Οι χρωματομετρικές αναλύσεις της κλασικής κλινικής χημείας

Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Συμπληρωματικές σημειώσεις εργαστηρίου κλινικής χημείας Ι και ΙΙ Οι χρωματομετρικές αναλύσεις της κλασικής κλινικής χημείας ΠΕΤΡΟΣ Λ. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ Βιολόγος Msc, PhD, EurClinChem Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ AΤΕΙ ΑΘΗΝΩΝ Έκδοση Τέταρτη ΑΘΗΝΑ 2014

Πρόλογος Οι βιοχημικές αναλύσεις είναι οι συχνότερες αναλύσεις που γίνονται στα ιατρικά εργαστήρια, μαζί με την γενική αίματος και την γενική ούρων. Στην κατηγορία «βιοχημικές αναλύσεις» ανήκει ένας πολύ μεγάλος αριθμός ποσοτικών προσδιορισμών από τους οποίους οι σημαντικότερες αναφέρονται σε αυτές τις σημειώσεις. Όλες οι αναλύσεις που αναφέρονται εδώ ανήκουν στην κατηγορία που είναι γνωστές ως «χρωματομετρικές» ή «φωτομετρικές» αναλύσεις. Παλαιότερα εκτελούνταν με ένα μόνο απλό όργανο το φωτόμετρο. Σήμερα όμως εκτελούνται πλέον σε αυτόματους βιοχημικούς αναλυτές. Παρόλα αυτά η γνώση των μεθοδολογιών με την βοήθεια του φωτομέτρου είναι ακόμα και σήμερα χρήσιμη για να κατανοήσει κανείς τον τρόπο λειτουργίας αυτών των αυτόματων μηχανημάτων. Έτσι, ο χρήστης γνωρίζοντας τον τρόπο λειτουργίας των αυτόματων αναλυτών μπορεί να παρέμβει αποτελεσματικά όταν υπάρχουν τεχνικά προβλήματα και έτσι να βοηθήσει στην γρήγορη εξουδετέρωσή τους. Οι παρούσες σημειώσεις αποτελούν μια εισαγωγή στις φωτομετρικές αντιδράσεις όπου δίνονται βασικοί ορισμοί και περιγράφονται οι βασικές γνώσεις που θα πρέπει να γνωρίζει κάποιος που θέλει να ασχοληθεί με τους βιοχημικούς αναλύσεις όχι απλά ως χρήστης αλλά ως είναι καλό γνώστης της λειτουργίας τους. Οι σημειώσεις αυτές αποτελούν εισαγωγή στη χρωματομετρική ανάλυση. Στο φυλλάδιο «βιοχημικοί αναλυτές» ο αναγνώστης θα βρει πολύ περισσότερες λεπτομέρειες για τις χρωματομετρικές αναλύσεις. Αθήνα 2014 Καρκαλούσος Πέτρος Βιολόγος PhD, EurClinChem Στατιστικολόγος Msc Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων petef@teiath.gr users.teiath.gr/petef 2

Εισαγωγή Το βιοχημικό εργαστήριο αποτελεί μαζί με το αιματολογικό εργαστήριο και το εργαστήριο καλλιεργειών τα τρία τμήματα πρώτης γραμμής σε κάθε εργαστήριο. Γι αυτό τον λόγο άλλωστε τα δύο πρώτα βρίσκονται στα τμήματα επειγόντων περιστατικών (ΤΕΠ). Μεταξύ των πολλών εξετάσεων που διενεργεί σήμερα ένα σύγχρονο βιοχημικό εργαστήριο την πρώτη θέση σε σημασία και ποσότητα κατέχουν σήμερα οι κλασικές βιοχημικές αναλύσεις που είναι σήμερα γνωστές και ως «βιοχημικές εξετάσεις». Οι εξετάσεις αυτές διενεργούνται σήμερα σε αυτόματους βιοχημικούς αναλυτές, μπορούν όμως και να γίνουν και σε απλά φωτόμετρα. Οι εξετάσεις αυτές είναι οι εξής: Γλυκόζη Χοληστερόλη GOT/AST ALP Ολική πρωτεΐνη Σίδηρος Ουρία Τριγλυκερίδια GPT/ALT Μg Αλβουμίνη Ασβέστιο Ουρικό οξύ HDL-χοληστερόλη LDH K Ολική χολερυθρίνη Φώσφορος Κρεατινίνη LDL-χοληστερόλη γ-gt Na Άμεση χολερυθρίνη Αμυλάση Οι χρωματομετρικές αναλύσεις Οι χρωματομετρικές αναλύσεις είναι οι προσδιορισμοί που βασίζονται στην μέτρηση της έντασης του χρώματος που προκαλείται από μία χημική αντίδραση στην οποία συμμετέχει η προς προσδιορισμό ουσία. Η ονομασία «χρωματομετρικές» οφείλεται σε αυτή ακριβώς την δημιουργία χρώματος. Μία απλή φωτομετρική διάταξη 3

Μία απλή χρωματομετρική διάταξη λειτουργεί ως εξής: Το φως που παράγεται από μια απλή λυχνία περνάει μέσα από μία διάταξη φίλτρων. Tα φίλτρα είναι μια σειρά από μικρά έγχρωμα γυαλιά, τα οποία αλλάζουν αυτόματα από τον αναλυτή, φιλτράρουν το φως και επιτρέπουν να βγει από αυτά φως συγκεκριμένου μήκους κύματος 1. Το τελευταίο περνά μέσα από την κυψελίδα όπου βρίσκεται ένα έγχρωμο διάλυμα. Εκεί ένα μέρος του φωτός απορροφάται από το διάλυμα. Το υπόλοιπο φως βγαίνει από αυτό και μετράται με κατάλληλο φωτοανιχνευτή. Η διαφορά μεταξύ του φωτός που εισέρχεται στο διάλυμα και αυτού που βγαίνει ισούνται με την απορρόφηση του φωτός (Α) η οποία μπορεί να υπολογιστεί και από τον παρακάτω τύπο, γνωστό και ως νόμο του Lambert-Beer: A = α b C Όπου: A: η απορρόφηση. Δεν έχει μονάδες μέτρησης, είναι καθαρός αριθμός. α: η απορροφητικότητα (σταθερός αριθμός που εξαρτάται από το μήκος κύματος και διαφέρει για κάθε ουσία). b: η απόσταση που διανύει το φως μέσα στην κυψελίδα. C: η συγκέντρωση της μετρούμενης ουσίας. Μετράται σε mg/dl ή moles/l (SI). Υπάρχουν πολλοί τρόποι φωτομετρικών μετρήσεων στους βιοχημικούς αναλυτές. Ο απλούστερος από αυτούς είναι η μέτρηση τελικού σημείου. Παρακάτω θα περιγραφούν οι σχετικές μεθοδολογίες. Φωτομετρία ενζυματικές αντιδράσεις Η μεγάλη πλειοψηφία των χρωματομετρικών αναλύσεων χρησιμοποιούν ένζυμα για να επιταχυνθούν οι χημικές αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις αυτές ονομάζονται ενζυμικές. Η πορεία τους θα αναλυθεί εδώ. Ας πάρουμε για παράδειγμα τον προσδιορισμό της γλυκόζης. Αυτή πραγματοποιείται με την βοήθεια δύο ενζύμων, την οξειδάση (συμβολίζεται GOD) και την υπεροξειδάση (συμβολίζεται POD) τα οποία καταλύουν τις ακόλουθες αντιδράσεις. Στις χημικές αντιδράσεις που χρησιμοποιούνται στη κλινική χημεία συνήθως η πρώτη είναι μία χημική αντίδραση 1 Τo μήκος κύματος (συμβολίζεται διεθνώς με το Ελληνικό γράμμα λ) είναι μια περιορισμένη περιοχή της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας η οποία περιλαμβάνει το ορατό φως αλλά και αόρατες στο μάτι ακτίνες όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οι ακτίνες Χ, τα ραδιοκύματα κ.α. Μετράται σε νανόμετρα (nm). 4

που έτσι και αλλιώς γίνεται στον οργανισμό ενώ η δεύτερη έχει δημιουργηθεί από τους επιστήμονες. GOD Γλυκόζη + Ο 2 + Η 2 Ο Γλυκονικό οξύ + Η 2 Ο 2 2Η 2 Ο 2 + 4-αμινοφεναζόνη + p-υδροβενζοικό οξύ POD κινόνη + 4 Η 2 Ο Κατά την διάρκεια της αντίδρασης το αρχικό «υπόστρωμα» 2 των δύο ενζυματικών αντιδράσεων (η β-d-γλυκόζη) μειώνεται σταδιακά ενώ παράλληλα αυξάνει το τελικό προϊόν (η κινόνη). Η διάρκεια της αντίδρασης ονομάζεται «χρόνος επώασης» και εκτελείται σε συγκεκριμένη θερμοκρασία π.χ. στους 37 ο C. Το προϊόν της αντίδρασης, η κινόνη, είναι μια ουσία κόκκινου χρώματος η οποία αυξάνει διαρκώς με αποτέλεσμα το διάλυμα της αντίδρασης κατά την διάρκεια της επώασης να γίνεται όλο και περισσότερο κόκκινο. Όσο πιο κόκκινο είναι το διάλυμα στο τέλος της επώασης, τόσο περισσότερο κινόνη περιέχει και κατά συνέπεια τόσο περισσότερο β-d-γλυκόζη υπήρχε αρχικά. Ενζυμικές αντιδράσεις σαν αυτές του παραδείγματος χωρίζονται σε τρία στάδια: το αρχικό στάδιο, το κινητικό στάδιο και το στάδιο ισορροπίας. Ας δούμε πως λειτουργούν τα στάδια αυτά στην δεύτερη ενζυμική αντίδραση προσδιορισμού της γλυκόζης όπου το υπόστρωμα είναι το υπεροξείδιο του υδρογόνου H 2 O 2 και το προϊόν η κινόνη. Φάση Ι. Αρχικό στάδιο. Το «αρχικό» στάδιο είναι μια σύντομη περίοδος στην αρχή του χρόνου όπου η ενζυματική αντίδραση πραγματοποιείται αργά. Στην φάση αυτή υπάρχει πολύ υπόστρωμα και (H 2 O 2 ) και λίγο προϊόν (κινόνη). Φάση ΙΙ. Κινητικό στάδιο. Στην συνέχεια η αντίδραση πραγματοποιείται εξαιρετικά γρήγορα. Στη φάση αυτή η συγκέντρωση του υποστρώματος (H 2 O 2 ) μειώνεται και η συγκέντρωση του προϊόντος (κινόνη) αυξάνει ταχύτατα. Το στάδιο αυτό ονομάζεται «κινητικό». Mόνο στο στάδιο αυτό ισχύει ο νόμος Lambert-Beer (A = α b C). Φάση ΙΙΙ. Στάδιο ισορροπίας. Ακολουθεί το στάδιο ισορροπίας όπου ολόκληρη η ποσότητα του υποστρώματος (H 2 O 2 ) έχει καταναλωθεί και η ποσότητα του προϊόντος έχει φτάσει στη μέγιστη συγκέντρωση. Μόλις φτάσει η ενζυμική αντίδραση στο στάδιο ισορροπίας η συγκέντρωση του προϊόντος θα παραμείνει σταθερή (κινόνη) όσο και να παραταθεί περαιτέρω η επώαση. 2 Η ουσία(ες) που ενώνεται με το ενεργό κέντρο του ενζύμου και καταναλώνεται κατά την διάρκεια της αντίδρασης. Στα εργαστήρια πολλές φορές το αναφέρουμε με το Αγγλικό όνομα (Substrate). 5

Περιληπτικά τα στάδια μιας χρωματομετρικής ανάλυσης όπου παριστάνεται η μεταβολή της συγκέντρωσης της μετρούμενης ουσίας σε σχέση με το χρόνο. Εδώ μετράται η συγκέντρωση ενός προϊόντος και για αυτό η συγκέντρωση του αυξάνει με τον χρόνο. Θα μπορούσε να συμβεί το αντίθετο δηλαδή η ουσία που μετράμε να βρίσκεται στα αντιδρώντα οπότε η συγκέντρωσή της να μειώνεται με τον χρόνο. Σχέση Απορρόφησης και Διαπερατότητας H σχέση απορρόφησης και διαπερατότητας (transmittance) ισούνται με: A = 1/log(T). Τα φωτόμετρα μετρούν και απορρόφηση και διαπερατότητα αλλά συνήθως χρησιμοποιείται η απορρόφηση όπως σε αυτό το κείμενο. Οι κατηγορίες των χρωματομετρικών αναλύσεων Οι χρωματομετρικές αναλύσεις διακρίνονται σε τρεις μεγάλες κατηγορίες, τις αναλύσεις «τελικού σημείου», τις αναλύσεις «σταθερού χρόνου» ή «κινητικές δύο σταδίων» και τις «κινητικές». Μεταξύ τους έχουν διαφορές αλλά και ομοιότητες. Πρώτα από όλα θα πρέπει να αναφερθεί ότι οι χρωματομετρικές αναλύσεις εκτός από τα δείγματα των ασθενών χρειάζονται και άλλα δύο διαλύματα τα οποία είναι γνωστά ως «λευκό» δείγμα και «πρότυπο» δείγμα (βλ. παρακάτω). Οι διαφορές των τριών αυτών χρωματομετρικών αναλύσεων είναι οι ακόλουθες: 1. Μέτρηση «τελικού σημείου» (End point). Στη μέτρηση αυτή η απορρόφηση του δείγματος του ασθενούς μετράται μόνο μία φορά αφού προηγηθεί συγκεκριμένος χρόνος επώασης (βλ. παρακάτω). Με τέτοιες αναλύσεις προσδιορίζονται η γλυκόζη, η χοληστερόλη, η ουρία και γενικά διάφορες οργανικές ενώσεις που ονομάζονται υποστρώματα σε αντιδιαστολή με τα ένζυμα. 6

Για την μέτρηση τελικού σημείου εκτός από το δείγμα χρησιμοποιείται «λευκό» και «πρότυπο». 2. Μέτρηση «σταθερού χρόνου ή κινητική δύο σταδίων» (Fixed time). Στη μέτρηση αυτή η απορρόφηση του δείγματος μετράται δύο φορές σε συγκεκριμένα σημεία που βρίσκονται στην αρχή και στο τέλος του κινητικού σταδίου της ενζυμικής αντίδρασης. Σε αυτή την περίπτωση στον υπολογισμό της συγκέντρωσης του δείγματος χρησιμοποιείται η διαφορά των δύο απορροφήσεων (βλ. παρακάτω). Για την μέτρηση «σταθερού χρόνου εκτός από δείγμα χρειάζεται και «πρότυπο». Η μέτρηση «σταθερού χρόνου» έχει περιορισμένη σχετικά εφαρμογή και χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό της κρεατινίνης. 3. Μέτρηση «κινητική» (Kinetic). Στη μέτρηση αυτή η απορρόφηση του δείγματος μετράται αρκετές φορές συνήθως κατά την διάρκεια του κινητικού σταδίου της αντίδρασης. Στον υπολογισμό της συγκέντρωσης του δείγματος χρησιμοποιείται η μέση διαφορά μεταξύ διαδοχικών απορροφήσεων (βλ παρακάτω). Στις κινητικές μετρήσεις δεν χρειάζονται λευκό και πρότυπο δείγμα. Χρησιμοποιούνται αποκλειστικά για τον προσδιορισμό της ενεργότητας των ενζύμων (π.χ. GOT, GPT, ALP κ.α.). Η απλή μέθοδος των τριών και ο νόμος Lambert-Beer Ο νόμος Lambert-Beer είναι A = αbc. H απορρόφηση έχει γραμμική σχέση 3 με την συγκέντρωση αλλά παρόλα αυτά δεν μπορούμε να ξέρουμε την συγκέντρωση παρά μόνο την απορρόφηση την οποία μετρά το φωτόμετρο. Η συγκέντρωση είναι άγνωστη γιατί δεν γνωρίζουμε την σχέση Απορρόφησης/Συγκέντρωσης η οποία είναι διαφορετική για κάθε μετρούμενη ουσία και αναλυτική μέθοδος. Η σχέση Απορρόφησης/Συγκέντρωσης ονομάζεται Συντελεστής Προσδιορισμού ή απλούστερα Συντελεστής (στα Αγγλικά Factor) και υπολογίζεται με απλή μέθοδο των τριών με ένα πρότυπο δείγμα. Το πρότυπο περιέχει την ίδια ουσία με αυτή που θέλουμε να μετρήσουμε αλλά είναι γνωστής συγκέντρωσης. Έστω λοιπόν ότι η απορρόφηση του προτύπου είναι Α std και η συγκέντρωση του είναι C std καθώς επίσης η απορρόφηση του δείγματος είναι Α sample και του προτύπου A standard. Κάνουμε απλή μέθοδο των τριών για να βρούμε την συγκέντρωση του δείγματος, δηλαδή: 3 Γραμμική σχέση μεταξύ δύο μεγεθών σημαίνει ότι όταν αυξάνει το ένα μέγεθος αυξάνει και το άλλο ή αντίθετα όταν μειώνεται το ένα μέγεθος μειώνεται και το άλλο, κάθε φορά με μία σταθερή σχέση. 7

H απορρόφηση του προτύπου Α std αντιστοιχεί σε συγκέντρωση Cs td H απορρόφηση του δείγματος A sample τι συγκέντρωση έχει; (x). Άρα: Επειδή η συγκέντρωση του προτύπου είναι δεδομένη και δεν αλλάζει αλλά και επειδή την απορρόφηση του προτύπου την μετράμε μία φορά την αρχή των αναλύσεων το κλάσμα έχει σταθερή τιμή και για αυτό ονομάζεται συντελεστής πολλαπλασιασμού (factor). Tην σημασία του την αναλύσαμε προηγουμένως και στη πράξη είναι η σταθερή τιμή με την οποία θα πολλαπλασιάζονται στο εξής οι απορροφήσεις κάθε δείγματος προκειμένου να υπολογιστεί η συγκέντρωση τους. To πρότυπο δείγμα ή αλλιώς Standard Το «πρότυπο» δείγμα 4 είναι ένα διάλυμα που περιέχει συγκεκριμένη ποσότητα της προς προσδιορισμό ουσίας. Η ποσότητα αυτή έχει μετρηθεί με πρότυπες μεθόδους στο εργοστάσιο παρασκευής του. Παρόλο όμως που έχει συγκεκριμένη ποσότητα μιας ή και περισσότερων ουσιών υπάρχει μία μικρή διακύμανση σε αυτή την τιμή η οποία ονομάζεται «αβεβαιότητα βαθμονομητή». Εκφράζεται σε ποσοστό πχ 2% και συνοδεύει την τιμή του προτύπου. Το πρότυπο δείγμα βρίσκεται σε ξεχωριστό περιέκτη από τα αντιδραστήρια της ανάλυσης και μπορεί να είναι σε υγρή μορφή ή σκόνη. Αν είναι σε σκόνη τότε θα πρέπει να ανασυσταθεί με την προσθήκη κατάλληλου διαλύτη ή απλού αποσταγμένου νερού. H απορρόφηση του πρότυπου δείγματος μετράται μαζί με την απορρόφηση του δείγματος του ασθενούς. Η τιμή της συγκέντρωσης (C πρότυπο ) και της απορρόφησης του προτύπου (Α πρότυπο ) χρησιμοποιούνται για την μετατροπή της απορρόφησης του δείγματος (Α δείγμα ) σε συγκέντρωση (C δείγμα ) βάση συγκεκριμένου τύπου (βλ. παρακάτω). Οι κρίσιμες τιμές απορρόφησης (όριο ανίχνευσης, όριο ποσοτικοποίησης, όριο γραμμικότητας) Ο νόμος Lambert-Beer δεν ισχύει καθ όλη τη διάρκεια εξέλιξης της χρωματομετρικής αντίδρασης δηλαδή μέχρι να εξαντληθεί το υπόστρωμα. Αντίθετα ισχύει 4 Το «πρότυπο» δείγμα (Αγγλικά: Standard) ονομάζεται επίσης και βαθμονομητής (Αγγλικά: Calibrator). 8

μόνο στο κινητικό στάδιο. Μόνο σε αυτό το στάδιο ισχύει ο τύπος A = α b C δηλαδή η γραμμική σχέση y = α x ή αλλιώς C = α A. H γραμμική σχέση ξεκινά από το λεγόμενο «όριο ποσοτικοποίησης» και τελειώνει στο τελικό σημείο. Τιμή συγκέντρωσης κάτω από το όριο ποσοτικοποίησης δεν δίνεται σε ασθενή. Το όριο ποσοτικοποίησης είναι η τιμή της απορρόφησης όπου αυτή «ποσοτικοποιείται» δηλαδή μετατρέπεται σε συγκέντρωση. Άλλο σημαντικό σημείο πάνω στην καμπύλη Απορρόφηση/Χρόνος είναι το όριο ανίχνευσης. Πρόκειται για εκείνη την τιμή απορρόφησης όπου το φωτόμετρο διακρίνει ότι μέσα στο διάλυμα υπάρχει κάποια ουσία με απορρόφηση μεγαλύτερη από το τυφλό. Το όριο ανίχνευσης είναι μικρότερο από το όριο ποσοτικοποίησης και λίγο μεγαλύτερο από το τυφλό. Η απορρόφηση του τυφλού ισούνται με την απορρόφηση που έχει το διάλυμα αντίδρασης σε χρόνο μηδέν, δηλαδή αμέσως μόλις έρθει σε επαφή το δείγμα με το αντιδραστήριο εργασίας. Ενώ το όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης είναι το ίδιο σε όλες τις αναλύσεις που γίνονται με την ίδια μέθοδο το τελικό σημείο διαφέρει. Κάθε εξεταζόμενος έχει διαφορετικό τελικό σημείο ανάλογα με την συγκέντρωση της ουσίας στον οργανισμό του. Δεν είναι δυνατόν όμως το τελικό σημείο να πάρει άπειρες τιμές. Υπάρχει ένα όριο στη τιμή της συγκέντρωσης που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί από την μία τιμή απορρόφησης, δηλαδή ο νόμος Lambert-Beer ισχύει μέχρι ένα συγκεκριμένο ύψος απορρόφησης. Η τιμή αυτής της συγκέντρωσης λέγεται «όριο γραμμικότητας». Αναλυτικά η εξέλιξη της τιμής της απορρόφησης σε σχέση με το χρόνο. Κατά τη διάρκεια του κινητικού σταδίου ισχύει ο νόμος Lambert-Beer δηλαδή η απορρόφηση είναι ανάλογη της 9

συγκέντρωσης. Το κινητικό στάδιο ξεκινά από το όριο ποσοτικοποίησης και τελειώνει στο τελικό σημείο. Η καμπύλη αναφοράς Απλοποιημένη καμπύλη αναφοράς η οποία ξεκινά από το σημείο μηδέν. Η εφαπτομένη της γωνίας φ Στις χρωματομετρικές αναλύσεις η καμπύλη αναφοράς είναι μία ευθεία γραμμή. Αντιστοιχεί μόνο στο κινητικό στάδιο της καμπύλης απορρόφησης προς την μεταβολή του χρόνου. Ξεκινά από το μηδέν ή κοντά στο μηδέν όπου βρίσκεται η απορρόφηση (κοντά στο μηδέν) και η συγκέντρωση του τυφλού (πάντα μηδέν) και τελειώνει σε ένα δεύτερο σημείο που αντιπροσωπεύει την απορρόφηση (A std ) και την συγκέντρωση του προτύπου (C std ). Στις χρωματομετρικές αναλύσεις αποτελείται δηλαδή από δύο σημεία που αντιστοιχούν στην μηδενική συγκέντρωση και τη συγκέντρωση του πρότυπου. H γραμμή αυτή είναι ευθεία και όταν είναι η απορρόφηση του τυφλού μηδέν ισούνται με y = αx όπου y είναι η συγκέντρωση και x η απορρόφηση. Δηλαδή: C = α Α. Όταν η απορρόφηση του τυφλού δεν είναι μηδέν τότε η εξίσωση ισούνται με: y = αx+β. Το β είναι η απορρόφηση του τυφλού και μπορεί να έχει θετική ή αρνητική τιμή ανάλογα με το αν είναι πάνω ή κάτω από τον οριζόντιο άξονα. Οπότε ισχύει: C = α Α + Α blank. Και στις δύο περιπτώσεις το α είναι η κλίση της γωνίας φ η οποία ισούνται με την εφαπτομένη της γωνίας φ. Στα Αγγλικά το α ονομάζεται slope (κλίση) και έχει όπως θα δούμε δύο έννοιες: 1. Ισούνται με την εφαπτομένη της γωνίας που σχηματίζει η καμπύλη αναφοράς με τον οριζόντιο άξονα όπου βρίσκονται οι τιμές απορρόφησης. 10

Δηλαδή ή αλλιώς 2. Ισούνται με τον συντελεστή πολλαπλασιασμού (factor) με τον οποίο πολλαπλασιάζονται οι απορροφήσεις των δειγμάτων προκειμένου να υπολογιστούν οι συγκεντρώσεις τους. = Δηλαδή η κλίση (α) ισούνται με τον συντελεστή πολλαπλασιαμού (factor) που γνωρίσαμε προηγουμένως. Στην πράξη δηλαδή με την κλίση υπολογίζονται όλες οι τιμές προκειμένου να υπολογιστεί η συγκέντρωση του δείγματος. To α ονομάζεται και κλίση ή slope και αντιστοιχεί στον συντελεστή (factor) της μεθόδου. Το β ονομάζεται τομή ή intercept και αντιστοιχεί στο σταθερό συστηματικό σφάλμα της μεθόδου. Τυπικά το α είναι 1 και το β είναι 0. Συνήθως όμως το α είναι διαφορετικό από το 1, κοντά όμως σε αυτό π.χ. 1,2, 0,98 και το β είναι λίγο μεγαλύτερο ή μικρότερο π.χ. 0,012. Πιο ρεαλιστική καμπύλη αναφοράς είναι αυτή που αναφέρεται παρακάτω. Όριο γραμμικότητας και καμπύλη αναφοράς Στις χρωματομετρικές αναλύσεις η καμπύλη αναφοράς είναι ευθεία γραμμή που παριστάνεται γραφικά σε ένα διάγραμμα όπου στον κάθετο άξονα βρίσκεται η συγκέντρωση και στον οριζόντιο η απορρόφηση C = f(a). Ξεκινά από την απορρόφηση του ορίου ποσοτικοποίησης και τελειώνει στο όριο γραμμικότητας. Το τελικό σημείο της απορρόφησης κάθε εξεταζομένου είναι πάντοτε μικρότερο από το όριο γραμμικότητας. Αν η τιμή απορρόφησης ή συγκέντρωσης ενός εξεταζομένου είναι υψηλότερα από το όριο γραμμικότητας τότε κάνουμε αραίωση του δείγματος και νέα μέτρηση. 11

Εύρος μέτρησης και τι κάνουμε αν το υπερβούμε Το εύρος μέτρησης (measuring range ή MR) δίνει στον εργαστηριακό επιστήμονα τη συνολική δυνατότητα μέτρησης μιας αναλυτικής μεθόδου. Το κατώτερο όριο είναι το όριο ποσοτικοποίησης και το ανώτερο το όριο γραμμικότητας π.χ. 0,8 600 mg/dl. Όταν η συγκέντρωση ενός δείγματος είναι μικρότερη από το όριο ποσοτικοποίησης δεν δίνεται στον ασθενή. Αντιθέτως δίνεται ως μικρότερη του ορίου ποσοτικοποίησης π.χ. < 0,8 mg/dl. Όταν η συγκέντρωση ενός δείγματος είναι μεγαλύτερη από το όριο γραμμικότητας, ομοίως δεν δίνεται στον ασθενή. Σε αυτή την περίπτωση γίνεται αραίωση του δείγματος και ξανα-αραίωση του δείγματος. Το τελικό αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί την αραίωση. Π.χ. αν η συγκέντρωση στο προηγούμενο παράδειγμα είναι 800 mg/dl γίνεται αραίωση ½. Η νέα συγκέντρωση έστω ότι είναι 415 mg/dl. Τότε η συγκέντρωση του ασθενούς είναι 415 x 2 = 820 mg/dl. 12

Το τυφλό και οι τρεις χρήσεις του To «λευκό» δείγμα 5 είναι διάλυμα που περιέχει όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στην μέθοδο. Το μόνο που δεν περιέχει είναι δείγμα ασθενούς. Στη θέση του δείγματος του ασθενούς χρησιμοποιείται συνήθως ίση ποσότητα αποσταγμένου νερού. Ονομάζεται «λευκό» επειδή δεν περιέχει δείγμα ασθενούς και η απορρόφησή του είναι πολύ μικρή σχεδόν μηδενική. Μηδενισμός φωτομέτρου. Στις δια χειρός μεθόδους (manual methods) χρησιμοποιείται για το μηδενισμό του φωτομέτρου δηλαδή για την αφαίρεση της απορρόφησης του δείγματος όλων των απορροφήσεων που οφείλονται στα συστατικά της αντιδρώσας ουσίας και της ίδιας της κυβέττας. Στο παράδειγμα με τον προσδιορισμό της γλυκόζης η απορρόφηση του τυφλού ισούνται: A blank = A p-υδροβενζοικό οξύ + Α αμινοφαιναζόνη + Α POD + A GOD + A νερό + Α γλυκονικό οξύ + Α κυβέττα Η απορρόφηση αυτή αφαιρείται από όλες τις μετρήσεις. Δείκτης ποιότητας. Μία άλλη χρήση του τυφλού είναι ως δείκτης ποιότητας της χρωματομετρικής μεθόδου. Ιδανικά η απορρόφηση του τυφλού ισούνται με το μηδέν. Αυτό όμως δεν συμβαίνει σχεδόν ποτέ. Έχει πάντα μία έστω και μικρή απορρόφηση. Οι κατασκευαστές της αναλυτικής μεθόδου μπορεί να δώσουν μία τιμή απορρόφησης για το τυφλό η οποία λειτουργεί ως όριο ποιότητας. Αν το τυφλό υπερβεί αυτή την τιμή (π.χ. 0,2) κατά πάσα πιθανότητα η κυβέττα είναι πολύ βρώμικη και πρέπει να αντικατασταθεί. Έναρξη καμπύλης αναφοράς. Tέλος η απορρόφηση του τυφλού αποτελεί την έναρξη της καμπύλης αναφοράς πάνω στον κάθετο άξονα της συγκέντρωσης. Δηλαδή το τυφλό είναι το σημείο β της εξίσωσης y = αx ή όπως αλλιώς ετοιμάζεται η τομή ή intercept. Χρωματομετρική ανάλυση «τελικού σημείου» Η αντίδραση «τελικού σημείου» όταν διενεργείται σε απλό φωτόμετρο 6 αποτελείται από τα ακόλουθα στάδια: 5 Το «λευκό» δείγμα (Αγγλικά: blank) ονομάζονταν παλαιότερα στην Ελληνική βιβλιογραφία «τυφλό» όρος που χρησιμοποιείται όμως ακόμα και σήμερα. 6 Μπορεί να γίνει και σε αυτόματο βιοχημικό αναλυτή. 13

1. Χρησιμοποιούνται τρία σωληνάρια για την δημιουργία τριών διαλυμάτων. Το πρώτο είναι το δείγμα (sample), το δεύτερο το λευκό (blank) και το τρίτο το πρότυπο (standard). Σε όλα τα σωληνάρια τοποθετείται από ίση ποσότητα αντιδραστηρίου. Στο σωληνάριο του δείγματος τοποθετείται συγκεκριμένη ποσότητα δείγματος του ασθενούς. Στο σωληνάριο του προτύπου τοποθετείται αντί δείγματος ίση ποσότητα προτύπου ουσίας και στο σωληνάριο του λευκού τοποθετείται ίση ποσότητα αποσταγμένου νερού. Η σειρά τοποθέτησης των σωληναρίων στο φωτόμετρο είναι Λευκό Πρότυπο Δείγμα ή δείγματα. 2. Και τα τρία διαλύματα αναδεύονται καλά σε vortex και επωάζονται σε υδατόλουτρο για συγκεκριμένο χρόνο. 3. Μετά το τέλος του χρόνου επώασης μετράται η απορρόφηση και των τριών διαλυμάτων σε φωτόμετρο του οποίου η οπτική μονάδα έχει ρυθμιστεί σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. 4. Η συγκέντρωση του δείγματος (C δείγματος ) υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο: Όπου: Δεδομένου δε ότι μηδενίζουμε με το τυφλό ο τύπος κανονικά θα πρέπει να συμπεριλάβει και την τιμή του δηλαδή: Τα στάδια της ενζυμικής αντίδρασης κατά την μέτρηση τελικού σημείου. Στο διάγραμμα εξετάζεται η περίπτωση όπου η ένταση του χρώματος αυξάνεται όσο εξελίσσεται η ενζυμική αντίδραση. 14

Τα στάδια της ενζυμικής αντίδρασης κατά την μέτρηση τελικού σημείου. Στο διάγραμμα εξετάζεται η περίπτωση όπου η ένταση του χρώματος ελαττώνεται όσο εξελίσσεται η ενζυμική αντίδραση. O λόγος φυσικά είναι ότι η έγχρωμη ουσία που μετράμε βρίσκεται στα αντιδρώντα. Αντίστοιχη εικόνα παρουσιάζεται και κατά την εξέλιξη των χρωματομετρικών αναλύσεων των τύπων «σταθερού χρόνου» και «κινητικής ανάλυσης». Χρωματομετρική ανάλυση «σταθερού χρόνου» Η ανάλυση «σταθερού χρόνου» όταν διενεργείται σε απλό φωτόμετρο αποτελείται από τα ακόλουθα στάδια. 1. Χρησιμοποιούνται δύο σωληνάρια για την δημιουργία δύο διαλυμάτων, το δείγμα και το πρότυπο. Και τα δύο περιέχουν από ίση ποσότητα αντιδραστηρίου. Η διαφορά τους είναι ότι το σωληνάριο του δείγματος περιέχει συγκεκριμένη ποσότητα δείγματος ενώ το σωληνάριο του προτύπου ίση ποσότητα προτύπου ουσίας. 2. Και τα δύο διαλύματα αναδεύονται καλά σε vortex και επωάζονται σε υδατόλουτρο ίσο χρόνο. 3. Στην αρχή του χρόνου επώασης γίνεται μία πρώτη μέτρηση της απορρόφησης Α αρχ και στο τέλος του χρόνου επώασης μία δεύτερη μέτρηση της απορρόφησης Α τελ. Οι μετρήσεις αυτές γίνονται τόσο στο δείγμα όσο και στο πρότυπο. 4. Η συγκέντρωση του δείγματος (C sample ) υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο: 15

Όπου: C sample : η συγκέντρωση του δείγματος C standard : η συγκέντρωση του προτύπου Α 1sample : η πρώτη απορρόφηση του δείγματος Α 1standarde : η πρώτη απορρόφηση του προτύπου Α 2sample : η δεύτερη απορρόφηση του δείγματος Α 2standard : η δεύτερη απορρόφηση του προτύπου Τα σημεία μέτρησης σταθερού χρόνου κατά την διάρκεια της ενζυμικής αντίδρασης «Κινητική» χρωματομετρική ανάλυση H «κινητική» χρωματομετρική ανάλυση όταν διενεργείται σε απλό φωτόμετρο αποτελείται από τα ακόλουθα στάδια. 1. Χρησιμοποιείται ένα μόνο σωληνάριο το οποίο περιέχει συγκεκριμένη ποσότητα αντιδραστηρίου και δείγματος. 2. Το διάλυμα αναδεύεται καλά σε vortex και επωάζεται σε υδατόλουτρο συγκεκριμένο χρόνο. 3. Στην αρχή του χρόνου επώασης γίνεται η πρώτη μέτρηση της απορρόφησης Α 1 για να ακολουθήσουν τουλάχιστον άλλες δύο Α 2 και Α 3 σε απόσταση 16

συνήθως ενός λεπτού η μία από την άλλη. Όλες οι μετρήσεις γίνονται στο λεγόμενο «κινητικό» στάδιο της ενζυμικής αντίδρασης. 4. Η δραστικότητα του δείγματος (C sample ) υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο: 5. Όπου: Activity δείγματος : η συγκέντρωση του δείγματος ΔΑ/min: η μέση διαφορά της απορρόφησης μεταξύ των διαδοχικών μετρήσεων (Α 1, Α 2, Α 3 ) ανά λεπτό. Factor: o συντελεστής πολλαπλασιασμού της ΔΑ/min ο οποίος έχει να κάνει με το πάχος της κυβέττας, τον όγκο του δείγματος και του αντιδραστηρίου και τις μονάδες μέτρησης. Οι τρεις μετρήσεις οπτικής απορρόφησης Α 1, Α 2, Α 3 σε διαφορετικούς χρόνους t 1, t 2, t 3 στις κινητικές χρωματομετρικές μεθόδους. Οι κινητικές μέθοδοι γίνονται για τον προσδιορισμό των ενζύμων. Πρόκειται για ενζυμικές μέθοδους (όπως άλλωστε και οι μέθοδοι και για τους υπόλοιπους αναλύτες) όπου άλλα ένζυμα χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των ενζύμων που θέλουμε. Πρόκειται φυσικά για τις ενζυμικές χημικές αντιδράσεις που γίνονται και στον οργανισμό. Έχει επικρατήσει οι μέθοδοι αυτοί να παίρνουν το όνομα της επιστημονικής εταιρείας που έφτιαξε την μέθοδο. Οι μέθοδοι αυτοί διαφέρουν κυρίως στη διαφορετική θερμοκρασία επώασης. Αυτές οι επιστημονικές εταιρείες είναι οι ακόλουθες: SSCC = Scandinavian Federation of Clinical Chemistry SFBC = Société Française de Biologie Clinique 17

IFCC = International Federation of Clinical Chemistry DGKC = Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie Συνήθως στην Ελλάδα χρησιμοποιούνται οι μέθοδοι της IFCC (37 ο C). Όπως φαίνεται και από την προηγούμενη εξίσωση στις κινητικές μεθόδους δεν προσδιορίζεται η συγκέντρωση αλλά η δραστικότητα ή αλλιώς η ενεργότητα (activity) του ενζύμου. Η δραστικότητα αντιστοιχεί στη κατανάλωση του υποστρώματος του ενζύμου από το ένζυμο στη μονάδα του χρόνου. Η μονάδα αναφοράς της ενεργότητας είναι η IU/L ή U/L. Μία διεθνής μονάδα (IU ή πιο απλά U) είναι η ποσότητα του ενζύμου που καταλύει 1 μmol υποστρώματος σε 1 min. Τα ένζυμα βαθμονομούνται; Εδώ θα πρέπει να τονιστεί ότι τα τελευταία χρόνια υπάρχει μία σημαντική αλλαγή στον προσδιορισμό των ενζύμων. Παλαιότερα και σε πολλές περιπτώσεις - ακόμα και σήμερα - δεν υπήρχαν πρότυπα για τον προσδιορισμό των ενζύμων (σε αντίθεση δηλαδή με τον προσδιορισμό των υποστρωμάτων). Τον ρόλο του ενζύμου τον είχε ο Factor ο οποίος είναι πάντα ένας σταθερός αριθμός. Σήμερα όμως υπάρχουν πρότυπα και για τις κινητικές μεθόδους. Tα πρότυπα (standards) μετρώνται με κινητική μέθοδο (τρεις μετρήσεις ανά λεπτό) όπως και τα δείγματα. Η ενεργότητα του προτύπου Activity std είναι γνωστή, υπολογίζεται επομένως η μέση διαφορά απορρόφησης των τριών διαδοχικών απορροφήσεων του προτύπου. μόνο η ΔΑ std από τις τρεις μετρήσεις απορρόφησης. Πριν από κάθε μέτρηση μηδενίζεται το φωτόμετρο. Στη συνέχεια για κάθε δείγμα υπολογίζεται η ΔΑ sample. H ενεργότητα κάθε δείγματος υπολογίζεται στη συνέχεια από τον παρακάτω τύπο: ή sample Activity sample Activity std std Activity sample Activity std sample 18

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ Γλυκόζη (Glucose) Διαγνωστική αξία Η γλυκόζη αυξάνει στο αίμα κυρίως στον σακχαρώδη διαβήτη (τύπου Ι και ΙΙ), αλλά και σε άλλες παθήσεις όπως είναι οι διαταραχές της υπόφυσης και των επινεφριδίων (ορμονικές διαταραχές), σε παθήσεις του παγκρέατος (επειδή στο πάγκρεας παράγεται η ινσουλίνη) αλλά και μετά ένεση αδρεναλίνης, καταπληξία, εγκαύματα κ.α. Ελάττωση της γλυκόζης παρατηρείται όταν υπάρχει περίσσεια ινσουλίνης, ηπατική νόσος (σε οξείες λοιμώξεις, ιογενή ηπατίτιδα, δηλητηριάσεις) κ.α. Αρχή μεθόδου Μέθοδος Ι: GOD/POD Η πιο διαδεδομένη μέθοδος προσδιορισμού της γλυκόζης είναι η μέθοδος της οξειδάσης που χρησιμοποιείται ακόμα και στις ταινίες ούρων. Οξειδάση της γλυκόζης Γλυκόζη + Ο 2 + Η 2 Ο Γλυκονικό οξύ + Η 2 Ο 2 2Η 2 Ο 2 + φαινόλη + 4-αμινοαντιπυρίνη Υπεροξειδάση κινόνη + 4 Η 2 Ο Tελικού σημείου. λ = 510 nm. Μέθοδος ΙΙ: Εξοκινάσης Άλλη μέθοδος είναι αυτή της εξοκινάσης Eξοκινάση (HK) Γλυκόζη + ATP γλυκόζη-6-p + ADP Γλυκονικό οξύ + Η 2 Ο 2 G6P-DH γλυκόζη-6-p + NAD + γλυκονικό-6-p + NADH + Η + Tελικού σημείου. λ = 340 nm. 19

Δείγμα Ορός, πλάσμα, ούρα, ΕΝΥ. Ο ορός ή το πλάσμα πρέπει να διαχωρίζονται από τα ερυθρά όσο γίνεται πιο σύντομα για εμποδιστεί η γλυκόλυση και η μείωση της τιμής της γλυκόζης. Ο εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός τουλάχιστον 8 ώρες. Η μέτρηση της γλυκόζης στο ΕΝΥ θα πρέπει να γίνεται αμέσως γιατί η τιμή της γλυκόζης πέφτει πολύ γρήγορα. Τιμές αναφοράς Ορός: 70 105 mg/dl Ούρα: 0 0,5 g/24h ENY: 40 70 mg/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,0555 mmol/l Ουρία (Urea) Διαγνωστική αξία Η ουρία (NH 2 CONH 2 ) του αίματος αυξάνει στους φυσιολογικούς ανθρώπους αυξανομένου του περιεχομένου της πρωτεΐνης (π.χ. κρέας) στη δίαιτα. Για τον λόγο αυτό μειώνεται κατά την διάρκεια της εγκυμοσύνης. Επιπλέον αυξάνει όταν υπάρχει αυξημένος καταβολισμός (δηλαδή καταστροφή) των πρωτεϊνών π.χ. στον πυρετό και στην σηψαιμία. Ιδιαίτερα όμως επικίνδυνη είναι η αύξηση της ουρίας προκαλούμενη από προβλήματα του νεφρού. Συγκεκριμένα η ουρία του αίματος αρχίζει να αυξάνει όταν χαθεί το ισοδύναμο ενός νεφρού (νεφρική ανεπάρκεια). Η ουρία του αίματος αυξάνει επίσης σε αποφράξεις του ουροποιητικού αλλά και στο έμφραγμα του μυοκαρδίου. Μέθοδος: GIDH GLDH (Σταθερού χρόνου) Αρχή μεθόδου Ουρεάση NH 2 CONH 2 + 2Η 2 Ο 4NH 4 + + CO 3 2- Γλουταμινική δευδρογενάση 2-οξογλουταρικό οξύ + 2NH 4 + + 2NADH 2ΝΑD + + 2Η 2 Ο + (GLDH) + 2-L-γλουταμινικό Μέθοδος σταθερού χρόνου. Λαμβάνονται δύο μετρήσεις σε απόσταση 1 min. λ = 340 nm 20

Μέθοδος: o-φαινυλοφθαλδεύδης 23 ο CGLDH (σταθερού χρόνου) Αρχή μεθόδου NH 2 CONH 2 + o-φαινυλοφθαλδεύδη Η + Ισοινδόλη Μέθοδος σταθερού χρόνου. Λαμβάνονται δύο μετρήσεις σε απόσταση 1 min. λ = 510 nm Μέθοδος: Berthelot Αρχή μεθόδου Ουρεάση NH 2 CONH 2 + 2Η 2 Ο 4NH 4 + + CO 3 2-4NH 4 + + σαλυκιλικό οξύ + NaClO νιτροπρωσσικό ινδοφαινόλη Μέθοδος τελικού σημείου. λ = 580 nm Δείγμα Ορός ή πλάσμα (το μόνο αντιπηκτικό που δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί είναι το ηπαρινισμένο αμμώνιο). O ορός ή πλάσμα συντηρούνται για 4 ημέρες στους 2 8 ο C ή για 3 μήνες -20 ο C. Η μέτρηση της ουρίας μπορεί να γίνει και σε φυγοκεντρημένα ούρα μετά από αραίωση. Τιμές αναφοράς Ορός: 10 50 mg/dl Oύρα 24h: 19 36 g/24h Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,357 mmol/l Ουρικό οξύ (UA) Μέθοδος: Uricase/POD Διαγνωστική αξία 21

Το ουρικό οξύ προέρχεται από τον καταβολισμό των νουκλεϊνικών οξέων (DNA). Φυσιολογικά το ουρικό οξύ αυξάνει μετά από βαριά άσκηση, νηστεία και δίαιτα πλούσιο σε λίπος. Μειώνεται στην φυσιολογική εγκυμοσύνη. Παθολογικά το ουρικό οξύ αυξάνει όταν υπάρχει μεγάλη καταστροφή των νουκλεινικών οξέων (π.χ. πνευμονία) αλλά και στην λευχαιμία. Επιπλέον αυξάνει όταν υπάρχει νεφρική νόσος, δηλαδή μειωμένη επαναρρόφηση του ουρικού οξέος από τα νεφρικά σωληνάρια, καθώς και στην ουρική αρθρίτιδα. Αυξάνει επίσης στην στεφανιαία αρτηριακή νόσο, στην δηλητηρίαση από μόλυβδο, στην αιμολυτική αναιμία κ.α. Αρχή μεθόδου Ουρικάση ουρικό οξύ + Ο 2 + Η 2 Ο αλλαντοίνη + CO 2 + H 2 O 2 2Η 2 Ο 2 + 4-αμινοφαιναζόνη + 2,4,6 διβρωμο-3-υδροξυβενζοικό οξύ (AP) (DCPS) Υπεροξειδάση + κινόνη + 4H 2 O Tελικού σημείου. λ = 510 nm Δείγμα Μη αιμολυμένος ορός ή πλάσμα. Το ουρικό οξύ παραμένει σταθερό στον ορό για τρείς ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου και για έξι μήνες στην κατάψυξη. Αν το ουρικό οξύ μετρηθεί στα ούρα θα πρέπει να θερμανθεί στους 60 ο C για 10 λεπτά για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι ουρικού οξέος. Τιμές αναφοράς Ορός: Άνδρες: 3,8 7,2 mg/dl Γυναίκες: 2,2 6,0 mg/dl Ούρα 24h: 250 750 mg/24h Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,059 mmol/l 22

Κρεατινίνη (CREAT) Διαγνωστική αξία Η κρεατινίνη σχηματίζεται από την κρεατίνη (συστατικό των μυών) και διαχέεται ελεύθερα δια μέσου του νερού του σώματος. Ως ουσία είναι ένα προϊόν άχρηστο, η μέτρηση της όμως στον αίμα και στα ούρα δίνει πολύτιμες πληροφορίες για την λειτουργία του νεφρού. Φυσιολογικά αυξάνει μετά λήψη κρεατινίνης (π.χ. ψητό κρέας). Παθολογικά αυξάνει όταν υπάρχει υπερβολική σωματική αύξηση (π.χ. στον γιγαντισμό και στην μεγαλακρία) αλλά και στην νεφρική ανεπάρκεια. Για κάθε 50% ελάττωση στο ρυθμό της σπειραματικής διήθησης, η κρεατινίνη του ορού διπλασιάζεται. Μέθοδος Ι: Jaffé σε πικρικό Αρχή μεθόδου NaOH Κρεατινίνη + πικρικό οξύ ερυθρό σύμπλοκο Κινητική μέθοδος δύο σημείων. λ = 492 nm. Μέθοδος ΙI: Ενζυματική Αρχή μεθόδου A στάδιο Κρεατίνη + H 2 O Σαρκοσίνη + H 2 O + O 2 Kρεατινάση SOD Ουρία + Σαρκοσίνη Γλυκίνη + HCHO + H 2 O Kαταλάση 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 B στάδιο Κρεατινίνη + H 2 O Κρεατίνη + H 2 O Σαρκοσίνη + H 2 O + O 2 Kρεατινάση Kρεατινάση SOD Ουρία + Σαρκοσίνη Ουρία + Σαρκοσίνη Γλυκίνη + HCHO + H 2 O 2H 2 O 2 +Trinder POD έγχρωμο προϊόν 23

Tελικού σημείου. λ = 545 nm Δείγμα Ορός μη αιμολυμένος, πλάσμα με ηπαρίνη ή EDTA ή ούρα αραιωμένα κατά 1/100. Ο ορός ή πλάσμα αποχωρίζεται αμέσως και συντηρείται για 5 ημέρες στη ψύξη ή για 3 μήνες στην κατάψυξη. Ο εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός πριν την αιμοληψία τουλάχιστον 2 ώρες. Τα ούρα διατηρούνται στην κατάψυξη για 2 μήνες. Τιμές αναφοράς Ορός ή πλάσμα (οι τιμές αναφοράς εξαρτώνται από την επιφάνεια του σώματος): Άνδρες: 0,80 1,30 mg/dl Γυναίκες: 0,60 1,10 mg/dl Ούρα: 3 8 ετών: 110 680 mg/24h 9 12 ετών: 170 1410 mg/24h 13 178 ετών: 300 1800 mg/24h Ενήλικες άνδρες: 800 1800 mg/24h Ενήλικες γυναίκες: 600 1600 mg/24h Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 88,4 mmol/l Tριγλυκερίδια (TG ή Trig) Μέθοδος: GPO Διαγνωστική αξία Η μέση τιμή των τριγλυκεριδίων είναι υψηλότερη στους Δυτικούς βιομηχανοποιημένους πληθυσμούς. Τα επίπεδά τους είναι φυσιολογικά αυξημένα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Παθολογικά τα τριγλυκερίδια αυξάνονται: στη παχυσαρκία, στη μεγάλη λήψη οινοπνεύματος, στη λήψη αντισυλληπτικών, στους βαρείς καπνιστές, στο σακχαρώδη διαβήτη, στη νεφρική νόσο, στο οξύ stress, στη ηπατική νόσο, στη δυσπρωτειναιμία, στη οικογενή υπερτριγλυκεριδαιμία κ.α. Μείωση παρατηρείται σε νόσους όπως στη α-βηταλιποπρωτειναιμία. 24

Αρχή μεθόδου τριγλυκερίδια Λιποπρωτεινική λιπάση γλυκερόλη + λιπαρά οξέα Κινάση της γλυκερόλης γλυκερόλη + ΑΤΡ 3-φωσφορική γλυκερόλη + ADP γλυκερολ-3-φωσφορική οξειδάση 3-φωσφορική γλυκερόλη + O 2 Η 2 Ο 2 + φωσφορικήδιυδροξυακετόνη Υπεροξειδάση Η 2 Ο 2 + 4-αμινοαντιπυρίνη + 4-χλωροφαινόλη κινόνη + 4 H 2 O Tελικού σημείου. λ = 500 nm Δείγμα O εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός για 12 ώρες πριν την αιμοληψία καθώς επίσης να απέχει από τη λήψη αλκοολούχων ποτών για 3 ημέρες. Ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη ή EDTA. Το δείγμα παραμένει σταθερό στους -20 o C για ένα χρόνο, για μία εβδομάδα στην συντήρηση (-4 έως -8 o C) και για δύο ημέρες στη θερμοκρασία δωματίου. Τιμές αναφοράς Φυσιολογικό: 0 150 mg/dl Μέσος κίνδυνος: 150 200 mg/dl Υψηλός κίνδυνος: 200 400 mg/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,0113 mmol/l Oλική Χοληστερόλη (Chol) Μέθοδος: CΕ/CO Διαγνωστική αξία Η χοληστερόλη του ορού σχετίζεται ευθέως προς τον ρυθμό σύνθεσης των λιποπρωτεινών που μεταφέρουν τη χοληστερόλη (HDL, LDL). H χοληστερόλη βρίσκεται σε δίαιτες με πολύ ζωικό λίπος ή δίαιτες με κεκορεσμένο φυτικό λίπος που οδηγούν σε αύξηση της χοληστερόλης του ορού. Εκτός από την διατροφή άλλα αίτια αύξησης της 25

χοληστερόλης είναι: o αποφρακτικός ίκτερος, η ηπατίτιδα, η νεφρική νόσος, η παγκρεατική νόσος, η νόσος του θυρεοειδούς κ.α. Φυσιολογικά αυξάνεται στην εγκυμοσύνη. Ελάττωση της χοληστερόλης παρατηρείται στην ηπατική νόσο, στην ασιτία, στην στεατόρροια, στην αναιμία, στην ανεπάρκεια φυλλικού, στην αιμοφιλία κ.α. Αρχή μεθόδου εστέρας χοληστερόλης + Η 2 Ο Εστεράση χοληστερόλης χοληστερόλη + λιπαρά οξέα Οξειδάση χοληστερόλης χοληστερόλη + Ο 2 χοληστ-4-εν-3-όνη + Η 2 Ο 2 2Η 2 Ο 2 + 4-αμινοαντιπυρίνη + φαινόλη Υπεροξειδάση κινόνη + 4Η 2 Ο Mέθοδος τελικού σημείου. λ = 510 nm. CE: Cholesterol Esterase: Ολική χοληστερόλη, CO: Cholesterol Oxidase: Οξειδάση χοληστερόλης Δείγμα O εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός για 12 ώρες πριν την αιμοληψία. Επίσης πρέπει να βρίσκεται σε σταθερό διαιτολόγιο τις 3 τελευταίες εβδομάδες πριν την αιμοληψία. Απαγορεύεται επίσης η χρήση αλκοόλ 3 ημέρες πριν την αιμοληψία. Το δείγμα είναι ορός ή πλάσμα (με ηπαρίνη ή EDTA) χωρίς αιμόλυση. Αποχωρίζεται εντός 2 ωρών και συντηρείται για 7 ημέρες στους 2 8 ο C ή για 3 μήνες στους -20 ο C. Τιμές αναφοράς Φυσιολογικό: 200 mg/dl Μέσος κίνδυνος: 200 240 mg/dl Υψηλός κίνδυνος: 240 mg/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,0259 mmol/l Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL) Μέθοδος: CHE/CHO 26

Διαγνωστική αξία Όσο περισσότερη αυξημένη είναι η HDL τόσο λιγότερο κινδυνεύει το άτομο από αθηρωμάτωση. Γι αυτό τον λόγο ονομάζεται καλή χοληστερόλη. Παράγοντες που επηρεάζουν την αύξηση του HDL είναι το φύλο (είναι περισσότερη στις γυναίκες), η ηλικία (αυξάνει με την ηλικία) και την φυσική αύξηση. Η HDL μειώνεται με την παχυσαρκία, την δίαιτα πλούσια σε ζωικά λίπη και υδατάνθρακες, το κάπνισμα, τον σακχαρώδη διαβήτη, την νέφρωση και την κυστική ίνωση. Μέθοδος: Άμεση HDL-Cholesterol (DHDL) με καταβύθιση Αρχή μεθόδου Αρχικά απομακρύνονται τα υπόλοιπα λιπίδια LDL, VLDL και χυλομικρά. Ο διαχωρισμός μπορεί να γίνει είτε με αντισώματα που δεσμεύουν τα υπόλοιπα λιπίδια. είτε με την προσθήκη αντιδραστηρίου του φωσφοβολφραμικού ιόντος που καταβυθίζει τα υπόλοιπα λιπίδια. Καταβύθιση με αντισώματα LDL, VLDL, χυλομικρά αντισώματα αντι-αντιανθρώπινης β-λιποπρωτείνης σύμπλοκο αντιγόνου/αντισώματος To σύμπλοκο καταβυθίζεται και παίρνουμε το υπερκείμενο όπου επιπλέουν τα μικρού μοριακού βάρους HDL. Τα μόρια HDL έχουν την αποπρωτείνη Α (ApoA) που δεν αντιδρά με τα αντισώματα. Καταβύθιση με φωσφοβολφραμικό οξύ (PTA) LDL, VLDL, χυλομικρά, HDL + PTA + Mg ++ Ίζημα + υπερκείμενο To σύμπλοκο καταβυθίζεται και παίρνουμε το υπερκείμενο όπου επιπλέον τα μικρού μοριακού βάρους HDL. Mετά την καταβύθιση προσδιορίζεται η χοληστερόλη που υπάρχει μέσα στη ΗDL με την γνωστή από την ολική χοληστερόλη μέθοδο (CE/CO). εστέρας χοληστερόλης + Η 2 Ο Εστεράση χοληστερόλης χοληστερόλη + λιπαρά οξέα 27

Οξειδάση χοληστερόλης χοληστερόλη + Ο 2 χοληστ-4-εν-3-όνη + Η 2 Ο 2 2Η 2 Ο 2 + 4-αμινοαντιπυρίνη + φαινόλη Υπεροξειδάση κινόνη + 4Η 2 Ο Mέθοδος τελικού σημείου. λ = 510 nm. Μέθοδος: Άμεση HDL-Cholesterol (DHDL) με χρήση διαβρεκτών Αρχή μεθόδου Στο πρώτο στάδιο η χοληστερόλη που περιέχεται στις LDL, τις VLDL και στα χυλομικρά διασπάται από το σύστημα των ενζύμων χοληστερόλο-εστεράση (CE) και χοληστερόλοοξειδάση (CO) και το παραγόμενο Η 2 Ο 2 καταστρέφεται. Αντίθετα το κλάσμα των HDL προστατεύεται από ειδικούς διαβρέκτες και δεν είναι προσβάσιμο από τα ένζυμα. Σε δεύτερο στάδιο αποδεσμεύεται η χοληστερόλη των HDL, υφίσταται την επίδραση του ενζυμικού συστήματος CE/CO και το παραγόμενο Η 2 Ο 2 παρουσία υπεροξειδάσης αντιδρά με χρωστική προς έγχρωμο προϊόν. Η αύξηση της απορρόφησης στα 600 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στο κλάσμα των LDL στο δείγμα. Δείγμα Ορός ή πλάσμα. Αν η ποσότητα των τριγλυκεριδίων είναι πάνω από 1000 mg/dl θα πρέπει να γίνει αραίωση με φυσιολογικό ορό και επαναπροσδιορισμός. Τιμές αναφοράς Άνδρες Φυσιολογικό: 65 mg/dl Μέσος κίνδυνος: 35 650 mg/dl Υψηλός κίνδυνος: 35 mg/dl Γυναίκες Φυσιολογικό: 55 mg/dl Μέσος κίνδυνος: 25 55 mg/dl Υψηλός κίνδυνος: 25 mg/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,0259 mmol/l 28

Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη - LDL Διαγνωστική αξία Η χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη ονομάζεται αλλιώς «κακή χοληστερόλη». Όσο αυξάνεται τόσο αυξάνεται ο κίνδυνος για αθηρωμάτωση, δηλαδή για έμφραγμα. Είναι ο σημαντικότερος δείκτης για την αθηρωμάτωση. Φυσιολογικά η LDL αυξάνεται με την ηλικία. Παθολογικά η LDL αυξάνει στον υποθυρεοειδισμό, στην νέφρωση, στην χολόσταση, στην ηπατική νόσο, στην οικογενή υπερχοληστερολαιμία κ.α. Η LDL μειώνεται στην υπερτιγλυκεριδαιμία, αβηταλιποπρω-τειναιμία, υποβηταλιποπρωτειναιμία κ.α. Μέθοδος: Friedewald Αρχή μεθόδου Ο προσδιορισμός της LDL χοληστερόλης έγινε συνήθως υπολογιστικά με βάση τον τύπο του Friedewald: LDL χοληστερόλη = Ολική χοληστερόλη (HDL χοληστερόλη) (VLDL χοληστερόλη) Επειδή όμως VLDL = Τριγλυκερίδια/5 ισχύει: LDL χοληστερόλη = Ολική χοληστερόλη (HDL χοληστερόλη) Τριγλυκερίδια / 5 Οι υπολογισμοί της LDL-χοληστερόλης έγιναν λαμβάνοντας υπ' όψη ότι: α) η εφαρμογή του τύπου προϋποθέτει σταθερή σχέση τριγλυκεριδίων και VLDL χοληστερόλης και β) όσο αυξάνει η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων τόσο η εξίσωση χάνει την ισχύ της, ενώ η εξίσωση παύει να ισχύει όταν η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων είναι μεγαλύτερη των 400 mg/dl. Μέθοδος: LDL - Direct με διαβρέκτες Αρχή μεθόδου O άμεσος προσδιορισμός των LDL ακολουθεί δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο η χοληστερόλη που περιέχεται στις HDL, τις VLDL και στα χυλομικρά διασπάται από το σύστημα των ενζύμων χοληστερόλο-εστεράση (CE) και χοληστερόλοοξειδάση (CO) και το παραγόμενο Η 2 Ο 2 καταστρέφεται. Αντίθετα το κλάσμα των LDL προστατεύεται από ειδικούς διαβρέκτες και δεν είναι προσβάσιμο από τα ένζυμα. Σε δεύτερο στάδιο αποδεσμεύεται η χοληστερόλη των LDL, υφίσταται την επίδραση του ενζυμικού συστήματος CE/CO και το παραγόμενο Η 2 Ο 2 παρουσία υπεροξειδάσης αντιδρά 29

με χρωστική προς έγχρωμο προϊόν. Η αύξηση της απορρόφησης στα 600 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στο κλάσμα των LDL στο δείγμα. Eστέρας χοληστερόλης + H 2 O Εστεράση χοληστερόλης Χοληστερόλη + λιπαρά οξέα + H 2 O 2 Χοληστερόλο-οξειδάση Χοληστερόλη + Ο 2 Προϊόν + H 2 O 2 2Η 2 Ο 2 + αμινοφαιναζόνη + φαινολικό παράγωγο Υπεροξειδάση κινόνη + 4Η 2 Ο Tελικού σημείου. λ = 510 nm Δείγμα O εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός για 12 ώρες πριν την αιμοληψία. Επίσης πρέπει να βρίσκεται σε σταθερό διαιτολόγιο τις 3 τελευταίες εβδομάδες πριν την αιμοληψία. Απαγορεύεται επίσης η χρήση αλκοόλ 3 ημέρες πριν την αιμοληψία. Το δείγμα είναι ορός ή πλάσμα (με ηπαρίνη ή EDTA) χωρίς αιμοληψία. Αποχωρίζεται εντός 2 ωρών και συντηρείται για 7 ημέρες στους 2 8 ο C ή για 3 μήνες στους -20 ο C. Ορός, ηπαρινισμένο πλάσμα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιείται πλάσμα με EDTA και οξαλικό ή κιτρικό νάτριο. Τιμές αναφοράς Ιδανική τιμή: < 100 mg/dl Σχεδόν φυσιολογικός: 100 130 mg/dl Μέσος κίνδυνος: 130 160 mg/dl Υψηλός κίνδυνος: > 160 mg/dl Δείκτης αθηρωμάτωσης Αρχή μεθόδου: Υπολογιστική μέθοδος Ο δείκτης αθηρωμάτωσης υπολογίζεται με δύο διαφορετικές εξισώσεις: 1oς τύπος: Chol/HDL Οι τιμές αναφοράς του είναι: Φυσιολογικό: 3,3 30

Χαμηλός κίνδυνος: 3,4 4,4 Μέσος κίνδυνος: 4,5 7,1 Υψηλός κίνδυνος: 7,2 2oς τύπος: LDL/HDL Οι τιμές αναφοράς της είναι: Φυσιολογικό: 0,5 3,0 Μέσος κίνδυνος: 3,1 6,0 Υψηλός κίνδυνος: 6,0 Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,0259 mmol/l Ολική χολερυθρίνη (TBILI) Διαγνωστική αξία Στον ορό κυκλοφορεί η άμεση ή συνδεδεμένη χολερυθρίνη και η έμμεση ή μη συνδεδεμένη χολερυθρίνη. Η συνδεδεμένη χολερυθρίνη πήρε το όνομα της από την σύνδεσή της με το γλυκουρονικό οξύ στο ήπαρ. Στην πράξη στα βιοχημικά εργαστήρια προσδιορίζονται η ολική και η άμεση χολερυθρίνη οπότε η έμμεση προκύπτει από την διαφορά τους. Αρχή μεθόδου Χρησιμοποιούνται ευρέως δύο μέθοδοι για τον προσδιορισμό της χολερυθρίνης. Μέθοδος Ι: DPD σε αλκαλικό περιβάλλον Η αλβουμίνη δεσμεύει την έμμεση χολερυθρίνη. Το σύμπλοκο αυτό μαζί με την διαλυτή άμεση χολερυθρίνη σχηματίζει ένα σύμπλοκο μπλε χρώματος με το 3,5 διχλωροφαινολδιαζωτωμένο-τετραφθοροβοραικό οξύ (DPD). ολική χολερυθρίνη + DPD καφείνη αζωχολερυθρίνη Tελικού σημείου. λ = 540 nm 31

Μέθοδος ΙΙ: DMSO σε αλκαλικό περιβάλλον H δεσμευμένη με την αλβουμίνη χολερυθρίνη δηλαδή ή έμμεση χολερυθρίνη αποδεσμεύεται με τη χρήση διαβρέκτη (διμευθυλσουλφοξίδιο DMSO). Οπότε άμεση και έμμεση χολερυθρίνη δίνουν μαζί ως ολική χολερυθρίνη την αντίδραση Diaso. DBILI + διαζωτωμένο σουλφανιλικό οξύ H + αζωχολερυθρίνη Tελικού σημείου. λ = 540 nm Δείγμα Ο εξεταζόμενος πριν την αιμοληψία πρέπει να είναι νηστικός για τουλάχιστον 2 ώρες. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη και EDTA. Το δείγμα πρέπει να διατηρείται μακριά από το άμεσο φως. Σε θερμοκρασία δωματίου διατηρείται μόνο 12 ώρες, στην ψύξη διατηρείται δύο ημέρες και στην κατάψυξη για 1 μήνα. H τιμή της χολερυθρίνης αυξάνει μετά την λήψη τροφής και την φυσική άσκηση. Τιμές αναφοράς Νεογέννητα: 0,5 12,6 mg/dl Ενήλικες: 0,1 1,2 mg/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 17,1 μmol/l Άμεση χολερυθρίνη (DBILI) Μέθοδος: Diazo Διαγνωστική αξία Η άμεση ή συνδεδεμένη χολερυθρίνη κυκλοφορεί στο αίμα όταν το επίπεδο της στη ήπαρ ξεπεράσει κάποιο συγκεκριμένο όριο. Η άμεση χολερυθρίνη αυξάνει στις διάφορες ηπατίτιδες, στη λήψη διαφόρων φαρμάκων, σε μεταβολικές διαταραχές, σε κίρρωση, σε καρκίνο του ήπατος, σε χολόσταση κ.α. Η έμμεση χολερυθρίνη αυξάνει στην αιμόλυση, στον νεογνικό ίκτερο, στην ηπατίτιδα κ.α. 32

Αρχή μεθόδου DBILI + διαζωτωμένο σουλφανιλικό οξύ H + αζωχολερυθρίνη Tελικού σημείου. λ = 540 nm Δείγμα Ο εξεταζόμενος πριν την αιμοληψία πρέπει να είναι νηστικός για τουλάχιστον 2 ώρες. Το δείγμα μπορεί να είναι ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη και EDTA και διατηρείται μακριά από το άμεσο φως. Σε θερμοκρασία δωματίου διατηρείται μόνο 12 ώρες, στην ψύξη διατηρείται δύο ημέρες και στην κατάψυξη για 1 μήνα. H τιμή της χολερυθρίνης αυξάνει μετά την λήψη τροφής και την φυσική άσκηση. Τιμές αναφοράς 0 0,4 mg/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 17,1 μmol/l Έμμεση χολερυθρίνη (IBILI) Υπολογιστική μέθοδος IBILI = TBILI DBILI Ολική πρωτεΐνη (TP) Μέθοδος: Biuret Διαγνωστική αξία Στον ορό υπάρχουν πολλές πρωτεΐνες οι οποίες διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες την λευκωματίνη και τις σφαιρίνες. Στους ενήλικες η έντονη άσκηση προκαλεί μια προσωρινή αύξηση στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης του ορού. Παθολογικά αύξηση της πρωτεΐνης στον ορό παρατηρείται στην αφυδάτωση καθώς και σε καταστάσεις που αυξάνουν οι σφαιρίνες (οι σφαιρίνες αυξάνουν σε ανοσολογικές διαταραχές) π.χ. στις λοιμώξεις, σε αυτοάνοσα νοσήματα, στην σαρκοείδωση, στην κίρρωση του ήπατος και στην παραπρωτειναιμία. 33

Αρχή μεθόδου Πολυπεπτίδιο (πρωτεΐνη) + θειικός χαλκός ΟΗ - μωβ σύμπλοκο Tελικού σημείου. λ = 546 nm Δείγμα Ορός ή πλάσμα (με EDTA) χωρίς αιμόλυση. Συντηρείται στη ψύξη (2 8 ο C) για 20 ημέρες ή για 6 μήνες στους -20 ο C. Προσοχή η παρατεταμένη στάση πριν την αιμοληψία προκαλεί την αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στον ορό. H μέτρηση της πρωτεΐνης μπορεί να γίνει και ούρα 24ώρου. Το δείγμα των ούρων πριν την ανάλυση φυγοκεντρείται. Τιμές αναφοράς Περιπατητικός ασθενής: 6,2 8,5 g/dl Κατακεκλεισμένος ασθενής: 6,0 8,0 g/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,10 mmol/l Αλβουμίνη (ALB) Μέθοδος: BCG Διαγνωστική αξία H αλβουμίνη είναι η πιο διαδεδομένη πρωτεΐνη που απαντάται στον ορό. Ελαττώνεται όταν δεν προσλαμβάνεται επαρκής πρωτεΐνη με την τροφή (για ιατρικούς ή διαιτητικούς λόγους), όταν υπάρχει απώλεια πρωτεΐνης (σε αιμορραγία, νεφρική βλάβη κ.α.), όταν υπάρχει αυξημένος καταβολισμός (π.χ. σε λοιμώξεις, τραυματισμούς) καθώς και σε διάφορες παθήσεις (κίρρωση, μυέλωμα κ.α.). Αρχή μεθόδου αλβουμίνη + πράσινο της βρωμοκρεζόλης βρωμοκρεζόλης σύμπλοκο αλβουμίνης πράσινο Tελικού σημείου. λ = 600 nm 34

Με την επίδραση της αλβουμίνης η χρωστική «πράσινο της βρωμοκρεζόλης» αλλάζει χρώμα από κίτρινο σε πράσινο. Η ένταση του πράσινου χρώματος είναι ανάλογη με την συγκέντρωση της αλβουμίνης. Δείγμα Ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη. Η αλβουμίνη είναι σταθερή στον ορό ή πλάσμα για ένα μήνα σε συνθήκες ψύξης (2 8 ο C) και για ένα μήνα στους -20 ο C. Τιμές αναφοράς 3,5 5,0 g/dl Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 1 mmol/l Σφαιρίνες (GLOB) Υπολογιστική μέθοδος GLOB = TP ALB 35

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΖΥΜΩΝ γ-γλουταμινική τρανσφεράση (γ-gt) Μέθοδος: Szasz Διαγνωστική αξία Το ένζυμο γ-gt παράγεται σε πολλά όργανα (νεφροί, πάγκρεας, ήπαρ, σπλήνα κ.α.) αυτό όμως που κυκλοφορεί στο αίμα προέρχεται από το ήπαρ και την χολή. Έτσι η ενεργότητα της γ-gt αυξάνεται σε αποφρακτικό ίκτερο, ενδοηπατική χολόσταση, κίρρωση, ηπατίτιδα, λοιμώδη μονοπυρήνωση, υπερθυρεοειδισμό, παγκρεατίτιδα, ηπατική νόσο λόγω αλκοολισμού. Μείωση παρατηρείται σε υποθυρεοειδισμό ενώ αύξηση παρατηρείται και στον αλκοολισμό. H γ-gt είναι χρήσιμος δείκτης παγκρεατικού ή ηπατικού καρκίνου γιατί τα επίπεδά της αντανακλούν την έκταση του καρκίνου και την απάντηση του οργανισμού στη θεραπεία. Αρχή μεθόδου Η παρουσία του ενζύμου καταλύει την μεταφορά της ομάδας L-γ-Γλουταμύλο από το μόριο του L-γ-Γλουταμύλο 3-καρβόξυ 4-νιτρανιλίδιο (GLUPA-C) στο μόριο της γλυκυλογλυκίνης. Η αύξηση της απορρόφησης στα 405 nm οφείλεται στo παραγόμενο 5-άμινο-2- νίτροβενζοϊκο οξύ και είναι ανάλογη της δραστικότητας της γ-gt στο δείγμα. γ-gt L-γ-γλουταμυλο-3-καρβοξυ-4-νιτροανιλίδη + γλυκυλογλυκίνη ===== L-γ-γλουταμυλο-γλυκυλογλυκίνη + 5-αμινο-2-νιτροβενζοϊκό οξύ Κινητική μέθοδος: Factor = 1158, λ = 405 nm. Δείγμα Ορός μη αιμολυμένος. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί πλάσμα με EDTA. Tα φθοριούχα, οξαλικά και κιτρικά άλατα πρέπει να αποφεύγονται γιατί μειώνουν την δραστικότητα της γ-gt. Το δείγμα διατηρείται επί μία εβδομάδα στους 2 έως 8 o C και επί 5 ημέρες στη θερμοκρασία δωματίου. 36

Τιμές αναφοράς Ορός, πλάσμα Άνδρες: 10 49 U/L Γυναίκες: 7 32 U/L Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) Μέθοδοι L -> P, P -> L Διαγνωστική αξία Η LDH είναι ένα μόριο τετραμερές, δηλαδή αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Συγκεκριμένα αποτελείται από τις αλυσίδες Η που υπερτερούν στην καρδιακή μορφή και τις αλυσίδες Μ που υπερτερούν στη σκελετική μυϊκή μορφή. Έτσι υπάρχουν πέντε πιθανή τετραμερή (ισοένζυμα) τα: Η 4 (LDH 1 ), Η 3 Μ (LDH 2 ), Η 2 Μ 2 (LDH 3 ), ΗΜ 3 (LDH 4 ), Μ 4 (LDH 5 ). Τα κλάσματα του LDH απαντούν στην καρδιά, στα ερυθρά, στους νεφρούς και μέτρια στα περισσότερα όργανα. Το ολικό LDH αυξάνει στο έμφραγμα του μυοκαρδίου, στην οξεία ηπατίτιδα, σε μυϊκή βλάβη (π.χ. εγχείρηση), σε λευχαιμία, πνευμονία κ.α. H διάκριση των κλασμάτων της LDH γίνεται με ηλεκτροφόρηση. Αρχή μεθόδου Χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ολικής LDH οι οποίες έχουν και διαφορετικές τιμές αναφοράς. Οι μέθοδοι L-> P και P-> L. Μέθοδος Ι. L-> P (DGKC 25 ο C) L-γαλακτικό + NAD + LDH 25 ο C πυροσταφυλικό + NADH + H Κινητική μέθοδος: Factor = 8095, λ = 340 nm. Μέθοδος ΙΙ. P-> L (SFBC 37 o C) LDH πυροσταφυλικό + NADH + Η L-γαλακτικό + NAD + 37 o C Κινητική μέθοδος: Factor = 8095, λ = 340 nm. 37

Δείγμα Μη αιμολυμένος ορός ή πλάσμα από ηπαρίνη ή EDTA. To δείγμα διατηρείται στη ψύξη επί 3 ημέρες και στην κατάψυξη (- 20 ο C) για 6 μήνες. Τιμές αναφοράς 25 o C (L -> P): 120 240 U/L 37 o C (P -> L): 225-450 U/L Αλκαλική φωσφατάση (ALP) Μέθοδος: p-νιτροφαινόλη Διαγνωστική αξία Η αλκαλική φωσφατάση (ALP) είναι ένα ένζυμο το οποίο κυκλοφορεί στο αίμα με την μορφή τριών ισοενζύμων 7 : το οστικό, το εντερικό και το ηπατικό. Τα ονόματα τους οφείλονται στο όργανο από το οποίο παράγονται. Το οστικό (80%) και το εντερικό κλάσμα (20%) υπάρχουν φυσιολογικά σε όλους τους ανθρώπους σε αντίθεση με το ηπατικό που μετράται κυρίως σε παθολογικές καταστάσεις. Φυσιολογικά το οστικό κλάσμα είναι πολύ αυξημένο στα παιδιά λόγω της ταχείας ανάπτυξης των οστών τους. Παθολογικά το οστικό κλάσμα αυξάνει σε οστικές παθήσεις και στον υπερπαραθυρεοειδισμό, το εντερικό κλάσμα στην κίρρωση του ήπατος και το ηπατικό κλάσμα σε παθολογικές καταστάσεις του ήπατος και της χολής (π.χ. λοιμώδη μονοπυρήνωση, εξωηπατική απόφραξη των χοληφόρων). Η διάκριση των κλασμάτων της ALP γίνεται με ηλεκτροφόρηση. Αρχή μεθόδου H ολική αλκαλική φωσφατάση προσδιορίζεται δύο διαφορετικές χημικές μεθόδους που διαφέρουν ως προς την θερμοκρασία επώασης. 7 Τα ισοένζυμα είναι ένζυμα τα οποία ενώ καταλύουν την ίδια χημική αντίδραση έχουν διαφορετική χημική δομή. 38