογισμικό έκδοσης 4.1 03 531 414 001 LightCycler Τριχοειδή MG (100 µl) 03 612 066 001 Φυγόκεντρος Περιστρεφόμενου Δίσκου LC 2.0 03 709 582 001 MagNALyser Όργανο (230 V) 03 358 976 001 LightCycler Multicolor Compensation Set 04 484 355 001 SeptiFast Μονάδα Ψύξης 04 555 864 001 04802918001-06EL 5 Doc Rev. 6.0

Πωλούνται από Άλλες Εταιρίες Φυγόκεντρος με περιστρεφόμενο ρότορα για σωληνάρια 15 ml με δύναμη τουλάχιστον 4200 g (π.χ. Eppendorf) 1x Φυγόκεντρος 5810 2x προσαρμογείς (1 ζεύγος) με στοιχεία για σωληνάρια 15 ml με κωνική βάση 1x Περιστρεφόμενος ρότορας τουλάχιστον στα 4200 x g VWR International 521-0076 521-0061 521-0044 Φυγόκεντρος (π.χ. Eppendorf) VWR International 1x MiniSpin 521-0012 2 Θερμικοί αναδευτήρες (π.χ. Eppendorf) 2x Θερμικοί αναδευτήρες Comfort (συμπ.) 1x Θερμική Μονάδα για φιαλίδια 24 x 2,0 ml και 1x Θερμική Μονάδα για φιαλίδια 8 x 15 ml Κυλινδρικός αναδευτήρας σε σωλήνα/φιάλη (π.χ. Stuart Scientific) 1x Κυλινδρικός Αναδευτήρας 1x Αναδευτήρας τύπου Vortex Χρησιμοποιείτε μόνο φιαλίδια και ακροφύσια που δεν περιέχουν DNA (π.χ. Αναλώσιμα MG, greiner bio-one) Ακροφύσια με Φίλτρο MG 5 ml Ακροφύσια με Φίλτρο MG 1 ml Ακροφύσια με Φίλτρο MG 100 µl Ακροφύσια με Φίλτρο MG 20 µl Πιπέτα ορού MG 1 ml Σωληνάρια MG 1,5 ml Σωληνάρια με βιδωτό πώμα 1,5 ml, αποστειρωμένα Αντιδραστήριο απολύμανσης DNA (π.χ. biodelta GmbH) Σετ LTK-008 Πιπέτα 1-5 ml (π.χ. Thermo Life Sciences) 1x Finnpette 1-5 ml Πιπέτα 10-1000 μl (π.χ. Eppendorf) 2x Πιπέτα Αναφοράς 100-1000 µl 2x Πιπέτα Αναφοράς 10-100 µl 1x Πιπέτα αναφοράς 2-20 µl (μόνο για εξέταση meca) Θάλαμος Νηματικής Ροής (π.χ. Cleanair) Θάλαμος Βιολογικής Ασφάλειας EF 4E Σταθμός εργασίας PCR (π.χ. Safety Cabinet Solutions Ltd.) Θάλαμος PCR Παθητικού DNA Biocap Υλικό Θετικού Ορού Ελέγχου Παρέχεται από άλλες εταιρίες ή παρασκευάζεται στο εργαστήριο του χειριστή (βλ. ενότητα Προτάσεις για την Προετοιμασία του Υλικού Θετικού Ορού Ελέγχου). VWR International 460-1112 460-1116 460-1120 VWR International 445-5210 444-1372 greiner bio-one 940525MG 750289MG 772289MG 774289MG 700371MG 616202MG Sarstedt 72.692.105 ή αντίστοιχα biodelta GmbH 200-000 VWR International 613-2520 VWR International 613-3650 613-3649 613-3647 VWR International 135-0055 VWR International 135-6576 ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Συλλογή Δείγματος Το LightCycler SeptiFast Test MG προορίζεται μόνο για χρήση με δείγματα αίματος με K-EDTA. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται σε αποστειρωμένα σωληνάρια με χρήση K-EDTA ως αντιπηκτικού. Μεταφορά και Αποθήκευση Δειγμάτων Η μεταφορά ολικού αίματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν τη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων (10). Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται/αποθηκεύεται στους -15 έως -25 C ή στους 2 έως 8 C μέχρι και για 3 ημέρες ή στους 15 έως 25 C μέχρι και για 4 ώρες. Σταθερότητα Εκλουμάτων Χρησιμοποιείτε τα επεξεργασμένα δείγματα αμέσως μετά τον καθαρισμό του DNA. Αποθηκεύστε ένα κλάσμα δείγματος, για να χρησιμοποιηθεί για επακόλουθη εξέταση meca (αν χρειαστεί) (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο LightCycler SeptiFast meca Kit MG). Τα εκλούματα μπορούν να αποθηκευτούν στους -15 έως -25 C μέχρι και για 30 ημέρες ή στους 2 έως 8 C μέχρι και για 8 ημέρες ή στους 15 έως 25 C μέχρι και για 4 ώρες. 04802918001-06EL 6 Doc Rev. 6.0

ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Ρύθμιση του LightCycler 2.0 Οργάνου και του Σταθμού Εργασίας PCR Αντιστάθμιση Χρώματος Επισκόπηση: Τα Αντικείμενα Αντιστάθμισης Χρώματος (CCO) δημιουργούνται στο LightCycler 2.0 Όργανο χρησιμοποιώντας το Multicolor Compensation Set. Πριν από τη χρήση, τα αντικείμενα CCO πρέπει να αξιολογηθούν. Προετοιμασία Πειράματος Αντιστάθμισης Πολλαπλών Χρωμάτων Χρησιμοποιήστε το LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001). Χρησιμοποιήστε το Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης (EB, φιαλίδιο 6 του SeptiFast Prep Kit MG) (P/N: 04 404 459 001). ΣΗΜΕίΩΣΗ: Απαιτούνται συνολικά 70 µl διαλύματος EB. Η υπολειπόμενη ποσότητα του Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης (EB, φιαλίδιο 6 από το SeptiFast Prep Kit MG) μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε επόμενες αναλύσεις. Η υπολειπόμενη ποσότητα του διαλύματος EB πρέπει να αποθηκεύεται στους -15 έως -25 C και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έως 6 μήνες. 1. Χρησιμοποιήστε ένα φιαλίδιο Ρυθμιστικού Διαλύματος Έκλουσης (EB, φιαλίδιο 6 από το SeptiFast Prep Kit MG). 2. Αποψύξτε όλα τα φιαλίδια, εκτός από το φιαλίδιο 1 (CCB), του LightCycler Multicolor Compensation (MCC) Set, αναμίξτε τα προσεκτικά και εκτελέστε σύντομη φυγοκέντριση. 3. Τοποθετήστε έξι LightCycler Τριχοειδή (20 µl) στις θέσεις 1 έως 6 του LightCycler Περιστρεφόμενου Δίσκου Δειγμάτων. 4. Προετοιμάστε μια αραίωση 1:6 του CC530 (φιαλίδιο 2, LightCycler MCC Set) με το Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης (EB, φιαλίδιο 6 από το SeptiFast Prep Kit): Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl του διαλύματος EB (φιαλίδιο 6, SeptiFast Prep Kit MG) σε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο 1,5 ml με βιδωτό πώμα και προσθέστε 10 µl του CC530 (φιαλίδιο 2). Αναμίξτε προσεκτικά και εκτελέστε σύντομη φυγοκέντριση. 5. Διοχετεύστε με πιπέτα 20 µl από κάθε συστατικό σε ξεχωριστά τριχοειδή με την παρακάτω σειρά: Θέση ρότορα 1: EB (φιαλίδιο 6, SeptiFast Prep Kit MG) Θέση ρότορα 2: CC530 (αραιωμένο φιαλίδιο 2) Θέση ρότορα 3: CC610 (φιαλίδιο 3) Θέση ρότορα 4: CC640 (φιαλίδιο 4) Θέση ρότορα 5: CC670 (φιαλίδιο 5) Θέση ρότορα 6: CC705 (φιαλίδιο 6) ΣΗΜΕίΩΣΗ: Μη μειώνετε τον όγκο. Μην αλλάζετε τη σειρά των τριχοειδών στον LightCycler Περιστρεφόμενο Δίσκο Δειγμάτων. 6. Σφραγίστε κάθε τριχοειδές με ένα πώμα. Εκτελέστε φυγοκέντριση με την LC Φυγόκεντρο Περιστρεφόμενου Δίσκου 2.0 και μεταφέρετε τον LightCycler Περιστρεφόμενο Δίσκο Δειγμάτων στο LightCycler 2.0 Όργανο. Έναρξη και Αποθήκευση Ανάλυσης Αντιστάθμισης Χρώματος (CCR) Για την εγκατάσταση και τη χρήση του SeptiFast MCC_Macro_v1.0 ή νεότερης έκδοσης, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή Α για το LightCycler 2.0 Όργανο, "Εκτέλεση μιας Roche Macro". ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μη χρησιμοποιείτε το πεδίο <assay lot number> στον Οδηγό Macro. Εναλλακτικά, εισάγετε τις πληροφορίες αριθμού παρτίδας στο αντίστοιχο πεδίο του επεξεργαστή δείγματος. 1. Αποθηκεύστε την ανάλυση (π.χ. με το παρακάτω όνομα: SeptiFast_CCR_ΕΕΜΜΗΗ-xx, ΕΕ = έτος, ΜΜ = μήνας, ΗΗ = ημέρα, xx = αριθμός ανάλυσης). 2. Όταν ολοκληρωθεί η ανάλυση, δημιουργείται αυτόματα μια αναφορά. 3. Εκτυπώστε την αναφορά και αποθηκεύστε το έντυπο αντίγραφο. Επαλήθευση Ανάλυσης: Αν η αναφορά του LightCycler Multicolor Compensation Set επισημαίνεται με την ένδειξη <User Developed or Modified Test Method>, η ανάλυση MCC είναι άκυρη. Επαναλάβετε την ανάλυση. Δημιουργία Αντικειμένου CC (CCO) 1. Ενεργοποιήστε τη Μονάδα Ανάλυσης Αντιστάθμισης Χρώματος και πατήστε το κουμπί <save CC object>. 2. Για να είναι δυνατή η ταυτοποίηση ακριβείας από το SeptiFast Identification Software (SIS), αποθηκεύστε το CCO ως εξής: SeptiFast_CCO_ΕΕMMΗΗ-xx (ΕΕ = έτος, ΜΜ = μήνας, ΗΗ = ημέρα, xx = αριθμός ανάλυσης, π.χ., SeptiFast_CCO_050313-01). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το αντικείμενο CC πρέπει να αξιολογηθεί πριν από τη χρήση με το LightCycler SeptiFast Test MG ή το LightCycler SeptiFast meca Test MG. Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO Για την αξιολόγηση ενός νέου CCO, πρέπει να εκτελεστεί μια ανάλυση LightCycler SeptiFast Test με ένα RC και ένα NC που πληρούν τα κριτήρια αποδοχής τα οποία παρέχονται στη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1". Συνιστάται η εκτέλεση ενός ειδικού πειράματος LightCycler SeptiFast Test που περιλαμβάνει RC και 5 NC, ώστε να είναι δυνατή η επιλογή ενός NC για την αξιολόγηση CCO. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν μια έγκυρη ανάλυση LightCycler SeptiFast Test που πληροί τα κριτήρια SIS διατίθεται ήδη στο LightCycler 2.0 Όργανο, μπορείτε να προχωρήσετε στην ενότητα "Επιλογή έγκυρης Ανάλυσης LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO". Χρησιμοποιήστε το SeptiFast Lys Kit MG (P/N: 04 404 432 001). Χρησιμοποιήστε το SeptiFast Prep Kit MG (P/N: 04 404 459 001). Χρησιμοποιήστε το LightCycler SeptiFast Kit MG (P/N: 04 469 046 001). Χρησιμοποιήστε το πρότυπο της "Λίστας Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1" (παρέχεται στην ενότητα αυτή). 1. Εκτελέστε ένα πείραμα LightCycler SeptiFast Test ακολουθώντας ολόκληρη τη ροή εργασιών (συμπεριλαμβανομένης της προετοιμασίας δειγμάτων και της διαδικασίας PCR). Το πείραμα περιλαμβάνει RC και NC και για τις 3 αναλύσεις. Συνιστάται η χρήση 4 πρόσθετων NC ως δείγματα 1 έως 4. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για μια λεπτομερή περιγραφή της προετοιμασίας δειγμάτων, ορών ελέγχου, αντιδραστηρίων και PCR, καθώς και της διαδικασίας φόρτωσης και χειρισμού του LightCycler 2.0 Οργάνου, ανατρέξτε στις σχετικές ενότητες του παρόντος ένθετου συσκευασίας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αποθηκεύστε την ανάλυση με ένα όνομα που θα εξασφαλίζει την ταυτοποίηση ακριβείας (π.χ. Qualification_ΕΕΜΜΗΗ-xx, ΕΕ = έτος, ΜΜ = μήνας, ΗΗ = ημέρα, xx = αριθμός ανάλυσης). 04802918001-06EL 7 Doc Rev. 6.0

2. Εκτελέστε την ανάλυση ακολουθώντας την περιγραφή που παρέχεται στην ενότητα "Ανίχνευση Κορυφής και Αυτόματη Ταυτοποίηση Ειδών" και εκτυπώστε στο τέλος την αναφορά του SeptiFast Identification Software (SIS). 3. Συμπληρώστε τη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1", για να αξιολογήσετε τα αποτελέσματα για FLAGS και COMMENTS στη στήλη RUN FLAGS ή ASSAY FLAGS, καθώς και τα αποτελέσματα στο πλαίσιο Δείγματα για τα 4 Δείγματα-NC στην αναφορά SIS. Αυτή η λίστα ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιείται για λόγους τεκμηρίωσης. 4. Μεταβείτε στην ανάλυση LightCycler SeptiFast Test και αξιολογήστε και τις δύο μονάδες Abs Quant [G(+) 610 και 640] σύμφωνα με τη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1". Αυτή η λίστα ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιείται για λόγους τεκμηρίωσης. Ξεκινήστε με τη μονάδα Abs Quant G(+) 610. Ακολουθήστε τις παρακάτω οδηγίες και για τη μονάδα Abs Quant G(+) 640. Μεταβείτε στη μονάδα ανάλυσης [μονάδα Abs Quant G(+) 610] και κάντε κλικ. Μεγεθύνετε το παράθυρο ανάλυσης κάνοντας κλικ στη λαβή. Ελέγξτε αν υπάρχει τιμή CP. Εισάγετε Ν (Ναι) ή Ο (Όχι) στη στήλη "CP ή CP σε [ ]" ανάλογα με το αποτέλεσμα. Ολοκληρώστε την τεκμηρίωση εκτυπώνοντας την οθόνη αποτελεσμάτων ανάλυσης του LightCycler Λογισμικού (επιλέξτε <print window> από το μενού File). Τα έντυπα αντίγραφα των εκτυπώσεων πρέπει να αποθηκεύονται. Επιβεβαιώστε το βήμα αυτό εισάγοντας ένα σημάδι ελέγχου στη στήλη "Print Window " της "Λίστας Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1". 5. Ελέγξτε αν πληρούνται τα κριτήρια αποδοχής σύμφωνα με τη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1". 6. Επιλέξτε ένα από τα NC χωρίς CP και προχωρήστε στην ενότητα "Αξιολόγηση Αντικειμένου CC (CCO)". ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μια ανάλυση LightCycler SeptiFast Test που πληροί όλα τα κριτήρια αποδοχής μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ειδικό αρχείο LightCycler SeptiFast.ixo για περαιτέρω αξιολογήσεις CCO. Μια ανάλυση LightCycler SeptiFast Test που δεν πληροί όλα τα κριτήρια αποδοχής δεν πρέπει να χρησιμοποιείται για αξιολόγηση CCO. Στην περίπτωση αυτή, επαναλάβετε το πείραμα LightCycler SeptiFast Test με νέα NC. 04802918001-06EL 8 Doc Rev. 6.0

Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1 (Έλεγχος ανάλυσης LightCycler SeptiFast Test και επιλογή ενός NC) Συνιστάται η αντιγραφή αυτής Λίστας Ελέγχου για λόγους τεκμηρίωσης. Operator s Name / Date: LightCycler SeptiFast Test run (*.ixo-file): Ανατρέξτε στην ενότητα "Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO", βήματα 2 και 3: Εκτελέστε την ανάλυση LightCycler SeptiFast Test. Εξάγετε την ανάλυση LightCycler SeptiFast Test στο SIS. Αξιολογήστε τα αποτελέσματα για FLAGS ή COMMENTS στις στήλες Run Flags και Assay Flags της αναφοράς SIS. Run Flags (N/O) Assay Flags (N/O) Κριτήριο αποδοχής 1: Ένδειξη "No (N)" στις στήλες Run Flags και Assay Flags. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν εισαγάγατε "ΝΑΙ (N)" στις στήλες Run Flags ή Assay Flags, πρέπει να επαναλάβετε τη ροή εργασιών LightCycler SeptiFast Test με νέα NC. Αξιολογήστε τα αποτελέσματα στο πλαίσιο Specimen της αναφοράς SIS για τα 4 Δείγματα-NC (ισχύει μόνο για την ειδική ανάλυση LightCycler SeptiFast Test με 4 Δείγματα-NC). Κριτήριο αποδοχής 2: " : no analyte detected" στη στήλη αποτελέσματος για ένα Δείγμα-NC. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα Δείγματα-NC για τα οποία ανιχνεύτηκε αναλύτης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για περαιτέρω ανάλυση. Εκτυπώστε την αναφορά SIS για λόγους τεκμηρίωσης. Print SIS Report Ανατρέξτε στην ενότητα "Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO", βήματα 4 έως 6: Μεταβείτε στην ανάλυση LightCycler SeptiFast Test για ανάλυση και των δύο Μονάδων Abs Quant [G(+) 610 και 640]. Δείγμα Abs Quant G(+) 610 CP ή CP σε [ ] (N/O) Abs Quant G(+) 640 #NC# Ισχύει μόνο για την ειδική ανάλυση LightCycler SeptiFast Test με 4 Δείγματα-NC: Δείγμα 1-NC Δείγμα 2-NC Δείγμα 3-NC Δείγμα 4-NC Print Window 610 Print Window 640 Κριτήριο αποδοχής 3: Ένδειξη "Όχι (Ο)" στη στήλη "CP ή CP σε [ ]" και για τις δύο Μονάδες Abs Quant G(+) 610 και Abs Quant G(+) 640 σε τουλάχιστον ένα NC. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν κανένα NC δεν πληροί αυτό το Κριτήριο Αποδοχής, επαναλάβετε τη ροή εργασιών LightCycler SeptiFast Test με νέα NC. Πληρούνται τα Κριτήρια Αποδοχής 1, 2 και 3: NAI OXI Η ανάλυση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για Αξιολόγηση CCO Η ανάλυση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για Αξιολόγηση CCO Επιλεγμένο NC για Αξιολόγηση (όνομα δείγματος): 04802918001-06EL 9 Doc Rev. 6.0

Επιλογή έγκυρης Ανάλυσης LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO Εναλλακτική διαδικασία από εκείνη που αναφέρεται στην ενότητα "Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO". Ισχύει μόνο αν μια έγκυρη ανάλυση LightCycler SeptiFast Test που πληροί τα κριτήρια εγκυρότητας τα οποία αναφέρονται στην ενότητα "Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO" διατίθεται ήδη στο LightCycler 2.0 Όργανο. Χρησιμοποιήστε το πρότυπο της "Λίστας Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1" (παρέχεται στην ενότητα "Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO"). 1. Επιλέξτε μια έγκυρη ανάλυση LightCycler SeptiFast Test που έχει ήδη εκτελεστεί. Η ανάλυση αυτή θα έχει επιβεβαιωθεί ως έγκυρη από την αντίστοιχη αναφορά SIS. 2. Εφαρμόστε το νέο CCO στην έγκυρη ανάλυση LightCycler SeptiFast Test: Ανοίξτε το επιλεγμένο έγκυρο αρχείο LightCycler SeptiFast Test. Ανοίξτε τη μονάδα Run. Επιλέξτε το νέο CCO από το μενού <Color Compensation (On)> ως εξής (βλ. Σχήμα 1): Κάντε κλικ στο <Color Compensation (On)>. Κάντε κλικ στο <Select Color Compensation >. Σχήμα 1: Εφαρμογή CCO Ανοίγει ένα πλαίσιο διαλόγου (<Select Object>). Εντοπίστε και επιλέξτε το νέο CCO. Κάντε κλικ στο <ΟΚ>. Ανοίγει ένα άλλο πλαίσιο διαλόγου (<Color Compensation Channels>). Μην απενεργοποιείτε τα κανάλια. Κάντε κλικ στο <ΟΚ>. Προχωρήστε με τον ίδιο τρόπο για όλες τις μονάδες 12 Tm Calling (3 αναλύσεις, 4 κανάλια) και τις 2 μονάδες Absolute Quantification. 3. Εκτελέστε την ανάλυση LightCycler SeptiFast ακολουθώντας την περιγραφή που αναφέρεται στην ενότητα "Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO", βήματα 2 και 3. 4. Αξιολογήστε και τις δύο μονάδες Abs Quant [G(+) 610 και 640] όπως περιγράφεται στην ενότητα "Εκτέλεση Πειράματος LightCycler SeptiFast Test για Αξιολόγηση του CCO", βήματα 4 έως 6. 5. Αποθηκεύστε την ανάλυση με το νέο CCO που εφαρμόστηκε. Ανοίγει ένα πλαίσιο διαλόγου (<Change Log>). Πληκτρολογήστε την αιτία για τις αλλαγές (π.χ. εφαρμογή νέου CCO). Αξιολόγηση Αντικειμένου CC (CCO) 1. Ανοίξτε το ειδικό αρχείο LightCycler SeptiFast Test. 2. Αξιολογήστε το CCO χρησιμοποιώντας το επιλεγμένο NC (ανατρέξτε στη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 1"). 3. Αξιολογήστε όλες τις μονάδες T M Calling σύμφωνα με τη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 2". Αυτή η λίστα ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιείται για λόγους τεκμηρίωσης. Ακολουθήστε τις παρακάτω οδηγίες για όλες τις μονάδες T M Calling και τις τιμές Εύρους Στόχου T M. Ξεκινήστε με τη μονάδα T M Calling G(+) 640: Κάντε κλικ στη μονάδα ανάλυσης [π.χ., TM Calling G(+) 640]. Ενεργοποιήστε το επιλεγμένο NC μαζί με το #RC# για μια επισκόπηση. (Η αυτόματη προσαρμογή κλίμακας θα προσαρμοστεί στην υψηλότερη κορυφή.) Επεξεργαστείτε τη γραμμή αναφοράς με τις κατάλληλες τιμές "Γραμμής Αναφοράς Αξιολόγησης-CCO" που παρέχονται στη στήλη "Γραμμή Αναφοράς Αξιολόγησης-CCO" της "Λίστας Ελέγχου Αξιολόγησης CCO) (βλ. Σχήμα 2). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για κάθε εύρος στόχο T M απαιτείται μια νέα και διαφορετική ρύθμιση γραμμής αναφοράς για έλεγχο του NC. Ενεργοποιήστε μόνο το επιλεγμένο NC (βλ. Σχήμα 3). Η αυτόματη προσαρμογή κλίμακας θα προσαρμοστεί στο φθορισμό υποβάθρου του NC. Η γραμμή αναφοράς μπορεί να μην είναι πλέον ορατή. Σχήμα 2: Καμπύλες Τήξης των RC και NC (Επισκόπηση) RC NC Γραμμή Αναφοράς Αξιολόγησης CCO 04802918001-06EL 10 Doc Rev. 6.0

Σχήμα 3: Οθόνη Αποτελεσμάτων Ανάλυσης LightCycler Λογισμικού για NC Γραμμή Αναφοράς Αξιολόγησης CCO NC Εύρος Στόχος T M Επιλέξτε δύο γραμμές T M για επισήμανση των κατώτατων και ανώτατων τιμών του εύρους στόχου T M. Ανατρέξτε στη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 2", στη στήλη "Εύρος Στόχος T M ", για επεξεργασία των τιμών στα πλαίσια γραμμών Tm. Ελέγξτε το μέγιστο ύψος φθορισμού του επιλεγμένου NC στη στήλη "Εύρος Στόχος T M ". Εισάγετε Ν (Ναι) ή Ο (Όχι) στη στήλη "Μέγιστο Ύψος Φθορισμού Κάτω από τη Γραμμή Αναφοράς Αξιολόγησης-CCO" ανάλογα με το αποτέλεσμα. Ολοκληρώστε την τεκμηρίωση εκτυπώνοντας την οθόνη αποτελεσμάτων ανάλυσης του LightCycler Λογισμικού (επιλέξτε <print window> από το μενού File). Τα έντυπα αντίγραφα των εκτυπώσεων πρέπει να αποθηκεύονται. Επιβεβαιώστε το βήμα αυτό εισάγοντας ένα σημάδι ελέγχου στη στήλη "Print Window " της "Λίστας Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 2". 4. Επαναλάβετε το βήμα 3 μέχρι όλες οι τιμές Εύρους Στόχου T M σε όλες τις μονάδες T M Calling που παρέχονται στη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 2" να αναλυθούν και να τεκμηριωθούν στη συμπληρωμένη λίστα ελέγχου και στις εκτυπώσεις. 5. Ελέγξτε αν πληρούνται τα κριτήρια αποδοχής σύμφωνα με τη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 2". Ένα CCO που πληροί τα κριτήρια αποδοχής είναι έγκυρο και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έξι μήνες. Κάθε έξι μήνες πρέπει να εκτελείται μια νέα ανάλυση Αντιστάθμισης Χρώματος και μια διαδικασία αξιολόγησης. Αντιμετώπιση προβλημάτων Όταν δεν πληρούνται τα κριτήρια αποδοχής που παρέχονται στη "Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 2", το CCO δεν είναι έγκυρο και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί. Το πείραμα MCC πρέπει να επαναληφθεί και πρέπει να εκτελεστεί μια νέα διαδικασία αξιολόγησης CCO για το νέο CCO. Αν ένα τρίτο CCO δεν ολοκληρώσει με επιτυχία τη διαδικασία αξιολόγησης CCO, επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο της Roche. 04802918001-06EL 11 Doc Rev. 6.0

Λίστα Ελέγχου Αξιολόγησης CCO - Μέρος 2 Συνιστάται η αντιγραφή αυτής Λίστας Ελέγχου για λόγους τεκμηρίωσης. Operator s Name / Date: Ανάλυση LightCycler SeptiFast Test που χρησιμοποιείται για τη διαδικασία Αξιολόγησης CCO (αρχείο *.ixo): Επιλεγμένο NC για Αξιολόγηση (όνομα δείγματος): CCO (αρχείο *.ixo): Ανατρέξτε στην ενότητα "Αξιολόγηση Αντικειμένου CC (CCO)", βήματα 1 έως 4: Αξιολογήστε το CCO χρησιμοποιώντας το επιλεγμένο NC. Μονάδα T M Calling Δείγμα Γραμμή Αναφοράς Αξιολόγησης-CCO Εύρος Στόχος T M Μέγιστο Ύψος Φθορισμού Κάτω από τη Γραμμή Αναφοράς Αξιολόγησης-CCO (N/O) Print Window T M Calling G(+) 640 NC 0,029 49,03 56,04 NC 0,037 59,07 63,07 T M Calling G(+) 670 NC 0,061 49,32 53,42 T M Calling G(+) 705 NC 0,031 60,33 64,33 T M Calling G( ) 640 NC 0,039 55,48 62,37 NC 0,004 63,81 68,06 T M Calling G( ) 670 NC 0,256 48,88 53,38 NC 0,223 55,50 60,00 T M Calling F 670 NC 0,107 49,51 53,51 Κριτήριο αποδοχής: Ένδειξη "ΝΑΙ (Ν)" στη στήλη "Μέγιστο Ύψος Φθορισμού Κάτω από τη Γραμμή Αναφοράς Αξιολόγησης-CCO" για όλες τις μονάδες T M Calling και τις Γραμμές Αναφοράς Αξιολόγησης-CCO στο επιλεγμένο NC. NAI OXI Το CCO είναι έγκυρο και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έξι μήνες. Το CCO δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί. Ανατρέξτε στην ενότητα "Αντιμετώπιση προβλημάτων". Εγκατάσταση του SeptiFast Identification Software v2.0 (SIS): Για την ενημέρωση του λογισμικού, ελέγξτε εάν παρέχονται πρόσθετες πληροφορίες μαζί με το προϊόν. 1. Συνδεθείτε στο σταθμό δεδομένων LightCycler ως διαχειριστής. 2. Εισάγετε το CD του SeptiFast Software Set στη μονάδα CD του σταθμού δεδομένων LightCycler. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν η εγκατάσταση του προγράμματος δεν ξεκινήσει αυτόματα, ξεκινήστε την εγκατάσταση του SIS χειροκίνητα κάνοντας κλικ στο αρχείο setup.exe που παρέχεται στο CD του SeptiFast Software Set. 3. Για την πρώτη εγκατάσταση: Σε περίπτωση που δεν είναι εγκατεστημένο το Microsoft.NET 1.1 framework, θα σας ζητηθεί να το εγκαταστήσετε στην αρχή της εγκατάστασης του SIS. Η εγκατάσταση του Microsoft.NET 1.1 framework είναι απαραίτητη, διαφορετικά το SIS δεν θα λειτουργεί σωστά. 04802918001-06EL 12 Doc Rev. 6.0

4. Πατήστε <OK> για να αρχίσει η εγκατάσταση του SIS, ακολουθήστε τις οδηγίες του βοηθού εγκατάστασης. 5. Επιλέξτε <just me> εάν στο σταθμό δεδομένωνlightcycler πρόκειται να εργάζεται μόνο ένας χειριστής, επιλέξτε <everyone> εάν στο σταθμό δεδομένων LightCycler πρόκειται να εργάζονται περισσότεροι από ένας χειριστές. 6. Στο παράθυρο επιβεβαίωσης <Setup succeeded> πατήστε <OK> (η εκκίνηση του SIS μπορεί να γίνει τώρα από την επιφάνεια εργασίας μέσω του εικονιδίου του). 7. Ο φάκελος δεδομένων <C:\Export to SIS> για τα αρχεία *.ixo δημιουργείται αυτόματα. Ελέγξτε εάν έγινε σωστά η εγκατάσταση του SIS (για εξέταση με LightCycler SeptiFast Test MG και LightCycler SeptiFast meca Kit MG): 1. Όλα τα διορθωμένα αρχεία αντιγράφονται αυτόματα από το CD του SeptiFast Software Set στο φάκελο <C:\Export to SIS>. 2. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο SIS στην επιφάνεια εργασίας και πατήστε <Start>. 3. Επιλέξτε το διορθωμένο αρχείο από το <C:\Export to SIS> (SeptiFast Proof v2.0.ixo ή SeptiFast meca Proof v2.0, αντίστοιχα). 4. Επιλέξτε "NO" ως απάντηση στην ερώτηση εάν η LightCycler αναφορά περιέχει την ένδειξη <User Developed or Modified Test Method>. 5. Η ανάλυση του αρχείου θα πραγματοποιηθεί αυτόματα και θα εμφανιστούν τα δεδομένα. 6. Εκτυπώστε την αναφορά. 7. Ανοίξτε και εκτυπώστε τα σχετικά αρχεία pdf (SeptiFast Proof v2.0.pdf ή SeptiFast meca Proof v2.0.pdf, αντίστοιχα). 8. Η εκτυπωμένη αναφορά πρέπει να αντιστοιχεί με το εκτυπωμένο αρχείο proof.pdf. Διαφορετικά, επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο της Roche. 9. Εκτελέστε τα βήματα 3-8 με το δεύτερο αρχείο proof. Απεγκατάσταση του SIS: 1. Συνδεθείτε στο σταθμό δεδομένων LightCycler ως διαχειριστής. 2. Κάντε κλικ στο <Start> στη γραμμή εργασιών του σταθμού δεδομένων LightCycler. 3. Επιλέξτε <Settings - Control Panel - Add/Remove Programs>. 4. Θα εμφανιστεί μια λίστα με όλα τα προγράμματα που είναι εγκατεστημένα τη δεδομένη στιγμή, κάντε κλικ στο <SIS>. 5. Επιλέξτε <Remove> και επιβεβαιώστε πατώντας <Yes>. Εγκατάσταση των Μακροεντολών SeptiFast: 1. Εγκαταστήστε τις Μακροεντολές από το CD του SeptiFast Software Set v2.0. 2. Για την εγκατάσταση μιας Μακροεντολής, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου ("για in Vitro Διαγνωστική Χρήση"). Προετοιμασία του Θαλάμου Νηματικής Ροής και του Σταθμού Εργασίας PCR 1. Καθαρίστε και απολυμάνετε εκτενώς το θάλαμο νηματικής ροής και το σταθμό εργασίας PCR (π.χ. με LTK-008 ). 2. Ενεργοποιήστε για τουλάχιστον 30 λεπτά: την ακτινοβολία UV και τον αερισμό του θαλάμου νηματικής ροής καθώς και την ακτινοβολία UV του σταθμού εργασίας PCR. 3. Απενεργοποιήστε την ακτινοβολία UV κατά τη διάρκεια της εργασίας. 4. Ανοίξτε το LightCycler SeptiFast Kit MG και αφαιρέστε: 1 φιαλίδιο IC και 1 φιαλίδιο NC και αφήστε τα να αποψυχθούν στους 2 έως 8 C σε μία υποδοχή κατάλληλη για προετοιμασία δείγματος (δεν παρέχεται). 1 φιαλίδιο RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F και αφήστε τα να αποψυχθούν στη SeptiFast Μονάδα Ψύξης στους 2 έως 8 C κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας δείγματος. 5. Ενεργοποιήστε: Το Θερμικό αναδευτήρα 1 (για σωληνάρια 15 ml) και ρυθμίστε τη θερμοκρασία στους 56 C, το Θερμικό αναδευτήρα 2 (για σωληνάρια 2,0 ml) και ρυθμίστε τη θερμοκρασία στους 70 C. 6. Τοποθετήστε αρκετά φιαλίδια EB (1 φιαλίδιο ανά δείγμα/nc) στο Θερμικό αναδευτήρα 2 (70 C). 7. Τοποθετήστε τα σωληνάρια συλλογής αίματος ή τα φιαλίδια δείγματος στον κυλινδρικό αναδευτήρα σε φιάλη και ανακινήστε για 30 λεπτά. Επεξεργαστείτε τα αμέσως. Προετοιμασία Δείγματος και Ορού Ελέγχου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εκτελείτε όλα τα βήματα χειρισμού μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής. Προτάσεις για την Προετοιμασία του Υλικού Θετικού Ορού Ελέγχου Εφόσον ξεκινήσει η διαδικασία προετοιμασίας του δείγματος, πρέπει να ολοκληρωθούν όλα τα βήματα. Το υλικό Θετικού Ορού Ελέγχου μπορεί να αγοραστεί και από άλλες εταιρίες. Αν το υλικό αυτό παρασκευάζεται στο εργαστήριο του χειριστή, τα σαφώς προσδιορισμένα κλινικά απομονωμένα στελέχη θα πρέπει να συλλέγονται ανάλογα με τον τοπικό επιπολασμό και την κλινική επίδραση. Αυτές οι απομονωμένες αποικίες θα πρέπει να υποβληθούν σε επαναιώρηση και να προστεθούν εξωγενώς σε αρνητικό αίμα σε συγκέντρωση περίπου 300 CFU/mL. Για θετικό ορό ελέγχου, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε υλικό ATCC 33592, ένα S. aureus ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη, το οποίο παρέχει τη δυνατότητα χρήσης του εκλούματος ως θετικού ορού ελέγχου για το LightCycler SeptiFast Test MG καθώς επίσης και το LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). Το στέλεχος καλλιεργήθηκε για 18-24 ώρες στους 28 έως 37 C σε αιματούχο άγαρ (5% αίμα προβάτου) και υποβλήθηκε σε επαναιώρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα σε 0,5 McFarland (~1,5x10 8 CFU/mL). Το εναιώρημα αυτό προστίθεται εξωγενώς σε αρνητικό αίμα σε τελική συγκέντρωση 300 CFU/mL. Διαδικασία πριν από τη λύση με SeptiFast Lys Kit MG ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Διαβάστε προσεκτικά το Εγχειρίδιο Χειριστή του MagNALyser Οργάνου. 1. Χρησιμοποιήστε 1 κατάλληλα επισημασμένο φιαλίδιο LM για κάθε δείγμα ή NC. 2. Ανοίξτε το φιαλίδιο και μεταφέρετε 1500 µl δείγματος αίματος ή NC. 3. Κλείστε σφιχτά το σωληνάριο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μη σημειώνετε στα καπάκια των σωληναρίων. 4. Εκτελέστε προκαταρκτική λύση στα δείγματα στο MagNALyser Όργανο για 70 δευτερόλεπτα στα 7000 rpm. 5. Αφήστε τα φιαλίδια έξω από το όργανο για 10 λεπτά. Μην εκτελείτε φυγοκέντριση! 04802918001-06EL 13 Doc Rev. 6.0

Προετοιμασία Δείγματος με SeptiFast Prep Kit MG ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι καθαρά διαλύματα. Αν σχηματιστούν κατακρημνίσματα, θερμάνετε το διάλυμα (σε θερμοκρασία έως και 37 C). Ανακινήστε ελαφρώς μέχρι να διαλυθούν τα κατακρημνίσματα. 1. Προσθέστε 150 µl PK στο BET 1. 2. Προσθέστε 1 ml δείγματος που υποβλήθηκε σε προκαταρκτική λύση ή NC σε BET 1. Αποφύγετε τη διοχέτευση με πιπέτα των δειγμάτων λύσης στερεού τύπου ή αφρού. 3. Πωματίστε τα σωληνάρια και στροβιλίστε για σύντομο χρονικό διάστημα. 4. Προσθέστε 10 µl IC. Χρησιμοποιείτε καινούριο ακροφύσιο πιπέτας για κάθε δείγμα ή NC. 5. Προσθέστε το περιεχόμενο 2 φιαλιδίων LB, πωματίστε και στροβιλίστε αμέσως και εκτενώς. 6. Επωάστε για 15 λεπτά στους 56 C ανακινώντας ελαφρά (π.χ. στα 500 rpm με το Θερμικό αναδευτήρα Eppendorf). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλο το υγρό στο BET 1 πρέπει να καλύπτεται με τη συσκευή επώασης. 7. Προσθέστε το περιεχόμενο 1 φιαλιδίου BB, πωματίστε και στροβιλίστε. 8. Τοποθετήστε το FC στο BET 2. Μην αγγίζετε την εσωτερική πλευρά ή την έξοδο του FC. 9. Διοχετεύστε με πιπέτα το μισό μίγμα προετοιμασίας δείγματος από το BET 1 στο φίλτρο του FC (περίπου 2,7 ml). 10. Πωματίστε και φυγοκεντρίστε το σύστημα BET 2-FC για 1 λεπτό στα 1900 x g. 11. Διοχετεύστε με πιπέτα το υπόλοιπο μίγμα προετοιμασίας δείγματος από το BET 1 στο φίλτρο του FC (περίπου 2,7 ml). Χρησιμοποιείτε καινούριο ακροφύσιο πιπέτας για κάθε δείγμα ή NC. 12. Πωματίστε και φυγοκεντρίστε το σύστημα BET 2-FC για 3 λεπτά στα 1900 x g. 13. Τοποθετήστε το FC στο BET 3. Απορρίψτε το BET 2 κατά τη ροή. 14. Προσθέστε το περιεχόμενο ενός φιαλιδίου IRB στο φίλτρο του FC στο BET 3. 15. Πωματίστε και φυγοκεντρίστε το σύστημα BET 3-FC για 2 λεπτά στα 4200 x g. 16. Προσθέστε το περιεχόμενο ενός φιαλιδίου WB στο φίλτρο του FC στο BET 3. 17. Πωματίστε και φυγοκεντρίστε το σύστημα BET 3-FC για 10 λεπτά στα 4200 x g. 18. Τοποθετήστε το FC στο BET 4. Απορρίψτε το BET 3 κατά τη ροή. 19. Φυγοκεντρίστε το BET 4 για 1 λεπτό στα 4200 x g. 20. Τοποθετήστε το FC στο BET 5. Απορρίψτε το BET 4. 21. Διοχετεύστε με πιπέτα 300 µl EB που έχει προθερμανθεί (70 C) στο κέντρο του FC. 22. Πωματίστε τα σωληνάρια και επωάστε τα για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 23. Φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια για 2 λεπτά στα 4200 x g. 24. Απορρίψτε το FC. Μεταφέρετε το έκλουμα σε φιαλίδια 1,5 ml (π.χ. με πιπέτες ορού από greiner bio-one). Αποφύγετε την επαφή με το τοίχωμα του σωληναρίου. Προετοιμασία Αντιδραστηρίου με LightCycler SeptiFast Kit MG ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Συνιστάται να εκτελείτε όλα τα βήματα χειρισμού σε σταθμό εργασίας PCR, σε άλλο χώρο από αυτόν της προετοιμασίας δείγματος. 1. Αφαιρέστε τη SeptiFast Μονάδα Ψύξης με τα φιαλίδια αντιδραστηρίων από το ψυγείο, απολυμάνετε με αντιδραστήριο απολύμανσης DNA (π.χ. LTK-008 ) και μεταφέρετέ την στο σταθμό εργασίας PCR. 2. Στροβιλίστε για μικρό χρονικό διάστημα τα αντιδραστήρια που έχουν αποψυχθεί (εκτός του RM 1a) και εκτελέστε καθίζηση σε όλα τα αντιδραστήρια (αν έχουν σχηματιστεί κατακρημνίσματα, θερμάνατε το διάλυμα στους 37 C για 5 λεπτά και ανακατέψτε ελαφρώς μέχρι να διαλυθούν τα κατακρημνίσματα). 3. Τοποθετήστε τα φιαλίδια με τα αντιδραστήρια που έχουν αποψυχθεί και τα φιαλίδια εκλούματος στις ενδεδειγμένες θέσεις στη SeptiFast Μονάδα Ψύξης. 4. Ανοίξτε τα φιαλίδια RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- και DM F. 5. Διοχετεύστε με πιπέτα 600 µl RM 1b στο RM 1a, ανακατέψτε ελαφρώς εκτελώντας αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. 6. Διοχετεύστε με πιπέτα 200 µl Μίγμα Αντίδρασης από το 1a σε κάθε φιαλίδιο DM G+, DM G- και DM F για να δημιουργήσετε ένα Κύριο Μίγμα MM G(+), MM G(-) και MM F. Ανακατέψτε ελαφρώς εκτελώντας αναρρόφηση και έκχυση με την πιπέτα. Προετοιμασία Αντιδράσεων PCR 1. Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό τριχοειδών στη SeptiFast Μονάδα Ψύξης, 3 τριχοειδή για τα RC (θέσεις 1, 2, 3), 3 τριχοειδή για το έκλουμα NC (θέσεις 4, 5, 6), 3 τριχοειδή για κάθε έκλουμα δείγματος (θέσεις 7 και πάνω). 2. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl MM G(+) σε κάθε τριχοειδές στην πάνω σειρά. 3. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl MM G(-) σε κάθε τριχοειδές στη μεσαία σειρά. 4. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl MM F σε κάθε τριχοειδές στην κάτω σειρά. 5. Ανοίξτε το πρώτο φιαλίδιο εκλούματος δείγματος. Ξεκινήστε τη διαδικασία από το φιαλίδιο στη δεξιά πλευρά της SeptiFast Μονάδας Ψύξης. 6. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl εκλούματος δείγματος σε καθένα από τα τρία παραπάνω τριχοειδή, που περιέχουν MM G(+), MM G(-) και MM F. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αλλάξτε ακροφύσιο μετά από κάθε βήμα διοχέτευσης με πιπέτα. 7. Κλείστε τα τρία τριχοειδή με το Εργαλείο Πωματισμού (μέρος του LightCycler 2.0 Οργάνου. Για τον τρόπο χρήσης ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου). 8. Συνεχίστε με τα υπόλοιπα εκλούματα δείγματος, όπως περιγράφεται στα βήματα 5-7. Διοχετεύστε το έκλουμα NC τελευταίο στα τριχοειδή στις θέσεις 4, 5 και 6. 9. Ανοίξτε το RC G+. 10. Διοχετεύστε με πιπέτα 50 µl στο τριχοειδές της θέσης 1. 11. Κλείστε το τριχοειδές και στη συνέχεια, κλείστε το RC G+. 12. Διοχετεύστε με πιπέτα το RC G- και RC F στα τριχοειδή των θέσεων 2 και 3 αντίστοιχα, όπως περιγράφεται στα βήματα 9-11. 13. Μεταφέρετε όλα τα τριχοειδή στο LightCycler Περιστρεφόμενο Δίσκο Δειγμάτων ανάλογα με τον αριθμό τους. 14. Φυγοκεντρίστε το LightCycler Περιστρεφόμενο Δίσκο Δειγμάτων με τη Φυγόκεντρο Περιστρεφόμενου Δίσκου LC 2.0. 15. Τοποθετήστε τον LightCycler Περιστρεφόμενο Δίσκο Δειγμάτων στο LightCycler 2.0 Όργανο. 04802918001-06EL 14 Doc Rev. 6.0

Αποθήκευση των Υπόλοιπων Αντιδραστηρίων και Εκλουμάτων 1. Σημειώστε στα μη χρησιμοποιημένα Κύρια Μίγματα MM G(+), MM G(-) και MM F τον αριθμό των υπολειπόμενων αντιδράσεων και την ημερομηνία. Τοποθετήστε τα φιαλίδια στις αντίστοιχες θέσεις της SeptiFast Μονάδας Ψύξης. 2. Το Κύριο Μίγμα MM μπορεί να αποθηκευτεί στους 2 έως 8 C μέχρι και για 3 ημέρες. Για την επόμενη ανάλυση, μπορείτε να συμπληρώσετε το αποθηκευμένο Κύριο Μίγμα (MM) με νέο MM για να εξασφαλίσετε τον απαιτούμενο όγκου του διαλύματος εργασίας. Το διάλυμα αυτό πρέπει να χρησιμοποιηθεί αμέσως. 3. Σημειώστε στα εκλούματα των δειγμάτων και στο NC τον αριθμό ανάλυσης και αποθηκεύστε τα όπως συνιστάται. 4. Απορρίψτε όλα τα άδεια φιαλίδια αντιδραστηρίων. Φόρτωση και Λειτουργία του LightCycler 2.0 Οργάνου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Συνιστάται το LightCycler 2.0 Όργανο, να λειτουργεί σε χωριστό δωμάτιο από αυτό για τον καθαρισμό του DNA και την προετοιμασία διαλυμάτων εργασίας. 1. Ενεργοποιήστε τη Μακροεντολή SeptiFast "SeptiFast_2.0_04469046001" (ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του LightCycler 2.0 Οργάνου, κεφάλαιο "Εκτέλεση μιας Roche Macro"). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν αποσυνδεθεί ο χειριστής, μη συνεχίσετε την ανάλυση. Ξεκινήστε νέα ανάλυση με νέο όνομα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μη χρησιμοποιείτε το πεδίο <assay lot number>. Εάν θέλετε να προσθέσετε τον αριθμό παρτίδας ανάλυσης στην εξέταση, εισάγετε τις πληροφορίες στο αντίστοιχο πεδίο στον επεξεργαστή δείγματος. 2. Αποθηκεύστε την ανάλυση με ένα όνομα που θα εξασφαλίζει ακριβή ταυτοποίηση (π.χ. όνομα χειριστή και ημερομηνία). 3. Σε περίπτωση που απαιτούνται λιγότερα από 7 δείγματα, μειώστε τα δείγματα από τη λίστα φόρτωσης προεπιλογής. Διαγράψτε και τα 3 τριχοειδή ενός δείγματος στη λίστα, όχι μόνο 1 ή 2 από τις 3 παράλληλες αναλύσεις. Εάν κατά λάθος διαγραφούν πάρα πολλά τριχοειδή, μην τα προσθέσετε, αλλά ξεκινήστε τη διαδικασία από την αρχή. 4. Μπορείτε να καταχωρήσετε συγκεκριμένα δεδομένα ασθενή σε <αγκύλες> αντί να χρησιμοποιήσετε την προεπιλεγμένη ρύθμιση [π.χ., G(+) <Όνομα_01> αντί για G(+) <δείγμα 1>]. Το κείμενο πρέπει να είναι ίδιο και στις 3 παράλληλες αναλύσεις μιας λίστας δειγμάτων, για να διασφαλίζεται η σωστή αναγνώριση του δείγματος από το SIS. Διαφορετικά, αφήστε τις ρυθμίσεις προεπιλογής και πατήστε <Run Note> για να εισάγετε δεδομένα, αν απαιτείται. 5. Μόλις προστεθούν όλες οι ειδικές για τα δείγματα πληροφορίες, συνεχίστε κατά τον οδηγό κιτ και ξεκινήστε την ανάλυση με το LightCycler 2.0 Όργανο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Με τη χρήση ορισμένων ειδικών χαρακτήρων, όπως ' ή < > ` και, ενδέχεται να προκληθούν προβλήματα στις συμβάσεις ονομασίας κατά την εισαγωγή ενός ονόματος στο πεδίο προβολής ονόματος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην αλλάζετε τα προθέματα G(+), G(-), F. Μην αλλάζετε τα ονόματα των αντιδραστηρίων ελέγχου [π.χ., G(+) #RC#] και των αρνητικών ορών ελέγχου [π.χ., G(+) #NC#]. 6. Μετά τη ολοκλήρωση της ανάλυσης, ελέγξτε τη στάθμη του υγρού στα τριχοειδή (τα αποτελέσματα δεν είναι έγκυρα για το τριχοειδές, εάν η στάθμη του είναι μεταβλητή). Ανίχνευση Κορυφής και Αυτοματοποιημένη Ταυτοποίηση Ειδών Γενική Επεξήγηση των Μονάδων Ανάλυσης ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην ξεκινάτε την ανάλυση δεδομένων κατά τη διάρκεια μιας ανάλυσης με το LightCycler 2.0 Όργανο. Η χειροκίνητη εμφάνιση της τιμής Τ M απαιτεί 12 μονάδες εμφάνισης τιμής T M (3 αναλύσεις, 4 κανάλια). Οι μονάδες Απόλυτης Ποσοτικοποίησης δεν απαιτούν χειροκίνητο χειρισμό, πέρα από τον οπτικό έλεγχο. Η χειροκίνητη εμφάνιση τιμής T M μπορεί να εκτελεστεί έως και για 6 κορυφές χρησιμοποιώντας τις γραμμές T M (μπορούν να επισημανθούν έως 6 κορυφές για οποιαδήποτε καμπύλη δείγματος ή ορού ελέγχου). Οι ρυθμίσεις γραμμών T M κάθε μονάδας ανάλυσης προκαθορίζονται στις SeptiFast Μακροεντολές. Στο παράθυρο της κορυφής τήξης, εμφανίζονται όλες οι καμπύλες των επιλεγμένων γραφημάτων. Μπορείτε να επιλέξετε ή να αποεπιλέξετε τις γραμμές της τιμής T M χωρίς να εμφανιστεί ένδειξη. Οι τιμές αναφοράς κάθε μονάδας ανάλυσης προκαθορίζονται στις SeptiFast Μακροεντολές. Μην αλλάζετε ή αποεπιλέγετε τις τιμές αναφοράς. Εάν αλλάξουν κατά λάθος, πληκτρολογήστε τις σωστές τιμές από τον Πίνακα 3: Τιμές αναφοράς. Εάν ενεργοποιηθούν περισσότερα από ένα τριχοειδή, οι ρυθμίσεις του πρώτου τριχοειδούς εμφανίζονται στο πλαίσιο ελέγχου. Η μετατόπιση των γραμμών επηρεάζει όλα τα ενεργοποιημένα τριχοειδή. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην αλλάξετε τις παρακάτω ρυθμίσεις: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> ή <Peak Width>. Μπορείτε να επιλέξετε <Display - Peak Height>. Οι κορυφές ορίζονται ως οι μέγιστες τιμές πάνω από την τιμή αναφοράς. Οι ώμοι (shoulders) δεν θεωρούνται κορυφές. Εξαίρεση αποτελούν τα RC G-, Κανάλι 610 (π.χ. Εικόνα 4, Γράφημα 2) και 670 και RC F, Κανάλι 705. Οι δύο αριστερές κορυφές στο Γράφημα 1 είναι μέγιστες και πρέπει να επισημαίνονται με γραμμές. Στο γράφημα 2, μία από τις κορυφές (π.χ. η δεύτερη) εμφανίζεται ως ώμος (shoulder), αλλά πρέπει επίσης να επισημανθεί. Στα Γραφήματα 3 και 4 μία από τις κορυφές λείπει. Πρέπει να ενεργοποιηθούν μόνο δύο αντί για τρεις γραμμές. Σχήμα 4: RC G-, CH 610 Γράφημα 1 Γράφημα 2 Γράφημα 3 Γράφημα 4 04802918001-06EL 15 Doc Rev. 6.0