ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΥΓΡΑ ΑΣΤΙΚΑ ΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΤΥΧΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΔΟΜΗΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΑΥΤΩΝ ΣΕ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΑΣΤΙΚΩΝ ΛΥΜΑΤΩΝ Χ. Κουκούμης, Μ. Κορνάρος Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, 2654 Πάτρα Εργαστήριο Βιοχημικής Μηχανικής και Τεχνολογίας Περιβάλλοντος E-mail: kornaros@chemeng.upatras.gr, Τηλ.: +3 261 997418, Φαξ: +3 261 9937 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μια πολύ-υπολειμματική μέθοδος ανάλυσης για τον προσδιορισμό και τη μελέτη της τύχης των φαρμακευτικών ουσιών κατά την είσοδο και την έξοδό τους από τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας αστικών λυμάτων (ΕΕΛ). Για το σκοπό αυτόν λήφθηκαν δείγματα σε διάστημα ενός περίπου χρόνου (Μάϊος 214-Μάρτιος 215) για τη διερεύνηση υπολειμμάτων 12 φαρμακευτικών ουσιών που ανήκουν σε διαφορετικές θεραπευτικές ομάδες. Αυτά είναι μη στεροειδή/αντιφλεγμονώδη (ακεταμινοφαίνη/ παρακεταμόλη, ιβουπροφαίνη), αντιβιοτικά (αζιθρομυκίνη, κλαριθρομυκίνη), στατίνες/υπολιπιδαιμικοί παράγοντες (ατορβαστατίνη), H 2-ανταγωνιστές της ισταμίνης/ αντιόξινα (ρανιτιδίνη, ομεπραζόλη), αντιυπερτασικά (ατενολόλη), διουρητικά (φουροσεμίδη, υδροχλωροθειαζίδη), αντιεπιληπτικά (καρβαμαζεπίνη) και ψυχοδιεγερτικά (καφεΐνη). Οι επιλεγμένες μονάδες δειγματοληψίας της τρέχουσας μελέτης είναι οι ΕΕΛ του Δήμου Πατρών (WWTP1) και του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου των Πατρών (Δυτική Ελλάδα) (WWTP2). Η πιο συνήθης τεχνική προεπεξεργασίας τέτοιων δειγμάτων είναι η Εκχύλιση Στερεής Φάσης (Solid Phase Extraction), η οποία και χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση και επεξεργασία των προσδιοριζόμενων ουσιών. Τα δείγματα αναλύθηκαν έπειτα μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συζευγμένης με ένα τετραπολικό φασματόμετρο μάζας χρόνου πτήσης (High Performance Liquid Chromatography coupled to a Quadrupole Timeof-Flight Mass Spectrometer, HPLC-QTOF/MS). Με βάση τις αναλύσεις όλων των ληφθέντων δειγμάτων, όλες οι επιλεγμένες ουσίες έχουν ανιχνευτεί σ αυτά. Συγκεκριμένα, οι μέσες ετήσιες συγκεντρώσεις των παραπάνω φαρμακευτικών ουσιών στην WWTP1 κυμαίνονται μεταξύ.31-23 μg/l στην εισροή και μεταξύ.3-.49 μg/l στην απορροή, ενώ στην WWTP2 οι συγκεντρώσεις αυτές κυμαίνονται μεταξύ.56-316 μg/l και.34-8.4 μg/l, αντίστοιχα. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η παρουσία υπολειμματικών φαρμακευτικών ουσιών στο υδάτινο περιβάλλον αποτελεί ένα σημαντικό περιβαλλοντικό ζήτημα με συνέπεια το ενδιαφέρον γι αυτές να έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια. Από τη στιγμή που οι φαρμακευτικές ουσίες έχουν σχεδιαστεί για να προκαλούν βιολογικές αντιδράσεις, μπορούν να αποτελέσουν κίνδυνο για τους οργανισμούς στο φυσικό τους περιβάλλον, καθώς και στην ανθρώπινη υγεία σε περιπτώσεις βιοσυσσώρευσης αυτών. Οι φαρμακευτικές ουσίες εισέρχονται στο υδάτινο περιβάλλον κυρίως μέσω των εγκαταστάσεων επεξεργασίας αστικών λυμάτων (ΕΕΛ) και έχουν ανιχνευθεί στις εκροές αυτών, σε επιφανειακά νερά, ακόμη και σε υπόγεια και πόσιμα νερά. Παρ όλο που οι ουσίες αυτές ανιχνεύονται γενικά σε χαμηλές συγκεντρώσεις στο νερό (ng/l-μg/l), η συνεχής παροχέτευσή τους σ αυτό μπορεί να έχει δυσμενείς επιδράσεις στην υδρόβια ζωή. Χρόνιες τοξικές επιπτώσεις μπορεί να προκληθούν στους υδρόβιους οργανισμούς, οι οποίες όμως είναι δύσκολο να εκτιμηθούν λόγω έλλειψης οικοτοξικολογικών δεδομένων. Παρά την πληθώρα μελετών που έχουν δημοσιευτεί σε πολλές ευρωπαϊκές χώρες για την παρουσία φαρμακευτικών ουσιών στα υγρά αστικά λύματα, ελάχιστες μόνο έρευνες έχουν πραγματοποιηθεί στον Ελληνικό χώρο. Την τελευταία δεκαετία οι τεχνικές των οργάνων χρόνου πτήσης έχουν κερδίσει γρήγορα έδαφος στον τομέα της περιβαλλοντικής ανάλυσης. Ένας από τους βασικότερους λόγους γι αυτό είναι το γεγονός ότι οι μετρήσεις της ακριβής μάζας είναι εξειδικευμένες και ταυτόχρονα καθολικές για κάθε είδους προσδιοριζόμενης ουσίας και δεν εξαρτώνται από τον τύπο, το μοντέλο ή τη συγκεκριμένη οργανολογία που χρησιμοποιείται. Ο βαθμός θραυσματοποίησης μπορεί να ποικίλει ανάλογα με το αναλυτικό όργανο που χρησιμοποιείται, αλλά η ειδική τιμή της ακριβής μάζας ή/και οι πληροφορίες της ακριβής μάζας των ισοτόπων θα είναι σύμφωνες για ένα δεδομένο αναλύτη, ανεξάρτητα από το είδος ιοντισμού, τη διάσπαση επαγόμενης από σύγκρουση (Collision-Induced Dissociation) και τη θραυσματοποίηση MS-MS που χρησιμοποιείται. Ο προσδιορισμός της ακριβής μάζας επιτρέπει την απόκτηση μοναδικών πληροφοριών για ένα δεδομένο μόριο, καθώς και επιπρόσθετες πληροφορίες για την ισοτοπική του σύσταση, το έλλειμμα μάζας και τα συγκεκριμένα ιόντα που προκύπτουν από τη θραυσματοποίηση [1-2].
Υπάρχουν εκτεταμένες αναφορές για τον προσδιορισμό φαρμακευτικών ουσιών σε υδατικά δείγματα, οι περισσότερες από τις οποίες ακολουθούν μεθόδους πολύ-υπολειμματικής ανάλυσης και περιλαμβάνουν ένα μεγάλο αριθμό ενώσεων [3-9]. Η υγρή χρωματογραφία/φασματομετρία μάζας με τη χρήση πηγής ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό (Electospray Ionization) χρησιμοποιείται συνήθως σε μεθόδους πολύ-υπολειμματικής ανάλυσης λόγω της υψηλής ευαισθησίας της μεθόδου και του γρήγορου και επαρκούς διαχωρισμού ενός ευρέος φάσματος ενώσεων που μπορεί να επιτευχθεί. Ο πρωταρχικός σκοπός της έρευνας αυτής ήταν η μελέτη της ύπαρξης και της τύχης φαρμακευτικών ουσιών που ανήκουν σε διάφορες θεραπευτικές ομάδες κατά την είσοδο και την έξοδό τους από τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας αστικών λυμάτων (ΕΕΛ) μέσω της ανάπτυξης και εφαρμογής μιας μεθόδου ικανής για προσυγκέντρωση, εκχύλιση και ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό ενός ευρέος φάσματος φαρμακευτικών ουσιών με τη βοήθεια ενός υψηλής ακρίβειας μάζας HPLC-QTOF/MS. Ειδικότερα, στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκε το σύστημα HPLC 126 Series της Agilent συζευγμένο με το πολύ υψηλής ακρίβειας μάζας όργανο QTOF/MS 6538 της ίδια εταιρείας. Ο προσδιορισμός αυτός περιλάμβανε πρώτον τη χρήση του οργάνου στη λειτουργία TOF για ποσοτική ανάλυση και δεύτερον στη λειτουργία QTOF, όπου μέσω της διάσπασης επαγόμενης από σύγκρουση που εφαρμόζεται σε προεπιλεγμένα μητρικά ιόντα, συλλέγονται τα φάσματα των θυγατρικών ιόντων για την αναγνώριση και ταυτοποίηση των ιόντων αυτών. Η μέθοδος αναπτύχθηκε για την ανίχνευση και προσδιορισμό της ταυτότητας 12 φαρμακευτικών ενώσεων που ανήκουν σε διαφορετικές θεραπευτικές ομάδες συμπεριλαμβανομένων μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών και αναλγητικών, αντιβιοτικών, στατινών/υπολιπιδαιμικών παραγόντων μείωσης της χοληστερόλης, H 2- ανταγωνιστών της ισταμίνης/ αντιόξινων, αντιυπερτασικών, διουρητικών, αντιεπιληπτικών και ψυχοδιεγερτικών φαρμάκων. Οι ουσίες αυτές επιλέχθηκαν με βάση την υψηλή ετήσια κατανάλωσή τους στην Ελλάδα και το ενδιαφέρον για τις πιθανές επιπτώσεις τους στους υδάτινους οργανισμούς και στον άνθρωπο. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Συλλογή δειγμάτων Η συλλογή των δειγμάτων διενεργήθηκε την περίοδο Μαΐου 214-Μαρτίου 215 από δύο σταθμούς επεξεργασίας αστικών λυμάτων στην περιοχή της Πάτρας, την ΕΕΛ του Δήμου Πατρών (WWTP1) και την ΕΕΛ του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου των Πατρών (Δυτική Ελλάδα) (WWTP2). Η ΕΕΛ του Δήμου Πατρών εφαρμόζει προκαταρκτική επεξεργασία για την αφαίρεση των χονδρόκοκκων σωματιδίων, πρωτοβάθμια επεξεργασία για τη μείωση των αιωρούμενων στερεών σωματιδίων (πρωτοβάθμια καθίζηση), βιολογική διεργασία με ενεργό ιλύ (αναερόβια/ανοξική και αερόβια βαθμίδα ακολουθούμενη από δευτεροβάθμια καθίζηση) και τελική απολύμανση (χλωρίωση) των επεξεργασμένων λυμάτων. Λόγω του σημαντικά μικρότερου μεγέθους, τα στάδια της πρωτοβάθμιας καθίζησης και της αναερόβιας/ανοξικής βιολογικής βαθμίδας απουσιάζουν στην ΕΕΛ του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Στιγμιαία δείγματα συλλέχτηκαν εντός εικοσιτετραώρου κάθε δύο μήνες την ανωτέρω περίοδο από διάφορα σημεία της WWTP1 όπως είναι η εισροή, η εκροή της δεξαμενής πρωτοβάθμιας καθίζησης, η εισροή και η εκροή της δεξαμενής δευτεροβάθμιας καθίζησης και η τελική εκροή (μετά τη χλωρίωση), ενώ από την WWTP2 τα δείγματα αφορούσαν μόνο την είσοδο και έξοδο των λυμάτων από τη μονάδα. Τα δείγματα διατηρήθηκαν στη συντήρηση από τη στιγμή της δειγματοληψίας μέχρι και την εκχύλισή τους. Σε κάθε περίπτωση, πραγματοποιήθηκε διήθηση μέσω φίλτρου ινών υάλου πορώδους.7 μm και εκχύλιση όλων των δειγμάτων εντός 48 ωρών από τη δειγματοληψία. 2. Υλικά και μέθοδοι Τα πρότυπα με τις δραστικές φαρμακευτικές ουσίες προέρχονταν από τη Sigma-Aldrich, είχαν αναλυτική καθαρότητα HPLC (> 98%) και ήταν τα εξής: υδροχλωροθειαζίδη (HDR), φουροσεμίδη (FUR), ιβουπροφαίνη (IBU), ακεταμινοφαίνη/παρακεταμόλη (ACT), ρανιτιδίνη (RAN), αζιθρομυκίνη (AZI), κλαριθρομυκίνη (CLA), ατορβαστατίνη (ATR), ατενολόλη (ATE), καφεΐνη (CAF), ομεπραζόλη (OME) και καρβαμαζεπίνη (CRB). Η βαμεθάνη επιλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Για την επεξεργασία και αποθήκευση των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκαν διαλύτες όπως το ακετονιτρίλιο, το νερό και η μεθανόλη (Sigma-Aldrich), όλοι καθαρότητας HPLC. Ως πρόσθετο της κινητής φάσης χρησιμοποιήθηκε μυρμηκικό οξύ καθαρότητας LC-MS (Fluka). Μεμονωμένα πυκνά αναλυτικά πρότυπα (συγκέντρωσης 1 μg/ml) παρασκευάστηκαν σε καθαρή μεθανόλη και αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη (-18 o C). Από αυτά παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύματα εργασίας με αραιώσεις σε MeOH:H 2O, 1:9 (v/v) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Τα φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Oasis TM HLB (2 mg, 6 ml) της Waters. Μια offline διάταξη Εκχύλισης Στερεάς Φάσης (SPE) χρησιμοποιήθηκε για την προσυγκέντρωση των δειγμάτων. Η διάταξη αυτή παρέχει ειδικές θέσεις για την τοποθέτηση των φυσιγγίων εκχύλισης και λειτουργεί υπό κενό βρύσης για τη διευκόλυνση της διέλευσης των δειγμάτων μέσα από αυτά. Η πορεία της μεθόδου που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: τα φυσίγγια εκχύλισης διαβρέχονται αρχικά με 5 ml MeOH και ακολούθως με 6 ml Η 2O καθαρότητας HPLC. Μετά το στάδιο της διαβροχής, εισάγονται στα φυσίγγια δείγματα όγκου 1 ml ή 2 ml από την εισροή και εκροή αντίστοιχα με ρυθμό ροής 1 ml/min. Κατόπιν, τα φυσίγγια επλένονται με 5 ml
Η 2O και αφήνονται για περίπου 5 λεπτά να στεγνώσουν υπό κενό πριν ακολουθήσει η έκλουση. Η έκλουση πραγματοποιείται με 2 x 4 ml ΜeOH με ροή 1 ml/min. Τα εκχυλίσματα τοποθετούνται στη συνέχεια σε υδατόλουτρο (35 o C) και εξατμίζονται σχεδόν μέχρι ξηρότητας με τη βοήθεια απαλού ρεύματος αζώτου. Έπειτα, πραγματοποιείται ανασύσταση των δειγμάτων σε 1 ml ACN:H 2O, 1:9 (v/v) και τέλος, ακολουθεί η διήθησή τους κατευθείαν σε φιαλίδιο ανάλυσης με τη χρήση φίλτρου σύριγγας.2 μm. Τυφλά δείγματα πόσιμου νερού που δεν περιέχουν φαρμακευτικές ουσίες (μετά από ανάλυση) συλλέχθηκαν από τη βρύση του Εργαστηρίου Βιοχημικής Μηχανικής και Τεχνολογίας Περιβάλλοντος ώστε να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων με υπόστρωμα (matrix-matched standards) για την επικύρωση της μεθόδου. Τα δείγματα αυτά εμβολιάστηκαν με το μίγμα των φαρμακευτικών ουσιών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και με το εσωτερικό πρότυπο, εκχυλίστηκαν και ακολούθως αναλύθηκαν με HPLC/QTOF-MS. Ο διαχωρισμός των προσδιοριζόμενων ουσιών πραγματοποιήθηκε με σύστημα HPLC (126 Series της Agilent) αποτελούμενο από σύστημα αντλίας 2 καναλιών, σύστημα απαέρωσης κινητών φάσεων, αυτόματο δειγματολήπτη 1 θέσεων και θάλαμο στήλης ελεγχόμενης θερμοκρασίας (Agilent Series 126) εξοπλισμένο με αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης C 18 5 mm x 2.1 mm και πορώδους 1.8 μm (Zorbax Extended-C 18). Ως κινητές φάσεις Α και Β επιλέχτηκαν το ακετονιτρίλιο και το νερό με.1 % μυρμηκικό οξύ, αντίστοιχα. Ο ρυθμός ροής της κινητής φάσης ρυθμίστηκε στα.3 ml/min. Για τη βελτιστοποίηση του χρωματογραφικού διαχωρισμού και των παραμέτρων MS/MS των προσδιοριζόμενων ουσιών, κρίθηκε απαραίτητη η κατηγοριοποίηση τους σε 3 ομάδες. Οι ενώσεις που περιλαμβάνει κάθε ομάδα και οι συνθήκες έκλουσής τους περιγράφονται αναλυτικά στον Πίνακα 1. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 3 o C και ο όγκος του ενέσιμου δείγματος ήταν 2 μl για όλες τις ομάδες. Μετά από κάθε ένεση πραγματοποιούταν αυτόματα έκπλυση της βελόνας σε ξεχωριστό φιαλίδιο ανάλυσης που περιείχε Ισοπροπανόλη:Νερό, 5:5 (v/v) για την αποφυγή επιμόλυνσης μεταξύ των δειγμάτων. Το HPLC ήταν συνδεδεμένο με τετραπολικό φασματόμετρο μάζας-χρόνου πτήσης ιόντων (μοντέλο 6538 της Agilent) που ήταν εξοπλισμένο με πηγή ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό Dual ESI και λειτούργησε είτε στη θετική είτε στην αρνητική λειτουργία ιοντισμού. Οι παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε λειτουργία ιοντισμού ήταν οι ακόλουθοι: πίεση εκνεφωτή 3 psig, θερμοκρασία αερίου ξήρανσης 3 o C, ροή αερίου ξήρανσης 1 L/min, δυναμικό πηγής θραυσματοποίησης 9-225 V, δυναμικό αποκορυφωτή 65 V, δυναμικό οκτάπολου 1 RF 75 V και δυναμικό τριχοειδούς 35 V. Η λειτουργία του οργάνου ήταν 2 GHz Extended Dynamic Range και τα φάσματα μαζών καταγράφηκαν στο εύρος 5-15 m/z. Ακριβείς μετρήσεις μάζας αποκτήθηκαν για κάθε κορυφή από τα εξαγόμενα χρωματογραφήματα ιόντων μέσω ενός διαλύματος βαθμονόμησης που ψεκαζόταν συνεχώς στο σύστημα. Η σταθερότητα της ακρίβειας μάζας ελέγχονταν καθημερινά και όταν οι τιμές είχαν σφάλμα μεγαλύτερο των 2 ppm πραγματοποιούνταν επαναβαθμονόμηση του οργάνου. Στην εργασία αυτή, το QTOF-MS χρησιμοποιήθηκε ως TOF-MS στη λειτουργία πλήρης σάρωσης MS (full scan mode), καθώς επίσης και ως MS/MS για την καταγραφή των θυγατρικών ιόντων για επιβεβαίωση των προσδιοριζόμενων ουσιών. Τα δεδομένα που κατεγράφησαν στη λειτουργία πλήρης σάρωσης και στο MS/MS επεξεργάστηκαν με το λογισμικό MassHunter Workstation της Agilent. Πίνακας 1. Χρωματογραφικές συνθήκες για το διαχωρισμό των τριών ομάδων ενώσεων. Συνθήκες LC Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Προσδιοριζόμενες ουσίες ACE, RAN, AZI, CLA, ATR ATE, CAF, OME, CRB HDR, FUR, IBU Αρχική κινητή φάση 5% ACN με.1% HCOOH 95% H2O με.1% HCOOH 5% ACN με.1% HCOOH 95% H2O με.1% HCOOH 1% ACN με.1% HCOOH 9% H2O με.1% HCOOH Πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης t=. 5% ACN t=1.3 5% ACN t=5. 1% ACN t=6.5 1% ACN t=. 5% ACN t=1.3 5% ACN t=5. 1% ACN t=5.9 1% ACN t=. 1% ACN t=1.3 2% ACN t=2. 1% ACN t=4.6 1% ACN Stop time (min) 6.5 5.9 4.6 Post time (min) 2.5 2.5 2.5 Λειτουργία ιοντισμού + + - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Για τη βελτιστοποίηση του χρωματογραφικού διαχωρισμού των ενώσεων μελετήθηκαν διαφορετικές κινητές φάσεις (μεθανόλη και ακετονιτρίλιο) με ή χωρίς την προσθήκη οξικού οξέος. Η ευαισθησία των ενώσεων που ανιχνεύτηκαν με τη θετική λειτουργία ιοντισμού ήταν αυξημένη με την προσθήκη οξικού οξέος στην κινητή φάση ACN:H 2O. Οι ενώσεις που ανιχνεύτηκαν στην αρνητική λειτουργία χωρίς την προσθήκη οξικού οξέος εμφάνισαν καλύτερη απόδοση στον ιοντισμό τους, αλλά η χρωματογραφική κορυφή δεν παρείχε το επιθυμητό σχήμα. Το πρόβλημα αυτό λύθηκε με την προσθήκη του οξικού οξέος. Με το οξικό οξύ βελτιώθηκε ο χρωματογραφικός
διαχωρισμός των περισσότερων ενώσεων μειώνοντας την εμφάνιση ουράς και παρέχοντας καλύτερη ανάλυση, ενώ ταυτόχρονα μειώθηκε ο χρόνος έκλουσης των ενώσεων στην αρνητική λειτουργία. Γι αυτό αποφασίστηκε η προσθήκη.1 % οξικού οξέος στους διαλύτες ακετονιτριλίου και νερού και στις δυο λειτουργίες ιοντισμού. Ακολούθως, διενεργήθηκαν πειράματα ανάλυσης με έγχυση σε ροή (Flow Injection Analysis) με την απευθείας εισαγωγή στο σύστημα 1 μl διαλύματος συγκέντρωσης 1 ppb σε κινητή φάση ACN:H 2O, 1:9 (v/v) της κάθε ένωσης χωριστά. Από τα πειράματα αυτά λήφθηκαν φάσματα στη λειτουργία πλήρης σάρωσης (MS) και στη λειτουργία στοχευμένου MS/MS και προσδιορίστηκε το βέλτιστο δυναμικό της πηγής θραυσματοποίησης και της ενέργειας διάσπασης για κάθε ένωση ώστε να αποκτηθεί η μέγιστη ευαισθησία του μητρικού ιόντος και η μεγαλύτερη αφθονία των θυγατρικών ιόντων, αντίστοιχα. Από τις 12 ενώσεις 9 ανιχνεύτηκαν στη θετική λειτουργία ιοντισμού και 3 στην αρνητική λειτουργία ιοντισμού. Όλες οι ενώσεις εμφάνισαν σε μεγαλύτερη αφθονία τα ιόντα [Μ+Η] + ή [Μ+Η] - τα οποία και επιλέχτηκαν ως μητρικά. Αντίστοιχα πειράματα πραγματοποιήθηκαν για το εσωτερικό πρότυπο. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται συνοπτικά στον Πίνακα 2. Πίνακας 2. Βελτιστοποιημένες συνθήκες ανίχνευσης των δώδεκα φαρμακευτικών ουσιών με τις ακριβείς μάζες των μητρικών τους ιόντων. Χημική Ένωση RT (λεπτά) Mητρικό Ιόν Δυναμικό Θραυσματοποίησης (V) Ατενολόλη 1.266 267.173 18 2 Παρακεταμόλη 1.273 152.76 13 2 Ρανιτιδίνη 1.414 315.1485 13 15 Βαμεθάνη 2.86 21.1489 1 1 Καφεΐνη 4.325 195.877 16 25 Αζιθρομυκίνη 5.44 749.5158 15 35 Ομεπραζόλη 5.117 346.122 14 1 Κλαριθρομυκίνη 5.583 748.4842 2 2 Καρβαμαζεπίνη 5.651 237.122 17 25 Ατορβαστατίνη 6.342 559.263 22 25 Υδροχλωροθειαζίδη 1.361 295.9572 225 25 Φουροσεμίδη 3.975 329.4 17 2 Ιβουπροφαίνη 4.449 25.1234 9 1 Δυναμικό Διάσπασης (V) Για την αποτελεσματική εκχύλιση όλων των φαρμακευτικών ουσιών οι οποίες έχουν διαφορετικές φυσικές ιδιότητες (όξινες, ουδέτερες, βασικές ενώσεις) επιλέχθηκαν σύμφωνα και με τη βιβλιογραφία [5, 1, 11] τα πολυμερικά φυσίγγια εκχύλισης της Oasis HLB (2 mg, 6 ml). Η μεθανόλη επιλέχθηκε ως καταλληλότερος διαλύτης λόγω της αποτελεσματικότητάς του στην έκλουση των πολικών φαρμακευτικών ουσιών [12]. Η ρύθμιση του ph των δειγμάτων δεν κρίθηκε απαραίτητη, καθώς στόχος ήταν η έκλουση όλων των ενώσεων σε ένα βήμα. Επιπλέον, η ρύθμιση του ph δεν αυξάνει την ανακτησιμότητα των περισσότερων αναλυτών και προκαλεί την υδρόλυση πολλών απ αυτών [13, 14]. Γενικά, στις περισσότερες φαρμακευτικές ενώσεις που μελετήθηκαν οι τιμές ανακτησιμότητας στα φυσίγγια εκχύλισης HLB ήταν εντός των αποδεκτών ορίων (67-14 %). Μόνο τρεις από αυτές εμφάνισαν χαμηλή ανακτησιμότητα, η ατορβαστατίνη, η αζιθρομυκίνη και η κλαριθρομυκίνη. Η δυσκολία εκχύλισης της ατορβαστατίνης αποδίδεται στην αστάθεια που εμφανίζει λόγω της πιθανής αλληλομετατροπής της όξινης μορφής σε λακτόνη και αντίστροφα, ενώ η αστάθεια των αντιβιοτικών οφείλεται κυρίως στην υδρόλυσή τους [15, 16]. Εμβολιασμένα δείγματα πόσιμου νερού με μίγμα φαρμακευτικών ουσιών εκχυλίστηκαν με την ίδια ακριβώς διαδικασία με αυτή που χρησιμοποιήθηκε στα πραγματικά δείγματα και χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των καμπυλών βαθμονόμησης, έτσι ώστε τόσο η παρεμπόδιση του υποστρώματος όσο και η ανακτησιμότητα των προσδιοριζόμενων ουσιών να συνυπολογιστούν κατά την ποσοτικοποίηση των πραγματικών δειγμάτων. Η ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου εκχύλισης προσδιορίστηκε με πειράματα ανακτησιμότητας των αναλυτών σε υπόστρωμα ποσίμου νερού βρύσης σε συγκέντρωση.5 και 5 μg/l. Η ακρίβεια υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος πέντε επαναλαμβανόμενων μετρήσεων για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης και κυμάνθηκε μεταξύ 42-16 % (ποσοστό μεταξύ της πειραματικής και θεωρητικής συγκέντρωσης για κάθε αναλύτη). Η επαναληψιμότητα της μεθόδου εκφράστηκε ως η ποσοστιαία σχετική τυπική απόκλιση (RSD) πέντε επαναλαμβανόμενων μετρήσεων και κυμάνθηκε μεταξύ.4-7.7 %. Η αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου εκφράστηκε ως η ποσοστιαία σχετική τυπική απόκλιση (RSD) εμβολιασμένων και εκχυλισμένων δειγμάτων νερού σε πέντε διαδοχικές ημέρες και κυμάνθηκε μεταξύ 1.4-17.9 %. Τέλος, μελετήθηκαν οι επιδράσεις του υποστρώματος νερού βρύσης των πρότυπων διαλυμάτων με αντίστοιχα διαλύματα που περιείχαν ως υπόστρωμα καθαρό νερό. Η γραμμικότητα μελετήθηκε σε πρότυπα διαλύματα με υπόστρωμα πόσιμου νερού βρύσης σε δέκα επίπεδα συγκέντρωσης (.1,.5,.1,.5, 1, 5, 1, 5, 1, 5 μg/l ή ppb). Η ποσοτικοποίηση έγινε με τη μέτρηση
του εμβαδού κορυφής του κάθε αναλύτη και του αντίστοιχου του εσωτερικού προτύπου σε εξαγόμενο χρωματογράφημα ιόντος με παράθυρο εύρους μάζας.2 Da. Η συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου ήταν 1 ppb. H γραμμικότητα του αναλυτικού σήματος ήταν πολύ καλή και σε όλες τις περιπτώσεις οι σταθερές συσχέτισης (R 2 ) ήταν μεγαλύτερες από.99 και οι τιμές των υπολοίπων μικρότερες του 3 %. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου (LOD) εκτιμήθηκαν έπειτα από τριπλή ένεση εμβολιασμένων πρότυπων εκχυλισμάτων νερού (μετά από διήθηση και SPE) σε χαμηλές συγκεντρώσεις ώστε ο λόγος του σήματος προς το θόρυβο να είναι ίσος με 3, ενώ για τα όρια ποσοτικοποίησης της μεθόδου (LOQ) πραγματοποιήθηκε το ανάλογο αλλά με λόγο αυτό να είναι ίσο με 1. Το εύρος των ορίων ανίχνευσης κυμάνθηκε για όλες τις ενώσεις από λιγότερο από 5-1 ng/l, ενώ αντίστοιχα τα όρια ποσοτικοποίησης κυμάνθηκαν από 5-5 ng/l, όπως απεικονίζονται και στο Σχήμα 1. Σχήμα 1. Γραφική απεικόνιση του ποσοστού των φαρμακευτικών ενώσεων που μελετήθηκαν έναντι των ορίων ανίχνευσης (LODs) και ποσοτικοποίησης (LOQs) σε ng/l. Σύμφωνα με την οδηγία 22/657/EC της Ευρωπαϊκής Ένωσης απαιτείται ένα σύνολο τεσσάρων μονάδων ταυτοποίησης για κάθε αναλύτη που περιλαμβάνει την παρουσία του μητρικού ιόντος και δύο θυγατρικών αυτού. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε στο πιο έντονο ιόν (συνήθως το μητρικό μόριο, εκτός από εκείνες τις φαρμακευτικές ενώσεις που είχαν σε μεγαλύτερη αφθονία κάποιο θυγατρικό ιόν) με τη χρήση καμπυλών βαθμονόμησης υποστρώματος ποσίμου νερού για την αποφυγή ελαφρών διακυμάνσεων στο σήμα που δίνουν κάποιοι αναλύτες, καθώς και για την αποφυγή πιθανής ενίσχυσης ή καταπίεσης του σήματος που παρατηρείται ειδικά στα δείγματα λυμάτων σε σύγκριση με αυτά που περιέχουν καθαρό διαλύτη. Για την ποιοτική ανάλυση μετρήθηκαν οι αναλογίες των κορυφών μεταξύ του μητρικού και των θυγατρικών ιόντων με τη βοήθεια του λογισμικού MassHunter Quantitative Analysis. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στην εργασία αυτή εφαρμόστηκε για την ανάλυση των πραγματικών περιβαλλοντικών δειγμάτων και τον προσδιορισμό στοχευμένων φαρμακευτικών ουσιών σε υγρά αστικά απόβλητα του νομού Αχαΐας. Έτσι, συλλέχτηκαν συνολικά 52 δείγματα από την ΕΕΛ του Δήμου Πατρών (WWTP1) και 8 δείγματα από την ΕΕΛ του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου των Πατρών (Δυτική Ελλάδα) (WWTP2), η οποία επεξεργάζεται τόσο τα υγρά απόβλητα του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών όσο και αυτά του Πανεπιστημίου Πατρών. Η μέση ετήσια διακύμανση της συγκέντρωσης των φαρμακευτικών ουσιών στους δυο βιολογικούς καθαρισμούς στην εισροή και στην απορροή παρουσιάζονται στα Σχήματα 2-5. Στα Σχήματα 2 και 3 της εισροής είναι ολοφάνερη η κατά πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών που εισέρχονται στην WWTP2 λόγω του Νοσοκομείου της περιοχής, ενώ δυο φαρμακευτικές ουσίες, η ακεταμινοφαίνη (παρακεταμόλη) και η καφεΐνη παρουσιάζουν σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις και στις δύο εγκαταστάσεις σε σχέση με τις υπόλοιπες φαρμακευτικές ουσίες. Συγκεκριμένα, οι συγκεντρώσεις τους στο WWTP1 ανέρχονται στα 14.8 και 229.9 μg/l και στο WWTP2 στα 246. και 315.9 μg/l, αντίστοιχα. Αυτό οφείλεται κυρίως στην ευρεία κατανάλωση παυσίπονων που περιέχουν ως δραστική ουσία την παρακεταμόλη, ενώ αντίστοιχα η καφεΐνη περιέχεται στους καφέδες, στα αναψυκτικά και στα ενεργειακά ποτά, καθώς και ως έκδοχο σε πολλά φάρμακα. Η συγκέντρωση των υπόλοιπων ενώσεων δεν ξεπερνά τα 12 μg/l με εξέχουσες τα διουρητικά υδροχλωροθειαζίδη αν και αρκετά μειωμένη στον WWTP1 και φουροσεμίδη, το αναλγητικό ιβουπροφαίνη, η ρανιτιδίνη και το αντιβιοτικό κλαριθρομυκίνη. Στον αντίποδα, οι φαρμακευτικές ουσίες με συγκέντρωση μερικών ppb ήταν η ατορβαστατίνη, η ατενολόλη, η ομεπραζόλη και η καρβαμαζεπίνη. Αντίστοιχα, στα Σχήματα 4 και 5 της απορροής των δύο ΕΕΛ παρατηρούνται αυξημένες οι συγκεντρώσεις της καφεΐνης, των δύο διουρητικών και της ιβουπροφαίνης. Αξίζει να σημειωθεί ότι η φουροσεμίδη και η ρανιτιδίνη δεν ανιχνεύτηκαν στην έξοδο του WWTP1. Συνολικά, οι μέσες ετήσιες συγκεντρώσεις των παραπάνω
φαρμακευτικών ουσιών στον WWTP1 κυμαίνονται μεταξύ.31-23 μg/l στην εισροή και μεταξύ.3-.49 μg/l στην απορροή, ενώ στον WWTP2 οι συγκεντρώσεις αυτές κυμαίνονται μεταξύ.56-316 μg/l και.34-8.4 μg/l, αντίστοιχα. Τέλος, στα Σχήματα 6 και 7 παρουσιάζονται τα ποσοστά αποδόμησης αυτών των φαρμακευτικών ουσιών. Ο WWTP1 εμφανίζει σαφώς υψηλότερα ποσοστά αποδόμησης των φαρμακευτικών ουσιών της τάξης του 88-1 % σε αντίθεση με τον WWTP2 που εμφανίζει ποσοστά αποδόμησης 33-99 %. 4 3 2 1 25 2 15 1 5 HDR FUR IBU RAN AZI CLA ATR ATE OME CRB ACE CAF Σχήμα 2. Μέση ετήσια συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην εισροή του WWTP1. 14 12 1 8 6 4 2 35 3 25 2 15 1 5 HDR FUR IBU RAN AZI CLA ATR ATE OME CRB ACE CAF Σχήμα 3. Μέση ετήσια συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην εισροή του WWTP2. 6 5 4 3 2 1 HDR FUR IBU RAN AZI CLA ATR ATE OME CRB ACE CAF Σχήμα 4. Μέση ετήσια συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην απορροή του WWTP1.
1 8 6 4 2 HDR FUR IBU RAN AZI CLA ATR ATE OME CRB ACE CAF Σχήμα 5. Μέση ετήσια συγκέντρωση των φαρμακευτικών ουσιών (ng/l) στην απορροή του WWTP2. 1. 95. 9. 85. 8. HDR FUR IBU ACE RAN AZI CLA ATR ATE CAF OME CRB Σχήμα 6. Μέση ποσοστιαία αποδόμηση των φαρμακευτικών ουσιών στο WWTP1. 1. 8. 6. 4. 2.. HDR FUR IBU ACE RAN AZI CLA ATR ATE CAF OME CRB Σχήμα 7. Μέση ποσοστιαία αποδόμηση των φαρμακευτικών ουσιών στο WWTP2. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας αναπτύχθηκε μια μέθοδος πολύ-υπολειμματικής ανάλυσης βασιζόμενη στην εκχύλιση στερεάς φάσης που επέτρεψε την ταυτόχρονη εκχύλιση δώδεκα φαρμακευτικών ουσιών σε ένα βήμα, μειώνοντας έτσι δραστικά το χρόνο προετοιμασίας των δειγμάτων. Παράλληλα, ο προσδιορισμός των ουσιών αυτών με το τελευταίας τεχνολογίας αναλυτικό όργανο HPLC-QTOF/MS επέτρεψε την ανάπτυξη μιας αξιόπιστης και υψηλής ευαισθησίας τεχνικής ανάλυσης για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των δειγμάτων, σύμφωνα πάντα με την οδηγία 22/657/EC της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Τα χαμηλά όρια ανίχνευσης της μεθόδου επέτρεψαν την ανίχνευση των φαρμακευτικών ουσιών σε συγκεντρώσεις της τάξης μερικών ng/l, καταδεικνύοντας έτσι την εκλεκτικότητα της μεθόδου και την υψηλή ευαισθησία του οργάνου. Οι περισσότερες ουσίες είχαν αποδεκτές τιμές ανακτησιμότητας, αν και για μερικές απ αυτές απαιτείται η περαιτέρω βελτίωση των συνθηκών εκχύλισης ώστε να κυμαίνονται εντός των αποδεκτών ορίων.
Η μελέτη αυτή για την εύρεση της τύχης και της αποδομησιμότητας των φαρμακευτικών ουσιών στους δυο σταθμούς επεξεργασίας λυμάτων της περιοχής της Πάτρας είναι η πρώτη που πραγματοποιείται για το σκοπό αυτό. Οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων που αναλύθηκαν, κυμάνθηκαν συνολικά και στις δύο ΕΕΛ στα.31-316 μg/l στην εισροή και στα.3-8.4 μg/l στην απορροή. Οι ενώσεις που παρουσίασαν τις υψηλότερες συγκεντρώσεις ήταν η καφεΐνη και η παρακεταμόλη και ακολούθως, η κλαριθρομυκίνη, η φουροσεμίδη και η υδροχλωροθειαζίδη. Οι περισσότερες από τις προσδιοριζόμενες ουσίες εμφάνισαν υψηλότερη συγκέντρωση κατά τους φθινοπωρινούς και χειμερινούς μήνες λόγω της έξαρσης των ασθενειών την περίοδο αυτή, ενώ στην ημερήσια διακύμανσή τους εμφάνισαν μέγιστες συγκεντρώσεις κατά τις μεσημεριανές ώρες. Τα ποσοστά αφαίρεσης των φαρμακευτικών ουσιών από τις δυο εγκαταστάσεις, αν και υψηλά, δεν ήταν επαρκή για την πλήρη αποδόμηση των ουσιών αυτών με συνέπεια την συνεχόμενη παροχέτευσή τους στο υδάτινο περιβάλλον. Έτσι, ενώσεις όπως η φουροσεμίδη, η υδροχλωροθειαζίδη, η παρακεταμόλη και η καφεΐνη είχαν υψηλά ποσοστά αποδόμησης, ενώ η ιβουπροφαίνη, η καρβαμαζεπίνη και η ατενολόλη μέτρια. Αυτό καταδεικνύει ότι οι συμβατικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται στις εγκαταστάσεις επεξεργασίας υγρών λυμάτων δεν επαρκούν για την πλήρη αποδόμηση των περισσότερων φαρμακευτικών ουσιών. Επομένως, η διενέργεια οικοτοξικολογικών μελετών κρίνεται απαραίτητη για τη συσχέτιση των ενδεχόμενων χρόνιων επιπτώσεων των φαρμακευτικών ουσιών, αλλά και των προϊόντων μετασχηματισμού τους στα υδάτινα όντα και στον πιθανό αντίκτυπό τους στον ανθρώπινο οργανισμό λόγω της συσσώρευσης αυτών στην τροφή και στα αποθέματα γλυκού νερού. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. H.V. Botitsi, S.D. Garbis, A. Economou, D.F. Tsipi, Mass Spectrom. Rev. 97:3 (211). [2]. I. Ferrer, E.M. Thurman (Eds.), Liquid Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry: Principles, Tools and Applications for Accurate Mass Analysis, John Wiley and Sons, Inc, New York, 29. [3]. E. Gracia-Lor, J.V. Sancho, F. Hernandez, J. Chromatogr. A 2264:1218 (211). [4]. M. Huerta-Fontela, M.T. Galceran, F. Ventura, J. Chromatogr. A 4212:1217 (21). [5]. I. Ferrer, E.M. Thurman, J. Chromatogr. A 148:1259 (212). [6]. A. Jelic, M. Petrovic, D. Barcelo, Talanta 363:8 (21). [7]. B. Shao, D. Chen, J. Zhang, Y. Wu, C. Sun, J. Chromatogr. A 8312:1216 (29). [8]. M. Ibanez, J.V. Sancho, D. McMillan, R. Rao, F. Hernandez, Trends Anal. Chem. 481:27 (28). [9]. M.J.M. Bueno, A. Aguera, M.J. Gomez, M.D. Hernando, J.F. Garcia-Reyes, A.R. Fernandez-Alba, Anal. Chem. 9372:79 (27). [1]. M.M. Gomez-Ramos, A. Perez-Parada, J.F. Garcia-Reyes, A.R. Fernandez-Alba, A. Aguera J. Chromatogr. A 82:1218 (211). [11]. E. Garcia-Lor, J.V. Sancho, F. Hernandez, J. Chromatogr. A 626:1217 (21). [12]. Z.L. Zhang, J.L. Zhou, J. Chromatogr. A 25:1154 (27). [13]. M. Gros, M. Petrovic, D. Barcelo, Talanta 684:7 (26). [14]. I. Ferrer, E.M. Thurman, J. Chromatogr. A 5684:1217 (21). [15]. L. Novakova, D. Satinsky, P. Solich, Trends Anal. Chem. 352:27 (28). [16]. X.-S. Miao, C.D. Metcalfe, J. Chromatogr. A 133:998 (23).