תקציר 1. מבוא כללי קוטין סוברין

הידרוליזה אנזימתית של מרכיבי הקוטיקולה בסיבי כותנה אופיר דגני

הידרוליזה אנזימתית של מרכיבי הקוטיקולה בסיבי כותנה חיבור על מחקר לשם מילוי חלקי של הדרישות לקבלת התואר מגיסטר למדעים בביולוגיה אופיר דגני הוגש לסנט הטכניון מכון טכנולוגי לישראל תמוז תש"סא חיפה יולי 2001

הבעת תודה המחקר נעשה בהנחיית פרופ/ח שמעון גפשטיין ופרופ/ח קרלוס דוזורץ בפקולטה לביולוגייה בטכניון (חיפה) ובמרכז ידע גליל (מיג"ל, קריית שמונה). אני מודה למיג"ל על התמיכה הכספית הנדיבה בהשתלמותי. תודה מכל הלב לקרלוס דוזורץ על ההדרכה, הסבלנות, הנכונות והעידוד בכל שלבי המחקר. לשמעון גפשטין על הייעוץ, המעורבות הרבה, והעזרה החשובה. לחברי במעבדה במיג ל- פאולה, נתן, גרי, אורן, חוסיין, אוסנת, בלה, נופר, חאלד וחגי שתרמו מהידע האישי שלהם ונכונו לתת כתף, לסייע ולעודד בעת הצורך. תודה על הכל! לשכי על העזרה וההדרכה במעבדה בטכניון. תודה מיוחדת למשפחתי ובמיוחד לאשתי ולהורי שעמדו לצידי לאורך כל הדרך. לחברות AvcoChem (בית שמש),, Rakuto Kasei (Israel) Ltd סיידר הגליל technologies (רחובות) שאפשרו את ביצוע המחקר. (קריית שמונה) ו- CBD

תוכן עניינים עמוד 1 3 4 5 5 7 7 8 תקציר רשימת קיצורים 1. מבוא 2. סקר ספרות 2.1 סיבי כותנה 2.2 שכבת הקוטיקולה 2.2.1 כללי 2.2.2 המעטה של סיבי כותנה 9 13 15 15 16 16 17 קוטין סוברין שעוות פקטין הידרוליזה כימית של הדופן בסיבי כותנה 2.7.1 שלבים בעיבוד הטקסטיל 2.7.2 הידרוליזה כימית של הדופן בסיבי כותנה 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 18 18 19 20 20 הידרוליזה אנזימתית של הקוטיקולה הצמחית 2.8.1 כללי 2.8.2 האנזים קוטינאז 2.8.2.1 המבנה של קוטינאז 2.8.2.2 מנגנון הפעולה של קוטינאז 2.8 21 21 21 2.8.3. פקטינאזות 2.8.3.1 כללי 2.8.3.2 מנגנון הפעולה של פקטינאזות 23 23 24 25 25 Cellulose binding domain (CBD) 2.9 2.9.1 כללי 2.9.2 משפחות ה- CBD CBD 2.9.3 מאוחה עם חלבונים אחרים pet system 2.9.4 27 3. מטרות המחקר

28 28 4. שיטות וחומרים 4.1 חומרים תוכן עניינים (המשך) עמוד 29 29 29 הכנת קוטין והידרוליזאט של קוטין 4.2.1 מיצוי קוטין מתפוח 4.2.2 הכנת הידרוליזאט מקוטין תפוח 4.2 29 29 30 30 גידול הפטרייה Fusarium oxysporum והפקת האנזים קוטינאז מהנוזל החוץ תאי. 4.3.1 גידול Fusarium oxysporum 4.3.2 הכנת מצע מינרלי 4.3.3 הוספת 1-Hexadecanolלמצע הגידול 4.3 31 31 31 31 32 ניקוי האנזים קוטינאז מ- Fusarium oxysporum 4.4.1 ניקוי האנזים קוטינאז ב- HPLC 4.4.2 זיהוי החלבונים ב- SDS gel 4.4.2.1 הרצת הג'ל 4.4.2.2 הכנת תמיסות 4.4 33 33 33 Isoelectric focusing (IEF) 4.4.3 4.4.3.1 צביעת חלבונים לג'ל IEF 4.4.3.2 צביעת ג'ל IEF לפעילות אסתראזות 34 35 35 35 4.4.4 הכנת 4-nitropenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate 4.4.4.1 תהליך ניקוי האסתר הרצוי מתוצרי לוואי TLC 4.4.4.2 4.4.4.3 זיהוי התוצר שהתקבל ב- NMR 35 35 4.4.5 ביצוע המבחן לקוטינאז 4.4.6 בדיקת חלבון מסיס 36 36 36 4.5 הידרוליזה אנזימתית וכימית של מרכיבי הדופן בסריגי כותנה 4.5.1 הידרוליזה אנזימתית 4.5.2 הידרוליזה כימית

36 36 4.5.3 מדידת פעילות pectin lyase 4.5.4 מדידת פעילות polygalacturonase תוכן עניינים (המשך) עמוד 37 4.5.5 מדידת פעילות אסתראזות 38 38 38 39 4.6 האנליזות השונות למעקב אחר ההידרוליזה 4.6.1 מדידת משקל סריגי כותנה מטופלים 4.6.2 צביעת צלולוז ופקטין 4.6.3 מדידת קצב ההרטבה 4.6.4 הפרדת מרכיבי שעוות סריגי כותנה ב- ELSD-RP HPLC 39 39 39 39 39 40 40 40 וזיהויים ב- GC-MS 4.6.4.1 מיצוי קוטין מסריגי כותנה גולמיים 4.6.4.2 הכנת הידרוליזאט מקוטין סריג כותנה 4.6.4.3 מיצוי מרכיבי התגובה האנזימתית 4.6.4.4 הפרדת מרכיבי הקוטיקולה של סריגי כותנה ב- ELSD-RP HPLC 4.6.4.5 הפרדת מרכיבי הקוטיקולה של סריגי כותנה ב- GC-MS 4.6.4.5.1 דריווטציה של הדוגמאות וסלילציה 4.6.4.5.2 אנליזת הדוגמאות ב- GC-MS 40 CBD-GUS/GFP כמדד למידת חשיפת הצלולוז 4.7 41 41 4.7.1 ביטוי וניקוי CBD-GUS/GFP מהחיידק E. coli 4.7.1.1 ניקוי החלבון CBD-GUS 41 4.7.1.2 ניקוי החלבון CBD-GFP 42 4.7.1.3 שיטה אלטרנטיבית לניקוי החלבון CBD-GFP 42 43 43 43 קביעת פעילות CBD-GUS בשיטה פלורימטרית 4.7.2.1 קביעת קינטיקת ה- CBD-GUS הקשור לסריג על הסובסטרט MUG 4.7.2.2. קביעת קינטיקת הקישור של CBD-GUS לסריג 4.7.2.3 עקומת כיול ל- MU 4.7.2 45 45 תוצאות 5.1 אפיון האנזימים ששימשו לניסיונות סקורינג.5

45 46 5.1.1 קוטינאז Pectin lyase 5.1.2 תוכן עניינים (המשך) עמוד 47 48 Polygalacturonase 5.1.3 5.2 הפקה וניקוי האנזים קוטינאז מהפטרייה Fusarium oxysporum 5.3 הידרוליזה אנזימתית של Pectin lyase,cutinase 73 73 75 79 ו- Polygalacturonase על המעטה של סיב כותנה 5.3.1 הידרוליזה כימית עם NaOH 5.3.2 הידרוליזה אנזימתית עם קוטינאז 5.3.2.1 השפעת חומרים משטחים על יעילות התגובה האנזימתית של קוטינאז עם סריגי כותנה 83 88 5.3.3 הידרוליזה אנזימתית עם polygalacturonase ו- pectin lyase 5.3.4 הידרוליזה אנזימתית עם שילוב של קוטינאז ופקטין ליאז 90 CBD 5.4 כמדד למידת חשיפת הצלולוז 100 106 107 6. דיון 7. סיכום 8. רשימת ספרות

רשימת טבלאות ואיורים טבלאות מספר טבלה 1 2 3 4 5 6 כותרת טבלה הרכב ממוצע של סיבי כותנה בוגרים והדופן הראשונית/שכבת הקוטיקולה ניתוח הרכב השעוות של סיבי כותנה אנליזת detection) HPLC-ELSD (evaporative light-scattering למונומרים של קוטין מפרי הלימונית תאור האנזימים ששימשו במחקר. טבלת ניקוי לאנזים קוטינאז מ-.F oxysporum (מבחן לאסתראזות עם (p-nitrophenyl butyrate המרכיבים העיקריים של שעוות סריגי כותנה גולמיים (מיצוי בדיכלורומתאן חם במערכת סוקסלט במשך הלילה) כפי שזוהו ב- GC- MS עמוד 6 8 11 28 68 77 איורים מספר איור 1 2 3 4 5 6 7 כותרת איור הנצה (A) והתפתחות (B) של תאי סיב בדופן הביצית, בשחלה שבפרח הכותנה מבנה סיב הכותנה הבוגר דופן תא של סיבי כותנה מבנה המונומרים העיקריים של הקוטין מודל תיאורטי המתאר את דופן התא המכילה סוברין סכמה המתארת את המבנה והאינטראקציות של פולימרים של פקטין בדופן התא הראשונית מנגנון הפעולה של חמישה סוגי הפקטינאזות הנפוצים ביותר: Pectin lyase, Pectin esterase, exo-polygalacturonase, endo- Pectate lyase ו- Polygalacturonase עמוד 5 7 10 11 14 16 22

מספר איור 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 כותרת איור מודל המדגים את השימוש ב- CBD-GUS לדווח על אתרי צלולוז חשופים מבנה משפחה II של CBD s סינתזת הסובסטרט ester) 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone hexadecanoate סכמה המתארת את המבחן לאסתראזות וקוטינאז עם p-nitrophenyl butyrate p-nitrophenylbutyrate פעילות האנזים קוטינאז כתלות בריכוז הסובסטרט השפעת ריכוזים עולים של pectin lyase על פרוק polygalacturonic D-galacturonic acid והופעת התוצר acid potassium salt הקינטיקה של שחרור D-galacturonic acid בהשפעת האנזים polygalacturonase פעילות אסתראזות, ריכוז חלבון ו- ph בנוזל החוץ תאי במהלך גידול הפטרייה Fusarium oxysporum על גבי מצע מכיל קוטין תפוח מלא ירידה ב- ph התמיסה כתגובה לפעילות האנזים קוטינאז דעיכה בפעילות השאריתית של האנזים קוטינאז בנוכחות קוטין תפוח מלא והידרוליזאט של קוטין תפוח ירידה בפעילות הספציפית של האנזים קוטינאז בנוכחות הידרוליזאט של קוטין תפוח פעילות אסתראזות חוץ תאיות במהלך גידול הפטרייה Fusarium oxysporum על גבי מצע נוזלי מכיל הידרוליזאט של קוטין תפוח השפעת 1-Hexadecanolכמקור הפחמן במצע הגידול על פעילות אסתראזות בנוזל החוץ תאי במהלך גידול הפטרייה Fusarium oxysporum שחרור קוטינאז הספוח לתפטיר ולמרכיבי הקוטין במצע גידול של.F oxysporum השפעת תוספת מתנול (10%) וסוניקציה sec) 3x30, רציף) על הפרדת קוטינאז ממרכיבי המצע ומתפטיר הפטרייה Fusarium oxysporum כרומטוגרם ELSD-RP HPLC של הסובסטרט (16-4-nitrophenyl methyl sulfone ester) hexadecanoate עמוד 23 24 35 38 45 46 47 49 50 51 52 53 54 55 56 57

מספר איור 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 כותרת איור פענוח המבנה של הסובסטרט לקוטינאז (16-methyl 4-nitrophenyl H+-NMR - ב, sulfone ester) hexadecanoate תרשים התגובה של קוטינאז עם הסובסטרט -16) 4-nitrophenyl,methyl sulfone ester) hexadecanoate לקבלת p-nitrophenol צהוב מבחן ייחודי לקוטינאז על ידי שימוש בסובסטרט -16) 4-nitrophenyl methyl sulfone ester) hexadecanoate אנליזת ELSD-RP HPLC של הסובסטרט -nitrophenyl (16-methyl 4 sulfone ester) hexadecanoate לפני (untreated) ואחרי (treated) עיכול עם קוטינאז השפעת ריכוז הסובסטרט ester) 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone hexadecanoate וזמן ההדגרה על מהירות הריאקציה עם קוטינאז השתנות פעילות קוטינאז כתלות בריכוז הסובסטרט 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate (עקומת מיכאליס-מנטן) ליניאריזציה של גרף הפעילות כתלות בריכוז הסובסטרט על פי המודל של Hanes הפרדה ב- HPLC המצויד בקולונת Superdex 200 של מרכיבי הנוזל החוץ תאי המרוכז שהופק מ- Fusarium oxysporum ניקוי קוטינאז הפרדת מקטעים פעילים במחליף אניוני,Q Mono ph=8 השלב האחרון בניקוי האנזים קוטינאז הפרדה במחליף אניוני Mono Q, ph=9 הפרדה בג'ל SDS-PAGE של תוצרי הניקוי של קוטינאז שהופק מהפטרייה Fusarium oxysporum ניקוי והפרדת אסתראזות בג'ל IEF ג'ל IEF לקביעת חלבון, פעילות אסתראזות ופעילות קוטינאז לאחר שלב הניקוי בקולונת סופרדקס 200 הידרוליזה כימית של מעטה סריגי כותנה בהרתחה למשך 30 דקות עם NaOH השפעת ריכוזים עולים של האנזים קוטינאז (A), בהדגרה ל- 20 שעות, או זמני הדגרה עולים (B), עם 12.8 U/ml פעילות התחלתית של האנזים קוטינאז, על הפסד המשקל וכושר ההרטבה של סריגי כותנה עמוד 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 70 71 72 74 76

מספר איור 39 40 41 42 43 44 45 46 כותרת איור אנליזה של נגזרות טרימתיליות של מרכיבי שעוות סריגי כותנה גולמיים ב- GC-MS השפעת תוספת דטרגנטים מסחריים על פעילות האנזים קוטינאז השפעת דטרגנטים על יעילות הידרוליזת הקוטיקולה של סיבי כותנה על ידי קוטינאז השפעת דטרגנט על הופעת תוצרי פרוק שומניים בטיפול עם קוטינאז השפעה של (PL) Pectin lyase ו- (PG) Polygalacturonase על שינויים בסריג כותנה גולמי ובנוזל התגובה השפעת טיפול כימי ב- NaOH ואנזימתי ב- polygalacturonase על חשיפת הצלולוז (צביעה ב- (Congo red והעלמות הפקטין (צביעה ב- (Ruthenium red בסריגי כותנה השפעת טיפול קוטינאז U/ml) (80 ו- U/ml),Pectin lyase (200 בנפרד ובמשולב, על סריגי כותנה גולמיים מבחן איכותי לקישור CBD-GUS לסריגי כותנה, עם הסובסטרט -X GlcA עמוד 78 79 81 83 85 87 89 91 47 צילום במיקרוסקופ קונפוקלי של קישור CBD-GFP לסריגי כותנה 92 מטופלים בקוטינאז U/ml) 80 93 94 95 97 98 הקינטיקה של האנזים,(GUS) β-glucuronidase המאוחה ל- CBD לאחר הקישור לסיבי כותנה חסרי שעוות (סריגים לאחר הלבנה כימית תעשייתית), שטיפת עודפי החלבון והדגרה עם הסובסטרט MUG בחינת השפעת זמן ספיגת המים בסריג על קישור CBD אליו קישור CBD-GUS אל סריגי כותנה חסרי שעוות (מולבנים כימית) במשקלים עולים השוואת המדד המתבסס על קישור CBD למבחן ההרטבה המקובל השפעה של pectin lyase לבד ובתוספת ריכוז נמוך של קוטינאז על כושר הרטבה, אובדן משקל וקישור CBD לסריגי כותנה גולמיים 48 49 50 51 52

תקציר סיב הכותנה הוא בעל מבנה רב שכבתי שנלמד ואופיין באופן מעמיק. למבנה הדופן הראשונית של סיבי כותנה ובמיוחד לשכבת הקוטיקולה שבשטח הפנים יש השפעה רבה על מאפייני הכותנה. המרכיבים ההידרופובים שבקוטיקולה מגינים על הסיב מנזקי סביבה ומהתקפת פתוגנים ומונעים ספיגת מים על ידי הסיב. הקוטיקולה עשויה מרכיב מבני המכונה קוטין. זהו פוליאסתר לא מסיס המורכב בעיקר מחומצות שומן רוויות בנות 16 או 18 פחמנים, המכילות קבוצת הידרוקסיל אחת או יותר. הקוטיקולה קשורה לדופן התא הראשונית על ידי פקטין מאוסתר. בתעשיית הטקסטיל מוסרת הקוטיקולה בשלבים המוקדמים של ניקוי הבדים, בתהליך המכונה,scouring במטרה להקנות לבדים כושר ספיגת מים ולאפשר צביעה וגימור אחידים. השיטה המקובלת ל- scouring של בדי כותנה היא באמצעות הרתחה ב-,NaOH אך היא גובה מחיר אנרגטי יקר וכרוכה בשפכים הקשים לטיפול ועל כן הופנה בשנים האחרונות מאמץ למציאת פתרונות חלופיים. מחקר זה נועד ללמוד את התנאים להידרוליזה אנזימתית של קוטיקולת סיבי הכותנה ואת מאפייניה, תוך שימוש באנזים קוטינאז, לבד ובמשולב עם pectin lyase הפועל בתנאי ph וטמפרטורה דומים, ותוך השוואה לאנזים polygalacturonase ולטיפול הכימי עם.NaOH האנזים קוטינאז הופק מהפטרייה הפתוגנית Fusarium oxysporum על ידי השראת הפרשתו לנוזל החוץ תאי באמצעות מצעים המכילים קוטין, מרכיבי קוטין או.1-Hexadecanol האנזים נוקה ואופיינו מספר תכונות ביוכימיות והרכב חומצות האמינו שלו. לצורך אפיון הפעילות ומדידתה סונתז סובסטרט ספציפי,4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate שנועד לשמש למדידה ספקטרופוטומטרית ויוכל להחליף את השיטה הרדיואקטיבית המסורתית לזיהוי קוטינאז. במקביל נעשה שימוש באנזים נקי שמקורו ב- Interspex products ) Pseudomonas mandocino (Inc. לבדיקת השפעת הטיפול האנזימתי בקוטינאז על סריג כותנה גולמי. הטיפול בקוטינאז גרם לירידת משקל ועליה בכושר ההרטבה כתוצאה מפרוק הקוטיקולה וחשיפת הצלולוז. בהשפעת ריכוזים או זמני הדגרה עולים של קוטינאז עלו כושר ספיגת המים ואובדן המשקל של הסריגים המטופלים. השפעה דומה הושגה בעקבות טיפול ב- polygalacturonase,pectin lyase או הטיפול הכימי עם.NaOH הטיפול הכימי גרם להידרוליזה מוחלטת של הקוטיקולה שהתבטאה ברמת הרטבה טובה אך גם בירידת משקל גבוהה בהשוואה לטיפול האנזימתי הספציפי בקוטינאז שהביא לרמת הרטבה טובה עם אובדן משקל נמוך. תוספת דטרגנטים שונים גרמה להגברת ההשפעה של האנזים קוטינאז על כושר ספיגת המים של הבדים המטופלים ולשחרור מוגבר של מרכיבי הקוטיקולה לנוזל התמיסה. מדידת השינויים בנוזל התגובה ירידת ph כתוצאה משחרור חומצות שומן לנוזל ועליה בכמות התוצרים שזוהו באמצעות HPLC המצויד בגלאי- evaporative light (ELSD),scattering detector שימשה כמדד נוסף לפעילות האנזימתית והכימית. אנאליזת התוצרים באמצעות GC-MS הראתה כי התוצרים העיקריים שהשתחררו מהסריג בעקבות הטיפול עם קוטינאז היו חומצות שומן רוויות בנות 16 ו- 18 פחמנים. 1

שילוב של קוטינאז יחד עם pectin lyase גרם לאפקט סינרגיסטי בדומה לסינרגיזם שנמצא באנזימים אחרים. נראה כי פעולת האנזים קוטינאז מביאה לפרוק הקוטיקולה ומאפשרת בכך את חדירת האנזים pectin lyase לדופן הראשונית ועיכול מרכיבי הפקטין המחברים בין הקוטיקולה לדופן זו. שיטה חדשה העושה שימוש באתר חלבוני הנקשר באופן טבעי ובאפיניות גבוהה לצלולוז: Cellulose (CBD),Binding Domain פותחה במטרה לאפשר קביעה מדויקת של מידת עיכול הקוטיקולה על ידי האנזים קוטינאז וכמדד ל- scouring בכלל. לצורך כך נעשה שימוש ב- CBD מאוחה עם -β 4-methyl שימש GUS כסובסטרט לקביעת רמת הפעילות של.glucuronidase (GUS) (MUG) umbelliferyl-β-d-glucuronide המשחרר את תוצר ההידרוליזה הפלורוסנטי, (MU).Methylumbelliferone החלבון CBD-GUS הופק על ידינו מהחיידק.E coli שעבר טרנספורמציה ושימש לניסויים עם סריגים שעברו טיפול אנזימתי או כימי. הקשירה הספציפית של ה- CBD לצלולוז שנחשף באתרים בהם עברה הקוטיקולה עיכול, הוכחה ככלי יעיל ללימוד השפעת הטיפולים השונים על הבד. נמצא שפעילות GUS הקשור באמצעות CBD לצלולוז שבסיב, היא בהתאמה לדרגת הסרת הקוטיקולה ולעלייה ברמת ההידרופיליות ולפיכך מהווה ה- GUS-CBD מדד ספציפי ומדויק לקביעת רמת ה- scouring של סיבי כותנה. 2

רשימת קיצורים CBD Cellulose Binding Domain CMC Critical micelle Concentration CUT - Cutinase DCM - Dichloromethane DDW Double distilled water ELSD - Evaporative Light Scattering Detector GC - Gas Chromatograph GC-MS - Gas Chromatograph Mass Spectrometer. GFP Green fluorescent protein GUS - β-glucuronidase HPLC - High Pressure Liquid Chromatogrph IEF - isoelectric focusing MU Methylumbelliferone MUG 4-methyl umbelliferyl-β-d-glucuronide NMR Nuclear magnetic resonance PBS - Phosphate-buffered saline PG - Polygalacturonase PL - Pectin lyase PNP - Paranitrophenyl RP Reverse phase THF - Tetrahydrofuran TWEEN 80 Polyoxyethylene-sorbitan monooleate UV - Ultra Violet X-GLUC - 5-bromo-4-chloro-3indolyl β-d-glucuronide 3

1. מבוא שטח הפנים של סיבי כותנה גולמיים עשוי קוטיקולה שעוותית המקנה להם הידרופוביות גבוהה שאינה מאפשרת צביעה ועיבוד. לצורך הכנת בדים צבעוניים עוברים הבדים הגולמיים תהליך ניקוי water ) שמטרתו הרחקה של מרכיבים לא צלולוזים מהסיבים ובכללם גורמי דחיית המים (scouring).(repellent layer תהליך זה מתבצע כיום על ידי הרתחת הבדים בתמיסת.NaOH ריכוז המלחים הגבוה בתוצרי תהליך זה מקשים מאוד על טיפול בהם לצורך שימוש חוזר. בנוסף, תוצרי הלוואי של ניקוי הבדים בפרט, ושפכי תעשיית הטקסטיל בכלל, מהווים מפגע סביבתי ולכן רוכז בשנים האחרונות מאמץ למציאת פתרונות חלופיים. מספר קבוצות מחקר בחנו את השימוש באנזימים לתהליך הניקוי. תעשיית הטקסטיל היא אחת הצרכניות העיקריות של אנזימים הידרוליטים ולפיכך מהווה מועמד עדיף ליישום טכנולוגיה אנזימתית חדשה. לשימוש באנזימים בהיבט זה, יתרונות חשובים נוספים: הם עשויים להשתלב בתהליכים האנזימתים המבוצעים כיום (בעיקר שימוש בעמילאז ל- desizing ובצלולאז לשחיקת הצבע בבדי ג'ינס) ולקצר את זמן הייצור, להקטין את עלויות הייצור (הורדת הטמפרטורה) ולשפר את תדמית המוצר. בין האנזימים שנבדקו נכללים צלולאזות, ליפאזות ופקטינאזות. צלולאזות נמצאו יעילות הן להלבנה והן להסרת שעוות הבד, אך הן תוקפות את שכבת הצלולוז האמורפי, מחלישות את חוזק הסיבים ובנוסף פועלות בתנאי ph חומציים שאינם מתאימים לתנאים הנהוגים בתהליך העיבוד. מנגד ליפאזות דווחו במרבית המקרים כבלתי יעלות. פקטינאזות נמצאו במרבית המקרים כאנזים מתאים בשל יכולתן לפרק את שכבת הפקטין הקושרת את הקוטיקולה השעוותית לדופן הראשונה העשויה צלולוז. המגבלה בשימוש בפקטינאזות נובעת מיעילות חדירה נמוכה אל תוך שכבת הפקטין המכוסה במעטה שעוות. מחקר זה, בדק לראשונה את השימוש באנזים קוטינאז, לעיכול הקוטיקולה על ידי פרוק המרכיב הסטרוקטורלי שלה, הקוטין. לחקר פעילות האנזים קוטינאז על שעוות סיבי כותנה חשיבות מדעית ויתרונות מעשיים. מחד קיימים פערי מידע בכל הקשור בפעילות קוטינאז על קוטיקולת סריגי הכותנה בפרט ועל שעוות בכלל, ומאידך פעילות האנזים ב- ph בסיסי ואופייה של פעילות זו מקנים לו יתרונות בשימוש עם סריגים: פעילות האנזים אינה פוגעת בחוזק סיבי הצלולוז ומובילה לפרוק הדרגתי של הקוטיקולה המקל על חדירת פקטינאזות לדופן הראשונית. פעילות זו אף מאפשרת, בעת הצורך, שמירה על חלק מהשעוות הטבעיות התורמות לאיכות הסריגים. 4

2. סקירת ספרות 2.1. סיבי הכותנה מיני הכותנה שייכים לסוג Gossypium ממשפחת החלמיתיים.(Malvaceae) לפני פתיחת פרח הכותנה, הוא כבר מכיל ביציות (ovules) קטנות מאוד הנמצאות בשחלה seed-case).(ovary or כיומיים לפני הפתיחה מתחילים חלק מהתאים במעטה החיצוני של כל ביצית להתארך במהירות (איור 1). אם לאחר פתיחת הפרח תתרחש הפריה, ימשיכו תאים מיוחדים אלו להתארך עד שלבסוף ייווצר זרע הנושא עליו סיבי כותנה (1961.(Lord, A B איור 1 הנצה (A) והתפתחות (B) של תאי סיב בדופן הביצית, בשחלה שבפרח הכותנה. לאחר ההפריה מתארכים התאיים ויוצרים סיב. ניתן לראות את הגרעין בדופן של כל תא סיב מתפתח (רימון, 1985). Fig. 1 Budding (A) and development (B) of fiber cells in the ovary of the cotton flower. Following fertilization the cells elongate and form the fibers. Each of the developing fiber (B) contains a nucleus. החומר היבש של סיבי כותנה מכיל כ- 94% צלולוז ו- 6% פולימרים אמורפים ומלחים (טבלה 1). 5

טבלה 1 הרכב ממוצע של סיבי כותנה בוגרים והדופן הראשונית/שכבת הקוטיקולה (1999 al., Husain et רימון, 1985). Table 1 The composition of mature cotton fibers and of the cuticle and primary cell wall (Husain et al. 1999 ;.(רימון, 1985 מרכיב Constituent צלולוז פקטין שעוות חלבונים אפר אחר בסיב כולו In the fiber 94% 1.2% 1.3% 0.6% 1.2% 1.7% בקוטיקולה ובדופן הראשונית In the cuticle and primary wall 54% 9% 14% 8% 3% 12%,(Lord, 1961 ; דופן סיב הכותנה אינה הומוגנית ובנויה מארבע שכבות שונות (1965 Hamdy הכוללות מבחוץ פנימה (איור 2): קוטיקולה שכבה שעוותית חיצונית, מכילה קוטין, פקטינים וחלבונים. שכבה זו דוחה מים ומגנה על הסיב..I 14% 54% דופן ראשונית - הדופן הדקה המקורית של התא המורכבת מ- צלולוז,.II (U.S. חלבונים, 9% חומרים פקטינים, 8% שעוות, 3% אפר ו- 4% קוטין/ סוברין AIC-61 Publication).Dept. of Agriculture הדופן הראשונית מכילה את הגרעין ופרוטופלסמה, המהווים את החלק החי של תא הסיב. הצלולוז בדופן הראשונית יוצר חוטים דקים או.microfibrils מיקרופיברילות אלו אינן רצות באופן מקביל לסיב, אלא מונחות באופן אקראי. על כן הצלולוז בדופן הראשונית הוא אמורפי בהרבה מזה שבדופן השניונית. בחלק מהעבודות הראו כי המיקרופיברילות סובבות את הציר המרכזי בזווית של כ- 70. 0.III דופן שניונית - המהווה את המרכיב המשקלי העיקרי בסיבים, מכילה כמעט אך ורק צלולוז גבישי. שכבת הדופן השניונית שנוגעת בדופן הראשונית, מכונה שכבת פיתול,(winding) על מנת שניתן יהיה להבחין בינה לבין השכבה הפנימית הקרובה יותר ל- lumen (שכבת ההתעבות). סיבי הצלולוז (fibrils) מונחים כשכבות היוצאות ממרכז משותף ולהן צורת ספירלות (קוצנטריות). - lumen החלל המרכזי המכיל לעתים תרכובות חנקן או פרוטופלסמה יבשה..IV 6

דופן שניונית דופן שניונית דופן ראשונית דופן ראשונית קוטיקולה קוטיקולה לאומן לומן שכבת התעבות שכבת פיתול איור 2 מבנה סיב הכותנה הבוגר (1975.(Hunter, Fig. 2 Structure of a mature cotton fiber (Hunter 1975). 2.2. שכבת הקוטיקולה 2.2.1. כללי שכבת הקוטיקולה המכסה את הדופן החיצונית של האפידרמיס בחלקים החשופים בצמחים רבים מאיטה את קצב איבוד המים ומהווה שכבת מגן שבלעדיה חילוף החומרים עם הסביבה יהיה כה מהיר עד כי הצמח ימות (1965 Hamby,.(Jefree, 1982 ; הקוטיקולה מעניקה בנוסף הגנה כנגד פתוגנים וכנגד פגיעות מכניות קלות (1985;1987.(Kolattukudy, חשיבות הקוטיקולה לחקלאות היא בכוחה לדחות מים, ובכך היא מאפשרת לרסס צמחים בריסוסים על בסיס מים מבלי לפגוע בצמח עצמו. הקוטיקולה בנויה כמבנה רב שכבתי שבו שכבת שעוות (wax) חיצונית, שכבה דקה פנימית המכילה קוטין משובץ בשעוות proper) (the cuticle והשכבה הפנימית ביותר layer) (the cuticular המורכבת מקוטין ושעוות המעורבים עם מרכיבי דופן התא פקטין צלולוז וקרבוהידראטים נוספים ) and Taiz.(Zeiger, 1998 מחקר מאוחר מציע כי הקוטיקולה מכילה פולימר ליפידי נוסף, עשוי שרשרות פחמניות ארוכות, המכונה.(Jefree, (1996 cutan קוטין ושעוות מסונתזים ע"י האפידרמיס ומופרשים לשטח הפנים בדרך לא ידועה. 7

2.2.2. המעטה של סיבי כותנה צילומים במיקרוסקופ אלקטרוני סורק של הקוטיקולה בסיבי כותנה מראים לרוב פני שטח אמורפים, למרות שלעיתים נמצא גם מבנה משוכב. הקוטיקולה בסיבי כותנה קשורה לדופן התא האפידרמלי באמצעות פקטין.(Kolattukudy, 1985) פקטין ומרכיבים לא צלולוזים אחרים בקוטיקולה (חלבונים, שעוות וקוטין) מצויים במצב אמורפי ומהווים כ- 2.5% ממשקל הסיב ) ;1951 al., Tripp et Hardin,1998.(Li and לפי (1997) Hardin Lin and מהווה הקוטין 8.7% מהרכב הקוטיקולה של סיבי כותנה בוגרים יבשים (היות ומולקולות הקוטין מוקפות בשעוות, קשה להפרידן ועל כן אנליזות כימיות רבות מתייחסות לשני מרכיבים אלו יחד ומכנות אותם בשם שעוות).( 1965 ),Hamdy (1955) Guthrie Lin and Hardin (1997) ; ו-( 1975 ) Hunter מצאו כי שעוות מהוות בד"כ 0.6% מההרכב של סיבי כותנה בשלים (עם סטיות של 0.4-1.3% לפי הראשונים או 0.3-1% לפי האחרון). לפי Hunter העובי של השעוות בכותנה אמריקאית הוא כ- 0.025. µm כמות השעוות תלויה במקור הכותנה, בבשלות הסיבים ובעובי שלהם, אולם היא אינה מושפעת כמעט מתנאי הגידול. בסיבים דקים ניתן למצוא יותר שעוות מבסיבים עבים. קומפלקס השעוות מכיל אלכוהולים מונוהידררים, אסתרים וחומצות ווקס, יחד עם הידרוקרבונים, חומצות שומן, חומצות שרף, אלכוהול, גליצרול, סטרולים, חומצה סתארית, מגוון הידרוקרבונים, חומצה אולאית ועוד (טבלה 2). גליקול, טבלה 2 ניתוח הרכב השעוות של סיבי כותנה (1975 (Hunter,. Table 2 Analysis of cotton fiber waxes (Hunter, 1975) אחוז מכלל השעוות של סיבי כותנה מרכיב Percent of the total cotton Constituent fibers waxes 24% חומצות שומן רוויות חומצות שומן לא רוויות 52% - אלכוהול 10% סטרולים 7% הידרוקרבונים 6% מרכיבים לא פעילים קומפלקס השעוות של הקוטיקולה נצבע ב- sudan black, sudan red ו-,oil red על מנת לאפשר צפייה בו במיקרוסקופ אור, אך בהירות לא תמיד מושגת, אלא אם כן הסיב מטופל בקצרה באתיל אלכוהול רותח. 8

הפקטין בדופן הראשונית יצבע למטרה זו בתמיסה מימית של דיסולפט בסיסי, כמו למשל Nile Blue Sulphate Methylene biue או ruthenium red המגיבים עם הקבוצה הקרבוקסילית ברקמה (1965.(Hamdy, בתעשיית הטקסטיל מתבצעת הסרת שכבת השעוות ע"י חימום (נקודת ההתכה שלהן סביב 70-76) עם סודיום הידרוקסיד מהול. שימוש בכמויות קטנות של sulfonated oils 0 C מסייעים באמולסיית השעוות. (1975) Hunter מצא כי 0.1-0.3% מהשעוות נשארות לאחר כל תהליך המירוק וההלבנה הנהוגים בתעשיית הטקסטיל. ניתן להסיר את השעוות לשם אנליזה שלהן על ידי מיצוי עם ממס אורגני (כלורופורם, פחמן טטראכלוריד, בנזן וכו'). בנזן משמש לקביעה כללית של כמות השעוות בסיבים, למרות שבמקרים מסוימים נעשה שימוש באתיל אלכוהול חם (מיצוי השעוות במקרה זה מטופל לאחר מכן עם כלורופורם ומים). 2.3. קוטין קוטין (cutin) הינו פולימר לא מסיס המהווה את המרכיב הסטרוקטורלי של המטריקס העוטף את תאי האפידרמיס בפני השטח של צמחים עילאיים al.,1993).(schmutz et קוטין מונח בדרך כלל במהלך התארכות סיב הכותנה מבחוץ ובתוך החלק החיצוני של דופן התא האפידרמלי. בשונה ממנו סוברין נוצר לאחר שהסיב סיים את התארכותו והוא נמצא בדופן השניונית, בסמוך לממברנת הפלסמה (איור 3). 9

A B איור 3 דופן תא של סיבי כותנה. A. צילום במיקרוסקופ אלקטרוני של דופן תאי אפידרמיס צבועים של כותנה lint) :PW.(white דופן ראשונית. :SW דופן שניונית. החצים מראים על העלמות השכבה האוסמיאופילית (Bar=3μm) B..(Ryser et al., (1983 סכמה המתארת את התפקיד המשוער של הפקטין בקישור הקוטיקולה לדופן הראשונית של סיב הכותנה (1985.(Kolattukudy, Fig. 3 Cell wall of cotton fiber. A. Transmission electron microscopy of cotton (white lint) epidermis cell wall. PW: primary wall, SW: Secondary wall. Arrows point at zones of disappearance of the osmeophilic layer (Bar=3μm ) (Ryser et al., 1983). B. Model describing the pectin role in adhering the cuticle to the cotton fiber primary cell wall. (Kolattukudy, 1985). 10

קוטין הוא פולימר הטרוגני המכיל מגוון צרופים של תרכובות המשתייכות ל- 2 קבוצות של חומצות שומן: קבוצה אחת עם 16 פחמנים ושנייה עם 18 פחמנים (1982 Holloway, (Kolattukudy, 1980 ; (איור 4). בני המשפחה הראשונה הם 16-C וכוללים palmitic acid, 16-hydroxypalmitic acid ו-.9,16-and 10,16-dihydroxyhexadecanoic acid בני המשפחה השנייה הם -C 18 המופיעים גם בקוטין וגם ב- suberin וכוללים 9,10-epoxy-18-hydroxy, oleic acid, 18-hydroxyoleic acid 9,10,18-trihydroxyoctadecanoic acids יחד עם מרכיבים רוויים של האנאלוגים.(Kolattukudy, 1973, Holloway,1982, Kolattukudy, 1985 Purdy and ) Δ 12 איור 4 מבנה המונומרים העיקריים של הקוטין (1985.(Kolattukudy, Fig. 4 Structure of the main cutin monomers (Kolattukudy, 1985). מרביתן של חומצות שומן אלו הן בעלות 2 או יותר קבוצות הידרוקסיליות. קוטין מ-,Lime בוצע ע"י al.(1994) Ray et (טבלה 3). ניתוח המונומרים של 11

טבלה 3 אנליזת detection) HPLC-ELSD (evaporative light-scattering למונומרים של קוטין מפרי הלימונית (1994 al., Area.(Ray et הוא השטח היחסי של פיק מסוים מתוך כלל שטחי הפיקים המתקבלים בהפרדה ו- R t הוא זמן יציאת הפיק time).(retention Table 3 HPLC-ELSD (evaporative light-scattering detection) analysis of lime cutin monomers (Ray et al., 1994). Area is the relative area of a spesific peak as precentages of the total. R t is the retention time. Methyl esters Area R t Area המונומר (Monomer) Hexadecanoic, octadecanoic 10-hydroxyhexadecanoic 18-hydroxyoctadeca-9,12-dienoic 18-hydroxyoctadeca-9-enoic 16-hydroxyhexadecanoic 16-hydroxy-9-oxo-hexadecanoic 16-hydroxy-10-oxo-hexadecanoic 9,16-dihydroxyhexadecanoic 10,16-dihydroxyhexadecanoic חומצות (Acids) R t (%) (min) (%) (min) 3.9 2.4 3.7 2.4 7.8 6.3 0.95 9.5 0.5 11.4 0.8 13.8 4.4 12.5 1.7 14.4 4.3 13.2 2.8 15.5 2.0 19.2 4.8 21.7 30.2 20.2 51.0 22.7 3.2 25.1 2.9 26.6 29.4 26.8 27.9 28.1 קבוצות תפקודיות נוספות כגון אלדהידים נמצאות לפחות במינים מסוימים. האופי הפולימרי של קוטין נובע מקשרים אסתרים, המחברים קבוצות הידרוקסיליות וקרבוקסיליות בקבוצות השומן השונות. בנוסף נמצאו גשרי פרוקסיד וקשרים אתרים (1973 Kolttukudy,.(Purdy and כמויות קטנות של תרכובות פנוליות נוכחות אף הן בקוטין ויתכן שתפקידן לקשור בקשרים אסתריים את חומצות השומן לפקטינים של דופן התא האפידרמלי.(Hunter,1975) קוטין הוא יחסית אינרטי ונמצא גם במיני צמחים קדמונים. רק אורגניזמים מעטים מסוגלים לפרק קוטין ומתוכם מעטים בלבד מסוגלים להתקיים עליו כמקור הפחמן היחיד שלהם (1973 Kolttukudy,.(Purdy and 12

2.4. סוברין שכבות סוברין נמצאות בצמוד לקיר התא או בתוכו, באקסודרמיס ובשכבת השעם של הפרידרם, והן מאופיינות במבנה רב שכבתי (lamella).(schmutz et al., (1993 הוצע כי הסוברין מהווה מחסום הגנה באינטראקציות בין צמחים לפתוגנים. כמו כן הוא מהווה מרכיב עיקרי של נגזרות החומצה הצינמית בשעוות של תאי האפידרמיס בזרעי הכותנה, העשויות לתפקד כתרכובות רעילות כנגד פתוגנים פולשים (1993 al.,.(kolattukudy, 1987 Schmutz et סוברין בדומה לקוטין הוא פולימר לא מסיס אך בשונה ממנו הוא קשור לשעוות מסיסות (1980.(Kolattukudy, באמצעות מדידות אולטראסטרקטורליות וכימיות נמצא כי תאי אפידרמיס של זרעי הכותנה מיצרים הן קוטין והן סוברין 1983) al., (1983) Ryser et al.(ryser et מצאו כי סיבי כותנה ירוקה ) Gossypium (hirsutum מכילים סוברין במקום קוטין כפולימר הדומיננטי בדופן התא. הפולימר העיקרי של סוברין זה זוהה כ- 22-hydroxydocosanoic acid (65%) ונמצא בכמויות קטנות גם במיני הכותנה הלבנה. המצאות מרכיב זה במינים הלבנים של הכותנה מצביעה על כך שסוברין מסוים מופיע בהם ככל הנראה בדומה לכותנה הירוקה בשכבת הלמלה האוסמיאופילית הנמצאת בדופן השניונית של התא. עם התפתחות הדופן השניונית הרדיאלית נעלמת שכבת הלמלה ונשאר הסוברין (חצים, איור 3A). המבנה הכימי של סוברין פחות ידוע מאשר זה של קוטין ואחת הסיבות לכך היא הקושי להפרידו מדופן התא (1985.(Kolattukudy, מתוך המידע שהצטבר הניח (1985) Kolattukudy מודל המתאר את המבנה וההרכב של סוברין (איור 5). 13

Cell wall Cell wall Phenolics Aliphatics Dark Light איור 5 מודל תיאורטי המתאר את דופן התא המכילה סוברין.(Koklattukudy,1985) Fig. 5 Theoretical model describing the cell wall suberin. לפי מודל זה, שייר פנולי דמוי ליגנין, קשור לדופן התא. שיירים אליפאטים הדומים לאלו המרכיבים את הקוטין, קשורים לחומר פנולי זה. המרכיב הפולימרי האליפטי העיקרי בשכבות משועמות רבות הינו ω-hydroxy fatty acid והחומצות הדיקרבוקסיליות המקבילות אליו. למרות זאת, כמויות ניכרות של חומצות הידרוקסי ואפוקסי, יותר פולריות, הדומות למרכיבים העיקריים של הקוטין, עשויות להימצא אף הן. מודל מאוחר יותר (1993 al., (Schmutz et מציע כי חומר ארומטי, הקשור לגליצרול, קיים בסוברין של סיבי הכותנה, ומאפשר לכ- 1% מחומצות השומן הנמצאות בפולימר, לשמש כאבני יסוד לחלק מהשעוות. הרעיון כי עובי שכבת השעוות נקבע ע"י אורך חומצות השומן בסוברין נתמך ע"י ההצעה שהמבנה הרב שכבתי של הסוברין נובע מהבדלים בפולריות שלו. 14

2.5. שעוות שעוות בשונה מקוטין וסוברין אינן מקרומולקולה אלא תערובות מורכבת של ליפידים אצילים ארוכי שרשרת שהם הידרופובים מאוד. המרכיב הנפוץ ביותר בשעוות צמחים הן שרשרות ישרות של אלקאנים ואלכוהולים המכילות 25-35 אטומי פחמן. בנוסף למרכיב זה, שעוות נמצאו כמכילות גם אלדהידים ארוכי שרשרת, קטונים, אסתרים, וחומצות שומן חופשיות. השעוות של הקוטיקולה מסונתזות על ידי תאי האפידרמיס ומופרשות כטיפות דרך חורים בדופן התא במנגנון לא ידוע. ציפוי השעוות החיצוני של הקוטיקולה מתגבש לעיתים לצורות מורכבות של מקלות, שפורפרות או לוחיות (1998 Zeigar,.(Taiz and החומר הממוצה מסיבי הכותנה בעזרת כלורופורם פחמן טטרהכלוריד, בנזן וסולבנטים אורגנים אחרים מכונה לעיתים שעוות אך כולל בתוכו גם קוטין. 2.6. פקטין תרכובות פקטיות substances) (Pectic הן קבוצה של פוליסכרידים בעלי משקל מולקולרי גבוה, הנפוצים מאוד בממלכת הצמחים ומכילים בעיקר סוכרים חומצתיים דוגמת galacturonic acid המאורגנים בשרשרת, אך גם סוכרים ניאטרלים דוגמת rhamnose, galactose ו- arabinose (איור 6). פרוק פקטין משחרר בנוסף poly-galacturonic acid ו-.methyl alcohol בפקטין לא מפורק מרבית הקבוצות הקרבוקסיליות מופיעות בצורת מתיל אסתרים. הרתחת כותנה למשך חצי שעה בתמיסת 0.1% NaOH מסירה באופן מלא את הפקטין (אך גם שעוות וחלבונים) (1965.(Hamdy, מבנה ותכונות מולקולות הפקטין נתונים לשינויים ביולוגים וכימיים (סקירתם של al, 1993.(Sakai et פקטין מהווה מרכיב עיקרי ב- lamella של פרות ובדופן התא. להידרוקולואיד זה יש אפיניות למים והוא מסוגל לייצר ג'ל בתנאים מסוימים של ph וריכוז סוכר. רמת אסתריפיקציה גבוהה של מרכיבי הפקטין (מעל 85%) היא זו שתורמת למבנה הג'לי שלו. הג ל מחזיק בתוכו את הצלולוז, ההמיצלולוז ואולי אף חלבוני מבנה (1996 West,.(Godfrey and סיבי כותנה בוגרים יבשים מכילים 1.2% פקטין שמרביתו נמצאת בדופן הראשונית (1965.(Hamdy, לפי (1980) Kolattukudy הפקטין מחבר בין הקוטיקולה לבין הדופן הראשונית. 15

Cellulose microfibrile Hemicellulose איור 6 סכמה המתארת את המבנה והאינטראקציות של פולימרים של פקטין בדופן התא הראשונית. ניתן לראות כי הפקטין (בסגול) קשור להמיצלולוז (בכחול) ומקשר בין מיקרופיברילות הצלולוז (באדום).(Taiz and Zeigar, 1998) Fig. 6 Structure and interconnections of pectin polymers in primery cell wall. The pectin (purple) is bound to the hemicellulose (blue) and attach the cellulose microfibrile (red) (Taiz and Zeigar, 1998). 2.7. הידרוליזה כימית של הדופן בסבי כותנה 2.7.1 שלבים בעיבוד הטקסטיל מסיבי הכותנה מייצרים חוטים בתהליך אוטומטי של טוויה. החוט המתקבל נסרג לסריג כותנה או נארג לאריג. בתהליך האריגה מועברים החוטים שתי וערב. חוטי השתי נמצאים בתהליך האריגה תחת מאמצים עצומים של מתיחה וחיתוך העלולים לגרום לקריעתם וכתוצאה מכך להחלשתו של הבד. על מנת למנוע זאת, מוסיפים לחוטי השתי המשמשים ליצירת האריג, חומרי הדבקה על מנת לחזק אותם. תהליך זה מכונה מריקה (sizing) והוא מתרחש בטמפ' של 70. 0 C 16

חומרי המריקה הם לרוב עמילנים טבעיים בריכוזים של כ- 10-20% ממסת החוטים, אך גם עמילן סינתטי וחומרים נוספים כגון פולי ויניל אלכוהול ופוליאסתר. בסוף תהליך המריקה מתקבלים חוטים מצופים ומוגנים העוברים ייבוש על ידי מגע עם צילינדרים חמים. לאחר האריגה או הסריגה עוברים הבדים תהליכי הכנה והלבנה שנועדו לנקותם ולהכינם לצביעה. תהליכים אלו כוללים הסרת חומר המריקה באריגים,(desizing) ניקוי (scouring) והלבנה,(bleaching) בתעשייה נהוגים שני תהלכי הלבנה: הלבנה בתהליך רציף (חם או קר) המשמשת בעיקר לאריגים והלבנה במנות המשמשת בעיקר לסריגים. במרבית המערכות מבוצעים שלשת השלבים הראשונים בפעולה אחת וללא התערבות והם כרוכים בשימוש בכימיקלים קשים ובתרכובות אורגניות. התהליך המשולב מכונה הלבנה כימית ובסופו מתקבלים בדים חסרי שעוות בעלי צבע לבן בוהק. לעתים מתבצע לפני הצביעה תהליך נוסף המכונה מירצור.(mercerization) בתהליך זה עובר בד האריג בסודיום קאוסטיק 20% בטמפרטורת החדר כשהוא מתוח. כתוצאה מכך מתיישרים סיבי הצלולוז, ויוצרים שטח פנים חלק המאפשר ספיגה מוגברת של הצבע. הבד העובר תהליך זה הינו באיכות גבוהה יותר - צבעיו חזקים יותר בהשוואה לבד לא ממורצר. השלב האחרון בתהליך העיבוד הוא הצביעה. לצורך צביעה אחידה על הבד להיות נקי משעוות ועל כן נלקחת ממנו לפני הצביעה, דוגמה לבדיקת הרטבה. השיטות הפשוטות והנפוצות ביותר לבחינת כושר ספיגת המים של בדי כותנה מבוססות בסריגים על מדידת זמן הספיגה של טיפת מים בסריג, מרגע הנחת הטיפה ועד העלמות השתקפות קרני האור ממנה ) test AATTC.(Method 39-1980 לגבי סיבי כותנה לא מעובדים שיטה זו אינה מתאימה ולכן מבצעים את המבחן על ידי הנחת אגד סיבים על פני המים בכוס ומדידת זמן השקיעה עד התחתית ), Hardin Li and.(1997 2.7.2. הידרוליזה כימית של הדופן בסיבי כותנה תהליך ה- Scouring הוא הידרוליזה כימית בה מוסרות תרכובות לא צלולוזיות (שעוות, חומרי סיכה, אפר ועוד), בדופן הראשונית של הסיבים, על מנת להקנות לכותנה כושר ספיגת מים כהכנה להמשך עיבוד הטקסטיל. בדרך כלל מתבצע תהליך זה על ידי תמיסת סודיום הידרוקסיד (1-4%) במשך 30-60 דקות, בלחץ אטמוספרי, בטמפרטורה של 75-100, 0 C בסביבה אלקאלית, ph 9-10 ובתוספת מאיצים שונים (כלטורים וחומרים משטחים). בנוסף על המחיר האנרגטי היקר של תהליך זה, נחשבים החומרים הכימיים המשמשים בתהליך למזהמים הגובים מחיר סביבתי יקר. נטרול השפכים הבסיסיים שנוצרים גורם לעליית ריכוזי המלח בהם לרמות גבוהות ומגביל את השימוש החוזר בהם. על כך נוספת הסכנה שהם יחדרו לקרקע וימליחו את מקורות המים. בשנים האחרונות בוצעו עבודות רבות שבחנו את האפשרות להחליף את התהליך הכימי הקיים בתהליך ביולוגי המתבסס על אנזימים. 17

הפוטנציאל הכלכלי הטמון ב- scouring אנזימתי כולל חסכון בכמות המים ובאנרגיה (הורדת טמפרטורת מי השטיפה ל- ), 0 C30-40 תאימות עם תהליכים אחרים (למשל,(desizing היכולת לסקורינג סלקטיבי - הסרת שעוות רק מכותנה בתערובות סיבים המכילות בנוסף צמר או פוליאסתר והפחתת המפגע הסביבתי 1998) Cavaco-Paulo,.(Li and Hardin, 1997,1998 ; 2.8. הידרוליזה אנזימתית של הקוטיקולה הצמחית 2.8.1. כללי יתרונם העיקרי של אנזימים לשימוש בתהליך עיבוד הטקסטיל נעוץ בכך שהם פועלים בטמפרטורת הסביבה ונחשבים כחומרים ידידותיים לסביבה. אחד התחומים בהם מושקע מחקר רב בשנים האחרונות הוא שימוש באנזימים לתהליכי ה- scouring וה- bleaching של בדי כותנה ) and Li Hardin, 1998.(Hardin, 1997 ; Li and במחקרים אלו נעשה שימוש בליפאזות, פקטינאזות וצלולאזות ותערובות שלהן. עבודתיהם של Li and Hardin שהסתמכו על מדידת כושר הספיגה, תצפיות במיקרוסקופ אלקטרוני סורק, אנליזת תכולת החנקן ואובדן משקל בסיבי כותנה, הראו כי: I. בשכבת הקוטיקולה קיימים חרירים זעירים (micropores) או בקעים העשויים להיווצר או להתרחב בתהליך עיבוד הכותנה. האנזימים חודרים לקוטיקולה בתמיסה מימית דרך חורים זעירים אלו ויוצרים מגע עם הסובסטרט שלהם. פקטינאז הורס את מבנה קוטיקולת הכותנה ע"י עיכול הפקטין בקוטיקולה בעוד שצלולאז עושה זאת ע"י עיכול הצלולוז האמורפי שמתחת לקוטיקולה בדופן הראשונית. שעוות וחלבונים מוסרים פיסית ע"י פעילות אנזימתית זאת בגלל השבירה של המבנים המחברים אותם לפני השטח של הסיב..II המודיפיקציה האנזימתית של פני השטח של סיב הכותנה עם פקטינאזות וצלולאזות הינה תהליך פרוגרסיבי התלוי בכמות האנזים ומשך הטיפול. כבר בשלב הראשון של פעילות האנזימים (או בהשפעת טיפול מתון) מתקבל שיפור ביכולת הספיגה של הכותנה. מרכיבי הקוטיקולה מוסרים בהדרגה ככל שהטיפול כולל כמות אנזים גדולה יותר או משך זמן ארוך יותר..III כל גורם שיסייע לאנזים לבוא במגע עם הסובסטרט ובקטליזה עצמה יאיץ את תהליך המודיפיקציה האנזימתית. דוגמאות לכך הן: שימוש בחומרים פעילי שטח וערבול..IV ליפאזות או פרוטאזות שיפרו את יכולת הספיגה של סיבי הכותנה אך היו פחות אגרסיבים בהשוואה לפקטינאזות או צלולאזות בהיבט זה. V שילוב של אנזימים שונים (צלולאזות ופקטינאזות למשל) גרם להגברת ההשפעה (סינרגיזם) על סיבי כותנה בהשוואה להשפעה שהשיג כל אנזים בנפרד. 18

אף כי ליפאזות נמצאו בחלק מהמחקרים יעלות לסקורינג אנזימתי, הן הראו רגישות לחומרים פעילי שטח. קוטינאז, בן במשפחה זו, תוקף מרכיב ספציפי בשכבה החיצונית של הקוטיקולה ועד כה לא נבחן בהקשר זה. גורמים נוספים נמצאו תורמים לשיפור יעילות ההסרה האנזימתית של שעוות הבד. השפעת טלטול מכני על התגובה האנזימתית עם סיבי כותנה נסקרה בעבודתם של Hardin, 1998.Li and טלטול מכני משחרר את הקשרים בין הדופן הראשונית והדופן השניונית של הכותנה, הוא מגדיל או יוצר עוד micropores או בקעים בשטח הכותנה, הוא מגדיל את סיכויי האנזים לחדור לחרירים אלו בכך שהוא מגדיל את סיכויי ההתנגשות בין מולקולות האנזים וסיבי הכותנה והוא מקטין את הגבלת התנועה של מולקולות האנזים על ידי צלולוז הכותנה ובכך הוא מאפשר להן לנוע בין אתרי הקשירה. לעומת זאת טלטול מכני חזק עם כוחות גזירה חזקים עלול לגרום לדהאקטיבציה של האנזים. הרתחת הבדים המטופלים לפני או אחר התגובה האנזימתית עליהם, שיפרה משמעותית את ניקיון הבדים המתקבלים אך גרמה גם לאובדן משקל ולהתכווצות הסיבים ) al., Husain et.(1999 ; Hertzel and Hsieh, 1998 2.8.2. האנזים קוטינאז האנזים קוטינאז מסונתז ע"י מספר פטריות פיטופטוגניות ומשמש אותן כאמצעי לחדור לצמח הפונדקאי, ע"י עיכול אנזימי של הקוטיקולה שלו (1984 al.,.(kolattukudy et al. (1995) Kolattukudy et מצאו כי כמויות קטנות של קוטינאז הנישאות ע"י הספורות, באות במגע עם שטח הפנים של הצמח וגורמות לשחרור כמות קטנה של קוטין המהווה טריגר לביטוי הגן לקוטינאז. המבנה, התפקוד והשימושים באנזים נסקרו לאחרונה על ידי al. (1998). Carvalho et קוטינאז ממקורות שונים, בעיקר פטריות אך גם חיידקים, נוקה ואופיין על ידי קבוצות שונות. הייצור של קוטינאז מבוקר מאוד על ידי תנאי הגידול. הוא מדוכא בנוכחות גלוקוז ויצורו מושרה על ידי נוכחות קוטין הידרוליזאט או המרכיבים העיקריים של הקוטין. הקבוצה ההידרוקסילית בעמדת האומגה מהווה את הגורם החשוב ביותר להשריית פעילות האנזים ) and Murphy et. al 1996 ; Lin,Fusarium solani pisi גילו כי לפטרייה Purdy and Kolattukudy (1975).(Kolatukudy, 1978 שני איזוזימים: קוטינאז I וקוטינאז.II החוקרים מצאו כי לשני האנזימים פרופיל דומה בתנאים האופטימלים לפעולתם (לדוגמה שניהם פועלים אופטימלית ב- 10=.(pH למרות זאת, ההידרוליזה שבצע קוטינאז I על סובסטרט המודל נמצאה גבוהה פי שלושה מזו של קוטינאז.II האנזים קוטינאז שבודד מ- (Kolattukudy, 1985) Fusarium solani שובט ובוטא בחיידק Lauwereys et ) E. Coli Segt ) Saccharomyces cerevisiae מאוחר יותר פותחה מערכת ביטוי יעילה גם בשמר.(al., 1991. (and Verrips, 1995, Longhi et al, 1996 2.8.2.1 המבנה של קוטינאז 19

אנזימים ממשפחת הליפאזות שונים מאוד זה מזה בגודל וברצף חומצות האמינו שלהם, אולם כולם serine α/β hydrolases משתייכים למחלקת ה- serine esterases ולמשפחת העל של שבה ה- הנוקלאופילי (טורם האלקטרונים) נמצא בכניסה של פיתול חד מאוד בין מעטפת β וסליל Longhi ) α.(et al. 1997a לליפאזות מנגנון קטליטי הדומה לזה שקיים ב-,serine proteases הם מאופינים על ידי שלושה שיירים Ser, His ו- Asp ועל ידי אתר קישור אניוני חימצוני (oxyanion) המייצב את שלב הקישור באמצעות קשרי מימן עם שתי שרשרות של קבוצות.(Nicolas et al., (1996 amide קוטינאז אף הוא α/β הידרולאז ושייך למחלקת ה-.serine esterases המבנה בקרני X של קוטינאז טבעי הוגדר ברזולוציה של 1.0 1.25 ע"י al, (1992) Martinez et והרזולוציה הוגדלה לאחרונה ל- A 0 A 0 al.,1998).(jelsch et קוטינאז הינו מולקולה של 197 חומצות אמינו עם ממדים כלליים של כ- A 0 45X30X30 המכילה מעטפת β מרכזית ובה 5 גדילים מקבילים המכוסים על ידי 2 ו- 3 הליקסים משני צדדיה. בנוסף נמצא גדיל שלישי שאינו משתייך למרכז המעטפת. קוטינאז הינו בעל משקל מולקולרי של כ- 20-25. kd המבנה שלו יציב מאוד וכולל cysteines 4 קבועים היוצרים שני גשרי גופרית. קוטינאז מ-.F solani.f pisi מורכב מחלבון אחד ונמצא כבעל נקודה איזואלקטרית של 7.8.(Egmond et al.,1996) 2.8.2.2. מנגנון הפעולה של קוטינאז לפי (1973) Kolattukudy,Purdy and קוטינאז מ- F. solani f. pisi גורם לשחרור כל קבוצות המונומרים של הקוטין. אף כי פעילותו הטבעית של קוטינאז הינה הידרוליזה של קוטין (הוא serine hydrolase הספציפי לאסתרים אלכוהולים ראשונים המחברים את המונומרים של הקוטין), הוא מסוגל בנוסף לבקע אסתרים אחרים, חומצות שומן וכן אמולסיה של טרי-אציל-גליצרול באותה יעילות כמו ליפאזות אך ללא אקטיבציה של שטת הפנים. מבחינה תפקודית קוטינאז עשוי להיחשב כקשר בין אסתראזות וליפאזות בשל צורת הקישור שלו לסובסטרט. יש לו יכולת של שתי המשפחות: הוא קטליסט יעיל בשתי התגובות, גם בתמיסה וגם בשכבת שטח פנים שומנית. בעוד שאסתראזות פעילים רק בתמיסה מימית, פעילותם של ליפאזות מוגברת מאוד באינטרפאזה שומן-מים (שטח הפנים). ליפאזות אינם פועלים על הסובסטרט מתחת ל- (cmc) critical micellar concentration אך מראים פעילות גבוה בערכים גבוהים ממנו. אקטיבציה זו על ידי שטח הפנים הינה חיונית היות ובליפאזות אמיתיות, אתר הקשירה ההידרופובי מוסתר מהממס ע"י אזור מכסה אשר ככל הנראה נועד לסייע במניעת אגרגציה.(aggregation) במהלך הספיחה שלהן לשכבה השומנית מתרחש סידור מחדש של האזור המכסה וכתוצאה מכך גדל השטח ההידרופובי באתר הקשירה לשומן וחל שיפור ביכולת הספיחה, המאפשרת את קשירת הסובסטרט (1992 al.,.(martinez et לקוטינאז מ- F.solani pisi אין אזור מכסה ברור המסתיר את האתר הפעיל והוא אינו עובר שפעול על ידי שטח הפנים. האתר הפעיל שלו מורכב משלוש קבוצות קטליטיות Ser,120 Asp175 ו- His 188 20

(1992 al.,.(martinez et במקומו של אזור המכסה נמצא מעין 'צווארון' טעון חיובית לולאה -80 87 והלולאה היותר הידרופובית (1998 180-188 al.,,(jelsch et המשמש ככל הנראה למניעת אגרגציה באזור ההיקשרות ההידרופובי al.,1994a).(egmond et ככל הנראה האנזים קוטינאז מעצב פתח זה בעת הקשירה לסובסטרט, כמו בליפאזות אמיתיות, לפתח אניוני מחומצן (הגדרה בעמוד 20) המקל על ההיקשרות לאתר הפעיל שלו. al., (Martinez et (1992. מנגנון פשוט יחסית זה מסביר מדוע לקוטינאז חסרה יכולת האקטיבציה של שטח הפנים המופיעה בליפאזות אמיתיות. חיזוק לכך התקבל לאחרונה ע"י (1997) al. Prompers et שהשתמשו ב- NMR לחקר התכונות של קוטינאז מ-.F.solani pisi החוקרים מצאו כי השארית שיצרה את הפתח האניוני המחומצן נתונה לשינויים באנזים החופשי בתמיסה, בניגוד למצבו במבנה הגבישי. 2.8.3. פקטינאזות 2.8.3.1 כללי אנזימים מפרקי פקטין או פקטינאזות מיוצרים בטבע הן על ידי צמחים והן על ידי הפתוגנים התוקפים אותם. פטריות וחיידקים התוקפים את הצמח, מפרישים פקטינאז במטרה לפרק את דופן התא הצמחי. מקטעי פקטין (oligogalacturonide) המשתחררים בתגובה מדופן התא משמשים את הצמח כסיגנלים מוקדמים להפעלת גנים, בסמוך לאתר הפגוע, להגנה על הצמח מפני הפתוגנים. צמחים מייצרים פקטינאזות למטרות מגוונות הקשורות בהבגרה, במחזור החיים של הצמח. Bergey (1999) et al מצאו כי התקפה הרביבורית או פתוגנית עשויה לעורר תגובה אנדוגנית של הפרשת פקטינאז בצמח ובעקבותיה ייצור מקטעי פקטין הגורמים להפעלה מקומית ומערכתית של תגובת הגנה. 2.8.3.2 מנגנון הפעולה של פקטינאזות משפחת האנזימים מפרקי הפקטין כוללת אנזימים שונים ובהם pectin,pectin methyl esterases pectin בעוד ש- lyase.exo-polygalacturonase (PG) או endo ו- pectate lyases,lyase (PL) תוקף את הקשר הגליקוזידי בין שני פחמנים המכילים שייר אסתר ) 3 (COOCH או בין שני פחמנים שאחד מהם מכיל שייר אסתר והשני שייר חומצה קרבוקסילית,(COOH) פועל pectin esterase להפיכת השייר האסתרי לחומצה קרבוקסילית ובכך מאפשר פעולתם של פוליגלקטורונאזות. פקטינזות אלו נבדלים על פי אופי פעולתם: exo-polygalacturonase פועל על הקצה הלא מחזר של השרשרת ומנתק בכל פעם את הפחמן החיצוני ביותר ואילו endo-polygalacturonase ו- pectate lyase פועלים באופן אקראי על הקשרים הגליקוזידים במרכז השרשרת ובכך גורמים לירידה מהירה בצמיגות תמיסת התגובה (בזמן קצר שרשרת ארוכה נחתכת לשרשרות קצרות רבות ואילו פעולת 21

האנזים exo-polygalacturonase תיצור בזמן זה שרשרת ארוכה אחת עם מונומרים רבים). ) Sakai al., 1994 (et al.,1993 ; Bodie et (איור.(7 איור 7 מנגנון הפעולה של חמישה סוגי הפקטינאזות הנפוצים ביותר: exo- Pectin lyase, Pectin esterase, Pectin methyl esterases.pectate lyase ו- Polygalacturonase, endo-polygalacturonase מבצעים דהמתילציה על שיירי pectin lyases (PL),galacturonic chains מפרקים high methoxy pectate lyases,pectins הפועלים על low methyl או de-esterified polygalacturonic acids ו- Sakai et al.,1993 ; ) polygalacturonic acid המפרקים (PG) exo-poygalacturonases או endo.(bodie et al., 1994 Fig. 7 Activity of most common pectinases: Pectin lyase, Pectin esterase, Pectate lyase, exo- Polygalacturonase and endo-polygalacturonase. 22

Cellulose binding domain (CBD).2.9 השיטות הנהוגות כיום למדידת דרגת ההרטבה של סיבי כותנה לאחר תהליך הסקורינג מתבססות ברובן על הערכת מהירות ספיגת המים בסריג המטופל (הנחת טיפת מים ומדידת זמן היעלמותה בסריג) או זמן השקיעה של אגד סיבים שמונח על פני המים. שיטות אלו איכותיות באופיין ואינן מדווחות נאמנה על דרגת הסקורינג כאשר הסרת השעוות היא חלקית או בלתי אחידה. שיטות אחרות מדויקות יותר שנוסו מודדות רק את ספיגת המים של סיבים בודדים או חוטים טווים ובנוסף הן דורשות ציוד מתוחכם. עד כה לא תוארה שיטה פשוטה ומדויקת להערכת מידת החשיפה של הצלולוז. 2.9.1 כללי הדומין (אתר) חלבוני הנקשר באופן טבעי ובאפיניות גבוהה לצלולוז מכוונה Cellulose Binding (CBD),Lamed et al., 1986) Domain סקירתם של Warren,1997 CBD.(Shoseyov and נמצא בטבע כאתרים נפרדים בחלבונים שונים כגון צלולאזות כמו גם בחלבונים חסרי פעילות הידרוליטית. בצלולאזות חושבים ש- CBD מכוון וקושר את האתרים הקטליטים של האנזים אל פני השטח של הסובסטרט - הצלולוז הלא מסיס. בחלבונים שלהם אין פעילות הידרוליטית, ה- CBD הינו חלק מתת יחידות המבנה שמארגנות את תת היחידות הקטליטיות לקומפלקס רב אנזימי מלוכד המכונה.(Bayer et al., (1994 cellulosome ה- cellulosome אחראי לפרוק יעיל של הסובסטרט הצלולוזי. Clostridium cellulovorans CBD למשל ל- 189.036 kda בהיותו חלבון מבנה קטן,,CBD (1992 al.,,(shoseyov et עם עד 150 חומצות אמינו ובעל יכולת קיפול עצמי refolding) (self נמצא מתאים (או נוסה) לאיחוי רקומביננטי עם אנזימים או חלבונים על מנת להעניק להם יכולת קשירה ספציפית לצלולוז לצורך דווח או קיבוע (איור 8). 23

Cellulose CBD MUG GUS איור 8 מודל המדגים את השימוש ב- CBD-GUS לדווח על אתרי צלולוז חשופים. Fig. 8 Model describing the role of CBD in binding the reporter protein GUS to the cellulose network. 2.9.2. משפחות ה- CBD מעל 120 רצפים של CBD זוהו וחולקו לכ- 11 משפחות, שחלקן מכילות כעת 2 חברים בלבד (1995 al.,.(tomme et משפחה מס' 1 מכילה רק CBD s שמקורם באנזימים מפטריות. שאר ה- CBD s מקורם באנזימים מחיידקים למעט אחד מ- slime mold (עובש רירי) ואחד מסרטן. אין עדיין דווחים על CBD s מ-.archaea המשפחות היותר ידועות של CBD s הן 1-4 וה- CBD s בהן מורכבים בממוצע מ- 150 105, 36, ו- 150 ח. אמינו בהתאמה. מבנה CBD אחד אופייני למשפחות 3 1, ו- 4 ומאופיין ב- 12 3, ו- 10 מעטפות β המופיעות שתי וערב מקופלות ל"גלילי ג'לי". משפחת CBD-I היא בעלת צורת משולש עם צלע שטוחה הידרופובית המגיבה עם שטח הפנים של הצלולוז באמצעות 2 שיירי תירוזין וגלוטמין, וצלע נוספת הידרופילית. שני מבנים נוספים של CBD המופיעים במשפחה 2 הם בעלי 9 מעטפות β היוצרות גליל מאורך המכיל בקצהו 3 שיירי טריפטופן חשופים הנקשרים לפני השטח של הצלולוז (איור 9). 24

איור 9 מבנה משפחה II של.CBD s מעטפות ה- β מופיעות בזהב. Trp17, Trp54 ו- Trp72 הנקשרים לפני השטח של הצלולוז מופיעים באדום. ה- α הליקס צבוע בצהוב. (1997 warren,.(shoseyov and Fig 9. Structure of family II of the CBD. β shits are depicted in gold. Trp 54, Trp 17 and Trp 72 that bind the cellulose surface, are in red. The α-helix is in yellow. משפחה 3 של ה- CBD s הינה גם כן בצורת גליל מכילה משטח מאורך של ח. אמינו ארומטיות בצד אחד המעורבות בקשירה לצלולוז. בצד השני, בשונה ממשפחות 1 ו- 2, יש חריץ לא עמוק בעל תפקיד לא ידוע. כל חברי משפחות 2 1, CBD s ו- 3 נקשרים הן לצלולוז האמורפי (1 (cellulose והן לזה הקריסטליני (2.(cellulose אתר הקשירה של משפחת 4 CBD מורכב מ- 5 גדילים הנקטעים בתחתית ע"י מקטע של ח. אמינו הידרופוביות. בשונה מהקבוצות האחרות חברי משפחה 4 אינם נקשרים לצלולוז הקריסטליני. צלולוז הינו הומופולימר בלתי מסועף של (1-4)β תת יחידות גלוקוז הקשורות זו לזו. צלולוז קריסטליני מציג ל- CBD שטח פנים המורכב מ שרשרות צלולוז מקבילות ארוזות יחד. צלולוז אמורפי לעומת זאת מציג שרשרות שתי וערב או חסרות סדר. אתר הקשירה של משפחות 2 1, ו- 3 מותאם לקשירה לשטח הפנים ואילו משפחת 4 CBD מותאמת לקשירה למולקולות בודדות. לכן אין זה מפתיע כי רק חברי משפחה 4 נקשרים לנגזרות מסיסות של צלולוז ול- cello- CBD s.oligosaccharides נבדלים בתכונות הקשירה והשחרור שלהם מהצלולוז. חלק מהמשפחות נקשרות בקישור הפיך וחלקן בקישור בלתי הפיך (אינו מושפע אפילו משטיפה ממושכת). הצלולוז מציג ל- CBD מערך אתרי קישור חופפים. בנוסף הקשירה מתווכת ככל הנראה ע"י אינטראקציות הפיכות מרובות בין מולקולות הגלוקוז בצלולוז וחומצות האמינו ב-.CBD לפיכך סביר כי ספיגה חוזרת מצריכה שבירה סימולטנית של אינטראקציות מרובות מבלי לאפשר בסוס מחדש של אינטראקציות אלו עם אתרי קישור סמוכים או חופפים. 25

2.9.3. CBD מאוחה עם חלבונים אחרים חלבונים רבים העוברים איחוי או התמזגות עם CBD ייוצרו ונמצאים בשימוש. הגן של CBD נקשר לגן החלבון המבוקש וכתוצאה מכך נוצר חלבון רקומביננטי מאוחה הנקשר בחוזקה לצלולוז ושומר באופן אידאלי על הפעילות הביולוגית של החלבון השותף. הקשירה יציבה בטווח רחב של תנאים ) ph 2-10 וריכוזי מלח נמוכים וגבוהים). קיימות מערכות ביטוי העושות שימוש ב- CBD s ממשפחות 2 ו- 3 בשיתוף פעולה בין CBD Technologies ו- Inc.. Novagen, הוקטורים החדשים pet ו- pbac משתמשים בשלושה אתרי CBD המכונים.(Shoseyov and warren, 1997) CBD Tag sequences pet system.2.9.4 מערכת pet מאפשרת שיבוט וביטוי חלבונים רקומביננטים ב-.E-coli חלבוני המטרה משובטים בפלסמידים של pet תחת בקרה של סיגנלים חזקים של שעתוק ותרגום (אופציונלי) מהבקטריופאג' T7 והביטוי מעורר ע"י הוספת מקור של רנ"א פולימראז מתאי T7 בתא הפונדקאי. רנ"א פולימראז מ- T7 הוא כה סלקטיבי ופעיל עד כי כמעט כל משאבי התאים משועבדים למטרת ביטוי הגנים. התוצר המבוקש עשוי לכלול 50% מכלל חלבוני התא לאחר מספר שעות של אינדוקציה. יתרון נוסף של מערכת זו הוא היכולת לשמור על הגנים המהווים מטרה מושתקים מבחינת השעתוק כאשר הם לא במצב מעורר. הגנים המהווים מטרה משובטים בסופו של דבר תוך שימוש בפונדקאי שאינו מכיל את הגן לרנ"א פולימראז של T7, ובכך נמנעת אי יציבות הפלסמיד בעקבות יצירת חלבונים שהם רעילים פוטנציאלית לתאי הפונדקאי. הפלסמידים, ברגע שהתמקמו בפונדקאי שאינו מבוטא, מועברים לפונדקאי מתבטא המכיל עותק מהכרומוזום של רנ"א פולימראז מ- T7 תחת בקרת.(Novagen pet system manual, 1997).IPTG והביטוי מעורר ע"י הוספת,lacUV5 הגן מ-.E coli ל- (GUS, EC (3.2.1.31. β-glucuronidase פותח כמערכת גן מדווח לטרנספורמציות בצמחים. אנזים זה מקודד ע"י הלוקוס,(Novel and Novel, (1973 udia הוא הידרולאז המבצע את הביקוע של מגוון רחב של,β-glucuronides שרבים מהם משווקים כסובסטרטים ספקטרופוטומטריים, פלואורוסנטרים או היסטוכימיקלים. הגן - GUS שובט והרצף שלו נמצא. הוא נתגלה כמקודד לאנזים יציב בעל תכונות מתאימות לבנייה והאנליזה של איחוי גנים ) et Jefferson.(al., 1986 לגן GUS מספר יתרונות מועילים המציבות אותו כגן מדווח עיקרי בחקר הצמחים. ראשית צמחים רבים נבדקו ונמצאו חסרי פעילות GUS ברת גילוי, כלומר חסרי "רעש רקע" למבחן לביטוי הגנטי. שנית המבחן ל- glucuronidase הינו זול, קל ורגיש הן vitro in והן situ in בג'לים והוא חזק מספיק לעמוד בקיבוע. בכך הוא מאפשר אנליזה היסטוכימית למקום מסוים בתאים ובקטעי רקמה. האנזים GUS סובל הוספת קצה אמיני גדול ומאפשר בכך בניית איחוי מתורגם. לכן המערכת מאפשרת לימוד התנהגות או מעבר של פפטידים המשמשים כסיגנל, במערכות טרנסגניות או 26

vitro". in יצירת חלבון רקומביננטי מאוחה של CBD עם GUS יצרה הזדמנות לעשות שימוש בחלבון זה כמכשיר ביוטכנולוגי לבדיקת השינויים במעטה של סיבי הכותנה. טיפולים באנזימים או בחומרים כימים שנועדו להסיר את קוטיקולת הסיב גורמים לחשיפת הצלולוז האמורפי בדופן הראשונית בדרגות שונות כתלות בחומרת הטיפול. קישור החלבון המאוחה CBD-GUS לאתרי הצלולוז שנחשפו ופיתוח מבחן המתבסס על החלבון המדווח,GUS למדידת רמת הקישור, עשויים להוות כלי אנאליטי מדויק לבחינת כמות הצלולוז החשוף או לחילופין להערכת ביקוע הקוטיקולה. 27

3. מטרות המחקר המטרה הכללית של המחקר הייתה לימוד מאפייני ההידרוליזה האנזימתית של שעוות קוטיקולת דופן סיב הכותנה על ידי האנזים קוטינאז. המטרות הספציפיות כללו: 3.1. הפקה וניקוי קוטינאז מהפטרייה Fusarium oxysporum 3.1.1. גידול הפטרייה Fusarium oxysporum על מצעים מכילים קוטין או מרכיבי קוטין במטרה להשרות הפרשה מוגברת של קוטינאז לנוזל החוץ תאי. 3.1.2. הפקה וניקוי האנזים קוטינאז מפטרייה זו תוך שימוש במבחן לקוטינאז. 3.1.3. פיתוח מבחן ספציפי לקוטינאז כתחליף למבחן הרדיואקטיבי המקובל. 3.2. לימוד תהליך הידרוליזת שכבת הכיסוי של סיב הכותנה על ידי אנזימים בכלל וקוטינאז בפרט 3.2.1. חקר פעילות האנזימים Pectin lyase,cutinase ו- Polygalacturonase על המעטה של סיבי כותנה vitro in ב השוואה לטיפול כימי ב-.NaOH 3.2.2. בדיקת רמת הפרוק באמצעות מדדים כימים, פיסיקלים וביולוגים. 3.2.3. הפרדה וזיהוי תוצרי ההידרוליזה האנזימתית והכימית. 3.2.4. לימוד השפעתם של חומרים כימיים משטחים, המשולבים בתעשייה על הפעילות האנזימתית. 3.3. פתוח שיטה לערכה כמותית ואיכותית של הסרת שעוות הבד 3.3.1. לימוד קינטיקת הקישור של CBD לבדים המטופלים ואפיון השימוש בו כמדד למידת חשיפת הצלולוז וככלי לבחינת השינויים ברמת הסיב. 28

4. שיטות וחומרים 4.1 חומרים לצורך המחקר נעשה שימוש באנזימים המוצגים בטבלה 4. טבלה 4 תאור האנזימים ששימשו במחקר. Table 4 Specification of enzymes employed for scouring trials. אנזים Enzyme Cutinase (CUT) 1 Pectin Lyase (PL) 2 Polygalacturonase (PG) 2 מקור מיקרוביאלי Microbial source Pseudomonas mandocino Unknown Aspergillus niger שם מסחרי Commercial name Cutinase ISC-02- BE1 PectoZym HF Rapidase c-80l ספק Supplier InterSpex Products, Inc. Rakuto Kasei (Israel) Ltd. DSM-Gist- Brocades ph 8 8 5 T ( C) 37 45 40 preparation) (Solid אבקה 1 solution) (Aqueous תמיסה מימית 2 הדטרגנטים המסחריים הבאים שימשו לנסיונות: דטרגנט לא יוני AvcoPal-AWS (תערובת של mono and של (תערובת AvcoPal-AWS דרגנט אניוני,(polyoxyethylene fatty alcohols AVCO וסריגי כותנה גולמיים התקבלו באדיבות חברת (dialkyl potassium phosphate esters 28

CBD-GUS (בית שמש)..E coli חיידק הנושא את מערכת הביטוי לחלבון המאוחה CHEM התקבל באדיבות חברת Ltd. CBD-Technologies (נס ציונה) ו- umbelliferyl-β-d- 4-methyl 5-bromo-4-chloro-3-idolyl-b-D- ו- methylumbelliferone (MU),glucuronide (MUG) Lipase,Esterase (E-3019) (הולנד). DUCHEFA נרכשו מחברת glucuronic acid (X-GlcA) 16-Hydroxyhexadecanoic acid (H-2640), p-nitrophenyl,triton X-100,(L-1754) (9876-N) butyrate ו- (104-8) p-nitrophenol נרכשו מ-.Sigma תפוחי עץ מזנים שונים ו- polygalacturonase התקבלו באדיבות חברת סיידר הגליל (קריית שמונה). 4.2. הכנת קוטין והידרוליזאט של קוטין 4.2.1. מיצוי קוטין מתפוח לצורך המיצוי נבחרו תפוחים מזנים שונים ללא פגיעות בשטח הפנים שלהם. התפוחים השלמים נשטפו היטב ב- DDW ויובשו בנייר ספיגה. כל תפוח נטבל למשך כ- 15 דקות בכ- 200 מ"ל Dichloromethane (למיצוי מחמיר) או ב- Hexane (למיצוי עדין), תוך חמום על פלטה לכ- 60. 0 C נוזל השטיפה הוחלף כל 10-20 תפוחים, סונן ורוכז במנדף סיבובי ונשמר בדיסיקטור למשך הלילה. הקוטין היבש נאסף, נטחן דק ואוחסן תחת אווירת חנקן ב- 70-0 C עד לשימושו כמקור פחמן במצעי הגידול. המיצוי העדין שימש באנליזה הכימית לצורך השוואה לקוטין שהתקבל מסיבי הכותנה. 4.2.2 הכנת הידרוליזאט מקוטין תפוח 500 מ"ג קוטין תפוח הורחפו ב- 30 מ"ל תמיסת 95% אתנול שהכילה.KOH 10% התרחיף מוצה בקולבת זכוכית שלתוכה הוזרם חנקן במשך 30 דקות, במערכת סוקסלט במשך הלילה. לנוזל המיצוי הוספו 100 מ"ל מים מזוקקים פעמים והתערובת שהתקבלה הוחמצה עם HCl מרוכז. הנוזל שהתקבל עבר שלוש פעמים מיצוי בכלורופורם (בנפח שווה) ונוזל המיצוי הופרד במשפך מפריד נאסף, רוכז במנדף סיבובי ויובש בדיסיקטור (במשך כ- 16 שעות) (לפי al., Joseph et Kolattukudy, 1977 ; Lin and 1986 עם מודיפיקציות). ההידרוליזאט שימש לאנליזות כימיות וכתוסף למצעי הגידול של הפטרייה.Fusarium oxysporum 4.3. גידול הפטרייה Fusarium oxysporum והפקת האנזים קוטינאז מהנוזל החוץ תאי.4.3.1 גידול Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum הוחזקה על גבי מצע (PDA) Potato dextrose agar ב- 23 0 C למשך כ- 10 ימים. סוספנסייה מהספורות ב- 10% גליצרול (5 מ"ל לצלחת פטרי) נאספה ונשמרה ב- 70-,pH=7.2), לזריעה בשלב מאוחר יותר. כ- 2.5 מ"ל סוספנסייה הוספו ל- 90 מ"ל מצע מינרלי 0 C 29

ראה סעיף 4.3.4) המכיל גלוקוז (0.1%) וגודלו בבקבוקי- Fermbach במשך 3 ימים. תרבית זו שמשה כאינוקולום להמשך הניסיונות. 2 מ "ל אינוקולום הוספו ל-ארלנמייר (250 מ"ל) שהכיל 16 מ"ל מצע מנרלי חסר גלוקוז ו- 50-200 מ"ג קוטין או מרכיבי קוטין. התרביות גודלו ב-. 23 0 C בקרוב ביום 12 לגידול בו נמדד שיא בפעילות אסתראזות בנוזל החוץ תאי נאסף הנוזל החוץ תאי, סונן במשפך בוכנר בנייר סינון glass microfibre בקוטר 90 מ"מ GF/C),(Whatman סונן במסנן 0.45 μm ורוכז באולטרפילטרציה עם ממברנת PM-10 בעלת cut off של (Amicon) 10 kda (לפי Kolattukudy, 1978.(Lin and 4.3.2 הכנת מצע מינרלי 1978) (Lin and Kolattukudy המצע המינרלי ששימש לגידול.F oxysporum הכיל: חומר (NH 4 ) 2 SO 4 KH 2 PO 3 Na 2 HPO 4 MgSO 4 FeSO4*7H 2 O CaCl 2 H 3 BO 3 MnSO 4 ZnSO 4 CuSO 4 MoO 3 כמות 2 g 4 g 6 g (הוסף בנפרד לפני הגידול) 0.2 g 1 mg 1 mg 10 μg 10 μg 70 μg 50 μg 10 μg עוקר והוסף בנפרד למצע פני הזריעה. החומרים הומסו במים מזוקקים פעמים, ה- ph תוקן עם NaOH ל- 7.2 והנפח השלם ל- 1 ליטר. 4.3.3. הוספת 1-Hexadecanol למצע הגידול 1-Hexadecanol 200 mg הוספו לארלנמייר 250 ml שהכיל מצע מינרלי חסר גלוקוז (ראה סעיף 4.3.4) המכיל.Tween 80 0.5% הארלנמיירים עוקרו באוטוקלאב וקוררו לטמפרטורת החדר תוך טלטול rpm) 200) במטרה להרחיף את ה- 1-Hexadecanol במצע. 30

4.4. ניקוי האנזים קוטינאז מ- Fusarium oxysporum 4.4.1 ניקוי האנזים קוטינאז ב- HPLC הנוזל החוץ תאי המרוכז ml) 1, ראה סעיף 4.3.1) הומס בבופר פוספט,(pH=8, 50 mm סורכז UV-VIS Spectra- המצויד בגלאי (Waters 600E) HPLC והופרד ב- (14000 rpm, 2 min) (Physics) באורך גל של 280. nm ההפרדה הראשונה בוצעה בקולונת superdex 200 (ג'ל פילטרצייה, (Pharmacia Biotech בתנאים איזוקרטים בבופר פוספט,pH=8.50mM מקטעים של 1 מ"ל נאספו ב- (Pharmacia Biotech) fraction collector כל דקה במשך 45 דקות ונבדקו תחילה לפעילות אסתראזות. המקטעים שהראו פעילות אסתראזות נבדקו בנוסף במבחן לקוטינאז ועל סמך הפעילות והבליעה ב- 408 nm נבחרו המקטעים לשלב הניקוי הבא. כל מקטע רוכז מחדש,, סורכז min) 14000) rpm, 2 והוזרק להפרדה בקולונת מחליף אניוני מסוג mono Q Biotech) (Pharmacia בבופר ph=8 Tris תוך גרדיאנט 0-1M NaCl במשך 40 דקות. בדיקת המקטעים נעשתה באופן דומה לשלב הקודם והמקטעים הפעילים רוכזו עד יובש באולטרפילטרציה עם ממברנת PM-10 בעלת cut off של,(Amicon) 10 kda הומסו מחדש בבופר ph=9 Tris והוזרקו שוב לאותה קולונה אך עתה בבופר ph=9 Tris ובגרדיאנט 0-0.5M NaCl במשך 40 דקות. המקטעים נבחנו כנ"ל במבחן לאסתראזות ומבחן לקוטינאז והמקטעים הפעילים, רוכזו עד יובש, הומסו מחדש בבופר פוספט ph=8 50 mm והוטענו על ג'לים לבדיקת חלבון ופעילות. 4.4.2. זיהוי החלבונים ב- SDS gel 4.4.2.1. הרצת הג'ל מערכת ההרצה נשטפה היטב במים ויובשה. ג'ל תחתון ניצוק אל בין הזכוכיות לכ- 2/3 מהגובה ומעליו הנחו מספר טיפות מים. לאחר קרישת הג'ל (כ- 20 דקות), נשפכו עודפי המים, וג'ל עליון מולא עד הקצה. בג'ל ננעצו סרגלים לסימון בורות ההטענה והוא הועמד להתקרשות. הסרגלים סולקו ולכל באר טופטפו 30 μl דוגמה שהוכנה על ידי עירוב 20 μl מקטע חלבון שהופרדה ב- Sea Blue Plus2 (4-250 kda, 10 בופר דוגמה והרתחה 3 דקות באמבט. סמן μl עם HPLC USA) Novex, שימש לקביעת המשקל המולקולרי. המערכת מולאה בבופר הרצה והורצה כשעה במתח של 50. ma בגמר ההרצה הועבר הג'ל לתמיסת פיקסציה והודגר לשעה. לאחר מכן הועבר הג'ל להדגרה של 1/2 שעה בתמיסת דיסטיינינג, נשטף במים והודגר שעה נוספת בתמיסת עצירה. 31

4.4.2.2. הכנת תמיסות ml/l) 100) בתוך מים א. הכנת תמיסת פיקסציה 30% מתנול ml/l) (300, 10% מזוקקים ml/l).(600 חומצה אצטית ב. הכנת תמיסת צבע 0.25 )בתמיסת g /100ml) COOMASSIE BLUE 0.5% פיקסציה. ג. בופר ג'ל הרצה (מרוכז x10) 30.2 g - 25 mm Tris 188 g' 250 mm glycine מומסים ב- DDW ה, - ph מתוקן ל- 8.3 והנפח מושלם ל- 1 ליטר. לצורך השימוש הוא נמהל פי 10 לתמיסה המכילה SDS בריכוז סופי של.0.1% ד. הכנת ביס אקריל אמיד 30 g אקרילאמיד. 0.8 g ביסאקרילאמיד. 100 מ"ל מים מזוקקים. ה. הרכב ג'ל הרצה תחתון 12%. ג'ל הרצה בנפח סופי של 10 מ"ל הוכן ע"י הוספת התמיסות הבאות: 3.3 מ"ל מים מזוקקים. 4.0 מ"ל.30% acyrlamide mix 2.5 מ"ל (PH=8.8).1.5 M Tris 10% SDS 0.1 0.1 מ"ל. 10% ammonium persulfate 0.004 מ"ל.TEMED ו. הרכב ג'ל מסרק עליון ג'ל מסרק בנפח סופי של 4 מ"ל הוכן ע"י הוספת התמיסות הבאות. 2.7 מ"ל מים מזוקקים. 0.67 מ"ל. 30% acyrlamide mix 0.5 מ"ל (PH=6.8). 1 M Tris 32

10%SDS 0.04 0.04 מ"ל 10% ammonium persulfate 0.004 מ"ל.TEMED ז. בופר דוגמה (מרוכז פי 3) ph=6.8,tris 0.5M בופר 3.7 ml גליצרול 3 מ"ל ברומפנול כחול 50 μl 0.1% 1.5 ml B-mercaptoethanol 0.9 g SDS לאחר ערבוב החומרים, הושלם הנפח ל- 10 מ"ל עם DDW חולק למנות ונשמר בהקפאה עד השימוש. Isoelectric focusing (IEF).4.4.3 VectaSpin Micro (Whatman) 20 μl HPLC מקטעי החלבון שהופרדו ב- רוכזו ל- ב- המגבילים מעבר מולקולות הגדולות מ- 12, kda הוטענו על שני precast polyacrylamide Bio-Rad) electrophoresis gel (IEF ph 5-8, והורצו ב- 100 V למשך שעתיים. לקביעת הנקודה האיזואלקטרית נעשה שימוש בסמן Bio- IEF broad standard marker (pi 4.45-9.6,.Rad) ג'ל אחד עבר צביעה לחלבונים והג'ל השני עבר צביעה לפעילות אסתראזות. 4.4.3.1. צביעת חלבונים לג'ל IEF הג'ל הודגר למשך 45 דקות בתמיסת צבע ל- IEF-gel של.Bio-Rad החלבונים נצפו בג'ל לאחר שהוסרו עודפי תמיסת הצבע על ידי שטיפה עם תמיסה המכילה 40% methanol ו- 10% acetic.acid 4.4.3.2. צביעת ג'ל IEF לפעילות אסתראזות צביעה לאסתראזות נעשתה לפי (1974) al..dewald et 67 מיליגרם של Fast Blue R,R הומסו ב- 100 מ"ל בופר פוספט 50 mm ph 7.4 והתמיסה סוננה בנייר סינון (40 (Whatman בוואקום. לתמיסה המסוננת הוספו (בסמוך למועד בצוע המבחן) 2.7 מ"ל מתמיסת האם של α Naphthyl acetate 1% באצטון תוך כדי בחישה מהירה בכלי עטוף נייר כסף. הג'ל עובר אינקובציה בתמיסה זו בטמפרטורת החדר עד להופעת פסים ברורים. סיום הצביעה ושימור הג'ל נעשו על ידי העברת הג'ל לתמיסה של 7% חומצה אצטית במים מזוקקים. 33

.4.4.4 הכנת 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate במטרה לסנתז,4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate הוכנס דיכלורומתאן לתוך קולבה דו צווארית יבשה (בלהבה) המצוידת בבוחש מגנטי ומעבה, באווירת חנקן אנהידרוז (80 מ"ל), ולאחר קירור ב- -20 הוסף אליו 1 אקוויולנט מול של -16 0 C (3 hydroxyhexadecanoic acid גר', 0.011 מול). לתערובת זו הוספו 2 אקוויולנט של טריאתילאמין (3 מ"ל, 0.022 מול) ו- eq. 1 של מתאן סולפוניל כלוריד (0.85 מ"ל, 0.011 מול). לאחר בחישה למשך 1.5 שעות של תערובת התגובה בטמפ' זו הוספו eq. 2 של (3 PNP גר', 0.022 מול). התערובת נבחשה למשך 6 שעות בטמפ' זו. תערובת התגובה חוממה לטמפ' החדר ונבחשה עד העלמות חומר המוצא. מעקב אחר התקדמות התגובה (העלמות PNP והיוצרות התוצר) בוצע באמצעות.TLC בגמר התגובה: הוספו לתערובת סודיום ביקרבונט (10%, 50 מ"ל). התוצרים הופרדו מהתערבת עם מתילן כלוריד במשפך מפריד (30X3 מ"ל). הפאזה האורגנית נשטפה בתמיסה רוויה של מלח (סודיום כלוריד). הפאזות הופרדו והפאזה האורגנית יובשה מעל סודיום סולפט, סוננה ורוכזה בוואקום במנדף סיבובי לקבלת האסתר הרצוי. סינתזת הסובסטרט מתוארת באיור 10. O HO (CH 2 ) 15 C OH + ClCH 3 SO 3 N(CH 3 ) 3 O H 3 C S O (CH 2 ) 15 COOH O HO NO 2 O O C H 3 S O (CH 2 ) 15 C O NO 2 O 34

איור 10 סינתזת הסובסטרט.4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate Fig. 10 The synthesis of the substrate 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate. 4.4.4.1. תהליך ניקוי האסתר הרצוי מתוצרי לוואי החומר נוקה על גבי עמודת סיליקה ג'ל. ממס ההרצה היה מורכב מדיכלורומתאן 90% והקסאן 10%. התוצר הנקי זוהה בעזרת HPLC-ELSD,TLC (תנאי ההרצה מפורטים בסעיף 4.6.4.4) ו-.NMR TLC.4.4.4.2 נוזל ההרצה היה דיכלורומתאן. לאחר ההרצה נחשפו הלוחות לתמיסת פוספומוליפידיק אסיד והלוחות חוממו מעל פלטת חימום עד קבלת צבע. 4.4.4.3 זיהוי התוצר שהתקבל ב- NMR 200 (Hewlett Packard) NMR הבדיקה נעשתה בכלורופורם דיטריום ) 3 (CDCl מכשיר ב- ב- מה"צ. 4.4.5. ביצוע המבחן לקוטינאז 5 mg סובסטרט הורחפו ב- 1 ml מתנול, בסטירר (במבחנת אפנדורף). התמיסה שהתקבלה הועמדה בצנטרפוגה ב- 14,000 rpm למשך 5 דקות. המשקע בודד והורחף מחדש ב- 300 μl בופר פוספט 100. mm ph 8 לתמיסה זו הוספו 10 μl אנזים והתערובת הועמדה בטלטול ב- 37 0 C למשך 30 דקות או עד לפיתוח צבע צהוב. לאחר ההדגרה הסובסטרט הורחק על ידי צנטרפוגה 405. nm למשך 15 דקות ובליעה נבדקה בספקטרופוטומטר באורך גל של 14,000 rpm 4.4.6. בדיקת חלבון מסיס חלבון מסיס נמדד על ראגנט Bio-Rad על פי הנחיות היצרן. הבדיקה מבוססת על יצירת קומפלקס צבעוני בין החלבון לבין coomassie blue solution במדיום חומצי. לשם ביצוע 10 200 μl הבדיקה עורבבו 800 μl דוגמה עם ראגנט, הושהו בטמפרטורת החדר למשך דקות והבליעה נקראה בספקטרופוטומטר באורך גל 595. nm לעקומת כיול שימשו ריכוזי אלבומין בין 0-20 μg/ml שנבדקו בדרך זהה לדוגמאות. 35

4.5. הידרוליזה אנזימתית וכימית של מרכיבי הדופן בסריגי כותנה 4.5.1. הידרוליזה אנזימתית הטיפול האנזימתי בוצע במרבית המקרים על ידי הדגרת פיסות סריג יבשות ושקולות בתמיסת הריאקציה ביחס בד נוזל 1 gr:10 ml במבחנות פוליקרבונאט 50 ml חד פעמיות. אם לא צוין אחרת, הכילו תמיסות האנזים דטרגנט לא יוני CHEM) (AvcoPal-AWS, AVCO 50 mm ו- PL לקוטינאז ול- 100 mm phosphate buffer ph 8) בופר מתאים,0.1% (W/V) acetateל- buffer ph 5 (PG ואת האנזים המתאים. אם לא צוין אחרת, ההדגרה בוצעה במטלטלת סיבובית ב- 175 ל- rpm 20 שעות. מבחנות הביקורת הודגרו באותם תנאים ללא אנזים. לכל טיפול בוצעו לפחות 3 חזרות. 4.5.2. הידרוליזה כימית הטיפול הכימי בוצע על ידי הרתחת דוגמאות סריג גולמי יבשות ושקולות בתמיסת NaOH (יחס בד-נוזל (1gr/50 ml למשך 30 דקות תוך הקפדה שהסריג יישאר מכוסה בכל זמן הטיפול בנוזל. הביקורת בוצעה על ידי הרתחת הסריגים במים מזוקקים פעמיים למשך אותו הזמן..4.5.3 מדידת פעילות pectin lyase מבחן לפעילות האנזים (פרוטוקול התקבל יחד עם האנזים באדיבות (Rakuto Kasei Israel בוצע במבחנת קווארץ בספקטרופוטומטר ב- 50. 0 C כייחוס שימש 1.9 ml סובסטרט ו- 0.1 ml בופר שחומם ל- 50. 0 C המבחן בוצע על ידי הוספת 0.1 ml תמיסת אנזים (C 50) 0 ל- 1.9 ml תמיסת סובסטרט בטמפרטורה זהה. השינוי בבליעה ב- 235 nm כתוצאה משחרור galacturonic acid בלתי רווי, שימש לקביעת השיפוע וחישוב השינוי בבליעה לדקה (בין 2-7 דקות מתחילת הריאקציה). בתנאים הנ"ל 1 Unit מוגדרת כפעילות הגורמת לשחרור 1 mole של galacturonic acid במשך דקה (קבוע הבליעה המולארי שלו.(4,600/Mcm החומרים ששימשו לביצוע המבחן כללו: 0.1M.I בופר פוטסיום פוספט ph=7 (המכיל (0.5mM CaAl 2 שימש להכנת הסובסטרט ומיהול האנזים. 2,512. U/ml תמיסת אנזים מהולה בבופר שבסעיף א' ל-.II.III תמיסת סובסטרט Polygalacturonic acid potassium salt 0.1% בבופר שבסעיף א'. 4.5.4. מדידת פעילות polygalacturonase המבחן (לפי פרוטוקול מ- Corporation Worthington Biochemical ו- al., 1965 (Stephen et בוצע על ידי הכנת מבחנות שהכילו 6 ml סובסטרט ו- 1ml אנזים mg/ml) 0.1) והדגרתן למשך שעה באמבט 37 0 C מעלות. 36

בסוף ההדגרה הועברו המבחנות למי קרח לעצירת התגובה ו- 100 μl הועברו מכל מבחנה לסט מבחנות נוסף (בקרח) שלהן הוספו 2 ml מתמיסת ראגנט A ו- 2 ml מתמיסת ראגנוט B. התמיסות עורבבו בוורטקס וחוממו במים רותחים ל- 13 דקות. לאחר קירור המבחנות הוספו 2 ml מים מזוקקים פעמים ובליעה נקראה בספקטרופוטומטר באורך גל 450nm כנגד מים מזוקקים פעמים בקיווטות חד פעמיות. המבחן בוצע בטריפליקטים. מבחנות שהכילו 1 ml בופר ו- 6 ml סובסטרט הוכנו מראש ושימשו כבלנק לסובסטרט. מבחנות נוספות שהכילו 6 ml בופר ו- 1 ml אנזים שימשו כבלנק לאנזים. החומרים הבאים שימשו לבצוע המבחן: בופר מבחן - 5.0.0.1M Citric Acid/Phosphate buffer, ph ראגנט 40 g A של anhydrous Na 2 CO 3 הומסו ב- 600 ml מים מזוקקים פעמים. לתמיסה הוספו 16 g glycine והיא עורבבה על סטירר עד המסה. לאחר מכן הוספו CuSO 4 5H 2 O 0.45g ועורבבו עד המסה. הנפח הושלם ל- 1 ליטר עם מים מזוקקים פעמיים. ראגנט neocuporine-hcl B הומסו ב- 1 ליטר מים מזוקקים פעמיים..D-galacturonic acid 1 mg/ml סובסרטרט - 0.5% Polygalacturonic acid הוכן על ידי המסת 2.5 g polygalacturonuc acid ב- 500 ml מים מזוקקים פעמים בפלטה חמה תוך ערבוב( מבלי להרתיח), המסה והשלמה לנפח..I.II.III.IV.V תמיסת D-galacturonic acid שימשה להכנת תמיסת אם של 0.5, mg/ml ממנו הוכנו המיהולים הבאים :(μg/ml) 1 ml.125,100,75,50,25,0 מכל מיהול הודגרו עם 6 ml בופר ועברו טיפול זהה למבחנות שהכילו אנזים. 4.5.5. מדידת פעילות אסתראזות (לפי al., 1981,Kolattukudy et עם מודיפיקציות קלות) פעילות אסתראזות וקוטינאז נמדדה על ידי תגובה רציפה עם הסובסטרט para-nitrophenyl butyrate ב- 37 0 C לקבלת p-nitrophenol (PNP) (צהוב) והשייר n-butyric acid (איור 11). תגובה זו שמשה בנוסף כמבחן לא ספציפי לקוטינאז. החומרים הבאים שימשו כמרכיבי הראקצייה: Triton X-100 (1 g/250 ml DDW) - 100 μl Sodium phosphate bufer (0.1 M, ph=8) - 800 μl p-nitrophenyl butyrate (0.1mM) - 500 μl Enzyme solution - 100μl 37

החומרים עורבבו בוורטקס ובליעה נקראה בספקטרופוטומטר באורך גל של 405. nm O O + H 2 O Esterase Cutinase OH + HO O NO 2 NO 2 para-nitrophenylbutyrate para-nitrophenol n-butyric acid p-nitrophenylbutyrate p-nitrophenol n-butyric acid איור 11 סכמה המתארת את המבחן לאסתראזות וקוטינאז עם.p-Nitrophenyl butyrate התגובה נמדדה באופן רציף בספקטרופוטומטר באורך גל של 405. nm Fig. 11 Assay for esterase and cutinase activity. The release of p-nitrophenol continuously measured spectrophotometerically at 405 nm. 4.6. האנליזות השונות למעקב אחר ההידרוליזה 4.6.1. מדידת משקל סריגי כותנה מטופלים סריגי כותנה גולמיים יובשו בתנור 105 0 C למשך שעתיים ולאחר מכן בדיסיקטור וואקום לשעתיים נוספות. לאחר מכן הסריגים סומנו נשקלו במשקל אנאליטי ושימשו בניסויים. בתום הניסוי נשטפו הבדים היטב במים מזוקקים, יובשו במשך 2-4 שעות בתנור 105 0 C ושעתים נוספות בדיסיקטור ונשקלו שוב. הפסד המשקל מהסריג חושב על ידי הפחתת המשקל הסופי מההתחלתי. 4.6.2. צביעת צלולוז ופקטין תמיסת congo red 1% או ruthenium red הוכנה על ידי המסת 10 mg/ml ב- 20% אתנול ובמים מזוקקים פעמים בהתאמה. פיסות בד של 500 mg הודגרו עם 5 ml תמיסת ריאגנט במבחנות בטלטול 200 rpm ב- 35, 0 C במשך 10 דקות. לאחר ההדגרה הבדים הוצאו, ונשטפו בשלבים הבאים: I. שטיפה יסודית עם מים מזוקקים..II הדגרה 5 דקות בטלטול באותם תנאים כמו ההדגרה הראשונה..III שטיפה עם מים מזוקקים. וחוזר חלילה עד שבנוזל השטיפה לא התקבל יותר צבע. 38

4.6.3. מדידת קצב ההרטבה מבחן זה מבוסס על מדידת זמן הספיגה של טיפת מים בסריג, מרגע הנחת הטיפה ועד העלמות השתקפות קרני האור ממנה (39-1980.(AATTC test Method טיפת מים מזוקקים פעמיים בגודל 20 μl הונחה על הסריג היבש והזמן (בשניות) מרגע הנחת הטיפה ועד היעלמותה המוחלטת בסריג הוגדר כזמן ההרטבה. כל פיסת סריג נבדקה לפחות ב- 9 מקומות שונים והממוצע המתקבל שימש לקביעת זמן ההרטבה של הסריג הנבדק. 4.6.4. הפרדת מרכיבי שעוות סריגי כותנה ב- ELSD-RP HPLC וזיהוים ב- GC-MS 4.6.4.1 מיצוי קוטין מסריגי כותנה גולמיים 15 גר' סריג כותנה גולמי הועמדו בסוקסלט עם 200 מ"ל Dichloromethane למשך הלילה. נוזל המיצוי נודף ב- evaporetor סיבובי ובדיסיקטור וואקום והקוטין היבש נאסף, ונשמר בחנקן ב-.-70 0 C 4.6.4.2 הכנת הידרוליזאט מקוטין סריג כותנה בוצעה באופן זהה להכנת הידרוליזאט מתפוח (סעיף 4.2.2). 4.6.4.3. מיצוי מרכיבי התגובה האנזימתית תמיסות הראקציה של הניסויים השונים נאספו בנפרד (הבדים נסחטו במזרק 50 מ"ל), וערבבו ביחס של 1:1 עם כלורופורם במשפך מפריד. הפאזה האורגנית (התחתונה) בודדה ולפזה המימית בוצעו שתי שטיפות נוספות באופן דומה. הפאזה האורגנית של כל השטיפות נאספה יחד רוכזה במנדף סיבובי ויובשה בדיסיקטור וואקום במשך הלילה. חומצות השומן היבשות הומסו מחדש ב-,0.2-1 ml THF סוננו במסנן Gelman) 0.45 μm (GHP syringe filter, Acrodisc, ונשמרו בחנקן ב- 70-, 0 C עד להפרדה וזיהוי ב- HPLC וב-.GC-MS 4.6.4.4. הפרדת מרכיבי הקוטיקולה של סריגי הכותנה ב- ELSD-RP HPLC לצורך זיהוי הפיקים שנחשדו כחומצות שומן, תוצרי פרוק הקוטין, הופרדו מרכיבי התערובת ב- Luna C18 (25 cm x 4.60 mm i.d. 5 μm ; בקולונה,HPLC Hewlett Packard 1100 series (Phenomenex בקצב זרימה של 0.85 ml/min בנוזל הרצה שהכיל: אצטוניטריל חומצה טרי-פלורוסטית במים mm) 1) טטרהידרופוראן.I.II.III (כולם far UV-quality ובדרגת נקיון- (HPLC grade 39

בגראדיאנט הבא: 50 35 30 (דקות) זמן 0 60 60 60 50 א (%) 5 5 20 25 ב (%) 35 35 20 25 ג (%) החומרים זוהו ע"י גלאי UV באורך גל 210 ובגלאי (55 evaporative light (ELSD, Sedex scattering detector (לחץ 2 אטמוספירות, טמפרטורה (Gain=8,38 0 C המחובר במקביל. 4.6.4.5. הפרדה וזיהוי מרכיבי הקוטיקולה של סריגי הכותנה ב- GC-MS 4.6.4.5.1. דריווטציה של הדוגמאות וסלילציה לצורך הכנת נגזרות סיליל להזרקה ל-,GC-MS שימשו דוגמאות ממיצויים מסריגי כותנה ומתמיסות תגובה כימיות ואנזימתיות (סעיף 4.5). הדוגמאות יובשו עד תום על ידי בעבוע גזי של חנקן ולאחר מכן הומסו ב- 50 μl של Dioxane תוך ערבוב בוורטקס. לאחר מכן הוספו 50 μl של (BSTFA).bis (trimethylsilyl)-trifluoro-acetamide התערובת עורבבה בוורטקס, הועברה לבקבוקון שנסגר והועמד להדגרה 30 דקות ב- 10 mg 60. 0 C מסטנדרטים שונים של חומצות שומן רוויות ומרכיבי קוטין הומסו ב- Dioxane 450 ml ולאחר מכן טופלו בדומה לדוגמאות. 4.6.4.5.2. אנליזת הדוגמאות ב- GC-MS הדוגמאות שעברו סליל הוזרקו ל- Hewlett Packard 5972 series gas chromatograph עם He כגז נושא, המצויד בקולונת 0.25 mm X 30 m HP5 Phe Me Silicon וזוהו באמצעות Hewlett.Packard 5972 mass selective detector הקולונה חוממה ב- 10 0 C/min מ- 150 0 C ל- 300 300. 0 C ואז נשמרה בטמפרטורה זו למשך 20 דקות. המזרק והגלאי נקבעו ל- 0 C 4.7. CBD-GUS/GFP כמדד למידת חשיפת הצלולוז במטרה לפתח מבחן כמותי מדויק למידת ההידרוליזה של הקוטיקולה וחשיפת הצלולוז בסיבי כותנה, נעשה שימוש בחלבון Domain) CBD (Cellulose Binding המאוחה לאנזים -β) GUS E החלבון המאוחה הופק מ-.GFP (green fluorescent protein) או לחלבון glucuronidase) coli רקומביננטי, ושימש לניסויים עם סריגי כותנה שעברו עיכול ברמות שונות של הקוטיקולה שלהם עם אנזימים או עם.NaOH הערכת מידת הקישור של החלבון המאוחה לאתרי הצלולוז החשופים הסתמכה על תוצר התגובה של האנזים GUS עם הסובסטרט MUG (4-methyl.umbelliferyl-β-D-glucuronide) 40

4.7.1. ביטוי וניקוי CBD-GUS/GFP מהחיידק- E.coli לצורף הפקת CBD-GUS/GFP שימש חיידק (DE3) E.coli BL21 המכיל בתוכו את הפלסמיד.(Goldstein et al., (1993 pet-cbd תאי החיידק נדגמו מצלחות הגידול וגודלו במשך הלילה ב- 30 0 C בטלטול ב- 2 ml מצע LB שהוכן על ידי המסת gr) Trypton (10 gr), NaCL (10 ו- gr) Yeast extract 5) בליטר מים מזוקקים פעמיים. המצע עוקר באוטוקלאב ולאחר מכן הוסף לו Kanamycin A 50 mg/l מתמיסת אם של 50 mg/ml שעוקר במסנן..45 μm0 האינוקולום נמהל ביחס 1:1000 ב- 50 ml מצע LB שהכיל.Kanamycin A 50 mg/l התאים גודלו בטלטול ב- 175, rpm ב- 37 0 C במשך הלילה, עד לעכירות. התאים נאספו על ידי צנטרפוגה ב- 1600 g ונשמרו ב- 20 0 C עד השלב הבא. 4.7.1.1. ניקוי החלבון CBD-GUS התאים הורחפו מחדש ב- 10 ml בופר ph=7.2 PBS והתרחיף עבר סוניקציה sec) 3). x 30 הנוזל הכיל את החלבון CBD-GUS הופרד משברי התאים רוכז באולטרפילטרציה עם ממברנת PM-10 בעלת cut off של (Amicon) 10 kda ושימש בניסויים עם סריגי הכותנה. 4.7.1.2. ניקוי החלבון CBD-GFP לאחר הרחפת התאים (כמו בסעיף 4.7.1.1) וסוניקציה, ה- inclusion bodies בודדו בצנטרפוגה ב-,Tween 80 (עם Phosphate-buffered saline (PBS) המשקע בודד ונשטף עם בופר.10,000 g למעט בשטיפה האחרונה) ושאיבה עם פיפטה פסטר (תהליך הצנטרפוגה-שטיפה-המסה מחדש, חזר על עצמו עד שסולקו כל השאריות). המשקע הומס בבופר,(pH=11.3) Urea בריכוז חלבון של,1 mg/ml המכיל M) Tris base (40 mm), Urea (4.5 ו- mm).cysteine (1 התמיסה הועמדה בסטירר ב- 4 0 C ל- 2-4 שעות עד להמסת ה-.inclusion bodies החלבונים שעברו דהנטורציה אוששו בדיאליזה פעמיים כנגד בופר 20 mm Tris ph 8.6 המכיל 10 mm β-mercaptoethanol ופעם אחת כנגד בופר 20 mm Tris-HCl ph 7 ב-. 4 0 C לאחר צנטרפוגה ה- CBD-GFP נמצא בשלב זה כבר בדרגת נקיון של 95% (על סמך אנאליזה ב- Leammli,,SDS-PAGE 12.5% 1970). על מנת להסיר תרכובות בקטריאליות שעשויות היו להישאר, ה-,CBD-GFP הועבר ניקוי עדין בקולונת צלולוז ואושש כמוזכר לעייל. בדיקה כללית לתוצר המתקבל נעשתה על ידי הדגרת ה- CBD עם טבליות נייר והשוואת הפלורוסנציה של הטבליות לאחר שטיפה (כמו בסעיף 4.7.2.1 ב') המטופלות ב- CBD-GFP לטבליות נייר שהודגרו בבופר בלבד (על פי הספציפיקציות של,CBD-Technologies רחובות, ישראל). 41

4.7.1.3. שיטה אלטרנטיבית לניקוי ה- CBD-GFP לאחר הפרדת ה- inclusion bodies מהשאריות החומות, הומסו 4 mg/ml בבופר Tris-base (ph=11.5) 20 mm בטמפרטורת החדר והועמדו בסטירר למשך כשעה עד המסה מוחלטת. התמיסה המתקבלת הועברה טיטרציה באיטיות עם 50 mm HCl עד ל- ph 8 (משך הטיטרציה נמשך כשעה). התמיסה הועברה צנטרפוגה להרחקת משקעים (על פי הספציפיקציות של CBD-,Technologies רחובות, ישראל). 4.7.2. קביעת פעילות CBD-GUS בשיטה פלורימטרית -β הוא הידרולאז שמקטלז את ביקועם של מגוון רחב של E-coli מ- β-glucoronidase.glucuronides האנזים הינו טטראמר של תת יח' זהות עם משקל מולקולרי של כ- 68,200 D כל אחת. הוא יציב בתנאים פיסיולוגים, בעל אופטימום ph של 5.2-8 והוא יחסית עמיד לאינאקטיבצייה בחום (זמן מחצית חיים ב- 55 0 C הוא של כשעתיים). הוא פעיל במיוחד בנוכחות מתווכים מחזרים של thiol דוגמת β-mercaptoethanol ו- DTT המגינים עליו מפני נזקי חמצון. בשל העיכוב שלו ע"י יוני מתכת דו ערכיים, ניתן להוסיף EDTA לתערובת המבחן (חומר הסופח יונים ומבטל את השפעת המטען שלהם). לשם בצוע מבחנים כמותיים הסובסטרט הנפוץ ביותר הוא MUG המשמש במבחן פלורימטרי. המבחן מתחלק לשני חלקים: I. קביעת הפעילות בתמיסת ה-.CBD-GUS קביעה זו מתבססת על רוויה של בד ספיג לחלוטין (מולבן כימית) ב- CBD-GUS והדגרה שלו לפרקי זמן שונים עם MUG לקביעת הפעילות..II מדידת הקישור של ה- CBD-GUS לבד כמדד למידת חשיפת הצלולוז. מתבססת על קביעת תוצר התגובה של האנזים GUS הקשור ל-,CBD עם הסובסטרט,MUG לאחר הדגרה לפרק זמן קבוע של 15 דקות..I התמיסות ששימשו לקביעת מידת חשיפת הצלולוז בסריגי הכותנה באמצעות CBD-GUS היו: בופר פוספט PH=7. 1M ב. בופר מיצוי ל- :GUS כמות ב- 100 (מתמיסת אם 50 mm phosphate buffer ph=7 5 ml (1M (מתמיסת אם ph=7 1 mm Na 2 EDTA 200 μl (0.5M, 0.1 % Triton X-100 100 mg 0.1 % Sarkosyl (sodium lauryl sarcsine) 100 mg 10 mm DTT (Dithiothreitol) 154.2 mg ml בופר המבחן ל-.(MUG) GUS בופר מיצוי ל- GUS המכיל 20.3 mg MUG ) 1 mm MUG,Dushefa מומסים ב- 50 ml בופר מיצוי)..II 42

מ"ל תמיסת ד. תמיסת עצירה 2.12 g) 0.2 M Na 2 CO 3 מומסים ב-.(DDW 100 ml 4.7.2.1. קביעת קינטיקת ה- CBD-GUS הקשור לסריג על הסובסטרט MUG I. 100 מ"ג בד כותנה מולבן כימית (ללא שעוות כלל) הודגרו למשך שעה עם 1 CBD-GUS ב- 37 0 C בטלטול rpm) (175-200. 10 בדים הספיקו ל- 2 חזרות..II לאחר 60 דקות נשפך ה- SUP מהמבחנות, הוסף נוזל שטיפה והמבחנות הודגרו בטלטול למשך 10 דקות. השטיפות הן: (מכיל Tween-80 3 x 2 ml PBS buffer (0.05% 1 x 2 ml PBS buffer בגמר השטיפות הוחלפה תמיסת השטיפה האחרונה בבופר חדש ml) 2) והמבחנות נשמרו בקרח..III הבדים הודגרו ב- 2 ml בופר מבחן בעודף MUG בטלטול rpm) 175-200) ב- 37 0 C לזמנים שונים: 20 15, 10, 5, 0, ו- 25 דקות (העקומה נמצאה ליניארית עד זמן של כ- 30 דקות)..IV בזמן 0 הועברו 2 ml בופר מבחן למבחנות זמן 25 דקות, עורבבו בוורטקס ומיד הועברו 100 μl לאפנדורף המכיל 900 μl תמיסת עצירה. בשאר הזמנים הוכנס בופר מבחן בסדר יורד (אחרון מוכנס זמן 5 דקות) והתמיסות עורבבו בוורטקס. בזמן המתאים הועברו 200 μl למבחנה המכילה 1.8 ml תמיסת עצירה. V. התמיסות בבופר עצירה, נשמרו בחושך (נייר כסף) ובקרח. MU והתוצאות תורגמו לריכוזי EX=165 nm, EM=455 nm פלורוסנצייה נקראה ב-.VI באמצעות עקומת הכיול 1988) al.,.(draper et 4.7.2.2. קביעת קינטיקת הקישור של- CBD-GUS לסריג 175-rpm) 37 בטלטול 0 C ב- CBD-GUS הודגרו ב- 1 מ"ל תמיסת 100 mg פיסות בד של I. 200), בזמנים שונים..III הבדים נשטפו בנוהל המפורט למעלה..IV הבדים הודגרו עם בופר המבחן (MUG) למשך 15 דקות. V. תמיסת עצירה שימשה להפסקת התגובה ורמת הפלורסנצייה בדוגמאות נבדקה בספקטרופלורימטר. 43

Na-Methyl- C) (4 0 מוגנת 4.7.2.3. עקומת כיול ל- MU 1. תמיסת אם של 1 mm Na-MU הוכנה על ידי המסת 19.8 mg של Umbelliferone ב- 100 מ"ל מים מזוקקים פעמים. התמיסה נשמרה בקרור מאור. GUS הועברו לאפנדורף עטוף נייר כסף, 990 μl שהכיל בופר מיצוי ל- והתקבלה 10 μl.2 תמיסת אם 10 μm MU בבופר מיצוי. מתמיסת האם האחרונה בוצע מיהול בבופר מיצוי ליצירת סידרת הריכוזים הבאה (מוגנת.3 מאור): 5 μm 2.5 μm 1 μm 500 nm 100 nm 0 nm 500 μl 250 μl 100 μl 50 μl 10 μl ---- ת. אם 10 μm 500 μl 750 μl 900 μl 950 μl 990 μl בופר מיצוי 1 ml מתמיסות אם אלו הועברו 100 μl לאפנדורפים (דופליקטים) המכילים כל אחד 900 μl תמיסת הפסקה. התמיסות עורבבו בוורטקס והוחזקו בחושך עד לקריאת הפלורוסנצייה.(EX=365nm, EM=455nm).4 44

5. תוצאות 5.1. אפיון האנזימים ששימשו לניסיונות סקורינג האנזימים ששימשו לביצוע ה-,scouring התקבלו ממקורות שונים וכללו קוטינאז, פקטין ליאז ופוליגלקטורונאז. 5.1.1. קוטינאז פעילות האנזים קוטינאז נבחנה במבחן לאסתראזות המבוסס על פרוק p-nitrophenyl-butyrate ל- butyric acid ול- p-nitrophenol היוצר צבע צהוב בעל בליעה באורך גל של 405 nm (סובסטרט זה מלאכותי, היות והוא סונתז למטרת המבחן ואינו קיים בתגובות האנזימתיות המתרחשות בטבע). אף כי מבחן זה פשוט ועל כן נפוץ בשימוש, הוא אינו מסוגל להבחין בין סוגי האסתראזות השונות ובינן לבין האנזים קוטינאז. חישוב המקדמים הקינטים של האנזים קוטינאז עם הסובסטרט המלאכותי, בוצע לפי מיכאליס-מנטן על נתוני הפעילות כתלות בריכוז הסובסטרט (איור 12). 2.5 2 Activity (U/ml) 1.5 1 0.5 1/V 15 10 5 0 0 0.05 0.1 1/[S] 0 0 200 400 600 800 1000 PNP-butyrate (μm) איור 12 פעילות האנזים קוטינאז כתלות בריכוז הסובסטרט.p-Nitrophenyl-butyrate פעילות האנזים נבדקה בספקטרופוטומטר באורך גל של 405. nm תנאי המבחן היו 25, 0 C בופר פוספט 100 mm, ph 8 מכיל X-100.0.027% Triton הנתונים עובדו לערכי 1/V ו- 1/[S] והוצבו בתרשים הפנימי. 45

Fig 12 Esterase activity as a result of increasing levels of p-nitrophenyl butyrate. Changes in activity were measured spectrophotometrically by following changes at 405 nm. The incubation was done at 25 0 C, in 100 mm phosphate buffer ph 8, 0.027% Triton X- 100. Insert shows linearization of the values by converting them to 1/V versus 1/[S]. Pectin lyase.5.1.2 פעילות האנזים Pectin lyase חושבה בהתבסס על מבחן ל- galacturonic acid בלתי רווי. השינוי בכמות התוצר עם הזמן בכל ריכוז אנזים נמדד בספקטרופוטומטר באורך גל 235 nm והוצב באיור 13. הקטע הליניארי בעקומת הרוויה שהתקבלה שימש לחישוב פעילות האנזים בתמיסת האם. פעילות זו נמצאה שווה ל- 2006.1. U/ml Absorbance (235 nm) 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 R 2 = 0.99 0 10 20 30 40 50 PL (μl) איור 13 השפעת ריכוזים עולים של pectin lyase על פרוק polygalacturonic acid potassium salt והופעת התוצר.D-galacturonic acid המבחן לפעילות האנזים בוצע במבחנת קוורץ בספקטרופוטומטר ב-.50 0 C כבלנק שימש 1.9 ml סובסטרט ו- 0.1 ml בופר שחומם ל-.50 0 C המבחן בוצע על ידי הוספת 0.1 ml תמיסת אנזים (C 50), 0 בריכוזים עולים. השינוי בבליעה נבדק באורך גל של 235. nm בתנאים הנ"ל 1 Unit מוגדר כפעילות הגורמת לשחרור 1 mole של galacturonic acid במשך דקה (קבוע הבליעה המולארי שלו.(4,600/Mcm השינוי בבליעה בכל ריכוז אנזים הוצג באיור זה. Fig. 13 Effect of increasing concentrations of pectin lyase on the degradation of polygalacturonic acid and the appearance of D-galacturonic acid in the reaction fluid. The reaction was carried out in quartz cuvette in the spectrophotometer at 50 0 C. 0.1 46

ml enzyme of the indicated concentrations was added to 1.9 ml substrate solution. The changes in wavelength at 235 nm between 2-7 min were used to determine the slope. One unit of enzyme is the amount of enzyme required for the release of 1 mole of saturated D-galacturonic acid per min (its molar coefficient is 4,600/Mcm). The slope in each enzyme concentration was plotted. Polygalacturonase.5.1.3 פעילות האנזים חושבה בהתבסס על תגובה ל- D-galacturonic acid תמיסות אנזים בריכוזים עולים הודגרו במשך שעה עם תמיסת 0.5% polygalacturonic acid והשינוי בכמות התוצר (-D (galacturonic acid שימש לחישוב הפעילות בתמיסת האם. פעילות זו נמצאה שווה ל- 1074.1 U/ml (איור.(14 D-galacturonic acid ( g/ml) 250 200 150 100 50 0 R 2 = 0.9903 0 20 40 60 80 Incubation time (min) איור 14 הקינטיקה של שחרור D-galacturonic acid בהשפעת האנזים.polygalacturonase המבחן בוצע על ידי הכנת מבחנות שהכילו 6 ml סובסטרט (0.5% ( Polygalacturonic acid ו- 1ml אנזים mg/ml) (0.1 בבופר 0.1M Citric Acid/Phosphate buffer, ph 5 והדגרתן למשך שעה באמבט 37 0 C מעלות. בסוף ההדגרה הועברו המבחנות למי קרח לעצירת התגובה ו- 100 μl הועברו מכל מבחנה לסט מבחנות נוסף (בקרח) שלהן הוספו 2 ml מתמיסת ריאגנט A (מכילה.(neocuporine-HCl (מכילה B מתמיסת ריאגנט 2 ml ו- (anhydrous Na 2 CO 3 התמיסות נבחשו והורתחו ל- 13 דקות. לאחר קירור המבחנות הוספו להן 2 ml מים מזוקקים פעמים ובליעה נקראה בספקטרופוטומטר באורך גל 450 nm כנגד מים מזוקקים פעמים 47

בקיווטות חד פעמיות. המבחן בוצע בטריפליקטים (סימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן). מבחנות שהכילו 1 ml בופר ו- 6 ml סובסטרט הוכנו מראש ושימשו כבלנק לסובסטרט. מבחנות נוספות שהכילו 6 ml בופר ו- 1 ml אנזים שימשו כבלנק לאנזים. Fig. 14 Kinetics of D-galacturonic acid release as result of polygalacturonase activity. One ml enzyme (0.1 mg/ml) was added to 6 ml 0.5% polygalacturonic acid in 0.1M citric acid/phosphate buffer, ph 5, and incubated for one hour at 37 0 C. At the end of the incubation, 100 μl were mixed with 2 ml reagent A (anhydrose Na 2 CO 3 ) and 2 ml of reagent B (neocuporine-hcl). The solutions were then boiled for 13 min and to each tube 2 ml of DDW were added. Absorbency was determined at 450 nm. This test was done in triplicates (bars indicated standard deviation). Controls were done at the same condition but with buffer instead of the enzyme or substrate. 5.2. הפקה וניקוי האנזים קוטינאז מהפטרייה.F oxysporum במטרה לקבל יכולת עצמאית של ייצור האנזים קוטינאז נעשה שימוש בפטרייה הפתוגנית לצמחים.F oxysporum שגודלה על מצעים מוגבלים במקור הפחמן שלהם במטרה להשרות בה ייצור מוגבר של קוטינאז חוץ תאי. הפטרייה גודלה על גבי מצע מינרלי שהכיל 100 mg קוטין תפוח מלא (על פי המתואר בשיטות וחומרים). פעילות אסתראזות בנוזל החוץ תאי עלתה והגיעה לשיא ביום 12 לגידול. במקביל נמדדה עליה בכמות החלבון החוץ תאי. בכל ימי הגידול נשמר ph קבוע של ph 7.2 (איור.( 15 48

Esterase activity (U/ml) 0.75 ph 0.50 Protein Esterase activity 10 10 0.25 8 6 4 2 0.00 0 0 5 10 15 20 Culture age (day) 30 20 Protein (μg/ml) / ph איור 15 פעילות אסתראזות, ריכוז חלבון ו- ph בנוזל החוץ תאי במהלך גידול הפטרייה Fusarium oxysporum על גבי מצע מכיל קוטין תפוח מלא. הפטרייה (2.5 מ"ל תרחיף ב- 90 מל מצע) גדלה שלושה ימים ב-,fernbach על מצע מינרלי נוזלי מכיל 0.1% גלוקוז. ביום השלישי לאחר שכילתה את הגלוקוז, נזרעו מחדש 2 מ"ל מהאינוקולום על מצע נוזלי המכיל 100 mg אבקת קוטין תפוח מורחפת (בבקבוקי ארלנמייר בנפח 250 ml המכילים 16 ml תרבית). התרביות הודגרו ללא טלטול באינקובטור 23. 0 C הערכים מציינים ממוצע של שלוש מדידות. סימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן. Fig. 15 Changes in esterase activity, protein concentration and ph in the growth medium during the growth of the fungi Fusarium oxysporum on a medium containing raw apple cutin. Suspensions of the fungus (2.5 ml) were added to 90 ml mineral medium containing 0.1% glucose and inoculated in fernbach for three days. Two ml innoculum were added to 250 ml Erlenmeyer flask containing 16 ml mineral medium and 100 mg raw apple cutin powder. The cultures were kept in 23 0 C. Values represent average of three measurements. Bars indicate standard deviation. 49

על מנת לייעל את תהליך הפקת האנזים, נבדקה השפעתם של תחליפים לקוטין התפוח שהכנתו אורכת זמן רב, יקרה, מצריכה תשומת לב מיוחדת, על מנת לוודא שרק שכבת הקוטין ממוצה בתהליך. בשלב ראשון הוחלף הקוטין הגולמי בקוטין תפוח שעבר הידרוליזה כימית על ידי KOH אתנולי בסוקסלט למשך הלילה. הידרוליזאט זה נמצא בסדרת ניסויים מקדימה (איורים 16,17,18) כנגיש יותר לאנזים בהשוואה לקוטין תפוח שלא עבר פרוק כימי. פעילות האנזים קוטינאז על ההידרוליזאט של הקוטין הייתה רבה יותר בהשוואה לפעילותו עם קוטין תפוח מלא והתבטאה הן בירידת ph מהירה יותר (פי 2 בקרוב תוך 10 דקות, איור 16) והן בדעיכה מהירה בפעילות השאריתית של האנזים בנוזל התגובה (איור 17). 8.10 8.05 8.00 Raw apple cutin Hydrolysate of Apple cutin Positive control (olive oil) ph 7.95 7.90 7.85 7.80 7.75 7.70 0 100 200 300 400 500 600 700 Time (sec) איור 16 ירידה ב- ph התמיסה כתגובה לפעילות האנזים קוטינאז. הבדיקה נערכה עם הסובסטרטים: קוטין תפוח מלא, הידרוליזאט של קוטין תפוח ואמולסיה של שמן זית (המהווה ביקורת חיובית). 25 mg קוטין תפוח גולמי או 1.4 mg קוטין תפוח שעבר הידרוליזה אלקלית (ב- KOH אתנולי חם) הודגרו עם 0.04 U/ml קוטינאז ב- 5 ml תמיסה המכילה 100-X 0.04% Triton ובופר פוספט 20. mm ph 8 הטיפולים נבחשו בטמפרטורת החדר והושוו לביקורת חיובית ) ml 1 (lipase substrate, Sigma בתנאים זהים. Fig. 16 ph drop as result of cutinase activity with various substrates. Twenty five mg raw apple cutin or 1.4 mg hydrolysate of apple cutin (treated with hot alkaline ethanol- KOH in a reflux system), were incubated with 0.04 U/ml cutinase in 5 ml solution containing 0.04% Triton X-100 and 20 mm potassium phosphate buffer ph 8. The 50

reactions were carried out in a room temperature and were compared to 1 ml lipase substrate (Sigma). Cutinase activity (U/ml) 0.4 0.3 0.2 0.1 Control Raw apple cutin Hydrolysate of apple cutin 0.0 0 1000 2000 3000 Time (min) איור 17 דעיכה בפעילות השאריתית של האנזים קוטינאז בנוכחות קוטין תפוח מלא והידרוליזאט של קוטין תפוח. 3.53 u/ml קוטינאז הודגרו עם 50 mg קוטין תפוח או הידרוליזאט של קוטין תפוח בתמיסת בופר פוספט 100 mm, ph 8 המכילה X-100 0.004% Triton בטמפרטורה של 37. 0 C ביקורת בוצעה באותם תנאים אך ללא סובסטרט. הערכים מבטאים ממוצע של שתי חזרות בלתי תלויות. Fig. 17 Reduction in the residual cutinase activity in the presence of raw apple cutin and hydrolysate of apple cutin. 3.53 U/ml cutinase were incubated with 50 mg apple cutin, raw or hydrolysate, in a 100 mm potassium phosphate buffer ph 8, containing 0.004% Triton X-100, at 37 0 C. The control test tube incubated at the same conditions with no substrate. Values represent average of two independent replications. הדעיכה המוגברת בפעילות של האנזים קוטינאז בנוכחות הידרוליזאט של קוטין תפוח הוכחה כנובעת מהתבלות האנזים ולא מספיחתו לסובסטרט (איור 18). 51

נראה כי ההתבלות המהירה קשורה בפעילות המוגברת של האנזים קוטינאז עם ההידרוליזאט של הקוטין בהשוואה לקוטין המלא. פעילות מוגברת זו יתכן והיא נובעת מהיותו של סובסטרט זה נגיש יותר לאנזים. נגישות זו עשויה להתבטא כאמור גם בהשריית יצור מוגבר של קוטינאז על ידי הפטרייה.F. fusarium 0.01 8 Specific activity (U/mg) 0.008 0.006 0.004 0.002 Specific activity ph 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 ph 0 0 1 3 4.5 24 7.3 Time (h) איור 18 ירידה בפעילות הספציפית של האנזים קוטינאז בנוכחות הידרוליזאט של קוטין תפוח. האנזים קוטינאז הודגר עם 1.4 מ"ג קוטין הידרוליזאט בטמפרטורה 37 0 C במטלטלת סיבובית ) 175 (rpm בבופר פוספט 20 mm ph 8 המכיל X-100 0.04% Triton בזמנים המצוינים. Fig. 18 Changes in ph values of the solution and in cutinase specific activity over time in the presence of apple cutin hydrolysate substrate. Cutinase was incubate with 1.4 mg cutin hydrolysate at 37 0 C in 20 mm potassium phosphate buffer, ph 8, containing 0.04% Triton X-100, for the indicated times. השפעת תוספת הידרליזאט של קוטין למצע חסר מקור פחמן, כתחליף לקוטין גולמי נבחנה כשלב ביניים במטרה להשרות בסופו של דבר ייצור והפרשת קוטין למצע הגידול על ידי מרכיב בודד של קוטין. ההידרוליזאט של הקוטין הוסף למצע המינרלי ביום הרביעי לגידול.F oxysporum לאחר שהפטרייה כילתה את תכולת הגלוקוז במצע (הגידול המקדים במצע מכיל גלוקוז נועד להגדיל את הביומסה של הפטרייה) (איור 18). 52

Esterases (U/ml) 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Addition of cutin hydrolysate Esterases activity Glucose concentration 0 2 4 6 8 10 12 14 Culture age (day) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Glucose (mg/ml) איור 19 פעילות אסתראזות חוץ תאיות במהלך גידול הפטרייה Fusarium oxysporum על גבי מצע נוזלי מכיל הידרוליזאט של קוטין תפוח. הפטרייה גדלה 4 ימים בטמפרטורת החדר (C 25) 0 ב- 20 ml מצע מינרלי שהכיל גלוקוז וביום הרביעי לגידול הוספו 1.6 mg הידרוליזאט. שיא בפעילות אסתראזות חוץ תאיות התקבל ביום 9 לגידול. Fig. 19 Esterase activity in the growth medium of Fusarium oxysporum growing on a cutin hydrolysate as carbon source. The fungus grew for 4 days at room temperature (25 0 C) in 20 ml mineral medium containing glucose. At the fourth day 1.6 mg apple cutin hydrolysate were added. A peak in esterase activity was measured at day 9. לאחר שהוכח כי הן מצע קוטין מלא והן הידרוליזאט של קוטין משרים ייצור של אסתראזות חוץ תאיות על ידי הפטרייה, נבדקה השפעתו של הקסדקאנול,(1-hexadecanol) שנמנה על המרכיבים הניאטרלים של קוטין, על תגובה זו (איור 20). הקסדקאן זה דווח כתוסף מוצלח לצורך הפקת קוטינאז מ-.(Lin and Kolattukudy, 1978) F. solani 53

1-Hexadecanol Esterases activity (U/ml) 10.0 Apple cutin 7.5 5.0 2.5 0.0 0 2 4 6 8 10 12 14 Age of culture (day) איור 20 השפעת 1-Hexadecanolכמקור הפחמן במצע הגידול על פעילות אסתראזות בנוזל החוץ תאי במהלך גידול הפטרייה.Fusarium oxysporum הפטרייה גדלה במשך שלושה ימים על מצע מכיל גלוקוז. ביום הרביעי לגידול, לאחר שכילתה את הגלוקוז במצע, היא נזרעה מחדש בבקבוקי ארלנמייר ml) 250) שהכילו 20 ml תרבית ובה קוטין גולמי mg) 100) או הקסדקאנול mg) 200) כמקור הפחמן. הבקבוקים שהכילו הקסדקאנול קוררו לטמפרטורת החדר במטלטלת סיבובית rpm) 200) לאחר שהוסף להם 5, % Tween 80 במטרה להרחיף את ההקסדקאן במצע. התרביות גודלו באינקובטור 23 0 C ללא טלטול ובכל יומיים נדגמו באקראי 3 בקבוקים ונבדקו לפעילות אסתראזות בנוזל החוץ תאי. הערכים מצינים ממוצע של שלוש מדידות. סימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן. Fig. 20 Effect of 1-hexadecanol on cutinase activity measured in the culture medium. Addition of 100 mg raw apple cutin powder or 200 mg 1-hexadecanol to the fungus growth medium resulted in an enhanced secretion of cutinase into the extracellular fluid. When 1-hexadecanol was used as a carbon source, the flasks were autoclaved prior to the insertion of the inoculum and cooled in a rotary shaker, 200 rpm after addition of 0.5 % Tween 80. Values represent average of 3 measurements. Bars indicate standard deviation. 54

שיא בפעילות אסתראזות בנוזל החוץ תאי בנוכחות 200 mg) 1-Hexadecanol לתרבית) הופיע ביום 10 לגידול, בדומה לשיא בנוכחות קוטין תפוח מלא mg) 100 לתרבית), אך הפעילות שנרשמה הייתה גבוהה משמעותית בהשפעת תרכובת זו. כתוצאה מאופיו ההידרופובי הן של הקוטין והן של ההידרוליזאט של הקוטין או ההקסדקאנול הם נוטים להיספח לתפטיר ולאנזימים החוץ תאיים במצע. שחרור האנזים הספוח לנוזל בוצע הן על ידי שטיפת התפטיר ומרכיבי הקוטין במתנול ומים (איור 21) והן על ידי טפול משולב של תוספת מתנול וסוניקציה (איור 22). שטיפת התפטיר גרמה להגברה בפעילות האנזים בנוזל השטיפה בעיקר בשטיפה הראשונה ובמקביל לעלייה בחלבון הכללי (איור 21, תרשים עמודות). שילוב של תוספת מתנול (10%) וסוניקציה הניב את העלייה הגבוהה ביותר הן בפעילות האסתראזות בנוזל והן ברמת החלבון הכללי בהשוואה לכל טיפול בנפרד. Esterase activity in the rinsate (U/ml) 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 Ethanol DDW Protein (μg/ml) 0 1 2 3 4 5 6 Rinse number Before rinse After rinse איור 21 שחרור קוטינאז הספוח לתפטיר ולמרכיבי הקוטין במצע גידול של.F. oxysporum השחרור נעשה באמצעות 2 שטיפות במתנול 10% ולאחר מכן במנות של.DDW כל השטיפות היו בנפח 2 מ"ל על גבי נייר סינון במשפך בכנר. הנוזל המסתנן נדגם וואקום הופעל לייבוש מרכיבי התפטרי והמצע שעל גבי הממברנה לפני השטיפה הבאה. התרשים הפנימי (עמודות) מדגים את העלייה הכללית בחלבון בנוזל בתום השטיפות. Fig. 21 Release of adhering cutinase from the mycelium and the cutin components in the F. oxysporum culture medium. 20 15 10 5 0 55

The release of the adhering enzyme was carried out by rinsing the rough solid residues twice with 2 ml of 10% methanol and then several times with 2 ml DDW each. Insertion demonstrates increase in the protein concentration in the fluid after the rinsing. Protein (μgr/ml) 0.4 Prot. before Prot. after E. Act. before 0.3 E. Act. after 0.2 0.1 60 50 40 30 20 (U/ml) Esterase activity 10 0.0 0 Methanol Sonication Meth. + Sonic. איור 22 השפעת תוספת מתנול (10%) וסוניקציה sec) 3x30, רציף) על הפרדת קוטינאז ממרכיבי המצע ומתפטיר הפטרייה.Fusarium oxysporum מרכיבי התרבית הודגרו עם תוספת המתנול למשך שעה ואז נדגמו. Fig. 22 Effect of methanol (10%) and sonication (3x30 sec, continuously) on the separation of the adhering cutinase from the F. oxysporum mycelium and from cutin components in the culture fluid. The cultures were incubated with the methanol for 1 hour. הנוזל החוץ תאי המופרד הועבר תהליך ניקוי במטרה לבודד את החלבון הפעיל. הניקוי הראשוני כלל שלושה שלבים: הפרדה בקולונת סופרדקס ולאחריה הפרדה במחליף אניוני ph=8,mono Q ו- ph=9 של המקטעים הפעילים. המקטעים נבחנו הן על פי המבחן לאסתראזות עם הסובסטרט p-nitrophenyl butyrate והן על פי מבחן ספציפי לקוטינאז המתבסס על הסובסטרט -4 nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate שסונתז ואופיין לראשונה בעבודה זו (איורים 23 ו-.(24 הסובסטרט לקוטינאז ) ester) 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone -p עם 16-hydroxyhexadecanoic acid סונתז על ידי ריאקציה של (hexadecanoate Nitrophenol ובשלב ראשון היה צורך לוודא שהוא נקי מחומרי המוצא. 56

אנאליזה ב- ELSD-RP HPLC (איור 23) הראתה כי הסובסטרט שהתקבל הראה שיא עיקרי בזמן 20.6 ללא הופעת שיאים של חומרי המוצא. Absorbance Absorbance Absorbance 8400 7900 7400 6900 6400 5900 5400 8400 7900 7400 6900 6400 5900 5400 8400 7900 7400 6900 6400 5900 5400 Substrate 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) p-nitrophenol 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) C-16 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) איור 23 כרומטוגרם ELSD-RP HPLC של הסובסטרט ester) 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone.16-hydroxyhexadecanoic acid :C-16 הסובסטרט המסונתז, :Substrate.hexadecanoate הסובסטרט וחומרי המוצא הומסו בטטרהירופוראן. Fig. 23 ELSD-RP HPLC chromatogram of the substrate, 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate. Substrate: the synthesized substrate, C-16: 16- Hydroxyhexadecanoic acid. The substrate and the parent materials were dissolved in tetrahydrofurane. הסובסטרט הנקי עבר פענוח המבנה הכימי שלו באמצעות H + -NMR (איור 24) קבוצת מתיל סולפון אסתר, שרשרת רוויה של 16 פחמנים וקבוצת - 4 ניטרופניל. ונמצא מכיל 57

O O C H 3 S O C O NO 2 O 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) איור 24 פענוח המבנה של הסובסטרט לקוטינאז.H+-NMR - ב, hexadecanoate Fig. 24 H + -NMR analysis and Structure of the 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate substrate. התגובה האנזימתית של קוטינאז עם סובסטרט זה גורמת לשחרור תוצר צהוב, p-nitrophenol (איור 25). כמות התוצר שהשתחרר נקראת באורך גל 405 nm בספקטרופוטומטר. 58

איור 25 תרשים התגובה של קוטינאז עם הסובסטרט ester) 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone,hexadecanoate לקבלת p-nitrophenol צהוב. Fig. 25 The reaction of cutinase with the 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate substrate. The product of the reaction is the yellowish p-nitrophenol. ייחודו של הסובסטרט הוא בחוסר מסיסותו. ההידרוקסיל אלכוהול הקשור לפחמן 16 בשרשרת השומנית נחסם על ידי מתיל סולפון המגביל את מסיסות התרכובת בתמיסה מימית. חוסר מסיסות זו מונעת את נגישותו לאסתראזות הפועלות בתמיסה אך הופך אותו נגיש לקוטינאז הפועל בשכבת המגע שבין התמיסה המימית לשטח פנים שומני. הסובסטרט החדש נבדק עם קוטינאז ואסתראז אך עלייה מוגברת בתוצרים נמצאה רק בנוכחות האנזים קוטינאז עם הזמן (איור 26). עליה בזמן ההדגרה של קוטינאז וסובסטרט זה גרמה לעלייה ליניארית בכמות התוצרים (p-nitrophenol) בנוזל התגובה, שנקראה בספקטרופוטומטר באורך גל 405. nm בנוכחות האסתראז שנבדק (שהראה במבחן מקדים פעילות אסתראזות זהה עם p-nitrophenyl,(butyrate כמות התוצר שנמדדה הייתה שאריתית. תגובה מסוימת נמצאה כאשר נבדק הסובסטרט עם ליפאז מ-,(Sigma, (1754-L Candida rugosa הפועל אף הוא בשכבת שטח פנים שומנית, אך כמות התוצר שהשתחררה לאחר 30 דקות הייתה קטנה פי 3 מזו שהשתחררה בנוכחות קוטינאז שהראה פעילות זהה בנוכחות.p-nitrophenyl butyrate 59

p-np concentration (mm) 3 2 1 Esteras cutinase esterase Cutinas 0 0 100 200 300 Time (min) איור 26 מבחן ייחודי לקוטינאז על ידי שימוש בסובסטרט ester) 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone.hexadecanoate התרשים הפנימי מדגים את הופעת התוצר הצהוב בעקבות הטיפול בקוטינאז בניסוי זה. התגובה כללה 5 mg סובסטרט ב- 1 ml תערובת ריאקציה המכילה פעילות אסתראזות התחלתית (הן לקוטינאז והן לאסתראז) של 10.92 U/ml ב- 100 mm phosphate buffer ph 8.37 0 C והתבצעה במטלטלת סיבובית rpm) 175) בטמפרטורה של טיפול הביקורת (מוצא הצירים) התבצע באותו אופן רק ללא האנזים. Fig. 26 Specific assay for cutinase activity using the substrate 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate. Insert demonstrates the yellowish solution resulted from the cutinase treatment in comparison to the esterase treatment. Five mg substrate was dissolved in 1 ml reaction mixture containing initial esterase activity (both for cutinase and esterase) 10.92 U/ml in 100 mm phosphate buffer ph 8. The incubation carried out at a rotary shaker (175 rpm) at temperature 37 0 C. Control treatments (axis origin) were incubated at the same conditions but without enzyme. הסובסטרט הראה ספציפיות גבוהה לקוטינאז וכמעט העדר תגובה עם האסתראז שנבדק. בנוכחות האסתראז נשארה התמיסה צלולה, בניגוד לצבע הצהוב שהתקבל בתגובה עם קוטינאז (הופעת (p-nitrophenol (איור 26, תרשים פנימי). 60

התגובה של קוטינאז עם סובסטרט זה נבחנה גם עלי ידי אנליזת ELSD-RP HPLC של הסובסטרט לפני ואחרי הדגרה ממושכת עם קוטינאז (איור 27). הכרומטוגרם שהתקבל מראה על העלמות הסובסטרט (שיא ב- 20.3 דקות), לאחר העיכול האנזימתי, והופעת p-nitrophenol (שיא ב- 4.3 שזוהה באמצעות תמיסת סטנדרט). 8400 Substrate 7900 Absorbance 7400 6900 6400 Untreated 5900 5400 0 20 40 60 Time (min) 8400 7900 Absorbance 7400 6900 6400 P-Nitrophenol Treated 5900 5400 0 20 40 60 Time (min) איור 27 אנליזת ELSD-RP HPLC של הסובסטרט ester) 4 -nitrophenyl (16-methyl sulfone 5 mg עיכול עם קוטינאז. תנאי התגובה היו (treated) ואחרי (untreated) לפני hexadecanoate סובסטרט ב- 10 ml תערובת תגובה שהכילה קוטינאז (מעל 10) U/ml בבופר פוספט 100, mm 37. 0 C ובטמפרטורה של 175) rpm) ההדגרה בוצעה במשך 5 ימים במטלטלת סיבובית.pH 8 Fig. 27 ELSD-RP HPLC analysis of the 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate substrate before (untreated) and after (treated) treatment with cutinase. 61

Five mg substrate suspended in 10 ml reaction mixture containing cutinase (>10 U/ml) in 100 mm phosphate buffer ph 8. The incubation carried out for 5 days on a rotary shaker (175 rpm) at temperature 37 0 C. הקינטיקה של קוטינאז עם סובסטרט זה נבחנה ונמצאה אפיניות גבוהה של האנזים לסובסטרט (איורים 29 28, ו- 30). קוטינאז U/ml) 10.92) הודגר עם סדרה עולה של ריכוזי סובסטרט לפרקי זמן עולים. ניתן לראות שבריכוז 10) mg/ml) 0.022 mm/ml סובסטרט התקבלה רוויה במהירות הריאקציה. השיפועים שהתקבלו שימשו לקביעת מהירות התגובה (V) והוצבו בעקומת מיכאליס -מנטן כנגד ריכוז הסובסטרט [S]. המקדמים הקינטים חושבו על ידי הצבת [S]/V כנגד [S] בעקומה על שם Vmax.Hanes חושב מתוך שיפוע הגרף ונמצא שווה ל- 0.0105 mm/min וה- Km חושב מתוך נקודת המפגש של הישר עם ציר ה- X ונמצא שווה ל- 2.6. μm ערך נמוך זה מעיד על אפיניות גבוהה של האנזים לסובסטרט. בנוסף חושב ונמצא Kcat של 1- min 0.66. p-np concentration (mm) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 100 200 300 400 Incubation time (min) con. (mg) 0 1 5 10 25 50 איור 28 השפעת ריכוז הסובסטרט 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate וזמן ההדגרה על מהירות הריאקציה עם קוטינאז. תנאי ההדגרה היו 0-50 mg סובסטרט ב- 1 ml תערובת ריאקציה המכילה 10.92 U/ml קוטינאז ב- 100 mm בופר פוספט ph 8 במטלטלת סיבובית rpm) (175 בטמפרטורה של.37 0 C Fig. 28 The effect of substrate concentration and incubation time on the rate of cutinase activity. 62

Incubation conditions were: 0-50 mg substrate in 1 ml reaction mixture containing 10.92 U/ml cutinase in 100 mm phosphate buffer ph 8. The incubation was carried out at 37 0 C under continuos rotary shaking (175 rpm). 0.0 100 Activity (U/ml) 0.0 075 0.0 050 0.0 025 0.0 000 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) [S] (M) איור 29 השתנות פעילות קוטינאז כתלות בריכוז הסובסטרט hexadecanoate (עקומת מיכאליס-מנטן). נתוני הפעילות חושבו מתוך שיפועי הישרים שבתרשים 28. יחידת פעילות אחת של קוטינאז מוגדרת ככמות האנזים הדרושה לשחרור 1 מיקרומול -p nitrophenol למ"ל לדקה. Fig. 29 Michaelis-Menten curve for cutinase and the substrate 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate. The depicted graph is based on calculation of results presented in Fig. 28. One Unit of cutinase is defined as the amount of enzyme required for the release of 1 micromole p-nitrophenol per ml per min. 63

[S]/V (U/mM) 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 S V = ( V 1 max Km S) + V max 0.005 0.030 0.055 0.080 0.105 [S] (M) איור 30 ליניאריזציה של גרף הפעילות כתלות בריכוז הסובסטרט על פי המודל של.Hanes הנתונים חושבו (ראה נוסחה) על סמך הנתונים שהוצגו בתרשימים 28 ו- 29. מהירות התגובה בסדרת ריכוזים עולים של סובסטרט שימשה לציור קו ישר במערכת צירים של S/V כנגד [S]. מתוך העקומה חושבו המקדמים הקינטים של התגובה של קוטינאז עם הסובסטרט 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate ונמצא ה- (2.6 μm) Km ו- (0.0105 mm/min) Vmax מתוך נקודת החיתוך עם ציר ה- X ושיפוע הקו בהתאמה. Fig. 30 Hanes plot (see equation) calculated on the basis of data depicted in Fig. 28 and 29. The velocities at different substrate concentrations were used to plot the graph of S/V versus [S]. The Km (2.6 μm) and Vmax (0.0105 mm/min) values were determined from the x axis intercept and from the line slope respectively. לאחר שאופיין 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate כסובסטרט ספציפי לקוטינאז ונמצאו הקבועים הקינטים שלו, הוא שימש לזיהוי המקטעים שהכילו קוטינאז בשלבי ניקוי האנזים שהופק מהפטרייה.Fusarium oxysporum הנוזל החוץ תאי המרוכז עבר צנטרפוגה והוזרק לקולונת ג'ל פילטרציה מסוג סופרדקס 200 בעלת יכולת הפרדת חלבונים בתחום מסות של 10-600 kda (איור 31). התוצאות מראות שיא פעילות קוטינאז החופף בקרוב לשיא של פעילות האסתראזות ושיא החלבון בזמנים של 9-16 דקות. 64

2000000 500 Esterase activity Enzyme activity (U/ml) 400 300 200 100 Cutinase activity Absorbence (280) 1500000 1000000 500000 Absorbance (280 nm) 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Time (min) איור 31 הפרדה ב- HPLC המצויד בקולונת Superdex 200 של מרכיבי הנוזל החוץ תאי המרוכז שהופק 50 mm ph 8 מ-.Fusarium oxysporum קרוד האנזים הופרד בקולונה זו עם בופר פוספט כנוזל הרצה שהוזרם איזוקרטי בקצב זרימה של 1. ml/min המקטעים נבחנו לפעילות אסתראזות ואלו שהראו פעילות כזו נבדקו עם 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate לפעילות קוטינאז. יחידת פעילות אחת של אסתראז מוגדרת ככמות האנזים הדרושה לשחרור 1 מיקרומול p-nitrophenol למ"ל לדקה ואילו של קוטינאז מתייחסת לנאנומול תוצר למ"ל לדקה. Fig. 31 HPLC purification of the cutinase enzyme from Fusarium oxysporum using a Superdex 200 column. Purification was done with HPLC (Waters 600E) equipped with a spectra-physics detector (280 nm), a fraction collector (Pharmacia Biotech) and a gel filtration Superdex 200 column with isocratic flow (1 ml/min) of potassium phosphate buffer (50 mm, ph 8). Fractions collected every 1 min for 45 min. The fractions that showed esterase activity (with p-nitrophenyl butyrate) were also assayed for cutinase activity with the 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone ester) hexadecanoate substrate. One Unit of esterase is defined as the amount of enzyme required for the release of 1 micromole p-nitrophenol per ml per min while cutinase activity is defined as nanomoles per ml per min. המקטעים שהראו פעילות אסתראזות ופעילות קוטינאז (מקטעים 9-12 ו- 13-16 דקות) הופרדו ונשמרו לשלבי הניקוי הבאים ולהטענה על ג'לים. מקטעים אלו הוזרקו תחילה לעמודת מחליף אניוני מסוג mono Q ב- ph=8 (איור 32). 65

180 600000 Enzyme activity (U/ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 Esterase activity Cutinase activity Absorbence (280 nm) 500000 400000 300000 200000 Absorbance (280 nm) 0 0 10 20 30 40 50 Time (min) 100000 איור 32 ניקוי קוטינאז הפרדת מקטעים פעילים במחליף אניוני ph=8.mono,q המקטעים הפעילים מהשלב הקודם (איור 31) אוחדו, רוכזו באולטראפילטרציה, סורכזו והועברו בעמודת מחליף אניוני Biotech) (Mono Q, FPLC, Pharmacia עם בופר תריס 8) (50 mm, ph וגרדיאנט של 0-1 M NaCl במשך 40 דקות. הגדרת יחידות פעילות כמו באיור 31. Fig. 32 Purification of the cutinase enzyme using Mono Q column (ph 8). The Cutinasecontained fractions (Fig. 31) were combined and concentrated by ultrafiltration, centrifuged and injected into an anionic Mono Q column (FPLC, Pharmacia Biotech) with Tris buffer (50 mm, ph 8) and 0-1 M NaCl gradient for 40 min. Esterase and cutinase activity Unit definition as in Fig. 31. ph=9 מקטעים 10 ו- 11 שנמצאו פעילים, (איור 33, A ו- B בהתאמה). הועברו שלב ניקוי אחרון באותה הקולונה אך ב- 66

Enzyme activity (U/ml) 5 4 3 2 1 A esterase activity cutinase activity Absorbence (280 nm) 180000 170000 160000 150000 140000 Absorbance (280 nm) 0 0 10 20 30 40 50 Time (min) 130000 4 esterase activity 180000 Enzyme activity (U/ml) 3 2 1 B cutinase activity Absorbence (280 nm) 170000 160000 150000 140000 Absorbance (280 nm) 0 0 10 20 30 40 50 Time (min) 130000 איור 33 השלב האחרון בניקוי האנזים קוטינאז הפרדה במחליף אניוני ph=9.mono,q המקטעים הפעילים הועברו בקולונה באותם התנאים אך בבופר תריס mm) ph 9 50) וגרדיאנט 0-0.05 M NaCl במשך 40 דקות. המקטעים הפעילים שנאספו בשלב ניקוי זה היו מקטעים 19-20 שמקורם במקטע (A) 10 ומקטע (B) 21 שמקורו במקטע 11 מהשלב הקודם. הגדרת יחידות פעילות כמו באיור 31. Fig. 33 Final step of cutinase purification using Mono Q column (ph 9). The fractions enriched with cutinase activity, were injected into the same column but with Tris buffer (50 mm) ph 9 and 0-0.5 M NaCL gradient for 40 min. 67

Esterase and cutinase activity found in fractions 19-20 of the 10 min fraction at the previous step (A) and in fraction 21 of the 11 min fraction from the previous (B). Unit definition as in Fig. 31. טבלת הניקוי של שלבי הניקוי הראשונים מדגימת את העלייה בפעילות הספציפית יחד עם העלייה בדרגת הניקיון (טבלה 5). דרגת הניקיון והפעילות הספציפית לאחר שלב הניקוי בקולונת mono Q ב-,pH 8 היו גבוהות יותר במקטע 10 לעומת מקטע 11. רמת הניקיון היותר גבוהה של מקטע 10 מתבטאת גם בשיא פעילות בודד (איור 33, A). המבחן לאסתראזות מדגים עלייה של פי 7 ופי 5 בדרגת הניקיון של מקטעים 10 ו- 11 בהתאמה, לאחר שני שלבי ניקוי. 68

טבלה 5 p-nitrophenyl טבלת ניקוי לאנזים קוטינאז מ-.F oxysporum (מבחן לאסתראזות עם A..(butyrate מקטע 10, B. מקטע 11. יחידת פעילות אחת של אסתראז מוגדרת ככמות האנזים הדרושה לשחרור 1 מיקרומול p-nitrophenol למ"ל לדקה. Table 5 Purification steps for cutinase from F. oxysporum (esterase assay with p-nitrophenyl butyrate). A. The 10 min fraction, B. The 11 min fraction. One Unit of esterase is defined as the amount of enzyme required for the release of 1 micromole p- nitrophenol per ml per min. (A) תאור נפח (ml) פעילות פעילות ניצולת חלבון פעילות דרגת (mg/ml) כללית (%) ספציפית ניקיון (U/ml) (U/mg) (U) Cleaning Specific Protein Utilizati- General Activity Volume Descript- degree activity (U/mg) (mg/ml) on (%) activity (U) (U/ml) (ml) ion 1 40 14 100 1374 550 3 Crude 2.1 85 3 32 437 218 2 Superdex 6.9 274 0.18 7 100 50 mono Q 2 ph=8 (B) mono 4.75 188 0.18 5 69 34 2 Q ph=8 דוגמאות משלושת שלבי הניקוי הורצו בג'ל- SDS-PAGE אל מול סמן מולקולרי (איור 34). ניתן לראות כי כמות החלבונים הלכה וירדה בשלושת שלבי הניקוי וכי בשלב הניקוי האחרון (קולונת התקבלו במקטע שני פסים, האחד של כ-.40 kd והשני של כ- 65 kd 21 (mono Q, ph 9 69

Mono Q ph=9 Mono Q ph=8 Superdex Crude 21 19-20 11 10 13-16 MW (kda) 148 98 64 50 36 22 6 4 איור 34 Fusarium הפרדה בג'ל SDS-PAGE של תוצרי הניקוי של קוטינאז שהופק מהפטרייה.oxysporum על ג'ל (12%) SDS-polyacrylamide הוטענו דוגמאות בנפח של 20 μl שהכילו כ- 10 μg חלבון (למעט מקטעים משלבי הניקוי הראשוני שהכילו כ- 30 μg חלבון). החלבונים נצפו לאחר צביעת.Comassie blue Fig. 34 SDS-PAGE purification steps of cutinase from F. oxysporum. Comassie blue staining of SDS-polyacrylamide gel (12%) was used to view the proteins. Twenty μl samples containing approximately 10 μg protein (unless for the first cleaning steps that contains 30 μg protein) were loaded in each wail. בנוסף הורצו המקטעים על גבי ג'ל IEF לבדיקת חלבון, פעילות אסתראזות (איור 35). ניתן לראות כי פס של פעילות אסתראזות בערכי pi של כ- 5.1 הלך והתנקה. 70

צב יעת חלבון פע יל ותאסתרא ז ות Mono Q ph 9 21 Mono Q ph 8 Superdexx Crude 19-20 11 10 13-16 סמן IEF pi 4.45-9.6 Mono Q ph 9 21 (MW kd) pi (31) 6 (18.4) 5.1 (23.2) 4.4-4 איור 35 ניקוי והפרדת אסתראזות בג'ל.IEF זיהוי פעילות אסתראזות במקטעים משלבי הניקוי של קוטינאז שהופק מהפטרייה Fusarium oxysporum וקביעת חלבון במקטע הנקי ביותר כנגד סמן.pI הג'ל נצבע לפעילות אסתראזות (שמאל) ולחלבון (ימין). מקטע 21: המקטע הנקי ביותר משלב הניקוי ב-.pH 9,Mono Q Fig. 35 An isoelectric focusing (IEF) separation of the F. oxysporum cutinase purification steps. The gel was stained for esterase activity (left) and for protein (right). Fraction 21: The most purified fraction from the Mono Q, ph 9 cleaning step. על מנת לוודא כי מקטע זה (איור 35, מסומן בחץ אדום) הוא בעל פעילות קוטינאז, הורצו מקטע מהקרוד ומקטע משלב הניקוי הראשון (קולונת סופרדקס 200) על גבי ג'ל IEF שנחתך לשלושה מקטעים. המקטע הראשון נבדק לפעילות חלבון, השני לפעילות אסתראזות והשלישי לפעילות קוטינאז. נמצא כי אכן מקטע זה (איור 36, מסומן בחץ אדום) הוא בעל פעילות קוטינאז. 71

Crude Superdex איור 36 ג'ל IEF לקביעת חלבון, פעילות אסתראזות ופעילות קוטינאז לאחר שלב הניקוי בקולונת סופרדקס 200. המקטעים שהראו פעילות קוטינאז (12-14) אוחדו והוטענו על ג'ל.IEF הג'ל נצבע לחלבון ולפעילות אסתראזות ונבדק לפעילות קוטינאז על ידי הדגרתו עם 5 mg סובסטרט לקוטינאז בתמיסת בופר פוספט (8 100) mm, ph במטלטלת סיבובית ב- 37 0 C במשך 20 דקות. פעילות קוטינאז (תרשימי העמודות) מופיעה בערכי בליעה (OD) באורך גל 405. nm Fig. 36 IEF purification of cutinase and esterase after separation on a Superdex 200 column. The fractions enriched with cutinase activity (12-14 min) were combined and loaded on an IEF gel (right), along with a crude sample (left). The gel was stained for protein and esterase. For cutinase activity assay 5 mg cutinase substrate were suspended in potassium phosphate buffer (100 mm, ph 8) and shake in a rotary shaker (175 rpm) at 37 0 C for 20 min. Cutinase activity (bars) depicted in 405 nm OD values, 72

מקטע 21 הראה פס יחיד של חלבון, בערך pi נמוך (4.5). 5.3. הידרוליזה אנזימתית של סיבי כותנה עם Pectin lyase,cutinase ו- Polygalacturonase פעילות האנזימים על סיבי כותנה המאוגדים לסריג, נבחנה בשני היבטים: השינויים שעבר הסריג. א. השינויים שחלו בנוזל התגובה. ב. המדדים ששימשו לבחינת השינויים בסריג כללו מבחן לכושר ההרטבה של הסריג (הנחת טיפת מים על הסריג ומדידת זמן שקיעתה), אובדן משקל, צביעות ספציפיות לצלולוז ולפקטין וקישור CBD לצלולוז החשוף כמדד למידת פרוק הקוטיקולה. המדדים לבחינת השינויים בנוזל כללו מדידת ירידת ph הנוזל, ELSD-RP HPLC ו- GC-MS למיצוי אורגני של חומצות שומן מהנוזל. סטנדרטים של המרכיבים העיקריים של הקוטיקולה הצמחית שימשו להתאמת שיטה שתאפשר הפרדה טובה של תוצרי פרוק שעוות הבד ב- HPLC המצויד בגלאי.ELSD מרבית חומצות השומן הרוויות הופיעו בשיטה זו בזמנים של בין 20-25 דקות. הקטנת השרשרת הפחמנית, תוספת קבוצות הידרוקסיליות או קשרים כפולים הגדילו את רמת ההידרופיליות וגרמו לשחרור מוקדם של החומרים בשיטת הפרדה זו. 5.3.1. הידרוליזה כימית עם NaOH תחילה נבדקו השינויים בסריגי כותנה שעברו טיפול כימי ברמות עולות של ) NaOH 100-2000 (mm במשך 30 דקות. עם ההחרפה בטיפול חלה עלייה אקספוננציאלית בכושר ספיגת המים של הסריג (זמן ההרטבה התקצר) עם רוויה בין 1-1.5 M NaOH (איור 37, A). הטיפול התעשייתי המקובל מתבצע ב- 250. mm NaOH החרפת הטיפול הכימי התבטאה גם בעלייה בהפסד המשקל שהגיעה קרוב לערך רוויה כבר בריכוז ההתחלתי של 100. mm NaOH ניתן לראות כי טיפול הביקורת עם DDW רותחים גרם ל- 60% בקרוב מאבדן המשקל. השינויים בפני השטח של הסיב לוו בהופעה של תוצרי הידרוליזה בנוזל התגובה (איור 37, B). תוצרים אלו כללו הן פקטין והן חומצות שומן רוויות ומכאן שהשפעת הטיפול הייתה הידרוליזה מוחלטת של הקוטיקולה. הכרומטוגרמים של ה- ELSD-RP HPLC מדגימים כי עוצמת השיאים המיצגים את מרכיבי הפקטין (3-8 דקות) ואת מרכיבי השעוות (26-30 דקות) נמצאת בהתאמה כמותית להגברה ברמת ההרטבה של הסריגים המטופלים. 73

ב, A 8000 160 Wetting time (s) 6000 4000 2000 120 80 40 Weight loss (mg) 0 0 500 1000 1500 2000 0 Initial NaOH concentration (mm) B Pectin Constituents Cutin Constituents איור 37 הידרוליזה כימית של מעטה סריגי כותנה בהרתחה למשך 30 דקות עם A..NaOH עליה בהפסד המשקל והאצה בזמן ההרטבה של סריגי הכותנה המטופלים כתלות בריכוז NaOH עולים. NaOH התגובות בוצעו בהרתחה במשך 30 דקות בריכוזי המצוינים. ביקורת (מוצא הצירים) בוצעה ב- DDW באותם תנאים. הערכים מצינים ממוצע של 3 חזרות וסימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן. B. הפרדה ב- ELSD-RP HPLC של מיצוי בכלורופורם של תוצרי הפרוק מסריג כותנה שטופל ב- DDW (ביקורת) - NaOH 250 mm או ב-.1000 mm NaOH 74

ניתן לראות הופעה של 2 קבוצות חומרים עיקריות, הראשונה הידרופילית יותר (3-8 דקות) ואשר שימוש בסטנדרטים הראה כי היא מכילה D-galacturonic acid תוצר הפרוק של פקטין והשנייה הידרופובית (26-30 דקות). תוצרי הקבוצה השנייה זוהו על ידי אסוף מקטעים (כל 0.5 דקה) מההפרדה ב- HPLC-RP והזרקתם לזיהוי ב-.GC-MS נמצא שקבוצת השיאים ההידרופובית מכילה בעיקר חומצות שומן רוויות בנות 16 ו- 18 פחמנים. ניתן גם לראות שכמות התוצרים עלתה כתלות בריכוז ה-.NaOH Fig. 37 Chemical scouring of cotton fabrics with NaOH. A. Effect on the weight loss and wetting time. Reactions were carried out for 30 min at 100 C in a NaOH solution at the indicated concentration. Control treatments (axis origin) were done with boiling DDW for 30 minutes. Values represent average of three independent replicates. Bars indicate standard deviation B. ELSD-RP HPLC analysis of a chloroform extract of the residual reaction fluid of the treatments without (control) or with 250 and 1000 mm NaOH at the above conditions. The changes in the fabric surface were accompanied by the appearance in the reaction fluid of specific hydrolysis products of both the pectin (RT-3-8 min), identified using standards to contain D-galacturonic acid and waxy layers (RT-26-30), identified by collecting the RP HPLC fractions and injecting them separately to the GC-MS. This indicated complete hydrolysis of the fiber cuticle. As depicted by the ELSD-RP HPLC chromatograms, the peaks height is positively correlated with the increase in wettability. 5.3.2 הידרוליזה אנזימתית עם קוטינאז תגובה דומה של הגברה בהפסד המשקל ובכושר ספיגת המים התרחשה כאשר הסריג טופל בריכוזים עולים של האנזים קוטינאז או כאשר נעשה שימוש בריכוז אנזים קבוע וזמני הדגרה ארוכים יותר (איור 38). ריכוז האנזים נבחן בתחום של 0-34, U/ml לאחר הדגרה של 20 שעות ואילו זמן ההדגרה נבחן בטווח של 1-20 שעות בנוכחות 12.8 U/ml אנזים.בהדגרה לפרקי זמן עולים, הפעילות השאריתית של קוטינאז בנוזל התגובה נשארה גבוהה במשך כ- 4 שעות (נתונים לא מוצגים), הזמן בו התרחשו מרבית השינויים בסריג. בשני המקרים התרחשה ירידה בזמן ההרטבה בעקומת רוויה עם אסימפטוטה סביב קצב ספיגת מים של 30 שניות, ובמקביל עלייה ליניארית בהפסד המשקל. ניתן לראות כי אבדן משקל בטיפול הביקורת, ללא אנזים, (מוצא הצירים) הוא כמעט 70% מכלל הפסד המשקל שהתקבל ומכאן שטיפול זה הסיר לכלוכים ספוחים מסיבי הכותנה. 75

1500 A 60 1000 40 Wetting time (s) 500 20 0 0 10 20 30 0 40 Initial cutinase activity (U/ml) 1500 B 60 1000 40 Weight loss (mg) 500 20 0 0 0 5 10 15 20 25 Incubation time (h) איור 38 השפעת ריכוזים עולים של האנזים קוטינאז (A), בהדגרה ל- 20 שעות, או זמני הדגרה עולים (B), עם 12.8 U/ml פעילות התחלתית של האנזים קוטינאז, על הפסד המשקל וכושר ההרטבה של סריגי כותנה. תנאי ההדגרה היו: פיסות סריג במשקל 10 ml 1, g תערובת ריאקציה המכילה 100 mm בופר פוספט 8),(pH דטרגנט לא יוני 0.1% AvcoPal-AWS בטמפרטורה 37 0 C וטלטול במטלטלת סיבובית rpm) 175). טיפולי הביקורת (מוצא הצירים) התבצעו באותם תנאים אך ללא האנזים. הערכים מצינים ממוצע של 3 חזרות. סימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן. Fig. 38 Changes in weight loss and wetting time during incubation of cotton fabrics with cutinase. A. Effect of increasing rates of enzyme activity. The incubation time was 20 h. B. Effect of incubation periods. Initial cutinase activity was 12.8 U/ml. Incubation conditions were: 1 g fabric swatches, 10 ml reaction mixture containing 100 mm phosphate buffer ph 8 and 0.1% AvcoPal-AWS non-ionic detergent, at 37 0 C on a 76

rotary shaker (175 rpm). Control test tubes did not contain enzyme. Values represent average of three independent replicates. Bars indicate standard deviation. במקביל לבחינת השינויים שעברו הסריגים המטופלים בעקבות הידרוליזה אנזימתית עם קוטינאז נבחנה השפעת הטיפולים על נוזל התגובה. שעוות שמוצו מסריגי כותנה זוהו ב- FID כנגד סטנדרטים ונמצא שהן מכילות בעיקר חומצות שומן רוויות בנות 16 ו- 18 פחמנים אך גם חומצה לינולאית (18:2) (נתונים לא מוצגים). תמונה מפורטת יותר של מרכיבי השעוות התקבלה באנליזת GC-MS של שעוות שמוצו מסריג כותנה גולמי ב- dichloromethane במערכת סוקסלט למשך הלילה. המרכיבים העיקריים שנמצאו מוצגים בטבלה 6. טבלה 6 המרכיבים העיקריים של שעוות סריגי כותנה גולמיים (מיצוי בדיכלורומתאן חם במערכת סוקסלט במשך הלילה) כפי שזוהו ב-.GC-MS Table 6 GC-MS identification of the main components of waxes extracted from raw cotton fabrics. Reflux preformed in hot DCM over night. RT שם נוסחה משקל מולקולרי שטח (%) Erea (%) 1.63 RT 7.138 Molecular weight 185.79 Equation C 9 H1 4 O 4 Name Azelaic acid 1.34 7.684 227.055 C 14 H 25 O 2 Tetradecanoic acid 32.9 9.69 255.085 C 16 H 31 O 2 Hexadecanoic acid 6.13 10.65 269.105 C 17 H 33 O 2 Heptadecanoic acid 12.97 11.59 283.115 C 18 H 35 O 2 Octadecanoic acid 9 14.76 433.385 C 33 H 65 Hexatriacontane 5.70 20.28 409.295 C 28 H 55 O Octacosanol שני המרכיבים העיקריים שנמצאו במיצוי הם 16:0 ו- 18:0. מרכיבים אלו נמצאו גם כתוצרים העיקריים במיצוי תמיסת הריאקציה של קוטינאז עם סריגי כותנה גולמיים (איור 39). 77

A Raw cotton B Reaction fluid איור 39 אנליזה של נגזרות טרימתיליות של מרכיבי שעוות סריגי כותנה גולמיים ב- A..GC-MS מיצוי של סריגי כותנה גולמיים ב- (DCM) dichloromethane במערכת סוקסלט במשך הלילה. B. מיצוי כלורופורמי של נוזל התגובה לאחר הדגרה של 19 U/ml קוטינאז למשך 23 שעות. שאר תנאי התגובה כמו באיור C:16.38 C:14, ו- C:18 הם tetra, hexa ו- octadecanoic acids בהתאמה. Fig. 39 GC-MS analysis of trimethylsilyl derivatives of cutin constituents of cotton fiber. A. Dichloromethane extract of raw cotton swatches with reflux over night. B. Chloroform extract of the residual reaction solution following incubation with 19 U/ml cutinase for 23 h. Conditions were similar to those indicated in Fig. 38. C:14, C:16 and C:18 designate tetra, hexa and octadecanoic acids. 78

anionic detergent nonionic detergent Cutinase activity (%) 150 130 110 triton x-100 Cutinase activity (%) 125 100 75 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Surfactant (% V/V) 90 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Surfactant (% V/V) 5.3.2.1. השפעת חומרים משטחים על יעילות התגובה האנזימתית של קוטינאז עם סריגי כותנה חומרים משטחים ממלאים תפקיד חשוב בהגברת נגישות אנזימים שונים לסובסטרטים שומניים. בנוסף גורמים הדטרגנטים עצמם לפרוק חלקי של מעטה סיבי הכתנה. יעילות ההידרוליזה האנזימתית עם קוטינאז על המעטה של סיבי הכותנה נבחנה כתלות בנוכחותם של חומרים משטחים בריכוזים שונים (איור 40). פעילות האנזים נבדקה עם ריכוזים עולים של דטרגנט לא יוני AvcoPal-AWS (תערובת של,(polyoxyethylene fatty alcohols דרגנט אניוני AvcoPal-.Triton X-100 ו- (mono and dialkyl potassium phosphate esters של (תערובת AWS שלושת הדטרגנטים גרמו בריכוזים עולים להגבה בפעילות האנזים (עד 0.04%, 0.1% ו- 0.4 % בהתאמה).בריכוזים גבוהים יותר הראו הדטרגנט הלא יוני והטריטון השפעה יורדת בהאצת הפעילות. איור 40 השפעת תוספת דטרגנטים מסחריים על פעילות האנזים קוטינאז. האנזים הודגר בתמיסה המכילה דטרגנט אניוני,(AvcoBlank-AW) דטרגנט לא יוני (AvcoPal-AWS) תוצרת AVCO- CHEM או X-100 Triton (תרשים פנימי), ב- 25 0 C בבופר פוספט 8).(100 mm ph תערובת הריאקציה עורבבה ופעילות האנזים נבדקה מידית עם הסובסטרט.p-nitrophenyl butyrate הביקורות נעשו ללא דטרגנט (מוצא הצירים). Fig. 40 Effect of commercial detergents on cutinase activity. The enzyme was incubated with increasing concentrations of anionic detergent (AvcoBlank-AW), nonionic detergent (AvcoPal-AWS) of AVCO-CHEM or with Triton X-100 (insertion) of Sigma. 79

Reactions were carried out at 25 0 C in 100 mm potassium phosphate buffer, ph 8. Cutinase activity was measured with p-nitrophenyl butyrate immediately following the addition of the enzyme. Control treatment did not contain detergent. לאחר שנמצאו ריכוזי הדטרגנט המיטביים להאצת הפעילות של קוטינאז, נבדקה השפעתם בריכוזים אלו על יעילות ההידרוליזה האנזימתית של המעטה של סיבי כותנה (איור 41). השפעת הדטרגנט הלא יוני,(polyoxyethylene),Triton 100-X הושוותה להשפעת תערובת של דטרגנט לא יוני (AvcoPal-AWS) ודטרגנט אניוני ) esters, (mono and dialkyl potassium phosphate,avcoblank-aw המקובלת בתעשייה. התוצאות מראות על השפעה מוגברת של קוטינאז, פי 7 בקרוב, בנוכחות תערובת הדטרגנטים (איור 41, A). השינוי בביקורות ללא אנזים מדגים כי לדטרגנטים השונים יכולת הסרה מסוימת של הקוטיקולה גם ללא אנזים בהדגרות לזמן ממושך. ניתן לראות כי למרות שה- 100-X Triton ללא אנזים הראה יעילות טובה יותר בגרימת כושר הרטבה, תערובת הדטרגנטים, השיגה שיפור טוב יותר בפעילות קוטינאז על המעטה של סיבי הכותנה. ההגברה בכושר ההרטבה של הסריגים הייתה בהתאמה לירידה בפעילות השאריתית של האנזים (נתונים לא מופיעים) והופעת תוצרי ההידרוליזה של שכבת הקוטין, 16:C ו- 18:C, בנוזל התגובה, שהופרדו ועל ידי ELSD-RP HPLC וזוהו על ידי אנליזה של המקטעים המופרדים ב-.(C,B,41 (איור GC-MS 80

A Wetting time (s) 6000 1000 600 350 100 60 30 0 +CUT Control Triton MIX DDW B With Detergent C Control-No detergent איור 41 השפעת דטרגנטים על יעילות הידרוליזת הקוטיקולה של סיבי כותנה על ידי קוטינאז. 81

AvcoPal-) תערובת של דטרגנט לא יוני :MIX,0.1% Triton X-100 :Triton השפעה של.A (AWS ודטרגנט אניוני (AvcoBlank-AW) (0.05% כל אחד) ו- :DDW ללא דטרגנט על זמן ההרטבה של סריגי כותנה. הסריגים mg) 250) הודגרו עם 16.5 U/ml קוטינאז ב- 37 0 C במטלטלת סיבובית rpm) 150) למשך 23 שעות. הביקורות מראות הדגרה עם הדטרגנט אך ללא אנזים. הערכים מסמנים ממוצע של שלוש חזרות בלתי תלויות וסימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן. B. אנליזת ELSD-RP HPLC של מיצוי בכלורופורם של התוצרים מנוזל התגובה לאחר הדגרה של קוטינאז וסריג כותנה גולמי בנוכחות דטרגנט לא יוני.(Avco-Pal-AWS) C. אנליזת ELSD-RP HPLC של מיצוי בכלורופורם של התוצרים מנוזל התגובה לאחר הדגרה של קוטינאז וסריג כותנה גולמי ללא דטרגנט. תנאי ההדגרה כמו באיור 39. Fig. 41 Influence of detergents on the scouring efficiency of cutinase. A. Effect on wetting time. Triton: 0.1% Triton X-100; MIX: mixture of AvcoPal-AWS non-ionic and AvcoBlank-AW anionic detergents (0.05% each); DDW: without detergent. Control treatment did not contain enzyme. Values represent average of three independent replicates. Bars indicate standard deviation. B. ELSD-RP HPLC analysis of a chloroform extract of the residual reaction fluid after incubation with Avco-Pal-AWS non-ionic detergent. C. ELSD-RP HPLC analysis of a chloroform extract of the residual reaction fluid after incubation without detergent. Reaction conditions as indicated in Fig. 39. התוצרים שהשתחררו בעקבות העיכול האנזימתי של הסריגים עם קוטינאז כללו רק שיאים המעידים על הידרוליזת הקוטין, בשונה מהטיפול הכימי ב- NaOH (ראה איור 37) שגרם בנוסף לשחרור תוצרי פרוק של פקטין. ממצאים אלו מדגימים את ספציפיות התגובה של קוטינאז עם סריגי הכותנה. כמות תוצרים אלו בנוזל התגובה עלתה כתלות בחומרת הטיפול האנזימתי. תוצאות דומות לאלו המופיעות באיור B, 41 התקבלו בהפרה וזיהוי ב- GC-MS של תוצרי התגובה של קוטינאז עם סריג כותנה גולמי, עם וללא דטרגנט לא יוני (Avco-Pal-AWS) (איור 42). גם פה תוספת דטרגנט הניבה הופעה מוגברת של תוצרי ההידרוליזה של שכבת הקוטין, 16:C ו- 18:C, בנוזל התגובה. 82

with detergent without detergent 16:0 18:0 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) איור 42 השפעת דטרגנט על הופעת תוצרי פרוק שומניים בטיפול עם קוטינאז. הפרדה ב- GC-MS של תוצרי התגובה של קוטינאז עם סריג כותנה עם וללא תערובת של דטרגנט לא יוני AvcoPal-) (AWS ודטרגנט אניוני (AvcoBlank-AW) (0.05% כל אחד). תנאי התגובה זהים לאלו באיור 41,.B Fig. 42 Effect of detergent on release of fatty products by cutinase. GC-MS analysis of the residual reaction solution after incubation cutinase with or without mixture of AvcoPal-AWS non-ionic and AvcoBlank-AW anionic detergents (0.05% each). Incubation conditions as indicated in Fig. 41 B. 5.3.3. הידרוליזה אנזימתית עם Pplygalacturonase ו- Pectin lyase השפעה דומה לזו של קוטינאז על סריגי כותנה גולמיים נמצאה גם לגבי הפקטינאזות Pectin lyase ו- Polygalacturonase (איור 43). אנזימים אלו נבדקו ברמות פעילות של 5-85 U/ml ו- 10-350 U/ml בהתאמה, אך גרמו כבר במינונים נמוכים לקצב הרטבה מהיר ולאובדן משקל של הסריגים המטופלים. 83

אף כי הטיפול ב- PG היה יעיל יותר והראה זמן הרטבה אסימפתוטי של כ- 10 שניות לעומת 35 שניות בטיפול ב-,PL הביקורות (מוצא הצירים) מאשרות כי חלק מהבדל זה קשור ב- ph התמיסה החומצי (5 (ph שבו התרחשה הריאקציה עם.PG שני האנזימים הראו יעילות דומה לזו של האנזים קוטינאז בהקניית כושר ספיגת מים לסריגים המטופלים. השפעה דומה של שלושת האנזימים התבטאה גם בירידת המשקל של הסריגים (איור A, 43 תרשים עמודות). אנליזת ELSD-RP HPLC מלמדת כי הטפול האנזימתי השפיע בעיקר על קבוצת שיאים הידרופובית שמופיעה בזמנים של 2-3 דקות. קבוצה זו זוהתה כמכילה,D-galacturonic acid תוצר הפרוק של פקטין. בנוסף על כך גרם PL גם לשחרור של שרשרת פחמנית רוויה בת 16 פחמנים המהווה מרכיב עיקרי בקוטיקולה וזוהתה כבר קודם לכן (איורים 41 39, 37, ו- 42) כתוצר פרוק עיקרי המשתחרר מסריגי כותנה המטפלים ב- NaOH חם, בתערובת דטרגנטים או באנזים קוטינאז. 84

A Wetting time (s) 1500 300 200 150 100 50 PG PL Weight loss (mg) 300 200 100 0 PG PL Enzyme Control B Pectin constituents 0 0 100 200 300 400 Initial enzyme activity (U/ml) 16:0 Pectin lyase Polygalacturonase Control 0 10 20 30 40 50 Time (min) 85

איור 43 השפעה של (PL) Pectin lyase ו- (PG) Polygalacturonase על שינויים בסריג כותנה גולמי ובנוזל התגובה. A. השפעת האנזימים על כושר הרטבה של סריגי כותנה גולמיים. תרשים העמודות (A, תרשים פנימי) מדגים את הפסד המשקל בעקבות הטיפול ב- 85 ו- U/ml 350 של PL ו- PG בהתאמה. ההדגרה בוצעה ב- 37 0 C למשך 20 שעות, בבופר פוספט (8 100) mm, ph עבור PL או למשך 16 שעות, בבופר אצטט (5 50) mm, ph עבור.PG כל שאר תנאי התגובה זהים לאלו שבאיור 38. הביקורות לשני האנזימים (מוצא הצירים) כללו הדגרה באותם התנאים אך ללא האנזים. הערכים מצינים ממוצע של שלוש חזרות נפרדות וסימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן. B. אנליזת ELSD-RP HPLC של מיצוי בכלורופורם של התוצרים מנוזל התגובה לאחר הדגרה של שני האנזימים עם סריג כותנה גולמי. 20.06 U/ml PL ו- 10.74 U/ml PG הודגרו עם 800 mg סריג בבופר פוספט mm) 100) ב- ph 8 ו- ph 5 בהתאמה. המכיל 0.1% דטרגנט לא יוני,(AvcoPal-AWS) ב- 37 0 C למשך 18 שעות. הביקורת כללה הדגרה באותם התנאים אך ללא אנזים. Fig. 43 Enzymatic scouring of cotton fabrics with polygalacturonase (PG) and pectin lyase (PL). A. Effect of increasing enzyme concentration on the wetting time of the treated fabrics. A. Insert shows weight loss after enzymatic treatment with 85 and 350 U/ml of PL and PG, respectively. Incubations were carried out at 37 C: 20 h and ph 8 (100 mm phosphate buffer) for PL or 16 h and ph 5 (50 mm acetate buffer) for PG. Reaction conditions similar to those depicted in Fig. 38. Controls of enzymatic treatments did not contain enzyme. Values represent average of three independent replicates. Bars indicate standard deviation. B. ELSD-RP HPLC analysis of a chloroform extract of the residual reaction solution following incubation with the two enzymes. Reactions were carried out with 20.06 U/ml PL and 10.74 U/ml PG and 800 mg fabric at 37 0 C in 100 mm potassium phosphate buffer, ph 8 and ph 5 respectively for 18 hours. Control treatment did not contain enzyme. הופעת תוצרים בנוזל התגובה בעקבות טיפול ב- polygalacturonase לוותה בהעלמות תוצרים שומניים מהבד. הסריגים המטופלים באנזים זה וביקורות שעברו הדגרה באותם התנאים אך ללא אנזים, מוצו במשך הלילה במערכת סוקסלט (reflux) עם petroleum ether חם, תוצרי המיצוי רוכזו במעבה סיבובי, יובשו בדיסיקטור וואקום, הומסו מחדש בטטרהידרופוראן והוזרקו להפרדה וזיהוי ב-.ELSD-RP HPLC התוצאות מדגימות ירידה בכמות התוצרים שמוצו מהסריג המטופל ב- PG לעומת הביקורת. 86

ירידה זאת הייתה מקבילה לעלייה בכמות התוצרים שמוצו מנוזל התגובה של אנזים זה. Polygalacturonase הוכח כגורם לחשיפת הצלולוז ואובדן הפקטין מהסריג בדומה להשפעת הטיפול הכימי עם.NaOH עדות להשפעה זו נמצאה כאשר הבדים המטופלים עברו צביעת ב- Congo red (לצלולוז) ו- Ruthenium red (לפקטין) (איור 44). הטיפול הכימי היה יעיל יותר מהאנזימתי בחשיפת הצלולוז אך מעט פחות יעיל בהרחקת הפקטין. הטיפול האנזימתי ב- PG הראה ספציפיות גבוהה בדומה לספציפיות שהודגמה לגבי קוטינאז בעיכול מרכיבי הקוטין (איור 41, B). הוא גרם להסרה משמעותית של הפקטין, אך חשיפת צלולוז גבוהה יותר התרחשה כתוצאה מהעיכול הכימי שגרם בנוסף להסרת הפקטין גם להסרת מרכיבי השעוות. איור 44 השפעת טיפול כימי ב- NaOH ואנזימתי ב- polygalacturonase על חשיפת הצלולוז (צביעה ב- (Congo red והעלמות הפקטין (צביעה ב- (Ruthenium red בסריגי כותנה. הטיפול הכימי בוצע על ידי הרתחה ב- 100 0 C למשך 30 דקות בתמיסת 250. mm NaOH הסריגים המטופלים ב- PG התקבלו לאחר הדגרה ב- 350 U/ml בניסוי המתואר בתרשים 43, A. הביקורת נלקחו אף הן מניסוי זה. Fig. 44 Effect of NaOH and polygalacturonase treatment on pectin removal, as visualized by concomitant increase of color intensity upon staining with Congo red, and a decrease of color intensity upon staining with Ruthenium red. The chemical treatment was done by incubating the fabrics in boiling 250 mm NaOH solution at 100 0 C for 30 min. Enzymatic treatment was done with 350 U/ml PG as described in Fig 43, A. 87

5.3.4. הידרוליזה אנזימתית עם שילוב של קוטינאז ופקטין ליאז תנאים אופטימלים דומים בפעילות האנזימים קוטינאז ו- PL אפשרו לבצע ניסוי המשלב את שני האנזימים במטרה להשיג אפקט מוגבר (איור 45). הניסוי בוצע ללא תוספת דטרגנט לתערובת הריאקציה. קוטינאז לבד גרם לרמת הרטבה גבוהה יותר בהשוואה ל- PL לבד, אולי בגלל נגישותו הטובה יותר לשכבה השעוותית בהעדר דטרגנט. כאשר הודגרו שני האנזימים יחד התקבל אפקט סינרגיסטי שהביא להגברה של פי 4 בכושר ספיגת המים של הסריגים המטופלים לעומת הטיפול בקוטינאז לבד (איור 45, A ).כמות התוצרים שהשתחררו לתגובה עלתה ביחס ישר לרמת ההרטבה שהושגה. גלאי 210) nm) UV הראה שינוי בקבוצת השיאים שבין 2-8 דקות (איור 45, B). קוטינאז גרם לשחרור מועט יחסית של תוצרים לנוזל התגובה אך גרם להגברה משמעותית בכושר ההרטבה של הסריגים בהשוואה לפקטין ליאז. בהשפעת שני האנזימים יחד התקבלה עליה בתוצרים שהייתה גבוהה בהשוואה לזו שהושגה בעקבות הטיפול בכל אנזים בנפרד. מניתוח השיאים שזהו באורך גל 210 nm בגלאי UV ואשר בהם נצפה שינוי משמעותי, עלה כי חלק מהתוצרים הם תוצאה כמעט בלעדית של פעילות האנזים קוטינאז (שיא ב- 4.1 דקות) וחלק אחר מקורו בפעילות האנזים פקטין ליאז (שיא ב- 2.9 דקות וב- 4.5). נראה כי העלייה הכללית בטיפול המשולב של שני האנזימים כוללת שילוב של תוצרי הפעילות של קוטינאז ותוצרי פעילות האנזים.PL 88

A Wetting time (s) B 6000 4000 2000 1000 800 600 400 200 0 DDW PL CUT CUT+PL Time (min) איור 45,Pectin lyase (200 U/ml) השפעת טיפול קוטינאז U/ml) 80) ו- בנפרד ובמשולב, על סריגי כותנה גולמיים. 89

:PL ביקורת ללא אנזימים, :DDW השפעה על כושר ההרטבה של סריגי הכותנה המטופלים. A פקטין ליאז לבד, :CUT קוטינאז לבד, :PL+CUT תערובת של שני האנזימים. ההדגרה בוצעה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 0 C בבופר פוספט (8 100) mm, ph במטלטלת סיבובית rpm) 175). הערכים מצינים ממוצע של שלוש חזרות וסימני השגיאה בתרשים מסמנים סטיית תקן. B. השפעה על הופעת תוצרי פרוק בנוזל התגובה (זיהוי ב-.(UV-RP HPLC Fig. 45 Changes in the fabric and in the reaction solution following scouring of cotton fabrics with a mixture of pectin lyase and cutinase. A. Effect on wetting time. DDW: control without enzymes; PL: pectin lyase alone; CUT: cutinase alone; CUT+PL: mixture of both enzymes. Incubations were carried out for 24 h at 37 C at ph 8 (100 mm phosphate buffer) with 200 U/ml PL and 80 U/ml CUT, in the absence of detergent. Values represent average of three independent replicates. Bars indicate standard deviation. B. UV-RP HPLC analysis of a chloroform extract of the residual reaction solution after incubation with the two enzymes. העלייה בכמות התוצרים בנוזל שימשה כמדד לפעילות האנזימתית על הסריג. תוצאות מדד זה לשינויים בנוזל התגובה תאמו את תוצאות מבחן ההרטבה שבדק שינויים בסריג המטופל. טיפול בריכוזי קוטינאז עולים גרם להופעה כללית מוגברת של תוצרים בנוזל התגובה (נתונים לא מוצגים) ובכללם השיא העיקרי (לא מזוהה) שנצפה ב- 4.1 דקות ב- UV (איור 45, B). 5.4. CBD כמדד למידת חשיפת הצלולוז במטרה לבחון באופן כמותי ומדויק את השינויים בסריג הכותנה בעקבות הטיפולים הכימי והאנזימתי, פותח מדד המבוסס על קישור CBD-GUS לצלולוז החשוף בסיב. מידת הקישור של ה- CBD המאוחה עם החלבון המדווח GUS לצלולוז שבסיב מותנית בעיכול הקוטיקולה המכסה אותו ועל כן מהווה מדד לרמת הפרוק של הקוטיקולה. היכולת של CBD המאוחה לחלבון מדווח (האנזים GUS או החלבון הפלורוסנטי (GFP להיקשר לצלולוז של סיבי כותנה הודגמה תוך שימוש בסריגי כותנה גולמיים בהם הצלולוז עטוף ברובו על ידי קוטיקולה שעוותית וסריגי כותנה שעברו עיכול כימי או אנזימתי שבהם הצלולוז חשוף (איורים 46 ו 47 -). פיסות הסריג הודגרו בתמיסת CBD המאוחה לחלבון המדווח למשך הלילה, ונשטפו מעודפי CBD מאוחה בתמיסת בופר (7.2 (PBS, ph המכילה.Tween 80 קישור החלבון CBD-GUS נצפה על ידי צביעה עם הסובסטרט X-GlcA המשחרר צבע סגול נראה לעין בתגובה עם האנזים.GUS קישור החלבון CBD-GFP נקרא במיקרוסקופ פלורוסנטי ובמיקרוסקופ קונפוקלי. הן הסריגים המטופלים בקוטינאז והן אלו שעברו טיפול כימי הראו הגברה בכושר ספיגת המים (נתונים לא מוצגים) 90

ובקישור ה-.CBD-GUS המיקרוסקופ הקונפוקלי מאשר כי קישור ה- CBD-GFP מתרחש בכל אזורי הסריג אך אין אחידות במידת הקישור לאורך הסיב וכי באזורים מסוימים יש קישור רב ובאחרים קישור מועט. יתכן ואי אחידות זו נגרמה מאתרי קישור פנויים שנשארו לאחר כל קישור כל ה- CBD-GFP הזמין. סיבה אפשרית נוספת היא שעיכול חלקי של שכבת הכיסוי גרם לאי אחידות בחשיפת הצלולוז. Control Cutinase Control NaOH איור 46 מבחן איכותי לקישור CBD-GUS לסריגי כותנה, עם הסובסטרט X-GlcA.לצורך המבחן שימשו 50 mg סריג מטופל בקוטינאז (הדגרה למשך 66 שעות עם 10.4 U/ml אנזים במטלטלת סיבובית, 175, rpm ב- 37), 0 C סריג גולמי (מטופל באותם התנאים אך ללא אנזים) וסריג שעבר הלבנה כימית תעשייתית (הרתחה בתערובת סודיום הידרוקסיד ופרוקסיד). הסריגים הודגרו למשך הלילה עם 1 מ"ל תמיסת,CBD-GUS עודפי ה- GUS-CBD נשטפו ולאחר מכן הודגרו הסריגים לילה נוסף עם תמיסת מבחן המכילה 5 mg/ml X-GlcA בבופר PBS (שתי ההדגרות בוצעו ב-,37 0 C במטלטלת סיבובית,.(175 rpm Fig. 46 A qualitative assay to fabric s CBD-GUS binding with the substrate X-GlcA. Fifty mg of cutinase treated fabrics (pretreated for 66 hours with 10.4 U/ml enzyme on a rotary shaker, 175 rpm, at 37 0 C), row fabrics (pretreated at the same way but in a 91

buffer solution) and chemical-whitened fabrics were used. The fabrics were incubated over night in 1 ml CBD-GUS solution. Following washing the residual protein the fabrics were incubated in 1 ml staining solution containing 5 mg/ml X-GlcA in PBS buffer (both incubations carried out at 37 0 C in a rotary shaker, 175 rpm). Control Cutinase Control NaOH איור 47 צילום במיקרוסקופ קונפוקלי של קישור CBD-GFP לסריגי כותנה מטופלים בקוטינאז ) 80,U/ml הדגרה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 0 C בבופר פוספט,,100 mm, ph 8 במטלטלת סיבובית, 175) rpm וב- 1, (M NaOH הרתחה לחצי שעה). התוצאות השוו לביקורת: הדגרה ושטיפות באותו הבופר (7.2 (PBS, ph אך ללא.CBD-GFP Fig. 47 A confocal microscopy of CBD-GFP bound to fabrics. Treatment involved 80 U/ml of cutinase treated fabrics (in a rotary shaker, 175 rpm, at 37 0 C for 24 hours) or 1 M NaOH (0.5 hour in boiling temperature). The treatments were compared to a controls that did not included CBD-GFP. 92