УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Дeпартман за сточарство Шаран Момчило Генетски полиморфизам κ-казеина млечних раса говеда Мастер рад Нови Сад, 2015.
УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ПОЉОПРИВРЕДНИ ФАКУЛТЕТ Дeпартман за сточарство Кандидат: Момчило Шаран Ментор: Проф. др Снежана Тривуновић Генетски полиморфизам κ-казеина млечних раса говеда Мастер рад Нови Сад, 2015.
КОМИСИЈА ЗА ОЦЕНУ И ОДБРАНУ МАСТЕР РАДА: 1. Др Снежана Тривуновић, ван. проф., ужа н. о. Оплемењивање животиња, 30.11.2012., Пољопривредни факултет, Нови Сад. ментор. 2. Др Михајла Ђан, ван. проф., ужа н. о. Генетика, 17.07.2013., Природно-математички факултет, Нови Сад 3. Др Саша Драгин, ван. проф., ужа н. о. Репродукција животиња, 26.03.2015., Пољопривредни факултет, Нови Сад
Садржај: РЕЗИМЕ... 1 SUMMARY... 1 1.УВОД... 2 1.1. Протеини млека... 3 1.1.1. Казеин... 4 1.1.2. Суруткини протеини... 5 1.2. Принцип коагулације млека и улога капа казеина... 6 1.3. Генетски полиморфизам капа казеина и његова повезаност са производним особинама млека... 7 2. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА... 10 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОД РАДА... 11 3.1. МАТЕРИЈАЛ... 11 3.2. МЕТОДЕ... 11 3.2.1. Изолација ДНК... 11 3.2.2. PCR реакција... 13 3.2.2.1. Параметри PCR реакције коришћене у овом раду... 15 3.2.3. Генотипизација путем RFLP (Restriction Frgment Lenght Polymorphism) методе 15 3.2.3.1. Параметри RFLP методе коришћене у овом раду... 16 3.2.4. Агарозна електрофореза и визуелизација резултата... 17 3.2.4.1. Поступак при електрофорези ДНК на агарозном гелу и визуелизација резултата у овом раду... 18 3.2.5. Статистичка обрада података... 19 4. РЕЗУЛТАТИ ИСТРАЖИВАЊА И ДИСКУСИЈА... 20 4.1. Холштајн фризијска раса... 23 4.2. Браон свис раса... 24
4.3. Сименталска раса... 26 4.4. Биво... 27 5. ЗАКЉУЧАК... 30 6. ЛИТЕРАТУРА... 31
Момчило Шаран Мастер рад Резиме РЕЗИМЕ Капа казеин је протеин који има одлучујућу улогу у стабилизацији казеинских мицела и коагулацији млека. Капа казеин испољава генетску, а самим тим и фенотипску варијабилност, која има знатан утицај на технолошки квалитет млека, пре свега на особине млека везане за производњу сира ка што су: рандман сира, брзина коагулације млека, чврстина груша и др. Из овог разлога ово истраживање је имало за циљ испитивање тренутне заступљености појединих алела и генотипова капа казеина млечних раса говеда и бивола, на нашем подручју. PCR-RFLP методом генотипизирано је 10 грла холштајн фризијске расе, 10 говеда браон свис, 8 сименталске расе и 4 бивола. Први корак корак у раду, била је изолација ДНК путем фенол-хлороформизоамилалкохол екстракције (PCI). Амплификација ДНК је извршена in vitro ланчаном реакцијом полимеразе. Агарозном гел-електрофорезом установљено је да су сви узорци успешно амплификовани. Дигестијом умножене ДНК, рестрикционим ензимима HinfI, HaeIII и HpyCH4IV добијени су фрагменти различите дужине. На основу распореда и величине добијених фрагмената установљено је присуство два алела (А и Б), унутар свих испитиваних популација. Код холштајн фризијске расе најфреквентнији је био алел А (0,95), код браон свис алел Б (0,75), код сименталске то је био Б алел (0,69) и код бивола такође алел Б са фреквенцијом од 0,75. Уочена хетерозиготност (Ho) била је највећа код сименталске расе (0,625), а најмања код холштајн фризијске расе (0,1). Све испитиване популације биле су у Hardy-Weinberg-овој равнотежи. Резултати добијени у овом раду су дали увид у тренутну заступљеност појединих алeла унутар раса, што ће послужити за креирање смерница при селекцији путем фаворизовања пожељних алела гена који кодира синтезу капа казеина. Кључне речи: капа казеин, полиморфизам, PCR-RFLP метода, фреквенција алела 1
Момчило Шаран Мастер рад Summary SUMMARY Kappa-casein is a protein which has a decisive role in the stabilization of the casein micelles and the coagulation of the milk. Kappa-casein express genetic and hence phenotypic variability, which has a considerable influence on the technological quality of milk, primarily on the cheese-making properties of milk, such as: cheese yield, coagulation rate, curd firmness and others. Therefore, the purpose of this study is to examine the current presence of certain kappa-casein alleles and genotypes of dairy cattle and buffaloes, in the province of Vojvodina, Serbia. 10 Holstein Friesian, 10 Brown Swiss, 8 Simmental cattle and 4 Buffaloes were genotyped by PCR-RFLP technique. The first step was the isolation of the DNA by phenolchloroform-isoamylalcohol extraction (PCI). Amplification of DNA was carried out in vitro by polymerase chain reaction. Agarose gel electrophoresis showed that all samples were successfully amplified. Restriction enzymes HinfI, HaeIII and HpyCH4IV are used to digest the amplified DNA, resulting in fragments of different lengths. Distribution and size of the DNA fragments showed the presence of two alleles (A and B), within all the studied populations. In Holstein Friesian, the A allele was the most frequent (0.95), while in Brown Swiss the allele B was the most frequent (0.75), as well as in Buffalo and Simmental with a frequency of 0.75 and 0.69, respectively. The observed heterozygosity (Ho) was the highest in Simmental (0.625), and the lowest in Holstein-Friesian (0.1). All studied populations were in Hardy-Weinberg equilibrium. Results obtained in this study have provide insight into the current proportion of certain alleles within the races, which will be used to create guidelines for the selection by forcing favorable alleles of the gene encoding kappa casein synthesis. Keywords: Kappa-casein, polymorphism, PCR-RFLP method, allele frequency 1
Момчило Шаран Мастер рад Увод 1.УВОД Oсобине многих млечних производа у великој мери зависе од својстава млечних протеина, што се посебно односи на производњу сира. Протеине млека можемо поделити на две фракције: казеин, који сачињава око 80% свих протеина и суруткине или серум протеине који обухватају 20% млечних протеина. Главне класе казеина су: α s1 -казеин, α s2 -казеин, β-казеин i κ-казеин, који заједно формирају казеинске мицеле. Иако процентуално мање заступљен од других казеина, капа казеин има одлучујућу улогу у стабилизацији казеинских мицела и процесима који се одвијају при коагулацији млека и прављењу сира. Попут многих других протеина, и капа казеин испољава фенотипски, а самим тим и генотипски полиморфизам. Према широко прихваћеној дефиницији коју су дали (Cavalli-Sforza и Bodmer, 1971), полиморфизам представља постојање два или више алела на једном локусу у истој популацији. Одређени локус се сматра полиморфним ако фреквенција најучесталијег алела није већа од 0,95 или 0,99. С обзиром да су протеини продукти ДНК, полиморфизам капа казеина је могуће истражити на нивоу ДНК, применом метода технологије рекомбинантне ДНК. За ову сврху, између осталих метода, најчешће се употребљавају рестрикциони ензими (ендонуклеазе). Уочено је да краве појединих генотипова капа казeина, испољавају супериорније особине у погледу већег садржаја протеина у млеку, већег приноса сира и бољим коагулационим својствима млека у односу на друге генотипове. Стога је веома битно утврдити генотип крава у нашој популацији говеда, како би се утврдила тренутна фреквенција генотипова, што би отворило простор и дало смернице за рад на ширењу пожељних алела за капа казеин, планским избором родитеља пожељног генотипа. 2
Момчило Шаран Мастер рад Увод 1.1. Протеини млека Око 3,0-3,5% нормалног крављег млека се састоји од протеина; њихова концентрација и састав могу да варирају током лактације. Функција протеина млека је да обезбеде организам младунаца са есенцијалним амино киселинама које су неопходне за развој мишићног и других протеинских ткива младих сисара, као и биолошки активним протеинима: имуноглобулинима, ензимима, витаминима и метал-везаним протеинима и различитим протеинским хормонима. Протеине млека можемо поделити у две фракције: казеин, који сачињава 80% свих протеина и суруткине или серум протеине који обухватају 20% мелечних протеина (Fox и McSweeney, 1998). У табели 1. приказан је просечан састав протеина млека. Табела 1. Просечан састав протеина млека (Walstra и сар., 1984) Концентрација у млеку % од укупног протеина (g/kg) Казеин α s1 -казеин 10,0 30,6 α s2 - казеин 2,6 8,0 β-казеин* 10,1 30,8 κ-казеин 3,3 10,1 Укупни казеин 26,0 79,5 Суруткини протеини α-лакталбумин 1,2 3,7 β-лактоглобулин 3,2 9,8 Крвни серум албумин 0,4 1,2 Имуноглобулини 0,7 2,1 Остали минорни протеини 0,8 2,4 Укупни суруткини протеини 6,3 19,3 Протеини мембране масне глобуле 0,4 1,2 Укупни протеин 32,7 100 *укључујући γ-казеин 3
Момчило Шаран Мастер рад Увод 1.1.1. Казеин Казеин је име за доминантну групу протеина млека. Казеини међусобно формирају полимере који садрже више идентичних или различитих типова молекула (Gösta, 1995). Главне класе казеина су: αs1-казеин, αs2-казеин, β-казеин и κ-казеин (Walstra и сар., 1984). γ-казеин се јавља у траговима, а настаје природном протеолизим β-казеина до стране плазмина (Swaisgood, 1992). Казеини су груписани и организовани у виду казеинске мицеле. Њена биолошка улога је обезбеђивање велике количине високо нерастворљивог колоидног калцијум фосфата за младунче у течном стању и да ради ефикасније исхране формира груш у желудцу. Поред казеина, калцијума и фосфора, мицеле садрже и цитрате, неке јоне, ензиме и заробљене суруткине протеине. Мицеле сачињавају 6-12% укупног волумена млека или око 4 ml/g. Њихов дијаметар варира од 50-250 nm (Goff, 2015.). Средишњи део мицеле се састоји од приближно једнаке количине αs и β-казеина и веома мало κ-казеина, док се спољашњи део састоји од отприлике једнаког броја αs и κ-казеина, а веома мало β-казеина. Мицеле су изграђене из субмицела, чија се величина креће од 12 до 15 nm. Субмицеле садрже у просеку 20 до 25 казеинских молекула. Неке субмицеле могу садржати 1 или 2 полимера κ-казеина који се простиру изван мицеле. Остале субмицеле ће садржати врло мало или неће садржати κ-казеин. Велики део κ-казеина се налази у облику полимера од 2 до 9 молекула, међусобно повезаним -С-С- везама (Walstra и сар., 2005). Слика 1. Претпостављени изглед и структура казеинске мицеле. (А) Приказане су субмицеле повезане калцијум фосфатом. (Б) Кратки негативно наелектрисани региони ( истурени ланци ) се налазе дуж целе површине мицеле (Walstra и сар., 2005). (Ц) Структура казеинске мицеле снимљена помоћу електронског микроскопа високе резолуције (Dalgleish и сар., 2004). 4
Момчило Шаран Мастер рад Увод На површини мицеле налази се кончасти слој, кога чини κ-казеин (састављен од отприлике 75 аминокиселинских резидуа), на чијим крајевима се налази карбоксилна група. Н-крајем κ-казеин је везан за остале казеине. Ове нити су прилично хидрофилне и негативно наелектрисане, због присуства карбоксилне групе κ-казеина. Овај кончасти слој, тачније капа казеин је суштински важан за одржавање колоидне стабилности мицеле. У мицелама се налазе тзв. нанокластери калцијум фосфата пречника око 3 nm. Они садрже неоргански фосфор, али и органски фосфор везан за серин и глутаминску киселину. Силе које држе структурне елементе мицеле на окупу јесу: физиолошко својство млека, хидрофобне везе међу протеинима и везе између пептидних ланаца од стране нанокластера калцијум фосфата. Студије су показале да су протеински молекули у казеинској мицели скоро у потпуности непокретни, осим кончастих крајева (Walstra и сар., 2005). 1.1.2. Суруткини протеини То је друга по величини фракција протеина, после казеина. По структури се убрајају у глобуларне протеине, више растворљиве у води и мање терморезистентни од казеина. Главни представници су: α-лакталбумин, β-лактоглобулин, говеђи серум албумин (ГСА) и имуноглобулини (Ig). β-лактоглобулини се састоје од 162 аминокиселина. Јавља се у 8 генетских варијанати (постоји генетски полиморфизам) и чини половину укупних суруткиних протеина. Садржи две дисулфидне везе и једну слободну тиолну групу. Поседује секундарну структуру и егзистира као нековалнтно везани димер. α-лакталбумин се састоји од 123 аминокиселине. Има јасно изражену секундарну и компактну, сферну терцијалну структуру (Goff, 2015). Суруткини протеини, а посебно α-лакталбумин, имају врло високу нутритивну вредност. Њихов аминокиселински састав је веома близу оном који се сматра биолошким оптимумом (Gösta, 1995). 5
Момчило Шаран Мастер рад Увод 1.2. Принцип коагулације млека и улога κ-казеина Сиришни ензими пресецају κ-казеин, тако да кончасти ланци, који вире на површини мицеле, нестају или постају много краћи. Коагулација казеина сиришним ензимом химозином (ренином) се одвија у две фазе. У првој химозин (протеолитички ензим) делује на κ-казеин, прекида везу између између 105. и 106. аминокиселине (Phe- Met) (Walstra и сар., 2005). На тај начин κ-казеин се преводи у пара-κ-казеин и гликомакропептид. Ово узрокује дисбаланс унутар међумолекулских сила у млеку, након што су се хидрфилни делови κ-казеина тј. макропептиди одвојили и прешли у сурутку. За разлику од κ-казеина, пара-κ-казеин нема способност да стабилизује мицеле и спречи њихову коагулацију. У другој фази, формирањем веза од стране колоидног калцијум фосфата (CCP) унутар казеинских мицела, ствара се тродимензијална структура груша или тpодимензијални казеински матрикс у коме се налази заробљена млечна маст и остали млечни састојци. Коагулација се може извести и додавањем киселине у млеко, када H + неутрализује негативно наелектрисање казеинске мицеле тј. κ-казеина. Када ph млека достигне вредност од 4,7; која представља његову изоелектричну тачку (стање када су сва наелектрисања неутрална) настаје грушање млека и формирања киселог казеина. Химозин -казеин пара -казеин + ГМП 64 аминокиселине (169 аминокиселина) (105 аминокиселина) и угљенохидратна простетична група Слика 2. Деловање химозина на капа казеин 6
Момчило Шаран Мастер рад Увод 1.3. Генетски полиморфизам κ-казеина и његова повезаност са производним особинама млека Генетичка варијабилност млечних протеина може се установити на ДНК и фенотипском нивоу. Фенотипски се утврђује помоћу техника као што су изоелектрично фокусирање (IEF), електрофореза, хроматографија и др. (Caroli и сар., 2009). Генотипизација млечних протена на ДНК нивоу поседује знатне предности од оне на фенотипском нивоу, јер се на овај начин може одредити генотип женских јединки и пре почетка лактације, нпр. на рођењу, као и генотип мушких јединки. Са развојем молекуларне биологије, до сада је развијено више метода за индетификацију варијабилности млечних протеина на ДНК нивоу (Ng-Kwai-Hang и Grosclaude, 2003). Данас је у употеби неколико PCR метода којима се може утврдити присуство различитих алелних варијанти млечних протеина. У ове методе спадају: Simple Sequence Repeat Polymorphism (SSR или микросателитски маркери), Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP), полиморфизам једног нуклеотида (SNP), Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR RFLP анализа) (Hristov и Radoslavov, 2015). Особине капа каезеина се интеnзивно прpучавају због његове улоге у стабилизацији казеинских мицела и утицаја на производне особине млека. За више раса доказана је генетска варијабилност капа казеинског локуса и то за сваку са различитом фреквенцијом алела, што је условљено генетичком разноврсношћу међу расама (Smiltiņa и Grīslis, 2010). Најчешћи алели су А и Б, док се ређе јављају и следећих 9 алела (Ц, Д, Е, Ф,Х, И, Ј, W) (Caroli и сар., 2009), док (Farrell и сар., 2004) наводе постојање 11 алела. Аминокиселински састав ових форми је веома сличан. Доказано је да субституција неколико аминокиселина у полипептидном ланцу κ-казеина резултира полиморфизмом. Капа казеин А разликује се од Б типа по супституисаном треонину са изолеуцином и аспарагинској киселини са аланином, на 136. и 148. позицији. У односу на Б, форма А садржи један више остатак аспарагинске киселине и треонина, док форма Б има један више остатак аланина и изолеуцина. Замена аминокиселине аргинин са хистидином на положају 97, резултира варијантом Ц капа казеина. На позицији 155, 7
Момчило Шаран Мастер рад Увод капа казеин А једини има аминокиселину серин, док Е варијанта има глицин (Стојчевић, 2004). Казеински гени су лоцирани на q31-33 региону хромозома 6. Они формирају кластер уско везаних гена распоређених следећим редоследом: αс1, β, αс2 и κ-казеин. Читав кластер је дугачак око 200 кило база (Rijnkels и сар., 1997). Слика 3. Геномска организација говеђег казеинског локуса који кодира синтезу: αs1-cn (CSN1S1), β-cn (CSN2), αs2-cn (CSN1S2), и κ-cn (CSN3). Празне површине означавају интроне, а попуњене егзоне, који су приказани као сиви (5 и 3 непреводиви региони), црни (део егзона који кодира сигнални пептид) и обојени (делови егзона који који кодирају протеине) (Martin и сар., 2002). Најпожељнији генотип је ББ који испољава позитиван ефекат на принос сира и садржај протеина, затим АБ и на крају АА. Kübarsepp и сар., (2005) су утврдили да су 8
Момчило Шаран Мастер рад Увод измерени параметри коагулације били сигнификантно бољи за ББ капа казеин а лошији за АА генотип. ББ капа казеин је испољио мањи проценат некоагулисаних узорака млека, након додавања сирила. Испитивањем Zambrano и сар., (2010) праћен је просечан износ приноса сира по појединим генотиповима капа казеина холштајн крава. Млеко крава ББ генотипа је давао најбољи рандман сира, за килограм сира било је неопходно 5,46 литара млека. Предности крава са ББ генотипом капа казеина, може се објаснити тиме што он формира мање и стабилније мицеле, у односу на друге генотипове. Анализом величине казеинске мицеле, Hristov и сар., (2014) су утврдили да млеко крава АА генотипа садржи мицеле већег дијаметра у односу на АБ и ББ генотип. У истрживању које су спровели Pečiulaitienė и сар., (2007) у популацији говеда домаћих раса у Литванији, утвређен је утицај генетског полиморфизма млечних протеина на производњу млека и састав млека. Резултати су показали позитиван утицај ББ генотипа капа казеина на садржај протеина и масти у млеку, међутим ове краве су имале мањи принос млека. Краве са АА генотипом капа казеина су производиле више млека (за 175,7 kg више) и имале већи просечан принос протеина (за 2,88 kg више) од крава са АБ генотипом. Краве АБ генотипа су производиле млеко са вишим % масти у млеку (за 0,23% више) и протеина (за 0,06% више) у односу на АА генотип. Млеко крава са ББ генотипом је имало више масти (за 0,27%) и протеина (за 0,21%) у односу на АА генотип. Повољне сиришно-коагулационе особине млека к-казеин ББ генотипа огледају се у краћем времену коагулације млека са сирилом, због повезаности са повећаним садржајем казеина и укупних протеина у млеку. Утврђено је, да је време подсиравања млека к- казеин ББ генотипа било око 3 пута брже у односу на капа казеин АА млеко и око 2 пута брже у односу на капа казеин АБ млеко (Стојчевић, 2004). Бржу коагулацију к-казеин ББ млека у односу на капа казеин АА млеко установили су и Тривуновић, и сар., (2006). Б варијанте капа казеина су повезане са већим приносом сира из два разлога: први је то што он повећава количину казеина у млеку, а други разлог је могуће повећање слободног калцијума услед чега се ствара много чвршћи сирни груш (Eenennaam и Medrano, 1991). 9
Момчило Шаран Мастер рад Задатак и циљ рада 2. ЗАДАТАК И ЦИЉ РАДА Циљ овог рада је да се уради генотипизација крава за ген који кодира капа казеин. Ово је постигнуто прикупљањем узорака крви, изолацијом ДНК и циљаном PCR амплификацијом региона ДНК који кодира синтезу капа казеина, док је сама генотипизација остварена сечењем ДНК помоћу рестрикционих ендонуклеаза. Након генотипизације употребом софтверског пакета ARLEQUIN 3.5.1.2. утврђена је фреквенција идентификованих алела и генотипова унутар раса, колика је хетерозиготност и да ли су популације испитиваних раса у Hardy-Weinberg-овој равнотежи, путем егзактног теста методом марковљевих ланаца (Markov chain). Све у циљу сагледавања и процене тренутних фреквенција алела унутар испитиваних раса, што ће дати основу за даљу селекцију говеда на ову особину, као и за креирање одгајивачких програма. 10
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОД РАДА 3.1. МАТЕРИЈАЛ За потребе испитивања генетског полиморфизма капа казеина, прикупљено је 32 узорка крви, од којих је 10 било пореклом од браон свис расе, 10 холштајн фризијске и 8 сименталске расе, док су преостала 4 узорка крви узета од домаћег бивола. Говеда од којих потичу узорци крви се узгајају на комерцијалној фарми (браон свис и холштајн фризијска раса) и мањем породичном газдинству (сименталска раса и биволи) које се налазе на територији АП Војводине; Р. Србија. Узорковање крви извршено је помоћу вакутајнера, чија је унутрашњост обложена eтилендиаминтетрасирћетном киселином (EDTA) чија улога је била да спречи коагулацију крви. Сваки узорак је обележен, тако што је на налепници вакутајнера уписан идентификациони број грла. До тренутка када је извршена изолација ДНК, узорци крви су чувани на температури од 4ºC, како би се спречила деградација ДНК. 3.2. МЕТОДЕ 3.2.1. Изолација ДНК Изолација ДНК из крви поменутих узорака је изврштена, путем фенолхлороформ-изоамилалкохол екстракције (PCI). 11
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада Изолација ДНК је извршена тако што је најпре 200 µl крви из вакутајнера пребачено у стерилну кивету у коју је затим додато 380 µl дигестионог пуфера (0,1% SDS, 100 mm NaCl, 10 mm EDTA, 100 mm Tris-HCl, ph 8,0), 10 µl раствора протеиназе К (40mg/ml) i 10 µl β - меркаптоетанола. Затим је садржај сваке појединачне кивета промешан на вортексу (око 10 секунди), а потом инкубиран на 60ºC током 30 минута. По завршетку инкубације узорци су центрифугирани 4 минута на 12000 rpm. Затим је у нове стерилне кивете одливено око 400 µl супернатанта и иста толика запремина фенола, након чега је садржај кивете промешан 5 секунди на вортексу. Следећи корак је био центрифугирање сваке кивете 4 минута на 12000 rpm. Пажљивим пипетирањем пребачена је горња фаза (супернатант) у којој се налазила ДНК, у нове кивете у које је такође додато 350 µl хлороформ-изоамилалкохола. Свака кивета је промешана на вортексу 5 секунди, а потом и центрифугирана 4 минута на 12000 rpm. Пошто су се након центрифугирања формирала три слоја, у нове кивете је одливен горњи. У кивете је додато 0,1 запремине (око 25 µl) 3М Na-ацетата и две запремине (око 500 µl) 95% етанола расхлађеног на - 20ºC. Узорци су стављени у расхладну комору на -70ºC током 30 минута. Након тога узорци су центрифуговани 20 минута на 12000 rpm. У следећем кораку течност из кивета је одливена, док је ДНК остала преципитована на дну кивете. Затим је у кивете додат 1 ml леденог 70% етанола. Следило је центрифугирање 5 минута на 12000 rpm. Етанол из кивета је одливен и кивете су прво положене на папирни убрус да се осуше, а потом стављене у термоблок (око 10 минута) како би и преостали етанол испарио из кивета. У сваку кивету је додато 50 µl 0,1 ТЕ пуфера. Кивете су на кратко (2-3 минута) стављене у термоблок на температури од око 55ºC, а након тога остављене око 15 минута на собној температури да се охладе и потом похрањене на чување на температури од -20ºC до момента извођења PCR реакције. Количина и квалитет изоловане ДНК узорака је измерена на NanoDrop спектрофотометру. 12
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада 3.2.2. PCR реакција Ланчана реакција полимеразе (енгл. Polymerase Chain Reaction - PCR) је метода која омогућава умножавање одређеног фрагмента дезоксирибонуклеинске киселине (ДНК) у in vitro условима. Састоји се од три основна корака: (1) денатурације дволанчане ДНК матрице (најчешће на температури од 95 C), (2) хибридизације специфичних олигонуклеотида који се називају прајмери (амплимери, граничници) и ДНК матрице и (3) екстензије прајмера. Екстензија прајмера је катализована Таq или неком другом термостабилном ДНК полимеразом (слика 4.). Три наведена корака чине један циклус PCR-а који се током реакције понавља 20 45 пута при чему се жељени фрагмент ДНК умножи 10 6 10 9 пута (Цикота и сар., 2002). Слика 4. Приказ амплификације ДНК помоћу PCR методе (Alberts и сар., 2002) Фаза денатурације У овој фази раскидају се водоничне везе између два комплементарна ланца ДНК молекула, што се постиже инкубацијом на 95ºC током 3-5 минута; циљ је да комплетна ДНК буде денатурисана и добијени једноланчани молекули. 13
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада Фаза хибридизације прајмера У овој фази температура се аутоматски снижава (варијације иду од 42 C до 65 C) у интервалу од 20 секунди до 1 минута, како би се пар прајмера строго специфичних за 3' крај циљне секвенце могао везати. Сваки прајмер претражује цео геном и везује се за циљну секвенцу својим 5' крајем на одговарајућем ланцу ДНК коју проналази у низу нуклеотида, при чему они служе као граничници дефинишући секвенцу која се копира, а неопходни су и за почетак активности Таq полимеразе којој је потребна иницијална секвенца олигонуклеотида да би отпочела полимеризацију. Фаза елонгације прајмера. У овој фази ензим синтетише комплементаран ланац за сваки ланац циљне секвенце користећи слободне нуклеотиде из смеше. Синтеза се врши у правцу 5'-3' и то од места где се налази прајмер у једном смеру на једном ланцу и у другом смеру на другом ланцу ДНК. У маси ДНК молекула, копира се само ДНК која садржи циљне секвенце јер Таq полимераза може да копира само оне делове ДНК који имају хибридизоване прајмере. Оптимална температура за термостабилну Таq полимеразу је 72 C, тако да се ова фаза изводи на тој температури у трајању од 20 секунди до 2 минута (Живковић, 2007). PCR реакциона смеша је волумена од 5 до 100 μl и садржи компоненте потребне за in vitro синтезу ДНК: o ДНК молекул, матрица која се копира; o Прајмере, олигонуклеотиде комплементарне крајевима секвенце која се копира, а који су неопходни за отпочињање ДНК синтезе; o Нуклеотиде, градивне елементе ДНК; o Таq полимеразу, термостабилну ДНК полимеразу која катализује уградњу нуклеотида по принципу комплементарности са ДНК матрицом; o Јоне Mg (Mg 2+ ), неопходе за рад Таq полимеразе и синтезу ДНК; o Пуфер, који обезбеђује оптималну активност Таq полимеразе. 14
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада 3.2.2.1. Параметри PCR реакције коришћене у овом раду ДНК фрагмент егзона IV гена који кодира синтезу капа казеина, укупне дужине 453 базних парова је амплификован помоћу PCR уређаја Eppendorf Thermocycler. Прајмери коришћени при амплификацији били исти као они који су коришћени у раду аутора Barroso и сар., (1998). F: 5 TGT GCT GAG TAG GTA TCC TAG TTA TGG 3 R: 5 GCG TTG TCT TCT TTG ATG TCT CCT TAG 3 Секвенца прајмера коришћених у овом раду За амплификацију поменуте секвенце ДНК, припремљена је PCR реакциона смеша укупног волумена 25 µl, која се састојала од: 17,85 µl dh 2 O; 2,5 µl 10Х пуфер (који је садржао и 10 mm MgCl 2 ); 1,25 µl 2 mm dntp; оба прајмера по 0,5 µl раствора концентрације 10 pm. У смешу је додато и 2 µl раствора изоловане ДНК, тако да је количина ДНК у смеши била око 50 ng. Услови PCR реакције приказани су у табели 2. Табела 2. Програм за ланчану реакцију полимеразе за амплификацију капа-казеин кодирајућег региона ДНК Фаза Температура ºC Време Број циклуса Почетна денатурација 94 5 минута 1 Денатурација 94 50 секунди Везивање прајмера 65 30 секунди 35 Екстензија 72 30 секунди Финална екстензија 72 5 минута 1 3.2.3. Генотипизација путем RFLP (Restriction Frgment Lenght Polymorphism) методе Рестрикционионе ендонуклеазе су ензими који секу специфичне кратке ДНК секвенце означене као палиондроми. Палиондроми представљају нуклеотидне секвенце које имају исти редослед нуклеотида када се окрену за 180º. Рестрикциони ензими су 15
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада нормално присутни у ћелијама бактерија штитећи их од вирусне ДНК. Редослед нуклеотида које препознају рестрикциони ензими варира међу различитим врстама бактерија, тако да је до данас изоловано преко 200 различитих рестрикционих ендонуклеаза. Ови ензими препознају нуклеотидне секвенце дужине 4-8 базних парова. Такве секвенце постоје и у бактеријској ДНК, али су у њима аденин и цитозин метиловани. На тај начин бактеријска ДНК је заштићена од самоубилачког дејства својих рестрикционих ензима (Ђелић и Станимировић, 2004). Активност ензима је изражена у ензиматским јединицама (units, U). Једна јединица предтавља колчину рестрикционог ензима потроебну за потпуну разградњу 1 µg λ ДНК за 60 минута на 37ºC у 50 µl реакционе смеше. Након PCR амплификације ДНК и њене дигестије рестрикционим ензимима, дужина добијених фрагмената се одређује путем гелелектрофорезе поређењем њихове дужине са дужинама маркера унапред познате дужине. 3.2.3.1. Параметри RFLP методе коришћене у овом раду Након PCR амплификације секвенце ДНК која кодира капа казеин, умножена секвенца је исечена помоћу рестикционих ензима како би се на тај начин утврдио полиморфизам како између јединки тако и унутар раса. Рестрикциони ензими коришћени у овом истраживању су били: HinfI, HaeIII и HpyCH4IV (изосизомер ензима Mae II). 5...GANTC...3 3...CTNAG...5 HinfI 5...GGCC...3 3...CCGG...5 HaeIII 5...ACGT...3 3...TGCA...5 HpyCH4IV Слика 5. Приказ места препознавања и дејства рестрикционих ензимa Ензим HinfI изолован је из бактерије Haemophilus influenzae Rf, ензим HaeIII из Haemophilus aegypticus, a HpyCH4IV из бактерије Helicobacter pylori CH4. Начин сечења ДНК поменутим ензимима приказан је на слици 3. Коришћени ензим HaeIII је набављен 16
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада од произвођача Sigma-Aldrich, а преостала два од произвођача New England BioLabs. Приликом одређивања потребне количине ензима и услова реакције коришћена су упутства добијена од произвођача. За потребе дигестије ДНК секвенце која кодира синтезу капа казеина, у кивети је за сваки узорак припремљена реакциона смеша укупног волумена 25 µl у чији састав је улазило: 5 µl PCR продукта, 2,5 µl 10х NEB пуфера, 1 µl (10 U/ µl) ензима HinfI односно HpyCH4IV и 16,5 µl PCR воде. За дигестију ДНК са HaeIII ензимом припремљена је следећа реакциона смеша укупне запремине 20 µl: 5 µl PCR продукта, 2µl 10х пуфера, 1 µl (10 U/µl) ензима HaeIII и 12 µl PCR воде. Да би ензими испољили своје дејство и исекли ДНК, узорци су икубирани на 37 C током 1 часа (HaeIII) односно 15 минута (HinfI и HpyCH4IV), а након тога инактивирани тако што су узорци загревани на 65 C током 15 минута (HaeIII) односно (HinfI и HpyCH4IV) на 80 C у трајању од 20 минута (табела 3). Табела 3. Протокол за извршену дигестију ДНК рестрикционим ензимима HaeIII HinfI HpyCH4IV Инкубација 37 C током 1 часа 37 C током 15 минута 37 C током 15 минута Инактивација 65 C током 15 минута 80 C током 20 минута 80 C током 20 минута 3.2.4. Агарозна електрофореза и визуелизација резултата Аарозна гел елекктрофореза је једна од стандардних метода у молекуларној биологији помоћу које се врши идентификација фрагмената нуклеинских киселина различитих дужина. Улога агарозе је да формира матрикс који омета кретање ДНК кроз гел, услед чега се дужи фрагменти ДНК крећу спорије него они краћи. Нуклеинске киселине су негативно наелектрисане, услед чега мигрирају ка позитивном полу када се нађу електричном пољу. Процес сепарације зависи од коришћене волтаже, особина гела, као и набоја и облика молекула које се испитује. Агароза је полисахарид изолован из црвених морских алги. Агароза се додаје у пуфер за електрофорезу у коме се раствара загревањем. Брзина којом ДНК фрагменти мигрирају кроз агарозне гелове у 17
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада електричном пољу зависи пре свега од величине ДНК фрагмената. Брзина миграције двоструког ланца ДНК је обрнуто пропорционална логаритму његове величине. Осим величине ДНК молекула, фактори који утичу на брзину миграције су: својства пуфера који се користи, концентрација агарозе у гелу, јачина коришћене струје, као и конформација ДНК молекула (Weuher и сар., 2006). У зависности од концентрације агарозе у гелу, фрагменти од преко 100 па до 30000 базних парова се могу детерминисати стандардном агарозном гел електрофорезом. Фрагменти ДНК се на гелу могу визуелизовати, употребом флуоресцентних боја (EtBr, SYBER green и др.) које се интеркалирају између база двоструког хеликса ДНК (Corley, 2005). 3.2.4.1. Поступак при електрофорези ДНК на агарозном гелу и визуелизација резултата у овом раду Након амплификације региона ДНК од интереса путем PCR методе и дигестије PCR продуката од стране рестрикционих ензима, добијени резултати су проверени путем 2% агарозне гел електрофорезе. Електрофореза се одвијала при константној волтажи од 100V у 1xTAE пуферу. Припрема агарозних гелова је вршена тако што је у ерленмајер боцу додато 0,5 g агарозе, 25 ml 1xTAE пуфера. Наведена смеша је загревана до тачке кључања, а затим јој је додато 5 µl етидијум бромида (EtBr). Затим је агароза изливана у калупе у које је уроњен тзв. чешаљ, помоћу кога се формирана удубљења у гелу. Након полимеризације, гел је пренешен у кадицу у којој се налазио ТАЕ пуфер, а потом су у претходно припремљена удубљења у гелу пипетирани узорци помешани са бојом. У сваки гел је нанешен маркер произвођача Thermo Scientific, каталошки број SM0241. Дужине фрагмената маркера, којих је укупно било 10, кретале су се од 100-1000 базних парова (разлика у дужини између сваког фрагмента била је 100 бп). По завршетку електрофорезе извршена је визуелизација резултата тако што је гел постављен на УВ трансилуминатор. Пошто се етидијум бромид интеркалирао у ДНК, PCR продукти су постали видљиви из разлога што етидијум бромид при излагању УВ светлу, флуоресцира наранџастом бојом. Дужине фрагмената ДНК одређене су тако што 18
Момчило Шаран Мастер рад Материјал и метод рада су упоређени са дужином маркера познатих дужина. Добијени резултати су фотографисани. 3.2.5. Статистичка обрада података Након лабораторијских анализа, добијени подаци статистички су обрађени употребом софтверског пакета ARLEQUIN 3.5.1.2. Обрадом података утврђена је фреквенција алела, фреквенције генотипова, уочена и очекивана хетерозиготност. Такође је утврђено да ли се испитиване популације налазе у Hardy-Weinberg-овој равнотежи. При испитивању се кренуло од претпоставке да се популација налази у Hardy-Weinberg-овој равнотежи. 19
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија 4. РЕЗУЛТАТИ ИСТРАЖИВАЊА И ДИСКУСИЈА Изолација ДНК из крви путем фенол-хлороформ-изоамилалкохол екстракције (PCI), је упешно извршена из сва 32 узорка. Квантитет и квалитет изоловане ДНК је проверена на NanoDrop спектрофотометру, помоћу ког је измерена апсорпција УВ таласа, таласних дужина (λ) 230, 260 и 280 nm. Измерене концентрације ДНК појединих узорака приказане су у табели 4. Табела 4. Измерене концентрације ДНК и резултати спектрофотометријског мерења Узорак Концентрација Концентрација λ=260/280 Узорак (ng/µl) (ng/µl) λ=260/280 1 19,49 1,75 17 34,25 1,56 2 14,65 1,67 18 27,42 1,56 3 14,03 1,53 19 23,86 1,48 4 7,88 1,57 20 29,49 1,82 5 5,35 1,15 21 28,98 1,75 6 23,72 1,36 22 32,04 1,65 7 18,07 1,23 23 27,16 1,40 8 23,8 1,45 24 133,97 1,96 9 15,7 1,42 25 237,68 1,52 10 8,91 1,37 26 52,26 1,68 11 12,31 1,31 27 29,65 1,41 12 7,47 1,63 28 375,6 1,72 13 11,98 1,72 29 20,89 1,31 14 413,86 1,42 30 13,68 1,36 15 21,52 1,37 31 33,81 1,63 16 35,42 1,57 32 87,15 1,82 Пре дигестије ДНК рестрикционим ензимима, а након PCR амплификације, агарозном гел електрофорезом утврђено је да су у свим узорцима успешно амплификоване секвенце ДНК егзона IV гена дужине 453 базна пара, који кодира синтезу капа казеина (слика 6). 20
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија Слика 6. Аамплификована секвенце ДНК егзона IV гена који кодира синтезу капа казеина, дужине 453 базна пара Након инкубације и дигестије ДНК рестрикционим ензимима HinfI, HaeIII и HpyCH4IV добијени су фрагменти различитих дужина, на основу који се могла извшити идентификација генотипова испитиваних јединки. Пошто је сваки узорак ДНК сечен са три различита ензима, утврђивање генотипа испитиваних јединки извршено је поређењем добијених дужина фрагмената ДНК. Дужине фрагмената и начин одређивања генотипа приказан је у табели 5. Резултати су се подударали са онима које су утврдили Naranjo и сар., (2007). Табела 5. Начин идентификације алела капа казеина на основу RFLP анализе, према (Barroso и сар., 1998; Naranjo и сар., 2007) Назив рестрикционог ензима и његово место сечења ДНК Алел HinfI (5'-GATC-3') HaeIII (5'-GGCC-3') HpyCH4IV (5'-GATC-3') А - 326 100 27 230 223 - - - 254 199 Б 426 - - 27 230 223 - - - 254 199 Ц 426 - - 27 230 223 - - 453 - - Е - 326 100 27 230-145 78-254 199 У овом истраживању добијени су алели А и Б и генотипови АА, АБ и АБ. При дигестији ензимом HaeIII, ДНК свих узорака исечена је на фрагменте једнаке дужине (230 и 223 базних парова). Исти случај је био са дигестијом ДНК ензимом HpyCH4IV, помоћу ког су код свих узорака добијени фрагменти дужине 254 и 199 базних парова. 21
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија Међутим, при сечењу ДНК ензимом HinfI установљена је разлика у дужини фрагмената ДНК. ДНК носиоца алела А исечена је на два места при чему су добијена три фрагмента, дужина 326, 100 и 27 базних парова, док је алел Б исечен на једном месту након чега су добијена два фрагмента дужине 426 и 27 базних парова (слика 9). Према (Medrano и Aguilar-Cordova, 1990; Damiani и сар., 1990) код Б алела је дошло до замене нуклеотида тј. тачкасте мутације, на егзону IV капа казеинског гена, при којој је цитозин (ACC) замењен тимином (ATC), a аденин (GAT) цитозином (GCT), a услед чега је ензим HinfI изгубио место препознавања и сечења ДНК. Ова замена нуклеотида одражава се и на нивоу секвенце аминокиселина капа казеина на позицији 136 и 148. Слика 7. Слика 8. Слика 7. и 8. Добијени фрагменти ДНК дигестијом ензимом HpyCH4IV (слика 7.) и HaeIII ензимом (слика 8.) Слика 9. Добијени фрагменти ДНК дигестијом ензимом HinfI 22
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија 4.1. Холштајн фризијска раса У узорку говеда холштајн фризијске расе генотип АА је имао највећу релативну фреквенцију (0,9), а у погледу фреквенције алела, алел А је био најзаступљенији (0,95). Поред АА генотипа само код једне јединке је детектован АБ генотип, док се ББ није појављивао (Табела 6). Уочена хетерозиготност је биле веома ниска (0,1) (Табела 7), што је најмања вредност од свих испитивани раса. Табела 6. Утврђене фреквенције алела и генотипова капа казеина унутар ХФ расе Генотипови Алели АА АБ ББ А Б Број 9 1 0 19 1 Фреквенција 0,9 0,1 0 0,95 0,05 Ови резултати су у сагласности са резултатима добијеним у различитим домаћим и страним испитивањима, којима се потврђује преовлађујуће присуство АА генотипа и А алела у популацијама холштајн фризијске расе. Тако су Serrano и сар., (2014) у мексичкој популацији ХФ говеда утврдили највеће присуство АА генотипа од 69%. На узорку од 304 ХФ говеда у Пољској, Sitkowska и сар., (2008) детектовани су следећу фреквенцију генотипова: АА (0,71), АБ (0,23) и ББ (0,26). Занимљиво је да су краве АА генотипа производиле више млека него краве АБ и ББ генотипа. Према раду Ivanković и сар., (2011), међу 130 ХФ грла у Хрватској, преовлађујући алел за капа казеин био је А алел са фреквенцијом. од 0,76 и АА генотип (63%). Ren и сар., (2011) генотипизацијом 98 ХФ говеда у Кини такође потврђују преимућство А алела (0.69) над Б алелом (0.31). Табела7. Број уочених алела и генотипова, уочена и очекивана хетерозиготност у популацији холштајн фризијских говеда, р-вредност Број Број Уочена Очекивана HW, p- алела генотипова хетерозиготност (Ho) хетерозиготност (He) вредност 2 2 0,1 0,1 1,0 ns P>0,05 ns ; P<0,05*; P<0,01** 23
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија У истраживањима у нашој земљи добијени су приближно слични резултати. Tanaskovska и сар., (2003) су генотипизацијом црвених холштајн фризијских грла, утврдили да је 12 било АА, 11 АБ и 1 ББ генотипа. Испитивањем Стојчевић, (2004) поређењем млека крава АА, АБ и ББ генотипа ХФ расе, утврђено је да је млеко крава ББ генотипа најпогодније за производњу сира. Подаци добијени овим истраживањем показују да би се при селекцији и дизајнирању одгајивачког програма холштајн фризијске расе, као најбројније расе у Војводини, требала обратити пажња и на капа-казеински генотип, како би се повећала фреквенција Б алела. Повећање фреквенције Б алела би имало позитиван финансијски ефекат на произвођаче и прерађиваче млека, јер како су генотипизацијом ХФ крава утврдили Aleandri, и сар., (1990) капа-казеински ББ генотип доприноси већем проценту протеина у млеку, а уколико је присутан и ББ генотип β-лактоглобулина биће виши и проценат масти. Млеко ББ капа-казеинског генотипа било је супериорније односу на АА у погледу приноса сира. У овом истраживању фреквенција генотипова била је следћа: АА (0,55), АБ (0,41) и ББ (0,04). Утврђено је да нема сигнификантне разлике (P>0,05) између уочене и очекиване хетерозиготности, из чега произилази да се популација холштајн фризијских говеда налази у Hardy-Weinberg-овој равнотежи. 4.2. Браон свис раса Анализом генотипа капа казеина јединки браон свис расе, установљена је подједнака фреквенција АБ и ББ генотипова, док АА генотип није детектован (табела 8). Алел Б је био најзаступљенији са фреквенцијом од 0,75. Висока распрострањеност Б алела у популацијама браон свис говеда, такође је потврђена у претходним истраживањима која су се бавила овом тематиком. У раду који су спровели Caroli и сар., (2004) алел Б је имао већу фреквенцију (0,65) од алела А (0,35). 24
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија Табела 8. Утврђене фреквенције алела и генотипова капа казеина унутар БС расе Број грла (n=10) Генотипови Алели АА АБ ББ А Б Број 0 5 5 5 15 Фреквенција 0 0,5 0,5 0,25 0,75 Међу популацијом браон свис говеда у Калифорнији, према резултатима Eenennaam и Medrano, (1991) најфреквентнији је био алел Б (0,67). У неким популацијама су забележене ниже вредности Б алела. Међу испитиваним браон свис говедима у Хрватској најзаступљенији је био АБ генотип (0,44) и алел A (0,61). Фреквенцију алела Б од 0,505 и А алела од 0,495 капа казеина међу браон свис говедима у Турској утврдили су Dorgu и сар., (2009). Браон свис раса је широм света препозната као раса чије млеко је веома погодно за производњу сира, што се доводи у везу са високим садржајем протеина у млеку и повољним односом протеин-маст, али и са високом фреквенцијом Б алела међу грлима ове расе. De Marchi и сар., (2008) наводе да млеко браон свис расе у поређењу са холштајн фризијском расом, садржи више протеина, казеина, има већу титрациону киселост, даје већи рандман сира, испољава краћу коагулацију, даје сир пожељније жуте боје, али истовремено даје мање количине млека. Број уочених алела и генотипова, уочена и очекивана хетерозиготност у унутар браон свис расе говеда приказан је у табели 9. Табела 9. Број уочених алела и генотипова, уочена и очекивана хетерозиготност унутар браон свис расе говеда, р-вредност Број Број Уочена хетерозиготност Очекивана HW, p- алела генотипова (Ho) хетерозиготност (He) вредност 2 2 0,5 0,39474 1,0 ns P>0,05 ns ; P<0,05*; P<0,01** Утврђено је да нема сигнификантне разлике (P>0,05) између уочене и очекиване хетерозиготности, што значи да се популација браон свис расе налази у Hardy-Weinbergовој равнотежи. 25
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија Графикон 1. Графички приказ фреквенције алела унутар испитиваних раса 4.3. Сименталска раса Сименталска раса је имала највећу уочену хетерозиготност од свих исптитиваних раса (Ho=0,625). Најзаступљенији генотип био је хетерозиготни АБ генотип, са фреквенцијом од 0,625, док је у погледу фреквенције алела то био Б алел (0,69) (Табела 10). Табела 10. Утврђене фреквенције алела и генотипова капа казеина унутар сименталске расе Број грла (n=8) Генотипови Алели АА АБ ББ А Б Број 0 5 3 5 11 Фреквенција 0 0,625 0,375 0,3125 0,6875 Међу генотиповима сименталске расе у истраживању Ђедовић и сар., (2015.) најзаступљенији је такође био генотип АБ (47,6), док су утврђена знатно мања 26
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија фреквенција Б алела (0,33) и већа А алела (0,67), него у овом истраживању. Већу фреквенцију А алела (0,60) унутар популације чешког сименталца су установили Kučerová и сар., (2006). Они су такође поред А и Б алела, установили присуство ретког Е алела (0,024). Çardak, (2005) у свом раду извештава да је у испитиваном узорку сименталских крава у Турској најзаступљенији био АБ генотип (0,51) и А алел (0,675). Испитивањем 100 крава сименталске расе у Пољској од стране Felenczak и сар., (2006) установљено је да се АБ генотип капа казеина јавља најфреквентије (49,8), затим АА (28,1) и ББ (22,1). Установљено је да је највиши принос сира и садржај протеина у млеку био код крава са ББ генотипом. Сименталска раса се одликује комбинованим производним својствима и добрим аклиматизационим способностима, што је допринело да ова раса буде најраширенија у Србији. Из овог разлога при даљој селекцији ове расе требала би се обратити пажња на капа-казеински генотип, како би се на тај начин унапредио укупни квалитет и призводна својства млека у нашој земљи. Број уочених алела и генотипова, уочена и очекивана хетерозиготност у популацији холштајн фризијских говеда, р-вредност приказани су у табели 11. Табела 11. Број уочених алела и генотипова, уочена и очекивана хетерозиготност у унутар сименталске расе говеда, р-вредност Број Број Уочена Очекивана HW, p- алела генотипова хетерозиготност (Ho) хетерозиготност (He) вредност 2 2 0,625 0,45833 0,48702 ns P>0,05 ns ; P<0,05*; P<0,01** Утврђено је да нема сигнификантне разлике (P>0,05) између уочене и очекиване хетерозиготности, из чега произилази да се популација сименталске расе налази у Hardy-Weinberg-овој равнотежи. 4.4. Биво Биволи (лат. Bubalus bubalis), припадају истој породици (Bovidae) и подпородици (Bovinae) као и домаће (право) говедо, услед чега они великим делом деле заједничку генетску основу. Из овог разлога, у овом истраживању је, користећи исте прајмере као и 27
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија за права говеда, успешно амплификован капа-казеински кодирајући сегмент ДНК бивола. Рестрикционом дигестијом ДНК, добијени су резултати који показују подједнаку заступљеност ББ и АБ генотипа (0,5) као и преовлађујуће присуство Б алела (0,75) (Табела 12). Табела 12. Утврђене фреквенције алела и генотипова капа казеина унутар узорка бивола Број грла (n=4) Генотипови Алели АА АБ ББ А Б Број 0 2 2 2 6 Фреквенција 0 0,5 0,5 0,25 0,75 У многим истраживањима, потврђено je да су Б алел и ББ генотип преовлађујући међу популацијама бивола. У испитивању које су спровели Otaviano и сар., (2005) свих 115 биволица са подручја Бразила су биле ББ генотипа. Gouda и сар., (2013) на узорку бивола из Египта, су утврдили да је фреквенција Б алела била 0,875 а А алела 0,125. Ren Da-Xi, и сар., (2011) су такође, на узорку од 48 бивола у Кини, користећи RFLP методу, код свих јединки установили ББ генотип. Биволи у Србији припадају медитеранском типу, који је пореклом од индијског бивола. Биволе одликује екстензиван начин узгоја, што за последицу има смањену производњу млека. Она може да варира од 900 до 4000 kg у зависности од менаџмента. Млеко бивола одликује се високим садржајем млечне масти од око 8% и протеина од око 4,4%. Из тог разлога је веома цењено јер се од њега справљају веома квалитетни сиреви као што су: mozzarela, treccia, scamoza, ricotta (Италија), vladaesa, braila (Румунија) и др. (Moioli, 2005). Оно што може да буде компаративна предност бивола је висока заступљеност Б алела, што је потврђено и овим испитивањем, а самим тим и добре производне одлике млека за производњу сира. Када овоме додамо и висок удео млечне масти и протеина, може се рећи да је млеко биволица идеално за прозводњу квалитетних сирева. Интересентно је напоменути да је од 4 бивола који су анализирани, један био мужјак, те се тако и на овом примеру може препознати супериорност детерминације полиморфизма на ДНК нивоу у односу на фенотипски ниво, из разлога што се генотип за особине млечности, као полно везана својства, не могу се детектовати 28
Момчило Шаран Мастер рад Резултати истраживања и дискусија на фенотипском нивоу код мужјака. Табела 13 приказује број уочених алела и генотипова, уочену и очекивану хетерозиготност у популацији бивола, р-вредност. Табела 13. Број уочених алела и генотипова, уочена и очекивана хетерозиготност у узорку бивола, р-вредност Број Број Уочена Очекивана HW, p- алела генотипова хетерозиготност (Ho) хетерозиготност (He) вредност 2 2 0,5 0,42857 1,0 ns P>0,05 ns ; P<0,05*; P<0,01** Утврђено је да нема сигнификантне разлике (P>0,05) између уочене и очекиване хетерозиготности, из чега се може закључити да се популација бивола налази у Hardy- Weinberg-овој равнотежи. Графикон 2. Графички приказ фреквенције генотипова унутар испитиваних раса 29
Момчило Шаран Мастер рад Закључак 5. ЗАКЉУЧАК Генотипизацијом узорака крви три испитиване расе говеда и бивола путем PCR- RFLP методе, уочена су два алела, А и Б, који се међусобно разликују по аминокиселинској секвенци. Алели Ц и Е нису детектовани. Алел А је био најфреквентнији у популацији холштајн фризијских говеда (0,95), док је највећа фреквенција алела Б била забележена у популацији браон свис расе и бивола у вредности од 0,75., док је код сименталске расе Б алел био нешто ниже заступљен (0,69). Уочена хетерозиготност (Ho) била је највећа код сименталске расе (0,625), а најмања код холштајн фризијске расе (0,1). Поређењем уочене и очекиване хетерозиготности, утврђено је да су испитиване популације биле у Hardy-Weinberg-овој равнотежи. PCR-RFLP техника се показала као ефикасана метода којом се независно од пола и старости може извршити генотипизација говеда. Олигонуклеотидне секвенце (прајмери) дизајниране за права говеда, у овом раду су успешно примењене у амплификацији ДНК бивола, што је још један доказ генетске сличности између ове две врсте. Генотипизација говеда, а пре свега бикова због великог броја потмака, за капаказеински локус би требала да уђе у широку употребу. Ово је особина на коју би се требала вршити селекција, фаворизовањем пожељног Б алела, нарочито код холштајн фризијске расе, код које је установљена најмања фреквенција Б алела (0,05). Иако извршено на малом узорку, ово истраживање је дало почетну основу за даља испитивања на ову тему у нашој земљи. 30