ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Φαρμακευτικής Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Φαρμακευτικής Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας ΜΥΪΚΟΥ ΤΥΠΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΣΑΝ ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΓΙΑ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΝΙΑΡΧΟΣ Φαρμακοποιός ΠΑΤΡΑ 2008

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Σωκράτης Τζάρτος Αν. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κωνσταντίνος Αυγουστάκης ΛΕΚΤΟΡΑΣ Κωνσταντίνος Πουλάς 1

Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Πρώτα απ όλα θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της Τριμελούς Επιτροπής. Τον επιβλέπων καθηγητή μου κ. Σωκράτη Τζάρτο για την ανάθεση, την επίβλεψη και τον εξοπλισμό που μου παρείχε, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Αυγουστάκη για την τεχνογνωσία που μου έδωσε και τον λέκτορα κ. Κωνσταντίνο Πουλά για την πολύτιμη υποστήριξη που μου παρείχε σε πολλαπλά επίπεδα. Ονομαστικά θα ήθελα να ευχαριστήσω, την κ. Άννα Κόκλα και τον κ. Νίκο Τράκα του Εργαστηρίου Βιοχημείας του Ινστιτούτου Παστέρ για τη συνεχή προμήθεια πολλών υλικών, παρασκευασμάτων και πειραματόζωων απαραίτητων για την εκτέλεση των πειραμάτων. Από το ίδιο εργαστήριο θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Αλέξανδρο Σωτηριάδη για τη βοήθειά του σχετικά με τα κύτταρα εντόμων High Five. Για την προμήθεια των ίδιων κυττάρων θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Ιατρού από το ΕΚΕΦ Δημόκριτος. Από το εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής Πατρών, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συναδέλφους μου Γιώργο Λαγουμιντζή, Δήμητρα Καλαμίδα, Γρηγόρη Κόρδα και ιδιαίτερα την Μίνα Γεωργοστάθη για τη βοήθεια, τη συμπαράσταση και τη τεχνογνωσία που μου προσέφεραν. Ξεχωριστά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτορα και φίλο Γιώργο Ματθαιολαμπάκη για την πολύτιμη συμβολή του στα πειράματα Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS) και για την απίστευτη διάθεσή του να με βοηθήσει γενικότερα. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια και τους φίλους μου για την πάσης φύσεως στήριξη που μου προσέφεραν τα δύο αυτά χρόνια. 2

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ...5 1.1 Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ...6 1.1.1 ΕΙΔΗ ΧΗΜΕΙΟΕΛΕΓΧΟΜΕΝΩΝ ΚΑΝΑΛΙΩΝ ΙΟΝΤΩΝ...6 1.1.2 Η ΔΟΜΗ ΤΩΝ Π.Χ.Κ.Ι...9 1.1.3 Η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ...14 1.1.4 ΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΣΔΕΝΟΝΤΑΙ ΣΤΟΥΣ nachrs ΚΑΙ Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥΣ...16 1.1.4.1 ΑΓΩΝΙΣΤΕΣ...17 1.1.4.2 ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ...18 1.1.4.3 ΜΕΡΙΚΟΙ ΑΓΩΝΙΣΤΕΣ...19 1.1.4.4 ΘΕΣΕΙΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΑΓΩΝΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΩΝ...20 1.2 Η ΒΑΡΙΑ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ...21 1.2.1 ΙΣΤΟΡΙΑ...21 1.2.2 ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ...23 1.2.3 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ, ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ...26 1.2.4 ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΡΑΞΗ...28 1.2.5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ...30 1.3 ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ...31 1.3.1 Η ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ...31 1.3.2 Η ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ...32 1.3.3 ΕΙΔΗ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΩΝ...34 1.3.4 ΕΙΔΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ...36 1.3.5 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ...38 1.3.6 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ-ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ...40 1.3.7 Η ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ...42 1.3.8 ΧΡΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ...43 1.4 ΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Pichia Pastoris ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five...45 1.4.1 ΤΟ ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Pichia pastoris...45 1.4.2 ΤΟ ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five...47 1.5 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...48 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...50 2.1 ΥΛΙΚΑ...51 2.1.1 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ...51 2.1.3 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ...52 2.1.4 ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ...53 2.1.5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ...53 2.1.6 ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ...53 2.2 ΜΕΘΟΔΟΙ...57 2.2.1 ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ ΑΠΟ ΤΑ ΗΛΕΚΤΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΑ ΤΟΥ ΨΑΡΙΟΥ Torpedo californica...57 2.2.2 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΦΕΡΟΥΝ T. nachr...58 2.2.3 ΜΕΘΟΔΟΣ STEWART...59 3

2.2.4 ΕΝΖΥΜΟΣΥΝΔΕΤΗ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ (ELISA)...60 2.2.5 ΜΕΤΡΗΣΗ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ Ι 125 -ΜΠΟΥΓΚΑΡΟΤΟΞΙΝΗΣ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ (FILTER ASSAY)...62 2.2.6 ΒΙΟΚΑΤΑΝΟΜΕΣ...63 2.2.7 ΜΕΘΟΔΟΣ BRADFORD...64 2.2.8 ΕΤΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΦΡΑΣΗ, ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ ECD ΤΗΣ a1 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΜΥΪΚΟΥ ΤΥΠΟΥ nachr, ΣΤΟΝ ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΑ Pichia pastoris...65 2.2.9 ΕΤΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ ECD ΤΗΣ α1 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ, ΜΥΪΚΟΥ ΤΥΠΟΥ nachr, ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five...67 2.2.10 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ...68 2.2.11 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ...69 2.2.12 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΣΕ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ (SDS PAGE)...70 2.2.13 ΡΑΔΙΟΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ...71 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...72 Α ΜΕΡΟΣ...73 3.A.1 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ T. nachr ΣΤΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ, ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ...74 3.A.2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ME T. nachr...75 3.A.3 ΑΠΕΙΚΟΝΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΜΕ T. nachr ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΑΤΟΜΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΕΩΝ...77 3.A.4 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ in vitro ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ mαb35 ΑΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕ T. nachr...78 3.A.5 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ in vitro ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ I 125 -α-bgt ΑΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕ T. nachr...86 3.A.6 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ in vivo ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ mαb35 ΑΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕ T. nachr...93 3.A.7 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΟΚΑΤΑΝΟΜΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΜΕ T. nachr ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ...95 Β ΜΕΡΟΣ...99 3.B.1 ΕΚΦΡΑΣΗ, ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ECD ΤΗΣ α1 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΜΥΪΚΟΥ nachr ΣΤΟ ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Pichia pastoris ΚΑΙ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five...99 3.B.2 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ I 125 -α-bgt ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ α1 ECDs ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΣΤΗΚΑΝ ΣΕ Pichia pastoris ΚΑΙ High Five...101 3.B.3 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΩΝ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΠΟ ΤΑ Pichia pastoris ΚΑΙ High Five α1 ECDs...102 4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...104 5.1 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...110 5.2 ABSTRACT...113 6 ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΩΝ...116 7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...117 4

1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5

1.1 Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ 1.1.1 ΕΙΔΗ ΧΗΜΕΙΟΕΛΕΓΧΟΜΕΝΩΝ ΚΑΝΑΛΙΩΝ ΙΟΝΤΩΝ Η ρύθμιση της εισόδου ιόντων στο κυτταρόπλασμα είναι μια ζωτικής σημασίας διεργασία για το κύτταρο και τον οργανισμό και συχνά ελέγχεται μέσω καναλιών τα οποία επιτρέπουν τη δίοδο ιόντων όταν προσδένεται σε αυτά κάποιος συγκεκριμένος νευροδιαβιβαστής. Υπάρχουν πολλά είδη χημειοελεγχόμενων καναλιών ιόντων τα οποία ανήκουν στην ίδια υπεροικογένεια και θεωρούνται ότι έχουν προκύψει από το ίδιο προγονικό γονίδιο. Όλα αυτά τα κανάλια αποτελούνται από πέντε υπομονάδεςπρωτεΐνες οι οποίες συμβολίζονται με γράμματα και με αριθμούς, ανάλογα με την σειρά ανακάλυψής τους (Εικόνα 1) Εικόνα 1: Τυπική δομή ενός πενταμερούς χημειοελεγχόμενου διαύλου. Διακρίνονται: (1) Το σημείο πρόσδεσης του αγωνιστή (2) Ο πόρος του διαύλου (3) Το εξωκυτταρικό τμήμα (4) Το διακυτταρικό τμήμα (5) Το κυτταροπλασματικό τμήμα του καναλιού. Οι 5 υπομονάδες που αποτελούν τα κανάλια αυτού του τύπου συμβολίζονται με γράμματα. (Εικόνα από Alberts et al. τροποποιημένη) Τα πενταμερή χημειοελεγχόμενα κανάλια ιόντων (Π.Χ.Κ.Ι.) μπορούν να διακριθούν ανάλογα με το νευροδιαβιβαστή που τα ενεργοποιεί ή τον οργανισμό ή τον ιστό στον οποίο απαντώνται. Έτσι υπάρχουν οι υποδοχείς σεροτονίνης, γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABA), γλυκίνης, ακετυλοχολίνης κ.α. Επίσης για τους νικοτινικούς 6

υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nachrs) έχουμε, για παράδειγμα, τον ανθρώπινο νευρικό υποδοχέα α7 ή τους μυϊκούς (α1) 2 β1εδ (εμβρυϊκός) και (α1) 2 β1γδ (ενήλικος). Στον ανθρώπινο οργανισμό οι (nachr) μεσολαβούν στη διαβίβαση νευρικού ερεθίσματος τόσο στο κεντρικό νευρικό σύστημα όσο και στο αυτόνομο, αλλά και στη νευρομυϊκή σύναψη [Betz et al. (1990), Stroud et al. (1990), Fostieri et al. (2006), Kalamida et al. (2007)]. Μέχρι πριν από λίγα χρόνια ήταν γενικά παραδεκτό ότι τα Π.Χ.Κ.Ι ήταν παρόντα μόνο σε ανώτερους οργανισμούς που διαθέτουν νευρικό σύστημα. Το τελευταίο διάστημα αίσθηση έχει προκαλέσει η ανακάλυψη ενός καναλιού συγγενικού των χημειοελεχγόμενων καναλιών ιόντων που ανήκει στο κυανοβακτήριο Gloeobacter violaceus. Το κανάλι αυτό ενεργοποιείται από την αύξηση της εξωκυττάριας συγκέντρωσης πρωτονίων και έχει 20% ομολογία με τον ανθρώπινο α7 νευρικό nachr [Bocquet et al., (2007)]. Από όλα τα είδη των Π.Χ.Κ.Ι που υπάρχουν, το μεγαλύτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι ανθρώπινοι υποδοχείς ακετυλοχολίνης, σεροτονίνης και γλυκίνης, λόγω της καίριας θέσης που κατέχουν στον οργανισμό και της ενδεχόμενης στοχευσής τους σε θεραπευτικές εφαρμογές. Πολλά υπάρχοντα φάρμακα και πολλά περισσότερα υποψήφια τους στοχεύουν. Παραδείγματα τέτοιων φαρμάκων είναι τα υπνωτικά, αντιψυχωσικά, μυοχαλαρωτικά καθώς και φάρμακα για τη διακοπή του καπνίσματος, ενώ ολοένα και αυξάνεται το ενδιαφέρον για δημιουργία φαρμάκων για νόσους όπως Parkinson και Alzheimer. Η γνώση της στερεοδιαμόρφωσης αυτών των υποδοχέων με την καλύτερη δυνατή ανάλυση, είναι το κλειδί για το σχεδιασμό αγωνιστών και ανταγωνιστών υψηλής εκλεκτικότητας-δραστικότητας. Η παρούσα εργασία θα εστιαστεί στον ανθρώπινο μυϊκό nachr και στον nachr από το ελασματοβράγχιο Torpedo californica. Οι υποδοχείς αυτοί είναι κανάλια ιόντων Να + όπως και όλοι οι nachrs. Οι ανθρώπινοι μυϊκοί nachr είναι δύο ειδών: αυτοί που έχουν τη στοιχειομετρία (α1) 2 β1εδ και είναι ο τύπος που κυριαρχεί στους ενήλικες και όσοι έχουν τη στοιχειομετρία (α1) 2 β1γδ και παρουσιάζεται στα έμβρυα. Στους εξωτερικούς οφθαλμικούς μύες και οι δύο υπότυποι συνυπάρχουν [Horton, (1993)]. Εκτός από μυϊκούς nachrs υπάρχουν και νευρικοί. Οι νευρικοί nachrs διακρίνονται σε ομοπενταμερείς και ετεροπενταμερείς με κυριότερους εκπροσώπους τον (α7) 5 και τους (α4) 2 (β2) 3 και (α3) 2 (β4) 3 αντίστοιχα. Ο τύπος (α4) 2 (β2) 3 απαντάται στον εγκέφαλο, ο τύπος (α3) 2 (β4) 3 στα γάγγλια, ενώ οι (α7) 5 εντοπίζονται και στις δύο περιοχές (Εικόνα 2). 7

Εικόνα 2: Τα είδη των nachr. Μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε μυϊκούς (1,2) και νευρικούς (3-8). Οι τελευταίοι διακρίνονται σε ετερομερείς (3-7) ή ομομερείς (8) (εικόνα τροποποιημένη από Lindstrom, 2000). Ο Torpedo nachr (T. nachr) απαντάται σε μεγάλες σχετικά ποσότητες στα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica (αρκετά mg ανά kg ηλεκτρικών οργάνων). Χρησιμοποιείται σε μελέτες του ανθρώπινου μυϊκού nachr, λόγω της δομικής και λειτουργικής τους ομοιότητας. Η ομολογία σε επίπεδο αμινοξέων μεταξύ των διαφόρων υπομονάδων τους είναι 35-50% [Raftery et al. (1980)] και αν συγκριθούν οι α1 υπομονάδες τους η ομολογία φτάνει το 80% [Hucho et al. (1996)]. Ο T. nachr είναι και αυτός κανάλι ιόντων Να + ενεργοποιούμενο από ακετυλοχολίνη και με παρόμοια στοιχειομετρία υπομονάδων 2(α 1 )βγδ [Karlin et al. (1989)]. Πριν τον προσδιορισμό των cdnas των διαφόρων υπομονάδων και την κατασκευή ανασυνδυασμένων υποδοχέων και τμημάτων τους, [Claudio et al. (1983), Claudio et al. (1989), Noda et al. (1983)], ο nachr αυτός ήταν ο μόνος εκπρόσωπος της υπεροικογένειας των πενταμερών χημειοελεγχόμενων διαύλων ιόντων που μπορούσε να απομονωθεί και να καθαριστεί για περαιτέρω μελέτες. 8

1.1.2 Η ΔΟΜΗ ΤΩΝ Π.Χ.Κ.Ι Τα Π.Χ.Κ.Ι, όπως είδαμε, αποτελούνται από 5 υπομονάδες οι οποίες είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες που διαπερνούν την κυτταροπλασματική μεμβράνη, έχουν ένα υδρόφιλο εξωκυτταρικό τμήμα, ένα υδρόφοβο διαμεμβρανικό και ένα άλλο υδρόφιλο κυτταροπλασματικό τμήμα. Τα πιο ενδιαφέροντα κατάλοιπα είναι τα συντηρημένα μεταξύ των διαφόρων υπομονάδων, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι σημαντικά για τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Όλες οι υπομονάδες έχουν παρόμοια δομή στο χώρο. Ο προσδιορισμός της διαμόρφωσης των υπομονάδων και των καναλιών στο χώρο αποδεικνύεται δύσκολο εγχείρημα, γιατί είναι ιδιαίτερα δύσκολη η κρυστάλλωση αυτών των αμφίφιλων διαμεμβρανικών, ευκαρυωτικών γλυκοπρωτεϊνών. Έτσι τα πρώτα δεδομένα για τη δομή των Π.Χ.Κ.Ι έδιναν πληροφορίες κυρίως για τη δευτεροταγή δομή των υποδοχέων και προέκυψαν από φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού, συντονισμό Raman [Hucho et al., (1996)] και από υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier. Επειδή η έκφραση, η απομόνωση και ο καθαρισμός, περιλαμβάνουν πολλά και δύσκολα στάδια, ο πρώτος nachr που μελετήθηκε ήταν ο Torpedo. Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών δεν μπόρεσαν να συμφωνήσουν σε τελικές τιμές γιατί τα παρασκευάσματα διέφεραν μεταξύ τους, αλλά κυρίως γιατί οι παραπάνω τεχνικές δεν ήταν άμεσα συγκρίσιμες. Όμως όλες κατέληξαν ότι κατά το μεγαλύτερο μέρος τους οι nachr αποτελούνται από α-έλικες και β-πτυχωτές επιφάνειες. Οι πληροφορίες που έχουμε για τη στερεοδιαμόρφωση των υπομονάδων ή και ολόκληρων των καναλιών αυτών σήμερα προέρχονται κυρίως: Α) Από τη μελέτη ηλεκτρονικής μικροσκοπίας του T. nachr. Η διακριτικότητα που επετεύχθη με την τεχνική αυτή ήταν αρχικά 9Å [Unwin et al. (1993)] και αργότερα 4Ǻ [Unwin et al., (2005), Miyazawa et al., (2003)]. Β) Από την έκφραση και κρυστάλλωση των ομόλογων πρωτεϊνών που δεσμεύουν ακετυλοχολίνη πρώτα από το σαλιγκάρι του γλυκού νερού Limnaea stagnalis με διακριτικότητα 2,7Å και αργότερα από άλλα είδη σαλιγκαριών όπως το Bulinus truncatus και το Aplysia californica με παρόμοια διακριτικότητα [Patrick et al. (2005), Hansen et al. (2005)]. Επίσης την ίδια χρονική περίοδο εμφανίστηκαν και οι αντίστοιχες κρυσταλλικές δομές των παραπάνω καναλιών σε σύμπλοκα με ορισμένους αγωνιστές και ανταγωνιστές [Patrick et al. (2004), Hansen et al. (2004), 9

Ulens et al. (2006)]. Οι δομές αυτών των καναλιών μοιάζουν με αυτές του ανθρώπινου και του T. nachr. Γ) Τέλος πρόσφατα δημοσιεύτηκε η πρώτη κρυσταλλική δομή τμήματος nachr από θηλαστικό και συγκεκριμένα το ανασυνδυασμένο εξωκυτταρικό τμήμα (ECD) της α1 υπομονάδας ποντικού σε σύμπλοκο με μπουγκαροτοξίνη [Dellisanti et al. (2007)]. Οι εργασίες αυτές άνοιξαν το δρόμο για τη δημιουργία ολοένα και ακριβέστερων μοντέλων της δομής των διαφόρων υποδοχέων της οικογένειας των nachr. Τα μοντέλα αυτά δείχνουν ότι κάθε υπομονάδα αποτελείται από: (α) το ECD το οποίο είναι το υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο της υπομονάδας μήκους 210-220 αμινοξέων. Σε αυτή την περιοχή προσδένονται οι αγωνιστές και οι ανταγωνιστές των υποδοχέων, (β) τέσσερις μικρές υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές, με διαμόρφωση α-έλικας, που συμβολίζονται συνήθως με Μ1-Μ4 (15-20 αμινοξέων), (γ) δύο πολύ μικρές υδρόφιλες θηλιές που ενώνουν τις περιοχές Μ1-Μ2 και Μ2-Μ3 μεταξύ τους και μια μεγαλύτερη θηλιά 100-150 αμινοξέων που ενώνει τις Μ3-Μ4 περιοχές (δ) το υδρόφιλο καρβοξυτελικό άκρο της υπομονάδας, μήκους 4-28 αμινοξέα. (Εικόνα 3). Εικόνα 3: Μια τυπική υπομονάδα πενταμερούς χημειοελεγχόμενου καναλιού ιόντων. Διακρίνονται: (α) το μεγάλο εξωκυτταρικό τμήμα, (β) οι υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές Μ1-Μ4, (γ) η μεγάλη κυτταροπλασματική θηλιά [Bocquet et al. (2007)]. Χαρακτηριστικά στοιχεία στην τριτοταγή δομή των υπομονάδων των nachr είναι οι δέκα β-πτυχωτές δομές, η α-έλικα του αμινοτελικού άκρου, η Cys loop και η double Cys. Η α-έλικα παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόσδεση αγωνιστών και ανταγωνιστών, ενώ οι 10 β-πτυχωτές δομές σχηματίζουν δύο υδρόφοβους πυρήνες οι οποίοι σταθεροποιούν την υπομονάδα. Η δομή Cys loop σχηματίζεται από το δισουλφιδικό δεσμό που δημιουργείται μεταξύ των συντηρημένων κυστεϊνών 128 και 10

142 στην α-υπομονάδα του T. nachr. Η θηλιά αυτή των 15 αμινοξέων [Stroud et al. (1990)] περιέχει 13 τα οποία είναι αρκετά συντηρημένα [Ortells et al. (1995)]. Γι αυτό τα πενταμερή χημειοελεγχόμενα κανάλια ιόντων ονομάζονται και Cys-loop receptors [Karlin et al. (1995)]. Η δομή double Cys είναι ένας ακόμα δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ των κυστεϊνών που αντιστοιχούν στα κατάλοιπα 192 και 193 του T. nachr. Οι Cys-loop και η double Cys παίζουν σημαντικό ρόλο στην ένωση των διαφόρων υπομονάδων για τον τελικό σχηματισμό του καναλιού [Εικόνα 4]. Εικόνα 4: Η τριτοταγής δομή μιας τυπικής υπομονάδας Π.Χ.Κ.Ι. Διακρίνονται: (Α) Το αμινοτελικό άκρο και (α1) η α-έλικα κοντά σε αυτό. (β1-β10) οι δέκα β-πτυχωτές δομές. Οι δομές Cys loop και double Cys και (Κ) το καρβοξυτελικό άκρο της υπομονάδας [KatjusÏa et al. (2001)]. Οι υπομονάδες των υποδοχέων ακετυλοχολίνης είναι γλυκοπρωτεΐνες. Η γλυκοζυλίωση σε όλα τα είδη των υπομονάδων γίνεται στο αμινοτελικό τους άκρο. Ο αριθμός των αμινοξέων που θα γλυκοζυλιωθούν και η ακριβή θέση γλυκοζιλίωσης εξαρτάται από τη συγκεκριμένη υπομονάδα. Η γλυκοζυλίωση συνήθως γίνεται με προσθήκη μανόζης και λιγότερο συχνά σιαλικών οξέων. Η σημασία της γλυκοζιλίωσης αποδεικνύεται και από το γεγονός ότι απογλυκοζυλιωμένες α- υπομονάδες παρουσιάζουν πολύ μικρότερη συγγένεια για την μπουγγαροτοξίνη σε 11

σχέση με τις αντίστοιχες μη-απογλυκοζυλιωμένες. Από τα προηγούμενα προκύπτει και ένας από τους λόγους για τους οποίους τα ευκαρυωτικά συστήματα έκφρασης προτιμήθηκαν κατά καιρούς για την παραγωγή ανασυνδυασμένων nachrs, καθώς μόνο αυτά μπορούν να γλυκοζυλιώνονται. Όμως το ζήτημα που προέκυπτε πάντα ήταν το κατά πόσο η γλυκοζυλίωση γινόταν ομοιογενώς και πόσο έμοιαζε με αυτή που πραγματικά υφίστανται οι υποδοχείς στον ανθρώπινο οργανισμό [Poulter et al. (1989), Nomoto et al. (1986), Strecker et al. (1994), Shoji et al. (1992)]. Τα μοντέλα δείχνουν ότι σε επίπεδο nachr, οι πέντε υπομονάδες σχηματίζουν ένα κυλινδρικό διαμεμβρανικό κανάλι το οποίο έχει ένα κυτταροπλασματικό και ένα εξωκυτταρικό τμήμα τα οποία είναι υδρόφιλα (Εικόνα 5), καθώς και ένα υδρόφοβο διαμεμβρανικό τμήμα. Το κανάλι αυτό έχει υψηλή συμμετρία και ύψος 120Å, διάμετρο 80Å και διάμετρο πόρου 20Å. Ο πόρος του καναλιού σχηματίζεται κυρίως από την Μ2 έλικα της κάθε υπομονάδας. Κάθε υπομονάδα συνδέεται με τις διπλανές τις με μια μεγάλη και μια μικρή πλευρά. Οι θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης είναι δύο και σχηματίζονται από τις δυο α1 υπομονάδες και τις γειτονικές τους γ και δ [Εικόνες 1, 6] (Changeux et al, 1993). Εικόνα 5: Κάτοψη του εξωκυτταρικού και του κυτταροπλασματικού τμήματος του T. nachr. Με μπλε παριστάνονται οι θετικά φορτισμένες περιοχές και με κόκκινο οι αρνητικά, ενώ η γαλάζια σφαίρα έχει αναλογικά το ίδιο μέγεθος με ένα κατιόν Καλίου [Unwin et al. 2005]. 12

Εικόνα 6: Ο αθρώπινος μυϊκός nachr. Αποτελείται από τις υπομονάδες (α1) 2 β1εδ οι οποίες σχηματίζουν ένα κανάλι τα τοιχώματα του οποίου είναι οι Μ2 έλικες των υπομονάδων (Τροποποιημένο από Changeux et al, 1993). 13

1.1.3 Η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Η λειτουργία των nachr είναι να ρυθμίζουν την είσοδο ιόντων νατρίου στο κυτταρόπλασμα, ανάλογα με τα χημικά σήματα που λαμβάνουν από τον οργανισμό. Η επικρατούσα στερεοδιαμόρφωση του nachr απουσία ακετυλοχολίνης είναι η κλειστή, όπου δεν επιτρέπεται διέλευση ιόντων. Η πρόσδεση ακετυλοχολίνης προκαλεί αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής με αποτέλεσμα την αύξηση της διαμέτρου του πόρου, τη δίοδο των ιόντων νατρίου και τις ακόλουθες βιοχημικές μεταβολές (Εικόνα 7). Αμέσως μετά τη διάνοιξη του διαύλου ακολουθεί ένα χρονικό διάστημα 20μs κατά το οποίο το κανάλι δεν μπορεί να διεγερθεί ξανά. Τα ιόντα μπορούν και διασχίζουν τον υποδοχέα από έναν υδρόφιλο πόρο που σχηματίζεται στο εσωτερικό του από τις έλικες των Μ2 τμημάτων των 5 υπομονάδων του, ο οποίος όταν ανοίγει έχει διάμετρο στο στενότερο σημείο του μόλις 7 Å [Auerbach et al. (1993), Katz et al. (1957), Sakmann et al. (1980), Neubig et al. (1982), Heidmann et al. (1983), Jackson et al. (1989), Hess et al. (1993), Colquhoun et al. (1985)]. α β γ Εικόνα 7: Οι αλλαγές στη διαμόρφωση του υποδοχέα. α) Φάση ηρεμίας β) Ενεργοποίηση από πρόσδεση αγωνιστή γ) Απενεργοποίηση (http://bio1151b.nicerweb.com/locked/media/ch11/ion_channels.html) 14

Το διαμεμβρανικό τμήμα του καναλιού. Παρουσιάζει απόλυτη συμμετρία ενώ οι υπομονάδες στην περιοχή αυτή είναι πολύ κοντά η μια στην άλλη. Οι παραπάνω ιδιότητες οφείλονται σε συγκεκριμένα αμινοξέα που αποτελούν τις έλικες των Μ2 τμημάτων τα οποία είναι υδρόφοβα και ογκώδη και έρχονται σε στενή επαφή. Τα αμινοξέα που αλληλεπιδρούν είναι η λευκίνη 251 με τη γειτονική της αλανίνη ή σερίνη και η βαλίνη ή ισολευκίνη 255 με τη γειτονική της φαινυλαλανίνη [Miyazawa et al. (2003)]. Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης στη νευρομυϊκή σύναψη για να λειτουργήσουν πρέπει να είναι κατά ομάδες (clusters). Για να σχηματιστούν τα clusters η ραψίνη σχηματίζει σύμπλοκο με τους υποδοχείς σε αναλογία 1:1 [LaRochelle et al. (1986), Sealock et al. (1982)]. Η ραψίνη είναι προσκολλημένη στη βάση του κυτταροπλασματικού τμήματος του υποδοχέα και απελευθερώνεται πειραματικά σε αλκαλικό περιβάλλον [Frail et al. (1988), Neubig et al. (1979)]. Η ραψίνη θεωρείται επίσης ότι συνδέει τους υποδοχείς με τον κυτταροσκελετό [Froehner et al. (1990), Phillips et al. (1991), Phillips et al. (1993), Apel et al. (1995)]. Εκτός από την ραψίνη, σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό των clusters και την πρόσδεση στον κυτταροσκελετό έχουν και άλλες πρωτεΐνες όπως η MuSK (Muscle- Specific Kinase), η RATL (Rapsin Associated Transmembrane Linker) η Αγγρίνη (Agrin) και η MASC (Myotube Associated Specificity Component). Εικόνα 8: Σχηματική αναπαράσταση του nachr με τις πρωτεΐνες που τον συνοδεύουν. Η ραψίνη σχηματίζει σύμπλοκο με το πενταμερές του υποδοχέα και τον συνδέει με τη RATL. Αυτή συνδέεται με την MuSK η οποία με τη σειρά της συνδέεται με την Agrin που τέλος συνδέεται με την MASK. Δύο ρόλοι των συνοδών αυτών πρωτεϊνών είναι ο σχηματισμός Clusters υποδοχέων και η ένωση με τον κυτταροσκελλετό (Fostieri et al. 2006). 15

1.1.4 ΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΣΔΕΝΟΝΤΑΙ ΣΤΟΥΣ nachrs ΚΑΙ Η ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥΣ Υπάρχουν πολλά μόρια που προσδένονται στους nachrs και αρκετά συστήματα ταξινόμησής τους. Το μοναδικό μόριο που εκκρίνει ο ανθρώπινος οργανισμός είναι ο αγωνιστής ακετυλοχολίνη η οποία όταν επιδρά σε νικοτινικούς υποδοχείς προκαλεί μυϊκή σύσπαση (Εικόνα 9). Τα υπόλοιπα μόρια είναι είτε φυσικά προϊόντα, είτε χημικές ενώσεις, τα οποία δρουν είτε σαν αγωνιστές, είτε σαν ανταγωνιστές, συναγωνιστικοί ή μη. Εικόνα 9: Μοντέλο της πρόσδεσης ακετυλοχολίνης στον ανθρώπινο μυϊκό nachr. Τα περισσότερα αμινοξέα ανήκουν στην α υπομονάδα. (Εικόνα από http://mayoresearch.mayo.edu/mayo/research/receptor_biology) 16

1.1.4.1 ΑΓΩΝΙΣΤΕΣ Οι αγωνιστές είναι μόρια που προκαλούν ενεργοποίηση του καναλιού, τα οποία μπορεί να δρουν είτε προσδενόμενα στην ίδια περιοχή που προσδένεται η ακετυλοχολίνη, με χαρακτηριστικό παράδειγμα τη νικοτίνη, είτε να δρουν προσδενόμενα σε άλλες περιοχές του υποδοχέα επάγοντας τη δράση τους αλλοστερικά. Νικοτίνη: Πρόκειται για αλκαλοειδές από το φυτό Nicotiana tabacum. Είναι εκπολωτικό των γαγγλίων, προκαλώντας έμμεσα αύξηση της αρτηριακής πίεσης. Έχει επίσης δράση και στο κεντρικό νευρικό σύστημα προκαλώντας ευφορία και εξάρτηση, γι αυτό και έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον πολλών ερευνών για τη διερεύνηση της δυνατότητας παρασκευής φαρμάκων για τη διακοπή του καπνίσματος. Προσδένεται σε μυϊκούς nachrs καθώς και σε ορισμένους νευρικούς. Συγκεκριμένα προσδένεται με μεγαλύτερη συγγένεια σε νευρικούς υποδοχείς και ειδικότερα στους ομοπενταμερείς [Auerbach et al., (1993)](Εικόνα 10). Επιβατιδίνη: Πρόκειται για φυσικό προϊόν που απομονώθηκε από το δέρμα του βατράχου Epipedobates tricolor. Έχει μεγάλη συγγένεια με όλους τους νευρικούς υποδοχείς ακετυλοχολίνης. Προσπάθειες για δημιουργία αναλόγων με φαρμακευτικές προοπτικές είναι σε εξέλιξη. Καρβαμυλοχολίνη: Χημικό μόριο που έχει δράση αγωνιστή τόσο για νικοτινικούς όσο και για μουσκαρινικούς υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (Εικόνα 10). 17

1.1.4.2 ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ Πρόκειται για μόρια που απενεργοποιούν τον nachr, είτε αποκλείοντας την ακετυλοχολίνη από την θέση πρόσδεσής της, όπως η α-μπουγκαροτοξίνη, η α-τουβοκουραρίνη και η μεθυλοκακονιτίνη (συναγωνιστικοί ανταγωνιστές), είτε προσδενόμενα σε άλλες θέσεις και δρώντας με τρόπο αλλοστερικό, όπως η γκαλαμίνη. α-μπουγκαροτοξίνη: Είναι συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicinctus. Έχει την ιδιότητα να παραλύει και να προκαλεί, μαζί με άλλα συστατικά, το θάνατο του θηράματος. Η α-μπουγκαροτοξίνη είναι ένα πολυπεπτίδιο που αποτελείται από 74 αμινοξέα και ανταγωνίζεται συναγωνιστικά την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης. Το μόριο αυτό προσδένεται σε πολλούς νευρικούς nachr, αλλά έχει τη μέγιστη συγγένεια για τους μυϊκούς nachrs [Karlin et al. (1986), Arias et al. (1997)]. α-τουβοκουραρίνη: Είναι φυσικό προϊόν, συστατικό του κουράριου το οποίο παράγεται από το φυτό Chondrodendron tomentosum. Χρησιμοποιήθηκε και χρησιμοποιείται ακόμα από ιθαγενείς του Αμαζονίου για να παραλύουν τα θηράματά τους, καθώς αποκλείει συναγωνιστικά τους μυϊκούς nachrs. Στη σύγχρονη θεραπευτική χρησιμοποιείται ως μυοχαλαρωτικό στην αναισθησία, μειώνοντας έτσι τη δόση του αναισθητικού που απαιτείται. Εκτός από τους μυϊκούς nachrs, η α-τουβοκουραρίνη προσδένεται και σε κάποιους νευρικούς (Εικόνα 10). Μεθυλοκακονιτίνη: Αποκλείει συναγωνιστικά τον α7 νευρικό υποδοχέα [Palma et al. (1996)]. Γκαλαμίνη: Ανήκει στους μη συναγωνιστικούς (αλλοστερικούς) ανταγωνιστές του μυϊκούς nachrs, ενώ δεν προσδένεται σε νευρικούς nachrs (Εικόνα 11). 18

1.1.4.3 ΜΕΡΙΚΟΙ ΑΓΩΝΙΣΤΕΣ Τα μόρια που ανήκουν στην κατηγορία αυτή δρουν ανάλογα με την περίπτωση τόσο ως αγωνιστές όσο και ως ανταγωνιστές. Ένας εκπρόσωπος της κατηγορίας αυτής είναι η κυτισίνη [Papke, (1994)], που προσδένεται με διαφορετική συγγένεια σε διαφόρους ετεροπενταμερείς νευρικούς nachrs. A B Εικόνα 10. Α) Το μόριο της Νικοτίνης. B) Το μόριο της Tουβοκουραρίνης. Αγωνιστής και ανταγωνιστής αντιστοίχως των nachrs (Από http://en.wikipedia.org/wiki/nicotine) A B Εικόνα 11. Α) Το μόριο της Γκαλαμίνης. Β) Το μόριο της Καρβαμυλοχολίνης. Ανταγωνιστής και αγωνιστής αντιστοίχως των nachrs (Από http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/productdetail) 19

1.1.4.4. ΘΕΣΕΙΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΑΓΩΝΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΩΝ Η αρχική εκτίμηση για το ότι η θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης ήταν αποκλειστικά στην α υπομονάδα γρήγορα εγκαταλείφθηκε, καθώς εμφανίστηκαν μελέτες που έδειχναν ότι η θέση αυτή σχηματίζεται από την α και από μια γειτονική υπομονάδα (Εικόνες 1 και 5) [Karlin et al. (1995), Kurosaki et al. (1987)]. Στις μελέτες αυτές αναδείχθηκε ο ρόλος αρωματικών και υδρόφοβων καταλοίπων και ιδιαίτερα του συντηρημένου δισουλφιδικού δεσμού ανάμεσα στις β9 και β10 πτυχωτές δομές [Kao et al. (1984)]. Επίσης αναδείχθηκε και ο ρόλος 4 ακόμα συντηρημένων καταλοίπων των Tyr93, Trp149, Tyr190 και Tyr198 στην α υπομονάδα. Όσο για τις γ και δ υπομονάδες σημαντικά κατάλοιπα βρέθηκαν να είναι τα Asp174 και Trp55 για την πρώτη και τα Asp180, Trp57 και Glu189 για τη δεύτερη. Η παραπάνω αρίθμηση αφορά τον T. nachr [Dennis et al. (1988), Abramson et al. (1989), Galzi et al. (1990), Cohen et al. (1991), Middleton et al. (1991), Mishina et al. (1985)]. 20

1.2 Η ΒΑΡΙΑ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ 1.2.1 ΙΣΤΟΡΙΑ Η μελέτη του ανθρωπίνου μυϊκού nachr έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς το κανάλι αυτό εκτός από στόχος φαρμάκων είναι ταυτόχρονα και στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος στην περίπτωση της νόσου βαριά μυασθένεια. Η πρώτη περιγραφή της νόσου έγινε από το Βρετανό ιατρό Thomas Willis το 1672, ο οποίος περιέγραψε την κλινική περίπτωση ασθενούς με μόνιμη κατάσταση μυϊκής αδυναμίας. Παρατήρησε επίσης ότι η ένταση των συμπτωμάτων δεν ήταν πάντοτε η ίδια, αλλά η κλινική του κατάσταση εμφάνιζε περιόδους ύφεσης και επιδείνωσης. Η πρώτη εμπεριστατωμένη περιγραφή θεωρείται ότι έγινε από τον Γάλλο ιατρό Wilhem Erb δύο αιώνες αργότερα. Το όνομα της νόσου οφείλεται στον Friedrich Jolly ο οποίος το 1895 περιέγραψε σε ένα επιστημονικό συμπόσιο δύο κλινικές περιπτώσεις της νόσου χρησιμοποιώντας τον όρο myasthenia gravis pseudo-paralytica. Τους όρους myasthenia και pseudo-paralytica τους άντλησε από τη δεξαμενή της ελληνικής γλώσσας, ενώ ο όρος gravis είναι λατινικός και σημαίνει βαρύς, οξύς, επιθετικός. Τα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου είχαν περιγραφεί πλήρως μέχρι τα τέλη του 19 ου αιώνα [Erb (1879), Campbell et al. (1900)], ενώ από το 1910 η βαριά μυασθένεια άρχισε να συνδέεται με την παρουσία όγκων στο θύμο αδένα. Περί τα 1930 η αιτία της μυϊκής αδυναμίας στη βαριά μυασθένεια, εντοπίστηκε στην περιοχή της νευρομυϊκής σύναψης. Λίγα χρόνια αργότερα ξεκίνησαν και οι πρώτες προσπάθειες για θεραπεία, με τη χορήγηση αντιχολινεστερασικών φαρμάκων [Walker 1934] οι οποίες οδήγησαν στην καθιέρωσή τους το 1935. Το 1936 πραγματοποιήθηκε η πρώτη εγχείρηση θυμεκτομής και μάλιστα χωρίς να είναι πλήρως κατανοητή η σχέση θυμώματος-βαριάς μυασθένειας [Blalock et al. (1939)]. Τρείς δεκαετίες αργότερα (1960) προτάθηκε η θεωρία της αυτοάνοσης αιτιολογίας της νόσου [Simpson et al 1960, Simpson et al (1977)]. Tη δεκαετία του 1970 αποδείχθηκε πειραματικά ότι η βλάβη εντοπίζεται στις νευρομυϊκές συνάψεις [Engel et al. (1971), Fambrough et al. (1973)]. Το 1973 η μελέτη της βαριάς μυασθένειας πέρασε και σε μοριακό επίπεδο καθώς με τη χρήση νευροτοξινών από το δηλητήριο φιδιών, απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν ποσότητες nachr από τα ηλεκτρικά 21

όργανα του ψαριού Torpedo californica. Oι νευροτοξίνες αυτές, οι οποίες έχουν μεγάλη συγγένεια για τους nachrs, ακινητοποιήθηκαν σε στήλες σεφαρόζης και οι υποδοχείς που απομονώθηκαν ήταν σε ικανή ποσότητα και καθαρότητα ώστε να μπορούν να μελετηθούν με μια σειρά ενόργανων αναλυτικών τεχνικών και έδωσαν τις πρώτες δομικές πληροφορίες για την οικογένεια των nachrs [Patrick et al. (1973)]. Το επόμενο βήμα ήταν η απομόνωση ανθρώπινου μυϊκού nachr με τη βοήθεια του οποίου ανιχνεύθηκαν κυκλοφορούντα αυτοαντισώματα στον ορό μυασθενών καθώς και Τ-λεμφοκύτταρα έναντι του υποδοχέα [Lindstrom et al., (1976), Engel et al. (1984), Lisak et al. (1987), Schonbeck et al. (1990), Lindstrom et al. (1988)]. Επίσης χορήγηση του T. nachr σε κουνέλια οδήγησε σε πρόκληση πειραματικής μυασθένειας [Lindstrom et al. (1976), Engel et al. (1984), Lisak et al. (1987), Lindstrom et al. (1988)] πιστοποιώντας έτσι τις αντιγονικές ιδιότητες του μορίου. Τέλος η χορήγηση αντισωμάτων από ασθενείς σε πειραματόζωα προκάλεσε συμπτώματα παρόμοια με αυτά της μυασθένειας, αποδεικνύοντας έτσι ότι αυτά είναι η βασική αιτία της καταστροφής των nachr στις νευρομυϊκές συνάψεις [Toyka et al. (1975)]. 22

1.2.2 ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ Πειράματα σύγκρισης δειγμάτων μυών από υγιείς και μυασθενικούς, ως προς την ικανότητα να προσδένουν ραδιοσημασμένη α-μπουγκαροτοξίνη, έδειξαν ότι οι δεύτεροι είχαν πολύ λιγότερους nachr σε σχέση με τους πρώτους [Fambrough et al. (1973)], στοιχείο που παρατηρείται και στην πειραματική μυασθένεια, τη νόσο δηλαδή που επάγεται σε διάφορα μοντέλα ζώων. Επιπλέον, βιοψίες προσδιόρισαν το ποσοστό της μείωσης των υποδοχέων στους ασθενείς στο 66% [Pestronk et al. (1985)]. Η έλλειψη αυτή των υποδοχέων κάνει την μεταβίβαση της νευρικής ώσης προβληματική, με αποτέλεσμα τα συμπτώματα της μυασθένειας και μάλιστα με ποσοτική σχέση. Η διαπίστωση της έλλειψης nachr στις βιοψίες, σε συνδυασμό και με άλλες παρατηρήσεις στην περιοχή της μετασυναπτικής μεμβράνης όπως: α) η μείωση του αριθμού των μετασυναπτικών πτυχών, β) η διεύρυνση της συναπτικής σχισμής, γ) η συσσώρευση θραυσμάτων μεμβρανών στο συναπτικό χώρο, [Engel et al. (1976)] δ) η παρουσία αντισωμάτων τύπου IgG και στοιχείων του συμπληρώματος, και ε) η απουσία φαγοκυττάρων ή κυτταροτοξικών κυττάρων [Engel et al. (1977), Engel et al. (1980), Sahashi et al. (1980)] οδήγησαν στη διατύπωση κάποιων πιθανών μηχανισμών με τους οποίους συμβαίνουν οι βλάβες που δίνουν τα χαρακτηριστικά συμπτώματα της μυασθένειας. Οι επικρατέστεροι προτεινόμενοι μηχανισμοί είναι τρείς. Σύμφωνα με τον πρώτο προτεινόμενο μηχανισμό το συμπλήρωμα συνδέεται στα προσδεμένα στους nachr αυτοαντισώματα και ενεργοποιείται προκαλώντας ρήγματα στα μετασυναπτικά κύτταρα με αποτέλεσμα το θάνατό τους. Ο δεύτερος μηχανισμός προτείνει ότι τα προσδεμένα στους nachr αυτοαντισώματα διασυνδέουν γειτονικούς nachrs με επακόλουθη τη γρηγορότερη ενδοκυττάρωση και καταστροφή τους. Σύμφωνα με τον τρίτο μηχανισμό η πρόσδεση των αυτοαντισωμάτων στους nachr παρεμποδίζει την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης με αποτέλεσμα να μην μπορούν να λειτουργήσουν (Εικόνα 12). 23

Εικόνα 12: Προτεινόμενοι Μηχανισμοί πρόκλησης των συμπτωμάτων της βαριάς μυασθένειας. α) Σύνδεση του συμπληρώματος στα προσδεμένα αυτοαντισώματα και πρόκληση ρηγμάτων στα μετασυναπτικά κύττταρα β) Διασύνδεση γειτονικών υποδοχέων και ακολούθως ενδοκυττάρωση γ) Λειτουργική παρεμπόδιση της πρόσδεσης ακετυλοχολίνης (Τροποποιημένο από Kaminski et al. 2006). Εκτός από τους ανοσολογικούς μηχανισμούς που προκαλούν τις βλάβες στις νευρομυϊκές συνάψεις, ενδιαφέρον παρουσιάζουν και οι διάφοροι πιθανοί μηχανισμοί ανοσοποίησης έναντι του μυϊκού nachr. Τα στοιχεία που προέκυψαν μετά από διάφορες έρευνες οδήγησαν στη διατύπωση διαφόρων θεωριών οι οποίες εμπλέκουν περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες προδιάθεσης [Fostieri et al. (2006)]. Σύμφωνα με μια θεωρία, για την ανοσοποίηση έναντι του μυϊκού nachr ευθύνεται κυρίως ο θύμος αδένας, καθώς το 75% των μυασθενικών έχουν διάφορες αλλοιώσεις στο θύμο αδένα. Στο 85% των περιπτώσεων αυτών εμφανίζεται υπερπλασία του αδένα ενώ στο υπόλοιπο 15% θύμωμα. Ως πηγή του αντιγόνου μπορεί να λειτουργούν τα μϋοειδή κύτταρα τα οποία βρίσκονται στον θύμο αδένα, 24

μοιάζουν με τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα και έχουν στην επιφάνειά τους μυϊκούς nachrs. Τα κύτταρα αυτά είναι συνεχώς σε πολύ στενή επαφή με ένα μεγάλο αριθμό αντιγονοπαρουσιαστικών και βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων και έτσι σε περίπτωση κάποιας διαταραχής των λεμφοκυττάρων αυτών η ανοσοποίηση έναντι του nachr είναι ένα ενδεχόμενο. Επίσης σε επιθηλιακά κύτταρα του θύμου από ασθενείς με θύμωμα έχει ανιχνευτεί το πεπτίδιο p153 το οποίο είναι ένα δεκαπεπτίδιο-επίτοπος που μοιάζει με έναν επίτοπο της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr, ο οποίος είναι ικανός να δεσμεύει μονοκλωνικά αντισώματα [Vincent et al. (2001), Castleman et al. (1966), Drachman et al. (1994), Marx et al. (1990)]. Στο θύμο αδένα έχουν βρεθεί Β και Τ λεμφοκύτταρα ειδικά για επιτόπους του μυϊκού nachr. Το γεγονός ότι η θυμεκτομή σε περιπτώσεις μυασθένειας επιφέρει ύφεση της νόσου, επαληθεύει την παραπάνω θεωρία. Μια άλλη θεωρία για την ανοσοποίηση έναντι του nachr έχει να κάνει με ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος από αντιγόνα του περιβάλλοντος τα οποία έχουν κοινούς επιτόπους με τον nachr. Η διαδικασία αυτή καλείται μοριακή μίμηση. Παραδείγματα τέτοιων αντιγόνων είναι ένας επίτοπος του ιού του απλού έρπητα καθώς και διάφοροι επίτοποι μερικών βακτηρίων [Dieperink et al. (1989), Schwimmbeck et al. (1989), Stefansson et al. (1985)]. Ο μυϊκός nachr δεν είναι το μόνο αντιγόνο που εμπλέκεται στη μυασθένεια. Από όλους τους ασθενείς με μυασθένεια, το 85% έχει στον ορό κυκλοφορούντα αυτοαντισώματα έναντι του nachr τα οποία και ανιχνεύονται. Οι υπόλοιποι ασθενείς ονομάστηκαν αρχικά ορο-αρνητικοί γιατί δεν ανιχνεύονταν αυτοαντισώματα στον ορό τους. Αργότερα αποδείχθηκε ότι αυτοί οι ασθενείς είτε έχουν αντισώματα έναντι του nachr σε τίτλο κάτω από το ανιχνεύσιμο όριο, είτε τα αντισώματα αυτά στοχεύουν πρωτεΐνες που γειτνιάζουν με τον nachr και συνεισφέρουν στη λειτουργία του. Παράδειγμα τέτοιων πρωτεϊνών είναι η Muscle- Specific Kinase (MuSK) [Hoch et al. (2001)]. 25

1.2.3 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ, ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Το χαρακτηριστικότερο σύμπτωμα στη βαριά μυασθένεια είναι η μυϊκή αδυναμία που συνοδεύεται από την εύκολη κόπωση, λόγω των βλαβών που παρατηρούνται στη νευρομυϊκή σύναψη. Η μυϊκή αδυναμία μπορεί είτε να είναι γενική σε όλο το σώμα, είτε εντοπισμένη σε πολύ συγκεκριμένους μύες όπως τους οφθαλμικούς, του προσώπου και των άκρων. Έχει καταγραφεί κλινική περίπτωση με την αδυναμία εντοπισμένη στο λάρυγγα. [Kanemaru et al. (2007)]. Τα πρώτα συνήθη κλινικά συμπτώματα τα οποία εμφανίζονται κατά την διάρκεια των δύο πρώτων ετών της εξέλιξης της νόσου είναι η βλεφαρόπτωση και η διπλωπία. Στη συνέχεια, στους περισσότερους ασθενείς, η νόσους αρχίζει να εξαπλώνεται σταδιακά σε πολλούς μύες του σώματος προκαλώντας αίσθημα γενικευμένης αδυναμίας. Κατά περίπτωση τα συμπτώματα μπορεί να είναι από ήπια μέχρι πολύ σοβαρά. Αν η αδυναμία προσβάλει τους αναπνευστικούς μύες, τότε η κατάσταση γίνεται επικίνδυνη και μπορεί ο ασθενής να καταλήξει [Grob et al. (1987) ]. Η συχνότητα της βαριάς μυασθένειας είναι 125-400 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο πληθυσμού. Μπορούμε να κατατάξουμε το χρόνο έναρξης της νόσου σε τρείς βασικές περιόδους: Την πρώιμη, όταν η νόσος εμφανίζεται πριν την ηλικία των 40 ετών. Αυτή αφορά κυρίως γυναίκες και συνήθως συμβαδίζει με υπερπλασία του θύμου αδένα. Την όψιμη, όταν η νόσος κάνει την εμφάνισή της μετά την ηλικία των 40 ετών. Αυτό συμβαίνει συχνότερα σε άνδρες και συνήθως ο θύμος αδένας είναι φυσιολογικός ή και ατροφικός. Την περίοδο μεταξύ 40 και 60 ετών. Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν άνδρες και γυναίκες στο ίδιο ποσοστό, ενώ συχνά η νόσος σχετίζεται και με θύμωμα. [Poulas et al (2000), Poulas et al (2001), Drachman et al (1998), Fostieri et al (2006)] Οι πρώτες ενδείξεις για τη διάγνωση της βαριάς μυασθένειας είναι το ιστορικό αδυναμίας και εύκολης μυϊκής κόπωσης. Ακολουθεί ο ραδιοανοσολογικός έλεγχος σε δείγμα ορού για να διαπιστωθεί η ύπαρξη αντισωμάτων έναντι του nachr ή της MuSK. Για την ανίχνευση των αντισωμάτων χρησιμοποιείται ραδιοσημασμένος ανθρώπινος μυϊκός nachr για αντισώματα έναντι του υποδοχέα ή ραδιοσημασμένη 26

MuSK για αντισώματα έναντι της MuSK. Αν ασθενής με συμπτώματα χρόνιας μυϊκής αδυναμίας και εύκολης κόπωσης δώσει θετικά δείγματα για κάποιο από τα παραπάνω αντιγόνα τότε τίθεται η διάγνωση της βαριάς μυασθένειας [Vincent et al (1985), Vincent et al (2003), Lindstrom et al 1976, Appel et al 1977]. Άλλη τεχνική που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση της βαριάς μυασθένειας είναι η χορήγηση κάποιου αντιχολινεστερασικού φαρμάκου υπερβραχείας δράσης, όπως είναι το εδροφώνιο. Το φάρμακο αυτό αναστέλλει τη δράση του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση, το οποίο αποικοδομεί την ακετυλοχολίνη που βρίσκεται στη χασματική σύνδεση, βοηθώντας έτσι να ολοκληρωθεί μια μυϊκή σύσπαση και δίνοντας στον μυ τον απαραίτητο χρόνο να ανακάμψει για την επόμενη. Εφόσον ο ασθενής πάσχει από βαριά μυασθένεια, η πρόσκαιρη αναστολή της λειτουργίας του ενζύμου αυτού επιφέρει μια στιγμιαία βελτίωση των συμπτωμάτων λόγω της αύξησης της συγκέντρωσης της ακετυλοχολίνης στη νευρομυϊκή σύναψη [Daroff and Seybold, 1986]. Τέλος ως διαγνωστική δοκιμασία της βαριάς μυασθένειας έχει χρησιμοποιηθεί και η μέθοδος του επαναληπτικού ερεθισμού ενός νεύρου. Σε αυτή τη μέθοδο εφαρμόζονται ηλεκτρικοί παλμοί με συχνότητα περίπου 3/δευτερόλεπτο και καταγράφονται τα δυναμικά ενέργειας στην επιφάνεια του μυός. Στους φυσιολογικούς μύες το πλάτος των δυναμικών ενέργειας μικραίνει πολύ λίγο κατά τη διάρκεια της εξέτασης, ενώ στους μυασθενικούς η μείωση είναι σημαντικά μεγαλύτερη και πολύ γρηγορότερη. Αν η ελάττωση της ηλεκτρικής δραστηριότητας είναι μεγαλύτερη από 15%, τότε η εξέταση θεωρείται θετική για μυασθένεια [Keesey et al (1989)]. 27

1.2.4 ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΡΑΞΗ Μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί και καθιερωθεί διάφορες θεραπείες για τη βαριά μυασθένεια. Όμως δυστυχώς καμία δεν οδηγεί σε πλήρη και μόνιμη ίαση της νόσου αλλά όλες επιβραδύνουν την εξέλιξή της. Οι θεραπείες αυτές είναι οι εξής: Α) Χορήγηση αντιχολινεστερασικών φαρμάκων. Η χορήγηση αναστολέων της ακετυλοχολινεστεράσης και η αύξηση της συγκέντρωσης της ακετυλοχολίνης που ακολουθεί, προκαλεί παροδική υποχώρηση των συμπτωμάτων της μυασθένειας. Το πρόβλημα με αυτή τη θεραπεία είναι ότι καταπολεμά τα συμπτώματα και όχι την αιτία της νόσου. Συχνά, μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, οι υποδοχείς ακετυλοχολίνης μειώνονται περισσότερο και ο ασθενής παύει να αποκρίνεται ικανοποιητικά στη θεραπεία [Munsat TL. (1984)]. Β) Θυμεκτομή. Δεδομένης της στενότατης σχέσης του θύμου αδένα με τη βαριά μυασθένεια, η θυμεκτομή προκαλεί συνήθως ύφεση των συμπτωμάτων. Όμως γενικά ο θύμος αδένας είναι ένα σημαντικό κομμάτι του ανοσοποιητικού συστήματος καθώς είναι το κέντρο όπου τα Τ-λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται και ωριμάζουν, οπότε σε περίπτωση που ο αδένας αυτός δεν νοσεί (π.χ. θύμωμα) συνίσταται να μην αφαιρείται [Jaretzki A., (2004)]. Γ) Χορήγηση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων. Η χορήγηση ανοσοκατασταλτικών ουσιών είναι αποτελεσματική γιατί μειώνει τον αριθμό των B και Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων και την παραγωγή των αυτοαντισωμάτων έναντι του υποδοχέα. Όμως τα φάρμακα αυτά προκαλούν γενική ανοσοκαταστολή, καθιστώντας τον οργανισμό πιο ευάλωτο σε λοιμώξεις. Δ) Πλασμαφαίρεση. Η θεραπεία αυτή συνίσταται στην απομάκρυνση, ανά χρονικά διαστήματα της τάξεως του μήνα, ενός μεγάλου ποσοστού (της τάξεως του 50%) του ορού του ασθενούς με αποτέλεσμα την απομάκρυνση και ενός μεγάλου ποσοστού των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων. Η μείωση των αυτοαντισωμάτων έχει ως αποτέλεσμα την παροδική ανακούφιση από τα συμπτώματα. Τα κυτταρικά συστατικά του αίματος επιστρέφονται στον ασθενή, ενώ οι μεγάλοι όγκοι ορού που χάνει 28

αντικαθίστανται. Τα μειονεκτήματα της πλασμαφαίρεσης συνίστανται στον αυξημένο κίνδυνο σχηματισμού θρόμβων με ότι αυτό συνεπάγεται και στην απομάκρυνση πολλών χρήσιμων συστατικών του ορού εκτός από τα παθογόνα αυτοαντισώματα [Kuks JB. et al., (1998)]. Ε) Ενδοφλέβια χορήγηση ανοσοσφαιρινών (IVIG). Σε αυτή τη θεραπεία χορηγούνται ενδοφλεβίως σε υψηλές δόσεις της τάξεως των g/kg ασθενούς αντισώματα απομονωμένα από τον ορό ενός μεγάλου αριθμού υγιών δοτών. Αυτή η θεραπεία δεν χρησιμοποιείται μόνο στη βαριά μυασθένεια, αλλά σε μια σειρά αυτοάνοσων νοσημάτων όπου οι βλάβες στον οργανισμό προκαλούνται από κυκλοφορούντα αυτοαντισώματα. Οι μηχανισμοί δράσης είναι κοινοί. Αν και δεν είναι καλά εξακριβωμένοι μπορεί να περιλαμβάνουν εξουδετέρωση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων από αντι-ιδιοτυπικά αντισώματα του μείγματος των χορηγουμένων ανοσοσφαιρινών. Επίσης η υψηλή συγκέντρωση ανοσοσφαιρινών που επιτυγχάνεται στον οργανισμό με αυτή τη θεραπεία μπορεί να δεσμεύει τα συστατικά του συμπληρώματος εμποδίζοντάς τα να συνδεθούν στα προσδεμένα στους στόχους αυτοαντισώματα και να δράσουν βλαπτικά. Τα μειονεκτήματα αυτής της θεραπείας είναι το μεγάλο κόστος της και κάποιοι κίνδυνοι που έχουν να κάνουν με αναφυλακτικές αντιδράσεις και σχηματισμό θρόμβων [Gajdos P., 2007]. 29

1.2.5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ ΤΗΣ ΒΑΡΙΑΣ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Επειδή οι καθιερωμένες θεραπείες της Βαριάς Μυασθένειας δεν εμφανίζουν πλήρες και μόνιμο θεραπευτικό αποτέλεσμα και έχουν σημαντικές παρενέργειες, διάφορες προσπάθειες έχουν γίνει και γίνονται για την εξεύρεση νέων και πιο αποτελεσματικών θεραπειών. Σε αυτές περιλαμβάνονται: Α) Πρόκληση ανοσιακής ανοχής έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με δύο τρόπους: 1) Χορήγηση ECDs του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από το στόμα ή την αναπνευστική οδό. Η επαφή αντιγόνων με τον βλεννογόνο του πεπτικού ή του αναπνευστικού συστήματος οδηγεί σε ανοσιακή ανοχή έναντι του αντιγόνου αυτού. Αυτό μπορεί να συμβεί είτε με χρόνια χορήγηση χαμηλών δόσεων του αντιγόνου είτε και με μια μεγάλη εφάπαξ δόση [Maiti P., 2004]. 2) Πρόκληση ανοσιακής ανοχής με ex vivo θεραπεία τροποποιημένων αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά θα προέρχονται από τους ίδιους τους ασθενείς, θα πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργειες in vitro όπου και θα τροποποιούνται και στη συνέχεια θα χορηγούνται πίσω στους ίδιους τους ασθενείς για να προκαλέσουν ανοσιακή ανοχή [Nencioni A., (2004)]. Β) Προστασία του υποδοχέα με χορήγηση μη παθογόνων τμημάτων αντισωμάτων. Έχει δειχθεί σε in vitro και in vivo πειράματα ότι Fab τμήματα μονοκλωνικών αντισωμάτων, τα οποία δεν έχουν την δυνατότητα να προσδένουν το συμπλήρωμα, μπορούν να προστατεύσουν τον nachr από την πρόσδεση παθογόνων αυτοαντισωμάτων [Sophianos D. and Tzartos S., (1989)]. Γ) Δημιουργία ανοσοπροσροφητικών στηλών με ECDs οι οποίες θα έχουν την ικανότητα να προσδένουν και να απομακρύνουν από την κυκλοφορία εκλεκτικά τα παθογόνα αυτοαντισώματα, αποφεύγοντας έτσι τα μειονεκτήματα της πλασμαφαίρεσης [Tzartos et al. (2008)]. Οι προτεινόμενες αυτές θεραπείες βρίσκονται ακόμα σε πειραματικό στάδιο, αλλά στο μέλλον κάποιες από αυτές μπορεί να προστεθούν στις σημερινές θεραπείες που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη. 30

1.3 ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ 1.3.1 Η ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Τα λιποσώματα είναι μικροσκοπικά κυστίδια φωσφολιπιδικής σύστασης τα οποία περικλείουν μέρος της υδατικής φάσης στην οποία είναι εναιωρημένα. Τα λιποσώματα σχηματίζονται κυρίως από φωσφολιπίδια τα οποία δημιουργούν διπλοστοιβάδες λόγω της αμφίφιλης φύσης τους όπως κάνουν και στις βιολογικές μεμβράνες. Όλα τα φωσφολιπίδια έχουν μια υδρόφιλη πολική κεφαλή και μια μακριά, υδρόφοβη υδρογονανθρακική ουρά. Σε υδατικό περιβάλλον τα φωσφολιπίδια προσανατολίζονται έτσι ώστε οι υδρόφιλες κεφαλές να εκτίθενται στα μόρια του νερού, αλληλεπιδρώντας με αυτά με δεσμούς υδρογόνου, ενώ οι μακριές υδρόφοβες ουρές αλληλεπιδρούν μεταξύ τους με δυνάμεις Van der waals και συμπλέκονται δημιουργώντας τις διπλοστοιβάδες. Τα λιποσώματα έχουν προσελκύσει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Στο εσωτερικό τους μπορούν να περικλείουν οποιαδήποτε υδατοδιαλυτά μόρια, από απλές χημικές ενώσεις έως και μακρομόρια βιολογικής προέλευσης. Επίσης η φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα μπορεί να ενσωματώσει με μη ομοιοπολικούς δεσμούς πολλά αμφίφιλα μόρια όπως μεμβρανικές πρωτεΐνες, υδρόφοβα μόρια ή και μία ευρεία γκάμα μορίων ομοιοπολικά συνδεμένων με τα φωσφολιπίδια. Α Β Εικόνα 13. Α: Μοντέλο φωσφολιπιδικής διπλοστοιβάδας Β: Φωσφολιπίδιο και λιπόσωμα (Εικόνες από Encyclopaedia Britannica 2007). 31

1.3.2 Η ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Η ιστορία των λιποσωμάτων ξεκίνησε το 1911 από ερευνητές που μελετούσαν τα φαινόμενα γύρω από την ενυδάτωση ταινιών αφυδατωμένων λιπαρών ουσιών. Αυτοί οι ερευνητές παρασκεύασαν χωρίς να το γνωρίζουν τα πρώτα λιποσώματα. Στη δεκαετία του `50 οι ερευνητές που ασχολούνταν με της ιδιότητες της λεκιθίνης από διάφορες πηγές, παρασκεύαζαν τις μορφές που την επόμενη δεκαετία θα ονομάζονταν λιποσώματα [Rhodes et al., (1957)]. Στις αρχές της δεκαετίας του `60 οι A. Bangham και Δ. Παπαχατζόπουλος [Papahadjopoulos et al., (1967), Bangham et al., (1964)] κατέδειξαν τις ιδιότητες των φωσφολιπιδικών μορφών που δημιούργησαν οι ερευνητές της προηγούμενης δεκαετίας και απέδειξαν ότι ήταν περίπου σφαιρικοί σχηματισμοί που αποτελούνται από απλές ή πολλαπλές φωσφολιπιδικές διπλοστοιβάδες, οι οποίες εσωκλείουν ένα ποσοστό του υδατικού διαλύματος στο οποίο είναι εναιωρημένες. Μετά τις ανακαλύψεις αυτές, τα λιποσώματα άρχισαν να χρησιμοποιούνται ως πειραματικά μοντέλα για τη διερεύνηση των ιδιοτήτων των βιολογικών μεμβρανών [Sessa et al., (1970)]. Ταυτόχρονα άρχισαν να χρησιμοποιούνται ως φορείς φαρμακευτικών μορίων. Σύντομα ανακαλύφθηκε η ιδιότητα των λιποσωμάτων να αναγνωρίζονται και να φαγοκυτταρώνονται ταχύτατα από τα φαγοκύτταρα του δικτυοενδοθυλιακού συστήματος, ιδιότητα που έκανε τα λιποσώματα από τη μία ένα καλό μέσο για τη μεταφορά βιοδραστικών μορίων στα μακροφάγα του δικτυοενδοθυλιακού συστήματος, αλλά ταυτόχρονα τα καθιστούσε ένα ανεπαρκές μέσο για μεταφορά φαρμάκων σε οποιοδήποτε άλλο ιστό του οργανισμού [Gregoriadis et al., (1972), Papahadjopoulos et al., (1978), Gregoriadis et al., (1972), Beaumier et al., (1983)]. Κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του `70 έλαβαν χώρα πολλές μελέτες με στόχο να δημιουργηθεί μια σαφή εικόνα για τις δυνατότητες των λιποσωμάτων. Τα συμπεράσματα ήταν ότι τα λιποσώματα είχαν πολύ μικρό χρόνο ζωής στην κυκλοφορία, δεν μπορούσαν να διεισδύσουν από τα αγγεία στους ιστούς, η φόρτωση και η αποδέσμευση των φαρμάκων δεν ήταν επαναλήψιμη, ενώ συχνά εμφάνιζαν φυσική και χημική αστάθεια. Τα μειονεκτήματα αυτά αποθάρρυναν πολλούς από την περαιτέρω ενασχόληση τους με τα σύστημα αυτό, αλλά οι ανακαλύψεις που ακολούθησαν από τα τέλη της δεκαετίας του `70 και ύστερα ανανέωσαν το ενδιαφέρον για τα λιποσώματα. 32

Ερευνητικές προσπάθειες για την εύρεση τρόπων αύξησης του χρόνου ζωής στην κυκλοφορία έδειξαν ότι αυτό μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους. Ένας τρόπος βρέθηκε να είναι η χρήση βέλτιστων συνδυασμών λιπιδίων, όπως ο συνδυασμός ουδέτερων φωσφολιπιδίων με μακριές κορεσμένες υδρόφοβες αλυσίδες και χοληστερόλης. Επίσης το γαγγλιοσίδιο GM1 και η κορεσμένη φωσφατιδύλοϊνοσιτόλη βρέθηκαν να παρατείνουν το χρόνο ζωής των λιποσωμάτων στη γενική κυκλοφορία. Άλλος ενδιαφέρον τρόπος που βρέθηκε ήταν η μείωση του μεγέθους των λιποσωμάτων. Αποδείχθηκε ότι τα μικρότερα σε μέγεθος λιποσώματα είχαν σημαντικά μεγαλύτερους χρόνους ζωής [Beaumier et al., (1983), Kirby et al., (1980), Allen et al., (1987), Gabizol et al., (1988)]. Τέλος πολύ σημαντική μέθοδος για την αύξηση του χρόνου παραμονής των λιποσωμάτων στην κυκλοφορία ήταν η προσθήκη στην επιφάνεια των λιποσωμάτων μακριών αλυσίδων υδρόφιλων πολυμερών όπως αυτών της πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Τα πολυμερή αυτά, αρχικά μη ομοιοπολικά και στη συνέχεια ομοιοπολικά συνδεμένα με τα φωσφολιπίδια εμπόδιζαν την αλληλεπίδραση των λιποσωμάτων με τις πρωτεΐνες του οργανισμού, αυξάνοντας πολύ το χρόνο παραμονής των λιποσωμάτων στη γενική κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση τους (λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας). Η ιδέα να δοκιμαστούν πολυμερή για την αύξηση του χρόνου ζωής προέκυψε από παλιότερα ευρήματα που έδειχναν ότι ομοιοπολική σύνδεση υδρόφιλων πολυμερών σε πρωτεΐνες αύξανε σημαντικά τον χρόνο ζωής in vivo και μείωνε την αντιγονικότητα [Abuchowski et al., (1977), Nucci et al., (1991), Woodle et al., (1990), Klibanov et al., (1990), Blume et al., (1990), Woodle et al., (1991), Senior et al., (1991)]. Τις βελτιώσεις αυτές στα λιποσώματα ακολούθησαν και μερικές άκρως ενδιαφέρουσες ανακαλύψεις, όπως ότι το αγγειακό ενδοθήλιο σε πολλούς καρκινικούς όγκους είναι ασυνεχές επιτρέποντας στα λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας να εισέρχονται στους όγκους και να απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους τοπικά σε υψηλές δόσεις (φαινόμενο που καλείται παθητική στόχευση). Επίσης η πρόοδος της βιοτεχνολογίας και της πεπτιδικής χημείας έκανε δυνατή την παρασκευή λιποσωμάτων τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους αντισώματα που τα κατευθύνουν σε συγκεκριμένους ιστούς-στόχους. Όλα τα παραπάνω ανανέωσαν το ενδιαφέρον για τα λιποσώματα τα οποία τα τελευταία χρόνια ερευνώνται εντατικά από εργαστήρια σε όλο τον κόσμο. 33

1.3.3 ΕΙΔΗ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΩΝ Τα φωσφολιπίδια χωρίζονται σε δυο είδη ανάλογα με τη χημική τους δομή, τα φωσφοδιγλυκερίδια και τα σφιγγολιπίδια [Rickwood et al., (1990)]. Τα φωσφοδιγλυκερίδια αποτελούνται από μια υδρόφοβη αλειφατική ουρά και από μια υδρόφιλη φορτισμένη κεφαλή, η οποία αποτελείται από γλυκερόλη, μια φωσφορική ομάδα καθώς και από μια ακόμη χημική ομάδα που μπορεί να είναι χολίνη, αιθανολαμίνη, σερίνη κ.α. (Εικόνα 14). Εικόνα 14. Χημική δομή ενός φωσφοδιγλυκεριδίου. Διακρίνεται η χαρακτηριστική χημική ομάδα της γλυκερόλης, το μόριο της χολίνης καθώς και η υδρόφοβη αλειφατική ουρά. (Εικόνα τροποποιημένη από www.uic.edu/classes/bios/bios100/lecturesfo4am/phospholipid) Τα σφιγγολιπίδια αποτελούνται από το μόριο της σφιγγοσίνης, το οποίο είναι ένα λιπαρό οξύ με 15 άτομα άνθρακα και ένα διπλό δεσμό, συνδεμένο με ένα λιπαρό οξύ, το οποίο με τη σειρά του είναι ομοιοπολικά συνδεμένο με αμιδικό δεσμό με το μόριο της γλυκερόλης και αυτό με μια πολική ομάδα που μπορεί να περιέχει χολίνη, σάκχαρο ή πολυσακχαρίτη, ή μια φωσφορική ομάδα. Εκτός από το διαχωρισμό των φωσφολιπιδίων με βάση τη χημική τους δομή, αυτά μπορούν να διακριθούν και με βάση τις ιδιότητές τους. Ανάλογα με το φορτίο τους διακρίνονται σε φωσφολιπίδια αρνητικά, θετικά ή ουδέτερα φορτισμένα. Επίσης μια ακόμη ιδιότητα με βάση την οποία κατηγοριοποιούνται τα φωσφολιπίδια είναι η λεγόμενη θερμοκρασία μετάβασης φάσης, η οποία είναι η θερμοκρασία που η διπλοστοιβάδα από τα φωσφολιπίδια περνά από μια ημιστερεά ζελατινώδη 34

κατάσταση σε μια ρευστή. Το κάθε είδος φωσφολιπιδίων έχει τη δική του χαρακτηριστική θερμοκρασία μετάβασης. Τα φωσφολιπίδια που χρησιμοποιούνται στην παρασκευή λιποσωμάτων είναι συνήθως μόρια φωσφατιδυλοχολίνης, που αποτελούνται από ένα μόριο γλυκερόλης στο οποίο είναι ομοιοπολικά συνδεμένα δυο μόρια αλειφατικών αλυσίδων και ένα μόριο φωσφοχολίνης. Παλαιότερα ήταν συχνή η δημιουργία λιποσωμάτων με μίγματα φωσφολιπιδίων που προέρχονταν από την λεκιθίνη αυγού ή άλλες φυσικές πηγές. Σήμερα για παρασκευή λιποσωμάτων χρησιμοποιούνται κυρίως συνθετικά φωσφολιπίδια απόλυτα γνωστής σύστασης και υψηλής καθαρότητας. 35

1.3.4 ΕΙΔΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Όπως στα φωσφολιπίδια, έτσι και στα λιποσώματα υπάρχουν διάφορα είδη ανάλογα με κάποιες ιδιότητες που διαθέτουν ή όχι. Η πρώτη ιδιότητα με βάση την οποία κατηγοριοποιούνται τα λιποσώματα είναι το μέγεθός τους. Τα λιποσώματα τύπου MLV (MultiLameral) είναι πολυστοιβαδικά και μεγάλου μεγέθους (1000 nm ή και ακόμα μεγαλύτερα). Τα λιποσώματα που αποτελούνται από λίγες ομόκεντρες στοιβάδες ονομάζονται OLV (OligoLameral) και συνήθως έχουν μικρότερο μέγεθος από τα MLV. Στον αντίποδα των MLV λιποσωμάτων είναι τα μικρά μονοστοιβαδικά λιποσώματα (SUV) το μέγεθος των οποίων φτάνει έως και τα 25 περίπου nm το οποίο είναι και το θεωρητικό όριο που μπορεί να έχει ένα κυστίδιο που αποτελείται από φωσφολιπίδια. Εκτός από τα παραπάνω είδη λιποσωμάτων υπάρχουν και τα μεγάλα μονοστοιβαδικά (LUV) τα οποία έχουν διαμέτρους 100 nm ή και μεγαλύτερες καθώς και τα μονοστοιβαδικά λιποσώματα μέσου μεγέθους (MUV) με μεγέθη από 40 έως 80 nm (Εικόνα 15). Εικόνα 15: Σχηματική απεικόνιση των κυριότερων τύπων λιποσωμάτων που μπορούν να δημιουργηθούν ανάλογα με τη μέθοδο παρασκευής τους. 36

Επειδή τα κλασικά λιποσώματα έχουν κάποια μειoνεκτήματα τα οποία σχετίζονται με μειωμένο χρόνο ζωής στον οργανισμό, εκλεκτικότητα μικρότερη από αυτήν που απαιτείται, ή ακόμα και διαφυγή ορισμένων λιπόφιλων μορίων από το εσωτερικό τους, έχουν παρασκευαστεί και άλλα νεώτερα είδη λιποσωμάτων με βελτιωμένες φαρμακοκινητικές ιδιότητες. Ένα είδος τέτοιων λιποσωμάτων είναι αυτά τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους προσδεμένες αλυσίδες PEG [Immordino et al., (2006), Allen et al., (2002)]. Αυτά τα λιποσώματα έχουν την ιδιότητα να παραμένουν στην κυκλοφορία για σημαντικά περισσότερο χρόνο σε σχέση με τα κλασικά. Ένα άλλο είδος λιποσωμάτων είναι αυτό στο οποίο τα λιποσώματα έχουν στην επιφάνειά τους προσδεμένα αντισώματα ή πεπτίδια που τα κατευθύνουν σε συγκεκριμένα μόριαστόχους [Maruyama et al., (1999)]. Τέλος έχουν αναπτυχθεί και λιποσώματα τα οποία περικλείουν υδατικά διαλύματα πολυμερών που συγκρατούν καλύτερα τα λιπόφιλα μόρια στο εσωτερικό τους εμποδίζοντάς τα να διαφύγουν. 37

1.3.5 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Υπάρχουν διάφοροι μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων κάθε μια από τις οποίες έχει τα δικά της πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα και χρησιμοποιείται ανάλογα με το είδος των λιποσωμάτων που σκοπεύουμε να δημιουργήσουμε. Κάθε μια μέθοδος παράγει συνήθως λιποσώματα ορισμένου τύπου (Εικόνα 15). Η πιο συνηθισμένη μέθοδος παρασκευής λιποσωμάτων τα οποία περιέχουν διάλυμα μιας φαρμακευτικής ουσίας είναι αυτή της μηχανικής διασποράς (Εικόνα 16). Σε πρώτη φάση τα φωσφολιπίδια διαλύονται σε οργανικό διαλύτη, ο οποίος στη συνέχεια εξατμίζεται αφήνοντας μια ξηρή μεμβράνη φωσφολιπιδίων. Σε δεύτερο χρόνο η μεμβράνη αυτή ενυδατώνεται με το διάλυμα του φαρμάκου το οποίο θέλουμε να εγκλειστεί στα λιποσώματα και αυθόρμητα σχηματίζεται ένα εναιώρημα κυρίως από λιποσώματα τύπου MLV. Επειδή συνήθως αυτού του τύπου τα λιποσώματα είναι πολύ μεγάλα για να χρησιμοποιηθούν, τα τελευταία υποβάλλονται σε κατεργασία μείωσης του μεγέθους. Η μείωση του μεγέθους και της πολυστοιβαδικότητας μπορεί να επιτευχθεί με χρήση υπερήχων, αλλεπάλληλα περάσματα του εναιωρήματος από κατάλληλα φίλτρα με πόρους συγκεκριμένου μεγέθους, καθώς και με διαδοχικούς κύκλους ψύξης-θέρμανσης. Εναλλακτικοί τρόποι δημιουργίας λιποσωμάτων είναι οι μέθοδοι της διασποράς του διαλύτη και της διαλυτοποίησης της επιφανειοδραστικής ουσίας. Σύμφωνα με την πρώτη μέθοδο, τα φωσφολιπίδια διαλυτοποιούνται σε αιθανόλη ή αιθέρα και στη συνέχεια το διάλυμα αυτό περνά με λεπτή σύριγγα στο υδατικό διάλυμα με το φάρμακο που θέλουμε να εγκλειστεί στα λιποσώματα. Καθώς ο οργανικός διαλύτης αραιώνεται ταχύτατα, σχηματίζονται λιποσώματα διαφόρων τύπων ανάλογα με τις συνθήκες. Η μέθοδος παρασκευής λιποσωμάτων με διαλυτοποίηση της επιφανειοδραστικής ουσίας, είναι αρκετά διαφορετική και στηρίζεται στη διαλυτοποίηση της ξηρής μεμβράνης φωσφολιπιδίων με διάλυμα που περιέχει απορρυπαντικό και στη συνέχεια απομάκρυνσή του, είτε με διαπίδυση είτε με απορρόφησή του από ειδικά σφαιρίδια. Η τελευταία μέθοδος είναι ιδιαίτερα σημαντική για την παρασκευή λιποσωμάτων με ενσωματωμένες πρωτεΐνες στη φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα, αφού δεν περιλαμβάνει την ανάμειξη της πρωτεΐνης σε οργανικό διαλύτη σε κανένα στάδιο. Για την παρασκευή λιποσωμάτων χρησιμοποιούνται συνήθως δύο τουλάχιστον διαφορετικά είδη συνθετικών φωσφολιπιδίων τα οποία να συναρμόζονται στον χώρο 38

σχηματίζοντας σταθερότερες διπλοστοιβάδες. Αξίζει να αναφερθεί ότι σε όλες τις παραπάνω μεθόδους τα στάδια που περιλαμβάνουν το σχηματισμό φωσφολιπιδικών διπλοστοιβάδων, πρέπει να γίνονται σε θερμοκρασία που να είναι πάνω από τη θερμοκρασία μετάβασης φάσης του φωσφολιπιδίου με τη μέγιστη αντίστοιχη τιμή. Μετά την παρασκευή του εναιωρήματος λιποσωμάτων τα οποία φέρουν στο εσωτερικό ή την επιφάνειά τους τα επιθυμητά μόρια (π.χ. φάρμακα), ακολουθεί καθαρισμός έτσι ώστε να διαχωριστούν τα λιποσώματα από τα ελεύθερα μόρια που δεν έχουν ενσωματωθεί. Ο συνηθέστερος τρόπος καθαρισμού εναιωρήματος λιποσωμάτων είναι με χρωματογραφία μοριακής διήθησης, καθώς τα λιποσώματα έχουν πολύ μεγαλύτερη μάζα σε σχέση με τα μόρια που θέλουμε να εγκλειστούν [Basu et al., (2002), Janoff et al., (1999)]. Εικόνα 16: Παρασκευή λιποσωμάτων με τη μέθοδο της μηχανικής διασποράς. Σε πρώτη φάση τα φωσφολιπίδια διαλύονται σε οργανικό διαλύτη, ο οποίος στη συνέχεια εξατμίζεται αφήνοντας μια ξηρή μεμβράνη φωσφολιπιδίων. Σε δεύτερο χρόνο η μεμβράνη αυτή ενυδατώνεται με το διάλυμα του φαρμάκου το οποίο θέλουμε να εγκλειστεί στα λιποσώματα και αυθόρμητα σχηματίζεται το εναιώρημα των λιποσωμάτων. 39

1.3.6 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ-ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Μετά την παρασκευή και τον καθαρισμό των λιποσωμάτων ακολουθεί η αξιολόγηση των ιδιοτήτων τους με διάφορες τεχνικές. Η πρώτη ιδιότητα που αξιολογείται είναι η κατανομή μεγέθους των λιποσωμάτων, κάτι που μπορεί να γίνει με αρκετούς τρόπους. Η πιο κλασσική τεχνική που χρησιμοποιείται είναι η παρατήρηση με οπτικό μικροσκόπιο. Άμεση παρατήρηση λιποσωμάτων με αυτή τη μέθοδο μπορεί να γίνει μόνο σε μεγάλα λιποσώματα τύπου MLV, αλλά με χρήση κατάλληλων λιπόφιλων χρωστικών που ενσωματώνονται στη διπλοστοιβάδα των φωσφολιπιδίων και με χρήση κατάλληλων Laser ως πηγές φωτός είναι δυνατόν να παρατηρηθούν λιποσώματα διαμέτρου έως και 0,1 μm. Με τη χρήση συστήματος μικροσκοπίου-κάμερας-υπολογιστή και κατάλληλου λογισμικού, η εικόνα ψηφιοποιείται και το λογισμικό, μετρώντας δειγματοληπτικά διάφορα μεμονωμένα λιποσώματα, βγάζει αποτελέσματα για την κατανομή του μεγέθους των λιποσωμάτων [Hargreaves et al., (1978), Lichtenberg et al., (1988), Lichtenberg et al., (1981)]. Άλλες σύγχρονες τεχνικές, που προσφέρουν πληροφορίες για την κατανομή του μεγέθους των λιποσωμάτων, αλλά και με τα δικά τους πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα, είναι η μέτρηση της κατανομής μεγέθους με μεθόδους δυναμικού σκεδασμού του φωτός (DLS) και με μετρητή coulter (coulter counter). Η τεχνική DLS (Dynamic light scattering) είναι στην ουσία η μέτρηση της έντασης και της γωνίας σκέδασης που υφίσταται μια δέσμη φωτός Laser από το εναιώρημα των λιποσωμάτων. Όσο μεγαλύτερη η γωνία και η ένταση του σκεδαζόμενου φωτός, τόσο μεγαλύτερο είναι και το μέγεθος του λιποσώματος πάνω στο οποίο προσπίπτει η ακτίνα Laser τη στιγμή της μέτρησης. Επεξεργασία ικανού αριθμού τιμών με το κατάλληλο λογισμικό δίνει τα αποτελέσματα της κατανομής των μεγεθών των λιποσωμάτων [Lichtenberg et al., (1988), Rickwood et al., (1990)]. Η τεχνική της μέτρησης της κατανομής του μεγέθους με μετρητή coulter συνίσταται στη δίοδο του εναιωρήματος ανάμεσα από δυο ηλεκτρόδια τα οποία έχουν μια διαφορά δυναμικού. Κάθε φορά που διέρχεται ένα κυστίδιο ανάμεσα από τα ηλεκτρόδια, αυτή η διαφορά δυναμικού διαταράσσεται, ανάλογα με το μέγεθος του κυστιδίου. Έτσι γρήγορα συγκεντρώνονται μετρήσεις τις οποίες επεξεργάζεται κατάλληλο λογισμικό και δίνει την κατανομή μεγέθους [Chowhan et al., (1972)]. 40

Η τεχνική που μπορεί να δώσει λεπτομερείς και έγκυρες πληροφορίες για τη δομή των λιποσωμάτων, ακόμα και των πιο μικρών, είναι η ηλεκτρονική μικροσκοπία. Σε πρώτη φάση το λιποσωμικό παρασκεύασμα μονιμοποιείται και χρωματίζεται αρνητικά με ενώσεις βαρέων μετάλλων, τα οποία σκεδάζουν έντονα τα ηλεκτρόνια. Στη συνέχεια το παρασκεύασμα βομβαρδίζεται με δέσμη ηλεκτρονίων και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων από το κατάλληλο λογισμικό δίνει μια εικόνα που αναπαριστά την πυκνότητα των ηλεκτρονίων σε κάθε σημείο του παρασκευάσματος. Το μειονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι ότι η διαδικασία της χρώσης του παρασκευάσματος μπορεί να αλλοιώσει τα λιποσώματα [Larrabee et al., (1978), Olson et al., (1979)]. Μια άλλη τεχνική, η οποία έχει το πλεονέκτημα ότι προσφέρει αρκετά λεπτομερείς απεικονίσεις των λιποσωμάτων ακόμα και όταν αυτά έχουν πολύ μικρό μέγεθος, είναι η τεχνική AFM (Atomic Force microscopy) (Εικόνα 17). Στην τεχνική αυτή μια εξαιρετικά λεπτή ακίδα κινείται πάνω από το παρασκεύασμα και οι δονήσεις που υφίσταται, λόγω των μικροσκοπικών εμποδίων που βρίσκει στο πέρασμά της, γίνονται αισθητές μέσω ενός συστήματος που μετρά την απόκλιση μιας δέσμης laser. Τα δεδομένα καταγράφονται και με τη βοήθεια του κατάλληλου λογισμικού δημιουργείται μια εικόνα του παρασκευάσματος. Α Β Εικόνα 17: Α: Η αρχή λειτουργίας του AFM. Μια εξαιρετικά λεπτή ακίδα (2) ακουμπά πάνω στη μετακινούμενη πλάκα (5) στην οποία είναι φορτωμένο το δείγμα και ανάλογα με την υφή του προκαλούνται αναταράξεις σε αυτή. Οι αναταράξεις ανιχνεύονται με φωτοδίοδο (3) από την εκτροπή που υφίσταται μια δέσμη Laser (1) και με τις πληροφορίες αυτές σχηματίζεται η εικόνα. Β: Εικόνες διαφόρων λιποσωμικών παρασκευασμάτων που δημιουργήθηκαν με AFM. (Εικόνα από http://sahussain.com) 41

1.3.7 Η ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Η οδός χορήγησης ενός εναιωρήματος λιποσωμάτων είναι συνήθως παρεντερική, καθώς τα λιποσώματα αποικοδομούνται ταχύτατα στις συνθήκες του γαστρεντερικού αυλού. Η τύχη των λιποσωμάτων στον οργανισμό, σε περίπτωση ενδοφλέβιας χορήγησης, εξαρτάται από το είδος και τις ιδιότητές τους. Τα λιποσώματα που αποτελούνται από απλά φωσφολιπίδια αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες του πλάσματος από τις οποίες άλλες τους αποσπούν φωσφολιπίδια, με αποτέλεσμα να τα αποσταθεροποιούν, και άλλες τα οψωνινοποιούν, με αποτέλεσμα να φαγοκυτταρώνονται γρήγορα από τα μακροφάγα κύτταρα του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (Δ.Ε.Σ.) του ήπατος και του σπλήνα [Jones et al., (1991), Fugman et al., (1984), Scherphof et al., (1984)]. Γενικά, όσο μεγαλύτερο μέγεθος έχουν τα λιποσώματα τόσο μειώνεται ο χρόνος κυκλοφορίας τους στο αίμα [Woodle et al., (1992), Senior et al., (1987), Lasic et al., (1991)]. Πάντως σε κάθε περίπτωση ο χρόνος κυκλοφορίας των απλών λιποσωμάτων είναι πολύ περιορισμένος και γι αυτό προτιμάται η χρήση λιποσωμάτων που φέρουν στην επιφάνειά τους αλυσίδες PEG. Οι αλυσίδες PEG στην επιφάνεια των λιποσωμάτων παρεμποδίζουν στερεοχημικά την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών (οψωνινών) με τα λιποσώματα. Έτσι ο χρόνος ζωής των λιποσωμάτων παρατείνεται σημαντικά. Γενικά, όσο μεγαλύτερο ποσοστό της επιφάνειάς τους είναι καλυμμένο με αλυσίδες PEG και όσο μεγαλύτερο το μήκος των αλυσίδων, τόσο μεγαλύτερος είναι ο χρόνος ημιζωής των λιποσωμάτων στην κυκλοφορία του αίματος [Woodle et al., (1992), Klibanov et al., (1992), Torchillin et al., (1993)]. Τα PEG-λιποσώματα, ανάλογα με το μέγεθός τους, καταλήγουν και σε διαφορετικές αναλογίες στα διάφορα όργανα και ιστούς του οργανισμού στους οποίους εδρεύουν μακροφάγα. Λιποσώματα μεγέθους κάτω από 90 nm καταλήγουν σε αυξημένο ποσοστό στο ήπαρ, ίσως γιατί λόγω μεγέθους μπορούν και περνούν από τα στενά αγγεία του οργάνου [Allen et al., (1991), Klibanov et al., (1991), Allen et al., (1989)]. Αντίθετα λιποσώματα με μέσο μέγεθος 300 nm καταλήγουν στο σπλήνα [Klibanov et al., (1992), Liu et al (1992)]. 42

1.3.8 ΧΡΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Τα λιποσώματα, λόγω του σχήματος και των ιδιοτήτων τους, έχουν αρκετές χρήσεις και εφαρμογές. Για καθαρά ερευνητικούς σκοπούς χρησιμοποιούνται ώστε να προσομοιάσουν την κυτταρική μεμβράνη η οποία είναι και αυτή διπλοστοιβάδα φωσφολιπιδίων. Οι πρακτικές εφαρμογές τους αφορούν τη χημειοθεραπεία και την ανάπτυξη εμβολίων. Υπάρχουν αρκετά φάρμακα για τη χημειοθεραπεία συστηματικών βακτηριακών και μυκητησιακών λοιμώξεων καθώς και για τη χημειθεραπεία του καρκίνου, τα οποία δρουν καλύτερα όταν είναι εγκλεισμένα σε λιποσώματα. Ένα καλό παράδειγμα της κατηγορίας αυτής είναι το αντιβιοτικό κεφαλοθίνη όταν αυτό προορίζεται για χρήση εναντίον ενδοκυτταρικών βακτηρίων όπως της Βρουκέλλας, της Σαλμονέλας και της Λιστέριας, τα οποία προσβάλουν κυρίως όργανα του Δ.Ε.Σ. Το αντιβιοτικό αυτό βρέθηκε ότι έχει καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα όταν χορηγείται εγκλεισμένο σε λιποσώματα απ ότι σε ελεύθερη μορφή προφανώς επειδή προσλαμβάνεται εκλεκτικά από το Δ.Ε.Σ. επιτυγχάνοντας έτσι υψηλότερες συγκεντρώσεις εκεί που απαιτείται [Desiderio et al., (1983)]. Παρόμοια βελτιωμένα αποτελέσματα προσφέρουν και ορισμένα άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα όταν χορηγηθούν εγκλεισμένα σε λιποσώματα λόγω της αυξημένης πρόσληψής τους από τα όργανα του Δ.Ε.Σ. Παράδειγμα αποτελούν το αντιμυκητησιακό φάρμακο αμφοτερικίνη [Shygar et al., (1987), Lopez-Berstein et al., (1986)] και το ανθελονοσιακό πριμακίνη [Pirson et al., (1980), Smith et al., (1983)]. Η αμφοτερικίνη, στη λιποσωμική μορφής της, κυκλοφόρησε με την ονομασία AmBisomes με την οποία η νεφροτοξικότητά που παρουσιάζει στην ελεύθερη μορφή της περιορίστηκε πάνω από 10 φορές. Η πριμακίνη εγκλεισμένη σε λιποσώματα μείωσε πολύ την καρδιοτοξικότητά της χωρίς όμως να αυξηθεί η δόση που απαιτείται για το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Δυο άλλες εφαρμογές των λιποσωμάτων στη θεραπευτική οι οποίες δοκιμάζονται εκτενώς είναι η ενκαψακίωση αντινεοπλασματικών παραγόντων καθώς και εμβολίων σε λιποσώματα. Το πλεονέκτημα που θα προσφέρει η ενκαψακίωση στα μόρια που λειτουργούν ως εμβόλια είναι ότι θα τα κατευθύνει ταχύτατα στα μακροφάγα τα οποία θέλουμε να ενεργοποιηθούν [Koff et al., (1984), Fraser-Smith et al., (1983), Lopez-Berstein et al., (1986)] έναντι μολυσματικών παραγόντων ή καρκινικών 43

κυττάρων. Όσο για τα κυτταροστατικά φάρμακα, στόχος είναι από τη μια η μείωση των σοβαρότατων παρενεργειών τις οποίες έχουν τα φάρμακα αυτά στην ελεύθερη μορφή τους και από την άλλη η αυξημένη απόδοση των φαρμάκων στο ιδιαίτερα ανεπτυγμένο και ανώμαλο αγγειακό δίκτυο που αναπτύσσουν οι όγκοι [Weinstein et al., (1984), Gabizol et al., (1982), Olson et al., (1982), Perez-Soler et al., (1986), Lauterstain et al., (1986)]. 44

1.4 ΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Pichia Pastoris ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five 1.4.1 ΤΟ ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Pichia pastoris Ο ζυμομύκητας Pichia pastoris (P. pastoris) είναι ένα από τα πλέον χρησιμοποιούμενα συστήματα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών λόγω της απλότητας και του χαμηλού κόστους του σε σχέση με άλλα πιο πολύπλοκα συστήματα έκφρασης όπως οι κυτταρικές σειρές εντόμων ή θηλαστικών. Η ποιότητα των εκφραζόμένων πρωτεϊνών είναι συνήθως καλή, καθώς ο P. pastoris είναι ευκαρυωτικός οργανισμός και έχει πολλά από τα πλεονεκτήματα των ανώτερων συστημάτων έκφρασης, όπως η καλύτερη αναδίπλωση και η γλυκοζιλίωση της εκφραζόμενης πρωτεΐνης. Έχουν αναπτυχθεί ειδικά στελέχη του ζυμομύκητα P. pastoris και ειδικά πλασμίδια για έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με αυτό το σύστημα. Τα παραπάνω εξασφαλίζουν: Τη μεγιστοποίηση της παραγωγής της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Την ελαχιστοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών της ίδιας της ζύμης. Την αντοχή σε κάποιο αντιβιοτικό επιλογής για την επιβίωση μόνο των μετασχηματισμένων κυττάρων. Την κατεύθυνση της εκφραζώμενης πρωτεΐνης στο επιθυμητό διαμέρισμα του κυττάρου ή στον εξωκυττάριο χώρο. Την έκφραση της πρωτεΐνης έτσι ώστε να φέρει στο ένα άκρο της ένα πεπτίδιο που βοηθά στην απομόνωση και τον καθαρισμό. Επίσης έχουν αναπτυχθεί και στελέχη του ζυμομύκητα P. pastoris τα οποία δύναται να μετασχηματισθούν μόνιμα, ενσωματώνοντας στο γενετικό τους υλικό γραμμικά τμήματα DNA της πρωτεΐνης προς έκφραση. Ο ζυμομύκητας P. pastoris είναι ένας μεθυλοτρόπος οργανισμός, δηλαδή μπορεί να χρησιμοποιεί τη μεθανόλη ως μοναδική πηγή άνθρακα, χάρη στο ένζυμο της αλκοολικής οξειδάσης. Το ένζυμο αυτό οξειδώνει τη μεθανόλη (αλλά και άλλες αλκοόλες) προς την αντίστοιχη αλδεΰδη, η οποία στη συνέχεια, μετατρεπόμενη στο αντίστοιχο οξύ καταλήγει στον κύκλο του Krebs. Η όλη διαδικασία πραγματοποιείται 45

στα υπεροξειδιοσώματα για την προστασία του κυττάρου από το επικίνδυνο υπεροξείδιο του υδρογόνου που παράγεται ως παραπροϊόν. Επειδή το ένζυμο της αλκοολικής οξειδάσης έχει χαμηλή συγγένεια για τη μεθανόλη, ο ζυμομύκητας εκφράζει μεγάλη ποσότητα του ενζύμου προκειμένου να ανταπεξέλθει στις ανάγκες του μεταβολισμού του παρουσία αλκοόλης και απουσία σακχάρων. Όταν πάλι υπάρχουν αρκετά σάκχαρα και καθόλου αλκοόλες η έκφραση του ενζύμου ελαχιστοποιείται. Η έκφραση του ενζύμου της αλκοολικής οξειδάσης ρυθμίζεται κυρίως από τον υποκινητή ΑΟΧ1. Η μεθανόλη είναι ένας από τους ισχυρούς επαγωγείς του ενζύμου ενώ μόρια όπως σάκχαρα και γλυκερόλη μπλοκάρουν τη μεταγραφή του. Ως υποκινητής των προς έκφραση γονιδίων στο σύστημα του ζυμομύκητα P. pastoris χρησιμοποιείται ο ΑΟΧ1. Συνήθως η καλλιέργεια για παραγωγή πρωτεΐνης χωρίζεται σε δυο φάσεις. Στην πρώτη φάση ο ζυμομύκητας καλλιεργείται σε θρεπτικό με 1% γλυκερόλη, η οποία δεν επιτρέπει την παραγωγή πρωτεΐνης, για να αυξηθεί ο μύκητας σε περίπτωση που η εκφραζώμενη πρωτεΐνη είναι τοξική για αυτόν. Στη δεύτερη φάση η καλλιέργεια γίνεται σε θρεπτικό με 0,5% μεθανόλη. Ο υποκινητής ΑΟΧ1 ενεργοποιείται και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη υπερεκφράζεται. Ακολουθούν τα στάδια της απομόνωσης και του καθαρισμού [Methods in molecular biology, Vol 103 ]. 46

1.4.2 ΤΟ ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ: ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five Σε αρκετές περιπτώσεις έκφρασης πρωτεϊνών που ανήκουν σε ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, το σύστημα έκφρασης του P. pastoris δεν παράγει πρωτεΐνες αρκετά καλής ποιότητας και γι αυτό έχουν αναπτυχθεί και ανώτερα συστήματα έκφρασης. Μια κατηγορία αυτών των συστημάτων έκφρασης είναι οι κυτταρικές σειρές εντόμων (κύτταρα εντόμων). Τα κύτταρα εντόμων έχουν το πλεονέκτημα ότι είναι εξελικτικά πολύ πιο κοντά στα κύτταρα των ανώτερων θηλαστικών σε σχέση με τους ζυμομύκητες, ενώ παράλληλα είναι αρκετά πιο σταθερά και πιο ανθεκτικά από τις αντίστοιχες κυτταρικές σειρές θηλαστικών. Επίσης οι αποδόσεις που επιτυγχάνονται με αυτό το σύστημα είναι πολύ υψηλότερες σε σχέση με τις κυτταρικές σειρές από θηλαστικά. Όλα τα παραπάνω καθιστούν την έκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα εντόμων ως το επόμενο βήμα στην προσπάθεια έκφρασης μιας πρωτεΐνης από ανώτερο θηλαστικό, όταν η έκφραση σε E. coli και P. pastoris δεν έχει δώσει ικανοποιητικά αποτελέσματα. Από τις πιο διαδεδομένες εμπορικά σειρές κύτταρα εντόμων είναι οι SF9 και Hi Five που προέρχονται από τις ωοθήκες των εντόμων Spodoptera frugiperda και Trichoplusia ni αντιστοίχως. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι για την έκφραση πρωτεϊνών σε κύτταρα εντόμων χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα πλασμίδια. Τα πλασμίδια αυτά ύστερα από διαμόλυνση, είτε ενσωματώνουν το cdna της πρωτεΐνης στο γονιδίωμα των κυττάρων εντόμων, είτε δημιουργούν βακιλοϊούς οι οποίοι μολύνοντας τα κύτταρα, παράγουν την επιθυμητή πρωτεΐνη. Τα κύτταρα εντόμων καλλιεργούνται είτε προσκολλημένα σε επιφάνεια είτε σε αιώρηση, ανάλογα με την κλίμακα της καλλιέργειας. Για μικρής κλίμακας καλλιέργειες όπου γίνεται πιλοτική παραγωγή πρωτεΐνης προτιμώνται οι καλλιέργειες με μικρό όγκο θρεπτικού όπου τα κύτταρα είναι προσκολλημένα. Για μεγάλες καλλιέργειες με μεγάλη παραγωγή πρωτεΐνης προτιμώνται οι καλλιέργειες όπου τα κύτταρα είναι σε αιώρηση [Invitrogen 2002]. 47

1.5 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε με απώτερο στόχο την ανάπτυξη νέων πειραματικών θεραπειών της βαριάς μυασθένειας που θα στηρίζονται στην εκλεκτική απομάκρυνση των παθολογικών αυτοαντισωμάτων από το αίμα των ασθενών. Η εκλεκτική αυτή απομάκρυνση των αυτοαντισωμάτων στην πράξη μπορεί να γίνει κάνοντας χρήση του ανθρωπίνου μυϊκού nachr ή ανασυνδυασμένων ECDs των υπομονάδων του. Τα ECDs αυτά θα μπορούσαν να βρίσκονται στην κυκλοφορία του ασθενούς, ελεύθερα ή προσδεμένα σε κάποιο φορέα π.χ. λιποσώματα και έτσι να δεσμεύουν τα κυκλοφορούντα αντισώματα, είτε να είναι προσδεμένα σε μια στήλη από την οποία θα περνά το αίμα εξωσωματικά και θα καθαρίζεται. Στην εργασία αυτή μελετήθηκαν και οι τρεις αυτές προσεγγίσεις. Η απ ευθείας διοχέτευση στην κυκλοφορία του nachr ή ανασυνδυασμένων τμημάτων του, αν και η πλέον απλή, ενέχει τον κίνδυνο της περαιτέρω ενεργοποίησης του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι των υποδοχέων της νευρομυϊκής σύναψης. Η ενσωμάτωση του υποδοχέα ή ανασυνδυασμένων τμημάτων του σε λιποσώματα που φέρουν εξωτερικά αλυσίδες PEG θα μπορούσε να αυξήσει κατά πολύ το χρόνο ζωής στο αίμα και να μειώσει την αντιγονικότητά τους. Από την άλλη, η πρόσδεση των ECDs σε στήλες απλοποιεί την επιδιωκόμενη θεραπεία παρακάμπτοντας τα όποια προβλήματα που μπορεί να προκύψουν από την χορήγηση στην κυκλοφορία ECDs ή παραγώγων τους. Η παρούσα μελέτη αποτελείται από δυο μέρη. Στο πρώτο μέρος έγιναν παρασκευάσματα του Τ. nachr σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), PBS/Χολικό Νάτριο 2% (PBS/Χ.Ν.2%) και λιποσώματα επικαλυμμένα με αλυσίδες PEG. Τα παρασκευάσματα αυτά μελετήθηκαν για να διερευνηθούν τα πλεονεκτήματά και τα μειονεκτήματά τους, ως προς την ικανότητα δέσμευσης αντισωμάτων έναντι του μυϊκού nachr in vitro και in vivo, καθώς και ως προς την σταθερότητα και τον χρόνο ζωής τους in vivo. To αντίσωμα έναντι του μυϊκού nachr που χρησιμοποιήθηκε, ήταν το μονοκλωνικό αντίσωμα 35 (mab35), το οποίο προσδένεται σε διαφόρους μυϊκούς nachrs, καθώς και στον T. nachr. Ο T. nachr χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο μυϊκού nachr, καθώς είναι διαθέσιμος σε αρκετά μεγάλες ποσότητες σε παρασκευάσματα μεμβρανών των ηλεκτρικών οργάνων του ψαριού Torpedo californica και ως διαμεμβρανικό κανάλι έχει έμφυτη την τάση να ενσωματώνεται σε μεμβράνες όπως αυτές των λιποσωμάτων. 48

Στο δεύτερο μέρος της μελέτης εκφράστηκε, καθαρίστηκε και απομονώθηκε, με χρωματογραφία συγγένειας και μοριακού αποκλεισμού, το ανασυνδυασμένο ECD της α1 υπομονάδας του ανθρωπίνου μυϊκού nachr που είχε εκφρασθεί στο ζυμομύκητα Pichia Pastoris και σε κύτταρα εντόμων τύπου High Five. Στη συνέχεια τα δύο αυτά μόρια ECDs που προέκυψαν συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητα να προσδένουν παθολογικά αυτοαντισώματα από ορούς μυασθενών για να βρεθεί το πιο αποτελεσματικό. Ο έλεγχος και η σύγκριση της ικανότητας πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων στα ECDs έγινε με τη ραδιοανοσολογική μέθοδο (RIA). Τα ECDs της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου μυϊκού nachr είναι πολύ σημαντικά στις προσπάθειες εκλεκτικής πρόσδεσης και απομάκρυνσης παθολογικών αντισωμάτων στη βαριά μυασθένεια, καθώς η α1 υπομονάδα είναι η πλέον αντιγονική. Τα ECDs αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο στη δημιουργία ανοσοπροσροφητικών στηλών όσο και λιποσωμάτων που θα τα φέρουν και θα μπορούν να απομακρύνουν με τη βοήθειά τους αυτοαντισώματα από τον ορό μυασθενών. 49

2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 50

2.1 ΥΛΙΚΑ 2.1.1 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Για την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω όργανα και αναλώσιμα: 1) Πιπέττες Gilsson για την μετάγγιση υγρών από 1μl έως 1ml. 2) Ηλεκτρικός αναρροφητήρας (PIPETING AID) της Gilson για μετάγγιση υγρών από 5 έως 50ml. 3) Ογκομετρικοί κύλινδροι για μέτρηση υγρών της Nalgen από 100ml έως 2l. 4) Ζυγός της KERN. 5) Μικροζυγός από την METTLER TOLEDO. 6) Πλαστικά δοχεία (beakers) από τη Nalgen. 7) Στήλη μοριακού αποκλεισμού Sephacryl S1000 της Amersham Biosciences 8) Για την εξώθηση των εναιωρημάτων των λιποσωμάτων μέσα από φίλτρα isopore χρησιμοποιήθηκε η συσκευή GASTIGHT 1750 της HAMILTON. 9) Για την μέτρηση της οπτικής πυκνότητας χρησιμοποιήθηκε το φασφατοφωτόμετρο model 6305 UV/Visible της JENWAY. 10) Κυψελίδα χαλαζία για μέτρηση οπτικής απορρόφησης. 11) Για την ανάγνωση των πλακών μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων χρησιμοποιήθηκε το φασφατοφωτόμετρο Microplate reader model 680 της BIORAD 12) Μικροφυγόκεντροι Eppendorf και Hettich. 13) Φυγόκεντρος Cubota 7780 με κεφαλές RA-159G, AG-6512C, AG-5006A. 14) Η αποστείρωση των θρεπτικών έγινε με αυτόκαυστο της Raypa. 15) Συσκευή αναρρόφησης για Filter Assay. 16) AFM 17) DLS 18) Rotary Evaporator 19) Υπερφυγόκεντρος τύπου Beekman με κεφαλή SW-28. 20) Κασέτα συμπύκνωσης με cutoff 10 kdalton από την Pall 21) Περισταλτική αντλία της Masterflex 22) Συσκευή ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών της BIORAD 23) Μετρητής γ ακτινοβολίας Wallac 1275 minigama. 51

24) Συσκευή υγρής χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για τον καθαρισμό πρωτεϊνών (FPLC) τύπου AKTA pυrifier της General Electric. 25) Σφαιρίδια στήλης μοριακού αποκλεισμού S1000 της Amersham Biosciences 26) Στήλη μοριακού αποκλεισμού Superoze 12 από την Amersham Biosciences 27) Επωαστήρες mrc και Thermo Forma 28) Θάλαμος νηματικής ροής LAB CAIRE 2.1.2 ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ 1) Πλαστικά ακρορύγχια (tips) από Greiner bio-one. 2) Πλαστικοί σωλήνες πολυπροπυλενίου των 15 και 50 ml από Falcon. 3) Πλαστικά σωληνάρια (eppendorf) 1,5 ml από Greiner bio-one 4) Φίλτρα με διάμετρο πόρου 0,2 και 0,45 μm από Whatmann. 5) Μεμβράνες διαπίδυσης με cutoff 12-14 kd από Spectrum. 6) Πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων πολυστυρενίου από Greiner bio-one. 7) Υάλινα σιφώνια των 5, 10 και 20 ml. 8) Σύριγγες μιας χρήσης από B.D. 9) Φίλτρα τύπου ISOPORE διαμέτρου 200nm από την MILLIPORE. 10) Ιονανταλλακτικά φίλτρα για filter assay από την Whatmann 11) Πλαστικές φλάσκες για καλλιέργειες κυττάρων από Greiner bio-one. Όλα τα γυαλικά και πλαστικά είδη που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αποστειρωμένα ή αποστειρώνονταν με υγρή αποστείρωση με το πρωτόκολλο: 20 λεπτά στους 121 0 C. 2.1.3 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 1) Όλα τα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή ρυθμιστικών διαλυμάτων ήταν καθαρότητας τουλάχιστον 99% από τις εταιρίες Sigma και Applichem. 2) Τα λιποσώματα σχηματίστηκαν με τα φωσφολιπίδια Dimiristoyl Phosphatidyl choline (DMPC) και Dimiristoyl Phosphatidyl Glycerol (DMPG) από την Sigma και Dimiristoyl Phosphatidyl Ethanolamine Polyethylenoglycol (DMPE-PEG) από την Avanti Lipids. 3) Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιείται σαν βάση για την καλλιέργεια των High Five incect cells είναι το Express Five από την Invitrogen. 52

4) Τα συστατικά των θρεπτικών μέσων για τις καλλιέργειες ήταν από Invitrogen και Sigma. 5) α-μπουγκαροτοξίνη από Sigma, ιωδινιωμένη με NaI 125 από Amersham International. 2.1.4 ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ a. Μονοκλωνικό αντίσωμα mab35 από υβριδωματική σειρά αρρουραίου που προσδένεται σε μυϊκούς υποδοχείς ακετυλοχολίνης b. Αντισώματα από κουνέλι συζευγμένα με το ένζυμο της υπεροξυδάσης αγριοραπανίδος έναντι ανοσοσφαιρινών αρουραίου από PIERCE. c. Αντισώματα έναντι ανθρωπίνων ανοσοσφαιρινών από το AChRab kit. 2.1.5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αρουραίοι τύπου Lewis ηλικίας 4 εβδομάδων. 2.1.6 ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Τα ρυθμιστικά διαλύματα (Ρ.Δ.) που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη των οποίων η παρασκευή ή η σύσταση δεν αναφέρετε στο κεφάλαιο 2.2 ΜΕΘΟΔΟΙ περιγράφονται σε αυτή την παράγραφο: Τα Ρ.Δ. I, II και III που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση μεμβρανών από ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica (2.2.1) είναι τα ακόλουθα: Ι) Tris 50 mm EDTA 3 mm EGTA 1 mm PMSF 0,1 mm Iodoacetamine 5 mm Aprotinin 5 units/ml Pepstatin 5 μg/ml NaN 3 250 μl/l Ρύθμιση ph με προσθήκη υδροχλωρίου στην τιμή 7,5. II) 32% γλυκόζη in Ρ.Δ. (18,185gr in 50ml Ρ.Δ.) ΙII) 41% γλυκόζη in Ρ.Δ. (48,45 gr in 100ml Ρ.Δ.) 53

Τα Ρ.Δ. φωσφορικών (PB) διαφόρων τιμών ph και συγκεντρώσεων, παρασκευάζονται ως εξής: Παρασκευάζονται τα διαλύματα KH 2 PO 4 1M και K 2 ΗPO 4 1M και αναμειγνύονται μέχρι το ph να φτάσει στην επιθυμητή τιμή. Στη συνέχεια από το PB 1Μ, αραιώνοντας με d.d.h 2 O προκύπτουν οι άλλες συγκεντρώσεις Ρ.Δ. τύπου PB ίδιου ph. PBS: 60mM PB ph 7,4, 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl Tο διάλυμα χρώσης που χρησιμοποιείται στη μέθοδο Stewart παρασκευάζεται ως εξής: 27 g Ferric chloride hexahydrate 30,4 g ammonium thiocyanate Προσθήκη δις απεσταγμένου (δ.α.) H 2 O μέχρι το 1L Τα διαλύματα ΤΜΒ και Η 2 Ο 2 που χρησιμοποιούνται στην Elisa είναι έτοιμα από την Pierce ενώ το διάλυμα γλουταμίνης100x που χρησιμοποιείτε στην καλλιέργεια των Hi Five incect cells είναι έτοιμο από την Invitrogen. Τα θρεπτικά για την έκφραση του α1ecd στον ζυμομύκητα Pichia pastoris παρασκευάζονται ως εξής: YPD: δ.α. H 2 O: 500ml Yeast Extract: 5g Peptone: 10g Υγρή αποστείρωση 21 λεπτά στους 121 0 C Ύστερα προστίθεται αφού περάσει από φίλτρο των 0,2μm: Διάλυμα γλυκόζης 20%: 50ml BMGY: δ.α. H 2 O: 700ml Yeast Extract: 10g Peptone: 20g PB 1M ph 7:100ml Υγρή αποστείρωση 21 λεπτά στους 121 0 C Ύστερα προστίθενται αφού περάσουν από φίλτρο των 0,2μm: Διάλυμα γλυκερόλης 10%: 100ml Διάλυμα YNB 13,4%: 30ml 54

Διάλυμα βιοτίνης 0,02%: 4ml BMMY δ.α. H 2 O: 800ml Yeast Extract: 10g Peptone: 20g PB 1M ph 6:100ml Υγρή αποστείρωση 21 λεπτά στους 121 0 C Ύστερα προστίθενται αφού περάσουν από φίλτρο των 0,2μm: 100% μεθανόλη: 5ml Διάλυμα YNB 13,4% : 30ml Διάλυμα βιοτίνης 0,02%: 4ml Τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται για την έκφραση του α1ecd σε High Five κύτταρα εντόμων είναι τα εξής: Το θρεπτικό ανάπτυξης είναι: Express Five + 10% διάλυμα γλουταμίνης100x + γενταμυκίνη 50 μg/ml + πουρομυκίνη 15 μg/ml Το θρεπτικό αποθήκευσης σε θερμοκρασία υγρού αζώτου είναι 10% DMSO + 5% βόειος εμβρυϊκός ορός (FBS) + 42,5% Express Five + 42,5% θρεπτικό ανάπτυξης από την καλλιέργεια των κυττάρων που αποθηκεύονται. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου παρασκευάζονται ως εξής: Πήκτωμα διαχωρισμού: 3,4ml δ.α.h 2 O 2,5ml 1,5M Tris-HCl, ph 8,8 0,1ml 10% (w/v) SDS 3,3ml Acrylamide Bis-acrylmide (30%/0,8% w/v) 0,05 ml 10% (w/v) ammonium persulfate 5 μl TEMED Πήκτωμα φόρτωσης: 3,075ml δ.α.h 2 O 1,25ml 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8 0,1ml 10% (w/v) SDS 0,67ml Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0,8%w/v) 25μl 10 (w/v) ammonium persulfate 5 μl TEMED 55

Διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων 3x πυκνό 2,4 ml 1M Tris-Cl ph 6,8 3 ml 20% SDS 3ml Glycerol 100% 1,6 ml B-mercaptoethanol 0,006 gr Bromophenol blue Διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς 3,03 g Tris base 14,4 g Glycine 1gr SDS δ.α. H 2 O μέχρι το 1L Διάλυμα χρώσεως 0,1g Coomassie Blue R-250 40ml μεθανόλη 10g ακετοξικό οξύ δ.α. H 2 O μέχρι τα 100ml Διάλυμα αποχρωματισμού 40ml μεθανόλη 10g ακετοξικό οξύ δ.α. H 2 O μέχρι τα 100ml 56

2.2 ΜΕΘΟΔΟΙ 2.2.1 ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΩΝ ΑΠΟ ΤΑ ΗΛΕΚΤΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΑ ΤΟΥ ΨΑΡΙΟΥ Torpedo californica Για την παραλαβή των πλούσιων σε T. nachr μεμβρανών από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica ακολουθήθηκε το παρακάτω πρωτόκολλο: 1) 50 g ηλεκτρικών οργάνων από το ψάρι Torpedo californica παγώνουν με υγρό άζωτο και κονιορτοποιούνται. 2) Προστίθενται 100 ml Ρ.Δ. Ι και αποψύχονται μέχρι τους 4 0 C. 3) Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 7min στα 1500g στους 4 0 C. 4) Το ίζημα συλλέγετε και ακολουθεί δεύτερη φυγοκέντρηση για 60 min 33.000g στους 4 0 C, για την καθίζηση των εναπομεινάντων μεμβρανών σε αιώρηση. 5) Το ίζημα συλλέγετε και επαναιωρείται σε Ρ.Δ. ΙΙ μέχρι τα 23ml. Στη συνέχεια ομογενοποιείται σε υάλινο ομογενοποιητή. 6) Το ομογενοποίημα αποχύνεται πάνω από άλλα 23 ml Ρ.Δ. ΙΙΙ και γίνεται υπερφυγοκέντρηση για 4 ώρες στα 93.000g στους 4 0 C. 7) Συλλέγετε η φάση ανάμεσα στα δύο Ρ.Δ.s και αραιώνεται με Ρ.Δ. Ι 8) Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στα 93.000g στους 4 0 C. 9) Τα δύο τελευταία ιζήματα συλλέγονται και επαναιωρούνται σε 5ml Ρ.Δ. +5% γλυκερόλη. 10) Το εναιώρημα γίνεται aliquots παγώνουν στους -80 0 C. 57

2.2.2 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΦΕΡΟΥΝ T. nachr Η παρασκευή των λιποσωμάτων που φέρουν T. nachr έγινε σύμφωνα με το ακόλουθο πρωτόκολλο: 1) Οι μεμβράνες από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica ξεπαγώνουν και φυγοκεντρούνται στα 13.720g για 15λεπτά στους 4 0 C. 2) Έπειτα προστίθενται στο ίζημα 1ml PBS/Χολικό Νάτριο 2% και αφήνετε σε μέτρια ανάδευση για 3-4 ώρες στους 4 0 C. 3) Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 13.720g για 15λεπτά στους 4 0 C. 4) Σε απόλυτα καθαρή και στεγνή σφαιρική φιάλη των 50ml προστίθενται 3,33ml χλωροφορμίου και 1,67ml μεθανόλης και μετά την ανάμειξη τους προστίθενται 10mg DMPC, 5mg DMPG και από 1,5 έως 7 mg DMPE-PEG 2.000. 5) Ακολουθεί εξάτμιση των διαλυτών σε Rotary Evaporator στους 30 0 C για 2 ώρες για τη δημιουργία film φωσφολιπιδίων στα τοιχώματα της φιάλης. Το τελικό στέγνωμα του film γίνεται με ρεύμα αζώτου. 6) Στη συνέχεια προστίθενται σταδιακά στη σφαιρική φιάλη 1ml PBS Χολικό Νάτριο 2% στους 30 0 C και αναδεύοντας τα φωφολιπίδια μυκιλιοποιούνται. 7) Έπειτα προστίθενται στάγδην και υπό ανάδευση 1ml από το υπερκείμενο του βήματος 3). 8) Το περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης μπαίνει σε ημιπερατή μεμβράνη με πόρους 12-14 kdaltons και ακολουθεί dialysis σε 2 L PBS στους 30 0 C για 24 ώρες επί 2φορές. 9) Ακολουθούν αλλεπάλληλα περάσματα μέσα από φίλτρο isopore των 200nm για την μείωση του μέσου μεγέθους. 58

2.2.3 ΜΕΘΟΔΟΣ STEWART Για την ανίχνευση των φωσφολιπιδίων σε υδατικό διάλυμα χρησιμοποιείται η μέθοδος Stewart. Η χρωματομετρική αυτή μέθοδος αξιοποιεί την ιδιότητα που έχει το μετά αμμωνίου σίδηροθειοκυανικό άλας να σχηματίζει έγχρωμο σύμπλοκο με τα περισσότερα φωσφολιπίδια σε οργανικούς διαλύτες. Μία εξαίρεση είναι τα φωσφολιπίδια με φωσφατίδυλ-γλυκερόλη. Στην παρούσα μελέτη η τεχνική αυτή πραγματοποιήθηκε σε δυο φάσεις ως εξής: Δείγμα 700μl εκχυλίστηκε από κάθε κλάσμα της στήλης, με 700 μl χλωροφορμίου. Στη συνέχεια τα 700 μl χλωροφορμίου αναδεύονται ισχυρά με διάλυμα χρώσης και η οπτική απορρόφηση της στοιβάδας του χλωροφορμίου μετράτε στα 485 nm. Στη συνέχεια, συγκρίθηκαν οι οπτικές απορροφήσεις που έδωσαν τα δείγματα από τα διάφορα κλάσματα της στήλης. 59

2.2.4 ΕΝΖΥΜΟΣΥΝΔΕΤΗ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ (ELISA) Η ELISA είναι μια ιδιαίτερα διαδεδομένη και ευέλικτη τεχνική η οποία αξιοποιεί την ειδική πρόσδεση αντιγόνου-αντισώματος για ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών-αντιγόνων ή αντισωμάτων ανάλογα με το ζητούμενο κάθε φορά. Η αρχή λειτουργίας της μεθόδου βρίσκεται στα παρακάτω στάδια: Α) Η πρωτεΐνη-αντιγόνο επωάζεται στα φρεάτια της πλάκας μικροτιτλοδότησης με αποτέλεσμα ένα μέρος από αυτήν να προσκολλάτε στα τοιχώματα του φρεατίου. Β) Τα φρεάτια ξεπλένονται με το κατάλληλο Ρ.Δ. Γ) Γίνεται επώαση με το πρώτο αντίσωμα Δ) Ακολουθούν εκλύσεις με το κατάλληλο Ρ.Δ. Ε) Γίνεται επώαση με ένα δεύτερο αντίσωμα το οποίο προσδένεται στο πρώτο και είναι ομοιοπολικά συνδεμένο με το ένζυμο υπεροξειδάση από κάποιο είδος άγριοραπανίδας. Ζ) Ακολουθούν εκλύσεις με το κατάλληλο Ρ.Δ.. Η)Προστίθενται ένα κατάλληλο υπόστρωμα της υπεροξειδάσης που όταν οξειδώνεται μετατρέπεται σε χρωστική, μαζί με Η 2 Ο 2 στα φρεάτια. Θ) Μόλις σχηματιστεί χρώμα προστίθεται διάλυμα θειικού οξέος το οποίο σταματά την αντίδραση και μετράτε η οπτική απορρόφηση του κάθε φρεατίου. 60

Στην παρούσα μελέτη η ELISA έγινε χρησιμοποιώντας ως αντιγόνο τον T. nachr και ως αντίσωμα το mab35 με το εξής πρωτόκολλο: 1) Σε πλάκα μικροτιτλοδότησης των 96 φρεατίων προστίθενται 98μl PBS και 2μl με 1,6 pmol υποδοχέα Torpedo σε PBS/Χολικό Νάτριο 2%. Η πλάκα επωάζεται overnight και ακολουθούν 3 ξεπλύματα με PBS από 200μl 2) Ακολουθεί Blocking με 150μl PBS/BSA 2,5% για 1ώρα σε συνθήκες δωματίου και μετά 3 ξεπλύματα με PBS από 200μl. 3) Στη συνέχεια προστίθεται σε όγκο 100μl με Ρ.Δ. PBS/BSA 0,2% το δείγμα και ακολουθεί επώαση για 45 λεπτά σε συνθήκες δωματίου. Έπονται 3 ξεπλύματα με PBS/Triton 0,5 % από 200μl και 3 ξεπλύματα με PBS από 200μl. 4) Ακολουθεί επώαση με 100μl αντισώματος Rabit anti-rat 1:1.000 σε Ρ.Δ. BPS- BSA 0,2% για 30 λεπτά σε συνθήκες δωματίου. Έπονται 3 ξεπλύματα με PBS/tween 0,05% από 200μl και 3 ξεπλύματα με PBS από 200μl. 5) Στη συνέχεια προστίθενται 50μl διαλύματος ΤΜΒ και 50μl διαλύματος Η 2 Ο 2 σε κάθε φρεάτιο. 6) Ακολουθεί πρόσθεση 100μl διαλύματος H 2 SO 4 1M. 7) Τέλος γίνεται μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 450nm. Αν η ELISA γίνεται στα πλαίσια του προσδιορισμού της ικανότητας δέσμευσης mab35 από λιποσώματα με υποδοχέα, 4μl mab35 αραίωσης 1:10.000 επωάζονται με λιποσώματα σε όγκο 100μl με Ρ.Δ. PBS/BSA 0,2%. Αν η ELISA γίνεται για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του mab35 στον ορό των πειραματόζωων, 10 μl ορού προστίθενται σε κάθε φρεάτιο σε όγκο 100μl με Ρ.Δ. PBS/BSA 0,2%. 61

2.2.5 ΜΕΤΡΗΣΗ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ Ι 125 -ΜΠΟΥΓΚΑΡΟΤΟΞΙΝΗΣ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ (FILTER ASSAY) Το filter assay είναι μια μέθοδος που ανιχνεύει την αλληλεπίδραση πρωτεϊνών με διάφορους προσδέτες. Η τεχνική αυτή πραγματοποιείται σε δυο φάσεις. Στην πρώτη φάση η πρωτεΐνη επωάζεται με τον ραδιενεργά σημασμένο προσδέτη στο κατάλληλο Ρ.Δ. και στη δεύτερη το διάλυμα περνά υπό κενό από φίλτρο το οποίο φέρει φορτισμένες χημικές ομάδες οι οποίες έχουν την ιδιότητα να προσροφούν πρωτεΐνες με ιοντικούς δεσμούς. Οι εκπλύσεις που ακολουθούν με Ρ.Δ. που περιέχει απορρυπαντικό διώχνουν το μεγαλύτερο ποσοστό του προσδέτη που έχει προσροφηθεί μη ειδικά. Τέλος τα φίλτρα συλλέγονται και μετρούνται σε μετρητή ακτινοβολίας. Το filter assay που έγινε στην παρούσα μελέτη εκτελέστηκε ως εξής: 1. Γίνεται επώαση 2 ωρών σε συνθήκες δωματίου των δειγμάτων με ποσότητα I 125 -μπουγκαροτοξίνης που δίνει 50.000 κρούσεις το λεπτό (CPM) σε Ρ.Δ. PBS/BSA 0,2%. 2. Τα δείγματα περνούν από φίλτρα DEAE σεφαρόζης υπό κενό και μετά από πλύσεις κάθε φίλτρου με 4ml από 20mM Tris, 0,5% Triton, ph:7,4 μετρήθηκαν οι κρούσεις των φίλτρων σε μετρητή γ-ακτινοβολίας. Για το filter assay που έγινε για έλεγχο της ενσωμάτωσης του υποδοχέα στα λιποσώματα, (παράγραφος 1.1) αρχικά προστέθηκε σε όλα τα κλάσματα της στήλης ποσότητα Sodium Cholate ώστε η τελική του συσκέντρωση σε αυτά να είναι 2% και ύστερα προστέθηκε I 125 -μπουγκαροτοξίνη. 62

2.2.6 ΒΙΟΚΑΤΑΝΟΜΕΣ Ένας συνηθισμένος τρόπος για να παρατηρηθεί η πορεία μιας ουσίας in vivo είναι να σημανθεί ραδιενεργά ή χημικά και στη συνέχεια να χορηγηθεί σε πειραματόζωα. Σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα μετά την χορήγηση τα ζώα θανατώνονται και οι διάφοροι ιστοί αφαιρούνται και μετρώνται σε αυτούς είτε οι ραδιενεργές κρούσεις είτε η παρουσία της χημικής σήμανσης Οι βιοκατανομές των λιποσωμάτων και του υποδοχέα σε PBS και PBS/Χολικό Νάτριο 2% (PBS/X.N. 2%) έγιναν σε αρουραίους τύπου Lewis βάρους 50 περίπου g. Τα λιποσώματα για τις βιοκατανομές ήταν σημασμένα με ραδιοσημασμένη μπουγκαροτοξίνη. Η πορεία που ακολουθήθηκε για την παρασκευή τους ήταν η εξής: 1. Διάλυση του παρασκευάσματος Torpedo για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε PBS/X.N. 2% 2. Φυγοκέντρηση στα 13.720g για 15λεπτά στους 4 0 C. 3. Επώαση του υπερκειμένου με σημασμένη τοξίνη για 3 ώρες R.T. 4. Ξέπλυμα με PBS/X.N. 2% σε spinfilter με πόρους 30.000 Dalton για να ξεπλυθεί η μη προσδεμένη τοξίνη. 5. Προσθήκη στο διάλυμα φωσφολιπιδίων σε PBS/X.N. 2%. 6. Dialysis για 2 μέρες σε PBS. 7. Αλλεπάλληλα περάσματα από συσκευή με φίλτρο τύπου IsoPore με πόρους 200nm πριν την χορήγηση. 8. Ενδοφλέβια χορήγηση στη φλέβα της ουράς σε τρία ζώα για κάθε ένα από τα χρονικά διαστήματα των 1, 3 και 24 ωρών, για κάθε δείγμα λιποσωμάτων ή υποδοχέα. 9. Θανάτωση των ζώων και απομόνωση των επιμέρους οργάνων. 10. Μέτρηση των κρούσεων από όλα τα όργανα ανά λεπτό σε μετρητή γ- ακτινοβολίας. 11. Οι κρούσεις από όλα τα όργανα αθροίζονται και με βάση την δόση της ακτινοβολίας που έλαβε το ζώο, υπολογίζεται ένας συντελεστής με τον οποίο πολλαπλασιάζονται οι τιμές έτσι ώστε το άθροισμά τους να είναι ίσο με τις κρούσεις που έλαβε το ζώο συνολικά. 12. Με βάση τις διορθωμένες κρούσεις, υπολογίζεται το ποσοστό της ακτινοβολίας που κατανεμήθηκε σε κάθε όργανο. 63

2.2.7 ΜΕΘΟΔΟΣ BRADFORD Η μέθοδος Bradford είναι μια χρωματομετρική μέθοδος για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε διάλυμα. Η μέθοδος στηρίζεται στη δημιουργία έγχρωμου συμπλόκου, με μέγιστο απορρόφησης στα 595nm, της χρωστικής Coomassie brilliant blue με τα κατάλοιπα λυσίνης των πρωτεϊνών. Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης και έτσι η τελευταία υπολογίζεται εύκολα με βάση μια πρότυπη καμπύλη που συνήθως κατασκευάζεται με φωτομέτρηση γνωστής συγκέντρωσης διαλυμάτων αλβουμίνης. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιείται ένα έτοιμο διάλυμα χρωστικής Bradford από την BIORAD, το οποίο αραιώνεται 5 φορές και από αυτό προστίθενται 1ml σε κάθε δείγμα πρωτεΐνης των 100μl. Η πρότυπη καμπύλη κατασκευάστηκε με συγκεντρώσεις αλβουμίνης 0,125, 0,250, 0,500, 1, 1,5 mg/ml. 64

2.2.8 ΕΤΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΦΡΑΣΗ, ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ ECD ΤΗΣ a1 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΜΥΪΚΟΥ ΤΥΠΟΥ nachr, ΣΤΟΝ ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΑ Pichia pastoris. Η έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στον ζυμομύκητα Pichia pastoris γίνεται μέσω ειδικών για το σύστημα πλασμιδίων, στα οποία ενσωματώνονται τα γονίδια των προς έκφραση πρωτεϊνών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιείται στέλεχος του ζυμομύκητα Pichia pastoris μετασχηματισμένο με το πλασμίδιο ppic-zaa Εικόνα 19 το οποίο φέρει το ανασυνδυασμένο ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου μυϊκού nachr. Το πλασμίδιο αυτό, προάγει την υπερέκφραση και την έκκριση εξωκυτταρικά από τον μύκητα, α1 ECD που φέρει στο καρβοξυτελικό του άκρο έξι διαδοχικά κατάλοιπα ιστιδινών για την εύκολη απομόνωση με χρωματογραφία συγγένειας, με στήλη Ni 2+ -NTA (παράγραφος 2.2.11). Επίσης το πλασμίδιο αυτό φέρει και ένα γονίδιο που προσδίδει αντοχή στο αντιβιοτικό ζεοσίνη. Εικόνα 19. Το πλασμίδιο ppic-zaa. Διακρίνεται το τμήμα που περιέχει αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από διάφορα περιοριστικά ένζυμα για την ενσωμάτωση του γονιδίου της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης καθώς και το τμήμα Zeocin που βρίσκεται το γονίδιο που προσδίδει αντοχή στο αντιβιοτικό ζεοσίνη. (εικόνα από Invitrogen) 65

Η καλλιέργεια για την παραγωγή της πρωτεΐνης γίνεται σε τρία στάδια. Στο πρώτο στάδιο, 10ml θρεπτικό YPD εμβολιάστηκε με καλλιέργεια ζυμομύκητα σε YPD η οποία ήταν αποθηκευμένη στους -80 ο C με 30% γλυκερόλη. Αυτό το στάδιο είναι προπαρασκευαστικό για να ανακάμψει ο ζυμομύκητας από την πολύ χαμηλή θερμοκρασία και να φτάσει στη φάση εκθετικής ανάπτυξης. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 30 ο C υπό ανάδευση στις 225 στροφές το λεπτό (rpm), ξεκινά το δεύτερο στάδιο στο οποίο η προηγούμενη καλλιέργεια αποχύνεται σε 1L θρεπτικό BMGY που περιέχει 1% γλυκερόλη. Η γλυκερόλη εξασφαλίζει τη μη έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης και άρα ταχύτερη αύξηση για τον ζυμομύκητα. Στο στάδιο αυτό γίνεται η αύξηση του μύκητα. Η καλλιέργεια επωάζεται στους 30 ο C υπό ανάδευση στις 225 rpm μέχρι η οπτική της πυκνότητα να φτάσει την τιμή 4 σε μήκος κύματος 600nm. Όταν αυτό επιτευχθεί, ξεκινά το τρίτο στάδιο όπου η καλλιέργεια φυγοκεντρείται στα 2.000g για 10 λεπτά και στη συνέχεια το ίζημα επαναιωρείται σε 4L θρεπτικού BMMY, το οποίο περιέχει 0,5% μεθανόλη, η οποία επάγει την υπερέκφραση του α1 ECD. Η καλλιέργεια αυτή συνεχίζεται για 3 μέρες στους 22 ο C υπό ανάδευση στις 225 rpm. Όταν τα τρία προηγούμενα στάδια έχουν ολοκληρωθεί, ακολουθούν η απομόνωση και ο καθαρισμός του α1 ECD σύμφωνα με το παρακάτω πρωτόκολλο: a. Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας σε θρεπτικό BMMY στα 18.500g για 15 λεπτά στους 4 ο C. b. Φιλτράρισμα του υπερκειμένου με φίλτρο κενού με όριο διαπερατότητας τα 0,2 μm. c. Συμπύκνωση του φιλτραρισμένου υπερκειμένου με περισταλτική αντλία και κασέτα συμπύκνωσης ορίου διαπερατότητας τα 10 kd μέχρι τα 100ml. d. Συνέχιση της απομόνωσης και του καθαρισμού του α1 ECD με χρωματογραφία συγγένειας και μοριακού αποκλεισμού όπως περιγράφεται στις παραγράφους 2.10 και 2.11. 66

2.2.9 ΕΤΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ ECD ΤΗΣ α1 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ, ΜΥΪΚΟΥ ΤΥΠΟΥ nachr, ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιείται στέλεχος των High Five το οποίο είναι μόνιμα μετασχηματισμένο με το γονίδιο του ανασυνδυασμένου ECD της α1 υπομονάδας του ανθρωπίνου μυϊκού nachr. Το στέλεχος αυτό εκφράζει και εκκρίνει στον εξωκυτταρικό χώρο ανασυνδυασμένο α1 ECD το οποίο φέρει στο καρβοξυτελικό του άκρο έξι διαδοχικά κατάλοιπα ιστιδινών. Η καλλιέργεια για την παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ξεκινά με τον εμβολιασμό 5ml θρεπτικού μέσου σε φλάσκα τον 25 ml, με 3x10 6 κύτταρα εντόμων High Five τα οποία διατηρούνταν παγωμένα σε θερμοκρασία υγρού αζώτου σε 1ml θρεπτικό αποθήκευσης. Μετά το πέρας 1 ώρας επώασης στους 27 ο C, το υγρό περιεχόμενο της φλάσκας αποχύνεται μαζί με όσα κύτταρα δεν έχουν προσδεθεί στα τοιχώματα και προστίθενται άλλα 5 ml φρέσκου θρεπτικού. Η καλλιέργεια συνεχίζεται μέχρι τα κύτταρα να καλύψουν το 90-100% της επιφάνειας της φλάσκας, οπότε και γίνεται ανακαλλιέργεια κατά την οποία κύτταρα μιας κορεσμένης καλλιέργειας μεταφέρονται σε καινούργια φλάσκα με φρέσκο θρεπτικό ώστε η καινούργια καλλιέργεια να ξεκινήσει με πυκνότητα 20%. Οι κορεσμένες καλλιέργειες, μετά την ανακαλλιέργεια χρησιμοποιούνται για την παραλαβή του α1 ECD. Το υγρό περιεχόμενο της φλάσκας μετά από φυγοκέντρηση στα 600g για 10 λεπτά συλλέγετε και αποθηκεύεται στους -80 ο C. Όταν συγκεντρώνεται 1L υπερκειμένου συνολικά, αποψύχεται και αφού συμπυκνωθεί με περισταλτική αντλία και κασέτα με όριο διαπερατότητας 10kd μέχρι τα 100ml, απομονώνεται και καθαρίζεται περαιτέρω με χρωματογραφία συγγένειας και μοριακού αποκλεισμού. 67

2.2.10 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ Η χρωματογραφία συγγένειας αξιοποιεί την ιδιότητα που μπορεί να έχει μια πρωτεΐνη ανάλογα με τη δομή της να προσδένεται ειδικά σε κάποιο είδος σφαιριδίων για τον καθαρισμό της από προσμείξεις. Στην παρούσα μελέτη οι πρωτεΐνες φέρουν στο καρβοξυτελικό τους άκρο έξι διαδοχικά κατάλοιπα ιστιδινών, τα οποία προσδένονται ισχυρά (πιο δυνατά από τον μέσο δεσμό αντιγόνου-αντισώματος) σε ιόντα Νικελίου τα οποία βρίσκονται με τη μορφή συμπλόκου στην επιφάνεια σφαιριδίων σεφαρόζης. Για να επιτευχθεί ο καθαρισμός της πρωτεΐνης από τη στήλη, απαραίτητο είναι μετά την πρόσδεσή της στα σφαιρίδια, να ακολουθούν εκπλύσεις για την απομάκρυνση των προσμείξεων. Στη παρούσα μελέτη τα παραπάνω έγιναν με εκλούσεις της στήλης με Ρ.Δ. τα οποία είχαν όλο και μεγαλύτερη συγκέντρωση ιμιδαζολίου. Το ιμιδαζόλιο επειδή είναι η χαρακτηριστική ομάδα των καταλοίπων ιστιδίνης ανταγωνίζεται την πρόσδεση των ιστιδινών από τις πρωτεΐνες στα σφαιρίδια ανάλογα με τη συγκέντρωσή του. Σε συγκεντρώσεις έως 50mM εκτοπίζει όλες τις πρωτεΐνες οι οποίες έχουν λιγότερα από 6 συνεχόμενα κατάλοιπα ιστιδινών. Σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 150 mm εκτοπίζει και τις πρωτεΐνες με 6 διαδοχικά κατάλοιπα ιστιδινών επιτρέποντας την έκλουση και παραλαβή τους. Το Ρ.Δ. στο οποίο έγινε η πρόσδεση της πρωτεΐνης στα σφαιρίδια περιείχε 10-20mM ιμιδαζολίου για την αποτροπή της πρόσδεσης πρωτεϊνών που διέθεταν τυχαία, γειτονικά ιστιδινικά κατάλοιπα. Ειδικότερα ο καθαρισμός των a1 ECDs με στήλη Νικελίου έγινε ως εξής: 1. Συμπύκνωση του υπερκειμένου της καλλιέργειας, dialysis στο Ρ.Δ.: 50 mm PB, ph 8, 300 mm NaCl, 10 mm ιμιδαζολίου, πρόσθεση 2ml σφαιριδίων σεφαρόζης-νικελίου και επώαση στους 4 o C υπό ανάδευση για 2 ώρες. 2. Πακετάρισμα της στήλης Νικελίου και έκπλυση με 2 όγκους στήλης από το ίδιο Ρ.Δ. 3. Έκλουση της στήλης με 2 όγκους Ρ.Δ. 50 mm PB, ph 8, 300 mm NaCl, 40 mm ιμιδαζολίου 4. Έκλουση της στήλης με 2 όγκους Ρ.Δ. 50 mm PB, ph 8, 300 mm NaCl, 150 mm ιμιδαζολίου 68

2.2.11 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού είναι μια τεχνική η οποία κάνει δυνατό το διαχωρισμό μορίων με διαφορετικά μοριακά βάρη χρησιμοποιώντας μια στήλη μοριακού αποκλεισμού. Η αρχή λειτουργίας της τεχνικής αυτής βρίσκεται στη μοριακή δομή της στήλης η οποία αποτελείται από πορώδη σφαιρίδια. Τα μεγάλου μεγέθους μόρια εισχωρούν στο πορώδες δίκτυο πολύ λιγότερο από τα μικρότερα και έτσι εκλούονται από τη στήλη γρηγορότερα. Στην παρούσα μελέτη η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της ενσωμάτωσης του Torpedo nachr στα λιποσώματα και στον καθαρισμό των a1 ECDs. Στην πρώτη περίπτωση λιποσώματα πέρασαν από στήλη τύπου Sephacryl S1000, με μήκος 1m και όγκο 100ml. Ως Ρ.Δ. έκλουσης χρησιμοποιήθηκαν 3 όγκοι στήλης PBS ph: 7,4. Στη δεύτερη περίπτωση τα ECDs πέρασαν από στήλη Superoze 12 όγκου 24ml με 3 όγκους Ρ.Δ. έκλουσης: 50mM PB ph 7,4, 150mM NaCl. 69

2.2.12 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΣΕ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ (SDS PAGE) Η ηλεκτροφόρηση είναι η τεχνική πρώτης επιλογής για τον προσδιορισμό των μοριακών βαρών των πρωτεϊνών που υπάρχουν σε ένα δείγμα καθώς είναι απλή, οικονομική ενώ ταυτόχρονα προσφέρει μια καλή εικόνα για τα Μ.Β. των πρωτεϊνών του δείγματος και δίνει την δυνατότητα για εκτίμηση της συγκέντρωσής τους. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στο γεγονός ότι όταν ένα φορτισμένο μόριο βρεθεί μέσα σε ηλεκτροστατικό πεδίο, κινείται προς τον αντίθετα φορτισμένο πόλο. Ανάλογα με το επιθυμητό αποτέλεσμα η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει είτε σε φυσιολογικές συνθήκες είτε σε αποδιατακτικές. Στην τελευταία περίπτωση το δείγμα επωάζεται για 5 λεπτά στους 100 0 C πριν φορτωθεί, ενώ σε όλα τα στάδια οι πρωτεΐνες βρίσκονται σε Ρ.Δ. που περιέχει 1% δινατριούχου θεϊκό δωδεκακυλικό νάτριο (SDS). Το SDS διατηρεί τις πρωτεΐνες αποδιαταγμένες ενώ ταυτόχρονα τους προσδίδει αρνητικό φορτίο που είναι ανάλογο με τον αριθμό των καταλοίπων που διαθέτουν. Έτσι η συμπεριφορά τους στην ηλεκτροφόρηση εξαρτάται μόνο από το μοριακό τους βάρος. Επίσης αν χρειάζεται, το Ρ.Δ. φόρτωσης μπορεί να περιέχει και μερκαπτοαιθανόλη η οποία διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς που μπορεί να υπάρχουν στην πρωτεΐνη και να συγκρατούν ενωμένες δυο ή περισσότερες πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου χωρίζεται σε δυο μέρη. Το ένα μέρος που περιέχει και τα φρεάτια στα οποία φορτώνεται το δείγμα, έχει μικρή πυκνότητα και χρησιμεύει για την προετοιμασία των πρωτεϊνών, πριν τρέξουν στο κυρίως τμήμα του πηκτώματος το οποίο έχει υψηλότερη πυκνότητα και προκαλεί τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών καθώς ηλεκτροφορούνται. Ανάλογα με το μέγεθος των πρωτεϊνών που αναμένεται να βρίσκονται στο δείγμα κειμένεται και η πυκνότητα του τμήματος του πηκτώματος που προκαλεί τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών. Για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών μεγάλου μοριακού βάρους χρησιμοποιείται μικρής πυκνότητας πήκτωμα ενώ για τον διαχωρισμό μικρού μοριακού βάρους χρησιμοποιείται μεγάλης πυκνότητας πήκτωμα. Στην παρούσα μελέτη το μέρος του πηκτώματος που χρησιμεύει στη φόρτωση έχει πυκνότητα 4% και το μέρος που διαχωρίζει τις πρωτεΐνες 12% 70

2.2.13 ΡΑΔΙΟΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Η ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA) είναι μια τεχνική με την βοήθεια της οποίας ανιχνεύονται αντισώματα έναντι ενός συγκεκριμένου αντιγόνου σε ένα δείγμα. Η αρχή λειτουργίας της βρίσκεται στην ιδιότητα που έχουν τα αντισώματα να προσδένονται ειδικά στο αντιγόνο τους σχηματίζοντας σύμπλοκα μεγάλου μοριακού βάρους. Στην πράξη το πρώτο βήμα είναι η ράδιοσήμανση της πρωτεΐνης-αντιγόνου. Το δεύτερο βήμα είναι η επώαση του ραδιοσημασμένου αντιγόνου με το δείγμα. Αν το δείγμα περιέχει αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης-αντιγόνου θα δημιουργηθεί σύμπλοκο. Ακολουθεί επώαση με αντισώματα από άλλο είδος τα οποία προσδένονται στα πρώτα αντισώματα δημιουργώντας πολύ βαρύτερα σύμπλοκα που καταβυθίζονται εύκολα με φυγοκέντρηση. Εάν στο δείγμα υπήρχαν αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης-αντιγόνου, στο ίζημα θα έχει εγκλωβιστεί ραδιενέργεια, η οποία θα προέρχεται από την σημασμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο. Το τελευταίο βήμα περιλαμβάνει εκπλύσεις με κατάλληλο Ρ.Δ. για την απομάκρυνση της μη προσδεμένης ραδιενέργειας και μέτρηση των ραδιενεργών κρούσεων. Όσο περισσότερα αντισώματα έναντι του αντιγόνου υπάρχουν στο δείγμα, τόσες περισσότερες κρούσεις στη μονάδα του χρόνου μετρώνται. Στην παρούσα μελέτη η RIA πραγματοποιήθηκε με 40 ng από τα ECDs της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου μυϊκού nachr, εκφρασμένα στον ζυμομύκητα Pichia pastoris και σε κύτταρα εντόμων High Five, τα οποία ραδιοσημάνθηκαν με επώαση Ι 125 -μπουγκαροτοξίνης ενεργότητας 50.000 κρούσεων ανά λεπτό (50.000 CPM) για 2 ώρες στους 4 ο C. Η επώαση με τα δείγματα (οροί ασθενών) διήρκησε 14 ώρες στους 4 ο C, ενώ ο σχηματισμός των μεγαλύτερων αδιάλυτων συμπλόκων έγινε κατόπιν επώασης 2ωρών στους 4 ο C με, 20μl διαλύματος αντί-ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών, για κάθε 1μl ανθρώπινου ορού που υπήρχε σε κάθε αντίδραση. Η φυγοκέντρηση για την καταβύθιση των συμπλόκων αντιγόνου-αντισωμάτων έγινε στα 12.000g για 5 λεπτά ενώ οι πλύσεις για την απομάκρυνση της μη-ειδικά δεσμευμένης ραδιενέργειας έγιναν με προσθήκη 1ml PBS/Triton 0,5%, ανάδευση, φυγοκέντρηση και αναρρόφηση του υπερκειμένου για κάθε αντίδραση από δύο φορές. 71

3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 72

Α ΜΕΡΟΣ Για να πραγματοποιηθούν τα πειράματα αυτού του μέρους έγιναν τα παρασκευάσματα του Πίνακα 1. Για λόγους συντομίας τα παρασκευάσματα συμβολίζονται με το ποσοστό επικάλυψής τους με PEG και τη συγκέντρωση του T. nachr σε pmol/ml π.χ. 2,5/100 (2,5% επικάλυψη με PEG/ 100 pmol/ml T. nachr) Πίνακας 1: Παρασκευάσματα T. nachr και λιποσωμάτων με T.nAChR που προετοιμάστηκαν για τα πειράματα του πρώτου μέρους* ΣΥΣΤΑΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ-ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΗ 10mg DMPC, 5mg DMPG, 1,5mg DMPE-PEG 2,5/0 10mg DMPC, 5mg DMPG, 3,5mg DMPE-PEG 5,5/0 10mg DMPC, 5mg DMPG, 7mg DMPE-PEG 11/0 10mg DMPC, 5mg DMPG, 1,5mg DMPE-PEG, 200 pmol Τ. nachr 2,5/100 10mg DMPC, 5mg DMPG, 3,5mg DMPE-PEG, 200 pmol Τ. nachr 5,5/100 10mg DMPC, 5mg DMPG, 1,5mg DMPE-PEG, 400 pmol Τ. nachr 2,5/200 10mg DMPC, 5mg DMPG, 3,5mg DMPE-PEG, 400 pmol Τ. nachr 5,5/200 10mg DMPC, 5mg DMPG, 7mg DMPE-PEG, 400 pmol Τ. nachr 11/200 400 pmol Τ. nαchr σε PBS PBS/200 400 pmol Τ. nachr σε PBS/X.N. 2% PBS/Χ.Ν./200 10mg DMPC, 5mg DMPG, 400 pmol Τ.nAChR 0/200 50mg DMPC, 25mg DMPG, 45mg DMPE-PEG, 4 nmol Τ.nAChR 11/2000 4 nmol Τ. nαchr σε PBS PBS /2000 4 nmol Τ. nachr σε PBS/X.N. 2% PBS/Χ.Ν./2000 *Κάθε παρασκεύασμα είναι σε τελικό όγκο 2ml 73

3.A.1 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ T. nachr ΣΤΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ, ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ Προκειμένου να αποδειχθεί ότι ο T. nachr ενσωματώνεται στα λιποσώματα, παρασκευάστηκαν τα λιποσώματα 5,5/200 του Πίνακα 1 και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού χρησιμοποιώντας στήλη τύπου Sephacryl S1000 και ως buffer έκλουσης PBS ph 7,4. Επίσης το παρασκεύασμα PBS/200 πέρασε από την ίδια στήλη ως μάρτυρας. Τα κλάσματα της στήλης συγκεντρώθηκαν και σε κάθε ένα από αυτά πραγματοποιήθηκε filter assay με I 125 -α-μπουγκαροτοξίνη ( 125 Ι-α-Bgt) για την ανίχνευση του T. nachr. Για την ανίχνευση των φωσφολιπιδίων των λιποσωμάτων πραγματοποιήθηκε στα κλάσματα η μέθοδος Stewart. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν και από τις δύο τεχνικές στα διάφορα κλάσματα της στήλης παριστάνονται στην Εικόνα 19. 3000 2500 PBS/200 5,5/200 O.A.(485nm) 1,4 1,2 Κρούσεις/λεπτό 2000 1500 1000 500 1 0,8 O.A. 0,6 0,4 0,2 0 4 20 36 52 68 84 100 116 132 148 Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 19: Επαλήθευση ενσωμάτωσης του T. nachr σε λιποσώματα. Για να διαπιστωθεί αν ο υποδοχέας ενσωματώθηκε στα λιποσώματα, λιποσώματα με T. nachr υποβλήθηκαν σε χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού όπως και T. nachr σε PBS ως μάρτυρας,. Τα κλάσματα της στήλης αναλύθηκαν με filter assay (αριστερός άξονας) και με τη μέθοδο Stewart (δεξιός άξονας) για την ανίχνευση του T. nachr και των φωσφολιπιδίων αντίστοιχα. Από την Εικόνα 19 φαίνεται ότι ο T. nachr έχει ενσωματωθεί στα λιποσώματα, καθώς το μέγιστο της ραδιενέργειας του T. nachr των λιποσωμάτων και το μέγιστο της οπτικής απορρόφησης (Ο.Α.) που δίνουν τα φωσφολιπίδια στη μέθοδο Stewart ταυτίζονται σε όγκο έκλουσης 48 ml. Αντίθετα το μέγιστο της ραδιενέργειας που δίνει o T. nachr σε PBS αντιστοιχεί σε όγκο έκλουσης 64 ml. 0 74

3.A.2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ME T. nachr Για να διερευνηθεί η σταθερότητα λιποσωμάτων με διάφορες αναλογίες φωσφολιπιδίων και παρασκευάσματος T. nachr, παρασκευάστηκαν τα λιποσώματα 2,5/100, 5,5/100, 5,5/200, 11/200 του Πίνακα 1 και έγιναν μετρήσεις DLS για τον προσδιορισμό της μέσης διαμέτρου και της τυπικής απόκλισης των μέσων διαμέτρων. Οι μετρήσεις έγιναν σε διάφορα χρονικά διαστήματα από την ημέρα παρασκευής των λιποσωμάτων, αποθηκευμένα στους 4 ο C. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων με DLS ως προς τη μέση διάμετρο των λιποσωμάτων φαίνονται στην Εικόνα 20. Μέση διάμετρος (nm) 250 200 150 100 50 2,5/100 5,5/100 5,5/200 11/200 0 0 5 10 15 20 25 30 Ημέρες Εικόνα 20: Η μέση διάμετρος των λιποσωμάτων, ως προς το χρόνο που πέρασε από την ημέρα παρασκευής τους. Για να εκτιμηθεί η σταθερότητα των λιποσωμάτων, η μέση διάμετρος προσδιορίστηκε με DLS σε διάφορα χρονικά διαστήματα από την ημέρα παρασκευής. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 20, κατά τις πρώτες 10 ημέρες, τα μέσα μεγέθη των λιποσωμάτων όλων των συστάσεων είναι παρόμοια και γύρω στα 100nm. Το μέσο μέγεθος σε όλα τα είδη λιποσωμάτων, εκτός από τα 5,5/200 παρέμεινε σταθερό σε όλες τις μετρήσεις που έγιναν μετά την παρασκευή τους. Στην Εικόνα 20 υποδεικνύεται ότι τα 5,5/200 λιποσώματα άρχισαν να συσσωματώνονται μετά το πέρας των πρώτων 10 ημερών. 75

Επιπλέον από τη μέση διάμετρο, η σταθερότητα ή μη των λιποσωμάτων μπορεί να φανεί και από την τυπική απόκλιση των διαμέτρων, η οποία προσδιορίζει την ετερογένεια του μεγέθους των λιποσωμάτων σε ένα παρασκεύασμα. Στην Εικόνα 21 παριστάνεται η τυπική απόκλιση των μεγεθών των λιποσωμάτων που έχουν τα παρασκευάσματά τους, συναρτήσει των χρόνων που μεσολάβησαν από την κατασκευή τους. Τυπική απόκλιση 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 2,5/100 5,5/100 5,5/200 11/200 0 0 5 10 15 20 25 30 Ημέρες Εικόνα 21: Τυπική απόκλιση των μεγεθών των λιποσωμάτων κάθε σύστασης ως προς τον χρόνο που μεσολάβησε από την ημέρα παρασκευής τους. Επιπλέον από τη μέση διάμετρο, η σταθερότητα των λιποσωμάτων προσδιορίζεται και από την τυπική απόκλιση των διαμέτρων τους, η οποία προσδιορίζει την ετερογένεια του μεγέθους των λιποσωμάτων σε ένα παρασκεύασμα. Στην Εικόνα 21 φαίνεται ότι κατά τη διάρκεια των πρώτων δέκα ημερών τα λιποσώματα, όλων των συστάσεων εκτός των 11/200, είχαν περίπου την ίδια σχετικά χαμηλή τυπική απόκλιση στα μεγέθη τους. Μετά το πέρας των 10 πρώτων ημερών όλα τα λιποσώματα των συστάσεων εκτός των 2,5/100 παρουσιάζουν αύξηση της τυπικής απόκλισης των μεγεθών τους, που είναι σαφής ένδειξη αλλοίωσης. Τα πλέον σταθερά λιποσώματα ήταν τα 2,5/100. Η τυπική απόκλιση των μεγεθών τους παρέμεινε σχεδόν σταθερά στη χαμηλότερη τιμή από τα λιποσώματα με τις άλλες συστάσεις μέχρι και 25 ημέρες από την ημέρα παραγωγής. Πειράματα σταθερότητας, έμμεσα, έγιναν ακόμα μετρώντας και συγκρίνοντας την ικανότητα των λιποσωμάτων διαφόρων συστάσεων να προσδένουν mab35 και 125 Ι-α- Bgt σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα μετά την παρασκευή τους. Αυτά τα πειράματα περιγράφονται στα κεφάλαια 3.Α.4 και 3.Α.5. 76

3.A.3 ΑΠΕΙΚΟΝΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΜΕ T. nachr ΜΕ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΑΤΟΜΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΕΩΝ Για επαλήθευση του σχηματισμού των λιποσωμάτων καθώς και για περισσότερες πληροφορίες γύρω από τη μορφολογία τους, πραγματοποιήθηκε AFM, στο λιποσωμικό παρασκεύασμα 5,5/200 το οποίο έδωσε την Εικόνα 22 για ένα δείγμα 12 ημερών. Εικόνα 22: Δυο διαφορετικές απεικονίσεις από το ίδιο δείγμα εναιωρήματος λιποσωμάτων 5,5/200, 12 ημέρες από την παρασκευή τους. Από τις παραπάνω εικόνες μπορούμε κατ αρχήν να συμπεράνουμε ότι τα λιποσώματα έχουν σχηματιστεί και μάλιστα μέσα στα όρια μεγέθους που υπολογίστηκαν με DLS (100nm). Επίσης φαίνεται να έχουν υποστεί μικρού βαθμού συσσωμάτωση, κάτι αναμενόμενο, καθώς η ανάλυσή τους με DLS έγινε 12 ημέρες μετά την παρασκευή τους. 77

3.A.4 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ in vitro ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ mαb35 ΑΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕ T. nachr Ο προσδιορισμός της ικανότητας πρόσδεσης mab35 από τα παρασκευάσματα με T. nachr, έγινε με ELISA στην οποία τα φρεάτια είχαν στρωθεί με T. nachr. Τα λιποσώματα προεπωάζονταν με mab35 (0,5μg/ml) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και ύστερα το μείγμα της επώασης μεταφερόταν στην πλάκα ELISA. Όσα περισσότερα αντισώματα προσδένονταν στα λιποσώματα τόσο λιγότερα παρέμεναν διαθέσιμα για να προσδεθούν στον T. nachr και το σήμα μειωνόταν ανάλογα. Αρχικά ελέγχθηκαν τα όρια μέσα στα οποία η ένταση του χρώματος που δημιουργούν τα φρεάτια είναι ανάλογη της ποσότητας του mab35. Γι αυτό μετρήθηκε η Ο.Α. σε συνάρτηση με την ποσότητα mab35 (0,5μg/ml) που προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Ο.Α. 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 όγκος mab35, C:0,5 μg/ml (μl) Εικόνα 23: Πρότυπη καμπύλη για τον προσδιορισμό των ορίων μέσα στα οποία η δημιουργία χρώματος στα φρεάτια είναι ανάλογη της ποσότητας του mab35. Η Ο.Α. μετρήθηκε σε κάθε φρεάτιο ως συνάρτηση του όγκου του διαλύματος mab35 συγκέντρωσης 0,5μg/ml. Όπως φαίνεται στο παραπάνω διάγραμμα η γραμμική περιοχή ποσότητας mab35- έντασης χρώματος είναι μέχρι περίπου 30μl mab35 συγκέντρωσης 0,5μg/ml. Από τη γραμμική περιοχή επιλέχθηκαν τα 4μl (2ng mab35) για να χρησιμοποιηθούν στα επόμενα πειράματα in vitro δέσμευσης καθώς είναι η μικρότερη ποσότητα που δίνει σαφές σήμα στην ELISA. 78

Για να εξεταστεί αν κάποιο ποσοστό του mab35 προσροφάτε στα φωσφολιπίδια των λιποσωμάτων, επωάστηκαν 2ng mab35 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, με ποσότητες εναιωρήματος λιποσωμάτων: 2,5/0, 5,5/0 και 11/0, τα οποία δεν έχουν T. nachr και στη συνέχεια προσδιορίστηκε με ELISA αν δεσμεύτηκε κάποιο ποσοστό του μονοκλωνικού. 0,5 0,4 2,5/0 5,5/0 11/0 Ο.Α. 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 όγκος εναιωρήματος λιποσωμάτων (μl) Εικόνα 24: Έλεγχος της ποσότητας του mab35 που προσδένεται σε λιποσώματα χωρίς T. nachr. 2ng mab35 επωάστηκαν με αυξανόμενες ποσότητες εναιωρήματος λιποσωμάτων 2,5/0, 5,5/0 και 11/0 και το ποσοστό που προσδέθηκε προσδιορίστηκε με ELISA. Η Ο.Α. παραμένει σταθερή και ανεξάρτητη από την ποσότητα των λιποσωμάτων χωρίς T. nachr με τα οποία επωάστηκε δείχνοντας ότι το mab35 δεν προσδένεται σε αυτά. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 24 η Ο.Α. παραμένει σταθερή και ανεξάρτητη από την ποσότητα των λιποσωμάτων χωρίς T. nachr με τα οποία επωάστηκε δείχνοντας ότι το mab35 δεν προσδένεται σε αυτά. Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν, σε διάφορες χρονικές στιγμές από την ημέρα παρασκευής τους, οι ικανότητες δέσμευσης mab35, λιποσωμάτων με T. nachr ( 2,5/200, 5,5/200, 11/200 ), καθώς και ίδιας συγκέντρωσης T. nachr σε PBS και PBS/X.N. 2% ( PBS/200, PBS/X.N./200 ). Ποσότητες έως 16μl των παρασκευασμάτων 2,5/200, 5,5/200, 11/200, PBS/200 και PBS/X.N./200 του Πίνακα 1 επωάστηκαν με 2ng mab35 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προσδιορίστηκε με ELISA το ποσοστό του mab35 που δεσμεύτηκε σε κάθε περίπτωση. Τα πειράματα έγιναν 1, 5, 10 και 20 ημέρες μετά την κατασκευή των παρασκευασμάτων για να ελεγχθεί και η επίδραση του χρόνου στην ικανότητά τους να προσδένουν mab35. Κάθε ένα από τα διαγράμματα της Εικόνας 25 παριστάνει συγκριτικά μεταξύ τους, τα ποσοστά 79

δέσμευσης mab35 των παρασκευασμάτων του Πίνακα 1, 1, 5, 10 και 20 ημέρες απ τη δημιουργία τους. Δέσμευση mab35 (%) 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15 Όγκος παρασκευάσματος (μl) 2,5/200 5,5/200 11/200 PBS/200 PBS/X.N./200 Ημέρα 1η Ημέρα 5η Ημέρα 10η Ημέρα 20η Εικόνα 25: Τα ποσοστά δέσμευσης mab35 των παρασκευασμάτων του Πίνακα 1, 1, 5, 10 και 20 ημέρες απ τη δημιουργία τους. Δείγματα των παρασκευασμάτων 2,5/200, 5,5/200, 11/200, PBS/200 και PBS/X.N/200 του Πίνακα 1, επωάστηκαν με 2ng mab35 και στη συνέχεια προσδιορίστηκε με ELISA το ποσοστό δέσμευσης σε κάθε περίπτωση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 1, 5, 10 και 20 ημέρες μετά τη δημιουργία των παρασκευασμάτων για να ελεγχθεί και η επίδραση του χρόνου στην ικανότητά τους να προσδένουν mab35. 80

Στην Eικόνα 25 φαίνεται ότι το PBS/X.N./200 δεσμεύει το mab35 πιο αποτελεσματικά από το PBS/200 και αυτό πολύ πιο αποτελεσματικά από τα λιποσώματα ( 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 ). Συγκρίνοντας μεταξύ τους τα 2,5/200, 5,5/200 και 11/200, 1, 5, 10 και 20 ημέρες μετά την παρασκευή τους, βγαίνει το συμπέρασμα ότι η ικανότητά τους να δεσμεύουν mab35, πολύ λίγο επηρεάζεται από το ποσοστό της επικάλυψης τους από PEG. Για να γίνει φανερή η επίδραση του χρόνου που μεσολάβησε από την ημέρα παρασκευής, στην ικανότητα του κάθε παρασκευάσματος να προσδένει mab35, τα αποτελέσματα της Εικόνας 25 παριστάνονται στην Εικόνα 26 ομαδοποιημένα ως προς το κάθε παρασκεύασμα. 81

100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 1η μέρα 5η μέρα 10η μέρα 20η μέρα 2,5/200 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 5,5/200 100 Δέσμευση mab35 (%) 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 11/200 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 PBS/200 100 80 60 40 20 0 0 0,5 1 1,5 2 Όγκος παρασκευάσματος (μl) PBS/X.N./200 Εικόνα 26: Τα ποσοστά δέσμευσης mab35 για τα παρασκευάσματα 2,5/200, 5,5/200, 11/200, PBS/200 και PBS/X.N/200 του Πίνακα 1, 1, 5, 10 και 20 ημέρες από την παρασκευή τους, ομαδοποιημένα ως προς το κάθε παρασκεύασμα. Για να γίνει φανερή η επίδραση του χρόνου που μεσολάβησε από την ημέρα παρασκευής, στην ικανότητα του κάθε παρασκευάσματος να προσδένει mab35, τα αποτελέσματα της Εικόνας 25 παριστάνονται στην Εικόνα 26 ομαδοποιημένα ως προς το κάθε παρασκεύασμα. 82

Από την Eικόνα 26 είναι εμφανές ότι με την πάροδο των ημερών, η ικανότητα πρόσδεσης mab35 από τα λιποσώματα με T. nachr ( 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 ) μειώνεται σημαντικά. Αυτό όμως δεν ισχύει στον ίδιο βαθμό και για το παρασκεύασμα PBS/200 και ιδιαίτερα για το PBS/X.N./200, των οποίων η ικανότητα πρόσδεσης mab35 επηρεάζεται πολύ λιγότερο από το πέρασμα του χρόνου. Επίσης άξια σχολιασμού είναι και η σχέση με την οποία τα λιποσώματα δεσμεύουν το mab35. Η σχέση ποσότητας λιποσωμάτων-πρόσδεσης mab35 είναι κατά προσέγγιση γραμμική μόνο μέχρι περίπου το 50% της μείωσης και στη συνέχεια πολύ μεγαλύτερες ποσότητες λιποσωμάτων απαιτούνται για να επιτευχθεί επιπλέον μείωση. Για να διερευνηθούν τα αίτια της σημαντικής πτώσης στη δέσμευση mab35 με το πέρασμα λίγων ημερών, που παρατηρείται στην Eικόνα 26, για τα λιποσωμικά παρασκευάσματα ( 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 ), έγινε το εξής πείραμα: Προσδιορίστηκε η ικανότητα δέσμευσης mab35 των λιποσωμάτων 2,5/200, 5,5/200 και 11/200, τα οποία 10 και 20 ημέρες μετά την παρασκευή τους, πέρασαν ξανά από φίλτρα τύπου Isopore την μέρα που έγινε η μέτρηση. Τα λιποσώματα αυτά συγκρίθηκαν ως προς την ικανότητα δέσμευσης mab35 με αντίστοιχα λιποσώματα 1, 10 και 20 ημερών. Τα αποτελέσματα των αντίστοιχων πειραμάτων παριστάνονται γραφικά στην Εικόνα 27. 83

100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 1η ημέρα 10η ημέρα επαν/μένο 10η ημέρα 20η ημέρα επαν/μένο 20η ημέρα 2,5/200 100 Δέσμευση mab35 (%) 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 5,5/200 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 Όγκος εναιωρήματος λιποσωμάτων (μl) 11/200 Εικόνα 27: Σύγκριση ικανότητας δέσμευσης mab35 μεταξύ των 2,5/200, 5,5/200 και 11/200, 1, 10 και 20 ημέρες μετά την παρασκευή τους και των αντιστοίχων επαναφιλτραρισμένων παρασκευασμάτων τη 10 η και την 20 η ημέρα μετά την παρασκευή τους. Για να διερευνηθούν τα αίτια της σημαντικής πτώσης, με το πέρας λίγων ημερών, της ικανότητας δέσμευσης mab35 που παρατηρείται στην Eικόνα 26, για τα λιποσωμικά παρασκευάσματα του Πίνακα 1 ( 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 ), έγινε το εξής πείραμα: Προσδιορίστηκε η ικανότητα δέσμευσης mab35 των λιποσωμάτων 2,5/200, 5,5/200 και 11/200, τα οποία 10 και 20 ημέρες μετά την παρασκευή τους, πέρασαν ξανά από φίλτρα τύπου Isopore την μέρα που έγινε η μέτρηση. Τα λιποσώματα αυτά συγκρίθηκαν ως προς την ικανότητα δέσμευσης mab35 με αντίστοιχα λιποσώματα 1, 10 και 20 ημερών. 84

Όπως φαίνεται στην Eικόνα 27 τα λιποσώματα που ξαναπέρασαν από φίλτρο τη 10 η μέρα από την παρασκευής τους, ξεπέρασαν κατά πολύ τα αντίστοιχα λιποσώματα των 10 ημερών και πλησίασαν την αποδοτικότητα των αντιστοίχων που παρασκευάστηκαν μια μέρα πριν τη μέτρηση. Αυτά που ξαναπέρασαν από φίλτρο την 20 η μέρα από την παρασκευή τους, παρουσίασαν πολύ μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης mab35 από τα αντίστοιχα λιποσώματα που δεν ξαναπέρασαν από φίλτρο, αλλά μικρότερη από την αντίστοιχη των λιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν μια μέρα πριν την μέτρηση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η μείωση της ικανότητας δέσμευσης των λιποσωμάτων οφείλεται σε συσσωμάτωσή τους, κάτι το οποίο άρετε με το επαναληπτικό πέρασμα από τα φίλτρα isopore. 85

3.A.5 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ in vitro ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ I 125 -α-bgt ΑΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕ T. nachr Ένας ακόμα έλεγχος της ικανότητας δέσμευσης των παρασκευασμάτων του Πίνακα 1, έγινε με τη χρήση 125 Ι-α-Bgt. Τα παρασκευάσματα επωάστηκαν με ποσότητα 125 Ι-α-Bgt ενεργότητας 50.000 κρούσεων/λεπτό για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και ο προσδιορισμός του ποσοστού δέσμευσης έγινε με filter assay. Στην Εικόνα 28 παριστάνονται τα αποτελέσματα του filter assay που έγινε με λιποσώματα χωρίς T. nachr ( 2,5/0, 5,5/0, 11/0 του Πίνακα 1) τα οποία χρησιμοποιηθήκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Κρούσεις/Λεπτό 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 Όγκος εναιωρήματος λιποσωμάτων (μl) 2,5/0 5,5/0 11/0 Εικόνα 28. Δέσμευση 125 Ι-α-Bgt από λιποσώματα με 2,5, 5,5 και 11% επικάλυψη PEG χωρίς T. nachr. Για να διερευνηθεί αν λιποσώματα χωρίς T. nachr προσδένουν 125 Ι-α- Bgt, έγινε filter assay. Η πτωτική τάση που έχουν οι μετρήσιμες κρούσεις/λεπτό δείχνει πως τα φωσφολιπίδια όχι μόνο δεν συγκρατούν την 125 Ι-α-Bgt αλλά επιπλέον η παρουσία τους, ανάλογα με την ποσότητά τους, ανταγωνίζεται την πρόσδεση της 125 Ι-α-Bgt στα ιονανταλλακτικά φίλτρα που χρησιμοποιούνται στην τεχνική. 86

Στη συνέχεια, με την ίδια τεχνική, προσδιορίστηκε για τα παρασκεύασμα PBS/200, 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 του Πίνακα 1, η ικανότητα δέσμευσης 125 Ι-α-Bgt. Ποσότητες έως 8μl από κάθε παρασκεύασμα επωάστηκαν με 125 Ι-α-Bgt ενεργότητας 50.000 κρούσεων/λεπτό, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προσδιορίστηκε με filter assay η 125 Ι-α-Bgt που προσδέθηκε στην κάθε περίπτωση. Τα πειράματα έγιναν 1, 5, 10 και 20 ημέρες μετά τη δημιουργία των παρασκευασμάτων για να ελεγχθεί και η επίδραση του χρόνου στην ικανότητά τους να προσδένουν 125 Ι-α-Bgt. Κάθε ένα από τα διαγράμματα της Εικόνας 29 παριστάνει συγκριτικά μεταξύ τους, τη δέσμευση 125 Ι-α-Bgt των παρασκευασμάτων, 1, 5, 10 και 20 ημέρες απ τη δημιουργία τους. 87

Κρούσεις/Λεπτό 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 PBS/200 2,5/200 5,5/200 11/200 Ημέρα 1 Ημέρα 5 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 Όγκος παρασκευάσματος (μl) Ημέρα 10 Ημέρα 20 Εικόνα 29: Η δέσμευση 125 Ι-α-Bgt των παρασκευασμάτων PBS/200, 2,5/200, 5,5/200, 11/200 του Πίνακα 1, 1, 5, 10 και 20 ημέρες απ τη δημιουργία τους. Δείγματα από τα παρασκευάσματα PBS/200, 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 του Πίνακα 1 επωάστηκαν με 125 Ι-α-Bgt και στη συνέχεια προσδιορίστηκε με filter assay η πρόσδεση σε κάθε περίπτωση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 1, 5, 10 και 20 ημέρες μετά την παρασκευής τους για να ελεγχθεί η επίδραση του χρόνου στην ικανότητα των παρασκευασμάτων να προσδένουν 125 Ι-α-Bgt. 88

Στην Eικόνα 29 φαίνεται ότι το PBS/200 δεσμεύει πολύ πιο αποτελεσματικά την 125 Ι-α-Bgt σε σχέση με τα λιποσώματα ( 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 ). Συγκρίνοντας τα 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 μεταξύ τους, 1, 5, 10 και 20 ημέρες μετά την παρασκευή τους, βγαίνει το συμπέρασμα ότι η ικανότητά τους να δεσμεύουν 125 Ι-α-Bgt, πολύ λίγο επηρεάζεται από το ποσοστό της επικάλυψής τους με PEG. Για να γίνει φανερή η επίδραση του χρόνου που μεσολάβησε από την ημέρα παρασκευής, στην ικανότητα του κάθε παρασκευάσματος του Πίνακα 1 να προσδένει 125 Ι-α-Bgt, τα αποτελέσματα της Εικόνας 29 παριστάνονται στην Εικόνα 30 ομαδοποιημένα ως προς το κάθε παρασκεύασμα. 89

2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 Ημέρα 1η Ημέρα 5η Ημέρα 10η Ημέρα 20η 2,5/200 Κρούσεις/Λεπτό 2500 2000 1500 1000 500 0 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 5,5/200 11/200 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 2 4 6 8 Όγκος παρασκευάσματος (μl) PBS/200 Εικόνα 30: Τα ποσοστά δέσμευσης 125 Ι-α-Bgt για τα παρασκευάσματα PBS/200, 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 του Πίνακα 1, 1, 5, 10 και 20 ημέρες από την παρασκευή τους, ομαδοποιημένα ως προς το κάθε παρασκεύασμα. Για να γίνει φανερή η επίδραση του χρόνου που μεσολάβησε από την ημέρα παρασκευής, στην ικανότητα του κάθε παρασκευάσματος να προσδένει 125 Ι-α-Bgt, τα αποτελέσματα της Εικόνας 29 παριστάνονται στην Εικόνα 30 ομαδοποιημένα ως προς το κάθε παρασκεύασμα. 90

Από την Eικόνα 30 είναι εμφανές ότι με την πάροδο των ημερών, η ικανότητα δέσμευσης 125 Ι-α-Bgt από τα λιποσώματα με T. nachr ( 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 ) μειώνεται σημαντικά. Αυτό όμως δεν ισχύει στον ίδιο βαθμό και για τον T. nachr σε PBS ( PBS/200 ) του οποίου η ικανότητα πρόσδεσης επηρεάζεται λιγότερο από το πέρασμα του χρόνου. Η σχέση με την οποία τα λιποσώματα δεσμεύουν την 125 Ι-α-Bgt (σχέση ποσότητας λιποσωμάτων-κρούσεων/λεπτό) είναι κατά προσέγγιση γραμμική. Οι κρούσεις που δίνει ο T. nachr σε PBS ( PBS/200 ) φτάνουν σε ποσότητες πάνω από 4μl σε πλατό. Για να διερευνηθούν τα αίτια της μείωσης της δέσμευσης 125 Ι-α-Bgt με το πέρασμα λίγων ημερών, που παρατηρείται στην Eικόνα 30 για τα λιποσωμικά παρασκευάσματα του Πίνακα 1 ( 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 ), έγινε το εξής πείραμα. Λιποσώματα 2,5/200, 5,5/200 και 11/200, 10 και 20 ημερών ξαναπέρασαν από φίλτρα τύπου Isopore και η ικανότητά τους να δεσμεύουν 125 Ι-α- Bgt συγκρίθηκε με αυτήν των αντίστοιχων λιποσωμάτων 1, 5, 10 και 20 ημερών από την παρασκευή τους. Τα αποτελέσματα των αντίστοιχων πειραμάτων παριστάνονται γραφικά στην Εικόνα 31. 91

2500 2000 1500 1000 500 0 sdd 2500 0 2 4 6 8 1η ημέρα 10η ημέρα επαν/μένα 10η ημέρα 20η ημέρα επαν/μένα 20η ημέρα 2,5/200 Κρούσεις/Λεπτό 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 5,5/200 2500 2000 1500 1000 11/200 500 0 0 2 4 6 8 Όγκος εναιωρήματος λιποσωμάτων (μl) Εικόνα 31: Σύγκριση ικανότητας δέσμευσης 125 Ι-α-Bgt μεταξύ των 2,5/200, 5,5/200 και 11/200, 1, 10 και 20 ημέρες μετά την παρασκευή τους και των αντιστοίχων επαναφιλτραρισμένων παρασκευασμάτων τη 10 η και την 20 η ημέρα μετά την παρασκευή τους. Για να διερευνηθούν τα αίτια της μείωσης με το πέρας λίγων ημερών, της ικανότητας δέσμευσης 125 Ι-α-Bgt που παρατηρείται στην Eικόνα 30, για τα 2,5/200, 5,5/200 και 11/200 λιποσώματα του Πίνακα 1, έγινε το εξής πείραμα: Λιποσώματα 2,5/200, 5,5/200 και 11/200, 10 και 20 ημερών ξαναπέρασαν από φίλτρα τύπου Isopore και η ικανότητά τους να δεσμεύουν 125 Ι-α-Bgt συγκρίθηκε με αυτήν των αντίστοιχων λιποσωμάτων 1, 5, 10 και 20 ημερών από την παρασκευή τους. Όπως φαίνεται στην Eικόνα 31 τα λιποσώματα που ξαναπέρασαν από φίλτρο τη 10 η μέρα και την 20 η μέρα από την παρασκευής τους, αύξησαν την ικανότητά τους να δεσμεύουν 125 Ι-α-Bgt και πλησίασαν την αποδοτικότητα των λιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν μια μέρα πριν τη μέτρηση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η μείωση της ικανότητας δέσμευσης των λιποσωμάτων οφείλεται σε συσσωμάτωσή τους, κάτι το οποίο άρετε με το επαναληπτικό πέρασμα από τα φίλτρα isopore. 92

3.A.6 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ in vivo ΔΕΣΜΕΥΣΗΣ mαb35 ΑΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕ T. nachr Για να προσδιοριστεί αν τα παρασκευάσματα μπορούν να δεσμεύσουν αντισώματα έναντι του T. nachr in vivo, δηλαδή αν επιτρέπουν την περαιτέρω διερεύνηση της δυνατότητάς τους να χρησιμοποιηθούν σε ειδικές θεραπείες της Βαριάς Μυασθένειας, έγιναν πειράματα με αρουραίους, τύπου Lewis, τεσσάρων εβδομάδων, στα οποία παρασκευάσματα με T. nachr χορηγήθηκαν ενδοφλέβια, (i.v.) για να δεσμεύσουν mab35 που βρισκόταν ήδη στην κυκλοφορία του αίματος. Για την επίτευξη επιπέδων mab35 στην κυκλοφορία του αίματος, προηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκή (i.p.) του χορήγηση 18 ώρες πριν από το πειράματα. Ο προσδιορισμός του mab35 στην κυκλοφορία έγινε με ανάλυση 10μl ορού σε ELISA. Για την εύρεση της κατάλληλης i.p. δόσεως mab35, δηλαδή της ελάχιστης δυνατής που να δίνει στην ELISA σαφές σήμα σε δείγμα ορού μετά από 18 ώρες, έγινε ένα προκαταρτικό πείραμα. Στο πείραμα αυτό διάφορες δόσεις mab35 χορηγήθηκαν i.p. σε αρουραίους τεσσάρων εβδομάδων από τους οποίους λήφθηκε δείγμα ορού 18 ώρες αργότερα και μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση με ELISA. Επιπλέον στο πείραμα αυτό παρατηρήθηκε και η κατάσταση των ζώων για κάθε δόση mab35, μέχρι και 48 ώρες από τη χορήγηση. Πίνακας 2: Η ενδοπεριτοναϊκή δόση του mab35, το σήμα που έδωσε στην ELISA μετά από 18 ώρες καθώς και η κατάσταση του ζώου. Ζώο Βάρος (g) Ποσότητα Δ.Ο.Α.* Συμπτώματα mab35 (mg) ELISA 1,2 52,9, 54,2 0 0,209 Κανένα 3,4 55,1, 56,0 0,005 0,453 Κανένα 5,6 53,2, 55,5 0,01 0,598 Κανένα 7,8 53,6, 56,4 0,05 0,829 Κανένα 9,10 54,4, 57,0 0,1 0,890 Παράλυση 11,12 52,3, 51,8 0,2 0,931 Θάνατος (30 ώρες) 13,14 53,3, 54,1 0,4 0,952 Θάνατος (24 ώρες) * Δ.Ο.Α.= O.A.δείγματος Ο.Α. αρνητικού μάρτυρα. Από τις παραπάνω τιμές φαίνεται ότι ελάχιστη δόση mab35 που μπορεί να χορηγηθεί i.p. και να δώσει σαφές σήμα στην ELISA σε δείγμα ορού μετά από 18 ώρες είναι τα 5μg (0,005mg). 93

Η δόση των 5μg mab35 χορηγήθηκε στη συνέχεια i.p. σε αρουραίους τεσσάρων εβδομάδων οι οποίοι 17 ώρες και 20 λεπτά αργότερα έλαβαν ενδοφλεβίως 0,25, 0,5 και 1 ml από τα παρασκευάσματα με T. nachr: 11/2000, PBS/2000 και PBS/X.N./2000 του Πίνακα 1. 40 λεπτά αργότερα έγινε δειγματοληψία αίματος και ELISA με 10 μl ορού. Εκτός από τα ζώα στα οποία έγιναν χορηγήσεις, χρησιμοποιήθηκαν και άλλα ως αρνητικοί μάρτυρες στα οποία δεν χορηγήθηκε τίποτα. Τα αποτελέσματα φαίνονται στην Εικόνα 32. 0,6 0,5 0,4 11/2000 PBS/2000 PBS/X.N./2000 Μάρτυρες O.A. 0,3 0,2 0,1 0 0 0,5 1 1,5 όγκος παρασκευάσματος (ml) Εικόνα 32: Αποτελέσματα πειραμάτων in vivo δέσμευσης mab35 από τα 11/2000, PBS/2000 και PBS/X.N./2000 του Πίνακα 1. 17 ώρες και 20 λεπτά μετά από i.p. χορήγηση 5μg mab35, τα ζώα έλαβαν ενδοφλεβίως 0,25, 0,5 και 1ml από τα παρασκευάσματα 11/2000, PBS/2000 και PBS/X.N./2000. 40 λεπτά αργότερα η δέσμευση του mab35 προσδιορίστηκε με ELISA. Οι μάρτυρες είναι δείγματα από ζώα στα οποία δεν είχαν χορηγηθεί mab35 ούτε κάποιο από τα παρασκευάσματα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 32, από τα τρία παρασκευάσματα που χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως, το μόνο που κατάφερε να μειώσει τα επίπεδά του mab35 στην κυκλοφορία ήταν το PBS/X.N./2000, στο οποίο ο T. nachr ήταν διαλυμένος σε PBS/X.N.2%. Το PBS/X.N./2000 δέσμευσε ποσοτικά τα 5μg mab35 στην κυκλοφορία του αίματος, κατεβάζοντας την Ο.Α. από τα επίπεδα του 0,47 (οροί από ζώα στα οποία δεν έχει χορηγηθεί κάποιο παρασκεύασμα με T. nachr) στα επίπεδα των Μαρτύρων (0,23). 94

3.A.7 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΟΚΑΤΑΝΟΜΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΩΝ ΜΕ T. nachr ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Για να δειχθεί σε ποιο παρασκεύασμα ο T. nachr έχει μεγαλύτερο χρόνο ζωής στην κυκλοφορία του αίματος και σε ποια όργανα και ιστούς βιοκατανέμεται όταν χορηγείται με τη μορφή κάθε παρασκευάσματος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα βιοκατανομών σε αρουραίους, τύπου Lewis, τεσσάρων εβδομάδων. Στα πειράματα αυτά, τα παρασκευάσματα χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως, αφότου ο T. nachr σημάνθηκε με 125 Ι-α-Bgt. Μετά από 1, 3 και 24 ώρες τα ζώα θανατώθηκαν και αφού αφαιρέθηκαν συγκεκριμένα όργανα και ιστοί ακολούθησε μέτρηση της ραδιενέργειας σε αυτά. Μετά τη μέτρηση των ραδιενεργών κρούσεων, έγιναν υπολογισμοί με τους οποίους προσδιορίστηκε το ποσοστό της αρχικής δόσης που κατανεμήθηκε σε κάθε όργανο. Στους υπολογισμούς αυτούς λήφθηκε υπόψη και η συνήθης απώλεια ενός ποσοστού ραδιενεργών κρούσεων από την ληφθείσα δόση. Τα πειράματα βιοκατανομών έγιναν σε δυο φάσεις. Στην πρώτη φάση συγκρίθηκε η βιοκατανομή των λιποσωμάτων 0/200 του Πίνακα 1, τα οποία δεν φέρουν επικάλυψη PEG, με τα λιποσώματα 11/200 του ίδιου πίνακα που φέρουν. Τα αποτελέσματα της πρώτης φάσης των βιοκατανομών παριστάνονται στην Εικόνα 33. 95

40 35 30 25 20 15 10 5 0 40 0/200 11/200 1η ώρα Ποσοστό της Δόσης (%) 35 30 25 20 15 10 5 0 40 35 30 25 20 15 10 5 0 3η ώρα 24η ώρα Ηπαρ Έντερα Στομάχι Αίμα Σπλήνας Νεφρά Πνεύμονες Εικόνα 33: Συγκριτικά αποτελέσματα μεταξύ των βιοκατανομών των λιποσωμικών παρασκευασμάτων 0/200 και 11/200, 1, 3 και 24 ώρες μετά την ενδοφλέβια χορήγησή τους. Για να δειχθεί σε ποιο παρασκεύασμα ο T. nachr έχει μεγαλύτερο χρόνο ζωής στην κυκλοφορία του αίματος και σε ποια όργανα και ιστούς βιοκατανέμεται όταν χορηγείται μέσα σε κάθε παρασκεύασμα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα βιοκατανομών. Στην πρώτη φάση των πειραμάτων αυτών, ο T. nachr συγκρίθηκε στα λιποσώματα που δε φέρουν PEG 0/200 με τα 11/200 που φέρουν. 1, 3 και 24 ώρες μετά από i.v. χορήγηση των σημασμένων με 125 Ι-α-Bgt λιποσωμάτων, τα ζώα θανατώθηκαν και ακολούθησε μέτρηση της ραδιενέργειας σε συγκεκριμένα όργανα και ιστούς. Στην Εικόνα 33 παρουσιάζονται τα ποσοστά της αρχικής δόσης που κατανεμήθηκαν σε μερικούς ενδεικτικούς ιστούς και όργανα. 96

Από την Εικόνα 33 φαίνεται πως τα λιποσώματα με T. nachr, όπως αναμενόταν θεωρητικά, έχουν μεγαλύτερο χρόνο ζωής στο αίμα όταν είναι επικαλυμμένα με αλυσίδες PEG. Επίσης φαίνεται ότι και τα απλά λιποσώματα με T. nachr και αυτά που καλύπτονται με PEG έχουν την τάση να κατανέμονται και σε άλλους ιστούς όπως ήπαρ και τα έντερα και από εκεί να αποικοδομούνται και να απομακρύνονται προοδευτικά από τον οργανισμό των πειραματόζωων. Στη δεύτερη φάση των πειραμάτων βιοκατανομών, συγκρίθηκε η βιοκατανομή του T. nachr σε PBS ( PBS/200 ) και σε λιποσώματα ( 11/200 ). Τα αποτελέσματα με τη μορφή ποσοστών της ληφθείσας δόσης που κατανεμήθηκαν σε κάθε όργανο παριστάνονται στην Εικόνα 34. 97

25 PBS/200 11/200 20 15 1 ώρα 10 5 0 25 Ποσοστό της Δόσης (%) 20 15 10 5 0 3η ώρα 25 20 15 10 24η ώρα 5 0 Ηπαρ Έντερα Στομάχι Αίμα Σπλήνας Νεφρά Πνεύμονες Εικόνα 34: Συγκριτικά αποτελέσματα μεταξύ των βιοκατανομών των παρασκευασμάτων PBS/200 και 11/200 του Πίνακα 1, 1, 3 και 24 ώρες μετά την ενδοφλέβια χορήγησή τους. Για να δειχθεί σε ποιο παρασκεύασμα ο T. nachr έχει μεγαλύτερο χρόνο ζωής στην κυκλοφορία του αίματος και σε ποια όργανα και ιστούς βιοκατανέμεται όταν χορηγείται μέσα σε κάθε παρασκεύασμα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα βιοκατανομών. Στη δεύτερη φάση των πειραμάτων αυτών, συγκρίθηκε ο T. nachr διαλυμένος σε PBS PBS/200 και σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG ( 11/200 ). 1, 3 και 24 ώρες μετά από i.v. χορήγηση των σημασμένων με 125 Ι-α-Bgt παρασκευασμάτων, τα ζώα θανατώθηκαν και ακολούθησε μέτρηση της ραδιενέργειας σε συγκεκριμένα όργανα και ιστούς. Στην Εικόνα 34 παρουσιάζονται τα ποσοστά της αρχικής δόσης που κατανεμήθηκαν σε μερικούς ενδεικτικούς ιστούς και όργανα. Στην Εικόνα 34 φαίνεται ότι ο ενσωματωμένος σε λιποσώματα με PEG, T. nachr έχει σαφώς μεγαλύτερο χρόνο ζωής στο αίμα σε σχέση με τον T. nachr σε PBS. Επίσης όπως και στην Εικόνα 33 βλέπουμε τον T. nachr και τα λιποσώματα να συγκεντρώνονται στο ήπαρ, τα έντερα και το στομάχι και από εκεί να αποικοδομούνται και να απομακρύνονται προοδευτικά από τον οργανισμό των πειραματόζωων. 98

Β ΜΕΡΟΣ 3.B.1 ΕΚΦΡΑΣΗ, ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ECD ΤΗΣ α1 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΜΥΪΚΟΥ nachr ΣΤΟ ΕΤΕΡΟΛΟΓΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Pichia pastoris ΚΑΙ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΤΟΜΩΝ High Five Το α1 ECD του ανθρωπίνου μυϊκού nachr εκφράστηκε στον ζυμομύκητα Pichia pastoris και σε κύτταρα εντόμων High Five. Έγινε καλλιέργεια 1 λίτρου από κάθε σύστημα και τα α1 ECDs εκκρίθηκαν στο υπερκείμενο της κάθε καλλιέργειας. Στη συνέχεια ακολούθησε συμπύκνωση και καθαρισμός με στήλη Ni 2+ -NTA και χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού. Στα κλάσματα τις τελευταίας στήλης μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση και έγινε filter assay για την ανίχνευση των α1 ECDs. Από την ανάλυση των κλασμάτων προέκυψαν τα χρωματογραφήματα της Εικόνας 35. Pichia pastoris α1 ECD Κρούσεις/λεπτό 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Κρούσεις/λεπτό Ο.Α.(280nm) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 153kd 32kd Όγκος έκλουσης (ml) 0,3 0,25 0,2 0,15 Ο.Α. 0,1 0,05 0 High Five α1 ECD Κρούσεις/λεπτό 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Κρούσεις/λεπτό Ο.Α.(280nm) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 153kd 32kd Όγκος έκλουσης (ml) 0,3 0,25 0,2 0,15 Ο.Α. 0,1 0,05 0 Εικόνα 35. Τα χρωματογραφήματα των Pichia pastoris και High Five α1 ECD από στήλη Supersoze 12. Προκειμένου να καθαριστούν τα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs, πέρασαν από στήλη μοριακού αποκλεισμού (Superoze 12) αφού προηγουμένως είχαν καθαριστεί με στήλη συγγένειας Ni 2+ -NTA. Στα κλάσματα μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση (O.A.) και έγινε filter assay τα οποία έδωσαν τα χρωματογραφήματα της εικόνας 35. Και τα δύο ECDs εκλούονται σε όγκο 14ml που δείχνει ότι είναι μονομερή. 99

Όπως δείχνει η εικόνα 35 και στα δύο α1 ECDs, οι υψηλότερες κορυφές της οπτικής απορρόφησης στα 280 nm, συμπίπτουν με τις κορυφές των ραδιενεργών κρούσεων από το filter assay σε όγκο έκλουσης 14 ml. Αυτό δείχνει ότι τα α1 ECDs είναι μονομερή, καθώς σε αυτό τον όγκο εκλούονται πρωτεΐνες- μοριακοί δείκτες με M.B. 32 kd, που είναι ίσο με το M.B. των μονομερών. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των καθαρισμένων α1 ECDs με την τεχνική SDS PAGE η οποία έδωσε την εικόνα 36. P.pastoris High Five Εικόνα 36. SDS PAGE ηλεκτροφόρηση των Pichia Pastoris και High Five α1 ECDs. Τα κλάσματα της στήλη μοριακού αποκλεισμού ηλεκτροφορήθηκαν με την τεχνική SDS Page Διακρίνονται: 1: Μάρτυρες μοριακών βαρών. 2: 10μl Pichia pastoris α1 ECD 3: 5μl Pichia pastoris a1 ECD. 4: 10μl High Five α1 ECD. 5: 5μl High Five α1 ECD. Τα a1 ECDs βρίσκονται μεταξύ των μοριακών βαρών 32,5 και 25 kda όπως αναμενόταν θεωρητικά. Η Εικόνα 36 υποδεικνύει ότι τα δύο α1 ECDs απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν σε ικανοποιητικό βαθμό, βρίσκονται στο θεωρητικά αναμενόμενο μοριακό βάρος, ενώ δεν φέρουν σημάδια πρωτεόλυσης. Τέλος η συγκέντρωση των καθαρισμένων α1 ECDs προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford στα 0,229 και 0,184 mg/ml για το Pichia pastoris και High Five α1 ECD αντιστοίχως. Ο όγκος του διαλύματος κάθε καθαρισμένου α1 ECD ήταν 1ml. 100