Επίδραση των διατροφικών επιπέδων βιταµίνης Α στην οστεολογική ανάπτυξη του λαβρακιού, Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758)

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ «Οικολογία ιαχείριση και Προστασία Φυσικού Περιβάλλοντος» Επίδραση των διατροφικών επιπέδων βιταµίνης Α στην οστεολογική ανάπτυξη του λαβρακιού, Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758) Νοµική Γλυνάτση (Α.Μ. 345) Πάτρα 2008

Η εκπόνηση της διπλωµατικής εργασίας διεξήχθη στα πλαίσια του προγράµµατος FINEFISH. 1

Επιβλέπων Καθηγητής Κουµουνδούρος Γεώργιος (Επίκουρος Καθηγητής Πανεπιστηµίου Πατρών) Τριµελής Εξεταστική Επιτροπή Κασπίρης Παναγιώτης (Αναπληρωτής Καθηγητής Πανεπιστηµίου Πατρών) Κουµουνδούρος Γεώργιος (Επίκουρος Καθηγητής Πανεπιστηµίου Πατρών) Φλυτζάνης Κωνσταντίνος (Αναπληρωτής Καθηγητής Πανεπιστηµίου Πατρών) 2

Πρόλογος Η παρούσα διπλωµατική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Ιχθυολογίας του Τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών, στα πλαίσια του µεταπτυχιακού προγράµµατος: «Οικολογία - ιαχείριση και Προστασία Φυσικού Περιβάλλοντος». Χρηµατοδοτήθηκε από το ερευνητικό πρόγραµµα FINEFISH. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα της παρούσας εργασίας, Επίκουρο καθηγητή κ. Κουµουνδούρο Γεώργιο. Η υποµονή που επέδειξε όλους τους µήνες µέχρι την ολοκλήρωση της εργασίας είναι αξιοθαύµαστη ενώ οι συµβουλές και η βοήθεια που πρόσφερε στη διάρκεια διεξαγωγής αλλά και συγγραφής της εργασίας ήταν πραγµατικά αναντικατάστατες. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κασπίρη Παναγιώτη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Φλυτζάνη Κωνσταντίνο, µέλη της τριµελούς επιτροπής. Πολλές ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω στην Γεωργακοπούλου Έφη, Χριστοδουλοπούλου Σταυρούλα και Καραµάνο ηµήτρη για τη βοήθειά τους ήδη από το ξεκίνηµα αυτής της εργασίας. Στη Γεώργα Γιάννα, Συµεωνίδη ιονυσία και Vendafrida Mariangelo γιατί συνεισέφεραν όλοι τους στην παρούσα εργασία. Ένα τεράστιο ευχαριστώ στους γονείς µου, Μιχάλη και Μαρία για την συµπαράσταση και εµπιστοσύνη που µου δείχνουν όλα αυτά τα χρόνια. Σε κάθε βήµα, όπως και στο επόµενο είναι δίπλα µου στηρίζοντας µε ουσιαστικά. Σε εσάς αφιερώνω αυτή την εργασία και σας ευχαριστώ για όλα µέχρι τώρα αλλά και για τα επόµενα που έρχονται. 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Γενικά για τις θαλάσσιες Μεσογειακές υδατοκαλλιέργειες 1.2 Μορφο-ανατοµικές ανωµαλίες των εκτρεφόµενων ιχθύων 1.2.1 Κατηγορίες µορφο-ανατοµικών ανωµαλιών 1.3 Γενεσιουργοί παράγοντες των µορφο-ανατοµικών ανωµαλιών 1.4 Βιταµίνη Α και σκελετικές δυσπλασίες 1.5 Στοιχεία βιολογίας του λαβρακιού (Dicentrarchus labrax) 1.6 Στόχοι παρούσας µελέτης 2. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Εκτροφή νυµφών και ιχθυδίων λαβρακιού 2.2 ειγµατοληψία 2.3 Χρώση και φωτογράφηση νυµφών-ακτινογράφηση ιχθυδίων 2.4 Ανάλυση των δεδοµένων και στατιστική επεξεργασία 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Επίδραση βιταµίνης Α στη συχνότητα εµφάνισης σκελετικών δυσπλασιών στις νύµφες λαβρακιού 3.2 Επίδραση βιταµίνης Α στη συχνότητα εµφάνισης σκελετικών δυσπλασιών στα ιχθύδια λαβρακιού 3.3 Επίδραση βιταµίνης Α στους µεριστικούς χαρακτήρες του λαβρακιού 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Επίδραση της διατροφής στις σκελετικές δυσπλασίες 4.2 Επίδραση της διατροφής στην ανάπτυξη των µεριστικών χαρακτήρων 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 6. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 7. ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 4

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5

1.1 Γενικά για τις θαλάσσιες µεσογειακές υδατοκαλλιέργειες Η λεκάνη της Μεσογείου έχει µακρόχρονη παρουσία σε δραστηριότητες που σχετίζονται µε τις υδατοκαλλιέργειες. Υπάρχουν ενδείξεις ήδη ακόµη από την εποχή των Αιγυπτίων όπως δείχνουν τοιχογραφίες 2.500 ετών. Οι εκτατικές θαλάσσιες υδατοκαλλιέργειες αναπτύχθηκαν κατά τον 6 αιώνα π.χ. και περιελάµβαναν είδη όπως η τσιπούρα, το λαβράκι καθώς και οστρακοειδή. Το τέλος της Ρωµαϊκής Αυτοκρατορίας σηµατοδότησε την εξαφάνισή τους. Μόνο κατά τον 12ο αιώνα µ.χ. άρχισε να ανακάµπτει και πάλι αυτή η δραστηριότητα για είδη των γλυκών νερών. Κατά το 19 ο αιώνα η οστρακοκαλλιέργεια αποτελούσε συνήθη πρακτική στη δυτική Μεσόγειο και την Αδριατική (www.faosipam.org/). Η παράδοση σε αυτή τη δραστηριότητα παράλληλα µε τις ξεχωριστές οικολογικές συνθήκες της περιοχής ευνόησαν την ευρεία ανάπτυξη της σύγχρονης θαλάσσιας µεσογειακής υδατοκαλλιέργειας που έχει ζωή δύο µόλις δεκαετίες (Rigos & Troisi 2005). Σήµερα οι περισσότερες χώρες που βρέχονται από τη Μεσόγειο εµπλέκονται σε αυτόν τον παραγωγικό τοµέα. Γενικά, η Μεσογειακή υδατοκαλλιέργεια παρουσιάζει δυναµική πορεία µε µέσο ρυθµό ανάπτυξης 7,1% για το διάστηµα 1990-2000 (ειδικά για τις ιχθυοκαλλιέργειες ο ρυθµός αύξησης αγγίζει το 25,7%) και ετήσιο ρυθµό αύξησης που µεταβλήθηκε από 4% σε 13% στη διάρκεια είκοσι ετών (Monbrison 2004). Η παραγωγή ιχθύων είχε θεαµατική αύξηση ειδικά µετά την άνθηση των υδατοκαλλιεργειών σε Ελλάδα και Τουρκία κατά την προηγούµενη δεκαετία (παραγωγή τσιπούρας και λαβρακίου κυρίως). Η ανάλυση του ρυθµού αύξησης µεταξύ των ετών 1992 και 2001 καταδεικνύει πως η Ελλάδα και η Τουρκία κατέχουν από τις πρώτες θέσεις. Η παραγωγή τσιπούρας και λαβρακίου ανήλθε σε 118.000 τόνους το 2006 µε τη χώρα µας να κατέχει το 63% του συνόλου (σε ευρωπαϊκό επίπεδο) (www.fao.org) (Εικόνα 1). Η ταχεία αύξηση στην παραγωγή ιχθυδίων επιτεύχθηκε χάρη τόσο στην πρόοδο των τεχνικών µέσων όσο και σε επενδύσεις σε µεγαλύτερο αριθµό µονάδων παραγωγής γόνου (εκκολαπτήρια). Εκτιµάται πως λειτουργούν περίπου 90 εκκολαπτήρια τσιπούρας και λαβρακιού στην Ευρώπη τα οποία παράγουν 1-5 εκατοµµύρια ιχθυδίων ανά έτος. Επιπλέον, υπάρχουν γύρω στις 10 µονάδες που ειδικεύονται σε µεγαλύτερης κλίµακας παραγωγή (>10 εκατοµµύρια ιχθυδίων ανά έτος) και πώλησή τους (Shields 2001). 6

ΕΙΚΟΝΑ 1.1. Εξέλιξη της παραγωγής λαβρακιού και τσιπούρας µέχρι και το έτος 2005 (µε ανοιχτές κουκίδες η συνολική ευρωπαϊκή παραγωγή και µε κλειστές η ελληνική παραγωγή) (www.fao.org). 7

1.2 Μορφο-ανατοµικές ανωµαλίες εκτρεφόµενων ιχθύων Η εντατική θαλάσσια υδατοκαλλιέργεια της Μεσογείου αντιµετώπισε σοβαρά προβλήµατα µορφοανατοµικών ανωµαλιών τις δεκαετίες 1970 και 1980, κατά τη διάρκεια των οποίων η ερευνητική δραστηριότητα επικεντρώθηκε κύρια στην ποσότητα του παραγοµένου προϊόντος και όχι στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του. Αποτέλεσµα των ανωτέρω ήταν να είναι αδύνατη η διάθεση το προϊόντος σε ποσοστό έως και 90% και συνεπακόλουθα τις µεγάλες οικονοµικές απώλειες για τις µονάδες παραγωγής (Divanach et al. 1996). Η αντιστοίχηση της ποιότητας των εκτρεφόµενων ειδών µε τα πρότυπα των άγριων πληθυσµών αποτελεί προαπαιτούµενο για τις υδατοκαλλιέργειες σε οικονοµικό, βιολογικό και εµπορικό επίπεδο (Divanach et al. 1997). Μορφο-ανατοµικές ανωµαλίες έχουν αναφερθεί σε πολλά είδη εκτρεφόµενων ιχθύων όπως το ευρωπαϊκό λαβράκι (Chatain 1994, Boglione et al. 1995, Divanach et al. 1996, 1997, Koumoundouros et al. 2002b, Kranenbarg et al. 2005, Sfakianakis et al. 2006, Georgakopoulou et al. 2007a), η τσιπούρα (Chatain 1994, Andrades et al. 1996, Koumoundouros et al. 1997a, b), η συναγρίδα (Dentex dentex) (Koumoundouros et al. 2001), το µυτάκι (Diplodus puntazzo) (Favarolo & Mazzola 2000, Boglione et al. 2003, Sfakianakis et al. 2005), ο σαργός (Diplodus sargus) (Sfakianakis et al. 2003) καθώς και πολλά άλλα. Οι µορφο-ανατοµικές ανωµαλίες δεν έχουν ειδο-ειδική έκφραση και αναπτύσσονται κατά τα πρώτα αναπτυξιακά στάδια, υπό τη συνεργατική δράση διάφορων γενεσιουργών παραγόντων (Gapasin & Duray 2001, Koumoundouros et al. 2002b, Cahu et al. 2003, Fraser et al. 2004). Ως µορφο-ανατοµική ανωµαλία µπορεί να χαρακτηριστεί κάθε µη αναστρέψιµη µορφολογική απόκλιση από την καθορισµένη ως φυσιολογική κατάσταση. Κατά τα τελευταία χρόνια έχει σηµειωθεί σηµαντική πρόοδος στις συνθήκες εκτροφής, στη διατροφή και στον έλεγχο ασθενειών επιλύοντας αρκετά από τα παρατηρούµενα προβλήµατα (Sfakianakis et al. 2006a). Εντούτοις, µόνο για λίγες µορφο-ανατοµικές ανωµαλίες βρέθηκαν επαρκείς λύσεις αντιµετώπισής τους (Divanach et al. 1996, Sfakianakis et al. 2006a). Επί παραδείγµατι, στην περίπτωση ανάπτυξης προ-αιµατική λόρδωσης εξαιτίας της µη λειτουργικής νηκτικής κύστης, το πρόβληµα περιορίστηκε µε τη χρήση µηχανισµών αποµάκρυνσης του ελαιώδους φιλµ από την επιφάνεια των δεξαµενών οπότε οι νύµφες έχουν την δυνατότητα να προσλάβουν έγκαιρα την φυσαλίδα αέρα για την πλήρωση της νηκτικής τους κύστης (Chatain 1989). 8

Γενικά, τα προβλήµατα που σχετίζονται µε παραµορφώσεις αφορούν σε µείωση του ρυθµού σωµατικής αύξησης (Divanach et al. 1996), σε αύξηση της θνησιµότητας (Αndrades et al. 1996, Divanach et al. 1996) και βεβαίως στην παραγωγή προϊόντος που δεν µπορεί να διατεθεί στην αγορά (Divanach et al. 1996, Boglione et al. 2001). 1.2.1 Κατηγορίες µορφο-ανατοµικών ανωµαλιών Οι µορφο-ανατοµικές ανωµαλίες µπορούν να διακριθούν σε πέντε οµάδες ανάλογα µε την περιοχή του σώµατος που εντοπίζονται: i. στο σχήµα του σώµατος ii. στο χρωµατισµό του δέρµατος iii. στα λέπια iv. στη νηκτική κύστη v. στον σκελετό- κρανίο, σπονδυλική στήλη, πτερύγια. i. Όσον αφορά τις αποκλίσεις του σχήµατος του σώµατος, έχουν παρατηρηθεί σοβαρές περιπτώσεις όπως ο νανισµός καθώς και άλλες που συνδέονται µε εσωτερικές σκελετικές δυσπλασίες (Divanach et al. 1996, Koumoundouros et al. 1997a, 2001, 2002b, Setiadi et al. 2006, Sfakianakis et al. 2006b). Οι διαφορετικές συνθήκες εκτροφής όπως διαφορετική θερµοκρασία ανάπτυξης (Georgakopoulou et al. 2007b) ή η αλατότητα (Loy et al. 1996) φαίνεται να επηρεάζουν το σχήµα του σώµατος, εντός όµως των φυσιολογικών ορίων της φαινοτυπικής πλαστικότητας κάθε είδους. ii. Η αλλαγή στο χρωµατισµό των εκτρεφόµενων ιχθύων περιλαµβάνει το µερικό ή ολικό αλφισµό, τη διχρωµία ή τη σκουροχρωµία. Περιστατικά χρωµατικών αλλοιώσεων έχουν αναφερθεί στο λαβράκι και στην τσιπούρα, σε σπάνια και µε χαµηλά ποσοστά εµφάνισης (Divanach et al. 1996). iii. Στην περίπτωση των λεπιών έχουν παρατηρηθεί, ειδικά στους κυπρίνους, απουσία ή απώλειά τους. Μπορεί να αποκλίνουν από το κανονικό µέγεθος ή να έχουν διαφορετικό προσανατολισµό. Στο λαβράκι και την τσιπούρα συνδυάζεται µε εσωτερικές δυσπλασίες των σπονδύλων (Divanach et al. 1996). iv. Στους τελεόστεους ιχθύες η νηκτική κύστη αποτελεί όργανο της υδροστατικής ρύθµισης (Chatain 1989), αντίληψης και παραγωγής ήχων καθώς και της αναπνοής. Η σοβαρότερη κατάσταση στην περίπτωση της είναι αυτή της µη αρχικής πλήρωσής της µε αέρα, η οποία και την καθιστά µη λειτουργική. Η µη λειτουργική νηκτική κύστη 9

προκαλεί προ-αιµατική λόρδωση (Chatain 1989, 1994), µείωση του ρυθµού αύξησης και επιβίωσης, καθώς και αντίστασης στη φυσιολογική καταπόνηση (Chatain 1989). Η ανωµαλία αυτή απασχόλησε τη θαλάσσια Μεσογειακή υδατοκαλλιέργεια έντονα κατά τις δεκαετίες του 1970 και 1980, πλήττοντας µέχρι και το 90% των νυµφών τσιπούρας και λαβρακιού (Chatain 1989, Divanach et al. 1996). v. Οι σκελετικές παραµορφώσεις είναι ο συχνότερος τύπος µορφο-ανατοµικών ανωµαλιών που παρατηρούνται στα εκτρεφόµενα είδη ιχθύων, αποτελώντας έτσι αντικείµενο εντατικής έρευνας ως προς τη διερεύνηση των γενεσιουργών παραγόντων και κατ επέκταση του περιορισµού τους. Αφορούν όλες τις ανατοµικές περιοχές, από το κεφάλι µέχρι τη σπονδυλική στήλη και τα πτερύγια. Περιλαµβάνουν πολλαπλασιασµό ή απουσία σκελετικών στοιχείων καθώς και αλλαγές στη θέση ή τον προσανατολισµό ή/ και το σχήµα των οστών. Ως εκ τούτου επιδρούν άµεσα στη µορφολογία της περιοχής όπου αναπτύσσονται ή και ολόκληρου του σώµατος του ιχθύος. Κρανιακές παραµορφώσεις Οι παραµορφώσεις του κρανίου εντοπίζονται κύρια στο βραγχιακό επικάλυµµα, στις γνάθους και στο υοειδές τόξο. Κάθε κατηγορία εµφανίζει ποικίλο βαθµό έντασης και µορφολογίας. Οι παραµορφώσεις του βραγχιακού επικαλύµµατος είναι οι συχνότερα παρατηρούµενες, ειδικά στην τσιπούρα, και µπορούν επηρεάσουν έως και το 80% του πληθυσµού (Andrades et al. 1996). Σε χαµηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου τα προβληµατικά άτοµα παρουσιάζουν ευαισθησία και υψηλή θνησιµότητα (Barahona- Fernandes 1982). Όπως περιγράφτηκε στην τσιπούρα από τους (Koumoundouros et al. 1997b), τέσσερις τύποι οστών του σπλαγχνοκράνιου εµπλέκονται σε αυτήν την οµάδα παραµορφώσεων: οι βραγχιοστεγείς ακτίνες, το καλυπτρικό οστό, το υποκαλυπτρικό και το προκαλυπτρικό οστό. Τα οστά είτε είναι αναδιπλωµένα είτε γυρίζουν προς το εσωτερικό ή εξωτερικό του σώµατος, παρουσιάζουν κανονικό ή µικρότερο µέγεθος και συχνά συντήξεις. Η γενική όψη είναι του αναδιπλωµένου προς το εσωτερικό βραγχιακού επικαλύµµατος αφήνοντας εκτεθειµένα τα βράγχια (Koumoundouros et al. 1997b). Οι παραµορφώσεις των γνάθων περιλαµβάνουν τις καταστάσεις pugheadeness, κοντή κάτω γνάθος και "διασταυρώµενο δάγκωµα" (cross-bite). Η παραµόρφωση που χαρακτηρίζεται ως pugheadeness επηρεάζει το κρανίο, τις 10

γνάθους και τους οφθαλµούς καταλήγοντας σε µείωση του µεγέθους του εµπρόσθιου µέρους του κρανίου και των οστών της άνω γνάθου. Πρόκειται δηλαδή για µία συµπίεση του κρανίου και της άνω γνάθου κατά τον προσθοπίσθιο άξονα του σώµατος (Divanach et al. 1996). Το σύνδροµο του "διασταυρώµενου δαγκώµατος" αφορά στην κάτω γνάθο, η οποία αποκλίνει πλευρικά από το επίπεδο αµφίπλευρης συµµετρίας (Divanach et al. 1996). Η εξωτερική µορφολογία των ατόµων µε κοντή κάτω γνάθο παρουσιάζει την εικόνα ατόµου που πάσχει από το σύνδροµο του "διασταυρώµενου δαγκώµατος" (cross-bite) (Divanach et al. 1996), αλλά οφείλεται στο µικρότερο µέγεθος του οδοντικού και γωνιακού οστού της κάτω γνάθου (Fraser & de Nys, 2005). Τέλος, οι παραµορφώσεις του υοειδούς τόξου αφορούν στην κοιλιακή προβολή του υποϋοειδούς και γλωσσοϋοειδούς οστού του υοβραγχιακού σκελετού (Divanach et al. 1996, Cobcroft et al. 2001). εδοµένου του καθοριστικού ρόλου που έχει το κρανίο στην πρόσληψη της τροφής και στην αναπνοή των ιχθύων γίνεται φανερό πως οι παραµορφώσεις που αναπτύσσονται σε αυτό επηρεάζουν την αύξηση, την επιβίωση καθώς και την ευαισθησία αυτών σε ασθένειες (Divanach et al. 1996, Koumoundouros et al. 1997b). Σπονδυλική στήλη Οι κυριότερες παραµορφώσεις που αναπτύσσονται στην σπονδυλική στήλη διακρίνονται στη λόρδωση, κύφωση και σκολίωση. Είναι πολύ συχνές στο λαβράκι και την τσιπούρα. Παρουσιάζονται είτε µεµονωµένα είτε σε συνδυασµό και εµφανίζουν διαφορετικό βαθµό έντασης (Barahona-Fernandes et al. 1982, Boglione et al. 1995, Andrades et al. 1996, Divanach et al. 1997, Koumoundouros et al. 2002b). Επίσης, έχουν παρατηρηθεί παραµορφώσεις µεµονωµένων σκελετικών στοιχείων της σπονδυλικής στήλης (Boglione et al. 1995, Divanach et al. 1997, Fraser et al. 2004) ανεξάρτητα από την ταυτόχρονη παρουσία κάποιας εκ των τριών προαναφερθέντων. Η λόρδωση (L) αναπτύσσεται τόσο στην προ-αιµατική περιοχή όσο και στην αιµατική περιοχή της σπονδυλικής στήλης επαγοµένη από διαφορετικούς παράγοντες (Chatain 1989, 1994, Andrades et al. 1996, Divanach et al. 1997, Sfakianakis et al. 2006a). Τα λορδωτικά άτοµα παρουσιάζουν νωτοκοιλιακή κάµψη της σπονδυλικής στήλης σχήµατος V (Barahona-Fernandes et al. 1982, Andrades et al. 1996). Στην προ-αιµατική λόρδωση συνήθως εµπλέκονται 2-3 σπόνδυλοι στο σηµείο της φυσικής κάµψης της σπονδυλικής στήλης (Chatain 1989). Πρωτοπαρατηρείται σε νύµφες 11

λαβρακιού και τσιπούρας µήκους 20 mm. Σε αυτό το σωµατικό µέγεθος η γωνία της λόρδωσης είναι µικρή αλλά θα αυξηθεί καθώς αναπτύσσεται το άτοµο (Chatain 1989). Οι σπόνδυλοι που συµµετέχουν στο σχηµατισµό της λόρδωσης έχουν τραπεζοειδές σχήµα έναντι του φυσιολογικού τετραγωνισµένου και παρουσιάζουν υπερβολική εναπόθεση αλάτων από τους κανονικούς. Οι αλλαγές αυτές χαρακτηρίζονται ως απόκριση στο αυξηµένο µηχανικό φορτίο που δέχονται. Η λόρδωση θα µπορούσε να περιγραφεί ως ο συνδυασµός µία γενικής παραµόρφωσης της σπονδυλική στήλης µε τον επανασχεδιασµό των σπονδύλων (Kranenbarg et al. 2005). Όσον αφορά την κύφωση (Κ) η σπονδυλική στήλη των προβληµατικών ατόµων εµφανίζει νωτοκοιλιακή κάµψη σχήµατος Λ. Παρατηρείται στην τόσο στην προ-αιµατική (Boglione et al. 1995, Koumoundouros et al. 2002b), ραχιαία της νηκτικής κύστης και συχνά στους σπονδύλους 5 και 6 (Koumoundouros et al. 2002b), όσο και στην αιµατική περιοχή. Οι Koumoundouros et al. (2002b) αναφέρουν πως τα κυφωτικά άτοµα συµπεριφέρονται ληθαργικά και πως τα ποσοστά εµφάνισης της παραµόρφωσης σε άτοµα µεγαλύτερα των 17 mm TL µειώνονται δραµατικά λόγω της υψηλής θνησιµότητάς τους. Παράλληλα συσχέτισαν την εµφάνιση της κύφωσης µε την παρουσία παραµορφώσεων στις βραγχιοστεγείς ακτίνες. Η σκολίωση (S) αναφέρεται στην πλευρική κάµψη της σπονδυλικής στήλης. Θεωρείται σπάνια παραµόρφωση για εκτρεφόµενους πληθυσµούς. Στην τσιπούρα, η εµφάνιση σκολίωσης έχει αναφερθεί µόνο σε συνδυασµό µε λόρδωση και κύφωση (σύνδροµο LKS, Afonso et al. 2000). Oι παραµορφώσεις σκελετικών στοιχείων της σπονδυλικής στήλης αναφέρονται σε α) σύντηξη, µικρότερο µέγεθος, παραµόρφωση ή απουσία των κέντρων, β) συµπίεση, παραµόρφωση, σπάσιµο, απουσία ή σχηµατισµό επιπλέον αιµατικών και νευρικών αποφύσεων και τόξων, και γ) βράχυνση, παραµόρφωση, απουσία ή διαχωρισµό των πλευρών (Boglione et al. 1995, Divanach et al. 1996, Fraser et al. 2004). Η σοβαρότερη περίπτωση της συγκεκριµένης οµάδας παραµορφώσεων είναι η εκτεταµένη σύντηξη σπονδύλων η οποία επιδρά σηµαντικά στο σχήµα του σώµατος των ατόµων (Divanach et al. 1996). 12

Πτερύγια Η µη φυσιολογική ανάπτυξη του ουραίου πτερυγίου µελετήθηκε από τους Koumoundouros et al. (1997a) στην τσιπούρα. Περιγράφτηκαν δύο περιπτώσεις παραµορφωµένου ουραίου πτερυγίου, του διπλού πτερυγίου και του πτερυγίου µε πλάγια κάµψη. Το διπλό πτερύγιο χαρακτηρίζεται από το σχηµατισµό επιπλέον ραχιαίων κύριων ακτινών που αρθρώνονται σε επιπλέον µικρά και επίπεδα επουραία οστά. Τα παραπάνω επουραία οστά εδράζονται µεταξύ του τελευταίου υπουραίου ή της νωτοχορδής και του τελευταίου κανονικού επουραίου οστού. Το δεύτερο ουραίο πτερύγιο αναπτύσσεται ραχιαία του κανονικού. Η πλάγια κάµψη του ουραίου πτερυγίου οφείλεται στην παραµόρφωση και σύντηξη των υπουραίων οστών. Αξιοσηµείωτο είναι ότι και οι δυο τύποι δυσπλασιών συνοδεύονταν από εκτεταµένες παραµορφώσεις όλων των εσωτερικών στηρικτικών στοιχείων του ουραίου πτερυγίου. Ο όρος «σύνδροµο saddleback» χρησιµοποιείται για να περιγράψει την έλλειψη ενός τµήµατος ή και ολόκληρου του ραχιαίου πτερυγίου. Η µερική ανάπτυξη του ραχιαίου ή του εδρικού πτερυγίου αποτελεί µία από τις σοβαρότερες παραµορφώσεις των συγκεκριµένων πτερυγίων (Tave et al. 1983, Tave 1986). Έχει αναφερθεί σε είδη όπως η τσιπούρα, το λαβράκι αλλά και η συναγρίδα (Koumoundouros et al. 2001b). Στη συναγρίδα (Dentex dentex) (Koumoundouros et al. 2001b) και το λαβράκι (αδηµοσίευτα στοιχεία) η ατελής ανάπτυξη του ραχιαίου πτερυγίου ξεκινάει σε πρώιµο νυµφικό στάδιο κατά το οποίο ήδη γίνονται εµφανείς οι ανωµαλίες τόσο στο σχήµα και όσο και τον αριθµό των αντίστοιχων εγγύς πτερυγιοφόρων οστών. Στα προηγούµενα είδη ιχθύων το σύνδροµο saddleback σαφώς σχετίζεται µε σοβαρές παραµορφώσεις του ουραίου πτερυγίου (που εκφράζονται κυρίως ως έλλειψη άνω λεπιδοτριχίων και δερµατοτριχίων). Οι δύο αυτές οµάδες παραµορφώσεων οφείλονται σε ανωµαλίες της πρωτογενούς περιφερειακής πτερυγιοπτυχής και της κάµψης του οπίσθιου τµήµατος της νωτοχορδής κατά το σχηµατισµό του ουραίου πτερυγίου (flexion stage) (Koumoundouros et al. 2001b). Στο λαβράκι τα αδηµοσίευτα στοιχεία υποδεικνύουν πως το σύνδροµο saddleback εµφανίζει τα ίδια µορφο-ανατοµικά πρόδροµα στάδια. Εντούτοις, χωρίς να συνδέεται µε παραµορφώσεις της νωτοχορδής ή του ουραίου πτερυγίου. Οι Sfakianakis et al. (2003) περιέγραψαν παραµόρφωση του ραχιαίου πτερυγίου σχήµατος V στο σαργό (Diplodus sargus). Η παραµόρφωση συνέπιπτε µε προ-αιµατική κύφωση και αιµατική 13

λόρδωση χωρίς όµως ταυτόχρονη έλλειψη οποιουδήποτε σκελετικού στοιχείου του ραχιαίου πτερυγίου. Στο εδρικό πτερύγιο έχουν αναφερθεί ολική ή µερική έλλειψη σκελετικών στοιχείων. Όλες οι περιπτώσεις παραµορφώσεων των πτερυγίων συνοδεύονται από παραµορφώσεις των εσωτερικών στηρικτικών στοιχείων, όπως συντήξεις, κάµψεις, επιπλέον σχηµατισµός ή µη φυσιολογικό µέγεθος και σχήµα τους. Εντούτοις, οι δυσπλασίες των εσωτερικών στηρικτικών οστών είναι πολύ συχνές χωρίς απαραίτητα να σχετίζονται µε σοβαρές παραµορφώσεις µακροσκοπικά (Divanach et al. 1996). 14

1.3 Γενεσιουργοί παράγοντες των µορφο-ανατοµικών ανωµαλιών Οι γενεσιουργοί παράγοντες των µορφο-ανατοµικών ανωµαλιών είναι ποικίλοι. Ο εντοπισµός του δυσχεραίνεται από το γεγονός της κοινής συµπτωµατολογίας και της συνεργιστικής δράσης που έχουν στην επαγωγή των παραµορφώσεων. ιακρίνονται σε γενετικούς και επιγενετικούς. Όσοι παράγοντες είναι γενετικής προέλευσης (µεταλλάξεις, υβριδισµός) ή σχετίζονται µε τη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης προκαλώντας προβλήµατα στην οργανογένεση και κατ επέκταση προκαλούν την ανάπτυξη δυσπλασιών συγκαταλέγονται στους γενετικούς. Οι επιγενετικοί παράγοντες περιλαµβάνουν: τους αβιοτικούς, όπως η ένταση του φωτός, το ph, η συγκέντρωση O 2 και CO 2, η αλατότητα, η θερµοκρασία, η ταχύτητα των ρευµάτων στις δεξαµενές εκτροφής, τους βιοτικούς, όπου ανήκουν οι διατροφικές ανάγκες του κάθε είδους και σταδίου ανάπτυξης, η πυκνότητα των πληθυσµών, τα µηχανικά τραύµατα, οι µολύνσεις από παράσιτα, βακτήρια και ιούς, τα ορµονικά ερεθίσµατα, και τα διάφορα ξενοβιοτικά-παρασιτοκτόνα, ζιζανιοκτόνα, εντοµοκτόνα, βιοµηχανικά λύµατα και βαρέα µέταλλα. Γενικά, είναι αποδεκτό πως οι σκελετικές δυσπλασίες επάγονται περιβαλλοντικά µε την τροποποίηση των απαραίτητων -για τη διατήρηση της βιοχηµικής κατάστασης των οστών-βιολογικών διαδικασιών, ή µε νευροµυϊκές επιδράσεις οι οποίες καταλήγουν σε παραµορφώσεις χωρίς τη µεταβολή της σύστασης των οστών (Divanach et al. 1996). Η πληθώρα των γενεσιουργών αιτιών που έχει αποκαλυφθεί να καθορίζουν την ανάπτυξη των διαφορετικών σκελετικών δυσπλασιών καταδεικνύει την πολυπλοκότητα των φαινόµενων. Κρανίο Οι παραµορφώσεις του κρανίου δεν αποκλίνουν από το προαναφερθέν γεγονός. Στις δυσπλασίες του βραγχιακού επικαλύµµατος ενέχονται οι έντονες µηχανικές κινήσεις για τη σύλληψη της µεγάλου µεγέθους τροφής (ναύπλιοι Artemia sp. στο στάδιο Instar II) από τις πολύ µικρές νύµφες, ο υπερ-αερισµός (hyperventilation) για την κάλυψη των τροφικών αναγκών ή για τον καθαρισµό των βραγχίων σε συνδυασµό ή µη µε την ανεπάρκεια συγκεκριµένης βιταµίνης (βιταµίνη 15

Α και C) (Koumoundouros et al. 1997b, Villeneuve et al. 2005a) και πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (HUFA n-3) (Galeotti et al. 2000, Gapasin & Duray 2001, Villeneuve et al. 2005b). Στο είδος Chanos chanos ο εµπλουτισµός της παρεχόµενης τροφής µε τα n-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα EPA (20:5n-3) και DHA (22:6n-3) σε συνδυασµό µε βιταµίνη C µείωσε κατά 50% την ανάπτυξη παραµορφώσεων του βραγχιακού επικαλύµµατος (Gapasin et al. 1998, Gapasin & Duray 2001). Συγκεκριµένα στο λαβράκι η απουσία καθώς και η περίσσεια (250 και 1000 mg Kg -1 ξηρής τροφής) all-trans εστέρα της ρετινόλης (retinyl acetate) στην τροφή κατά την διεξαγωγή πειράµατος είχε ως αποτέλεσµα την ανώµαλη ανάπτυξη του βραγχιακού επικαλύµµατος (Villeneuve et al. 2005a). Επίσης, χαµηλά επίπεδα (0,3%) πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (DHA και EPA) στο φωσφολιπιδικό κλάσµα της παρεχόµενης τροφής επάγουν την ανάπτυξη ατόµων µε προβληµατικό βραγχιακό επικάλυµµα (Villeneuve et al. 2005b). Σε άλλα είδη όπως ο σολοµός Salmo gairdneri οι παραµορφώσεις του βραγχιακού επικαλύµµατος προκλήθηκαν από τον υπερκορεσµό σε αέρια του νερού λόγω της παρουσίας και αύξησης φυσαλίδας αέρα στην στοµατική κοιλότητα των νυµφών λίγες µέρες µετά την εκκόλαψή τους (Jensen 1988). Επιπλέον, ενδέχεται οι διακυµάνσεις των νιτρικών και νιτρωδών αλάτων, της αµµωνίας, των φωσφορικών αλάτων, του διοξειδίου του άνθρακα και του ph να ευθύνονται για την εµφάνιση των συγκεκριµένων παραµορφώσεων. εν έχουν γίνει αντίστοιχες µελέτες για τον έλεγχο αυτής της υπόθεσης (Koumoundouros et al. 1997b). Οι Galeotti et al. (2000) αναφέρουν την περίπτωση της τροποποίησης του µεταβολισµού ανθρακικών αλάτων/βιταµίνης D που οδηγεί σε αδύναµα οστά. Η ανώµαλη ή και µειωµένη εναπόθεση ανθρακικών αλάτων µπορεί να επάγει µετατροπή των οστών επιτρέποντας την αναδίπλωσή τους. Η εργασία των Georgakopoulou et al. (2007a) έδειξε πως η θερµοκρασία του νερού (15 ºC) κατά το εµβρυικό και νυµφικό στάδιο έχει σαφή επίδραση στην ανάπτυξη παραµορφώσεων των βραγχιοστεγών ακτινών. Η θερµοκρασία ίσως επιδρά έµµεσα µε το να τροποποιούνται οι διατροφικές προτιµήσεις των αναπτυσσόµενων ατόµων ανάλογα την εφαρµοζόµενη θερµοκρασία. Επίσης, ανεπάρκεια βιταµίνης C και λιπαρών οξέων ενδέχεται να εµπλέκονται στις παραµορφώσεις των βραγχιοστεγών ακτινών (Koumoundouros et al. 1997b). Όσον αφορά τις παραµορφώσεις των σιαγώνων αναφέρονται φυσικές παράµετροι όπως η ακατάλληλη θερµοκρασία εναπόθεσης των αβγών και των 16

νυµφών στο λεκιθοφόρο στάδιο, η αλατότητα, η ένταση του φωτός καθώς και η εισβολή παθογόνων βακτηρίων από τραυµατισµένες µεµβράνες της στοµατικής κοιλότητας. Οι εντατικές συνθήκες εκτροφής και πιθανοί ρυπαντές ενδέχεται να τροποποιούν τη γονιδιακή έκφραση οδηγώντας στις παραµορφώσεις των σιαγώνων προτείνουν οι Koumoundouros et al. (1997a). Σηµαντικό ρόλο στις παραµορφώσεις των σιαγώνων κατέχει η διατροφή. Ειδικά για την ανάπτυξη της παραµόρφωσης τύπου pugheadness χαµηλές συγκεντρώσεις πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (EPA, DHA) στην παρεχόµενη τροφή (Cobcroft et al. 2001, Villeneuve et al. 2005b), η ανεπάρκεια φωσφολιπιδίων, βιταµίνης C, η απουσία ή η υπερβολική συγκέντρωση βιταµίνης Α (Villeneuve et al. 2005a) και των παραγώγων της έχουν διαπιστωθεί πως προκαλούν δυσπλασίες στις νύµφες διαφόρων ειδών. Ειδικά στο λαβράκι η απουσία καθώς και η περίσσεια συγκέντρωσης (250 και 1000 mg Kg -1 ξηρής τροφής) all-trans εστέρα της ρετινόλης (retinyl acetate) στην τροφή κατά την διεξαγωγή πειράµατος είχε ως αποτέλεσµα την ανώµαλη ανάπτυξη των προ-γναθικών, γναθικών και οδοντικών οστών καταλήγοντας σε παραµορφώσεις των γνάθων (Villeneuve et al. 2005a). Επιπλέον, η έλλειψη ή η περίσσεια των n-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (EPA, DHA) στο φωσφολιπιδικό κλάσµα της παρεχόµενης τροφής, στη διάρκεια του νυµφικού σταδίου, συµπεριλαµβάνεται στους γενεσιουργούς παράγοντες της παραµόρφωσης της άνω γνάθου pugheadness (Villeneuve et al. 2005b, 2006). Σπονδυλική στήλη Τα αίτια ανάπτυξης των διαφόρων σκελετικών δυσπλασιών έχουν απασχολήσει τους ερευνητές εδώ και πάρα πολλά χρόνια. Λόρδωση Ειδικά η περίπτωση της λόρδωσης έχει µελετηθεί διεξοδικά παρέχοντας επαρκείς πληροφορίες που οδήγησαν στον περιορισµό της εµφάνισής της. ιακρίνεται σε προ-αιµατική και αιµατική λόρδωση. Ένας από τους παράγοντες της προ-αιµατικής λόρδωσης είναι η µη λειτουργική νηκτική κύστη εξαιτίας της µη πλήρωσής της µε αέρα. Οι νύµφες λαβρακιού ηλικίας 7 ηµερών (5 mm) και τσιπούρας 5 ηµερών (4 mm) πρέπει προσλάβουν µία φυσαλίδα αέρα για να εξελιχθεί φυσιολογικά το φαινόµενο. Σε περίπτωση αποτυχίας λόγω της δηµιουργίας 17

ελαιώδους στρώµατος στην επιφάνεια των δεξαµενών από τα προϊόντα του µεταβολισµού της τροφής οπότε είναι αδύνατη η πρόσληψη της φυσαλίδας αέρα, η νηκτική κύστη καθίσταται µη λειτουργική. Τα άτοµα µε µη λειτουργική νηκτική κύστη αναγκάζονται να κινούνται συνεχώς και σε πρόσθιο-κατακόρυφο προσανατολισµό, προκειµένου να αποφύγουν τη βύθιση µε αποτέλεσµα να αναπτύσσεται η λόρδωση στη προ-αιµατική περιοχή της σπονδυλικής στήλης (Chatain 1989, 1994). Παράγοντες που συµβάλουν στη µη πλήρωση της νηκτικής κύστης και εποµένως έµµεσα στην ανάπτυξη λορδωτικών ατόµων είναι η αλατότητα (Battaglene & Talbot 1993), η ένταση του φωτός και η φωτοπερίοδος (Battaglene et al. 1994), τα ρεύµατα στις δεξαµενές (Battaglene & Talbot 1993), η θερµοκρασία (Hadley et al. 1987) καθώς και η ευρωστία των νυµφών. Σε µεµονωµένες περιπτώσεις έχει προκληθεί λόρδωση από µηχανικό τραύµα ή εξαιτίας δαγκώµατος. Επίσης, η περίπτωση γενετικής προέλευσης δεν αποκλείεται, χωρίς εντούτοις να υπάρχουν πειραµατικά δεδοµένα που να το επιβεβαιώνουν (Chatain 1994). Οι συνθήκες εκτροφής και ειδικά η διατροφή ενοχοποιούνται για την ανάπτυξη λόρδωσης. Επί παραδείγµατι, η ανεπάρκεια ή η απουσία της βιταµίνης C από την παρεχόµενη τροφή διαταράσσει το µεταβολισµό του κολλαγόνου στα οστά προκαλώντας σοβαρές περιπτώσεις τόσο λόρδωσης όσο και σκολίωσης (Dabrowski et al. 1990). Η συσχέτιση αυτή έχει αποδειχτεί για το λαβράκι. Η διαταραχή στο µεταβολισµό του κολλαγόνου προκαλείται από τη χρήση συγκεκριµένων εντοµοκτόνων τα οποία πυροδοτούν έντονες µυικές συσπάσεις καταλήγοντας σε σκελετικές παραµορφώσεις. Στην πέστροφα (Oncorhynchus mykiss) παρατηρήθηκαν παρόµοια αποτελέσµατα λόγω περίσσειας της βιταµίνης D που διατάραξε το ισοζύγιο των ανθρακικών και φωσφορικών αλάτων (Poston 1969). Σε άλλα είδη, ανάλογα φαινόµενα παρατηρούνται εξαιτίας ανεπάρκειας φωσφολιπιδίων ή του αµινοξέος τρυπτοφάνη (Akiyama et al. 1989, Kanazawa et al. 1981). Η αιµατική λόρδωση παρατηρείται σε άτοµα µε λειτουργική νηκτική κύστη όταν υποβάλλονται σε ισχυρά ρεύµατα νερού (ταχύτητα µεγαλύτερη από 10cm ανά s) στις δεξαµενές εκτροφής (Divanach et al. 1997). Κοινή αιτία µε την προ-αιµατική λόρδωση θεωρείται η έντονη µυïκή δραστηριότητα του οπίσθιου τµήµατος του σώµατος στην πρώτη ως απόκριση στη βύθιση ενώ στη δεύτερη περίπτωση λόγω ρεοτακτισµού (Divanach et al. 1997). Η θερµοκρασία του νερού κατά την ανάπτυξη των νυµφών έχει σαφή επίδραση στην δηµιουργία και το βαθµό έντασης της αιµατικής λόρδωσης όπως 18

έδειξαν οι Sfakianakis et al. (2006). Αυτό εξηγείται ως αποτέλεσµα της οντογενετικής πλαστικότητας µυών και οστών που επάγεται από τη θερµοκρασία και έχει αποδειχθεί σε πολλά είδη ιχθύων όπως το λαβράκι (Koumoundouros et al. 2001c). Η διατροφή και συγκεκριµένα η ανεπάρκεια βιταµίνης Ε και σεληνίου Se λόγω της επαγωγής µυοπαθειών θα µπορούσαν να αποτελέσουν γενεσιουργούς παράγοντες της αιµατικής λόρδωσης (Lopez-Albors et al. 1995). Οι Andrades et al. (1996) αναφέρει ως πιθανές αιτίες της λόρδωσης γενετικούς παράγοντες, τη σύσταση της λεκίθου, περιβαλλοντικές παραµέτρους όπως θερµοκρασία, φως, ρυπαντές, µολύνσεις, µηχανικό σοκ που θα µπορούσαν να επηρεάσουν είτε του γεννήτορες είτε τα έµβρυα. Κύφωση Η ανάπτυξη της κύφωσης συνδέεται µε παρασιτισµό από µυξοσπορίδια, διάφορους ρυπαντές αλλά και άγνωστους µέχρις ώρας παράγοντες (Boglione et al. 1995, Divanach et al. 1996). Ενώ η πιθανότητα εµπλοκής γενετικών παραγόντων δεν αποκλείεται (Koumoundouros et al. 2002b). Σκολίωση Η σκολίωση θεωρείται ως µία σπάνια παραµόρφωση στις Μεσογειακές θαλάσσιες υδατοκαλλιέργειες. Σε πείραµα διαφορετικών επιπέδων all-trans εστέρα της ρετινόλης (retinyl acetate) στη χορηγούµενη τροφή βρέθηκαν άτοµα µε σκολίωση. Η συγκεκριµένη παρατήρηση χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση κατά τους ερευνητές (Villeneuve et al. 2005a) γιατί δεν βρέθηκε στατιστικά σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των διατροφικών επιπέδων και της εµφάνισης της συγκεκριµένης παραµόρφωσης. Εντούτοις, υψηλά (2,3-4,8%) ή πολύ χαµηλά επίπεδα (0,3%) πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (DHA, EPA) στο φωσφολιπιδικό κλάσµα της παρεχόµενης τροφής επάγουν την ανάπτυξη ατόµων µε σκολίωση (Villeneuve et al. 2006). Η ανεπάρκεια της βιταµίνης C ευνοεί την ανάπτυξη σκολίωσης (Dabrowski et al. 1990) Στις σαλµονίδες πείραµα έδειξε πως η ανεπάρκεια του αµινοξέος τρυπτοφάνη προκαλεί την ανάπτυξη σκολίωσης όπως και στην πέστροφα (Akiyama et al. 1989, Cahu et al. 2003a). 19

Ο συνδυασµός και των τριών παραµορφώσεων λόρδωσης, σκολίωσης και κύφωσης (σύνδροµο LSK) όπως παρατηρήθηκε σε εκτρεφόµενους πληθυσµούς τσιπούρας φαίνεται να συνδέεται µε γενετικούς παράγοντες (Afonso et al. 2000). 20

Πτερύγια Υπάρχουν δύο υποθέσεις για την δηµιουργία δυσπλασιών του ουραίου πτερυγίου στην τσιπούρα που αναπτύχθηκαν από τους Koumoundouros et al. (2001a). Η πρώτη αναφέρεται στις συνθήκες εκτροφής και σε πιθανούς ρυπαντές στο νερό ή σε τροποποιηµένα συστατικά της τροφής που ενδέχεται να µεταβάλουν την έκφραση οµοιοτικών γονιδίων της ουράς. Η δεύτερη υπόθεση σχετίζεται µε το γεγονός πως η εκτατική µέθοδος θα µπορούσε να ασκεί µεγαλύτερη επιλεκτική πίεση, από ότι η εντατική, σε παραµορφώσεις ανατοµικών στοιχείων σηµαντικών για κρίσιµες λειτουργίες, όπως η κολύµβηση. Πρόσφατα οι Sfakianakis et al. (2004) κατέδειξαν την επίδραση της θερµοκρασίας στην ανάπτυξη παραµορφώσεων στα στηρικτικά στοιχεία του ουραίου πτερυγίου που αφορούσαν στις αιµατικές και νευρικές αποφύσεις των δύο προουραίων σπονδύλων στο είδος Pagellus erythrinus. Ως γενεσιουργούς παράγοντες του συνδρόµου saddleback που αναπτύσσεται στο ραχιαίο πτερύγιο οι Sfakianakis et al. (2003) προτείνουν την ανεπάρκεια βιταµινών C, Ε και του σεληνίου (Se). 21

1.4. Βιταµίνη Α και σκελετικές δυσπλασίες ΕΙΚΟΝΑ 1.2. Μεταβολίτες βιταµίνης Α: ρετινόλη (Α), all-trans ρετινοϊκό οξύ (Β) και 9-cis ρετινοϊκό οξύ (Γ) (www.wikipedia.com) Μελέτες έχουν δείξει τη στενή σχέση µεταξύ της διατροφής των αρχικών αναπτυξιακών σταδίων και σκελετικών ανωµαλιών (Zambonino Infante et al. 1997, Zambonino Infante & Cahu 1999). Αναφορικά µε τη βιταµίνη Α, η συµµετοχή της στην ανάπτυξη παραµορφώσεων στα ψάρια έχει αποδειχθεί για τις δυσπλασίες που αφορούν το βραγχιακό επικάλυµµα και τις βραγχιοστεγείς ακτίνες, τις σιαγώνες (Koumoundouros et al. 1997b, Villeneuve et al. 2005a). Συγκεκριµένα στο λαβράκι αποδείχθηκε ότι η περίσσεια βιταµίνης Α (250 και 1000 mg Kg -1 ξηρής τροφής) (all-trans εστέρα της ρετινόλης) στην τροφή είχε ως αποτέλεσµα την ανώµαλη ανάπτυξη του βραγχιακού επικαλύµµατος και των σιαγώνων (pugheadness) (Villeneuve et al. 2005a). Άγνωστα ωστόσο παραµένουν τα ασφαλή όρια της βιταµίνης Α για την αποφυγή των δυσπλασιών σε αυτό το είδος. Τα ρετινοειδή είναι µεταβολίτες της βιταµίνης Α και ρυθµίζουν βιολογικές λειτουργίες όπως την κυτταρική διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασµό και τη µορφογένεση (Ross et al. 2000, Haga et al. 2002). Η βιολογική δράση της βιταµίνης Α επιτυγχάνεται κυρίως από το ενεργό µόριο του ρετινοϊκού οξέος. Υπάρχουν δύο ενεργές µορφές του, το 9-cis και το all-trans ρετινοϊκό οξύ (Εικόνα 1.2) που προκύπτει από την αφυδρογόνωση της βιταµίνης Α. Έρευνες έχουν καταδείξει ότι η 22

απουσία ή η περίσσεια βιταµίνης Α ευθύνεται για περιπτώσεις τερατογένεσης σε θηλαστικά, αµφίβια, πτηνά και ιχθείς µέσω της µη φυσιολογικής έκφρασης µορφογενετικών γονιδίων (Ross et al. 2000, Haga et al. 2002, Villeneuve et al. 2005a,b). Η βιολογική δράση των ρετινοειδών πραγµατοποιείται µέσω της ενεργοποίησης των πυρηνικών υποδοχέων του ρετινοϊκού οξέος (RAR) και των ρετινοειδών (RXR). Οι δύο οµάδες υποδοχέων διακρίνονται σε τρεις υπο-οικογένειες (α, β, γ) (Ross et al. 2000). Οι υποδοχείς RXR προσδένουν 9-cis ρετινοϊκό οξύ ενώ οι υποδοχείς RAR και τις δύο µορφές του ρετινοϊκού οξέος (Ross et al. 2000). Οι υποδοχείς RAR και RXR διµερίζονται µεταξύ τους. Ειδικά η οµάδα RXR ετεροδιµερίζεται µε άλλους πυρηνικούς υποδοχείς (Yu et al. 1991). Τα ετεροδιµερή προσδένονται µε τα στοιχεία απόκρισης (response elements) των λιπαρών οξέων, της βιταµίνης D και των θυρεοειδικών ορµονών ή µε τα ειδικά του ρετινοϊκού οξέος που εδράζονται σε συγκεκριµένα γονίδια στόχους και ως εκ τούτου ενισχύουν ή καταστέλλουν άµεσα ή έµµεσα τη µεταγραφή περισσότερων από 500 γονιδίων (Balmer & Blomhoff 2002). Το ρετινοϊκό οξύ συµµετέχει στην έναρξη της έκφρασης της οικογένειας γονιδίων Hox και shh (sonic hedgehog) οι οποίες σχετίζονται µε την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των ιστών (Haga et al. 2002). Ο σχεδιασµός του σωµατικού προτύπου, η ανάπτυξη των οστών και η µορφογένεση των άκρων ρυθµίζονται επιπλέον από άλλες οικογένειες γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες BMP (bone morphogenetic protein) και τους αυξητικούς παράγοντες IGF (insulin-like growth factor). Συγκεκριµένα οι BMP ρυθµίζουν την ανάπτυξη των σπονδυλωτών µέσω του ρόλου που έχουν στον πολλαπλασιασµό, τη διαφοροποίηση, τη µορφογένεση και την απόπτωση των οστεοκυττάρων. Από την άλλη, ο IGF-1 αποτελεί µιτωγόνο παράγοντα που δρα και ως παράγοντας διαφοροποίησης στα οστά, τους χόνδρους και τους µυς. Τόσο η έλλειψη όσο και η υπερβολική συγκέντρωση βιταµίνης Α διαταράσσουν το µονοπάτι των ρετινοειδών συµπεριλαµβανοµένων των παραπάνων οικογενειών γονιδίων προκαλώντας ανώµαλη ανάπτυξη της καρδιάς, των οστών, του κεντρικού νευρικού συστήµατος και του καθορισµού του προσθιοπίσθιου άξονα των εµβρύων των σπονδυλωτών (Ross et al. 2000, Suzuki et al. 2000, Haga et al. 2002, 2003). Τα µονοπάτια που προαναφέρονται έχουν περιγραφεί κυρίως στα ανώτερα σπονδυλωτά. Εντούτοις, τα τελευταία χρόνια πολλές µελέτες κατέδειξαν το ρόλο της 23

βιταµίνης Α στην επαγωγή σκελετικών παραµορφώσεων και στους θαλάσσιους ιχθείς (Haga et al. 2002, 2003, Villeneuve et al. 2005a, 2006). 1.5 Στοιχεία βιολογίας του λαβρακιού ( Dicentrarchus labrax) Φύλο: Υποφύλο: Οµοταξία: Υφοµοταξία: Τάξη: Υπόταξη: Οικογένεια: Είδος: Χορδωτά Σπονδυλωτά Ακτινοπτερύγιοι Τελεόστεοι Περκόµορφα Περκοειδή Moronidae Dicentrarchus labrax Το λαβράκι, Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758), αποτελεί ένα από τα κυρίαρχα είδη της Μεσογειακής θαλάσσιας υδατοκαλλιέργειας. Είναι ακτινοπτερύγιος ιχθύς της οικογένειας των Moronidae (Κασπίρης 2000), µε γεωγραφική κατανοµή στις ανατολικές περιοχές του Ατλαντικού Ωκεανού (από τη Νορβηγία µέχρι το Μαρόκο, τα Κανάρια νησιά και τη Σενεγάλη), τη Μεσόγειο και τη Μαύρη θάλασσα (Εικόνα 1.3). ΕΙΚΟΝΑ 1.3. Γεωγραφική κατανοµή του λαβρακιού (www.fishbase.com) 24

Πρόκειται για βενθοπελαγικό είδος που απαντάται στην παράκτια ζώνη καθώς και σε εκβολές ποταµών και λιµνοθάλασσες. Στο φυσικό περιβάλλον τα ιχθύδια µεταναστεύουν σε λιµνοθάλασσες και µικρούς κόλπους το χειµώνα, ενώ στο τέλος της άνοιξης επιστρέφουν στη θάλασσα (www.fishbase.com). Το λαβράκι έχει επίµηκες σχήµα σώµατος, µε D9-11,XI-XII τύπο ραχιαίου και Α3,Χ-ΧΙΙ τύπο εδρικού πτερυγίου, µικρά λέπια, ελαφρώς διχαλωτό ουραίο πτερύγιο και ασηµί-γκρι χρώµα. Η πλευρική γραµµή είναι ευδιάκριτη και σκουρόχρωµη µε 62-80 κυκλοειδή λέπια (Moretti et al. 1999). Το µέγιστο βάρος και ολικό µήκος που έχει αναφερθεί είναι 12 Κg και 103 cm αντίστοιχα (www.fishbase.com). Το λαβράκι είναι γονοχωριστικό είδος µε εξωτερική γονιµοποίηση και ισχυρό θερµοεξαρτώµενο φυλοκαθορισµό (Koumoundouros et al. 2002a). Στους φυσικούς πληθυσµούς της λεκάνης της Μεσογείου η αναπαραγωγική ωρίµανση λαµβάνει χώρα τους µήνες Σεπτέµβριο-Μάρτιο όταν η θερµοκρασία κυµαίνεται µεταξύ 11-15 ºC (Mananos et al. 1997). Εντούτοις, η εµβρυική ανάπτυξη µπορεί να πραγµατωθεί σε µεγαλύτερο θερµοκρασιακό εύρος (8-20 ºC) (Jennings & Pawson, 1992). Είναι είδος ευρύθερµο και ευρύαλο (Moretti et al. 1999). Οι διατροφικές συνήθειες του είδους περιλαµβάνουν µικρά ψάρια, κεφαλόποδα και καρκινοειδή. Πρόκειται για ενεργό θηρευτή και αποτελεί ένα από τα σηµαντικότερα είδη της θαλάσσιας µεσογειακής καλλιέργειας (Moretti et al. 1999, Κουµουνδούρος 2006, www.fishbase.com). ΕΙΚΟΝΑ 5. Παραγωγή από ιχθυοκαλλιέργεια σε χιλιάδες τόνους του λαβρακιού το χρονικό διάστηµα 1980-2000 στην Ελλάδα (www.fao.org). 25

1.6 Στόχοι παρούσας µελέτης Από τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό ότι αν και ο ρόλος της διατροφής στην ανάπτυξη των µορφο-ανατοµικών ανωµαλιών στους εκτρεφόµενους πληθυσµούς ψαριών είναι ιδιαίτερα σηµαντικός, οι σχετικές ερευνητικές εργασίες είναι περιορισµένες. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η µελέτη της επίδρασης των διατροφικών επιπέδων βιταµίνης Α στην ανάπτυξη σκελετικών δυσπλασιών στο λαβράκι. Παράλληλα διερευνάται η επίδραση της βιταµίνης Α στους µεριστικούς χαρακτήρες. εδοµένου ότι τόσο οι µεριστικοί χαρακτήρες, όσο και οι σκελετικές δυσπλασίες αναπτύσσονται κατά τα πρώιµα στάδια ανάπτυξης, η εφαρµογή των διαφορετικών συνθηκών έλαβε χώρα στο διάστηµα των πρώτων 45 ηµερών ανάπτυξης (σε θερµοκρασία 20 ο C), ενώ ακολούθως όλοι οι πληθυσµοί υποβλήθηκαν σε κοινές διατροφικές συνθήκες. 26

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 27

2.1 Εκτροφή νυµφών και ιχθυδίων λαβρακιού Εφαρµόσθηκαν 7 διαφορετικά διατροφικά επίπεδα ρετινόλης (0,3 µg ρετινόλης ισοδυναµούν µε 1 ΙU βιταµίνης Α, www.wikipedia.org) σε 21 νυµφικούς πληθυσµούς λαβρακιού (3 επαναλήψεις ανά διατροφική οµάδα). Οι επτά διαφορετικές συγκεντρώσεις της ρετινόλης που µελετήθηκαν ήταν 0, 5, 10, 15, 25, 35 και 70 mg/kg ξηράς τροφής. Η σύσταση της τροφής ως προς τα υπόλοιπα θρεπτικά από δίνεται από Mazurais et al. (2007 υπό δηµοσίευση). Το µέγεθος των κόκκων της τροφής ήταν 200-400 µm. Η εκτροφή των νυµφών και των ιχθυδίων έγινε στις εγκαταστάσεις του ινστιτούτου Ifremer-Brest (Institut Français de Recherche pour l'exploitation de la Mer) της Γαλλίας. Νύµφες λαβρακιού ηλικίας 3 ηµερών µετά την εκκόλαψη ελήφθησαν από τις εγκαταστάσεις του Ecloserie Marine de Gravelines (Gravelines, Γαλλία). Οι νύµφες εγκλιµατίστηκαν και διαχωρίστηκαν σε 21 κυλινδροκωνικές δεξαµενές (χωρητικότητας 35 λίτρων, κατασκευασµένες από fiberglass), µε αρχική πυκνότητα 60 άτοµα ανά λίτρο. Η παροχή του θαλασσινού νερού γινόταν µε σύστηµα συνεχούς ροής (flowing-through), το οποίο είχε προηγουµένως διέλθει από φίλτρο άµµου και κολώνα αποκορεσµού του νερού από τα αέρια. Η αλατότητα του νερού ήταν 35, ενώ η συγκέντρωσή του σε οξυγόνο >6 mg/l και η ανανέωση του νερού 30% του όγκου της δεξαµενής ανά ώρα (ταχύτητα ροής: 0.18L/min). Η θερµοκρασία του νερού ήταν 20 ο C, η φωτοπερίοδος 24/0 φως/σκοτάδι και η ένταση του φωτός στην επιφάνεια του νερού 9 W/m² (Mazurais et al. 2007 υπό δηµοσίευση). Η εφαρµογή των διαφορετικών συνθηκών έγινε από την έναρξη του νυµφικού σταδίου (6 η ηµέρα µετά την εκκόλαψη, dph, 20 o C) µέχρι την ηλικία των 45 dph. Μετά το τέλος εφαρµογής των διαφορετικών συνθηκών, οι 21 πληθυθσµοί υποβλήθηκαν σε κοινές διατροφικές συνθήκες µέχρι την ηλικία των 60 dph.. Κατά τη διάρκεια των πειραµάτων η παροχή της τροφής γινόταν όλο το 24ωρο, ώστε οι νύµφες να διευκολύνονται στην πρόσληψή της. 2.2 ειγµατοληψία Για τη µελέτη των σκελετικών δυσπλασιών και των µεριστικών χαρακτήρων, στο τέλος εφαρµογής των διαφορετικών συνθηκών (45 dph) από κάθε πληθυσµό λήφθηκε τυχαίο δείγµα 50±5 ατόµων, τα οποία αναισθητοποιήθηκαν και συντηρήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης 5%. 28

Ο έλεγχος των σκελετικών δυσπλασιών πραγµατοποιήθηκε και στην ηλικία των 60 dph, σε τυχαίο δείγµα 50±2 ιχθυδίων (35-45 mm SL), αναισθητοποιήθηκαν και συντηρήθηκαν στους -20 ο C. Ο έλεγχος του σταδίου των ιχθυδίων αποσκοπούσε κυρίως στη µελέτη της επίδρασης των πειραµατικών συνθηκών στην ανάπτυξη αιµατικής λόρδωσης. υσπλασία η οποία αν και αναπτύσσεται µετά το στάδιο της µεταµόρφωσης, επηρεάζεται σηµαντικά από τις συνθήκες διεξαγωγής του νυµφικού σταδίου (Sfakianakis et al. 2006a). Συνολικά µελετήθηκαν 1098 νύµφες και 1053 ιχθύδια. 2.3 Επεξεργασία και παρατήρηση των δειγµάτων Τα άτοµα εστάλησαν στο Εργαστήριο Ιχθυολογίας του Τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών. Εκεί πραγµατοποιήθηκε διπλή χρώση µε Κυανό της Αλσατίας (Alcian Blue) και Αλιζαρίνη (Alizarin Red S) για την εκλεκτική χρώση των χόνδρων και των οστών των νυµφών αντίστοιχα (Park and Kim 1984). Ακολούθησε ατοµική φωτογράφησή τους µε ψηφιακή φωτογραφική µηχανή Canon A95 προσαρτηµένη σε στερεοσκόπιο Zeiss. Η παρατήρηση των φωτογραφιών για τον εντοπισµό των δυσπλασιών έγινε σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. Ο προσδιορισµός κάθε δυσπλασίας έγινε βάσει της απόκλισης του υπό εξέταση τµήµατος από το φυσιολογικό σκελετικό πρότυπο. Η οστεολογική ανάλυση περιελάµβανε: την περιοχή της κεφαλής, την περιοχή του κορµού-σπονδυλική στήλη, ραχιαίο και εδρικό πτερύγιο και την περιοχή του ουραίου πτερυγίου. Η παρατήρηση της κεφαλής εκτός από πλάγια όψη έγινε και κοιλιακά για τον καλύτερο προσδιορισµό συγκεκριµένων ανατοµικών περιοχών (υοειδές τόξο). Επιπλέον, έγινε καταµέτρηση των µεριστικών χαρακτήρων για τη µελέτη της επίδρασης των διαφορετικών διατροφικών συνθηκών στην ανάπτυξή τους. Οι µεριστικοί χαρακτήρες που εξετάστηκα ν ήταν: ο αριθµός των προ-αιµατικών και αιµατικών σπονδύλων, ο αριθµός των βραγχιοστεγών ακτινών της δεξιάς και αριστερής πλευράς, ο αριθµός των προ-αιµατικών και αιµατικών σπονδύλων, ο αριθµός των ακάνθων και µαλακών ακτίνων του ραχιαίου πτερυγίου, ο αριθµός των ακάνθων και µαλακών ακτίνων του εδρικού πτερυγίου, 29

ο συνολικός αριθµός των ραχιαίων στοιχείων, ο συνολικός αριθµός των εδρικών στοιχείων, ο αριθµός των άνω και κάτω λεπιδοτριχίων του ουραίου πτερυγίου και ο αριθµός των άνω και κάτω δερµατοτριχίων του ουραίου πτερυγίου. Tο µέσο µεσουραίο µήκος (FL) των δειγµάτων µετρήθηκε στην ψηφιακή φωτογραφία κάθε ατόµου, µε τη βοήθεια του λογισµικού tpsdig (έκδοση 1.37) (Εικόνα 2.1). Εικόνα 2.1. Το µήκος ανάµεσα στα δύο σηµεία αντιστοιχεί στο µεσουραίο µήκος της νύµφης. Τα ιχθύδια ακτινογραφήθηκαν σύµφωνα µε τη µέθοδο των Koumoundouros et al. (2000b). Ακολούθησε παρατήρηση των ακτινογραφιών και εντοπισµός των σκελετικών δυσπλασιών σε κάθε άτοµο. Οι περιοχές που εξετάστηκαν αφορούσαν στην κεφαλή και στον κορµό, µε ιδιαίτερη έµφαση στην ανάπτυξη αιµατικής λόρδωσης. 2.4 Ανάλυση των δεδοµένων και στατιστική επεξεργασία Η ανάλυση των δεδοµένων έγινε µε τη βοήθεια του λογισµικού πακέτου Statistica (έκδοση 6.0). Πραγµατοποιήθηκαν τα µη παραµετρικά Kruskal-Wallis και Mann-Whitney U-test γιατί δεν πληρούνταν οι προϋποθέσεις για την εφαρµογή της ανάλυσης διακύµανσης (ANOVA) (λόγω ανοµοιογένειας διακυµάνσεων). Το G-test (Sokal and Rohlf 1981) εφαρµόστηκε για να ελεγχθεί αν οι παρατηρούµενες διαφορές των συχνοτήτων των δυσπλασιών µεταξύ των διαφορετικών πειραµατικών συνθηκών είναι στατιστικά σηµαντικές. 30

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 31

Στο τέλος εφαρµογής των διαφορετικών διατροφικών συνθηκών, τα άτοµα λαβρακιού που εξετάσθηκαν είχαν µεσουραίο µήκος 13,0-24,7 mm και είχαν σχηµατισµένα όλα τα σκελετικά στοιχεία. Η στατιστική επεξεργασία των µηκών έδειξε ότι τα διατροφικά επίπεδα ρετινόλης επηρέασαν σηµαντικά το µέγεθος των νυµφών λαβρακιού στην ηλικία των 45 ηµερών dph (ηµέρες µετά την εκκόλαψη), µε το βέλτιστο για τη µέγιστη σωµατική αύξηση να παρατηρείται στα 5 και 10 mg ρετινόλης ανά Kg τροφής (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.1). ΠΙΝΑΚΑΣ 3.1. Επίδραση των διατροφικών επιπέδων ρετινόλης στο µεσουραίο µήκος των νυµφών λαβρακιού στην ηλικία των 45 ηµερών dph. Συγκέντρωση ρετινόλης mg Kg -1 Μέσο FL SD Εύρος FL n (mm) (mm) 0 17,8 3,2 13,0-23,2 143 5 20,3 2,4 14,8-24,5 146 10 19,7 3,9 15,1-24,3 143 15 18,2 3,9 14,7-21,9 151 25 18,5 2,5 14,1-22,7 139 35 18,7 2,5 14,2-24,7 154 70 17,5 3,7 13,6-24,2 152 ΕΙΚΟΝΑ 3.1. Επίδραση της ρετινόλης στο µεσουραίο µήκος (FL, mm) των νυµφών. Οι τιµές µε το ίδιο γράµµα δεν παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (p>0.05, Kruskal-Wallis, Mann-Whitney U-test). 32

3.1 Επίδραση της ρετινόλης στην ανάπτυξη σκελετικών δυσπλασιών στις νύµφες του λαβρακιού Α. Κρανίο Όσον αφορά στο κρανίο, οι παραµορφώσεις που καταγράφηκαν αφορούσαν το βραγχιακό επικάλυµµα, τις γνάθους και το υοειδές τόξο. Οι παραµορφώσεις του βραγχιακού επικαλύµµατος αφορούσαν στην µονόπλευρη ή αµφίπλευρη προς τα έσω κάµψη του επικαλυµµατικού ή/και υποεπικαλυµµατικού οστού (Εικόνα 3.2A), µε µέση συχνότητα 0,0-3,7% (Εικόνα 3.3). Ο στατιστικός έλεγχος δεν υπέδειξε καµία σηµαντική διαφορά των συχνοτήτων αυτών µεταξύ των διαφορετικών διατροφικών συνθηκών (p>0,05, G-test). Αντίθετα, σηµαντική αποδείχθηκε η επίδραση της ρετινόλης στην κάµψη των βραγχιοστεγών ακτίνων (Εικόνα 3.2Β), η οποία εµφάνισε ελάχιστη συχνότητα στα 0, 5 και 15 mg Κg -1 (7,1-11,2%) και µέγιστη στα 10 και 25-70 mg Κg -1 (15,7-22,8%) (Εικόνα 3.4). Οι παραµορφώσεις των γνάθων περιελάµβαναν το σύνδροµο του «διασταυρούµενου δαγκώµατος» (Εικόνα 3.2Γ), την κατάσταση pugheadness (Εικόνα 3.2 ), την κοιλιακή κάµψη (Εικόνα 3.2Ε) ή τη βράχυνση της κάτω γνάθου (Εικόνα 3.2ΣΤ). Τα διατροφικά επίπεδα της ρετινόλης επηρέασαν σηµαντικά µόνο συχνότητα της κατάστασης pugheadness, η ελάχιστη συχνότητα της οποίας εντοπίσθηκε στα 5 mg Κg -1 (17,9%, Εικόνα 3.5Γ). Οι παραµορφώσεις του υοειδούς τόξου αφορούσαν στην κοιλιακή προεκβολή ή/και πλευρική µετατόπιση του γλωσσοϋοειδούς οστού (Εικόνα 3.2Ζ) και επηρεάσθηκαν σηµαντικά από τον εξεταζόµενο διατροφικό παράγοντα. Τα βέλτιστα επίπεδα ρετινόλης για τη φυσιολογική ανάπτυξη του υοειδούς τόξου εντοπίσθηκαν στα 0-5 mg Κg -1 (Εικόνα 3.6). 33

ΕΙΚΟΝΑ 3.2. Νύµφες λαβρακιού µε παραµόρφωση βραγχιακού επικαλύµµατος (A) ή βραγχιοστεγών ακτίνων (Β), διασταυρούµενο δάγκωµα (Γ), pugheadness ( ), πρόσθια κοιλιακή κάµψη της κάτω γνάθου (Ε), βράχυνση κάτω γνάθου (ΣΤ), και κοιλιακή προεκβολή του γλωσσοϋοειδούς (Ζ). Η κλίµακα ισούται µε 1 mm. 34

ΕΙΚΟΝΑ 3.3. Επίδραση των διατροφικών επιπέδων ρετινόλης στην εµφάνιση των παραµορφώσεων του βραγχιακού επικαλύµµατος αριστερά (A), δεξιά (B) και αµφίπλευρα (Γ). Στο * δίνεται το άθροισµα των συχνοτήτων όλων των τύπων. Οι γραµµές σφάλµατος ισούνται µε 1 SE. ΕΙΚΟΝΑ 3.4. Επίδραση των διατροφικών επιπέδων ρετινόλης στις παραµορφώσεις των βραγχιοστεγών ακτίνων. Οι γραµµές σφάλµατος ισούνται µε 1 SE. Στον πίνακα δίνονται τα επίπεδα σηµαντικότητας του ελέγχου των διαφορών των συχνοτήτων (G-test). *, p<0,05, **, p <0,01, και ***, p <0,001. 35

ΕΙΚΟΝΑ 3.5. Επίδραση της ρετινόλης στις παραµορφώσεις των γνάθων: (α) διασταυρούµενο δάγκωµα (Α), πεσµένο κάτω χείλος (Β), pugdeadness (Γ), κοντή κάτω γνάθος ( ) και πολύ κοντή άνω γνάθος (Ε). Υπάρχει στατιστικώς σηµαντική επίδραση της διαφορετικής συγκέντρωσης ρετινόλης στην περίπτωση της pugdeadness, κοντή κάτω γνάθος και πολύ κοντή άνω γνάθος. Οι γραµµές σφάλµατος ισούνται µε 1 SE. Στον πίνακα δίνονται τα επίπεδα σηµαντικότητας του ελέγχου των διαφορών των συχνοτήτων (G-test). *, p<0,05, **, p <0,01, και ***, p <0,001. 36

ΕΙΚΟΝΑ 3.6. Επίδραση της ρετινόλης στην παραµόρφωση του υοειδούς τόξου. Οι γραµµές σφάλµατος ισούνται µε 1 SE. Στον πίνακα δίνονται τα επίπεδα σηµαντικότητας του ελέγχου των διαφορών των συχνοτήτων (G-test). *, p<0,05, **, p <0,01, και ***, p <0,001. 37

Β. Σπονδυλική στήλη Οι δυσπλασίες που παρατηρηθήκαν στην σπονδυλική στήλη -λόρδωση, κύφωση, σκολίωση- αναπτύχθηκαν τόσο µεµονωµένα όσο και συνδυαστικά. Επιπλέον, σηµειώθηκαν παραµορφώσεις των σπονδύλων χωρίς απαραίτητα να συνοδεύονται από κάποια από τις τρεις προαναφερθείσες. Η λόρδωση (Εικόνα 3.7Α) εµφάνισε υψηλή συχνότητα σε όλες τις συγκεντρώσεις ρετινόλης. Το G-test έδειξε στατιστικά σηµαντική επίδραση των διαφορετικών συγκεντρώσεων ρετινόλης στην ανάπτυξη λόρδωσης, µε τη µεγαλύτερη µέση συχνότητα (42,4%) να εµφανίζεται απουσία ρετινόλης, ενώ η µικρότερη (23,3%) σε 15 mg Kg -1 (Εικόνα 3.8Α). Η βέλτιστη περιοχή εντοπίζεται µεταξύ των συγκεντρώσεων 5 και 15 mg Kg -1. Η κύφωση (Εικόνα 3.7Β) εµφάνισε περίπου τα ίδια ποσοστά συχνοτήτων (7,7-13,4%) ανεξάρτητα της εφαρµοζόµενης συγκέντρωσης ρετινόλης. Η διαφορά µεταξύ των διαφορετικών συχνοτήτων δεν βρέθηκε στατιστικά σηµαντική (Εικόνα 3.8Γ). Η σκολίωση (Εικόνα 3.7Γ) φάνηκε να ευνοείται απουσία ρετινόλης (3,9%) ενώ σε συγκέντρωση 5 mg Kg -1 η µέση συχνότητα ήταν 0,6% (Εικόνα 3.8Β). Ωστόσο δεν µπορούν εξαχθούν ασφαλή συµπεράσµατα γιατί το δείγµα των ατόµων µε σκολίωση ήταν ολιγάριθµο. Στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων συχνοτήτων εµφάνισης σκολίωσης βρέθηκαν µόνο στα ζεύγη 0-5 mg Kg -1 και 5-25 mg Kg -1. Παραµορφώσεις ελαφριάς έντασης των επιµέρους σπονδύλων (Εικόνα 3.7, περιορισµένης έκτασης συντήξεις, σπασίµατα αποφύσεων, αιµατικών και νευρικών τόξων) παρατηρήθηκαν και ανεξάρτητα από την ταυτόχρονη παρουσία άλλης παραµόρφωσης (λόρδωση, κύφωση ή σκολίωση). Όλες οι συγκεντρώσεις ρετινόλης φάνηκε να ευνοούν την ανάπτυξη παραµορφώσεων στους σπονδύλους (33,5-55,6%), ενώ το µέγιστο της συχνότητάς τους παρουσιάσθηκε στην τροφική συνθήκη όπου απουσίαζε η ρετινόλη (Εικόνα 3.9Α). Εντούτοις, οι διαφορές βρέθηκαν να είναι στατιστικά σηµαντικές µεταξύ τους. Τέλος, στατιστικά σηµαντική ήταν η επίδραση των διατροφικών επιπέδων ρετινόλης στη µετατροπή ενός προ-αιµατικού σπονδύλου σε αιµατικό (Εικόνα 3.7Ε), η οποία ευνοήθηκε απουσία ρετινόλης (66,4%) (Εικόνα 3.9Β). 38