ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 12. ΕΙΔΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 12 ΕΙΔΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΟΙΝΩΝ Ιωάννης Ρούσσης Ιωάννινα 2016-17 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ Προσδιορισμός ολικών εστέρων Οι εστέρες σχηματίζονται με αντίδραση αλκοόλης και οξέος, που είναι αμφίδρομη καθόσον συμβαίνει υδρόλυση των εστέρων. Υπάρχει μεγάλος αριθμός διαφορετικών αλκοολών και οξέων στον οίνο. Έτσι, ο αριθμός των πιθανών εστέρων είναι πολύ μεγάλος. Οι οξικοί αιθυλεστέρες είναι οι πιο κοινοί. Μόνο λίγοι εστέρες βρίσκονται στα σταφύλια, όπως ο ανθρανιλικός εστέρας που προσδίδει μια όξινη οσμή σε κάποιους οίνους. Οι εστέρες σχηματίζονται με ενζυμική εστεροποίηση κατά τη ζύμωση, και με χημική εστεροποίηση κατά την παλαίωση. Σχήμα. Ισορροπία εστεροποίησης αλκοόλης. Οι εστέρες που σχηματίζονται από οξέα με ένα καρβοξύλιο είναι ουδέτεροι, και οι εστέρες από οξέα με περισσότερα καρβοξύλια μπορεί να είναι όξινοι ή ουδέτεροι. Οι εστέρες παρουσιάζουν σημαντικό ενδιαφέρον λόγω των οργανοληπτικών τους χαρακτήρων. Εκτός από τον οξικό αιθυλεστέρα που έχει δυσάρεστη οσμή, οι εστέρες με μεγαλύτερο μοριακό βάρος έχουν άρωμα λουλουδιών ή φρούτων, και συμμετέχουν αποφασιστικά στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτήρων των οίνων. Ο γαλακτικός και ο προπιονικός αιθυλεστέρας έχουν ουδέτερη οσμή και υψηλό κατώφλι αντίληψης, και έτσι δεν φαίνεται να έχουν επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων. Οι αιθυλεστέρες των λιπαρών οξέων με ζυγό αριθμό ατόμων άνθρακα και ειδικότερα με 6, 8, 10 και 12 άτομα άνθρακα (εξανοικός, οκτανοικός, δεκανοικός και δωδεκανοικός) αποτελούν σπουδαία συστατικά του αρώματος και του μπουκέτου των οίνων. Επίσης, οξικοί εστέρες όπως ο οξικός ισοαμυλεστέρας, ο οξικός βενζυλεστέρας, ο οξικός φαυνυλ αιθυλεστέρας. Ο σχηματισμός εστέρων κατά την αλκοολική ζύμωση εξαρτάται από τον ζυμομύκητα ζύμωσης, τη θερμοκρασία, το ph, τον αερισμό, ακόμη και από το στάδιο της ζύμωσης. 1

Προσδιορισμός συνολικών πτητικών εστέρων φωτομετρικά - Αρχή μεθόδου Προσδιορισμός των συνολικών πτητικών εστέρων μπορεί να γίνει φωτομετρικά, μετά από απόσταξη του οίνου και αντίδραση με ειδικά αντιδραστήρια. Οι πτητικοί εστέρες αντιδρούν με υδροξυλαμίνη και δημιουργούν προϊόν που αντιδρά με τρισθενή σίδηρο και δημιουργεί έγχρωμο σύμπλοκο. Προσδιορισμός σορβικού οξέος Το σορβικό οξύ, CH 3 -CH=CH-CH=CH-COOH, έχει αντιμικροβιακή δράση. Δρα στους μύκητες, ενώ έχει πολύ μικρή δράση στα βακτήρια. Πρακτικά δεν έχει δράση στα γαλακτικά και στα οξικά βακτήρια. Είναι δραστικό έναντι όλων των ζυμομυκήτων, από τους οποίους πιο ευαίσθητοι είναι του γένους Kloeckera ή Hansieniaspora. Η αποτελεσματικότητά του εξαρτάται από την αλκοόλη και το ph. Σε υψηλότερα επίπεδα αλκοόλης απαιτείται μικρότερη συγκέντρωση σορβικού οξέος. Είναι πιο δραστικό σε χαμηλότερα ph. Σε ph 3,1 είναι δύο φορές πιο δραστικό από ότι σε ph 3,5. Ο συνδυασμός του σορβικού οξέος με τον θειώδη ανυδρίτη τον καθιστά πιο αποτελεσματικό. Σημειώνεται ότι το σορβικό οξύ δεν μπορεί να αντικαταστήσει τον θειώδη ανυδρίτη αλλά για μείωσή του, κυρίως στους γλυκούς οίνους. Επειδή το σορβικό οξύ είναι ελάχιστα διαλυτό στο νερό και στην αλκοόλη, χρησιμοποιείται το σορβικό κάλιο που είναι πιο διαλυτό. Το μέγιστο όριο χρησιμοποίησής του είναι 200 mg/l. Χρησιμοποιείται σε γλυκά κρασιά για αποφυγή επαναζύμωσης. Χρησιμοποιείται μαζί με 30-40 mg/l SO 2 για προστασία από την οξείδωση και για αναστολή βακτηρίων. Το σορβικό οξύ είναι αφομοιώσιμο από τον οργανισμό και δεν είναι τοξικό. Είναι λευκό, με καυστική οσμή, πτητικό, και πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στον προσδιορισμό της πτητικής οξύτητας για διόρθωση του αποτελέσματος. 2

Η προσθήκη του σορβικού οξέος στους ερυθρούς οίνους πρέπει να αποφεύγεται διότι σχηματίζει δυσάρεστη οσμή και γεύση. Δεν είναι σταθερό και διασπάται από γαλακτικά βακτήρια και προσδίδει δυσάρεστη οσμή που δύσκολα απομακρύνεται. Προσδιορισμός σορβικού οξέος φωτομετρικά Αρχή μεθόδου Το σορβικό οξύ παρουσιάζει μέγιστη απορρόφηση στο υπεριώδες στα 256 nm. H μέτρηση γίνεται σε απόσταγμα του οίνου, δεδομένου ότι το σορβικό οξύ είναι πτητικό με υδρατμούς. Ενζυμικός προσδιορισμός μηλικού οξέος, και άλλων οξέων Τα οργανικά οξέα είτε προέρχονται από το σταφύλι είτε σχηματίζονται κατά τις ζυμώσεις του γλεύκους και τις μικροβιακές αλλοιώσεις του οίνου. Τα κυριότερα οξέα του σταφυλιού Τρυγικό (HO 2 CCH(OH)CH(OH)CO 2 H), μηλικό (HO 2 CCH 2 CHOHCO 2 H), κιτρικό (HOC(COOH)(CH 2 COOH) 2 ), οξαλικό (HO 2 CCO 2 H), ουρονικά οξέα (σακχαρικά οξέα), (εξουρονικό οξύ, L-ασκορβικό οξύ βιταμίνη C, C 6 H 8 O 6 ). Το γλυκονικό οξύ (γλουκονικό οξύ, HOCH 2 (CHOH) 4 COOH) και άλλα οξέα υπάρχουν όταν συμβαίνει φαιά σήψη. Κατά τη ζύμωση σχηματίζονται ηλεκτρικό οξύ (HOOC-(CH 2 ) 2 -COOH) και γαλακτικό οξύ (CH 3 CH(OH)COOH), και με εστεροποίηση προκύπτουν αιθυλικοί εστέρες που συμβάλλουν σημαντικά στο άρωμα. Άλλα οξέα ζυμώσεων και μικροβιακών αλλοιώσεων είναι το κιτρομηλικό, το διμεθυλογλυκερινικό, το πυροσταφυλλικό, το α-κετογλουταρικό. Τα οξέα, μηλικό, τρυγικό, κιτρικό και γαλακτικό (υδροξυοξέα), δεσμεύουν το σίδηρο και έτσι αποφεύγονται θολώματα σιδήρου. Το κιτρικό σχηματίζει πιο ισχυρά σύμπλοκα με το σίδηρο και χρησιμοποιείται για αποφυγή θολωμάτων σιδήρου. Τα οργανικά οξέα συμβάλλουν θετικά στην ποιότητα του οίνου. Ρυθμίζουν την ογκομετρούμενη και την ενεργό οξύτητα του γλεύκους και του οίνου. Ρυθμίζουν την όξινη γεύση του οίνου. Περιορίζουν την ανάπτυξη διάφορων μικροοργανισμών όπως βακτηρίων αλλοίωσης του οίνου, και έτσι συμβάλλουν στη συντήρησή του. Το χαμηλό ph ευνοεί τη ζωηρότητα του χρώματος των οίνων. Όμως, ορισμένα οξέα προσβάλλονται κάποιες φορές από μικροοργανισμούς και έτσι προκαλούνται αλλοιώσεις των οίνων. Τα οργανικά οξέα βρίσκονται είτε ως ελεύθερα οξέα είτε με τη μορφή αλάτων. Τα ελεύθερα οξέα μπορεί να βρίσκονται σε μερική διάσταση, ενώ τα άλατα βρίσκονται σε πλήρη διάσταση. 3

Η συνολική αποτίμηση των οργανικών οξέων στους οίνους προκύπτει από α) την ολική ή ογκομετρούμενη οξύτητα, που εκφράζει το σύνολο των καρβοξυλομάδων των οξέων είτε βρίσκονται σε διάσταση είτε όχι, β) την ενεργό οξύτητα ή ph, που εκφράζει το σύνολο των καρβοξυλομάδων που βρίσκονται σε διάσταση και που αντιστοιχεί στο σύνολο των κατιόντων υδρογόνου, και γ) την αλκαλικότητα της τέφρας, που εκφράζει το σύνολο των οργανικών οξέων που βρίσκονται υπό μορφή αλάτων και που μετατρέπονται σε ανθρακικά άλατα με αποτέφρωση. Τρυγικό οξύ (2-5 g/l): το φυσικό τρυγικό οξύ του οίνου είναι το D-τρυγικό οξύ. Είναι το σπουδαιότερο από τα σταθερά οξέα του οίνου. Είναι το πιο ισχυρό και επηρεάζει την ενεργό οξύτητα του οίνου. Από τα τρία κυριότερα οξέα του σταφυλιού (τρυγικό, μηλικό, κιτρικό) το τρυγικό οξύ είναι το πιο ανθεκτικό στις βακτηριακές προσβολές. Με βάση τα παραπάνω, είναι το οξύ που ενδείκνυται περισσότερο για την αύξηση της οξύτητας της σταφυλόμαζας. Όμως, σε υψηλές δόσεις δίνει στον οίνο μία σκληρότητα και στυφότητα. Η συγκέντρωση του τρυγικού οξέος στο πράσινο σταφύλι είναι περίπου 15 g/l, και στο ώριμο περίπου 7,5 g/l, λόγω καύσης και διάλυσης στο νερό του σταφυλιού. Κατά την αλκοολική ζύμωση καθιζάνει ποσότητα όξινου τρυγικού καλίου, λόγω μικρότερης διαλυτότητας στην αλκοόλη, και η οξύτητα είναι 2,5-4 g/l. Με τα κρύα του χειμώνα, καταβυθίζονται όξινο τρυγικό κάλιο και τρυγικό ασβέστιο (αρχικά το άλας καλίου και αργότερα το άλας του ασβεστίου) (τρυγία). Έτσι, η συγκέντρωση του τρυγικού οξέος είναι 1,5-2,5 g/l. Μερικές φορές το τρυγικό οξύ προσβάλλεται από γαλακτικά βακτήρια, και η συγκέντρωση του τρυγικού μηδενίζεται, ενώ αυξάνει η πτητική οξύτητα. Μηλικό οξύ (0-4 g/l): Το φυσικό μηλικό οξύ είναι το L (-) ισομερές. Έχει σημαντική επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων, και προσδίδει χορτώδη οσμή και γεύση και κάποια στυφάδα. Στα πράσινα σταφύλια η συγκέντρωσή του είναι 15-25 g/l, στα ώριμα σταφύλια 2-5 g/l. Είναι ασταθές στους μικροργανισμούς. Οι συνήθεις ζύμες δεν μεταβάλλουν τη συγκέντρωση του μηλικού οξέος κατά την αλκοολική ζύμωση. Όμως, ο Schizosaccharomyces pombe μετατρέπει το μηλικό οξύ σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα (μηλοαλκοολική ζύμωση), και έτσι μειώνεται η οξύτητα των οίνων. Μερικές φορές λαμβάνει χώρα η μηλογαλακτική ζύμωση. Μηλογαλακτικά βακτήρια μετατρέπουν το μηλικό οξύ σε γαλακτικό οξύ και διοξείδιο του άνθρακα, και έτσι μειώνεται η οξύτητα. Η μηλογαλακτική ζύμωση ενδείκνυται για τους ερυθρούς οίνους και ιδιαίτερα οίνους με υψηλή οξύτητα, και βελτιώνει τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά. Κιτρικό οξύ (0-1 g/l): στο σταφύλι βρίσκεται μέχρι 0,5 g/l, ενώ με την ευγενή σήψη μέχρι 0,8-1,0 g/l. 4

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αύξηση της οξύτητας και τη γευστική βελτίωση των οίνων. Σημειώνεται ότι επιτρέπεται η προσθήκη κιτρικού στον οίνο, ενώ του τρυγικού οξέος μόνο στο γλεύκος. Όμως, είναι ευπρόσβλητο από γαλακτικά βακτήρια με αύξηση της πτητικής οξύτητας. Σωστό είναι αποφεύγεται η προσθήκη, και να προστίθεται μόνο στη δόση για προστασία από θολώματα σιδήρου και μόνο όταν είναι απαραίτητο. Επιτρεπόμενο όριο προσθήκης είναι 50 g/hl, ενώ 20-30 g/hl είναι συνήθως επαρκή. Ασκορβικό οξύ (0 g/l): υπάρχει στο γλεύκος σε 50-100 mg/l. Καταναλώνεται από τις ζύμες κατά τη ζύμωση, και έτσι δεν υπάρχει στους οίνους. Προστίθεται στους οίνους σε δόσεις μέχρι 100 mg/l. Δρά ως αντιοξειδωτικό, καθόσον οξειδώνεται το ίδιο γρήγορα. Εμποδίζει την οξείδωση του δισθενούς σιδήρου σε τρισθενή. Παρέχει κάποια προστασία σε ενώσεις αρώματος και διατηρεί τη φρεσκάδα του οίνου. Προστίθεται κατά την εμφιάλωση, σε οίνους με επαρκή ποσότητα θειώδη ανυδρίτη. Ηλεκτρικό οξύ (0,5-1,5 g/l): σχηματίζεται κατά τη ζύμωση των ζαχάρων, και γι αυτό είναι σε κάποια αναλογία με την αλκοόλη. Έχει σημαντική επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των οίνων, καθόσον η γεύση του συνδυάζει το ξινό, το αλμυρό και το πικρό. Το ηλεκτρικό οξύ είναι πολύ ανθεκτικό σε βακτηριακές προσβολές. Γαλακτικό οξύ. L (+) γαλακτικό οξύ (0,1-3 g/l) και D (-) γαλακτικό οξύ (0,1-0,5 g/l). Βρίσκεται στους οίνους αλλά όχι στα γλεύκη. Βρίσκεται και με τα δύο του ισομερή (το αριστερόστροφο (D-) ή/και το δεξιόστροφο (L+)). Προέρχεται από τη δράση των ζυμών κατά τη ζύμωση. Παράγεται το D (-) ισομερές σε 0,1-0,4 g/l, ενώ το L (+) ισομερές μόνο σε ίχνη. Επίσης, προέρχεται από τη δράση των μηλογαλακτικών βακτηρίων κατά τη μηλογαλακτική ζύμωση. Παράγεται μόνο το L (+) ισομερές, μέχρι 3 g/l. Έτσι, είναι δείκτης της μηλογαλακτικής ζύμωσης. Ακόμη, παράγεται από τη δράση γαλακτικών βακτηρίων με προσβολή ζαχάρων (εξόζες), της γλυκερίνης και του τρυγικού οξέος. Ανάλογα με το βακτήριο παράγεται το D (-) ισομερές είτε το L (+) ισομερές. Στις περιπτώσεις βακτηριακής αλλοίωσης η ολική συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος είναι υψηλή, ακόμη και μεγαλύτερη από 10 g/l. Όταν τα επίπεδα του γαλακτικού οξέος είναι υψηλά εξετάζονται τα επίπεδα του μηλικού οξέος (για μηλογαλακτική ζύμωση), των ζαχάρων (για βακτηριακή προσβολή ζαχάρων), και του τρυγικού οξέος (για βακτηριακή προσβολή του, εκτροπή). Το γαλακτικό οξύ είναι το πιο σταθερό οξύ του οίνου από χημική και βιολογική 5

άποψη. Έτσι, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για αύξηση της οξύτητας ορισμένων οίνων (το τρυγικό οξύ που χρησιμοποιείται συνήθως προσβάλλεται από βακτήρια). Eνζυμικές μέθοδοι H χρησιμοποίηση των ενζύμων στην ανάλυση των τροφίμων είναι σχετικά πρόσφατη. Tο κύριο πλεονέκτημα των ενζυμικών μεθόδων είναι η μεγάλη εξειδίκευση, όπως επίσης οι ήπιες συνθήκες ανάλυσης, η ευαισθησία, η ακρίβεια και η επαναληψιμότητά τους. Mειονεκτήματά τους είναι η ανασταλτική δράση διαφόρων συστατικών των τροφίμων, όπως και η αστάθεια των ενζύμων. Στις ενζυμικές μεθόδους ανάλυσης, το προσδιοριζόμενο συστατικό είναι, κατά κανόνα, το υπόστρωμα της αντίδρασης. Σύμφωνα με την εξίσωση Michaelis Menten E+S ES E+P, ενώ η αρχική ταχύτητα Uo = (Vmax [S]o)/(Km+[S]o). H συγκέντρωση του υποστρώματος μπορεί να προσδιοριστεί με δύο μεθόδους. 1. Mέθοδοι ολικής μεταβολής (total change) H αντίδραση αφήνεται να προχωρήσει το δυνατό και μετράται η ολική μεταβολή (κατανάλωση υποστρώματος ή δημιουργία προϊόντος). Όταν η ενζυμική αντίδραση δεν είναι ποσοτική υποβοηθείται με αύξηση της συγκέντρωσης αντιδραστηρίων (συνήθως των συνενζύμων), με δέσμευση κάποιου από τα προϊόντα ή με μεταβολή του ph. Oι μέθοδοι αυτές δεν απαιτούν αυστηρό έλεγχο των πολυάριθμων μεταβλητών. Eφαρμόζονται είτε άμεσες μετρήσεις είτε έμμεσες με την βοήθεια συζευγμένων αντιδράσεων. Παράδειγμα αν το υπόστρωμα έχει ένα χαρακτηριστικό φάσμα απορρόφησης μπορεί να μετρηθεί η μείωση της απορρόφησης σε ένα μήκος κύματος. H μεταφορά υδρογόνου απ' το υπόστρωμα στο NAD ή NADP και η μέτρηση της απορρόφησης στα 340nm, όπου απορροφά το αναγμένο συνένζυμο, είναι η βάση πολλών ενζυμικών προσδιορισμών, όπως του προσδιορισμού της αιθανόλης με αλκοολική δεϋδρογονάση. Στις μετρήσεις με συζευγμένες αντιδράσεις προϊόν της πρώτης αντίδρασης αντιδρά με χρωμογενές αντιδραστήριο προς δημιουργία χρώματος, όπως παράδειγμα στον προσδιορισμό γλυκόζης με οξειδάση γλυκόζης και υπεροξειδάση. 6

οξειδάση γλυκόζη γλυκόζη+h 2 O+O 2 γλουκονικό οξύ+h 2 O 2 υπεροξειδάση H 2 O 2 +λευκο-χρωστική H 2 O+χρώμα 2. Mέθοδοι μέτρησης αρχικής ταχύτητας Yπό ελεγχόμενες συνθήκες και σε μικρές συγκεντρώσεις υποστρώματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί η αρχική ταχύτητα για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του υποστρώματος. H περιοχή γραμμικότητας ισχύει για συγκεντρώσεις μικρότερες από 0,1 Km, και επειδή ο ρυθμός της αντίδρασης εξαρτάται από το ph, την θερμοκρασία και την ιονική ισχύ, οι συνθήκες πρέπει να κρατούνται αυστηρά σταθερές. Eκτός από την συγκέντρωση υποστρώματος, επίσης εφαρμόζεται και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης αναστολέα. Aναστολέας είναι ένωση που προκαλεί μείωση του ρυθμού ενζυμικής αντίδρασης, με σχηματισμό συμπλόκου με το ένζυμο ή το υπόστρωμα. Γενικά η αρχική ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης θα μειώνεται γραμμικά με αύξηση της συγκέντρωσης του αναστολέα, σε χαμηλές συγκεντρώσεις, και θα μηδενίζεται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Παράδειγμα αποτελεί ο προσδιορισμός των οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων, που είναι αναστολείς χοληνεστεράσης. Mεγάλη πρόοδο αποτέλεσε η αυτοματοποίηση των ενζυμικών μεθόδων, που επιτρέπει την εξέταση μεγάλου αριθμού δειγμάτων και καλύτερη ακρίβεια και επαναληψιμότητα, κυρίως με την εφαρμογή τεχνικών συνεχούς ροής. Γίνονται μετρήσεις απορρόφησης στο ορατό ή το υπεριώδες, φθορισμού. Επίσης χρησιμοποιούνται και άλλες μέθοδοι όπως ηλεκτροχημικές, φυγοκεντρικές, μικροθερμιδομετρικές και άλλες. Oι μετρήσεις, με ηλεκτρονικούς υπολογιστές, μετατρέπονται σε μονάδες ενζυμικής δραστικότητας ή άλλη παράμετρο που εξαρτάται απ' αυτήν. Mε την χρήση των ακινητοποιημένων ενζύμων μπορούν να ξεπεραστούν ορισμένα προβλήματα των ενζυμικών μεθόδων. Aυτά, λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης, δεν είναι ευαίσθητα στους αναστολείς, έχουν μεγαλύτερη σταθερότητα και επιτρέπουν την ξαναχρησιμοποίησή τους. Tα ακινητοποιημένα ένζυμα, σε συνδυασμό με ηλεκτροχημικές τεχνικές, βρίσκουν ιδιαίτερη εφαρμογή στην αυτοματοποίηση των ενζυμικών 7

μεθόδων. Tέτοιος συνδυασμός είναι τα ηλεκτρόδια ενζύμου που απλοποιούν τους προσδιορισμούς. H ενζυμική ανάλυση βρίσκει εφαρμογή στον προσδιορισμό πολλών συστατικών τροφίμων. Προσδιορίζονται υδατάνθρακες (π.χ. γλυκόζη, φρουκτόζη, γαλακτόζη, σακχαρόζη, ραφινόζη, άμυλο), οργανικά οξέα (π.χ. γαλακτικό, οξικό, μυρμηκικό, μηλικό, κιτρικό, πυροσταφυλλικό), αλκοόλες και αλδεΰδες (π.χ. αιθανόλη, σορβιτόλη, γλυκερόλη, ακεταλδεΰδη) και πολλά άλλα (π.χ. τριγλυκερίδια, λεκιθίνη, χοληστερόλη, κρεατίνη+κρεατινίνη, νιτρικά, ασκορβικό οξύ, ελεύθερα λιπαρά οξέα, φωσφορικά, ολικό SO 2, αμμωνία). Kυκλοφορούν εμπορικά σύνολα (kits) για την εύκολη εφαρμογή των διαφόρων μεθόδων, ενώ επίσης πιθανή είναι η χρήση, στο άμεσο μέλλον, αυτοματοποιημένων μεθόδων στον ποιοτικό έλεγχο στις βιομηχανίες τροφίμων. Προσδιορισμός μηλικού οξέος Αρχή μεθόδου Το L-μηλικό οξύ οξειδώνεται από το NAD (νικοτιναμιδο-αδενινοδινουκλεοτίδιο) παρουσία αφυδρογονάσης L-μηλικού οξέος L-μηλικό οξύ + NAD + οξαλοξικό +NADH + H + Το οξαλοξικό παρουσία L-γλουταμινικού μετατρέπεται σε L-ασπαρτικό, αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο τρανσαμινάση γλουταμινικούοξαλοξικού (GOT). Οξαλοξικό + L-γλουταμινικό L-ασπαρτικό +2-οξογλουταρικό Το ποσό του NADH που σχηματίζεται είναι σε στοιχειομετρική αναλογία με την ποσότητα του L-μηλικού. Η αύξηση του NADH αποτιμάται με μέτρηση της απορρόφησης στα 334, 340 ή 365 nm. 8

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Προσδιορισμός συνολικών πτητικών εστέρων φωτομετρικά Σε φιάλη φέρονται 100 ml οίνου και 50 ml απεσταγμένου νερού. Γίνεται απόσταξη και συλλέγονται 90 ml σε ογκομετρική φιάλη που είναι βυθισμένη σε πάγο. Γίνεται συμπλήρωση στα 100 ml με απεσταγμένο νερό. Σε δοκιμαστικό σωλήνα φέρονται 3 ml αποστάγματος, και προστίθενται 2 ml υδροχλωρικής υδροξυλαμίνης 2Μ και 2 ml ΝαΟΗ 3,5 N. Γίνεται ανάμιξη και ακολουθεί 10 min παραμονή. Στη συνέχεια, προστίθενται 2 ml HC1 4 N και 2 ml διαλύματος τριχλωριούχου σιδήρου (10 % w/v σε HC1 0,1N). Γίνεται ανάμιξη και μετράται η απορρόφηση στα 510 nm, με κυψελίδα 1 cm και τυφλό απεσταγμένο νερό. Χρησιμοποιείται τυφλό μεθόδου και κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με συγκεντρώσεις 0, 200, 400, 600 mg/l.. Προσδιορισμός σορβικού οξέος φωτομετρικά Σε φιάλη φέρονται 10 ml οίνου και προστίθεται περίπου 1 g τρυγικού οξέος. Γίνεται απόσταξη με υδρατμούς και συλλέγονται 250 ml αποστάγματος. Φέρονται 5 ml αποστάγματος σε κάψα πορσελάνης διαμέτρου 55 mm και προστίθεται 1 ml 0,02 Μ υδροξειδίου του ασβεστίου. Γίνεται εξάτμιση μέχρι ξηρού σε ζέον υδατόλουτρο. Το υπόλειμμα διαλύεται σε αρκετά ml αποσταγμένου νερού, μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 20 ml και γίνεται συμπλήρωση με αποσταγμένο νερό. Μετράται η απορρόφηση στα 256 nm με κυψελίδα χαλαζία 1 cm. Ως τυφλό χρησιμοποιείται διάλυμα που περιέχει 1 ml 0,02 Μ υδροξειδίου του ασβεστίου αραιωμένου στα 20 ml με αποσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση του σορβικού οξέος σε mg/l προκύπτει από πρότυπη καμπύλη. Για την πρότυπη καμπύλη παρασκευάζονται σορβικού οξέος 0 0,5 1,0-2,5 και 5 mg/l. Για την παρασκευή των παραπάνω διαλυμάτων παρασκευάζεται αρχικά διάλυμα 20 mg/l. Διαλύονται 20 mg σορβικού οξέος σε 2 ml 0,1 Μ καυστικού νατρίου, μεταφέρονται σε ογκομετρική φιάλη 1 L, και γίνεται συμπλήρωση με νερό. Εναλλακτικά διαλύονται 26,8 mg σορβικού καλίου σε νερό και γίνεται συμπλήρωση στο 1 L με νερό. Ενζυμικός προσδιορισμός μηλικού οξέος Διαλύματα - αντιδραστήρια Νο 1. L-γλουταμινικό οξύ, 440 mg, σε ρυθμιστικό διάλυμα γλυκυλ-γλυκίνης ph 10 (περίπου 30 ml), 9

No 2. Σκόνη NAD, 210 mg, που διαλύεται σε 6 ml αποσταγμένο νερό, No3. Αιώρημα, 0,4 ml, τρανσαμινάσης γλουταμικού-οξαλοξικού, περίπου 160 U, Νο 4. Διάλυμα αφυδρογονάσης L-μηλικού, περίπου 0,4 ml περίπου 2400 U, Νο 5. Διάλυμα L-μηλικού, control δοκιμής. Πορεία Σε σωλήνα προστίθενται 1,0 ml διαλύματος 1, 0,2 ml διαλύματος 2, 0,010 ml αιωρήματος 3, 0,1 ml διαλύματος δείγματος και 0,9 ml αποσταγμένου νερού. Για το τυφλό, προστίθενται 0,1 ml αποσταγμένου νερού στη θέση του διαλύματος δείγματος. Το διάλυμα δείγματος να περιέχει 0,5-35 μg L-μηλικού οξέος ανά δοκιμή (σε 0,1-1,0 ml όγκο δείγματος). Γίνεται ανάμιξη, και μετράται η απορρόφηση διαλύματος δείγματος και τυφλού σε περίπου 3 min. Απορρόφηση Α1. Ακολούθως, η αντίδραση ξεκινάει με προσθήκη 0,010 ml διαλύματος 4, σε καθένα από τα διαλύματα δείγματος και τυφλού. Γίνεται ανάμιξη, και μετράται η απορρόφηση μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, σε περίπου 5-10 min. Απορρόφηση Α2. Λαμβάνονται οι διαφορές Α2-Α1 για το τυφλό και το δείγμα, και υπολογίζεται το ΔΑ = (Α2-Α1) δείγματος (Α2-Α1) τυφλού. Οι διαφορές απορροφήσεων πρέπει να είναι τουλάχιστον 0,1. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του L-μηλικού οξέος σε g/l προκύπτει από τη σχέση: C = V x MB x ΔΑ : ε χ d x v x 1000, Όπου V τελικός όγκος σε ml, v όγκος δείγματος σε ml, ΜΒ το μοριακό βάρος του μηλικού οξέος (134,09) d η διαδρομή του φωτός σε cm, ε ο συντελεστής απόσβεσης του NADH, 6,3 στα 340 nm (L x mmol -1 x cm -1 ). C = 2,22 x 134,09 x ΔΑ : 6,3 χ 1,0 x 0,1 x 1000, Εάν το δείγμα έχει αραιωθεί το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται με τον συντελεστή αραίωσης. 10

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προσδιορισμός συνολικών πτητικών εστέρων Η πρότυπη καμπύλη είναι Α (Απορρόφηση) = 0,0012 χ C (Συγκέντρωση, mg/l) + 0,034, με R 2 = 0,9983. Η πρότυπη έγινε με εξανοικό αιθυλεστέρα. Συνεπώς, τα αποτελέσματα είναι σε mg/l, ως εξανοικό αιθυλεστέρα. Οι τιμές απορρόφησης που ελήφθησαν από τις πέντε ομάδες είναι: 1 =0,228, 2=0,299, 3=0,252, 4=0,2155, 5=0,245. Με βάση τα παραπάνω, ο κάθε φοιτητής μπορεί να υπολογίσει τη συγκέντρωση του δείγματος της ομάδας του. Προσδιορισμός σορβικού οξέος Η πρότυπη καμπύλη είναι Α (Απορρόφηση) = 0,1771 χ C (Συγκέντρωση, mg/l) + 0,0152, με R 2 = 0,9983. Οι τιμές απορρόφησης που ελήφθησαν από τις πέντε ομάδες είναι: 1=0,111, 2=0,093, 3=0,1018, 4=0,1085, 5=0,130. Με βάση τα παραπάνω, ο κάθε φοιτητής μπορεί να υπολογίσει τη συγκέντρωση του δείγματος της ομάδας του. 11

Ενζυμικός προσδιορισμός μηλικού οξέος Οι υπολογισμοί γίνονται με βάση τα παρακάτω: Λαμβάνονται οι διαφορές Α2-Α1 για το τυφλό και το δείγμα, και υπολογίζεται το ΔΑ = (Α2-Α1) δείγματος (Α2-Α1) τυφλού. Α1 οι απορροφήσεις στα 5 min. Α2 οι απορροφήσεις στα 10 min. Οι διαφορές απορροφήσεων πρέπει να είναι τουλάχιστον 0,1. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του L-μηλικού οξέος σε g/l προκύπτει από τη σχέση: C = 2,22 x 134,09 x ΔΑ : 6,3 χ 1,0 x 0,1 x 1000, Εάν το δείγμα έχει αραιωθεί το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται με τον συντελεστή αραίωσης. Ο κάθε φοιτητής μπορεί να υπολογίσει τη συγκέντρωση του μηλικού οξέος στο δείγμα είτε δείγματα της ομάδας του. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν είναι τα παρακάτω. Ομάδα 1 Δείγμα Λευκό Κρασί 2 φορές αραιωμένο, δηλαδή το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί 2. Απορροφήσεις στα 5 min. Τυφλό, 0,211 Κρασί, 0,384 Απορροφήσεις στα 10 min. Τυφλό, 0,276 Κρασί, 0,948 12

Ομάδα 2 Δείγμα Λευκό Κρασί 2 φορές αραιωμένο, δηλαδή το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί 2. Απορροφήσεις στα 5 min. Τυφλό, 0,265 Κρασί, 0,377 Απορροφήσεις στα 10 min. Τυφλό, 0,315 Κρασί, 0,930 Ομάδα 3 και Ομάδα 5 Δείγματα Λευκό Κρασί 3 φορές αραιωμένο, δηλαδή το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί 3. Γλεύκος 5 φορές αραιωμένο, δηλαδή το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί 5. Απορροφήσεις στα 5 min. Τυφλό, 0,2816 Κρασί, 0,425 Γλεύκος, 0,3201 Απορροφήσεις στα 10 min. Τυφλό, 0,289 Κρασί, 1,183 Γλεύκος, 0,708 13