Εφαρµοσµένη Βιοτεχνολογία Σηµειώσεις Νίκος Τσουκιάς, Ευάγγελος Τόπακας Σχολή Χηµικών Μηχανικών ΕΜΠ
για την παραγωγή μιας ενεργής πρωτεΐνης υπάρχουν ρυθμιστικοί μηχανισμοί σε πολλαπλά επίπεδα ιδιαίτερα για τα ανώτερα ευκαρυωτικά κύτταρα ένα παράδειγμα ρυθμιστικού μηχανισμού της γονιδιακής έκφρασης είναι το RNAi pathway
Προκαρυωτικά: Υποκινητης (Promoter), Χειριστης (Operator) RNA πολυμεράση ; Καταστολέας (Repressor)
Προκαρυωτικά: Υποκινητης (Promoter), Χειριστης (Operator) RNA πολυμεράση ; Καταστολέας (Repressor)
Ευκαρυωτικά: Υποκινητης (Promoter), Ενισχυτής (Enhancer) RNA πολυμεράση II; µεταγραφικοί παράγοντες (Transcription Factors) Ο ενισχυτής μπορεί να βρίσκεται χιλιάδες βάσεις του DNA μακριά από τον υποκινητή!!!!
Ευκαρυωτικά: Υποκινητης (Promoter), Ενισχυτής (Enhancer) RNA πολυμεράση II; µεταγραφικοί παράγοντες (Transcription Factors)
Μετα-μεταφραστική διεργασία και μεταφορά
Μετα-μεταγραφικές ρυθμίσεις Οι μετα-μεταγραφικοί έλεγχοι λειτουργούν αφότου η RNA πολυμεράση έχει προσδεθεί στον υποκινητή ενός γονιδίου και έχει ξεκινήσει η σύνθεση του RNA Αυτορυθμιζόμενα μόρια mrna περιέχουν ριβοδιακόπτες, δλδ βραχείες αλληλουχίες RNA που αλλάζουν διαμόρφωση όταν προσδένουν μικρά μόρια πχ μεταβολίτες. Παράδειγμα: Ριβοδιακόπτης ελέγχει τα γονίδια τα βιοσύνθεσης πουρινών
Μη μεταφραζόμενες περιοχές των mrna μπορεί να ελέγχουν τη μετάφραση Οι μετα-μεταγραφικοί έλεγχοι λειτουργούν αφότου η RNA πολυμεράση έχει προσδεθεί στον υποκινητή ενός γονιδίου και έχει ξεκινήσει η σύνθεση του RNA Listeria monocytogenes
Μικρά ρυθμιστικά RNA ελέγχουν την έκφραση χιλιάδων γονιδίων σε ζώα και φυτά Μη κωδικοποιητικό RNA που ονομάζεται microrna ή mirna (400 περίπου διαφορετικά είδη) ρυθμίζει περίπου το 1/3 όλων των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Το ώριμο mirna συναρμολογείται με εξειδικευμένες πρωτεΐνες που ονομάζονται RISC (RNA-induced silencing complex) Ένα μόνο mirna μπορεί να ρυθμίζει ομάδα διαφορετικών mrna εφόσον διαθέτουν ίδιες αλληλουχίες σε αμετάφραστες περιοχές. Οικονομία: τα μόρια αυτά καταλαμβάνουν πολύ μικρό χώρο στο γονιδίωμα σε σχέση με τους μεταγραφικούς ρυθμιστές Το μικρό τους μέγεθος καθυστέρησε πολύ την ανακάλυψη αυτών των μορίων
Ο μηχανισμός παρεμβολής του RNA καταστρέφει ξένα δίκλωνα RNA Το mirna μπορεί να παίξει ρόλο αμυντικού μηχανισμού του κυττάρου. Ο μηχανισμός στοχευμένης αποδόμησης RNA που αποκαλείται παρεμβολή RNA (RNAi, RNA interference). Η παρουσία ξένου δίκλωνου RNA στο κύτταρο πυροδοτεί το μηχανισμό RNAi. Η νουκλεάση DICER κόβει το δίκλωνο μόριο σε μικρά κομμάτια περίπου 23 νουκλεοτιδικών ζευγών που ονομάζονται sirnas (small interfering RNAs) Το RISC απορρίπτει τον ένα κλώνο για να προσδέσει ένα ξένο συμπληρωματικό μόριο RNA για να το καταστρέψει. Για παράδειγμα στα φυτά το RNAi διαδίδεται από ιστό σε ιστό ώστε το φυτό να αποκτήσει ανθεκτικότητα απέναντι σε έναν ιό ο οποίος έχει μολύνει κάποια λίγα κύτταρα του ανοσοποιητικό σύστημα
Η RNA παρεμβολή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αδρανοποίηση γονιδίων Το mirna μπορεί να παίξει ρόλο αμυντικού μηχανισμού του κυττάρου. Ο μηχανισμός στοχευμένης αποδόμησης RNA που αποκαλείται παρεμβολή RNA (RNAi, RNA interference). Για πρώτη φορά γίνονται κλινικές δοκιμές σε ασθενείς με τη νόσο του Huntington Huntington's disease (HD), also known as Huntington's chorea, is an inherited disorder that results in death of brain cells. [4] The earliest symptoms are often subtle problems with mood or mental abilities. [1] A general lack of coordination and an unsteady gait often follow. [2] As the disease advances, uncoordinated, jerky body movements become more apparent. [1] Physical abilities gradually worsen until coordinated movement becomes difficult and the person is unable to talk. [1][2] Mental abilities generally decline into dementia. [3]
microrna (mirna) και μετα-μεταγραφομική ρύθμιση γονιδιακής έκφρασης μικρά μόρια μη κωδικοποιητικού RNA (περίπου 22 νουκλεοτιδίων) βρίσκονται σε κύτταρα φυτών, ζώων, αλλά και σε ιούς προέρχονται από την ενδογενή μεταγραφή RNA που διπλώνει σχηματίζοντας φουρκέτα (primary mirna) https://en.wikipedia.org/wiki/microrna
Μία εξωγενής/ενδογενής διπλή αλυσίδα (dsrna) ή ένα ενδογενές προ-mirna Το ένζυμο dicer τεμαχίζει τη διπλή αλυσίδα του RNA (dsrna ή pre-mirna) Δημιουργεί θραύσματα small interfering RNA ή microrna. Ενσωμάτωση στο σύμπλοκο (RNA-induced silencing complex) (RISC), Στόχευση μονής αλυσίδας mrna και καταστολή της μετάφρασης του γονιδίου https://www.youtube.com/watch?v=ck-ogb1_ele Animation http://themedicalbiochemistrypage.org/gene-regulation.php
http://principlesofmolecularvirology.blogspot.gr/2013/11/the-great-rna-confusion-rnai-mirna.html
Γενωµική και Συστηµική Βιολογία [Ch 8.5] Genomics is a discipline in genetics that applies recombinant DNA, DNA sequencing methods, and bioinformatics to sequence, assemble, and analyze the function and structure of genomes https://en.wikipedia.org/wiki/genomics Γενωμική είναι ένας διεπιστημονικός κλάδος που χρησιμοποιεί πειραματικά και υπολογιστικά εργαλεία για την ανάγνωση και ανάλυση το γονιδιώματος και το συσχετισμό του με την παθοφυσιολογία του οργανισμού Ο συσχετισμός φυσιολογικής συμπεριφοράς με αλληλουχία νουκλεοτιδίων συνιστά σημαντική πρόκληση στην οποία Εμβιομηχανικοί μπορούν να συνεισφέρουν σημαντικά
Α. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ High throughput πειραματικές τεχνικές χρησιμοποιούν αυτοματισμούς για να πραγματοποιήσουν βιολογικά πειράματα σε μεγάλη κλίμακα large-scale data biology και καινούργια επιστημονικά πεδία με το συνθετικό -omics : Genomics, Transcriptomics, Proteomics, Metabolomics Στα βασικά πειραματικά εργαλεία περιλαμβάνονται: 1. Μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχιών DNA 2. Μέθοδοι σίγασης (silencing) και αφαίρεσης (knockout) γονιδίων 3. Μέθοδοι ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης mrna που έχει εκφραστεί 4. Μέθοδοι ανίχνευσης πρωτεϊνών
Α1. Αλληλούχιση του DNA Μέθοδος Sanger για την αλληλούχιση του DNA (1977) Next Generation sequencing (Next-Gen) επιτρέπει μεγάλης κλίμακας, αυτοματοποιημένο προσδιορισμό αλληλουχίας ολόκληρου γονιδιώματος 2014: 1000$ genome
Roche Illumina Life Technologies Pacific Biosciencies
Αλληλούχιση Sanger Εκμαγείο: Μονοκλωνικό DNA (θραύσματα) εκκινητής DNA Πολυμεράση του DNA deoxynucleosidetriphosphates (dntps) di-deoxynucleosidetriphosphates (ddntps) σταματούν την αντιγραφή σημαδεύεται ο παραγόμενος κλώνος (radiolabeling/fluorescence) ΑTP όπως και στην PCR σε Thermocycler Animation Animation dαtp ddαtp
4 αντιδράσεις PCR μία για κάθε ddntp Σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα θα παραχθούν αντίγραφα διαφορετικού μήκους που τελειώνουν στην ίδια βάση νουκλεοτιδίου (Ν) Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή άγαρ διαχωρίζει τους παραγόμενους κλώνους Μικρά κομμάτια DNA μέχρι ~ 500bp https://www.youtube.com/watch?v=qr6a4exzows
Παράδειγμα: Για την αλληλούχιση ενός μονόκλωνου τεμαχίου DNA χρησιμοποιήθηκε Sanger sequencing με εκκινητή 5 - GCAT-3. Η ηλεκτροφόρηση πήγματος διαχώρισε τα προϊόντα από 4 αντιδράσεις στις οποίες είχαν προστεθεί κατά σειρά ddτtp, ddctp, ddgtp, ddatp (μαζί με το DNA, τον εκκινητή, την DNA πολυμεράση και τα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια). Γράψτε την αλληλουχία των 22 βάσεων του τεμαχίου DNA στην κατεύθυνση 5' 3' 5 - GCAT G -3 Συμπληρωματικός κλώνος 3 - CGTA C -5 Σε κατεύθυνση 5 à 3 5 -. C ATGC -3
Αυτοματοποίηση Sanger Κλασμάτωση του DNA (10 6 επικαλυπτόμενα θραύσματα, 2000-10000bp) Κλωνοποίηση σε έναν φορέα και ενίσχυση in vivo Αντιδράσεις αλληλούχισης (PCR) Διαχωρισμός με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση Ανίχνευση φθορισμού (μία μόνο αντίδραση, 500bp)
Αυτοματοποίηση Sanger
Επικάλυψη - Depth (coverage) στην αλληλούχιση του DNA Είναι ο αριθμός των αναγνώσεων που περιλαμβάνουν ένα συγκεκριμένο νουκλεοτίδιο στην ανακατασκευασμένη αλληλουχία Depth =N x L / G (G): length of the original genome, (μήκος γονιδιώματος) (N): number of reads, (αριθμός αναγνώσεων -θραυσμάτων (L) : average read length, (αριθμός βάσεων-θραυσμάτων) Deep sequencing : Depth >7 παράδειγμα: Για το ανθρώπινο γονιδίωμα G = 3 δισεκατομμύρια bp L = 500 bp χρειαζόμαστε δηλαδή 70 εκατομμύρια διαφορετικές αναγνώσεις αλληλουχιών για να έχουμε μια ικανοποιητική επικάλυψη, Depth ~12x
Α2. Μέθοδοι ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης mrna 1. Real-time Quantitative PCR (RT-qPCR) 2. Μικροσυστοιχίες RNA (RNA microarrays) 3. Αλληλούχιση RNA Εξέλιξη μεταγραφομικών τεχνολογιών Northern Blot RT-PCR Microarrays (NGS) RNA-seq ένα γονίδιο πολλαπλά γονίδια ολόκληρα γονιδιώματα πληθυσμοί γονιδιωμάτων
1. Real-time Quantitative PCR Μας επιτρέπει να πολλαπλασιάσουμε ένα κομμάτι DNA
Ποσοτικοποίηση έκφρασης γονιδίων (mrna) Βήμα 1: Λύση κυττάρων και απομόνωση mrna Βήμα 2: σύνθεση cdna από μόρια mrna (αντίστροφη μεταγραφάση) Βήμα 3: Επιλογή εξειδικευμένου εκκινητή DNA για το γονίδιο του ενδιαφέροντος Βήμα 4: κύκλοι PCR - DNA πολυμεράση (Taq; Thermus aquaticus; 70-90 C) - Εκκινητές - deoxynucleosidetriphosphates (dntps) -Fluorescent probe (παρακολούθηση αριθμού σχηματιζόμενων κλώνων) SYBR Green [φθορισμός με τον σχηματισμό dsdna] TaqMan [φθορισμός κατά την επιμήκυνση του συγκεκριμένου γονιδίου, PacMan] Πολλαπλές αντιδράσεις σε 96 ή 384 well plates, κάθε αντίδραση μπορεί να χρησιμοποιεί εκκινητή για διαφορετικό γονίδιο. Επιτυγχάνεται σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης <384 γονιδίων. Χρησιμοποιούνται Housekeeping γονίδια για κανονικοποίηση https://www.youtube.com/watch?v=figgkkclluo
Log fluorescence Cycle number Επιλογή threshold ώστε να τέμνει μέσα στη εκθετική φάση όλες τις καμπύλες Υπολογισμός του κύκλου (C T ) που χρειάστηκε κάθε αντίδραση για να φτάσει την κρίσιμη τιμή φθορισμού (threshold fluorescence) Διαφορά στις τιμές C T μεταξύ δύο αντιδράσεων (γονιδίων). Το ΔC T δηλώνει 2 -ΔCT φόρες μεγαλύτερη/μικρότερη έκφραση
Συνάρτηση του λογάριθμου του κανονικοποιημένου φθορισμού [Log normalized fluorescence (ΔRn)] με των αριθμό των κύκλων της PCR
Η σχετική έκφραση μεταξύ δύο καταστάσεων συνήθως ανάγεται ως προς γονίδια που παραμένουν σταθερά (Housekeeping) H Διαφορά της διαφοράς ΔΔC T δηλώνει μεγαλύτερη/μικρότερη έκφραση (2 -ΔΔCT ) φορές http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23525470 Παράδειγμα: Healthy tissue CEACAM19 C T =31.5 Housekeeping C T =26.5 Cancerous tissue CEACAM19 C T =29 Housekeeping C T =26 ΔΔC T = (29-26)-(31.5-26.5)=-2 (2 -ΔΔCT ) =4; CEACAM19 Cancerous = 4x healthy Relative quantification of the CEACAM19 expression via real-time PCR. A representative amplification plot of CEACAM19 and HPRT1, in a randomly selected pair of matched cancerous (Ca) and non-cancerous (H) breast tissue parts. Τarget (CEACAM19) and the internal control (HPRT1) genes.
2. Μικροσυστοιχίες DNA (DNA microarrays) Φωτολιθογραφία για κατασκευή συστοιχιών ολιγονουκλεοτιδίων Αλληλουχία βάσεων με βάση ένα συγκεκριμένο γονίδιο Τα νουκλεοτίδια υβριδιώνονται με μόριο cdna που προέρχεται από mrna (αντίστροφη μεταγραφάση) Το μόριο cdna σημαδεύεται με χρωστική φθορισμού Υβριδίωση και ξέπλυμα Ανάλυση σήματος φθορισμού για την έκφραση 10 4 γονιδίων
https://www.youtube.com/watch?v=p9e3xfxbxy4
3. RNA-SEQ
Μακριά μόρια RNA μετατρέπονται σε μία βιβλιοθήκη θραυσμάτων cdna (RNA or DNA fragmentation) Sequencing adaptors (μπλε) προστίθενται σε κάθε cdna θραύσμα και γίνεται ανάγνωση μιας μικρής αλληλουχίας βάσεων από κάθε κομμάτι cdna με NGS Οι αλληλουχίες που προσδιορίζονται ευθυγραμμίζονται με τη βάση δεδομένων του συγκεκριμένου γονιδιώματος (reference genome or transcriptome), και προσδιορίζεται από πιο γονίδιο προέρχονται Ο αριθμός των αναγνώσεων (counts) που αντιστοιχούν σε ένα γονίδιο χρησιμοποιείται ως μέτρο της έκφρασης του γονιδίου αυτού. http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n1/fig_tab/nrg2484_f1.html
παράδειγμα: Sample 1 mrna A: 1000 bp B: 2000 bp #Reads A: 4 B: 4 other: 5,999,992 Total: 6 Million Sample 2 mrna A: 1000 bp B: 2000 bp #Reads A: 7 B: 10 other: 11,999,983 Total: 12 Million 0.4 4 Reads 1 Kbp x 6 Million Reads 4 Reads 2 Kbp x 6 Million Reads 7 Reads 1 Kbp x 12 Million Reads ο αριθμός των θραυσμάτων cdna άρα και των αναγνώσεων είναι ανάλογος των μορίων mrna δηλαδή της έκφρασης του συγκεκριμένου γονιδίου. ένα μεγάλο γονίδιο, ωστόσο, θα δημιουργήσει πιο πολλά θραύσματα και πιο πολλές αναγνώσεις κανονικοποίηση ως προς το μέγεθος του mrna και ως προς το συνολικό αριθμό αναγνώσεων RPKM : Reads per kb of exon per million mapped reads
RNA sequencing Samples of interest Isolate RNAs Generate cdna, fragment, size select, add linkers Condition 1 (normal colon) Condition 2 (colon tumor) Sequence ends Map to genome, transcriptome, and predicted exon junctions Downstream analysis 100s of millions of paired reads 10s of billions bases of sequence
Microarrays RNA-seq Κόστος ($100-200/δείγμα) Απλή ανάλυση Μεγαλύτερο δυναμικό εύρος Μεγαλύτερη ευαισθησία Ικανότητα για την ανίχνευση splicing variants Ικανότητα για την ανίχνευση μεταλλάξεων Ανίχνευση χαμηλής ποσότητας μεταγράφων Δε χρειάζονται ειδικά probes Η αλληλουχία του gdna μπορεί να είναι άγνωστη RNAseq σύντομα θα αντικαταστήσει τα microarrays για πολλές εφαρμογές