ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΓΝΑΘΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN Σοφία Κουβαριτάκη 1, Μάρθα Βαρδάκη 1, Σοφία Παντελιού 2, Χρίστος Κοντογιάννης 1,3 και Μαλβίνα Όρκουλα 1 1 Τµήµα Φαρµακευτικής, Πανεπιστήµιο Πατρών 2 Τµήµα Μηχανολόγων Μηχανικών και Αεροναυπηγών, Πανεπιστήµιο Πατρών 3 ΕΙΧΗΜΥΘ/ΙΤΕ, Πάτρα E-mail: malbie@upatras.gr, τηλ: 2610969941, fax: 2610997658 1. Εισαγωγή Η κάτω γνάθος, το κατώτερο οστό της κεφαλής, αποτελεί µαζί µε την άνω, το µεγαλύτερο και πιο δυνατό οστό της κεφαλής που συγκρατεί τα δόντια στη θέση τους. Αποτελείται από µια ανόργανη και µια οργανική φάση, οι οποίες δηµιουργούν ένα σύµπλεγµα µέσω της ασβεστοποίησης της οργανικής φάσης. Συγκεκριµένα, το ένα τρίτο του οστού αποτελείται από την οργανική φάση και τα δυο τρίτα από την ανόργανη. Η οργανική φάση του οστού συνίσταται από ίνες κολλαγόνου τύπου Ι (που αποτελούν το 90% της ολικής πρωτεΐνης του οστού) και πολυάριθµες µη κολλαγονούχες πρωτεΐνες (που συνιστούν το υπόλοιπο 10% της ολικής πρωτεΐνης του οστού). Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι µια εξαιρετικά ινώδης πρωτεΐνη µε σταυροδεσµούς, που προσδίδει στο οστό µηχανικές και βιοχηµικές ιδιότητες. Οι λειτουργίες των µη κολλαγονούχων πρωτεϊνών είναι ποικίλες και ορισµένες από αυτές δεν είναι ακόµα πλήρως κατανοητές [1]. Το ανόργανο τµήµα συνίσταται από ένα άλας του φωσφορικού ασβεστίου, τον βιοαπατίτη [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ]. Επιπλέον, ένα µικρό ποσοστό του οστού αποτελείται από κύτταρα και µυελό [2]. Ο όρος «ποιότητα οστού» αναφέρεται στο σύνολο των συνθετικών και αρχιτεκτονικών ιδιοτήτων του οστέινου ιστού που καθορίζουν τις ιδιότητες του υλικού και την ικανότητά του να εκτελεί µηχανικές λειτουργίες. Η µέτρηση της οστικής πυκνότητας (Bone Mineral Density) χρησιµοποιείται στη διάγνωση ασθενειών (π.χ οστεοπόρωση) µε µη επεµβατικές τεχνικές, χρησιµοποιώντας όµως ακτίνες-χ. Αν και οι τεχνικές αυτές χρησιµοποιούνται ευρέως, παρουσιάζουν αδυναµίες στη διάγνωση ασθενειών καθώς αποκρίνονται µόνο στο ανόργανο συστατικό του οστού (βιοαπατίτη) χωρίς να λαµβάνουν υπόψη το οργανικό (κολλαγόνο τύπου Ι). Έτσι, αναπτύσσονται νέες τεχνικές, όπως είναι και η φασµατοσκοπία Raman, η οποία αποδίδει στην ποιότητα οστού ένα σύνολο δοµικών, φυσικοχηµικών και βιολογικών παραµέτρων που σχετίζονται µε την αντοχή του όπως είναι ο προσανατολισµός των ινών του κολλαγόνου, η ποσότητα και το είδος των σταυροδεσµών του, ο λόγος ανόργανης/οργανικής φάσης, το µέγεθος των κρυσταλλιτών του βιοαπατίτη, κ.α. [3]. 2. Μεθοδολογία Χρησιµοποιήθηκαν δέκα ανθρώπινες γνάθοι, άγνωστης ηλικίας, χαρακτηρισµένες µε τα γράµµατα Κ, L, έως T. Η κάθε γνάθος χωρίστηκε σε τρεις θεωρητικές περιοχές, τη δεξιά, το κέντρο και την αριστερή. Για κάθε γνάθο καταγράφηκαν δεκαπέντε φάσµατα, 300 σαρώσεων, πέντε σε κάθε περιοχή, µε ισχύ προσπίπτουσας ακτινοβολίας 450 mw, ξεκινώντας πάντα από δεξιά προς αριστερά.
Το φασµατόµετρο που χρησιµοποιήθηκε ήταν το µοντέλο FRA-106/S χρησιµοποιώντας µετασχηµατισµό Fourier (FT-Raman) της εταιρίας Bruker, το οποίο εξέπεµπε ακτινοβολία στα 1064 nm. Η επεξεργασία των φασµάτων έγινε µε τα υπολογιστικά προγράµµατα Origin Pro 8.0 και Peakfit (Peakfit v4.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA). 3. Αποτελέσµατα Συζήτηση Στο σχήµα 1 φαίνεται ένα ενδεικτικό φάσµα µε τις χαρακτηριστικές κορυφές του οστού που αναλύθηκαν στην πορεία. Συγκεκριµένα, ο βιοαπατίτης δίνει δόνηση στα 960 cm -1, τα αµινοξέα προλίνη και υδροξυπρολίνη του κολλαγόνου στην περιοχή 830-920 cm -1 και το αµίδιο Ι του κολλαγόνου στην περιοχή 1600-1725cm -1. B Σχετική ένταση A Г 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Μ ετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήµα 1: Φάσµα Raman γνάθου µε τις χαρακτηριστικές περιοχές προλίνης και υδροξυπρολίνης του κολλαγόνου (Α), του βιοαπατίτη (Β) και του αµιδίου Ι (Γ). Επειδή οι κορυφές παρουσιάζουν επικάλυψη και οι µετρήσεις δεν είναι ακριβείς, εφαρµόστηκε διαχωρισµός κορυφών (deconvolution). Συγκεκριµένα, εφαρµόστηκε στις περιοχές του βιοαπατίτη (910-990 cm -1 ), του αµιδίου Ι (1650-1695 cm -1 ) και της προλίνης - υδροξυπρολίνης (830-920 cm -1 ) µε χρήση κατάλληλου λογισµικού (Peakfit v4.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA) χρησιµοποιώντας την τεχνική της δευτέρας παραγώγου και προσοµοίωση κορυφής µε µικτή κορυφή Gauss και Lorentzian.
Σχήµα 2Α. ιαχωρισµός κορυφών στην περιοχή 910-990 cm -1. Σχήµα 2Β. ιαχωρισµός κορυφών στην περιοχή 830-920 cm -1 (περιοχή προλίνης υδροξυπρολίνης). Σχήµα 3. ιαχωρισµός κορυφών στην περιοχή του αµιδίου Ι.
Ύστερα από µετρήσεις του ύψους και του εµβαδού των κορυφών που αποδίδονται στο βιοαπατίτη και στο κολλαγόνο τύπου Ι, υπολογίστηκαν για κάθε γνάθο ο λόγος ανόργανης/οργανικής φάσης [Ύψος απατίτη / (Ύψος προλίνης + Ύψος Υδροξυπρολίνης)] και η αναλογία µη αναγώγιµων / αναγώγιµων σταυροδεσµών κολλαγόνου [(Ύψος 1658 cm -1 + Ύψος 1668 cm -1 ) / (Ύψος 1680 cm -1 + Ύψος 1690 cm -1 )] και κατασκευάστηκαν διαγράµµατα για την παρακολούθηση της διαφοροποίησης της ποιότητας του οστού από σηµείο σε σηµείο της γνάθου. Στο σχήµα 4 εικονίζονται οι παραπάνω αναλογίες για τις µετρήσεις που έγιναν περιµετρικά σε µία γνάθο (L). Γίνεται εύκολα αντιληπτό ότι η αριστερή πλευρά εµφανίζει αυξηµένη αναλογία απατίτη προς κολλαγόνο και εποµένως και αυξηµένη σκληρότητα. Ταυτόχρονα ο λόγος µη αναγώγιµων προς αναγώγιµες κορυφές είναι χαµηλός το οποίο σηµαίνει ότι οι δισθενείς σταυροδεσµοί είναι περισσότεροι από τους τρισθενείς και το δίκτυο του κολλαγόνου είναι σε καλή κατάσταση στην περιοχή αυτή. Σχήµα 4. Λόγος ανόργανης προς οργανική φάση [ Υ960 / Υ(855+870+920) ] και λόγος µη για τη γνάθο L. Στο σχήµα 5 βλέπουµε τις αναλογίες στα διάφορα σηµεία περιµετρικά µιας άλλης γνάθου (Ν). Ενώ ο λόγος απατίτη προς κολλαγόνο είναι περίπου σταθερός περιµετρικά της γνάθου, η αναλογία µη αναγώγιµων προς αναγώγιµους σταυροδεσµούς παρουσιάζει σηµαντική διαφοροποίηση. Στην αριστερή πλευρά η αναλογία είναι αυξηµένη που σηµαίνει ότι υπερισχύουν οι τριπλοί των διπλών σταυροδεσµών. Αυτό µπορεί να συµβαίνει είτε λόγω µειωµένης δηµιουργίας νέων διπλοδεσµών µεταξύ των ινών του κολλαγόνου, πιθανόν λόγω µειωµένης ανάπτυξης του δικτύου του κολλαγόνου, είτε λόγω αυξηµένης µετατροπής των διπλο- σε τριπλοδεσµούς. Στην τελευταία περίπτωση, οι υπάρχουσες ίνες συνδέονται πιο ισχυρά µεταξύ τους και εποµένως το δίκτυο πιθανότατα χάνει την ελαστικότητα του και γίνεται πιο δύσκαµπτο. Σχήµα 5. Λόγος ανόργανης προς οργανική φάση [ Υ960 / Υ(855+870+920) ] και λόγος µη για τη γνάθο N.
Στην επόµενη γνάθο (R) στο σχήµα 6, βλέπουµε ότι µεταξύ δεξιάς πλευράς και µέσου (πρόσθιου) τµήµατος της γνάθου ο λόγος απατίτη προς κολλαγόνο είναι χαµηλός άρα η περιοχή αυτή είναι µειωµένης αντοχής, ενώ ο λόγος µη αναγώγιµων προς αναγώγιµους σταυροδεσµούς είναι αυξηµένος δηλαδή ταυτόχρονα και το κολλαγόνο στην περιοχή αυτή έχει υποστεί αλλοίωση. Μεταξύ µέσου και αριστερής πλευράς της γνάθου το ανόργανο υλικό είναι ενισχυµένο αλλά το δίκτυο του κολλαγόνου έχει αλλοιωθεί. Σχήµα 6. Λόγος ανόργανης προς οργανική φάση [ Υ960 / Υ(855+870+920) ] και λόγος µη για τη γνάθο R. 4. Συµπεράσµατα Στην παρούσα εργασία, χρησιµοποιήθηκε η Φασµατοσκοπία Raman ως εργαλείο για την εκτίµησηη της οστέινης ποιότητας κάτω γνάθων. είχθηκε ότι αυτή µπορεί να διαφέρει από πλευρά σε πλευρά ή από σηµείο σε σηµείο της γνάθου, όπως άλλωστε είναι αναµενόµενο, πράγµα που µπορεί να οφείλεται σε διάφορους λόγους όπως οι συνήθειες µασήµατος. Η φασµατοσκοπία Raman µπορεί να δώσει πληροφορίες σε καθαρά τοπικό επίπεδο τόσο για την ποσότητα του ανόργανου συστατικού το οποίο προσδίδει υψηλή µηχανική αντοχή όσο και για την κατάσταση του δικτύου του κολλαγόνου στην περιοχή αυτή, το οποίο επίσης υφίσταται αλλοιώσεις. 5. Βιβλιογραφικές αναφορές [1]. Cashman K.D., Ginty F., Bone, Elsevier (2003) [2]. Gong J.K., Arnold J.S. and Cohn S.H., Composition of trabecular and cortical bone, The Anatomical Record (1964) 149:325-331 [3]. Fritton J.C. and Schaffler M, B., Bone Quality, in: Osteoporosis, Chapter 24, 3 rd Edition, Marcus R., Feldman D., Nelson D. and Rosen C. (edit.), Elsevier (2008)