ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ TMHMA ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ TMHMA ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΟΣΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΑΛΙΣΚΙΡΕΝΗΣ ΚΑΙ Υ ΡΟΧΛΩΡΟΘΕΙΑΖΙ ΙΟΥ ΣΕ ΙΣΚΙΑ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΚΑΡΒΕΛΗΣ ΗΜΗΤΡΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΑΘΗΝΑ 2013 1

"Η έγκριση διατριβής ειδίκευσης από το Φαρµακευτικό Τµήµα του Πανεπιστηµίου Αθηνών, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα." 2

(Ν. 5343/1932, άρθρο 202) ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠH Μιχαήλ Κουππάρης Αικατερίνη Αντωνιάδου-Βυζά Ειρήνη Παντερή (Επιβλέπουσα) Καθηγητής Καθηγήτρια Αναπλ. Καθηγήτρια 3

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή ειδίκευσης εκπονήθηκε στον Τοµέα Φαρµακευτικής Χηµείας του Φαρµακευτικού Τµήµατος του Πανεπιστηµίου Αθηνών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράµµατος Σπουδών για την ειδίκευση "Παραγωγή και έλεγχος Φαρµακευτικών ενώσεων", υπό την επίβλεψη και καθοδήγηση της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας Ειρήνης Παντερή. Στον κύριο Μιχαήλ Κουππάρη, Καθηγητή του Τµήµατος Χηµείας και την κυρία Αικατερίνη Αντωνιάδου - Βυζά, Καθηγήτρια του Τοµέα Φαρµακευτικής Χηµείας του Τµήµατος Φαρµακευτικής εκφράζω τις θερµές ευχαριστίες µου για τις εποικοδοµητικές συµβουλές τους κατά τη συγγραφή της διατριβής και για την σηµαντική προσφορά τους σε όλη τη διάρκεια του σπουδών µου, η οποία συνέβαλε σηµαντικά στη διαµόρφωση της επιστηµονικής µου κατάρτισης. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερµές ευχαριστίες µου προς την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ειρήνη Παντερή, τόσο για την ανάθεση του θέµατος και τη συνεχή καθοδήγηση κατά τη διεξαγωγή της εργασίας, όσο και για την φιλική και ανθρώπινη της στάση στο διάστηµα αυτό. 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή Κεφάλαιο 1 ο : Υγροχρωµατογραφία υψηλής απόδοσης 1.1 Γ ενικά 9 1.2 Πεδίο εφαρµογών της HPLC 11 1.3 Ιστορική αναδροµή 11 1.4 Οργανολογία 12 1.4.1 Έλεγχος ροής και συστήµατα προγραµµατισµού 15 1.4.2 Συστήµατα έγχυσης δείγµατος 15 1.5 Πλεονεκτήµατα της HPLC έναντι άλλων µορφών υγροχρωµατογραφίας 16 1.5.1 Στήλες HPLC 17 1.5.2 Αναλυτικές στήλες HPLC 17 1.5.3 Προστατευτικές στήλες ( pre-column) 18 1.5.4 Θερµοστάτες στήλης 18 1.5.5 Υλικά πλήρωσης χρωµατογραφικών στηλών 18 1.6 Ανιχνευτές 19 1.6.1Τύποι Ανιχνευτών 20 1.7 Είδη υγροχρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης 21 Κεφάλαιο 2ο: : Μελέτες σταθερότητας φαρµακευτικών ενώσεων µε µε χρωµατογραφικές τεχνικές 2.1 Τι είναι η ενδεικτική µέθοδος σταθερότητας 24 2.2 Γενική επισκόπηση της πορείας ανάπτυξης µεθόδου για 25 µελέτες σταθερότητας 2.3 Επιλογή της χρωµατογραφικής µεθόδου 28 2.3.1 Υγροχρωµατογραφία αντιστρόφου φάσεως 28 2.3.2 Χειρόµορφη Χρωµατογραφία 28 2.3.3 Αεριοχρωµατογραφία 29 2.3.4 Χρωµατογραφία Λεπτής Στιβάδας (Thin-Layer Chromatography) 30 2.3.5 Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση (CE) και τριχοειδής 5

ηλεκτροχρωµατογραφία (CEC) 2.4 Ο ρόλος των µελετών σταθερότητας σε συνθήκες επιταχυνόµενης 31 διάσπασης 2.5 Προετοιµασία δείγµατος 33 2.6 Ανάπτυξη της µεθόδου διαχωρισµού- Επιλογή των πειραµατικών 34 συνθηκών 2.7 Βελτιστοποίηση του διαχωρισµού 36 2.8 Επικύρωση Μεθόδου 36 2.8.1 Παράµετροι επικύρωσης 40 2.8.2 Επικύρωση µεθόδων κατά την Αµερικανική Φαρµακοποιία 41 2.8.3 Οδηγίες του διεθνούς οργανισµού εναρµόνισης (ICH) 42 για την επικύρωση αναλυτικής µεθόδου 2.8.4. Ορισµοί 43 Κεφάλαιο 3ο: Υπέρταση- φάρµακα για τη θεραπευτική αντιµετώπιση της υπέρτασης: Rasilez HCT 3.1 Υπέρταση 54 3.2 Θεραπευτική Αντιµετώπιση 55 3.3 Αλισκιρένη και υδροχλωροθειαζίδη 56 Κεφάλαιο 4ο: Ανάπτυξη και Επικύρωση Μεθόδου Υγροχρωµατογραφίας Υψηλής Απόδοσης για τον Ποσοτικό Προσδιορισµό της Αλισκιρένης και του υδροχλωροθειαζιδίου 4.1 Εισαγωγή 59 4.2 Αρχή µεθόδου 60 4.3 Εξοπλισµός-Οργανολογία 61 4.4 Αντιδραστήρια 61 4.5 ιαλύµατα παρακαταθήκης και εργασίας 62 4.6 Καθορισµός των βέλτιστων χρωµατογραφικών συνθηκών 63 4.6.1 Μελέτη της επίδρασης του ποσοστού του οργανικού τροποποιητή στο χρόνο συγκράτησης και τον παράγοντα χωρητικότητας 63 4.6.2 Μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης του οξικού αµµωνίου στο χρόνο συγκράτησης και τον παράγοντα 65 χωρητικότητας 4.7 Βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες 67 4.8 Πορεία κατεργασίας των δισκίων 68 6

4.9 Καµπύλες αναφοράς Γραµµικότητα 71 4.10 Προσδιορισµός Ορίου Ανίχνευσης και Ορίου Ποσοτικοποίησης 80 4.11 Έλεγχος ορθότητας (Accuracy) και πιστότητας (Precision) 80 4.12 Ανθεκτικότητα της µεθόδου 84 4.13 Ποσοτικός προσδιορισµός της αλισκιρένης και του 86 υδροχλωροθειαζιδίου σε φαρµακευτικά σκευάσµατα 4.14 Έλεγχος της οµοιοµορφίας του περιεχοµένου στην ανάλυση 87 δισκίων αλισκιρένης-υδροχλωροθειαζιδίου 4.15 Μελέτες Σταθερότητας 89 4.16 Έλεγχος ειδικότητας µεθόδου προσδιορισµού 94 4.17 Συµπεράσµατα και προοπτικές 97 Συµπεράσµατα 99 SUMMARY 100 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 101 7

Εισαγωγή Θεωρητικό µέρος Στην παρούσα διατριβή ειδίκευσης αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε µέθοδος υγροχρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης για τον ποσοτικό προσδιορισµό της αλισκιρένης και του υδροχλωροθειαζιδίου σε δισκία. Στο 1 ο κεφάλαιο του θεωρητικού µέρους παρουσιάζονται οι βασικές αρχές και το θεωρητικό υπόβαθρο της υγροχρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης. Στο 2 ο κεφάλαιο παρουσιάζονται οι βασικές αρχές της σταθερότητας των φαρµακευτικών ενώσεων και παρουσιάζεται ο ρόλος των µελετών σταθερότητας σε συνθήκες επιταχυνόµενης διάσπασης. Στο 3 ο κεφάλαιο αναφέρονται συνοπτικά τα φαρµακολογικά στοιχεία της αλισκιρένης και της υδροχλωροθειαζίδης. Το πειραµατικό µέρος της διατριβής περιλαµβάνει το κεφάλαιο 4 στο οποίο περιγράφεται η τεχνική που αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε µε στόχο τον ποσοτικό προσδιορισµό της αλισκιρένης και του υδροχλωροθειαζιδίου σε δισκία. Αναφέρεται η οργανολογία και οι πειραµατικές συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν καθώς και οι µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν ώστε να διερευνηθούν οι παράγοντες που επηρεάζουν τη συγκράτηση των αναλυτών και του εσωτερικού προτύπου (βρωµαζεπάµη) ώστε να καθοριστούν οι βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες. Ακολούθως, η µέθοδος HPLC αξιολογήθηκε ως προς τα κύρια χαρακτηριστικά ποιότητάς της (γραµµικότητα, ακρίβεια, επαναληψιµότητα, ανθεκτικότητα) ενώ παράλληλα καθορίστηκε το όριο ανίχνευσης και το όριο ποσοτικοποίησης της µεθόδου. Πραγµατοποιήθηκαν µελέτες σταθερότητας σε συνθήκες επιταχυνόµενης διάσπασης. Τέλος η µέθοδος εφαρµόσθηκε στον έλεγχο περιεκτικότητας και στον έλεγχο οµοιοµορφίας περιεχοµένου σε δισκία που κυκλοφορούν στην Ελληνική αγορά και φέρουν ως δραστικά συστατικά την αλισκιρένη και το υδροχλωροθειαζίδιο. 8

Κεφάλαιο 1: Υγροχρωµατογραφία υψηλής απόδοσης 1.1 Γ ενικά Υγροχρωµατογραφία υψηλής απόδοσης 1,2 - High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - αναπτύχθηκε τις τελευταίες δεκαετίες ως µία από τις πλέον αξιόπιστες αναλυτικές τεχνικές στη Φαρµακευτική Βιοµηχανία, αλλά και για ερευνητικούς σκοπούς. Η σηµαντική αυτή άνοδος οφείλεται στους εξής λόγους: 3,4 α) στη χρήση των ηλεκτρονικών υπολογιστών, β) στην αλµατώδη εξέλιξη της τεχνολογίας στήλης (ελάττωση του µεγέθους των τεµαχιδίων του υλικού πλήρωσης, πακετάρισµα του υλικού πλήρωσης µε τη χρήση υπερήχων), γ) στη µεγάλη ικανότητά της να ανιχνεύει δραστικές ουσίες σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις, δ) στη δυνατότητα της HPLC να διαχωρίζει και να προσδιορίζει ταυτόχρονα πολλές φαρµακευτικές ουσίες, εφόσον συνυπάρχουν σε κάποιο σκεύασµα. Επίσης να προσδιορίζει παραπροϊόντα (impurities) τα οποία εντοπίζονται στις αµιγείς δραστικές ουσίες προερχόµενα, είτε από τη σύνθεση ως κατάλοιπα, είτε ως προϊόντα διάσπασης των δραστικών ουσιών και τέλος ε) στη δυνατότητα της HPLC να προσδιορίζει µικροποσότητες (της τάξης των ng και pg) δραστικής ουσίας και των µεταβολιτών της σε βιολογικά υγρά και ιστούς. Η σύγχρονη οργανολογία της HPLC µπορεί να δώσει αξιόπιστα αποτελέσµατα, µε ακρίβεια και επαναληψιµότητα. Όπως όλες οι άλλες αναλυτικές τεχνικές, η HPLC εισήχθη αρχικά στην εργαστηριακή έρευνα, αλλά γρήγορα το πεδίο δράσης της επεκτάθηκε στο να συµπεριλάβει και αναλύσεις καθηµερινότητας, ώστε σήµερα να χρησιµοποιείται ως µία αξιόπιστη αναλυτική διαδικασία στην καθ ηµέρα εργαστηριακή πρακτική κυρίως για ποσοτικούς προσδιορισµούς. 9

Σε σχέση µε την κλασική χρωµατογραφία διαφέρει, γιατί στην HPLC χρησιµοποιούνται υλικά πλήρωσης µε τεµαχίδια µικρού µεγέθους και κατά συνέπεια εφαρµόζονται µεγάλες πιέσεις. Υπερτερεί δε της κλασικής χρωµατογραφίας επιτυγχάνοντας ταχύτερους και καλύτερης απόδοσης διαχωρισµούς µιγµάτων 5. Ο σχεδιασµός για έναν επιτυχή διαχωρισµό µε HPLC στηρίζεται στη σωστή επιλογή της κατάλληλης κινητής φάσης για συγκεκριµένη στήλη και δείγµα. Πρέπει επίσης να συνυπολογισθούν πολλές και διαφορετικές ιδιότητες ενός διαλύτη και κυρίως η ιονική ισχύς και η εκλεκτικότητά του. Η HPLC ανήκει στη χρωµατογραφία στήλης που βεβαίως ο διαχωρισµός είναι αποτέλεσµα της συνδυαστικής δράσης µιας στατικής και µιας κινητής φάσης. Το δείγµα εφαρµόζεται στην κορυφή της στήλης και µε τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά του µετακινούνται µε τη µορφή ζωνών κατά µήκος της στήλης και τελικά εκλούονται διαδοχικά. Οι υπό προσδιορισµό ουσίες κατανέµονται ή προσροφώνται µεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης κι αυτό έχει ως αποτέλεσµα να µετακινούνται µε διαφορετικές ταχύτητες κατά µήκος της στήλης. Στην HPLC συνήθως χρησιµοποιείται µίγµα διαλυτών ή και βαθµιαία µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης 6. Ο χρόνος ανάλυσης είναι της τάξης των µερικών λεπτών, ενώ η ακρίβεια και η επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων είναι πλήρως αποδεκτές 7. Αρχικά, η HPLC πραγµατοποιείτο µε υάλινες στήλες διαµέτρου 1 έως 5 cm και µήκους 50 έως και 500 cm. Για την επίτευξη ρεαλιστικής ταχύτητας ροής, η διάµετρος των σωµατιδίων της στερεάς φάσης ήταν συνήθως 150 έως 250 µm. Ακόµη και έτσι οι ταχύτητες ροής ήταν µικρές, της τάξης των µερικών δεκάτων του χιλιοστόλιτρου ανά λεπτό. Συνεπώς, οι χρόνοι διαχωρισµού ήταν µεγάλοι και συχνά έφθαναν τις µερικές ώρες. Απόπειρες επιτάχυνσης µε εφαρµογή κενού ή µε άντληση, δεν ήταν αποτελεσµατικές, επειδή αυξήσεις στην ταχύτητα ροής προκαλούσαν αύξηση των υψών των θεωρητικών πλακών µακριά από το ελάχιστο, που εµφανίζεται στην τυπική καµπύλη ύψους πλάκας-ταχύτητας-ροής. Το αποτέλεσµα αυτών ήταν οι ελαττωµένες αποδόσεις 8. Γρήγορα, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της HPLC, οι επιστήµονες κατάλαβαν ότι σηµαντική βελτίωση στην απόδοση της στήλης θα µπορούσε να επιτευχθεί 10

µε ελάττωση του µεγέθους των σωµατιδίων του υλικού πλήρωσης της στήλης. Στο τέλος της δεκαετίας του 1960 αναπτύχθηκε η τεχνολογία παραγωγής και χρήσης πληρωτικών υλικών µε σωµατίδια διαµέτρου 3 έως και 10 µm 9. Η τεχνολογία απαιτούσε εξελιγµένα όργανα, µε δυνατότητα λειτουργίας σε υψηλές πιέσεις, κάτι που ήταν αδύνατο να επιτευχθεί µε τις απλές υάλινες στήλες της κλασικής υγρής χρωµατογραφίας µε βαρυτική ροή. Η ονοµασία Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) χρησιµοποιείται για να διακρίνει αυτές τις νεότερες τεχνικές από τις παλαιότερες, που ακόµη χρησιµοποιούνται για παρασκευαστικούς σκοπούς 10. 1.2 Πεδίο εφαρµογών της HPLC Η HPLC είναι η πιο διαδεδοµένη απ όλες τις αναλυτικές τεχνικές διαχωρισµού, µε ετήσιες πωλήσεις σε όργανα HPLC που φθάνουν τα δισεκατοµµύρια δολάρια. Οι λόγοι αυτής της αποδοχής της τεχνικής είναι η ευαισθησία της, η εύκολη προσαρµογή της σε ακριβείς ποσοτικούς προσδιορισµούς, η καταλληλότητά της για διαχωρισµούς µη πτητικών ή θερµικά ευαίσθητων συστατικών και κυρίως, η εφαρµοσιµότητά της σε προσδιορισµούς ουσιών πρωτίστου ενδιαφέροντος για τη βιοµηχανία, το δηµόσιο και πολλά επιστηµονικά πεδία. Παραδείγµατα αποτελούν τα αµινοξέα, οι πρωτεΐνες, τα νουκλεϊκά οξέα, οι υδρογονάνθρακες, τα φάρµακα, τα τερπενοειδή, τα φυτοφάρµακα, τα αντιβιοτικά, τα στεροειδή, οι οργανοµεταλλικές ενώσεις και µια ποικιλία ανόργανων ουσιών. Για ιοντικές ενώσεις χαµηλού µοριακού βάρους χρησιµοποιείται ευρέως η χρωµατογραφία ιοντανταλλαγής. Επιπλέον, η παραλλαγή αυτή της υγρής χρωµατογραφίας χρησιµοποιείται συχνά για διαχωρισµούς ενώσεων, που ανήκουν στην ίδια οµόλογη σειρά. Η χρωµατογραφία προσρόφησης συχνά επιλέγεται για διαχωρισµό µη-πολικών ενώσεων, ισοµερών και κατηγορίες ενώσεων, όπως είναι οι αλειφατικοί υδρογονάνθρακες από αλειφατικές αλκοόλες 11. 1.3 Ιστορική αναδροµή Το 1941 οι Martin και Synge περιέγραψαν τις αρχές της υγρής-υγρής χρωµατογραφίας 11

κατανοµής και στην ίδια εργασία βρίσκονταν τα θεµέλια της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης. Στην εργασία αυτή γίνεται λόγος για το ύψος κάποιων θεωρητικών στοιβάδων εντός της στήλης που είναι ισοδύναµες µε µία θεωρητική πλάκα. Αυτή η παράµετρος έχει υιοθετηθεί σήµερα ως µέτρο της χρωµατογραφικής ικανότητας της στήλης. Επίσης φαίνεται, ότι η αυξηµένη απόδοση της στήλης µπορούσε να επιτευχθεί µε τη χρήση τεµαχιδίων στατικής φάσης µικρότερου µεγέθους. Είναι ωστόσο παραδεκτό, ότι η ανάπτυξη της HPLC άρχισε τη δεκαετία του 1960 12 και µεταξύ 1967-1969, οι Kirkland, 13 Huber 14 και Horvath, Presis και Lipsky, 15 περιέγραψαν την πρώτη χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης, όπως τουλάχιστον χρησιµοποιείται σήµερα. Η HPLC είναι µία µέθοδος ανάλογη της αερίου χρωµατογραφίας, όπου η στατική φάση αποτελείται από κάποια στερεή ή υγρή επιφάνεια υπό τη µορφή πορώδους υλικού, πακεταρισµένου σε µεταλλική στήλη, όπου η υγρή κινητή φάση µετακινείται επειδή ασκείται πίεση. 1.4 Οργανολογία Για να αναπτυχθούν ικανοποιητικές ταχύτητες ροής του υγρού έκλουσης όταν χρησιµοποιούνται υλικά πλήρωσης αποτελούµενα από σωµατίδια µεγέθους 2 έως και 10 µm, που είναι συνηθισµένα στη σύγχρονη HPLC, οι απαιτούµενες πιέσεις από τις αντλίες φθάνουν τις µερικές χιλιάδες psi ( pounds per square inch, 1 atm = 14,696 psi). Ως συνέπεια αυτών των υψηλών πιέσεων, η οργανολογία της HPLC είναι πολυπλοκότερη, µε υψηλό κόστος, σε σύγκριση µε την οργανολογία άλλων ειδών χρωµατογραφίας. Στο Σχήµα 1.1 παρουσιάζονται τα σηµαντικότερα τµήµατα από τα οποία αποτελείται µια διάταξη HPLC 16,17. 12

Σχήµα 1.1: Σχηµατική παράσταση µιας διάταξης HPLC. Ένα σύγχρονο σύστηµα HPLC είναι εφοδιασµένο µε ένα ή περισσότερα υάλινα ή ανοξείδωτα δοχεία, καθένα από τα οποία περιέχει 200 έως 1000 ml διαλύτη. Τα δοχεία είναι συχνά εφοδιασµένα µε µέσα αποµάκρυνσης των διαλυµένων αερίων, συνήθως οξυγόνου και αζώτου, που παρεµποδίζουν το σχηµατισµό φυσαλίδων στη στήλη και στον ανιχνευτή των συστηµάτων. Οι φυσαλίδες αυτές προκαλούν διεύρυνση των κορυφών. Επιπλέον, εµποδίζουν συχνά τη σωστή λειτουργία του ανιχνευτή. Οι απαερωτές µπορεί να αποτελούνται από ένα σύστηµα άντλησης κενού, ένα σύστηµα απόσταξης, διατάξεις που θερµαίνουν και αναδεύουν τους διαλύτες ή (όπως φαίνεται στο Σχήµα 2) από συστήµατα εισαγωγής µικρών φυσαλίδων αδρανούς αερίου χαµηλής διαλυτότητας. Συχνά τα συστήµατα αυτά περιλαµβάνουν φίλτρα αποµάκρυνσης σκόνης και αιωρούµενων σωµατιδίων από τους διαλύτες για να προληφθούν πιθανές βλάβες στις αντλίες ή στα συστήµατα έγχυσης, όπως και η έµφραξη της στήλης. Όπως δείχνεται στο Σχήµα 2, δεν είναι αναγκαίο οι απαερωτές και τα φίλτρα να είναι ενσωµατωµένα τµήµατα ενός συστήµατος HPLC. Για παράδειγµα, ένας απλός τρόπος επεξεργασίας διαλυτών, πριν την εισαγωγή τους στο δοχείο, είναι η διήθησή τους µέσω µικροπορώδους 13

φίλτρου (millipore filter) µε εφαρµογή κενού. Η επεξεργασία αυτή αποµακρύνει αέρια και αιωρούµενα σωµατίδια. 18 Ο διαχωρισµός στον οποίο χρησιµοποιείται ένας διαλύτης σταθερής σύστασης καλείται ισοκρατική έκλουση (isocratic elution). Συχνά, η απόδοση διαχωρισµού ενισχύεται σηµαντικά µε τη βαθµιδωτή έκλουση (gradient elution). Εδώ χρησιµοποιούνται δύο ή τρία συστήµατα διαλυτών, που διαφέρουν σηµαντικά ως προς την πολικότητα. Αφού αρχίσει η έκλουση, ο λόγος των διαλυτών µεταβάλλεται µε τρόπο προγραµµατισµένο άλλες φορές συνεχώς και άλλες µε µια σειρά βηµάτων. Τα σύγχρονα συστήµατα HPLC συχνά είναι εφοδιασµένα µε διατάξεις, οι οποίες εισάγουν διαλύτες από δύο ή περισσότερα δοχεία σε θάλαµο ανάµιξης µε ρυθµούς που µεταβάλλονται συνεχώς. Ο λόγος των όγκων των διαλυτών µπορεί να µεταβάλλεται ως προς το χρόνο γραµµικά ή λογαριθµικά. Όταν η στατική φάση είναι πιο πολική από την κινητή φάση, αυτή η µορφή της HPLC ονοµάζεται κανονικής φάσεως χρωµατογραφία. Σ αυτή την περίπτωση, η στατική φάση έχει προσροφητικές ιδιότητες. Συνήθη υλικά πληρώσεως της στήλης περιλαµβάνουν τη silica και διάφορες πολικές δεσµευµένες φάσεις (κύανο-, διολο-, αµινο-). Στην HPLC κανονικής φάσης, οι αλληλεπιδράσεις διαλύτη-δείγµατος είναι σχετικά ισχυρές. 19 Αυτή η µέθοδος HPLC χρησιµοποιείται συνήθως για το διαχωρισµό συστατικών διαλυτών σε οργανικούς διαλύτες και για το διαχωρισµό ισοµερών. Η κινητή φάση συνίσταται από µη πολικούς διαλύτες, όπως εξάνιο ή 1,1,2-τριφθορο,1,1,2- τριχλωροαιθάνιο(freon). Τροποποιητές, όπως το µεθυλοχλωρίδιο ή ο µέθυλο-tβουτυλαιθέρας, προστίθενται συχνά. Τα συστήµατα HPLC αντιστρόφου φάσεως, εισήχθησαν από τους Howard και Martin 20 το 1950, χρησιµοποιώντας µη πολική στατική φάση, σε συνδυασµό µε πολική κινητή φάση. Χαρακτηρίζονται από ισχυρές αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στην πολική κινητή φάση και τα µόρια του δείγµατος. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση µεταξύ των µορίων του δείγµατος και της µη πολικής στατικής φάσης, είναι ασθενής. Αυτό υποδεικνύει, ότι οι αλληλεπιδράσεις, συνήθως µεταξύ δείγµατος και διαλύτη, είναι αυτές που καθορίζουν τη σχετική κατακράτηση και το διαχωρισµό στα συστήµατα HPLC αντιστρόφου φάσεως. Οι πιο συνηθισµένες αντίστροφες φάσεις είναι οι δεκαοκτυλο-(c18), οκτυλο- (C8), φαιναιθυλο- και κυανοπροπυλο- που είναι χηµικά συνδεδεµένες µε οξείδιο 14

του πυριτίου. Η κινητή φάση, συνήθως συνίσταται από µεθανόλη, ακετονιτρίλιο ή τετραϋδροφουράνιο, αναµειγµένα µε νερό. 1.4.1 Έλεγχος ροής και συστήµατα προγραµµατισµού Πολλά εµπορικά όργανα είναι εφοδιασµένα µε συσκευές ελεγχόµενες από υπολογιστή για τη µέτρηση της ταχύτητας ροής, η οποία υπολογίζεται από την πτώση πίεσης σε έναν αναστολέα τοποθετηµένο στην έξοδο της αντλίας. Κάθε παρατηρούµενη διαφορά στο σήµα από µια προκαθορισµένη τιµή χρησιµοποιείται ακολούθως για αύξηση ή µείωση της ταχύτητας του κινητήρα της αντλίας. Επίσης, τα περισσότερα όργανα διαθέτουν έναν µηχανισµό µεταβολής της σύστασης του διαλύτη κατά συνεχή ή βηµατικό τρόπο. Για παράδειγµα, το όργανο του Σχήµατος 2 διαθέτει µια βαλβίδα, που επιτρέπει την ανάµιξη µέχρι και τεσσάρων διαλυτών κατά ένα εκ των προτέρων προγραµµατισµένο και συνεχώς µεταβαλλόµενο λόγο. 21 1.4.2 Συστήµατα έγχυσης δείγµατος Συχνά, ο περιοριστικός παράγοντας στην επαναληψιµότητα των µετρήσεων στην HPLC είναι ο τρόπος εισαγωγής των δειγµάτων στη στήλη. Το πρόβληµα επιδεινώνεται µε τη διεύρυνση των κορυφών, που προκαλεί η υπερφόρτωση των στηλών. Συνεπώς, οι όγκοι πρέπει να είναι οι ελάχιστοι δυνατοί, από µερικές δεκάδες ml έως 500 ml. Επιπλέον, είναι σηµαντικό να εισάγεται το δείγµα χωρίς να προκαλείται αποσυµπίεση του συστήµατος. Ο παλαιότερος και απλός τρόπος εισαγωγής δείγµατος ήταν η έγχυση µε σύριγγα µέσω ενός ελαστικού διαφράγµατος γνωστού ως septum. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται µικροσύριγγες σχεδιασµένες να αντέχουν σε πιέσεις µέχρι 1500 psi. Σε εγχύσεις αναχαίτισης ροής, η ροή του διαλύτη διακόπτεται στιγµιαία, αποµακρύνεται ένας προσαρµογέας στην κεφαλή της στήλης και το δείγµα εγχέεται απευθείας στην κορυφή (κεφαλή) της στήλης. Μετά την επανατοποθέτηση του προσαρµογέα, το σύστηµα επανέρχεται σε συνθήκες πίεσης. Το πλεονέκτηµα αυτής της τεχνικής είναι η απλότητά της. Η συνηθέστερα χρησιµοποιούµενη µέθοδος εισαγωγής δείγµατος στην HPLC βασίζεται σε βρόχους δειγµάτων, όπως αυτός που φαίνεται στα σχήµατα 1.2 και 1.3. 15

Σχήµα 1.2: Βρόχος δειγµατοληψίας HPLC. Με τη χειρολαβή της βαλβίδας, όπως δείχνεται στο αριστερό σχήµα, ο βρόχος γεµίζει από τη σύριγγα και η κινητή φάση ρέει από την αντλία προς τη στήλη. Όταν η βαλβίδα τοποθετηθεί στη θέση που δείχνεται στο δεξιό σχήµα, ο βρόχος παρεµβάλλεται µεταξύ αντλίας και στήλης, οπότε η κινητή φάση µεταφέρει το δείγµα προς τη στήλη. Σχήµα 1.3: Περιστροφική βαλβίδα δείγµατος: α) θέση πλήρωσης του βρόχου ACB, β) εισαγωγή του δείγµατος στη στήλη. Οι διατάξεις αυτές είναι συχνά ένα αλληλένδετο τµήµα ενός υγροχρωµατογράφου µε βρόχους µεταβλητού όγκου από 5 έως 500 µl. Με βρόχους αυτού του τύπου εισάγονται δείγµατα σε πιέσεις µέχρι 7000 psi µε αποκλίσεις µικρότερες του 1%. Επίσης είναι διαθέσιµες βαλβίδες έγχυσης για µικροόγκους µε βρόχους δείγµατος από 0,5 έως 5µL. 1.5 Πλεονεκτήµατα της HPLC έναντι άλλων µορφών υγροχρωµατογραφίας Μερικά από τα πλεονεκτήµατα είναι: α) Οι στήλες της HPLC χρησιµοποιούνται πολλές φορές χωρίς την ανάγκη αναγέννησης. β) Η διαχωριστική ικανότητα τέτοιων στηλών είναι πολύ µεγαλύτερη από τις κοινές ανοικτές στήλες. γ) Ο χρόνος ανάλυσης είναι µικρότερος. 16

δ) Η οργανολογία της HPLC αυτοµατοποιείται εύκολα, εποµένως είναι δυνατόν ναπραγµατοποιηθεί µεγάλος αριθµός ποσοτικών αναλύσεων. ε) Επειδή η όλη διαδικασία της ανάλυσης εξαρτάται από την οργανολογία και λιγότερο από την ικανότητα του χειριστού-αναλυτή, η επαναληψιµότητα είναι καλύτερη. στ) Είναι δυνατή η ταυτόχρονη διεξαγωγή χρωµατογραφικών αναλύσεων φαρµάκων διαφορετικής χηµικής δοµής. 1.5.1 Στήλες HPLC Οι στήλες της HPLC συνήθως κατασκευάζονται από σωλήνες µικρής διαµέτρου (mm) από ανοξείδωτο χάλυβα, αν και περιστασιακά χρησιµοποιούνται και παχύτοιχοι υάλινοι σωλήνες. Οι τελευταίοι χρησιµοποιούνται σε πιέσεις µικρότερες από 600 psi. Εκατοντάδες πακεταρισµένων στηλών µε διαφορετικό µέγεθος και υλικό πλήρωσης είναι διαθέσιµες από διαφορετικούς κατασκευαστές. 1.5.2 Αναλυτικές στήλες HPLC Οι περισσότερες στήλες HPLC έχουν µήκος από 10 έως 30 cm. Συνήθως οι στήλες είναι ευθύγραµµες. Όταν απαιτείται επιµήκυνσή τους, αυτή επιτυγχάνεται µε σύζευξη δύο ή περισσοτέρων στηλών σε σειρά. Περιστασιακά χρησιµοποιούνται σπειροειδείς στήλες, αν και λόγω σχήµατος η αποτελεσµατικότητά τους δεν είναι καλή. Η εσωτερική διάµετρος των στηλών είναι συνήθως 4 έως 10 mm και το µέγεθος σωµατιδίων του υλικού πλήρωσης είναι 5 ή 10 µm. Σήµερα, η πιο συνηθισµένη στήλη έχει µήκος 25 cm, εσωτερική διάµετρος 4,6 mm και υλικό πλήρωσης µε σωµατίδια µεγέθους 5 µm. Στήλες αυτού του τύπου διαθέτουν 40.000 έως 60.000 θεωρητικές πλάκες/m. Πρόσφατα, ορισµένοι κατασκευαστές προσφέρουν στήλες HPLC, µε µικρότερες διαστάσεις από αυτές που ήδη περιγράφηκαν. 22 Οι στήλες αυτές έχουν εσωτερικές διαµέτρους από 1 έως 4,6 mm και µέγεθος σωµατιδίων υλικού πλήρωσης 3 έως 5 µm. Το µήκος τους είναι µικρό (3 έως 7,5 cm). Οι στήλες του τύπου αυτού διαθέτουν µέχρι και 100.000 πλάκες/m και προσφέρουν το πλεονέκτηµα της ταχύτητας και της ελάχιστης κατανάλωσης διαλύτη. Η τελευταία ιδιότητα έχει ιδιαίτερη σηµασία, επειδή οι διαλύτες υψηλής 17

καθαρότητας, που απαιτούνται στην HPLC είναι δαπανηροί τόσο στην αγορά όσο και στη διάθεσή τους ως εργαστηριακά απόβλητα. 1.5.3 Προστατευτικές στήλες (pre-column) Συνήθως πριν από την αναλυτική στήλη, παρεµβάλλεται µια µικρή προστατευτική στήλη 23 (guard column) ή προστήλη (pre-column) για να αυξήσει το χρόνο ζωής της, αποµακρύνοντας όχι µόνο τα αιωρούµενα σωµατίδια και τις προσµίξεις από το διαλύτη, αλλά και συστατικά του δείγµατος που συνδέονται µε τη στατική φάση µη αντιστρεπτά. Επιπλέον, στη χρωµατογραφία υγρού-υγρού, η προστήλη προκαλεί κορεσµό της κινητής φάσης µε τη στατική έτσι, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες του διαλύτη της αναλυτικής στήλης. Η σύσταση του υλικού της προστήλης πρέπει να είναι παρόµοια µε αυτό της αναλυτικής στήλης. Ωστόσο, το µέγεθος των σωµατιδίων είναι συνήθως µεγαλύτερο για να ελαχιστοποιείται η πτώση πίεσης. Όταν η προστήλη ρυπαίνεται, αναγοµώνεται ή απορρίπτεται και αντικαθίσταται µε νέα του ιδίου τύπου. Εποµένως, η προστήλη θυσιάζεται για την προστασία της δαπανηρότερης αναλυτικής στήλης. 1.5.4 Θερµοστάτες στήλης Σε πολλές εφαρµογές ο αυστηρός έλεγχος της θερµοκρασίας της στήλης δεν είναι αναγκαίος και οι στήλες λειτουργούν σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Ωστόσο συχνά λαµβάνονται καλύτερα χρωµατογραφήµατα διατηρώντας τη θερµοκρασία της στήλης σταθερή εντός µερικών δεκάτων του βαθµού Κελσίου. Τα σύγχρονα όργανα είναι σήµερα εφοδιασµένα µε θερµοστάτες, που ελέγχουν τη θερµοκρασία της στήλης στην περιοχή θερµοκρασιών δωµατίου µέχρι 100 ή 150 0C µε ακρίβεια µερικών δεκάτων του βαθµού. Επίσης, οι στήλες µπορεί να συνδέονται µε µανδύες ύδατος τροφοδοτούµενους από υδατόλουτρο σταθερής θερµοκρασίας για τον ακριβή έλεγχο της θερµοκρασίας. 1.5.5 Υλικά πλήρωσης χρωµατογραφικών στηλών Στην HPLC χρησιµοποιούνται δύο βασικοί τύποι πληρωτικών υλικών, ο πρώτος τύπος αποτελείται από σωµατίδια σφαιροειδή (pellicular) και ο δεύτερος από πορώδη. Τα πρώτα αποτελούνται από σφαιρικά σωµατίδια από ύαλο ή 18

πολυµερές µε τυπικές διαµέτρους 30 έως 40 µm. Στην επιφάνεια των σφαιριδίων αυτών αποτίθεται λεπτό πορώδες στρώµα, όπως SiO2, αλουµίνα, συνθετική ρητίνη πολυστερινίου-διβινυλοβενζολίου ή µια ιονανταλλακτική ρητίνη. Για µερικές εφαρµογές προστίθεται ένα επιπλέον στρώµα, αποτελούµενο από µια υγρή στατική φάση, που συγκρατείται µε προσρόφηση. Εναλλακτικά, τα σφαιρίδια µπορεί να υποστούν χηµική επεξεργασία για να παραχθεί ένα οργανικό επιφανειακό στρώµα. Αυτό το είδος υλικού πλήρωσης χρησιµοποιείται συχνότατα για την κατασκευή προστηλών κι όχι για αναλυτικές στήλες. Το υλικό πλήρωσης µε βάση τα πορώδη σωµατίδια αποτελείται από µικροσωµατίδια διαµέτρου 3 έως 10 µm. Καταβάλλεται κάθε προσπάθεια για την ελαχιστοποίηση του εύρους περιοχής µεγεθών τους. Τα σωµατίδια αποτελούνται από SiO2, αλουµίνα, συνθετικές ρητίνες πολυστερινίουδιβινυλοβενζολίου ή µια ιονανταλλακτική ρητίνη. Το SiO2 είναι το συνηθέστερο υλικό πλήρωσης στην HPLC. Τα σωµατίδια του SiO2 παρασκευάζονται µε συσσωµάτωση σωµατιδίων SiO2 µεγέθους µικρότερου από ένα µm σε συνθήκες που οδηγούν στο σχηµατισµό µεγαλύτερων σωµατιδίων πολύ στενής περιοχής τιµών διαµέτρου. Τα σχηµατιζόµενα σωµατίδια συχνά καλύπτονται µε λεπτά οργανικά στρώµατα, που συνδέονται µε την επιφάνεια µε χηµικό ή φυσικό τρόπο. 1.6 Ανιχνευτές Αντίθετα µε την αέριο χρωµατογραφία, στην υγρή χρωµατογραφία δεν υπάρχουν ανιχνευτές 24, που βασίζονται σε γενικές ιδιότητες της ύλης και τόσο αξιόπιστοι, όπως ο ανιχνευτής φλόγας και ο θερµικής αγωγιµότητας. Η µεγάλη πρόκληση στην ανάπτυξη της υγρής χρωµατογραφίας είναι η βελτίωση των ανιχνευτών. Ο ιδανικός ανιχνευτής για την HPLC πρέπει να έχει όλες τις ιδιότητες που αναφέρονται στους ανιχνευτές της αερίου χρωµατογραφίας µε τη διαφορά ότι ο ανιχνευτής της HPLC δεν απαιτείται να αποκρίνεται σε τόσο µεγάλη περιοχή θερµοκρασιών. Επιπλέον, ένας ανιχνευτής HPLC πρέπει να έχει τον ελάχιστο δυνατό εσωτερικό όγκο για να περιορίζεται η διεύρυνση των κορυφών. 19

1.6.1 Τύποι ανιχνευτών Υπάρχουν δύο βασικοί τύποι ανιχνευτών HPLC 25. Αυτοί που ανταποκρίνονται σε µια βασική ιδιότητα (bulk property detectors) της κινητής φάσης, όπως ο δείκτης διάθλασης, η διηλεκτρική σταθερά ή η πυκνότητα, οι τιµές των οποίων επηρεάζονται από την παρουσία των εκλουόµενων συστατικών. Αντίθετα, υπάρχουν ανιχνευτές που αποκρίνονται σε ιδιότητα του εκλουόµενου συστατικού (solute property detectors), όπως είναι η απορρόφηση στο υπεριώδες, ο φθορισµός ή το ρεύµα διάχυσης. Την ιδιότητα αυτή δεν πρέπει να διαθέτει η κινητή φάση. Στον Πίνακα 1 αναφέρονται οι συνηθέστεροι ανιχνευτές HPLC και µερικές από τις πιο σηµαντικές ιδιότητές τους. Μια καταγραφή του 1982, από 365 δηµοσιευµένες εργασίες στις οποίες η HPLC έπαιζε σηµαντικό ρόλο, αποκάλυψε ότι στο 71% γινόταν χρήση ανιχνευτή απορρόφησης UV, στο 15% φθορισµού, στο 5,4% δείκτη διάθλασης, στο 4,3% γινόταν χρήση ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή και στο 4,3% χρησιµοποιήθηκαν διάφορα άλλα συστήµατα µέτρησης. 26 Από τους ανιχνευτές απορρόφησης UV, το 39% βασίσθηκε σε µια από τις γραµµές εκποµπής υδραργύρου, το 13% σε επιλεγµένη ακτινοβολία από πηγή δευτερίου και το 48% σε ακτινοβολία επιλεγµένη µε µονοχρωµάτορα. 20

Πίνακας 1.1: Απόδοση ανιχνευτών HPLC Ανιχνευτής HPLC ιαθεσιµότητα στο εµπόριο Όριο ανίχνευσης µάζας (LOD) (εµπορικοί ανιχνευτές)α Όριο ανίχνευσης µάζας (LOD) (υπάρχουσα κατάσταση)β Απορρόφησης Ναι γ 100pg-1 ng 1 pg Φθορισµού Ναι γ 1 10 pg 10 fg Ηλεκτροχηµικός Ναι γ 10 pg 1 ng 100 fg είκτη διάθλασης Ναι 100 ng 1 µg 10 ng Αγωγιµότητας Να ιδ 100 pg 1ng 500 pg FT-IR Ναι δ 1 µg 100 ng Σκέδαση φωτός ε Ναι - 500 mg Επιλογής στοιχείου Όχι - 10 ng Φωτοϊοντισµού Όχι - 1 pg 1ng α Το όριο ανίχνευσης µάζας (LOD) υπολογίζεται ως η εγχεόµενη µάζα που αποδίδει σήµα ίσο µε το πενταπλάσιο του θορύβου (σ), χρησιµοποιώντας ένα γραµµοµοριακό βάρος 200 g/mol. Έγχυση 10 ml για συνήθη ή 1 ml για µικροσωληνώδη LC. β Ορίζεται όπως στο α, αλλά ο όγκος έγχυσης είναι γενικά µικρότερος. γ Εµπορικά διαθέσιµοι για µικροσωληνώδη LC. δ Εµπορικά διαθέσιµοι, ωστόσο υψηλού κόστους. ε Συµπεριλαµβανοµένης της σκέδασης φωτός µικρής γωνίας και της νεφελοµετρίας. 1.7 Είδη υγροχρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης Στην HPLC µπορούν να εφαρµοστούν όλα τα είδη των φυσικοχηµικών µηχανισµών που λαµβάνουν χώρα στους χρωµατογραφικούς διαχωρισµούς, 27 µε την κατάλληλη χρήση υλικού πλήρωσης της στήλης, δηλαδή της στατικής φάσης και του διαλύτη έκλουσης της λεγόµενης κινητής φάσης. Έτσι λοιπόν, µε βάση το υλικό πλήρωσης της στήλης και κατά συνέπεια το µηχανισµό διαχωρισµού των υπό ανάλυση ουσιών (φαρµάκων) 28, η HPLC διακρίνεται σε: 1) Χρωµατογραφία Προσρόφησης: είναι η παλαιότερη χρωµατογραφική τεχνική 29, στην οποία τα συστατικά του µίγµατος αλληλεπιδρούν (προσροφούνται) στην επιφάνεια ή σε ορισµένες θέσεις της επιφάνειας τηςστερεής συνήθως-στατικής φάσης. Η ισορροπία που καθίσταται µεταξύ των προσροφηµένων σωµατιδίων και των σωµατιδίων στην κινητή φάση, η οποία 21

µπορεί να είναι υγρή ή αέρια, πετυχαίνει το διαχωρισµό. Οι αλληλεπιδράσεις που λαµβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης, διπόλου-διπόλου, δυνάµεις London, ή συνδυασµός των δυνάµεων αυτών. Κατατάσσεται στη χρωµατογραφία κανονικής φάσης, όπου η στατική φάση (διοξείδιο του πυριτίου SiO2 ή αλουµίνα Al2O3) είναι πολικότερη από την κινητή φάση που αποτελείται από µη πολικούς διαλύτες, όπως εξάνιο, χλωροφόρµιο κ.ά. 2) Χρωµατογραφία Κατανοµής: εφαρµόζεται στην ανάλυση οµόλογων µη ιονικών ενώσεων 30. Η υγρή στατική φάση σχηµατίζει ένα λεπτό υµένιο στην επιφάνεια του στερεού υποστρώµατος. Ο διαχωρισµός βασίζεται στη διαφορετική κατανοµή µεταξύ της υγρής κινητής και της υγρής στατικής φάσης. Κατατάσσεται στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης, όπου η στατική φάση που είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από διοξείδιο του πυριτίου (SiO2) συζευγµένο µε οµοιοπολικό δεσµό µε αλκύλια, φαινύλια, αµινοοµάδες, διόλες κ.ά., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από µίγµατα οργανικών διαλυτών (µεθανόλη, ακετονιτρίλιο) µε υδατικά ρυθµιστικά διαλύµατα ή νερό. Τα υλικά της συζευγµένης φάσης πλεονεκτούν ως προς τη σταθερότητα, αλλά και τη συµβατότητα µε µεγάλη ποικιλία εκλουστικών συστηµάτων. Είναι η πιο διαδεδοµένη τεχνική HPLC και χρησιµοποιείται στο 80% περίπου των αναλυτικών εφαρµογών. 3) Χρωµατογραφία Ιοντοανταλλαγής: ο διαχωρισµός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των αναλυόµενων ιόντων και των φορτισµένων οµάδων της στατικής φάσης 31. Έτσι στην περίπτωση της κατιοντοανταλλαγής λαµβάνει χώρα η ισορροπία: RSO - 3X + + Y + RSO - 3 Y+ + X+ όπου: RSO3 - X+ είναι η δραστική οµάδα της στατικής φάσης και Y+ το αναλυόµενο κατιόν. Ανάλογη ισορροπία ισχύει και στην περίπτωση της ανιοντοανταλλαγής. Οι κυριότερες παράµετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής οµάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το ph, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερµοκρασία. 22

Ως υλικά πλήρωσης χρησιµοποιούνται διάφορες ρητίνες που αποτελούν συµπολυµερή στυρενίου-διβινυλοβενζολίου, στα οποία έχουν εισαχθεί σουλφονικές ή καρβοξυλικές οµάδες, τριτοταγείς ή τεταρτοταγείς αµίνες. 4) Χρωµατογραφία Συγγένειας (Affinity Chromatography): για να επιτευχθεί διαχωρισµός, οι προσδιοριζόµενες ενώσεις δεσµεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες (ligands) 32 οι οποίοι είναι συνδεδεµένοι µε οµοιοπολικούς δεσµούς στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Για παράδειγµα ο υποκαταστάτης µπορεί να είναι ένα είδος αντισώµατος σε µια συγκεκριµένη πρωτεΐνη. Κατά τη διέλευση µέσα από τη στήλη µίγµατος µεγάλου αριθµού πρωτεϊνών, µόνο µία πρωτεΐνη αντιδρά µε το συγκεκριµένο αντίσωµα. Μετά την έκπλυση των υπολοίπων συστατικών από τη στήλη, η επιθυµητή πρωτεΐνη αποδεσµεύεται από το αντίσωµα µε µεταβολή της τιµής ph ή της ιονικής ισχύος.αποτελεί την πιο σύγχρονη και πιο εκλεκτική χρωµατογραφική τεχνική. Στην κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωµατογραφία Εναντιοµερών µε την οποία διαχωρίζονται εναντιοµερείς µορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειροµορφία (Chiral Chromatography) 33. Για µερικά φάρµακα που παρουσιάζουν χειροµορφία, η επιθυµητή φαρµακολογική δράση οφείλεται εφ ολοκλήρου στο ένα εναντιοµερές, ενώ ο αντίποδας είναι υπεύθυνος για σηµαντικές ανεπιθύµητες ενέργειες. Η Χρωµατογραφία Εναντιοµερών είναι αποτελεσµατική µέθοδος για το διαχωρισµό των ρακεµικών µιγµάτων. 5) Χρωµατογραφία Αποκλεισµού Μεγέθους (Size Exclusion) ή ιαπερατότητας Πηκτής (Gel Permeation Chromatography): ο διαχωρισµός επιτυγχάνεται µε βάση το σχήµα και το µέγεθος των µορίων των υπό ανάλυση ενώσεων. Τα µεγαλύτερα µόρια προχωρούν µε µεγαλύτερη ταχύτητα. Σ αντίθεση µε τα άλλα είδη χρωµατογραφίας, δεν υπάρχει αλληλεπίδραση ανάµεσα στη στατική φάση και τα διαχωριζόµενα συστατικά. Η υγρή ή η αέρια κινητή φάση διαπερνά µέσα από πορώδη πηκτή. Το µέγεθος των πόρων είναι µικρό και αποκλείονται τα µεγάλα µόρια του προσδιοριζόµενου συστατικού που προχωρούν, χωρίς να εισέλθουν στην πηκτή, ενώ τα µικρά µόρια εξέρχονται από τη στήλη σε µεγαλύτερο χρόνο. Η Χρωµατογραφία Αποκλεισµού Μεγέθους βρίσκει εφαρµογές στους προσδιορισµούς και το χαρακτηρισµό των πολυµερών. 23

Κεφάλαιο 2: Μελέτες σταθερότητας φαρµακευτικών ενώσεων µε χρωµατογραφικές τεχνικές 2.1 Τι είναι η ενδεικτική µέθοδος σταθερότητας Σύµφωνα µε τον τυπικό ορισµό της έννοιας, µία ενδεικτική µέθοδος σταθερότητας είναι ένας αριθµός ποσοτικών αναλυτικών µεθόδων που βασίζονται στη χαρακτηριστική δοµή, τις χηµικές ή βιολογικές ιδιότητες κάθε δραστικού συστατικού του φαρµακευτικού προϊόντος και οι οποίες διακρίνουν κάθε ενεργό συστατικό από τα προϊόντα αποικοδόµησης έτσι ώστε κάθε δραστικό συστατικό να µπορεί να µετρηθεί µε ακρίβεια. Εποµένως, µία ενδεικτική µέθοδος σταθερότητας είναι µία αναλυτική διαδικασία η οποία είναι ικανή να διαχωρίζει το δραστικό συστατικό από τα προϊόντα διάσπασης και τα προϊόντα διάσπασης µεταξύ τους παρουσία προσµίξεων κατά την διάρκεια της αξιολόγησης της µεθόδου σταθερότητας. Επιπλέον, η µέθοδος πρέπει να είναι ευαίσθητη ώστε να ανιχνεύει και να ποσοτικοποιεί ένα ή περισσότερα από τα προϊόντα διάσπασης και να είναι ικανή να διαχωρίζει κάθε άλλη πιθανή κορυφή όπως είναι εκείνη του εσωτερικού προτύπου. Με τα παραπάνω κριτήρια, η διαγνωστική φύση της µεθόδου υποδεικνύει ότι η µέθοδος πρέπει να είναι ειδική για µελέτες σταθερότητας (stability-specific). Ακραίες (stress) συνθήκες µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την επιτάχυνση της διαδικασίας αποικοδόµησης και την παραγωγή των προϊόντων διάσπασης της δραστικής ουσίας. Ωστόσο, οι ακραίες συνθήκες διάσπασης οι οποίοι πραγµατοποιούνται σε έντονες συνθήκες οξείδωσης, φωτόλυσης ή υδρόλυσης σε ακραίες τιµές ph µπορεί να σχηµατιστούν κάποια προϊόντα διάσπασης τα οποία είναι απίθανο να σχηµατιστούν σε συνθήκες επιταχυνόµενες ή σε µακράς διάρκειας µελέτες σταθερότητας κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης των φαρµακευτικών προϊόντων. Τα παραγόµενα προϊόντα διάσπασης είναι χρήσιµα για την ανάπτυξη και την επικύρωση µιας αναλυτικής µεθόδου για τον ποιοτικό έλεγχο η οποία να είναι ενδεικτική για µελέτες σταθερότητας (stability-indicating) διευρύνοντας έτσι τη χρησιµότητα της αναλυτικής µεθόδου. Μια µέθοδο ενδεικτική για µελέτες σταθερότητας πρέπει να είναι σύµφωνη µε την επιδιωκόµενη εφαρµογή της, εποµένως πρέπει να επιλέγεται η κατάλληλη τεχνική ώστε να προσδιορίζει τις απαιτήσεις της µελέτης 24

σταθερότητας. Προφανώς, η σκοπούµενη εφαρµογή της ενδεικτικής µεθόδου σταθερότητας αφορά την παρακολούθηση της σταθερότητας µιας συγκεκριµένης ουσίας- σε τελικό προϊόν- και απαιτεί αξιολόγηση της µεθόδου. Ωστόσο, όταν τίθεται θέµα αναµονής χρόνου, όπως συµβαίνει κατά την διάρκεια της διαλυτοποίησης ή κατά τη διαδικασία της παραγωγής, προτείνεται να αξιολογείται η µέθοδος ως προς τα χαρακτηριστικά της µεθόδου σταθερότητας πριν την σκοπούµενη εφαρµογή της. Η περισσότερο διαδεδοµένη τεχνική για µελέτες σταθερότητας είναι η υγροχρωµατογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC). Στην τεχνική αυτή βασίζεται πάνω από το 85% των φαρµακευτικών εφαρµογών. Άλλες χρωµατογραφικές τεχνικές διαχωρισµού, όπως είναι η χειρόµορφη χρωµατογραφία (CC), η χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (TLC), η αεριοχρωµατογραφία (GC), και η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (CE) είναι κατάλληλες για την ανάπτυξη ενδεικτικών ή και ειδικών µεθόδων για µελέτες σταθερότητας. Μη χρωµατογραφικές και φασµατοσκοπικές τεχνικές όπως είναι η τιτλοµετρία, η ατοµική απορρόφηση, η φασµατοφωτοµετρία, και η φασµατοσκοπία IR, αν και ακριβής δε θεωρούνται κατάλληλες για ανάπτυξη µεθόδων ενδεικτικών για µελέτες σταθερότητας. 2.2 Γενική επισκόπηση της πορείας ανάπτυξης µεθόδου για µελέτες σταθερότητας Η διαδικασία που ακολουθείται για την ανάπτυξη µεθόδου για µελέτες σταθερότητας µπορεί να απεικονιστεί µε ένα γενικό πλαίσιο ώστε να προσδιοριστούν τα βήµατα που απαιτούνται µέχρι το τελικό προϊόν. Η διαδικασία αυτή οδηγεί στην προτεινόµενη µελέτη σταθερότητας, σχήµα 2.1. 25

Συγκέντρωση γενικών πληροφοριών που προέρχονται από φυσικοχηµικές ιδιότητες Προσδιορισµός εάν το δείγµα απαιτεί ιδιαίτερο χειρισµό Από τις φυσικοχηµικές ιδιότητες επιλέγεται το λmax του ανιχνευτή Επιλογή της µεθόδου LC και εκτέλεση αρχικών µετρήσεων Εκτίµηση παραµέτρων διαχωρισµού / ισοκρατικός ή βαθµιαίος Εκτέλεση πειραµάτων αποικοδόµησης σε έντονες συνθήκες Βελτιστοποίηση συνθηκών διαχωρισµού/ Βελτιστοποίηση Rs Σύνοψη µεθοδολογίας/ Οριστικοποίηση τεκµηρίωσης Επικύρωση µεθόδου/μεταφορά στο εργαστήριο έλεγχου Σχήµα 2.1. Γενικό πλάνο ανάπτυξης µελέτη σταθερότητας Η γνώση των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων των δραστικών συστατικών των φαρµακευτικών προϊόντων είναι ανεκτίµητης σηµασίας κατά τη διαδικασία της ανάπτυξης της µεθόδου. Πληροφορίες για τις διάφορες ιδιότητες µπορεί να συλλεχθούν είτε µέσω ειδικού προγράµµατος που παράγει τις κατάλληλες πληροφορίες κατά την ανάπτυξη του φαρµάκου-σύνθεση του φαρµάκου-ή µέσω βιβλιογραφικής έρευνας ή από το προφίλ των φαρµάκων από την εταιρεία παραγωγής, από βιβλιοθήκες φασµάτων ή αναφορές. Πληροφορίες σχετικές µε τις σταθερές διάστασης, τους συντελεστές κατανοµής, τον ενδογενή φθορισµό (αν υπάρχει), τη χρωµατογραφική συµπεριφορά, τις φασµατοφωτοµετρικές ιδιότητες, τα δυναµικά οξειδοαναγωγής, τη διαλυτότητα και τις µελέτες σταθερότητας σκευάσµατος, είναι χρήσιµες και µπορούν να επισπεύσουν την πορεία της ανάπτυξης της αναλυτικής µεθόδου. Η σταθερά διάστασης και οι συντελεστές κατανοµής µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανάπτυξη αποδοτικών διαδικασιών υγρής/υγρής εκχύλισης, ενώ οι πληροφορίες σχετικές µε φθορίζουσες, φασµατοφωτοµετρικές, χρωµατογραφικές, και οξειδοαναγωγικές ιδιότητες µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την επιλογή της καλύτερης µεθόδου ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης του αναλύτη που µας ενδιαφέρει. Μελέτες σταθερότητας πραγµατοποιούνται στη φαρµακευτική ουσία, σε διάλυµα και σε µίγµα µε φαρµακευτικά έκδοχα ως µέρος των µελετών συµβατότητας. Χαρακτηριστικές οµάδες ταυτοποιούνται και διερευνάται η ευαισθησία του φαρµάκου στην 26

υδρόλυση, την οξείδωση, τη θερµική διάσπαση και σε άλλες συνθήκες. Οι µελέτες συµβατότητας πραγµατοποιούνται για την αξιολόγηση της σταθερότητας των δραστικών συστατικών όταν αναµιγνύονται µε κοινά έκδοχα καθώς επίσης και για τον προσδιορισµό πιθανών αλληλεπιδράσεων µεταξύ του φαρµάκου και των πρώτων υλών. Οι διαλυτότητες θα πρέπει να προσδιορίζονται σε έναν αριθµό διαλυτών που καλύπτουν µία κλίµακα πολικότητας και είναι οι πιο συνήθης κατά την ανάπτυξη της µεθόδου. Οι διαλυτότητες πρέπει να προσδιορίζονται τόσο σε υδατικούς και όσο και σε οργανικούς διαλύτες. Βιβλιοθήκες φασµάτων έχουν καθιερωθεί από τις οποίες µπορούν να σταχυολογηθούν χρήσιµες πληροφορίες για τις αρχικές συνθήκες σε έναν διαχωρισµό HPLC. Ωστόσο, οι πληροφορίες αυτές µπορεί να µην είναι γνωστές ή διαθέσιµες, οπότε ο αρχικός διαχωρισµός πρέπει να βασίζεται σε προηγούµενη εµπειρία ώστε να προσδιοριστεί το σύνολο των ενεργειών που απαιτούνται για την πειραµατική πορεία που θα πρέπει να ακολουθηθεί. Ιδανικά, η γνώση της φύσης των δραστικών συστατικών που σχετίζονται µε τη πορεία της σύνθεσης και άλλες ιδιότητες θα µπορούσε να είναι ωφέλιµη. Για παράδειγµα, πληροφορίες που αφορούν τη συνθετική πορεία της ένωσης, θα µπορούσαν να βοηθήσουν την αναζήτηση συγγενών ουσιών, πιθανών προϊόντων διάσπασης και προσµίξεων. Η γνώση της χηµικής δοµής της ένωσης θα µπορούσε να αποκαλύψει πιθανά στερεοϊσοµερή τα οποία µε την σειρά τους να απαιτούν µία διαφορετική στρατηγική διαχωρισµού. Στον πίνακα 2.1, παρατίθενται τυπικές πληροφορίες που είναι χρήσιµες και αφορούν τη φύση της ένωσης. Όσο περισσότερες πληροφορίες είναι διαθέσιµες, τόσο λιγότερο εµπειρική θα είναι η προσέγγιση της ανάπτυξης αναλυτικής µεθόδου. 27

Πίνακας 2.1 Χρήσιµες φυσικοχηµικές πληροφορίες σχετικές µε τον αναλύτη Μήκος κύµατος απορρόφησης (λmax) Tαυτότητα/Αριθµός ενώσεων που περιέχονται (π.χ.στερεοϊσοµερή/κέντρα ασυµµετρίας) Χηµική δοµή /επαµφοτερίζουσες ιδιότητες Μοριακό βάρος pka τιµές των ενώσεων Μορφή άλατος της ένωσης ιαλυτότητα της ένωσης Καθαρότητα της ένωσης 2.3 Επιλογή της χρωµατογραφικής µεθόδου Μία φαρµακευτική ένωση έχει συνήθως µοριακό βάρος µικρότερο από 1,000 dalton και είναι διαλυτή είτε στο νερό είτε σε κάποιο οργανικό διαλύτη. Τα υδατοδιαλυτά φάρµακα είναι ιοντικές ή µη ιοντικές ενώσεις, ενώ τα φάρµακα που διαλύονται σε οργανικούς διαλύτες είναι πολικές ή µη πολικές ενώσεις. Οι περισσότεροι διαχωρισµοί πραγµατοποιούνται µε την τεχνική της υγροχρωµατογραφίας αντίστροφης φάσης (RP-HPLC). Σε µερικές περιπτώσεις, τα πολικά φάρµακα αναλύονται µε κανονικής φάσης HPLC. Στις περιπτώσεις ουσιών µε MB>1000 daltons, είναι αναγκαίο να χρησιµοποιηθούν άλλες χρωµατογραφικές µέθοδοι για το διαχωρισµό τους. 2.3.1 Υγροχρωµατογραφία αντιστρόφου φάσεως Στα πλεονεκτήµατα της τεχνικής RP-HPLC υπάγονται η ευαισθησία των µεθόδων που αναπτύσσονται και η ικανότητα της τεχνικής να χρησιµοποιείται σε θερµοκρασία περιβάλλοντος ή σε σχετικά µέτριες θερµοκρασίες οπότε δεν ευνοείται η διάσπαση του αναλύτη. 59 2.3.2 Χειρόµορφη Χρωµατογραφία Από τις αρχές της δεκαετίας του 90, ο οργανισµός FDA εκδίδει ένα έγγραφο σχετικά µε την ανάπτυξη νέων εναντιοµερών φαρµάκων, µέχρι τότε η πλειοψηφία των εναντιοµερών συνθετικών ενώσεων θεωρούνταν ως ρακεµικά µίγµατα. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι, µέχρι πρόσφατα, δεν ήταν τεχνικά δυνατός αλλά και οικονοµικά εφικτός ο διαχωρισµός ενός ρακεµικού µίγµατος 28

στα επιµέρους εναντιοµερή του. Η εµπειρία έχει δείξει ότι τα εναντιοµερή επιδεικνύουν διαφορετικές θεραπευτικές ιδιότητες. Ωστόσο, µε τις οδηγίες του διεθνούς οργανισµού FDA και την πρόσφατη τεχνολογική ανάπτυξη, νέες χηµικές ενώσεις που διαθέτουν κέντρα ασυµµετρίας µπορούν να διαχωριστούν και εποµένως τα φαρµακευτικά προϊόντα που είναι εναντιοµερή χορηγούνται στη πλειονότητα τους µε τη µορφή του δραστικού εναντιοµερούς και όχι ως ρακεµικά µίγµατα 60. Όπως αναφέρετε στις οδηγίες του διεθνούς συνεδρίου εναρµόνισης (ICH, International Conference on Harmonization) που αφορούν τις προδιαγραφές των φαρµακευτικών ουσιών και φαρµακευτικών προϊόντων, θα πρέπει να ικανοποιούνται οι έλεγχοι που παρατίθενται στον πίνακα 2.2 για µία νέα φαρµακευτική ουσία που είναι οπτικά ενεργή. Πίνακας 2.2 Οδηγίες του ICH για τα φαρµακευτικά προϊόντα Φαρµακευτική Ουσία Προσµίξεις Ανάλυση Ταυτότητα Φαρµακευτικό Προϊόν Προϊόντα διάσπασης Ανάλυση Ταυτότητα Έλεγχοι/Προδιαγραφές απαιτήσεων Παρεµφερείς µε άλλες προσµίξεις Εναντιοεκλεκτική διαδικασία ή µη χειρόµορφη µέθοδος µε κατάλληλα µέσα για τον έλεγχο προσµίξεων εναντιοµερών Οι έλεγχοι πρέπει να διακρίνουν τα εναντιοµερή Έλεγχος για άλλο εναντιοµερές εάν αυτό αποτελεί προϊόν διάσπασης Εάν το εναντιοµερές δεν είναι προϊόν διάσπασης, µία µη εναντιοεκλεκτική µέθοδος είναι αποδεκτή, αλλά ή χειρόµορφη ανάλυση είναι προτιµότερη ή εναλλακτικά µη εναντιοεκλεκτική ανάλυση συµπεριλαµβανοµένου τρόπου για τον έλεγχο της παρουσίας του εναντιοµερούς Έλεγχος για την διακρίβωση του σωστού εναντιοµερούς 2.3.3 Αεριοχρωµατογραφία H αεριοχρωµατογραφία µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την ανάπτυξη µιας ενδεικτικής µεθόδου σταθερότητας, δεν είναι όµως τόσο εύχρηστη όσο η HPLC µέθοδος καθώς η φαρµακευτική ουσία µπορεί να µην είναι πτητική. Από 29

την άλλη πλευρά, η αύξηση της θερµοκρασίας πιθανόν να προκαλέσει διάσπαση της ουσίας ή και ρακεµοποίησή της, αν πρόκειται για χειρόµορφη ένωση. Υπάρχει µόνο ένας περιορισµένος αριθµός περιπτώσεων στις οποίες η τεχνική αυτή θα µπορούσε να είναι χρήσιµη καθώς µικρές και µη αρωµατικές ενώσεις συνήθως διαχωρίζονται µε τις τεχνικές της HPLC και της TLC. 2.3.4 Χρωµατογραφία Λεπτής Στιβάδας (Thin-Layer Chromatography) Η χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) αποτελεί την πρώιµη χρωµατογραφική τεχνική και είναι ακόµη ευρέως διαδεδοµένη σε όλα τα στάδια της φαρµακευτικής βιοµηχανίας, τόσο σε επίπεδο έρευνας όσο και στο εργαστήριο ποιοτικού ελέγχου. Χρησιµοποιείται κατά τη διαδικασία Της ανάπτυξης ενός φαρµάκου, στον έλεγχο καθαρότητας ενός φαρµακευτικού υποστρώµατος, στον έλεγχο των διαλυµάτων αναφοράς, και στα ενδιάµεσα προϊόντα. Χαρακτηρίζεται από σηµαντικά πλεονεκτήµατα όπως είναι η απλότητα, το χαµηλό κόστος, και ο σύντοµος χρόνος ανάλυσης. Το σηµαντικότερο µειονέκτηµα της τεχνικής είναι η µεταβλητότητα. Ο Constanzo έχει προτείνει µία µέθοδο προσέγγισης τριών σηµείων για την βελτιστοποίηση του διαχωρισµού και εποµένως µείωση της µεταβλητότητας ελέγχοντας τη σύσταση της κινητής φάσης. 61 2.3.5 Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση (CE) και τριχοειδής ηλεκτροχρωµατογραφία (CEC) Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση είναι µία τεχνική διαχωρισµού που βασίζεται στην κινητικότητα των ιόντων µέσω ενός ρυθµιστικού διαλύµατος που περιέχεται σε µία τριχοειδής στήλη υπό την επίδραση ηλεκτρικά φορτισµένου περιβάλλοντος. Αυτό παρέχει διαχωρισµό φορτισµένων σωµατιδίων. Όταν η CE συνδεθεί µε στατική φάση και εφαρµοστεί υψηλή πίεση, τότε είναι γνωστή ως CEC, στην οποία ο διαχωρισµός βασίζεται στην ηλεκτροφορετική µετανάστευση και χρωµατογραφικό διαµερισµό (chromatographic partitioning) καθιστώντας εφικτό τον διαχωρισµό ουδέτερων µορίων. Και οι δύο τεχνικές είναι περισσότερο εφαρµόσιµες σε βιολογικά συστήµατα, στην βιοφαρµακευτική και σε άλλες R&D εφαρµογές και λιγότερο στην διασφάλιση ποιότητας. Είναι πολύ ευαίσθητες και κατάλληλες για διαχωρισµούς µικρών ποσοτήτων ακριβών βιοφαρµακευτικών ουσιών. Από 30

την άλλη πλευρά έχουν µικρή εφαρµογή στους ελέγχους για την απελευθέρωση του προϊόντος ή στις µελέτες σταθερότητας. Η χρησιµότητα τους οφείλεται στην ικανότητα των τεχνικών να επιτυγχάνουν υψηλή ευαισθησία και διαχωριστικότητα µε υψηλές αποδόσεις ακόµη και στην περίπτωση κορυφών µε χαµηλή διασπορά. Ο Moffat και οι συνεργάτες του 62, έχει αναφέρει ασυνήθιστες υψηλές αποδόσεις της τάξης πάνω από 4.5 εκατοµµύρια πλάκες/µέτρο στην περίπτωση της τριχοειδούς ηλεκτροχρωµατογραφίας κατά την ανάλυση εν µέρει ιονισµένων ανιοντικώνουδέτερων ενώσεων της πυριµιδίνης χρησιµοποιώντας στήλη C18. 2.4 Ο ρόλος των µελετών σταθερότητας σε συνθήκες επιταχυνόµενης διάσπασης Σύµφωνα µε έκδοση του 1987 του οργανισµού FDA σχετικά µε τις οδηγίες που αφορούν την µελέτη σταθερότητας ορίζεται σαφώς ότι τα φάρµακα πρέπει να υποβάλλονται σε έναν αριθµό έντονων συνθηκών αποικοδόµησης συµπεριλαµβανοµένου όξινων, βασικών και οξειδωτικών συνθηκών. Σε αυτό το πρωτόκολλο ανάλυσης περιλαµβάνεται και κυκλικές σειρές µετρήσεων ελέγχοντας την επίδραση της θερµοκρασίας και του φωτός (φωτοσταθερότητα). Οι πρόσφατες οδηγίες του οργανισµού ICH (Q2Α και Q2Β) δεν προσδιορίζουν τον τρόπο διεξαγωγής των µελετών σταθερότητας αλλά αφήνεται στην κρίση των υπεύθυνων εταιριών. Η µελέτη των προϊόντων διάσπασης πρέπει να πραγµατοποιείται κατά τα πρώτα στάδια της πορείας ανάπτυξης ώστε να διασφαλίζεται ότι η µέθοδος διαθέτει διαχωριστική ευαισθησία πριν ο χρόνος, η προσπάθεια και τα χρήµατα δαπανηθούν για την παραγωγή του φαρµακευτικού σκευάσµατος. Στα έγγραφα των οδηγιών δεν αναφέρονται λεπτοµερώς οι συνθήκες διεξαγωγής των πειραµάτων. Οι προτεινόµενες συνθήκες διάσπασης συνοψίζονται στον πίνακα 2.2. Είναι απαραίτητο να πραγµατοποιηθούν κάποια προκαταρκτικά πειράµατα για την εύρεση τoυ κατάλληλου συνδυασµού συγκέντρωσης αντιδραστηρίου και χρόνου που επιδρά για την επίτευξη αποικοδόµησης σε ποσοστό κατά προτίµηση της τάξης 20-30%. Ανάλογα µε τη δραστική ουσία του φαρµακευτικού προϊόντος, δεν προκαλούν όλα τα αντιδραστήρια αποικοδόµησης διάσπαση της ουσίας, ωστόσο, κάθε αντιδραστήριο θα 31

πρέπει να αξιολογηθεί ώστε να προσδιοριστεί το αποτέλεσµα της διάσπασης που προκαλεί. Μελετώνται οι εξής παράµετροι: Ικανοποιητικός παράγοντας χωρητικότητας k. Κατά την αρχική ανάπτυξη της µεθόδου θα πρέπει να επιτυγχάνεται κατάλληλα διαχωρισµένη κορυφή, µε k να κυµαίνεται µεταξύ της περιοχής 4 έως 10. Αυτή η κλίµακα επιτρέπει κατάλληλο διάστηµα χρόνου στο χρωµατογράφηµα ώστε τα προϊόντα διάσπασης να εκλούονται πριν ή µετά την κύρια κορυφή του δραστικού προϊόντος. Καθώς η πολικότητα των προϊόντων αποικοδόµησης συγκρινόµενη µε εκείνη της κύρια κορυφής δεν είναι γνωστή, η τιµή του k της κύριας κορυφής στο µέσον του χρωµατογραφήµατος προσθέτει κάποια ασφάλεια ότι τα προϊόντα διάσπασης θα διαχωρισθούν ικανοποιητικά. Συνθήκες Αποικοδόµησης. Τυπικές συνθήκες διάσπασης περιλαµβάνουν αντιδράσεις υδρόλυσης, φωτόλυσης, διάσπαση σε όξινες και βασικές συνθήκες, µελέτη επίδρασης της θερµοκρασίας. Στόχος είναι η επίτευξη διάσπασης σε ποσοστό 20-30% και όχι η πλήρης αποικοδόµηση της δραστικής ουσίας καθώς µια τέτοια διαδικασία θα προκαλούσε δευτερογενής αντιδράσεις διάσπασης των προϊόντων διάσπασης που είναι απίθανο να συµβούν κάτω από φυσιολογικές συνθήκες αποθήκευσης. Αναλόγως της φύσης του δραστικού φαρµακευτικού συστατικού, µεταβάλλονται και οι συνθήκες που οδηγούν στη διάσπαση της. Εσωτερικό Πρότυπο. Εάν η αναλυτική µέθοδος απαιτεί τη χρήση εσωτερικού προτύπου, ενδείκνυται να µην διασπάται και η τιµή του k να µην επηρεάζει καµία από τις πιθανά εκλουόµενες κορυφές. ιορθώνει τα σφάλµατα που προκύπτουν από µεταβολές της θερµοκρασίας, πίεσης καθώς και της µη επαρκούς ανάκτησης κατά την κατεργασία του δείγµaτος. Οι ιδιότητες του εσωτερικού προτύπου θα πρέπει να είναι: να µην περιέχεται στο υπό ανάλυση δείγµα η κορυφή του να είναι ευδιάκριτη (Rs>1.5) από άλλα συστατικά παρόµοια χηµική δοµή µε την προσδιοριζόµενη ουσία να µην αντιδρά µε τα συστατικά του δείγµατος υψηλή καθαρότητα 32

Η αξιολόγηση του µίγµατος που προκύπτει από τις µελέτες διάσπασης επιτυγχάνεται µε ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (PDA). Ο προσδιορισµός της καθαρότητας της κύριας κορυφής είναι πολύ σηµαντικός και σχετίζεται µε την πιθανή παρουσία ανοµοιογενούς κορυφής µετά από τη διαδικασία της διάσπασης. Είναι απαραίτητο να επιβεβαιωθεί ότι δεν υπάρχει καµία κορυφή αποικοδόµησης κρυµµένη ή ατελώς διαχωρισµένη από την κύρια κορυφή. Η χρησιµότητα ενός ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων έγκειται στο γεγονός ότι ο αναλυτής µπορεί να επιλέξει όλη την κλίµακα των µηκών κύµατος δηλαδή από τα 200 έως τα 350 nm µε εύρος σάρωσης περίπου 80 nm. Αντίθετα µε ότι συµβαίνει σε ένα κλασσικό ανιχνευτή UV, όπου ανιχνεύονται µόνο οι ενώσεις που απορροφούν στο µήκος κύµατος ανίχνευσης, µε τον ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων υπάρχει η δυνατότητα να ανιχνευτούν όλες οι ενώσεις που απορροφούν σε όλη την περιοχή σάρωσης που έχει επιλεγεί για τη χρωµατογραφική ανάλυση. Πίνακας 2.3 Προτεινόµενο σχεδιάγραµµα για την πραγµατοποίηση µελετών αποικοδόµησης Συνθήκες ιάσπασης Προϊόν ιάσπαση Η 2Ο 2 Όξινο T ( o C) Οξύ Βάση Θειώδες νάτριο Φωτοσταθερότητα Προϊόν ναι Εικονικό ναι φάρµακο (placebo) Πρώτες ύλες ναι Εσωτερικό όχι - - - - - - πρότυπο Έλεγχοι Προϊόν όχι - - - - - - πρώτες ύλες όχι - - - - - - Τυφλό διάλυµα όχι - - - - - - 2.5 Προετοιµασία δείγµατος Η προετοιµασία του δείγµατος είναι κρίσιµο στάδιο σε µία χρωµατογραφική ανάλυση καθώς ο τρόπος κατεργασίας µπορεί να επηρεάσει την ανάλυση. Το στάδιο επεξεργασίας του δείγµατος περιλαµβάνει συνήθως διήθηση του δείγµατος ή εκχύλιση και σε ορισµένες περιπτώσεις 33