BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C: Từ cấu tạo siêu vi đến chẩn đoán và điều trị

BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C: Từ cấu tạo siêu vi đến chẩn đoán và điều trị Hơn 20 năm nghiên cứu về chu trình tăng sinh phát triển của siêu vi gây viêm gan C (hepatitis C virus = HCV), kể cấu tạo di truyền, chúng ta đã có những công cụ tương đối tốt để chẩn đoán và phát triển được nhiều thuốc mới. Hiện tại, xét nghiệm huyết thanh tầm soát bệnh viêm gan siêu vi C (VGSV C) được đề nghị cho những người có nguy cơ và xét nghiệm tìm nucleic acid được sử dụng để xác định một trường hợp nhiễm HCV đang xảy ra. Định lượng HCV RNA và genotype rất quan trọng để quyết định thời gian điều trị cần thiết cũng như dự đoán đáp ứng với điều trị. Vào đầu thế kỷ 21, peginterferon và ribavirin được xem là tiêu chuẩn điều trị, nhưng phác đồ này cho nhiều kết quả không mong muốn. Vì vậy, từ sau 2014, boceprevir, telaprevir, sofosbuvir, sofosbuvir/ledipasvir xuất hiện và được FDA công nhận đã làm thay đổi ngoạn mục kết quả điều trị. Nhiều loại thuốc chống HCV dạng uống, không cần đến interferon/peginterferon chích, có hiệu quả đối với nhiều loại genotypes khác nhau lần lược xuất và áp dụng vào thực tiển lâm sàng. Phần lớn, không phải tất cả, trường hợp VGSV C đã được chữa khỏi có thể do HCV kháng thuốc hoặc giá thành điều trị quá cao mà bệnh nhân không với tới. Một vấn đề quan trọng được nhiều người nhắc đến là kết quả điều trị rất tốt nhưng hiện nay chúng ta vẫn chưa có thuốc chủng ngừa VGSV C. MỘT VÀI ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH VGSV C Hiện nay VGSV C chiếm khoảng 15-20% tất cà trường hợp viêm gan cấp. 50-80% nhiễm HCV cấp trở thành mạn tính. Toàn cầu có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV. Nhiễm HCV mạn tính có nhiều nguy cơ đưa đến biến chứng trầm trọng đe dọa tính mạng như xơ gan (20%), HCC (incidence: 2-4%/năm ở bệnh nhân xơ gan). Nhiều nghiên cứu dich tễ cho thấy HCV có liên quan đến các biểu hiện ngoài gan như kháng insulin, tiểu đường type 2, bệnh lý vi cầu thận, biểu hiện ở miệng, etc. Đa số bệnh nhân nhiễm HCV sẽ diễn tiến sang thể mạn tính, nhưng 15-40% lại có thể loại bỏ siêu vi một cách tự nhiên. Yếu tố nào tác động đến diễn tiến khác nhau ở bệnh nhân nhiễm HCV? Diễn tiến động học của siêu vi và đa hình di truyền (genetic polymorphisms) của ký chủ (như interleukin 28B chẳng hạn) liên quan khá mật thiết đến diễn tiến của nhiễm HCV. Sau khi phát hiện ra HCV, nhiều dòng HCV phân lập được có chuổi nucleotides rất khác nhau, có thể do bất thường ở polymerase (HCV NS5B), vì vậy nhiều biến thể siêu vi (quasispecies) được ghi nhận ở bệnh nhân nhiễm HCV. Ở mỗi bệnh nhân nhiễm HCV thay đổi chuổi nucleotide chỉ vào khoảng 1-5%, nhưng tích lủy những chuổi nucleotides thay thế dần dần đưa đến hậu quả là xuất hiện nhiều subtypes và cả genotypes khác nhau. Như vậy bộ gien của HCV thường không đồng nhất (heterogeneous). Hiện tại HCV được chia làm 11 genotypes khác nhau (đánh số từ 1 đến 11), mỗi genotype có 30-50% chuổi nucleotide khác nhau, vì vậy chúng ta có 6 genotypes chính (1 đến 6). Trong mỗi genotype có nhiều loại subtypes khác nhau (đánh dấu bằng a, b, c, etc) có khác biệt ở chuổi nucleotide khoảng 15-30%. Tỉ lệ hiện mắc HCV genotypes và subtypes khác nhau theo từng vùng địa dư. Hiện nay trên toàn thế giới, genotype 1 chiếm ưu thế (khoảng 46%), kế đến là genotype 3, 2 và 4. Nhiều loại genotypes khác nhau nên tính gây nhiễm và gây bệnh cũng khác nhau, đều có ảnh hưởng đến tỉ lệ diễn tiến sang xơ gan và HCC. Tính không đồng bộ của HCV cũng gây hậu quả khác nhau: đáp ứng với điều trị kháng siêu vi cũng khác nhau (thí dụ như genotype 1 và 4 có tính kháng interferon mạnh hơn genotype 2 và 3). Chính vì tính không đồng bộ của HCV, chúng ta cần triển khai sớm những phương cách điều trị mới, vaccines mới hiệu quả với tất cả các loại genotypes, dỉ nhiên cũng ảnh hưởng đến chẩn đoán. Mặc dù HCV có tính không đồng bộ nhưng chu trình tăng sinh phát triển của HCV trong tế bào gan lại rất giống nhau. 1

CHU TRÌNH TĂNG SINH CỦA HCV HCV là siêu vi nhỏ, có vỏ, mang RNA thuộc họ Flaviviridae, genus hepacivirus. Bộ gien của HCV là một dây RNA xoắn có một cực mang điện tích dương, được bao bọc bằng protein lỏi. Phần vỏ của HCV được hình thành bằng hai lớp lipid chứa glycoprotein E1 và E2, hình thành siêu vi toàn vẹn. Mặc dù chuổi nucleotides có khác nhau theo từng genotypes nhưng tất cả các genotypes của HCV đều có ái tính (hepatotropic) và gây bệnh (pathogenic) cho tế bào gan. Chu trình tăng sinh của HCV bắt đầu khi HCV bám vào các thụ thể chuyên biệt ở tế bào gan. Cho đến hôm nay, thụ thể có nồng độ lipoprotein cao lớp B, type 1 là tetraspanin và protein vùng bản lề là claudin-1 và occludin được xem là những thụ thể khởi động bước đầu để HCV bám vào tế bào gan và gây nhiễm trùng. Một khi bám được vào các thụ thể, siêu vi được đưa vào bên trong, phóng thích nucleocapsid vào tế bào chất. HCV cởi bỏ lớp vỏ (uncoating), để cho genomic RNA được tự do dịch mả và tăng sinh trong tế bào chất. HCV tăng sinh xảy ra trong các phức hợp tăng sinh (replication complex), chứa đựng các protein không cơ cấu (non-structural) của siêu vi và của tế bào gan. HCV tăng sinh được xúc tác (catalyzed) bằng NS5B. Vùng NTPase/helicase nằm ở protein NS3 co nhiều chức năng quan trọng trong tiến trình tăng sinh của HCV, bao gồm tác dụng của NTPase kích thích RNA, kết dính RNA, mở rộng vùng RNA của cấu tạo thứ cấp. NS4B khởi động hình thành phức hợp tăng sinh hổ trợ cho tiến trình tăng sinh của HCV. NS5B giử vai trò điều hòa quan trọng cho tiến trình tăng sinh của HCV. Các thuốc chống siêu vi có tác dụng trực tiếp (direct acting agents = DAA) mới được thiết kế chuyên biệt để ức chế polymerase ở vùng NS5B. Hiện nay nhiều loại DAAs mới ức chế NS5A đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiển lâm sàng. Một số yếu tố của tế bào cũng có liên quan đến tăng sinh của HCV như cyclophilin A, tương tác với NS5A, NS5B, microrna-122 hổ trợ HCV tăng sinh qua con đường kết dính với vùng không dịch mả 5 (5 UTR) của bộ gien HCV. Mặt khác nhiều yếu tố của ký chủ cũng là những mục tiêu tác dụng của các thuốc trong phác đồ chống HCV. Hiện tại có ít nhất là hai nhóm có tác dụng hướng vào mục tiêu là ký chủ (host targeting agents = HTA), ức chế chuyên biệt cyclophilin A và đối kháng với microrna-122. Bộ máy bài tiết/tổng hợp lipoprotein có tỉ trọng rất thấp cũng có liên quan đến việc hình thành hạt tử siêu vi. HCV sử dụng con đường sinh tổng hợp lipoprotein để tạo ra hạt tử siêu vi trưởng thành và tống xuất HCV ra khỏi tế bào. RNA TRONG BỘ GIEN CỦA HCV RNA trong bộ gien của HCV chứa ba vùng khác nhau: vùng 5 UTR (không mả hóa), một khung đọc mở (open reading frame = ORF) dài với hơn 9000 nucleotides (nt) và vùng 3 UTR. Vùng 5 UTR chứa 341 nt mang codon khởi động dịch mả (initiation codon) của ORF. Vùng 5 UTR cũng có mang một vị trí xâm nhập vào bên trong tế bào, hình thành một phức hợp tiền khởi động (pre-initiation complex) bằng cách kết dính với một tiểu đơn vị (subunit) 40S của ribosome giúp dịch mả polyprotein của HCV. ORF mả hóa polyprotein (khoảng 3000 acid amin), được thực hiện bằng protease của ký chủ và của siêu vi. Vùng 3 UTR chủ yếu liên quan đến priming xoắn mang điện tích âm trong quá trình tăng sinh của HCV. Thay đổi chuổi nucleotides xảy ra ở toàn thể bộ gien. Vùng 5 UTR là vùng hầu như không thay đổi, trong khi đó vùng mả hóa cho protein vỏ E1 và E2 lại thay đổi nhiều nhất. Vì vậy, vùng 5 UTR được sử dụng để phát hiện bộ gien HCV ở nhiều loại genotypes khác nhau. CÁC LOẠI PROTEIN CỦA HCV ORF mả hóa cho polyprotein, được protease của ký chủ và siêu vi thực hiện cùng lúc hoặc sau dịch mả, hình thành ít nhất 10 protein khác nhau theo thứ tự NH 2 -C-E1- E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B- 2

NS5A-NS5B-COOH. Peptidase của ký chủ rất cần cho sự tách rời ở các vị trí kết nối C-E1, E1-E 2, E2- p7 và p7-ns2. Peptidase của ký chủ cũng rất cần cho sự trưởng thành của các protein lỏi. Hai loại proteases của siêu vi có liên quan đến tiến trình hình thành protein không cơ cấu của HCV, đó là protease phụ thuộc kẽm (Zinc dependent protease) tách rời NS2 và NS3, NS3 và NS4A và serine protease tách rởi NS3 và NS4A, NS4A và NS4B, NS4B với NS5A, NS5A với NS5B. Phần lỏi là một polypeptide cố định không thay đổi, gồm 191 acid amin, bao kín bộ gien RNA, hình thành nucleocapsid của siêu vi. Protein lỏi có liên quan đến tiến trình sinh ung thư (hepatocarcinogenesis) và hóa mở (steatosis). Hai loại glycoprotein của lớp vỏ E1 (33-35 kda) và E2 (70-72 kda) được tập hợp thành heterodimer không đồng giá rất cần cho siêu vi xâm nhập vào tế bào gan. Không giống như protein lỏi, E2 chứa một vùng rất thay đổi, có chuổi acid amin khác nhau đến gần 80% giửa các dòng HCV phân lập được. Xét nghiệm miễn dịch men (enzyme immuno-assay = EIA) phát hiện kháng nguyên lỏi của HCV tốt hơn là protein vỏ, có thể đại diện cho một số siêu vi toàn vẹn. HCV. Thành phần p7 là polypeptide 63 acid amin tạo ra một kênh ion cần thiết cho một nhiễm trùng NS2 là một protein 21-23 kda xuyên qua màng rất cần để hoàn thành chu trình tăng sinh của HCV. Thành phần tận cùng N không thích nước (hydrophobe) của protein NS2 hình thành 3 hoặc 4 vòng xoắn được chèn vào màng của hệ lưới nội bào (endoplasmic reticulum = ER) trong khi đó vùng tận cùng C của protein NS2 lại giử vai trò quan trọng về hoạt tính protease NS2/3 cùng với vùng tận cùng N của NS3. Thành phần NS3 cũng là một polypeptide gồm 67 acid amin có nhiều chức năng. Vùng tận cùng N của NS3 có hoạt tính của serine protease và vùng tận cùng C lại có hoạt tính của NTPase/helicase. Protein NS3 kết dính với màng ER thông qua sự tương tác với protein NS4A. Hoạt tính NTPase/helicase rất cần thiết cho sự tăng sinh của HCV. NS4A là một polypeptide có 54 acid amin là đồng yếu tố với protein NS3. Tương tác giửa protein NS4A và NS3 làm bền vửng và gia tăng hoạt tính protease. Protease NS3/NS4A rất cần thiết để tách rời các protein không cơ cấu. Như vậy, đây có thể là mục tiêu tác dụng của nhiều phương cách điều trị chống HCV. Hiện nay chúng ta đã có những loại DAAs mới được thiết kế để ức chế protease NS3/NS4A. NS4A rất cần thiết cho tiến trình phosphoryl-hóa NS5A và có thể tương tác trực tiếp với NS5A. NS4B là một protein nhỏ, không ưa nước, 27 kda, tuyển mộ nhiều loại protein của các loại các loại siêu vi khác để hình thành phức hợp tăng sinh. NS5A là một phosphoprotein ưa nước, 56-58 kda cũng quan trọng trong tiến trình tăng sinh của HCV, nhưng vai trò cụ thể thế nào vẫn chưa được biết rõ. NS5B là một protein 65 kda. Đây là một loại polymerase phụ thuộc RNA, chịu trách nhiệm trong quá trình tổng hợp RNA mới. NS5B giử nhiệm vụ trung tâm cho phức hợp tăng sinh và đây cũng có thể là mục tiêu tác dụng của nhiều thuốc chống HCV hiện nay. Tóm lại, sau 20 năm nghiên cứu đã giúp chúng ta hiểu biết thêm về chu trình tăng sinh của HCV, đặc điểm của RNA và các loại protein, từ đó hình thành các công cụ nhạy cảm sử dụng trong chẩn đoán và hình thành các phương cách điều trị mới hữu hiệu hơn. ÁP DỤNG VÀO CHẨN ĐOÁN BỆNH VGSV C Mục đích của chẩn đoán là xác định bệnh nhân nhiễm HCV để điều trị. Như vậy, chẩn đoán rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tiến triển và hạn chế siêu vi lan rộng. Phần lớn trường hợp nhiễm HCV không có triệu chứng và điều này có nghĩa là triệu chứng không phải là chỉ điểm chuyên biệt để xác định nhiễm HCV. Nồng độ siêu vi trong máu vẫn hiện diện mặc dù ALT bình thường. Vì vậy, phương pháp siêu vi vẫn tốt hơn là ALT để chẩn đoán nhiễm HCV. 3

Nhìn chung, các phương pháp siêu vi, có thể trực tiếp hoặc gián tiếp đều có thể sử dụng trong chẩn đoán nhiễm HCV. Xét nghiệm gián tiếp phát hiện kháng thể do HCV gây ra, bao gồm IgM (nhiễm trùng đang hoặc mới xảy ra) và IgG (nhiễm trùng đã xảy ra trong quá khứ). Xét nghiệm trực tiếp bao gồm phân lập siêu vi, phát hiện kháng nguyên của HCV và xác định hiện diện của nucleic acid. Hiện tại, phân lập siêu vi rất khó thực hiện và không thể nuôi cấy được HCV trong các mẩu bệnh phẩm. IgM anti-hcv chỉ phát hiện được khoảng 50-93% và 50-70% bệnh nhân VGSV C cấp và mạn tính. Như vậy, IgM anti-hcv cũng không phải là chỉ điểm đáng tin cậy của nhiễm HCV cấp và không được sử dụng trong thực hành lâm sàng. Vì thế, trong thực hành lâm sàng chẩn đoán nhiễm HCV dựa vào kháng thể anti-hcv toàn phần, kháng nguyên lỏi của siêu vi và bộ gien RNA của HCV. Phát hiện kháng thể anti-hcv Thông thường, xét nghiệm huyết thanh tìm kháng thể anti-hcv bao gồm xét nghiệm tầm soát (screening) và xét nghiệm xác định (confirmation). Xét nghiệm tầm soát được thực hiện đầu tiên để xác định mẩu huyết thanh dương tính và sau đó xét nghiệm xác định để phân định mẩu huyết thanh dương tính thực sự. Xét nghiệm tầm soát EIA (enzyme immunoassay) Hiện nay, xét nghiệm EIA thế hệ thứ ba thường được sử dụng trong phần lớn phòng xét nghiệm vi sinh. Các loại kháng nguyên không đổi như kháng nguyên lỏi ủa HCV, NS3, NS4 và NS5 thường được sử dụng để phát hiện kháng thể. Độ nhạy và độ chuyên biệt của EIA thế hệ thứ ba vào khoảng 98,9% và 100% ở bệnh nhân mắc bệnh gan mạn tính. EIA diể sử dụng, tương đối rẻ. Mặt khác, xét nghiệm này hoàn toàn tự động và phù hợp với các phòng xét nghiệm có quá nhiều bệnh phẩm. EIA được đề nghị tầm soát nhiễm HCV. Tuy nhiên, xét nghiệm này không dùng để chẩn đoán nhiễm HCV cho trẻ < 18 tháng vì có phản ứng với kháng thể của mẹ. Thời gian cửa sổ đối với EIA thế hệ thứ ba (tính từ lúc nhiễm HCV đến khi phát hiện được kháng thể) vào khoảng 40 ngày. Vào năm 2008, EIA thế hệ thứ tư xuất hiện, có thể phát hiện kháng thể anti-hcv sớm hơn. Kháng nguyên được sử dụng trong EIA thế hệ thứ tư là kháng nguyên lỏi, NS3, NS4A, NS4B, NS5A. NS3 và NS4 có nguồn gốc từ HCV genotype 1a, 1b, 2 và 3. Xét nghiệm tầm soát nhanh, phục vụ chăm sóc điều trị bệnh nhân Nhóm xét nghiệm này được sử dụng ở những nơi chăm sóc bệnh nhân, không có phòng xét nghiệm vi sinh với độ nhạy và độ chuyên biệt tương đối cao. Vào năm 2010, FDA đã công nhận OraQuick HCV Antibody Test (OraSure Technologies, Bethlehem, PA), sử dụng cho bệnh nhân > 15 tuổi và tầm soát cho những người có nguy cơ nhiễm HCV. Xét nghiệm này có thể phát hiện được kháng thể trong nhiều loại bệnh nhẩm khác nhau: máu đầu ngón tay, máu tỉnh mạch, máu toàn phần, huyết thanh, huyết tương và cả trong dịch vùng miệng. Protein tái hợp hoặc peptide tổng hợp của phần lỏi, NS3, NS4 được làm bất động trên màng nitrocellulose, hình thành xét nghiệm miễn dịch gián tiếp, kết quả có thể nhìn trực tiếp dưới dạng những đường màu đỏ thẩm trong vòng 20-40 phút nếu như có hiện diện của kháng thể anti-hcv trong bệnh phẩm. Xét nghiệm này thích hợp cho những cơ quan y tế có ngân sách eo hẹp, vì rẻ tiền, đơn giản và cho kết quả nhanh chóng. Xét nghiệm xác định (recombinant immunoblot assays) RIBA (recombinant immnunoblot assays) có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện của kháng thể anti-hcv ở những người có kết quả (+) với EIA. Xét nghiệm này có độ chuyên biệt cao, vì kháng thể này có khả năng phản ứng với nhiều loại bprotein của HCV dựa vào từng băng trên một tấm màng (membrane strip). INNO-LIA HCV Score assay (Fujirebio Europe, trước đây của Innogenetics) có thể được tự động hóa, bao gồm protein tái hợp, peptides tổng hợp từ vùng thay đổi E2, NS3 helicase, NS4A, NS4B và NS5A. EIA có độ nhạy và độ chuyên biệt cao, nên RIBA không còn cần thiết trong phòng xét nghiệm để kiểm định lại. Vì vậy, xét nghiệm tìm nucleic acid lại quan trọng hơn là RIBA trong các xét nghiệm xác định nhiễm HCV. Xét nghiệm gián tiếp phát hiện kháng thể anti-hcv nhưng không phân biệt được 4

nhiễm trùng trong quá khứ và nhiễm trùng hiện tại. Nhiễm HCV đang xảy ra phải được xác định bằng các phương pháp chẩn đoán trực tiếp. Xét nghiệm phát hiện HCV RNA Dựa vào kỹ thuật phóng đại, xét nghiệm phóng đại nucleic acid (nucleic acid amplification tests = NATs) được chia làm hai loại: phóng đại theo mục tiêu (target amplification) và phóng đại tín hiệu (signal amplification) và phóng đại đầu dò (probe amplification). Phóng đại theo mục tiêu bao gồm phản ứng chuổi sao chép ngược (reverse transcription-polymerase chain reaction = RT-PCR), phóng đại quan trung gian chép mả (transcription-mediated amplification = TMA). Phóng đại tín hiệu có thể kể đến DNA phân nhánh (branched DNA = bdna), thường dùng để phát hiện HCV RNA. Định chuẩn nồng độ HCV RNA rất quan trọng, theo TCYTTG, xác định bằng đơn vị quốc tế (international unit). Vì vậy, hiện nay tất cả xét nghiệm HCV RNA trên thị trường đều sử dụng kỹ thuật này. Xét nghiệm HCV RNA định tính Xét nghiệm này dựa vào nguyên tắc của RT-PCR hoặc TMA. Hiện nay, có rất nhiều xét nghiệm HCV RNA định tính được FDA công nhận. HCV RNA được ly trích và chuyển đổi vào dây DNA bổ sung (comlementary DNA = cdna) bằng cách dùng reverse transcriptase. cdna được hình thành qua các phản ứng men tạo ra một số lượng lớn DNA xoắn đôi. Phát hiện các sản phẩm khuếch đại này bằng kỹ thuật lai (hybridizing) amplicon vào các đầu dò chuyên biệt. Thông thường, vùng 5 UTR không đổi là mục tiêu chọn lọc để phát hiện RNA ở nhiều loại genotypes khác nhau. Xét nghiệm HCV RNA định lượng HCV RNA có thể định lượng bằng kỹ thuật khuếch đại mục tiêu (RT-PCR thời gian thực hoặc TMA) hoặc khuếch đại tín hiệu (bdna). Hiện nay FDA đã công nhận nhiều xét nghiệm HCV RNA định lượng. RT-PCR thời gian thực là phương pháp chọn lọc để định lượng HCVRNA trong thực tế lâm sàng. Xét nghiệm này có độ nhạy cao với khoảng phát hiện rất rộng và có thể ngăn chận được các trường hợp bội nhiễm. HCV NAT hoàn toàn tự động được sử dụng tại Hoa Kỳ vào năm 2007 và các bảng hướng dẫn về điều trị đều yêu cầu xét nghiệm này vào năm 2010. Tuy nhiên, chúng ta cần nhớ rằng không phải tất cả genotypes của HCV đều được phát hiện giống nhau bằng các loại xét nghiệm NAT, vì đa số trường hợp có sự kết nối các nucleotides từ trước. HCV RNA được phát hiện sớm trong huyết thanh của bệnh nhân VGSV C cấp, trước khi xuất hiện kháng thể anti-hcv nhiều tuần lể. VGSV C mạn tính được xác định bằng sự hiện diện của HCV RNA kéo dài trên 6 tháng. NATs thường được dùng để xác định nhiễm HCV ở bệnh nhân có anti-hcv (+). Định lượng HCV RNA cũng được sử dụng trước và trong khi điều trị. Tuy nhiên, nồng độ HCV RNA không có giá trị tiên lượng, nồng độ này xác địng mức độ tăng sinh của HCV, không liên quan đến mức độ nặng của bệnh gan, cũng không liên quan đến diễn biến đến xơ gan và HCC. Xét nghiệm phát hiện kháng nguyên lỏi So với nhiều phương pháp chẩn đoán khác như EIA, xét nghiệm NAT có độ nhạy và độ chuyên biệt cao. Tuy nhiên, xét nghiệm này lại có nhiều bất lợi như mất thời gian, cần nhiều trang bị, nhân viên được huấn luyện, thuốc thử giá cao Ở bệnh nhân VGSV C có sự liên quan khá chặc chẽ giửa nồng độ kháng nguyên lỏi của HCV với HCV RNA thuộc nhiều genotypes khác nhau. Xét nghiệm định lượng kháng nguyên lỏi rẻ tiền, dễ sử dụng, có thể xem như phương pháp thay thế xét nghiệm NATs phát hiện HCV RNA. Hiện nay, kháng nguyên lỏi được phát hiện bằng xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang vi hạt (chemiluminescent microparticle immunoassays) của Abbott, hoàn toàn tự động. Xét nghiệm Architect phát hiện kháng nguyên lỏi của HCV có độ chuyên biệt 100% với giới hạn thấp khoảng 3 fmol/l, tương đương với khoảng 1000 IU/ml HCV RNA. Hiện tại, xét nghiệm HCV RNA phát hiện được mức thấp nhất vào khoảng 5-15 IU/ml. Tuy nhiên, khoảng 90% các mẩu bệnh phẩm có HCV RNA (+) với nồng độ > 10.000 IU/ml, nghỉa là trên độ nhạy của xét nghiệm kháng nguyên lỏi. Xét nghiệm kháng nguyên lỏi của 5

HCV có thể thực hiện sau xét nghiệm tầm soát anti-hcv (+). Hiện nay đang thực hiện nhiều xét nghiệm phối hợp anti-hcv với kháng nguyên lỏi của HCV. Hiện tại, EIA không đủ độ nhạy để phát hiện kháng nguyên lỏi nên được thay thế bằng xét nghiệm NAT để phát hiện HCV RNA trong các ngân hàng máu, cũng như trong điều trị theo các hướng dẫn cập nhật gần đây. Xét nghiệm kháng nguyên lỏi chỉ được đề nghị cho các cơ sở có nguồn tài chánh eo hẹp. Hiện tại, theo một số chuyên gia, xét nghiệm Architect tìm kháng nguyên lỏi của HCV có thể là một công cụ tốt để theo dõi bệnh nhân dùng các phác đồ DAA không cần đến interferon và những bệnh nhân này cũng không cần đến xét nghiệm có độ nhạy cao. Cách đọc và phân tích các xét nghiệm chẩn đoán Bệnh nhân được phát hiện có HCV RNA trong huyết thanh nhưng anti-hcv (-), xác định rõ ràng là nhiễm HCV cấp, có thể được xác định bằng chuyển đổi huyết thanh (xuất hiện anti-hcv dương) khoảng vài ngày đến vài tuần sau. Trường hợp này có thể gặp ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bệnh nhân chạy thận (hemodialysis) hoặc bệnh nhân agammaglobulinemia. Trong trường hợp bệnh nhân cùng có anti-hcv và HCV RNA, chúng ta không phân biệt được nhiễm HCV cấp với cơn bùng phát của nhiễm HCV mạn tính (acute exacerbation of CHC). Trường hợp này chúng ta có thể dùng anti-hcv avidity index trong vòng 8 ngày đầu kể từ khi có triệu chứng lâm sàng. Nếu như anti-hcv (+) nhưng không có HCV RNA, có thể là nhiễm HCV đã khỏi hoặc nhiễm HCV cấp nhưng nồng độ siêu vi lại quá thấp. Nếu HCV RNA vẫn âm tính kéo dài trên 6 tháng, bệnh nhân được xem là thoát khỏi nhiễm HCV trong quá khứ. Bệnh nhân có biểu hiện của một bệnh gan mạn tính, VGSV C mạn tính chắc chắn khi phát hiện được HCV RNA và anti-hcv (+). Xét nghiệm tìm genotypes Mỗi loại genotype của HCV có đáp ứng với điều trị khác nhau. Vì vậy xét nghiệm genotype rất quan trọng để dự đoán đáp ứng và xác định thời gian điều trị thích hợp. Phương pháp huyết thanh học. HCV genotype có thể xác định bằng cách phát hiện kháng thể chống lại các epitopes chuyên biệt cho từng genotypes theo phương pháp EIA cạnh tranh (competitive EIA). Xét nghiệm hiện nay là Murex serotyping 1-6 HCO2, Abbott Laboratoires, North Chicago, Illinois có thể phát hiện được 6 HCV genotypes, không phát hiện được các subtypes, cho kết quả không phân tích được trong gần 90% trường hợp nhiễm HCV mạn tính. Kỹ thuật sinh học phân tử. Phương pháp tham khảo để phát hiện HCV genotype là xác định chuổi genome của protein lỏi/e1 hoặc vùng NS5B. Phương pháp in-house hiện nay rất ít được thực hiện trong các phòng xét nghiệm tham khảo. Xét nghiệm HCV genotype đã được công nhận trong chẩn đoán, riêng xét nghiệm của Roche hướng vào vùng 5 UTR. Xét nghiệm này dựa vào phương pháp khuếch đại PCR truyền thống, sau kỹ thuật lai ngược (reverse hybridation) vào một màng nhỏ có chứa các đầu dò chuyên biệt. Một số xét nghiệm định hướng vào nhiều vùng khác cộng với 5UTR giúp chúng ta phân biệt genotype 1a với 1b. Xét nghiệm Versant HCV genotype của Siemens cũng dựa vào kỹ thuật lai ngược, hướng vào vùng lỏi và 5 UTR. Mặt khác xét nghiệm HCV genotype thời gian thực của Abbott lại hướng vào vùng NS5B và 5 UTR. Xét nghiệm xác định các subtypes Xét nghiệm xác định subtype rất quan trọng trong các nghiên cứu dịch tễ, nhất là khi có dịch, không được xem là cần thiết khi điều trị bằng peginterferon-α và ribavirin. Tuy nhiên, xác định subtype lại quan trọng khi điều trị bằng các phác đồ có DAAs. Thí dụ khi nghiên cứu điều trị bệnh nhân VGSV C bằng telaprevir, boceprevir, faldaprevir, simeprevir cho thấy tỉ lệ SVR thấp đối với HCV genotype 1a so 6

với 1b. Xét nghiệm thế hệ hai sử dụng 5 UTR và vùng lỏi có thể xác định chính xác 1a và 1b trong hơn 90% trường hợp và hiện nay xét nghiệm này đang được sử dụng trong lâm sàng. Xét nghiệm tầm soát người nhiễm HCV Theo TCYTTG gần 80% bệnh nhân VGSV C không có triệu chứng. Hầu hết người nhiễm HCV không được chẩn đoán. Các quan trọng nhất để chẩn đoán nhiễm HCV là tầm soát người có nguy cơ cao bằng anti-hcv. Người là nguồn dự trử chính của HCV. Lây nhiễm HCV quan trọng chủ yếu qua các tiếp xúc xuyên qua da với máu. Tuy nhiên, yếu tố nguy cơ lây nhiễm HCV thường gặp nhất là chích ma túy và truyền máu trước tháng 7/1992. Người có yếu tố nguy cơ nhiễm HCV thấp là người được ghép tạng trước năm 1992, người có truyền yếu tố đông máu trước năm 1987, con của người có mẹ bị nhiễm HCV, bệnh nhân có chạy thận (hemodialysis), người hút hít ma túy qua đường mủi, người có xâm mình, người có quan hệ tình dục với người nhiễm HCV, người bị kim đâm (dính máu chứa HCV), người có ALT tăng kéo dài TCYTTG đề nghị nên thực hiện đầu tiên anti-hcv EIA cho những người có hành vi nguy cơ cao, không nên chờ đợi đến khi có triệu chứng, tiếp theo là xét nghiệm NAT tìm HCV RNA cho những ai có anti-hcv (+). CDC cũng đề nghị tầm soát nhiễm HCV cho người có nguy cơ nhiễm HCV từ năm 1998. Đến năm 2012, đề nghị này được chỉnh sửa gồm xét nghiệm nhiễm HCV một lần cho công dân Hoa Kỳ sinh nào những năm 1945 đến 1965, không phụ thuộc vào yếu tố nguy cơ. ÁP DỤNG VÀO ĐIỀU TRỊ Vào khoảng 50-80% bệnh nhân VGSV C cấp tính diễn tiến sang VGSV C mạn tính, 5-25% số bệnh nhân này được ghi nhận xơ gan sau 20-25 năm. Bệnh nhân xơ gan có nguy cơ bị bệnh gan giai đoạn cuối cũng như HCC. Mục đích của điều trị VGSV C mạn tính bằng thuốc chống siêu vi là ngăn chận diễn tiến bệnh, ngăn chận xơ gan mất bù và HCC. Tuy nhiên, thực sự rất khó khăn khi thiết kế các nghiên cứu lâm sàng để biết rõ diễn tiến bệnh. Đáp ứng siêu vi lâu dài (sustained virologic responses = SVR) được định nghĩa là không phát hiện nồng độ HCV RNA ít nhất 24 tuần sau khi hoàn tất chương trình điều trị. Hiện tại, SVR là kết điểm xác định điều trị thành công, liên quan đến việc loại bỏ lâu dài HCV. Bệnh nhân VGSV C nào đạt được SVR ít có nguy cơ tử vong hơn bệnh nhân không đạt SVR. Vì vậy, hiện nay SVR được xem là chỉ điểm chuẩn xác định điều trị thành công trong các nghiên cứu lâm sàng. Hình 1 Các loại protein của HCV và vị trí tác dụng của một số thuốc chống HCV Vào đầu thế kỷ 21, phối hợp pefinterferon và ribavirin trở thành điều trị chuẩn bệnh VGSV C. Tuy nhiên, peginterferon lại có bất lợi: chích mỗi tuần một lần, nhiều tác dụng phụ (mệt mõi, sốt, ) và không phải là thuốc điều trị lý tưởng. Chính vì vậy, rất cần thiết phải phát triển ra nhiều thuốc mới hiệu quả và an toàn hơn. Dựa vào chu trình tăng sinh phát triển của HCV, bao gồm kết dính với các thụ thể, endocytosis, cởi bỏ lớp vỏ (uncoating), dịch mả, tổng hợp polyprotein, tăng sinh RNA, tập hợp và phóng thích siêu vi đều là mục tiêu tác dụng của nhiều thuốc mới. Tiến bộ về hiểu biết về chu trình tăng sinh 7

phát triển của HCV là tiền đề tạo ra nhiều thuốc loại có tác dụng trực tiếp trên siêu vi (direct acting agents = DAAs) mới hiệu quả và dễ dung nạp. Vào năm 2011, FDA đã công nhận boceprevir và telaprevir, hai loại DAAs đầu tiên. Cả hai loại thuốc này là thuốc ức chế NS3/4A protease, có thể rút ngắn thời gian điều trị còn 24-28 tuần (phối hợp với peginterferon và ribavirin), so với điều trị chuẩn 48 tuần đối với HCV genotype 1. Vào năm 2013, FDA lại công nhận thêm một loại DAA thứ ba, simeprevir (ức chế NS3/4A protease). Cũng vào năm 2013, FDA công nhận sofosbuvir (ức chế NS5B), phối hợp với ribavirin để điều trị HCV genotype 2 và 3. Phác đồ ba thuốc sofosbuvir, peginterferon và ribavirin có thể dùng trong điều trị bệnh nhân VGSV C chưa điều trị, do HCV genotype 1 và 4. Phác đồ có sofosbuvir kéo dài 12 tuần đối với HCV genotype 1, 2, 4 và 24 tuần đối với genotype 3. Như vậy vào năm 2013, các thuốc điều trị VGSV C gồm peginterferon, ribavirin, boceprevir, telaprevir và sofosbuvir. Nếu không đưa kinh phí vào việc xem xét điều trị, hướng dẫn của TCYTTG đưa ra như sau: peginterferon + ribavirin tốt hơn là phác đồ không interferon + ribavirin, boceprevir/ telaprevir + peginterferon + ribavirin tốt hơn là peginterferon + ribavirin đối với HCV genotype 1, sofosbuvir + ribavirin, có hoặc không có peginterferon tùy theo genotype, được đề nghị cho HCV genotype 1, 2, 3 và 4, tốt hơn là peginterferon + ribavirin, simeprevir + peginterferon + ribavirin được đề nghị cho bệnh nhân VGSV C do HCV genotype 1a (không có đa hình Q80K), tốt hơn là peginterferon + ribavirin. Hình 2 Vị trí tác dụng của các loại thuốc ức chế NS5B Mặc dù hiện nay đã có nhiều phác đồ thuốc uống, không cần đến peginterferon, tuy nhiên peginterferon phối hợp với sofosbuvir và ribavirin vẫn còn hữu ích đối với HCV genotype 3, nhất là khi bệnh nhân bị xơ gan. Vì vậy, đánh giá bệnh nhân trước khi điều trị bằng phác đồ có peginterferon rất cần thiết và phức tạp, như HCV genotype, giai đoạn bệnh gan, tình trạng tâm thần kinh (nghiện rượu, lệ thuộc vào ma túy, mức độ tuân thủ), bệnh kèm theo, thai kỳ, IL28B. Trong quá trình điều trị, cần lưu ý đến tác dụng phụ như thiếu máu, giảm bạch cầu, phản ứng ngoài da, tăng acid uric, bilirubin Kháng thuốc được định nghĩa là chọn lọc các biến thể siêu vi (resistant-associated variants) làm giảm tác dụng của các thuốc chống HCV. Biến thể kháng thuốc xuất hiện một cách tự nhiên trong quá trình tăng sinh của HCV. Hiện nay, chưa có xét nghiệm nào trên thị trường phát hiện được các biến thể này trước và trong khi điều trị, chỉ có một cách duy nhất là theo dõi bùng phát nồng độ HCV RNA (tăng 10 lần so với lần trước đó) trong quá trình điều trị bằng thuốc chống HCV. Trong quá trình điều trị, HCV RNA định lượng được đề nghị thực hiện vào tuần 4, 8 (phác đồ có boceprevir), 12, 24 và khi kết thúc điều trị. Tiếp theo vào lúc 24 tuần sau khi kết thúc điều trị. Theo dõi nồng độ siêu vi rất quan trọng để phát hiện kháng thuốc và điều này giúp chúng ta điều chỉnh liều lượng và thời gian điều trị. Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị với phác đồ có peginterferon được chia làm hai nhóm: yếu tố liên quan đến siêu vi và yếu tố liên quan đến ký chủ. Yếu tố liên quan đến siêu vi bao gồm HCV genotype, nồng độ HCV RNA ban đầu, đáp ứng siêu vi trong quá trình điều trị. Yếu tố liên quan đến ký chủ gồm tuổi, phái, sắ tộc, giai đoạn xơ hóa, gan nhiễm mỡ, nồng độ cholesterol (LDL-C), kháng insulin, 8

IL28B. Điều trị VGSV C thay đổi rất dử dội theo thời gian, nhất là các phác đồ DAAs không cần đến peginterferon, vì vậy rất cần thiết phải xác định vai trò của những yếu tố liên quan đến siêu vi và ký chủ với hiệu quả của các phác đồ DAAs không có peginterferon. Đầu năm 2014, nhiều báo cáo công bố hiệu qủa của các phác đồ có DAAs mới như phối hợp simeprevir với sofosbuvir đối với HCV genotype 1 (hiệu quả cao, dễ dung nạp), phối hợp daclatasvir (ức chế NS5A) với asunaprevir (ức chế NS5A/4A protease) đối với HCV genotype 1b, kể cả xơ gan. Phối hợp dasabuvir (ức chế NS5B) với các loại DAAs khác cho tỉ lệ SVR khoảng 95% với độ an toàn và dung nạp cao cho bệnh nhân VGSV C do HCV genotype 1, phối hợp paritaprevir (ức chế NS3/4A), ritonavir, ombitasvir và dasabuvir cho kết quả khoảng 90-95% cho bệnh nhân chưa điều trị và cả bệnh nhân đã điều trị, phác đồ có sofosbuvir cũng hiệu quả đối với bệnh nhân đồng nhiễm HIV/HCV, sofosbuvir + peginterferon + Ribavirin có hiệu quả đối với HCV genotype 1, 4, 5, 6 Vào tháng 10/2014, FDA công nhận phối hợp sofosbuvir với ledipasvir (ức chế NS5A) cho bệnh nhân VGSV C do HCV genotype 1. Ngoài các loại DAAs, một số thuốc có tác dụng vào ký chủ (hosttargeting agents = HTAs) cũng được phát triển. Những thuốc này tác dụng vào các protein cố định, không tác dụng trên protein thay đổi nên có tiềm năng chống lại hầu hết các genotypes. Tuy nhiên, mãi đến hôm nay, chỉ có hai loại thuốc được nghiên cứu lâm sàng, đó là thuốc ức chế cyclophillin A peptidyl-prolyl cis/trans isomerase và thuốc đối kháng với microrna-122. Từng bước đi của DAAs và/hoặc là HTA trong nghiên cứu lâm sàng rất ngoạn mục. Phối hợp tối ưu nhiều loại DAAs và/hoặc là HTA sẽ tăng tối đa hiệu quả, giảm đến mức tối thiểu kháng thuốc và độc tính, hy vọng sẽ xuất hiện sớm trong thời gian gần đây. Một khi phác đồ có DAAs phát huy tác dụng, vai trò của peginterferon càng lúc càng nhỏ dần. Vì vậy, từ năm 2015, phác đồ có DAAs với thời gian điều trị ngắn, ít tác dụng phụ nên phác đồ có peginterferon chỉ còn sử dụng ở các đơn vị có nguồn tài chánh eo hẹp vì giá thành của DAAs còn quá cao. Bệnh nhân VGSV C được điều trị và đạt SVR, nguy cơ tử vong giảm > 50% so với người không đạt SVR. Điều cần lưu ý là một ít bệnh nhân dù đạt được SVR nhưng vẫn diễn tiến sang bệnh gan giai đoạn cuối. Như vậy, kết quả điều trị chỉ dựa vào SVR thì chưa hoàn toàn chính xác. Hiện nay, với những phác đồ mới không cần đến peginterferon cho tỉ lệ chữa khỏi > 95%. Tuy nhiên, điều trị vẫn còn một số bất lợi cần quan tâm: kháng thuốc, hiệu quả có thể thay đổi theo từng HCV genotype và nhất là giá thành còn quá cao. Vì vậy, không phải bệnh nhân nào mắc VGSV C cũng được chữa khỏi. Điều đáng tiếc là chúng ta chưa có thuốc chủng ngừa hiệu quả và đây mới là thử thách của y học hiện nay và nhiều năm sắp tới. Bs NGUYỄN HỮU CHÍ dịch từ Li HC, Lo SY. Hepatitis C: Virology, diagnosis and treatment. World J Hepatol 2015;7:1377-1389 9