«Ο ρόλος του παράγοντα Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης λεμφοτροπικών μεταγραφικών παραγόντων»

Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής Εργαστήριο Αιματολογίας Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες» Κατεύθυνση: Ιατρική Βιοχημεία- Ανοσολογία Διπλωματική Εργασία: «Ο ρόλος του παράγοντα Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης λεμφοτροπικών μεταγραφικών παραγόντων» Δάβουλου Παναγιώτα Βιολόγος Πάτρα, 2017

Η Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Μουζάκη Αθανασία Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Μουζάκη Αθανασία Kαθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Δραΐνας Διονύσιος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Ζαρκάδης Ιωάννης Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών 2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος... 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 SUMMARY... 9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 12 Μέρος 1 Ο... 13 Το ανοσοποιητικό σύστημα... 14 Λεμφοκύτταρα... 14 Τ Λεμφοκύτταρα... 14 T βοηθητικά λεμφοκύτταρα... 15 Kυτταροκίνες... 18 Μέρος 2 Ο... 20 Το ογκογονίδιο ets-2... 21 Λεμφοτροπικοί παράγοντες... 24 NFAT- Νuclear factor of activated T cells... 24 NF-κB- Νuclear factor-kappa B... 27 AP-1 - Activator protein 1... 30 CDK10 - Cyclin-dependent kinase 10... 34 Σκοπός... 36 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 37 Kαλλιέργεια κυτταρικών σειρών... 38 Ψύξη κυττάρων... 38 Απόψυξη κυττάρων... 38 Συνθήκες καλλιέργειας... 39 Mέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων... 39 Διαμόλυνση (transfection) κυττάρων... 39 Eνεργοποίηση κυττάρων... 40 Απομόνωση RNA από τα κύτταρα... 41 3

Δημιουργία cdna, RT-PCR... 43 Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 44 Hλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης... 47 Αποµόνωση πρωτεϊνών από τα κύτταρα... 48 Western Blot... 49 Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGΕ... 49 Ανοσοαπoτύπωμα western... 49 AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 52 Μελέτη έκφρασης του παράγοντα Εts-2 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές... 53 Yπερέκφραση του Εts-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat... 54 Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του ets-2 σε επίπεδο mrnα... 54 Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο... 56 Πρωτεϊνική έκφραση ΝFAT2... 57 Πρωτεϊνική έκφραση NF-κB p65... 58 Πρωτεϊνική έκφραση c-jun... 60 Yπερέκφραση του Εts-2 στην κυτταρική σειρά Η938... 61 Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του ets-2 σε επίπεδο mrna... 61 Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο... 62 Πρωτεϊνική έκφραση ΝFAT2... 64 Πρωτεϊνική έκφραση NF-κB p65... 65 Πρωτεϊνική έκφραση c-jun... 66 Πρωτεϊνική έκφραση CDK10... 68 Yπερέκφραση του Εts-2 στην κυτταρική σειρά ΗEK... 69 Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του ets-2 σε επίπεδο mrna... 69 Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο... 71 Πρωτεϊνική έκφραση c-jun... 72 Πρωτεϊνική έκφραση CDK10... 74 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 76 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 82 4

Πρόλογος H παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Αιματολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες», υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας Αθανασίας Μουζάκη. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια Μουζάκη Αθανασία, για την ευκαιρία που μου έδωσε να ενταχθώ στην ερευνητική της ομάδα, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και το χρόνο που μου αφιέρωσε. Η καθοδήγηση και η ενθάρρυνσή της ήταν καθοριστικά στοιχεία που διευκόλυναν την ολοκλήρωση της εργασίας μου. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω τα δύο υπόλοιπα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον καθηγητή κ. Δραΐνα Διονύσιο και τον καθηγητή κ. Ζαρκάδη Ιωάννη, που δέχτηκαν να είναι στην επιτροπή μου. Επιπλέον τους ευχαριστώ για τις πολύτιμες συμβουλές τους κατά την ολοκλήρωση της διπλωματικής. Θα ήταν παράλειψη μου να μην εκφράσω τις ευχαριστίες μου στα παλαιότερα και νεότερα μέλη του εργαστηρίου Αιματολογίας, για την άψογη συνεργασία μας καθώς και για το ευχάριστο κλίμα που δημιούργησαν. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον κ. Γεωργακόπουλο Τάσο, για την καθοδήγηση και τις συμβουλές του κατά τη διάρκεια της παρούσας διπλωματικής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον μεταδιδάκτορα Παναγούλια Γιάννη, για την επιστημονική καθοδήγησή του και την πολύτιμη βοήθεια του καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων, καθώς και την υποψήφια διδάκτορα Αγγελετοπούλου Ιωάννα, της οποίας η βοήθεια και η συμπαράσταση ήταν πολύτιμη και με βοήθησε να ανταπεξέλθω στις διάφορες δυσκολίες που συνάντησα. Ακόμα ευχαριστώ τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου Φωτοπούλου Χρυσάνθη και Μπεκιάρη Αλεξάνδρα, για την καλή συνεργασία που είχαμε και το ευχάριστο κλίμα που δημιούργησαν. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στους γονείς μου, που με στήριξαν και με στηρίζουν σε κάθε επιλογή μου. Σας ευχαριστώ 5

ΠΕΡΙΛΗΨΗ 6

O μεταγραφικός παράγοντας Ets-2 είναι μέλος της οικογένειας Εts, μιας οικογένειας συντηρημένων γονιδίων, που συμμετέχουν στη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων και εμπλέκονται σε βασικές βιολογικές διεργασίες, oι οποίες περιλαμβάνουν τη μίτωση, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και τη ρύθμιση της ανοσίας. O λόγος που μας οδήγησε στη μελέτη του παράγοντα Εts-2 προκύπτει από πειράματα του εργαστηρίου μας που απέδειξαν την κατασταλτική δράση του Εts-2 στην έκφραση του γονιδίου της IL-2 στα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου ασκείται η κατασταλτική αυτή δράση παραμένει υπό διερεύνηση. Για το λόγο αυτό, σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η μελέτη του ρόλου που έχει ο παράγοντας Ets-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων NFAT2, NF-κΒ p65, c-jun και της κινάσης CDK10, οι οποίοι αποτελούν κομβικούς παράγοντες που ελέγχουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Τ και Β κυττάρων. Αρχικά ελέγχθηκαν τα επίπεδα σύνθεσης του ets-2 mrna στις ανθρώπινες Τ λεμφοκυτταρικές σειρές Jurkat και Η938, στις ανθρώπινες Β λεμφοκυτταρικές σειρές U266, HS-Sultan, Raji, IM9 και RPMI και στην ανθρώπινη νεφρική εμβρυϊκή κυτταρική σειρά ΗΕΚ 293. Yψηλότερα επίπεδα παρουσιάστηκαν στις κυτταρικές σειρές Jurkat, H938 και ΗΕΚ 293. Για τους παραπάνω λόγους χρησιμοποιήθηκαν οι ανωτέρω κυτταρικές σειρές για την πραγματοποίηση των πειραμάτων. Συγκεκριμένα, προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος του παράγοντα Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των υπό μελέτη παραγόντων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαμόλυνσης των κυτταρικών σειρών με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου υπερέκφρασης του Εts-2 (pcdna-ets2). Tα κύτταρα καλλιεργήθηκαν απουσία (CM) ή παρουσία μιτογόνων (εστέρα φορβόλης και ιονομυκίνης, P/I). Για να εξακριβωθεί η υπερέκφραση του ets-2 σε μεταγραφικό επίπεδο, απομονώθηκε RNA απο τα κύτταρα και ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του ets-2 με PCR. Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων, με ανάλυση western blotting αρχικά ελέγχθηκε η υπερέκφραση του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο και ακολούθως με τη χρήση κατάλληλων αντισωμάτων διερευνήθηκε η επίδρασή της στην έκφραση των υπό μελέτη παραγόντων. Αναλύοντας τα αποτελέσματα που προέκυψαν, παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση του Εts-2 στις κυτταρικές σειρές Jurkat και Η938, επέφερε αύξηση της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων NFAT2, ΝF-κΒ p65 και c-jun, τόσο στα 7

κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM όσο και στα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν. Αντιθέτως στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ, σε ενεργοποιημένα κύτταρα, η υπερέκφραση του Ets-2 οδήγησε σε μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης c-jun, ενώ σε μη ενεργοποιημένα κύτταρα οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της c- Jun. Επίσης, στην κυτταρική σειρά H938, σε συνθήκες CM, oι αυξανόμενες ποσότητες του pcdna-ets2 προκάλεσαν μείωση των επιπέδων της CDK10, ενώ προκάλεσαν αύξηση των επιπέδων της CDK10 στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Aντιθέτως στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ, σε συνθήκες CM, η υπερέκφραση του Εts-2 οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της CDK10, σε αντίθεση με τα μειωμένα επίπεδα που παρατηρήθηκαν στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, συμπεραίνουμε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Εts-2 εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης κομβικών λεμφοτροπικών παραγόντων. Συγκεκριμένα, από την ανάλυση των αποτελεσμάτων παρατηρείται ότι στις κυτταρικές σειρές Jurkat και Η938, ο Εts-2 ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων ΝFAT2, NF-κΒ p65 και c- Jun. Επίσης, ο Εts-2 ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση της CDK10 στα ΗΕΚ κύτταρα σε συνθήκες CM και στα Η938 κύτταρα σε συνθήκες P/I. Ωστόσο, τα αποτελέσματά θέτουν τη βάση περαιτέρω μελετών για τη διερεύνηση του ρόλου του Ets-2 στη ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Τ και Β κυττάρων. 8

SUMMARY 9

Ets-2 is a transcription factor that functions either as an activator or as a repressor of transcription, in partnership with other DNA binding proteins and coregulators and regulates the expression of genes involved in diverse biological functions, such as cell mitosis, development, differentiation, apoptosis and the regulation of immunity. We chose to study Ets-2 because recent work in our laboratory showed that in naive T helper cells IL-2 gene expression is blocked by Ets- 2. However, the exact molecular mechanism underlying Ets-2 repression effect remains under investigation. In this work we studied the role of Ets-2 in the regulation of expression of key factors that control the expression of genes involved in activation and differentiation of T and B cells. Εts-2 expression was measured in eight cell lines. Ιn particular, ets-2 expression was examined in the human T lymphocytic cell lines Jurkat and H938, in the human B lymphocytic cell lines U266, HS-Sultan, Raji, IM9 and RPMI and in the human embryonic kidney cell line HEK 293. Jurkat, H938 and HEK293 cells, presented the highest expression of ets-2 mrna. To study the role of Ets-2 in the regulation of expression of the transcription factors NFAT2, NF-κΒ p65, c-jun and the kinase CDK10, Jurkat, H938 and HEK cells, were transfected with increasing amounts of an Ets-2 overexpressing vector (pcdna-ets2). The cells were cultured in the presence (P/I) or absence (CM) of the mitogens phorbol myristate acetate and ionomycin. To verify the overexpression of ets-2 at the transcriptional level, RNA was extracted from the cells and ets-2 expression was assayed by PCR. Western blot analysis was carried out to verify the overexpression of Ets-2 protein and to investigate its effect on the synthesis and activation of NFAT2, NF-κΒ p65, c-jun and CDK10. The results showed that overexpression of Ets-2 in Jurkat and H938 cells induced the levels of NFAT2, NF-κΒ p65 and c-jun under both CM and P/I conditions. In contrast, in stimulated HEK cells, the overexpression of Ets-2 resulted in a reduction in c-jun levels, while in non-stimulated HEK cells it resulted in increased levels of c-jun. In HEK cells increasing amounts of pcdna-ets2 led to an increase in CDK10 levels in CM condition; in contrast, overexpression of Ets-2 in P/I condition resulted in a reduction in CDK10 levels. Finally, overexpression of Ets-2 in unstimulated H938 cells resulted in reduced CDK10 protein levels, whereas in stimulated cells Ets-2 over-induced CDK10 levels. 10

We suggest that Ets-2 is involved in the regulation of expression and synthesis of key lymphotropic factors. In particular, overexpression of Ets-2 in Jurkat and H938 cells induces the expression of NFAT2, NF-κΒ p65 and c-jun. Overexpression of Ets- 2 induces also the expression of CDK10 in unstimulated HEK cells and in stimulated H938 cells. Our results set the stage for further studies to elucidate the role of Ets-2 in the regulation of signaling pathways involved in the activation and differentiation of T and B cells. 11

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 12

Μέρος 1 Ο 13

Το ανοσοποιητικό σύστημα Το ανοσοποιητικό σύστημα αποτελείται από ένα σύνολο κυττάρων που έχουν ως βασικό ρόλο την προστασία του οργανισμού από αντιγόνα. Ως αντιγόνα χαρακτηρίζονται διάφοροι παράγοντες τους οποίους ο οργανισμός αναγνωρίζει ως ξένους και μπορεί να περιλαμβάνουν μικροοργανισμούς (βακτήρια, μύκητες, παράσιτα, ιοί), τοξίνες και μακρομόρια. Λεμφοκύτταρα Tα λεμφοκύτταρα είναι κύτταρα τα οποία έχουν ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνειά τους για την αναγνώριση αντιγόνων κατέχοντας έτσι βασικό ρόλο στην κυτταρική και στην χυμική ανοσία. Με βάση τη λειτουργία τους και τον τρόπο αναγνώρισης των αντιγόνων διακρίνονται σε Β και Τ λεμφοκύτταρα (1). Τ Λεμφοκύτταρα Τα Τ λεμφοκύτταρα παράγονται στο μυελό των οστών και στη συνέχεια μεταναστεύουν στο θύμο αδένα όπου ωριμάζουν και εκπαιδεύονται για να ξεχωρίζουν τα ίδια αντιγόνα. Στην επιφάνεια τους βρίσκονται ειδικοί μεμβρανικοί αντιγονικοί υποδοχείς, οι TCR (T cell receptors). Διακρίνονται στα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (Τ helper cells), στα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (cytoxic cells) και στα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα (Τregs). Tα βοηθητικά λεμφοκύτταρα φέρουν στην επιφάνεια τους τη γλυκοπρωτεΐνη CD4, ενώ τα κυτταροτοξικά κύτταρα τη γλυκοπρωτεΐνη CD8 (2). Tα Τregs έχουν πολλούς και διαφορετικούς φαινότυπους. Αυτά που εξέρχονται του θύμου, λέγονται φυσικά Τregs (ntregs) και είναι CD4 + και CD25 +, δηλαδή εκφράζουν στην επιφάνεια τους τον υποδοχέα της α αλυσίδας της ιντερλευκίνης 2 (CD25). Επίσης εκφράζουν το μεταγραφικό παράγοντα FOXP3 (forkhead box P3), o οποίος αποτελεί τον πιο εξειδικευμένο δείκτη των ntregs και αποτελεί κύριο ρυθμιστή για την ανάπτυξη και την κατασταλτική λειτουργία τους (3) 14

T βοηθητικά λεμφοκύτταρα Τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα κατέχουν σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα. Έχουν πολλαπλές λειτουργίες με κυριότερη την παραγωγή κυτταροκινών και χημειοκινών που κατευθύνουν την ανοσολογική απόκριση. Τα λεμφοκύτταρα μετά τη διαδικασία ωρίμανσης τους στο θύμο αδένα, εξέρχονται στην κυκλοφορία, αλλά δεν είναι ενεργοποιημένα, διότι δεν έχουν έρθει σε επαφή με κάποιο αντιγόνο. Σε αυτή τη φάση καλούνται παρθενικά (naïve) Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (4). Στην περιφέρεια, μετά την ενεργοποίησή τους, που επέρχεται ως αποτέλεσμα της αντιγονοπαρουσίασης, τα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα (Τh) ενεργοποιούνται και διαφορποιούνται σε λειτουργικά T βοηθητικά λεμφοκύτταρα (Τh0), τα οποία εκκρίνουν ιντερλευκίνη 2 (ΙL-2). Στη συνέχεια, τα Th0 κύτταρα διαφοροποιούνται σε μια από τις παρακάτω σειρές διαφοροποίησης: Τh1, Th2, Th3, Th9, Th17, κ.α (Εικόνα 1). Η διαφοροποίηση αυτή εξαρτάται από το είδος του αντιγόνου και από τις κυτταροκίνες που υπάρχουν στον περιβάλλοντα χώρο (5) (6). Τα Th1 κύτταρα είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση ανοσολογικών αποκρίσεων έναντι ενδοκυτταρικών παθογόνων. Eπάγουν τις προφλεγμονώδεις αποκρίσεις και εμπλέκονται στις καθυστερημένου τύπου αντιδράσεις υπερευαισθησίας. Χαρακτηρίζονται από την έκκριση ιντερφερόνης-γ (IFN-γ). Επίσης εκκρίνουν και άλλες κυτταροκίνες που περιλαμβάνουν τον παράγοντα νέκρωσης όγκων α (ΤΝF-α) και τη λεμφοτοξίνη α (LTa). Αποτελέσματα μελετών έχουν δείξει ότι η Th1 απόκριση σχετίζεται με την εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων (2, 5). Τα Τh2 κύτταρα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή έναντι μεγάλων εξωκυτταρικών παθογόνων και επάγουν τις αντιφλεγμονώδεις αντιδράσεις και την παραγωγή αντισωμάτων, κυρίως των ΙgE. Η πιο χαρακτηριστική κυτταροκίνη που εκκρίνουν είναι η ιντερλευκίνη 4 (ΙL-4). Ακόμη εκκρίνουν ιντερλευκίνη-5 (IL-5) η οποία εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των ηοσινόφιλων, ιντερλευκίνη 13 (IL-13) και ιντερλευκίνη-25 (IL-25). Ανοσοαποκρίσεις τύπου Th2 εμπλέκονται στις αλλεργικές αντιδράσεις και στο άσθμα. Τα Τh1 κύτταρα και τα Th2 κύτταρα παρουσιάζουν μια ανταγωνιστική σχέση καθώς οι κυτταροκίνες που εκκρίνουν τα Th1 αναστέλλουν τη δράση των Th2 κυττάρων και αντιστρόφως. Η σωστή αυτή ισορροπία στην έκκριση των κυτταροκινών από τα Th1 και τα Th2 15

κύτταρα παίζει σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς η διατάραξη της οδηγεί στην εμφάνιση παθολογικών καταστάσεων (5). Tα Th17 κύτταρα εκκρίνουν την ιντερλευκίνη 17 (ΙL-17), μια προφλεγμονώδη κυτταροκίνη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή έναντι μικροβιακών λοιμώξεων. Επίσης εμπλέκεται σε διάφορες φλεγμονώδεις αντιδράσεις, όπως σε μεταβολικές διαταραχές, στον καρκίνο και σε αυτοάνοσα νοσήματα που περιλαμβάνουν τη ρευματοειδή αρθρίτιδα, την ψωρίαση, τη σκλήρυνση κατά πλάκας, τη φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και το συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (7) (1). Tα Τh9 κύτταρα εκκρίνουν κυρίως την ιντερλευκίνη 9 (IL-9). Τα Th9 κύτταρα ενεργοποιούνται από κυτταροκίνες που προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα και ειδικότερα την ιντερλευκίνη 25 (IL-25) και την ιντερλευκίνη 33 (ΙL-33), oι οποίες εμπλέκονται σε αντιδράσεις άσθματος. Τα Th9 κύτταρα έχουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και εξέλιξη πολλών τύπων αλλεργιών σε μοντέλα ποντικών (8). Επίσης, δυο ακόμη σημαντικές κατηγορίες Τ λεμφοκυττάρων αποτελούν τα Τr1 κύτταρα και τα Th3 κύτταρα, τα οποία ανήκουν στην κατηγορία των Τregs. Βασικό χαρακτηριστικό των Τregs είναι η διατήρηση της ομοιόστασης και η καταστολή της ανοσοαπόκρισης. Με αυτό τον τρόπο καταστέλλουν παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι τα αυτοάνοσα νοσήματα. Τα Tr1 και τα Th3 κύτταρα χαρακτηρίζονται από την έκκριση αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών και συγκεκριμένα της ιντερλευκίνης 10 (ΙL-10) και του ΤGF-β (Transforming growth factor) αντίστοιχα (9). 16

Eικόνα 1: Συνοπτική απεικόνιση των κυτταροκινών και των μεταγραφικών παραγόντων που ελέγχουν τη διαφοροποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων 17

Kυτταροκίνες Oι κυτταροκίνες είναι μικρού μοριακού βάρους διαλυτές πρωτεΐνες, οι οποίες εκκρίνονται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος ως απάντηση στην είσοδο κάποιου αντιγόνου και αποτελούν διαμεσολαβητές της ανοσολογικής απόκρισης. Η δράση τους διακρίνεται σε αυτοκρινή (autocrine), παρακρινή (paracrine) και ενδοκρινή (endocrine). Στον αυτοκρινή τρόπο δράσης οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς του κυττάρου που τις εκκρίνει, ενώ στον παρακρινή προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων που βρίσκονται κοντά στο κύτταρο που τις εκκρίνει. Τέλος στον ενδοκρινή τρόπο δράσης προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων που βρίσκονται μακριά από το κύτταρο που τις εκκρίνει (10). Eικόνα 2: Τρόποι δράσης των κυτταροκινών Στην επιφάνεια των κυττάρων βρίσκονται ειδικοί υποδοχείς στους οποίους προσδένονται οι κυτταροκίνες. Οι υποδοχείς αυτοί διαθέτουν ένα εξωκυττάριο τμήμα για τη σύνδεση με τις κυτταροκίνες και ένα διαμεμβρανικό και ενδοκυττάριο τμήμα για τη μετάδοση σήματος. Κατά την πρόσδεση τους με τις κυτταροκίνες, οι υποδοχείς 18

στην πιο απλή τους μορφή σχηματίζουν ένα ομοδιμερές. Στη συνέχεια, οι κυτταροπλασματικές περιοχές των υπομονάδων τους αλληλεπιδρούν με μια ομάδα μορίων, τις Jak κινάσες. Συγκεκριμένα, ο ενεργοποιημένος υποδοχέας φωσφορυλιώνει την Jak κινάση, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει μια σειρά πρωτεϊνών του κυττάρου, τα oποία συμβάλλουν στην μεταφορά του σήματος της κυτταροκίνης στον πυρήνα (11). Ο τρόπος με τον οποίο δρα κάθε κυτταροκίνη εξαρτάται από διάφορους ρυθμιστικούς παράγοντες. Το τελικό αποτέλεσμα δράσης των κυτταροκινών καθορίζεται από τις υπόλοιπες κυτταροκίνες, από την έκφραση και τη συγγένεια ειδικών για την κάθε κυτταροκίνη υποδοχέων σε κύτταρα στόχους, καθώς και από την συνολική κατάσταση ενεργοποίησης του κυττάρου-στόχου. Εξαιτίας της απουσίας ενός ολοκληρωμένου συστήματος ταξινόμησης, οι κυτταροκίνες αναγνωρίζονται με ποικίλους τρόπους, με κύριο αυτόν της λειτουργίας τους. Συγκεκριμένα το σύστημα αυτό περιλαμβάνει τις προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, τις αντιφλεγμονώδεις κυτταροκίνες και τις κυτταροκίνες με δράση αυξητικών παραγόντων. Κυριότεροι εκπρόσωποι των προφλεγμονωδών κυταροκινών είναι η ιντερλευκίνη 1 (IL-1), ο ΤΝF-a και η ιντερλευκίνη 6 (IL-6), ενώ των αντιφλεγμονωδών κυταροκινών η ιντερλευκίνη 4 (ΙL-4), η ιντερλευκίνη 10 (ΙL-10),η ιντερλευκίνη 13 (ΙL-13) και ο TGF-β(12), (13). 19

Μέρος 2 Ο 20

Το ογκογονίδιο ets-2 H ανακάλυψη ενός ογκογονιδίου, του V-ets, του ιού της λευχαιμίας των πτηνών, Ε26 (avian leukemia virus), είχε σαν αποτέλεσμα την ανακάλυψη της οικογένειας ETS (E26 transformation-specific family), μιας μεγάλης οικογένειας συντηρημένων γονιδίων η οποία αποτελείται από 27 γονίδια στον άνθρωπο. Τα γονίδια αυτά απομονώθηκαν από είδη φυλογενετικά απομακρυσμένα μεταξύ τους και συγκεκριμένα από τη Drosophila melanogaster και το C.elegans, έως τον άνθρωπο (14). Τα μέλη της συγκεκριμένης οικογένειας έχουν μια υψηλά συντηρημένη δομή πρόσδεσης στο DNA, την περιοχή ets (ETS domain). Aνάλογα με το βαθμό ομολογίας της συγκεκριμένης περιοχής τα μέλη της οικογένειας χωρίζονται σε υποοικογένειες, που είτε έχουν την ets περιοχή στο καρβοξυτελικό άκρο, είτε στο αμινοτελικό (15). H ets περιοχή αποτελείται από τρεις α-έλικες και τέσσερις β-θηλιές οι οποίες είναι διατεταγμένες έτσι ώστε να σχηματίζουν μορφή έλικας θηλιάς - έλικας, με την οποία προσδένονται στο DNA. Μέσω της συγκεκριμένης περιοχής οι πρωτεΐνες Εts αναγνωρίζουν αλληλουχίες υποκινητών που έχουν το μοτίβο GGAA/T και προσδένονται σε αυτούς. Η διατήρηση της συντηρημένης δομής της περιοχής υποδεικνύει ότι είναι πιθανή και η διατήρηση συντηρημένων λειτουργικών ιδιοτήτων. Ωστόσο μεταξύ των μελών της οικογένειας υπάρχουν διαφοροποιήσεις στη δομή που μπορούν να τους προσδώσουν διαφορετικές ιδιότητες. Για παράδειγμα, η αλλαγή ενός μόνο αμινοξέος στην ets περιοχή μπορεί να μεταβάλλει σε μεγάλο βαθμό τη συγγένεια πρόσδεσης της πρωτεΐνης με το DNA, καθώς και τις αλληλεπιδράσεις της με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες. Kάποια μέλη της οικογένειας έχουν μια ακόμη συντηρημένη δομή, την pointed περιοχή (pointed domain, PNT), η οποία παίζει βασικό ρόλο στις πρωτεΐνικές αλληλεπιδράσεις. Επίσης έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται σε λειτουργίες ομο-ολιγομερισμού, ετεροδιμερισμού καθώς και σε περιπτώσεις καταστολής της μεταγραφικής δραστηριότητας (16). 21

Εικόνα 3: Δομή των πρωτεϊνών της οικογένειας Εts. Oι έλικες (H) και οι β-θηλιές (β) της pointed περιοχής αναγράφονται με μπλέ χρώμα ενώ της περιοχής ets με κόκκινο χρώμα (Sharrocks et al, 2006) Η πρωτεΐνη Ets-2 κωδικοποιείται από το γονίδιο ets-2 και ανήκει στην οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων ΕTS. Πολλά μέλη της οικογένειας συμπεριλαμβανομένου του Εts-2 λειτουργούν σα μεταγραφικοί παράγοντες, είτε ενεργοποιώντας, είτε καταστέλλοντας τη μεταγραφή γονιδίων στόχων (17). Γονίδια στόχοι των μεταγραφικών παραγόντων Ets αποτελούν γονίδια που σχετίζονται με την μετάσταση, την αγγειογένεση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την αιμοποίηση τη διαφοροποίηση, γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση καθώς και ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Συνεπώς ανωμαλίες στην έκφραση τους, μπορεί να οδηγήσουν σε ανάπτυξη όγκων (15),(14). Μελέτες σε ποντίκια επιβεβαιώνουν τα παραπάνω, καθώς έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση των παραγόντων Ets-1 και Ets-2 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη όγκων, ενώ η παρεμπόδιση της έκφρασης των παραπάνω παραγόντων, τα αποτρέπει. Eπομένως, οι παράγοντες Ets-1 και Εts-2 φαίνεται να εμπλέκονται στη ρύθμιση γονιδίων που απαιτούνται για την ανάπτυξη καρκίνου (17). To γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Ets-2 βρίσκεται στη θέση q22.3 του χρωμοσώματος 21. Aποτελείται από 10 εξώνια και κάτω από διαφορετικές συνθήκες ωρίμανσης, είναι δυνατή η παραγωγή τριών διαφορετικών μεταγράφων RNA, με διαφοροποιήσεις στο μήκος του 3' άκρου (18). Υπερέκφρασή του έχει καταγραφεί στον εγκέφαλο και σε ινοβλάστες ατόμων με σύνδρομο Down (19). H ρύθμιση της δραστικότητας της πρωτεΐνης πραγματοποιείται με τη φωσφορυλίωσής της μέσω του 22

μονοπατιού Ras/MAPK ή μέσω του μονοπατιού φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης 3- κινάσης/akt (20). Σύμφωνα με μελέτες, έχει καταγραφεί η αλληλεπίδραση της με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, που είτε ανήκουν στην ίδια οικογένεια, είτε σε διαφορετική. Παραδείγματα τέτοιων αλληλεπιδράσεων αποτελούν ο AP-1, καθώς και ο Ets-1 και ο Stat5, σύμπλοκο των οποίων εμπλέκεται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ως απάντηση της έκκρισης IL-2 απο τα Τ λεμφοκύτταρα (21). To γονίδιο ets-2 αρχικά είχε χαρακτηριστεί ως πυρηνικό ογκογονίδιο. Ωστόσο ο ρόλος του κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης είχε κριθεί απαραίτητος (22). Συγκεκριμένα, κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, ο Ets-2 είναι υπεύθυνος για τη ρύθμιση της σωστής ανάπτυξης της τροφοβλάστης, καθώς και για τη ρύθμιση της επιβίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων που πραγματοποιείται στην εμβρυϊκή αγγειογένεση (23, 24). Υπερέκφραση του παράγοντα σε ποντίκια, οδηγεί στην ανάπτυξη κρανιοπροσωπικών και σκελετικών δυσμορφιών, αντίστοιχων με αυτών που παρατηρούνται σε ανθρώπους με σύνδρομο Down. Mετάλλαξη του γονιδίου που οδηγεί σε απαλοιφή της περιοχής πρόσδεσης στο DNA, έχει σαν αποτέλεσμα πρόωρη εμβρυϊκή θνησιμότητα, που οφείλεται κυρίως στη μη σωστή ανάπτυξη της τροφοβλάστης (22). Σημαντικός είναι ο ρόλος του παράγοντα Ets-2 στη διαφοροποίηση των μακροφάγων. Συγκεκριμένα, η έκφραση του επάγεται με την έκκριση της κυτταροκίνης C-MSF (Macrophage colony-stimulating factor) και έχει βρεθεί πως εκφράζεται επίσης σε μεταγενέστερα στάδια διαφοροποίησης των μακροφάγων. Η υπερέκφραση του σε ανώριμες μυελοειδείς κυτταρικές σειρές έχει τη δυνατότητα να επάγει τη διαφοροποίηση τους σε μακροφάγα. Ένας ακόμη βασικός ρόλος του συγκεκριμένου παράγοντα είναι η αναστολή της απόπτωσης, το οποίο το επιτυγχάνει μέσω επαγωγής της μεταγραφής του αντι-αποπτωτικού παράγοντα Bcl-XL (25). Σύμφωνα με μελέτες που έχουν γίνει, έχει βρεθεί επίσης ότι ο Εts-2 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε περιπτώσεις καρκίνου του μαστού και του προστάτη και ότι η υπερέκφραση του είναι απαραίτητη για τις μετασχηματικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων (14). Ακόμη, έχει βρεθεί οτι παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφή γονιδίων των κυτταροκινών στα Τ κύτταρα (26). 23

Λεμφοτροπικοί παράγοντες NFAT- Νuclear factor of activated T cells Oι μεταγραφικοί παράγοντες NFAT εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Η οικογένεια αυτή αποτελείται από πέντε μέλη: NFAT1 (NFATc2; NFATp), NFAT2 (NFATc1; NFATc), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATc3; NFATx) και NFAT5 (TonEBP; OREBP) (27). Οι NFAT παράγοντες είχαν πρώτα μελετηθεί στα Τ λεμφοκύτταρα όπου είχε βρεθεί η επαγωγική τους δράση στη μεταγραφή του υποδοχέα της IL-2 (28). Eπόμενες μελέτες επιβεβαίωσαν τη συμμετοχή των μεταγραφικών αυτών παραγόντων στη ρύθμιση επιπλέον κυτταροκινών, που περιλαμβάνουν τις: IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-γ. Όμως η δράση τους δεν περιορίζεται στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων, καθώς έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται στη ρύθμιση των ανοσολογικών αντιδράσεων των Β κυττάρων, των φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚnatural killers cells), των μακροφάγων και των ηοσινόφιλων (29). Επίσης ρυθμίζουν τις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, λειτουργία και μορφογένεση πολλών κυτταρικών τύπων και οργάνων και είναι υπεύθυνοι για τη ρύθμιση της μεταγραφής μεγάλου αριθμού γονιδίων και αυξητικών παραγόντων (27). Oι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας NFAT, αποτελούνται από δύο περιοχές ενεργοποίησης της μεταγραφής (TAD- transcriptional activation domain). Η μια περιοχή βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο και η δεύτερη περιοχή στο καρβοξυτελικό άκρο. Οι παράγοντες NFAT1-4, οι οποίοι ρυθμίζονται από το σηματοδοτικό μονοπάτι ασβεστίου/καλσινευρίνης, αποτελούνται από δυο επιπλέον συντηρημένες περιοχές. Τη ρυθμιστική περιοχή ΝΗR (NFAT-homology region) και την υψηλά συντηρημένη περιοχή πρόσδεσης στο DNA, DBD (DNA-binding domain), γνωστή και ως RHR (Rel-homology region) (30). Στην περιοχή ΝΗR περιλαμβάνονται οι περιοχές πρόσδεσης της καλσινευρίνης, μια αλληλουχία σήματος πυρηνικού εντοπισμού (NLS - nuclear localization sequence) και ένα σήμα πυρηνικής εξαγωγής (NES - nuclear export signal). Eπίσης περιλαμβάνονται κατάλοιπα σερίνης, τα οποία είναι φωσφορυλιωμένα στα κύτταρα εν ηρεμία (31). 24

Εικόνα 4: Σχηματική αναπαράσταση του μεταγραφικού παράγοντα NFAT (31) To σηματοδοτικό μονοπάτι ασβεστίου/καλσινευρίνης παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη μετάδοση σήματος από την επιφάνεια του κυττάρου στον πυρήνα. Με εξαίρεση τον NFAT5, ο οποίος ενεργοποιείται ως απάντηση στο ωσμωτικό στρες, οι υπόλοιποι παράγοντες της οικογένειας ρυθμίζονται από το συγκεκριμένο μονοπάτι. Eιδικότερα, όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε ηρεμία, κατάλοιπα σερίνης τα οποία βρίσκονται στην NHR περιοχή είναι φωσφορυλιωμένα, με αποτέλεσμα ο NFAT να βρίσκεται σε ανενεργή κατάσταση στο κυτταρόπλασμα (32). Η παραμονή του ΝFAT στο κυτταρόπλασμα ελέγχεται από σύνολο κινασών, που είτε δρουν στο κυτταρόπλασμα με σκοπό να αποτρέψουν τη μετακίνηση του στον πυρήνα (maintenance kinases), ή δρούν στον πυρήνα όπου ξανα φωσφορυλιώνουν τον ΝFAT με σκοπό την εξαγωγή του από τον πυρήνα και τη διακοπή της μεταγραφικής δραστηριότητας που ρυθμίζεται από τη δράση του (export kinases). Oι κινάσες αυτές περιλαμβάνουν τη JNK (c-jun N-terminal kinase), τη GSK3 (glycogen-synthase kinase 3), τη CK1 (casein kinase 1) και το p38 (30). Όμως η έναρξη μεταγωγής σήματος μέσω του TCR υποδοχέα, παρουσία κάποιου αντιγόνου, έχει σαν αποτέλεσμα τη διαδοχική ενεργοποίηση των κινασών τυροσίνης (PTKs), που οδηγούν στην ενδοκυτταρική αύξηση των ιόντων ασβεστίου (Ca +2 ) και κατά συνέπεια στην ενεργοποίηση των ρυθμιζόμενων μέσω της φωσφατάσης καλσινευρίνης (Cn) μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένου του NFAT (33). Συγκεκριμένα, η καλσινευρίνη αποφωσφορυλιώνει αμινοξικά κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης, που έχουν σαν αποτέλεσμα την πρόκληση δομικών αλλαγών στον NFAT, ο οποίος ενεργοποιείται και μεταφέρεται στον πυρήνα. Εκεί η συνεργιστική του δράση με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες συμβάλλει στη ρύθμιση της μεταγραφής συγκεκριμένων γονιδίων στόχων (32). 25

Εκτός από το σηματοδοτικό μονοπάτι της καλσινευρίνης, υπάρχουν επιπλέον μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του NFAT. Ένας από αυτούς περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες HOMER 2 (Homer protein homolog 2) και HOMER 3 (Homer protein homolog 3) που ενεργοποιούν τον NFAT, ανταγωνιζόμενοι την δράση της καλσινευρίνης (34). Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (Sumoylation, ADP-ribosylation), όπως επίσης και η πρόσδεση σε ενεργοποιητές ή καταστολείς, είναι επίσης υπεύθυνες για τη ρύθμιση και την ενεργοποίηση των μεταγραφικών αυτών παραγόντων (35). Eκτός από τους παραπάνω μηχανισμούς που αναφέρθηκαν, ο παράγοντας NFAT2 υπόκειται σε έναν επιπλέον μηχανισμό αυτορρύθμισης ο οποίος πραγματοποιείται σε μεταγραφικό επίπεδο. Συγκεκριμένα, η ρύθμιση της έκφρασης του NFAT2 ρυθμίζεται από 2 υποκινητές, τον P1 και P2. Ο NFAT2a που αποτελεί τη μια από τις δυο ισoμορφές του NFAT2, ελέγχεται από τον υποκινητή P1, η δράση του oποίου επάγεται από τον NFAT. H πρόσδεση του ΝFAT στον P1, έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης του NFAT2a. Aντιθέτως, η δράση του P2 ρυθμίζει τη βασική έκφραση της δεύτερης ισομορφής NFAT2b (36). Εικόνα 5: Ενεργοποίηση του NFAT μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού Ca +2 / Cn (http://www.angiobodies.com/uam_eng.asp) Η ικανότητα των NFAT παραγόντων να σχηματίζουν σύμπλοκα και να αλληλεπιδρούν με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες και ρυθμιστές που βρίσκονται στον πυρήνα, μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση ή καταστολή της μεταγραφικής δραστηριότητας (28). Πειράματα έχουν δείξει την αλληλεπίδραση του με μέλη της 26

οικογένειας μεταγραφικών παραγόντων MAF και GATA και τη συμμετοχή του σε σημαδοτικά μονοπάτια που οδηγούν σην ενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων (30). Σε ενεργοποιημένα Τ κύτταρα, ο κύριος μεταγραφικός παράγοντας που αλληλεπιδρά με τον NFAT είναι η πρωτεΐνη AP-1 (activator protein 1). NF-κB- Νuclear factor-kappa B Η οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων Rel/NF-κB αποτελείται από δομικά σχετιζόμενες μεταξύ τους πρωτεΐνες, οι οποίες εκτελούν τη λειτουργία τους σχηματίζοντας ομοδιμερή ή ετεροδιμερή. Τα μέλη της εμπλέκονται σε πολλαπλές βιολογικές διεργασίες με κυριότερη τη δράση τους στο ανοσοποιητικό σύστημα. Κατέχουν βασικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στις ανοσολογικές και φλεγμονώδεις διεργασίες των κυττάρων, που επιτελούνται ως απόκριση στη μόλυνση και στον τραυματισμό, καθώς και στην έκφραση γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την κυτταρική ανάπτυξη και αύξηση (37). Eπίσης παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και λειτουργία των Τ κυττάρων, των θυμοκυττάρων, των μακροφάγων, των δενδριτικών κυττάρων και των ινοβλαστών (7). Η ενεργοποίηση των συγκεκριμένων παραγόντων επέρχεται ως αποτέλεσμα της δράσης κυτταροκινών, παθογόνων μορίων, τραυματισμών καθώς και άλλων στρεσογόνων καταστάσεων (37). Προβλήματα που οδηγούν σε μη σωστή ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών του NF-κΒ αλλά και σε συνεχή ενεργοποίηση του, έχουν βρεθεί πως συνδέονται με φλεγμονώδεις αντιδράσεις, διάφορους τύπους καρκίνου και αυτοάνοσα νοσήματα όπως είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου και η σκλήρυνση κατά πλάκας (37, 38). Σε κύτταρα θηλαστικών έχουν ταυτοποιηθεί πέντε μέλη της οικογένειας NF-κΒ που χωρίζονται σε δυο υποομάδες. Η πρώτη υποομάδα αποτελείται από τις πρωτεΐνες ΝF-κΒ1 (p50; p105) και ΝF-κΒ2 (p52; p100). Οι πρωτεΐνες NF-κβ1/p105 και NF-κΒ2/p100 αποτελούν ανενεργές πρόδρομες ενώσεις των πρωτεϊνών p50 και p52 αντίστοιχα. Πρωτεόλυση τους οδηγεί στην παραγωγή των ώριμων πρωτεϊνών p50 και p52 που έχουν την ικανότητα να προσδένονται στο DNA. H άλλη υποομάδα αποτελείται από τις πρωτεΐνες RelA (p65), RelB, c-rel. Η επικρατέστερη ενεργοποιημένη μορφή του NF-κΒ είναι το ετεροδιμερές που αποτελείται από την υπομονάδα p65, συνδεδεμένη είτε με την υπομονάδα p50, είτε με την p52. Oι 27

πρωτεΐνες της συγκεκριμένης οικογένειας σχηματίζουν τόσο ομοδιμερή, όσο και ετεροδιμερή, τα οποία συνδέονται με συγκεκριμένες βιολογικές διεργασίες. Τα ομοδιμερή των υπομονάδων p50 και p52 έχουν κατασταλτικές ιδιότητες, ενώ τα διμερή που αποτελούνται από τις υπομονάδες RelA ή c-rel, λειτουργούν ενεργοποιώντας τη μεταγραφή γονιδίων στόχων. Η πρωτεΐνη RelB δεν έχει την ικανότητα ομοδιμερισμού, ωστόσο σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα με τις υπομονάδες p50 και p65 και μπορεί να λειτουργήσει τόσο κατασταλτικά όσο και επαγωγικά (39). Η αλληλουχία πρόσδεσης των παραγόντων στο DNA έχει τη μορφή GGGRNNYYCC (R: purine, Y: pyrimidine, N: any base) και ονομάζεται θέση σύνδεσης κβ. Κάθε διμερές του ΝF-κΒ έχει διαφορετική συγγένεια πρόσδεσης στο DNA, η οποία εξαρτάται από την συγκεκριμένη μορφή που παίρνει η αλληλουχία σε κάθε γονίδιο. Επομένως ανάλογα με την αλληλουχία της θέσης κβ που υπάρχει σε κάθε γονίδιο καθορίζονται οι υπομονάδες που σχηματίζουν τον ΝF-κΒ (40). Tα μέλη της οικογένειας αποτελούνται από μια υψηλά συντηρημένη περιοχή πρόσδεσης στο DNA και περιοχή διμερισμού, η οποία ονομάζεται RHR (Rel homology region). Η συγκεκριμένη περιοχή, περιέχει επίσης το σήμα πυρηνικής τοποθέτησης (NLS). Oι πρωτεΐνες RelA, RelB και c-rel διαθέτουν στο καρβοξυτελικό τους άκρο μια περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής (ΤΑD) η οποία τους δίνει τη δυνατότητα να ενεργοποιούν την έκφραση γονιδίων στόχων. Aντιθέτως οι πρωτεΐνες p50 και p52 διαθέτουν μια περιοχή που αποτελείται από πολλαπλά αντίγραφα επαναλήψεων αγκυρίνης, την περιοχή ARD (ankyrin repeat containing domain) αντί της περιοχής TAD (37). Εικόνα 6 : Σχηματική αναπαράσταση μελών της οικογένειας ΝF-κΒ (37) NTD: N-terminal domain, CTD: C-terminal domain Σε συνθήκες ηρεμίας ο NF-κΒ βρίσκεται σε ανενεργή κατάσταση στο κυτταρόπλασμα λόγω της πρόσδεσής του με τον αναστολέα του, ΙκΒ (inhibitors of kb). H οικογένεια των ανασταλτικών πρωτεϊνών ΙκΒ αποτελείται κυρίως από τις πρωτεΐνες IκBα, IκBβ, και IκBε αλλά και από τα μέλη IκBζ, Bcl-3, και IκBNS τα 28

οποία δρουν στον πυρήνα. Χαρακτηριστικό των μελών αυτής της οικογένειας αποτελεί μια χαρακτηριστική δομή επαναλήψεων «αγκυρίνης». Η δομή αυτή είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Οι πρόδρομες πρωτεϊνικές ενώσεις p100 και p105 αποτελούνται επίσης από παρόμοιες δομές με αυτές των επαναλήψεων αγκυρίνης και μπορούν να δράσουν όπως οι ανασταλτικές πρωτεΐνες ΙκΒ. O στόχος δράσης των ΙκΒ πρωτεΐνών είναι οι περιοχές ΝLS των υπομονάδων του NF-κΒ, τις οποίες «καλύπτουν», εμποδίζοντας έτσι τη μεταφορά τους στον πυρήνα (38). Yπάρχουν δυο σηματοδοτικά μονοπάτια που είναι υπεύθυνα για τη μετακίνηση του ΝF-κΒ από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Στο κλασσικό μονοπάτι, προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες και μοριακά πρότυπα που σχετίζονται με παθογόνα (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs), προκαλούν ενεργοποίηση των κινασών ΙΚΚ που φωσφορυλιώνουν τον ΙκΒ. Eπίσης ενεργοποίηση του συγκεκριμένου μονοπατιού επέρχεται και από μόρια-συνδέτες που προσδένονται σε υποδοχείς των Τ κυττάρων (ΤCR), σε υποδοχείς των B κυττάρων (BCR), σε υποδοχείς τύπου 1,2 του ΤΝF (tumor necrosis factor) (TNFR 1/2), σε Tolllike υποδοχείς (TLR) και σε μέλη της υπεροικογένειας υποδοχέων της ιντερλευκίνης 1 (ΙL-1R) (41). Σε αυτό το μονοπάτι κυρίαρχο ρόλο έχει η υπομονάδα ΙΚΚβ η οποία φωσφορυλιώνει κατάλοιπα σερίνης των πρωτεϊνών ΙκΒ, οι οποίες ακολούθως υφίστανται ουβικουιτίνωση και αποικοδόμηση από το 26S πρωτεάσωμα. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τα διμερή του ΝF-κB, που σε αυτό το μονοπάτι τα αποτελούν κυρίως οι υπομονάδες p50 και RelA, να μεταναστεύουν στον πυρήνα προκειμένου να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφική δραστηριότητα γονιδίων στόχων (39). Tα γονίδια αυτά μπορεί να περιλαμβάνουν γονίδια που κωδικοποιούν κυτταροκίνες, χημειοκίνες, καθώς και γονίδια αντιδράσεων στο στρες και αντιαποπτωτικά γονίδια. Tα παραπάνω μόρια παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην έμφυτη ανοσολογική απόκριση σε εισβάλλοντες μικροοργανισμούς και είναι απαραίτητα προκειμένου τα φλεγμονώδη κύτταρα και τα φαγοκύτταρα να μεταναστεύσουν στους ιστούς όπου μια μόλυνση ή ένας τραυματισμός έχει οδηγήσει στην ενεργοποίηση του ΝF-κΒ (42). Στο εναλλακτικό μονοπάτι, κυρίαρχο ρόλο έχει το ομοδιμερές που αποτελείται από τις πρωτεΐνες ΙΚΚα. Η ενεργοποίηση του ΙΚΚα από την επαγωγική κινάση ΝΙΚ (NF-κB- inducing kinase) οδηγεί στη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης NFκB2/p100 στα δυο C-άκρα. Ως αποτέλεσμα αυτής της φωσφορυλίωσης ακολουθεί η 29

ουβικουιτίνωση και η πρωετασωμική αποικοδόμηση του C-τελικού αναστολέα, με αποτέλεσμα την παραγωγή της υπομονάδας p52, η οποία μετατοπίζεται στον πυρήνα συνδεδεμένη συνήθως με την υπομονάδα RelB (39). Το εναλλακτικό αυτό μονοπάτι ενεργοποιείται από υποδοχείς που ανήκουν στην υπεροικογένεια των ΤΝFR και συγκεκριμένα είναι οι CD40, οι υποδοχείς της λεμφοτοξίνης Β (LTβR, Lymphotoxin beta receptor) και oι υποδοχείς ΒΑFF (B-cell activating factor receptors) (43). Σύμφωνα με μελέτες που έχουν γίνει, υποστηρίζεται ότι το μονοπάτι αυτό παίζει κεντρικό ρόλο στην έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και διατήρηση των δευτερογενών λεμφικών οργάνων (39). Eικόνα 7: a) Kλασσικό μονοπάτι ενεργοποίησης του NF-κΒ, b) Eναλλακτικό μονοπάτι ενεργοποίησης του NF-κΒ (39) ΒLC:B-lymphocyte chemoattractant, CD40L:CD40 ligand, COX2: cyclooxygenase 2, ELC :Epstein- Barr virus induced molecule 1 ligand chemokine, GM-CSF: granulocyte macrophage-colonystimulating factor, ICAM-1: intercellular adhesion molecule 1, Inos: inducible nitric oxide synthase, LT: lymphotoxin, MCP-1: monocyte chemotactic protein-1, MIP-1a: macrophage inflammatory protein-1a, PLA2: phospholipase 2, SDF-1: stromal cell-derived factor-1a, SLC: secondary lymphoid tissue chemokine, VCAM-1: vascular cell adhesion molecule-1. AP-1 - Activator protein 1 O μεταγραφικός παράγοντας ΑP-1 είναι από τους πρώτους μεταγραφικούς παράγοντες που ανακαλύφτηκαν στα θηλαστικά. Ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διεργασίες που περιλαμβάνουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τον κυτταρικό 30

θάνατο και την επιβίωση των κυττάρων. Επίσης εμπλέκεται στη ρύθμιση ανοσολογικών και φλεγμονωδών αποκρίσεων και στην ογκογένεση. H οικογένεια των μεταγραφικών αυτών παραγόντων αποτελείται από διμερή πρωτεϊνών που διαθέτουν το μοτίβο φερμουάρ λευκίνης και ανήκουν στις υποοικογένειες Jun (c-jun, JunB, JunD), Fos (c-fos, FosB, Fra-1 και Fra-2), Maf, (musculoaponeurotic fibrosarcoma, c-maf, MafB, MafA, MafG/F/K και Nrl) και ATF (activating transcription factor, ATF2, LRF1/ATF3, B-ATF, JDP1, JDP2). Μέσω του φερμουάρ λευκίνης οι πρωτεΐνες σχηματίζουν ομοδιμερή ή ετεροδιμερή (44). Tα μέλη της οικογένειας έχουν διαφορετικές ιδιότητες διμερισμού. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες Jun έχουν τη δυνατότητα να σχηματίζουν τόσο ομοδιμερή, όσο και ετεροδιμερή με μέλη της οικογένειας Fos και ΑΤF, σε αντίθεση με τις πρωτεΐνες Fos που σχηματίζουν μόνο ετεροδιμερή. Oι πρωτεΐνες c-maf και Nrl μπορούν να σχηματίζουν ετεροδιμερή με τις πρωτεΐνες c-jun και c-fos, ενώ τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας Maf σχηματίζουν διμερή μόνο με το c-fos. H πρωτεΐνη c-jun, η οποία είναι προϊόν του ογκογονιδίου c-jun, είναι το πιο δραστικό μέλος και ο πιο ισχυρός μεταγραφικός ενεργοποιητής της οικογένειας ΑP-1. Eκφράζεται σε πολλούς κυτταρικούς τύπους σε χαμηλά επίπεδα και η έκφραση της ρυθμίζεται θετικά με τη δράση αυξητικών παραγόντων, κυτταροκινών και ακτινοβολιας UV (45). 31

Eικόνα 8: Απεικόνιση της δομής του ετεροδιμερούς Jun-Fos και των βασικών δομών των πρωτεϊνών (46) Ο σχηματισμός διμερών επιτρέπει στις ΑP-1 πρωτεΐνες να προσδεθούν στο DNA και να δράσουν ως ρυθμιστές της μεταγραφής. Συγκεκριμένα οι πρωτεΐνες αναγνωρίζουν και δεσμεύονται στο ρυθμιστικό στοιχείο ΤRΕ (ΤPA response element) που αποτελείται από την αλληλουχία 5 -TGAG/CTCA-3 ή στο ρυθμιστικό στοιχείο CRE (camp response element) που αποτελείται από την αλληλουχία 5 - TGACGTCA-3 με σκοπό τη ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων-στόχων. Κάθε διμερές όμως έχει διαφορετική συγγένεια πρόσδεσης και διαφορετική ειδικότητα. Συγκεκριμένα, το διμερές Jun/ATF προσδένεται καλύτερα στην αλληλουχία CRE, ενώ το διμερές Jun/Fos έχει μεγαλύτερη συγγένεια και προσδένεται στην αλληλουχία ΤPA (47). Κάθε πρωτεΐνη της οικογένειας ΑP-1, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου και του ιστού, είναι δυνατόν να παρουσιάσει διαφορετική κατανομή. Αυτό όμως μπορεί να μεταβληθεί από περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Σύνολο αυξητικών παραγόντων, ορμονών, κυτταροκινών, χημειοκινών και περιβαλλοντικών παραγόντων στρες εμπλέκονται στη ρύθμιση του AP-1, σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης και πρωτεϊνικής σταθερότητας. Με αυτό τον τρόπο επηρεάζεται η σχετική αφθονία της πρωτεΐνης εντός των κυττάρων. Τα παραπάνω σήματα μπορεί επίσης να επηρεάσουν τις ιδιότητες των AP-1 πρωτεϊνών, που σχετίζονται με το σχηματισμό διμερών, την πρόσδεση στο DNA και την ενεργοποίηση γονιδίων (45). H δράση του ΑP-1 επάγεται από αυξητικούς παράγοντες, κυτταροκίνες, πολυπεπτιδικές ορμόνες, νευροδιαβιβαστές, βακτηριακές και ιικές μολύνσεις καθώς και από περιπτώσεις φυσικού και χημικού στρες. H δραστικότητα του AP-1 μπορεί να ρυθμιστεί μέσω αλλαγών στη μεταγραφή των γονιδίων που κωδικοποιούν τις υπομονάδες του, μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, μέσω ελέγχου της σταθερότητας του mrna, καθώς και μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Ο πιο διαδεδομένος μηχανισμός ελέγχου μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων περιλαμβάνει το μονοπάτι των JNK κινασών. Oι JNK κινάσες ανήκουν στην οικογένεια των MAP κινασών (Mitogen-activated protein kinase) (46). Μετά την ενεργοποίηση τους από τις ΜΑP κινάσες, μεταναστεύουν στον πυρήνα όπου φωσφορυλιώνουν την πρωτεΐνη c-jun στο Ν-αμινοτελικό άκρο και συγκεκριμένα φωσφορυλιώνουν αμινοξέα σερίνης, θρεονίνης στις θέσεις 63, 73 και 32

91, 93 αντίστοιχα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, την ενεργοποίηση της μεταγραφικής δραστηριότητας του c-jun. Eπιπλέον θέσεις φωσφορυλίωσης υπάρχουν στο καρβοξυτελικό άκρο, οι οποίες όμως αποφωσφορυλιώνονται κατά την ενεργοποίηση του c-jun. Η αποφωσφορυλίωση τoυλάχιστον μιας εκ των δυο θέσεων που υπάρχουν στο καρβοξυτελικό άκρο σε συνδυασμό με τη φωσφορυλίωση στις θέσεις 63 και 73 είναι απαραίτητες προκειμένου να ενεργοποιηθεί ο παράγοντας c-jun (42). Eκτός από τη φωσφορυλίωση των c-jun πρωτεινών, οι JNK κινάσες μπορούν επίσης να φωσφορυλιώσουν τις ΑTF πρωτεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν ετεροδιμερή με το c-jun (44). Aντιθέτως με τις πρωτεΐνες Jun, ο μηχανισμός ενεργοποίησης των πρωτεϊνών Fos δεν είναι τόσο ξεκάθαρος. Σύμφωνα με μελέτες η κινάση ERK (extracellularsignal-regulated kinase), η οποία αποτελεί υποομάδα των MAP κινασών, παίζει το σημαντικότερο ρόλο στην ενεργοποίηση των πρωτεϊνών Fos. Ωστόσο έχει βρεθεί πως εμπλέκονται και οι κινάσες FRK (Fos-related kinase) και RSK (ribosomal S6 kinase). Mια ακόμη κινάση, η p38 που ανήκει επίσης στις ΜΑP κινάσες μέσω φωσφορυλίωσης και ενεργοποίησης των ATF2, ΜΕF2C (monocyte-specific enhancer binding factor 2c) και ΤCFs (ternary complex factors), επάγει την ενεργοποίηση του ΑP-1 (46). 33

Eικόνα 9: Μηχανισμοί Ενεργοποίησης ΑP-1 MEK1/2, MKK3/6, MKK4/6: mitogen activated protein kinase 1/2, 3/6, 4/6, PI3 kinase: (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase), GSK-β: Glycogen synthase kinase 3 beta http://www.isogen-lifescience.com/ap1-293 Αποτελέσματα μελετών έχουν δείξει ότι ο μεταγραφικός παράγοντας AP-1 αλληλεπιδρά με τον ύψιστης σημασίας μεταγραφικό παράγοντα NFAT (32). H αλληλεπίδραση μεταξύ των μεταγραφικών αυτών παραγόντων είναι πολύ σημαντική καθώς εμπλέκεται στη ρύθμιση της σηματοδότησης μέσω του ασβεστίου και στη ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού RAS/MAPK. Eπίσης η συνεργιστική τους δράση έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων στόχων που οδηγούν στην πρόκληση λειτουργικών αλλαγών στα Τ κύτταρα. Οι λειτουργικές αυτές αλλαγές είναι χαρακτηριστικές για τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα. Μελέτες έχουν δείξει ότι απουσία του παράγοντα AP-1, τα Τ κύτταρα υφίστανται διαφορετικές αλλαγές στη λειτουργία τους, ως αποτέλεσμα της ενεργοποίησης διαφορετικών γονιδίων στόχων (30). CDK10 - Cyclin-dependent kinase 10 Oι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (CDKs) αποτελούν μια οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών που η βασική τους λειτουργία είναι η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Aνήκουν σε μια ευρύτερη οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών, τη CMGC, η οποία περιλαμβάνει επίσης τις ΜΑP κινάσες, τις GSKs, μέλη της οικογένειας DYRK (dual-specificity tyrosine-regulated kinase) και τις κινάσες τύπου CDK (CDK-like kinases) (48). H ρύθμιση της δραστικότητας τους επιτυγχάνεται με διάφορους τρόπους, με κυριότερο αυτόν της σύνδεσής τους με τις κυκλίνες, η οποία είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των CDKs. Eπίσης η δράση των CDKs επιτυγχάνεται και με άλλους μηχανισμούς και συγκεκριμένα με τη φωσφορυλίωση τους από τις CAKs (CDK Activating Kinases), την αποφωσφορυλίωσή τους, καθώς και την αλληλεπίδραση τους με πρωτεΐνες αναστολείς (CKIs-CDK inhibitors). Mέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 13 μέλη της οικογένειας στο ανθρώπινο γονιδίωμα (49). 34

H CDK10, η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο CDK10, ανήκει στην οικογένεια των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών. Παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα εμπλέκεται στη ρύθμιση της G2/M φάσης. Υπερέκφραση μεταλλαγμένης μορφής της πρωτεΐνης CDK10 «μπλοκάρει» τα κύτταρα στη G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου (50). Επίσης έχει δειχθεί ο ρόλος της CDK10 ως θετικός ρυθμιστής σε κάποια κύτταρα και ως καταστολέας της ανάπτυξης όγκων σε άλλα (51). Mια από τις σημαντικές δράσεις της CDK10 είναι η αλληλεπίδραση της με τον παράγοντα Ets-2 και συγκεκριμένα με την αμινοτελική περιοχή του παράγοντα, η οποία περιλαμβάνει την περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής και την pointed domain. Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι σε κύτταρα θηλαστικών, η CDK10 αναστέλλει τη μεταγραφική δραστηριότητα του Ets-2, ο οποίος είναι κυρίαρχος ρυθμιστής της CDK1, η οποία απαραίτητη για τη σωστή ρύθμιση της φάσης G2/M του κυτταρικού κύκλου. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως η CDK10 ρυθμίζει τη συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου, επομένως δημιουργείται το ερώτημα αν αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης της με τον Εts-2 ο οποίος με τη σειρά του επηρεάζει τα επίπεδα της CDK1(50). Ενδιαφέρον παρουσιάζουν επίσης τα αποτελέσματα μιας άλλης μελέτης που έδειξαν ότι η αποσιώπηση της CDK10 οδήγησε στην αύξηση της επαγόμενης μέσω του Ets-2 έκφρασης της πρωτεΐνης c-raf και στην ενεργοποίηση του μονοπατιού των ΜAP κινασών, που έχει βρεθεί πως σχετίζεται με την αντίσταση που παρουσιάζουν τα καρκινικά κύτταρα του μαστού στην ταμοξιφαίνη. Mελέτες που είχαν γίνει στο παρελθόν, δεν είχαν βρει κάποια συσχέτιση της CDK10 με κάποια κυκλίνη και αυτό αποτελούσε εμπόδιο στη διερεύνηση των βιολογικών της λειτουργιών. Aποτελέσματα πρόσφατων πειραμάτων που έγιναν από τον Guen VJ και την ομάδα του έδειξαν ότι η CDK10 αλληλεπιδρά με την κυκλίνη Μ. To σύμπλοκο CDK10/κυκλίνης Μ έχει την ικανότητα να φωσφορυλιώνει τον Εts- 2 in vitro και να ρυθμίζει θετικά την αποικοδόμηση του στο πρωτεάσωμα. Τα αποτελέσματα αυτά σε συνδυασμό με τα παραπάνω ευρήματα σχετικά με τη δράση της CDK10, αποτελούν μηχανισμούς που μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση του παράγοντα Εts-2, ο οποίος όπως είναι γνωστό παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στον καρκίνο και στην ανάπτυξη (51). 35

Σκοπός O σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων NFAT2, NF-κΒ p65, c-jun και της κινάσης CDK10. Oι λεμφοτροπικοί παράγοντες που επιλέχθηκαν στη συγκεκριμένη μελέτη αποτελούν κομβικούς παράγοντες, οι οποίοι ελέγχουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Τ και Β κυττάρων. O λόγος που μας οδήγησε στη μελέτη του παράγοντα Εts-2, προκύπτει από πειράματα του εργαστηρίου μας που απέδειξαν την κατασταλτική δράση του Εts-2 στην έκφραση του γονιδίου της IL-2 στα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. 36

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 37

Kαλλιέργεια κυτταρικών σειρών Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω κυτταρικές σειρές: Jurkat (T-cell acute lymphoblastic leukemia), H938 (H9 Lymphocyte-like cells; Contains integrated copies of HIV-1 LTR promotor linked to CAT gene), HEK 293 (Human embryonic kidney cells), U266 (plasmatocytoma), HS-Sultan και Raji (Burkitt s lymphoma), IM9 και RPMI 1788 (EBV-transformed B lymphoblastoid cells). Ψύξη κυττάρων Για μεγάλα χρονικά διαστήματα οι κυτταρικές σειρές προκειμένου να διατηρηθούν, παρέμειναν κατεψυγμένες σε δοχεία που περιείχαν υγρό άζωτο (- 196 ο C). Η διαδικασία κατάψυξης τους ήταν η παρακάτω: Συλλέχθηκαν κύτταρα τα οποία βρισκόντουσαν στην εκθετική φάση ανάπτυξής τους και φυγοκεντρήθηκαν Ακολούθησε επαναιώρηση του κυτταρικού ιζήματος και φυγοκέντρηση Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε στο διάλυμα κατάψυξης (90% FBS-Fetal bovine serum, 10% DMSO-Dimethyl sulfoxide) Ακολούθως ένα ml από το διάλυμα που περιείχε το διάλυμα κατάψυξης και το κυτταρικό ίζημα μεταφέρθηκε σε cryovial Το κάθε cryovial τοποθετήθηκε σε καταψύκτη στους -80 ο C για 8 ώρες και στη συνέχεια τοποθετήθηκε στο δοχείο με το υγρό άζωτο Απόψυξη κυττάρων Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την απόψυξη των κυττάρων περιλάμβανε τα παρακάτω βήματα: Κάθε cryovial μεταφέρθηκε από το υγρό άζωτο σε υδατόλουτρο ρυθμισμένο στους 37 o C 38

Το περιεχόμενο του vial μεταφέρθηκε σε ειδικό φυγοκεντρικό σωλήνα το οποίο περιείχε θρεπτικό μέσο, RPMI 1640 και ακολούθησε φυγοκέντρηση Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε πάλι σε RPMI 1640 και φυγοκεντρήθηκε Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 5 ml πλήρους καλλιεργητικού υλικού και καλλιεργήθηκαν στις συνήθεις συνθήκες καλλιέργειας Συνθήκες καλλιέργειας Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό CM (RPMI 1640 το οποίο περιείχε 10% FBS και 1% penicillin/streptomycin) σε επωαστικό κλίβανο, στον οποίο επικρατούσαν συνθήκες υγρασίας, η θερμοκρασία ήταν σταθερή στους 37 Ο C και η ατµόσφαιρα ήταν εµπλουτισµένη µε 5% CO2. Mέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων Προκειμένου να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε η χρωστική trypan blue. Η ιδιότητα της συγκεκριμένης χρωστικής είναι ότι εισέρχεται στα κύτταρα που είναι νεκρά και τα χρωματίζει (μπλε χρώμα). Τα ζωντανά κύτταρα δεν έχουν χρώμα. Σε ένα μέρος εναιωρήματος κυττάρων προστέθηκε ένα μέρος του διαλύματος της χρωστικής και το μείγμα τοποθετήθηκε σε αιμοκυτταρόμετρο τύπου Neubauer για να παρατηρηθεί στο μικροσκόπιο. Διαμόλυνση (transfection) κυττάρων Η διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμιδιακό DNA έγινε όταν τα κύτταρα βρισκόντουσαν σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης Αρχικά πραγματοποιήθηκε μέτρηση των κυττάρων Προσδιορίστηκε ο συνολικός αριθμός κυττάρων που χρειάζονται (χρησιμοποιoύνται 2 Χ 10 6 κύτταρα /well) Tα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε θρεπτικό υλικό CM 39

Σε eppendorf τοποθετήθηκε η προβλεπόμενη κάθε φορα ποσότητα RPMI Η ανάλογη ποσότητα πλασμιδιακού DNA προστέθηκε σε κάθε δείγμα και πραγματοποιήθηκε ανάδευση Προστέθηκε 1λ Plus reagent για 1γ πλασμιδιακού DNA Ακολούθησε ήπια ανάδευση και επώαση σε RT για πέντε λεπτά Προστέθηκαν 5λ Lipofectamin και πραγματοποιήθηκε καλή ανάδευση Ακολούθησε επώαση σε RT για μισή ώρα Το mix προστέθηκε στα κύτταρα τα οποία είχαν τοποθετηθεί σε well plates Τα well plates παρέμειναν στον επωαστικό κλίβανο για 40 h Eικόνα 10 : Διαμόλυνση κυττάρων με τη χρήση λιποσωμάτων http://aneesha2015.weebly.com/transfection.html Eνεργοποίηση κυττάρων Μετρήθηκε ο αριθμός των κυττάρων που υπήρχαν στα well plates Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε απουσία και παρουσία εστέρα φορβόλης (1mg/ml) 10ng/ml (PMA, Phorbol Myristate Acetate) και ιονομυκίνης (ιονοφόρο Ca2+, ionomycin-1mg/ml) 1-2 μμ). 40

Τα κύτταρα προς ενεργοποίηση επωάστηκαν για 6 h Αφού μαζέψαμε τα κύτταρα, μεταφέρθηκαν σε eppendorf και φυγοκεντρήθηκαν στις 1800 στροφές για 10 Απορρίφθηκε το υπερκείμενο και η πελέτα επαναδιαλύθηκε σε RPMI Aκολούθησε φυγοκέντρηση στις 1800 στροφές για 10 Απορρίφθηκε το υπερκείμενο και το κυτταρικό ίζημα φυλάχθηκε στην κατάψυξη Απομόνωση RNA από τα κύτταρα Η απομόνωση RNA από τα κύτταρα πραγματοποιείται με τη χρήση τριζόλης (Trizole GibcoBRL). H ιδιότητα της τριζόλης είναι ότι προκαλεί διάρρηξη των μεμβρανών των κυττάρων και εκχύλιση των κυτταροπλασματικών υλικών στα οποία περιέχεται το RNA. Xρησιμοποιήθηκε 1ml τριζόλης για 2x10 6 περίπου κύτταρα και ακολούθησε επώαση 5min σε RT Ακολούθησε προσθήκη διαλύματος χλωροφορμίου-ισοαμυλικής αλκοόλης (49:1) (200λ-1ml trizole) για να επιτευχθεί διαχωρισμός του RNA από τα υπόλοιπα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά υλικά (DNA, πρωτεΐνες κ.ά.) και επώαση σε RT για 5min Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν σε 12000rpm για 15min στους 4 ο C Μετά τη φυγοκέντρηση έχουν σχηματιστεί 3 στοιβάδες. Το RNA περιέχεται στην υπερκείμενη φάση. Στην ενδιάμεση φάση βρίσκονται οι πρωτεΐνες και στην υποκείμενη οργανική φάση βρίσκονται οι πρωτεΐνες οι οποίες έχουν συνδεθεί με CHCl3 και τη φαινόλη της τριζόλης 41

Eικόνα 11: Οι στοιβάδες που παρατηρούνται μετά την φυγοκέντρηση. Απεικονίζεται η υπερκείμενη φάση που περιέχει το RNA, η ενδιάμεση φάση και η οργανική φάση Η υδάτινη φάση μεταφέρθηκε προσεχτικά σε νέο eppendorf Προστέθηκε ισοπροπυλική αλκοόλη (500λ/ml trizole) και ακολούθησε ήπια ανάδευση Τα δείγματα μεταφέρθηκαν στους -80 ο C για 20min. Σε αυτή τη θερμοκρασία το RNA κρυσταλλοποιείται και καθιζάνει λόγω της αλκοόλης και του άλατος Aκολούθησε φυγοκέντρηση 10000rpm, για 30min, στους 4 ο C με σκοπό την πλήρη καθίζηση του RNA Aφαιρέθηκε το υπερκείμενο και στο RNA το οποίο ελήφθη με τη μορφή ιζήματος προστέθηκε 75% παγωμένη αιθανόλη (100λ) Τα δείγματα RNA φυγοκεντρήθηκαν στις 10000rpm για 20min στους 4 ο C Αφαιρέθηκε το υπερκείμενο και το ίζημα τοποθετήθηκε στο κενό προκειμένου να στεγνώσει Το ίζημα διαλύθηκε σε depc νερό το οποίο δεν περιέχει RNAασες που θα κατέστρεφαν το RNA και αποθηκεύθηκε στους -80 ο C 42

Δημιουργία cdna, RT-PCR Για την κατασκευή του cdna απαιτείται η µετατροπή του ολικού RNA σε DNA µε την χρήση του ενζύμου της αντίστροφης µεταγραφάσης (reverse transcriptase). Oι ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Invitrogen - M-MLV Reverse Transcriptase ήταν οι παρακάτω: Αντιδραστήρια Random Primers Ολικό RNA dntp mix (10mM each) H 2 O Ποσότητες 1λ 1ng-5µg 1λ μέχρι τελικό όγκο 10 λ Ακολούθησε θέρμανση των δειγμάτων στους 70 ο C για 10 min και μεταφορά σε πάγο για 1min. Στη συνέχεια προστέθηκαν: Αντιδραστήρια Ποσότητες ΜLV Reverse Transcriptase Buffer 2λ MLV Reverse Transcriptase 1λ RNase OUT 0,5λ H 2 O 6,5λ Επώαση στους 25 ο C για 10min Eπώαση στους 37 0 C για 50min Θέρμανση στους 90 ο C για 10min για την απενεργοποίηση της αντίδρασης Αποθήκευση του cdna στους -20 ο C 43

Aλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR, polymerase chain reaction) είναι μια αντίδραση η οποία επιτρέπει την παραγωγή in vitro, από κάποιο μείγμα DNA, ενός εξαιρετικά μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας. H αντίδραση αυτή επιτυγχάνεται με πολλαπλούς γύρους αντιγραφής, μέσω της χρήσης του ενζύμου DNA πολυμεράσης, ενός τμήματος DNA-στόχου, το οποίο βρίσκεται μεταξύ δύο ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών (primers). Οι εκκινητές είναι σχεδιασμένοι με ειδικό τρόπο, ώστε ο ένας εκκινητής να είναι συμπληρωματικός με τη μία άκρη της αλληλυχίας-στόχου στη μία αλυσίδα του DNA και ο δεύτερος εκκινητής να είναι συμπληρωματικός με την άλλη άκρη της αλληλουχίας-στόχου στη συμπληρωματική αλυσίδα. Το ένζυμο το οποίο χρησομοποιείται είναι η Τaq πολυμεράση, ένα θερμοανθεκτικό ένζυμο το οποίο απομονώνεται από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus. Η Τaq πολυμεράση συνθέτει δύο νέες αλυσίδες DNA έχοντας ως εκμαγείο την αλληλουχία μεταξύ των δύο εκκινητών. Kάθε αντίδραση PCR συνήθως επαναλαμβάνεται για 25-30 κύκλους, καθένας από τους οποίους αποτελείται από τα παρακάτω βήματα: 1. Αποδιάταξη (denaturation) στους 95 C: Η υψηλή θερμοκρασία προκαλεί αποδιάταξη των δίκλωνων μορίων DNA. Aποτέλεσμα της αποδιάταξης είναι η παραγωγή μονόκλωνων αλυδίσων που θα χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια ως μήτρες για τους εκκινητές και την DNA πολυμεράση. 2. Επανασύνδεση (annealing): Σε αυτό το στάδιο επιτυγχάνεται υβριδοποιήση των εκκινητών με τις αλληλουχίες στόχους. Η πρόσδεση γίνεται με τέτοιο προσανατολισμό ώστε τα 3 άκρα των εκκινητών να είναι στραμμένα προς το εσωτερικό της αλληλουχίας-στόχου. Η θερμοκρασία εξειδίκευσης της αντίδρασης της PCR προσδιορίζεται από την σχέση Tm=2(A+T)+4(C+G). 3. Σύνθεση (extension): Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται αύξηση της θεμροκρασίας στους 72 ο C. Η συγκεκριμένη θερμοκρασία είναι η βέλτιστη θεμροκρασία δράσης για την Ταq πολυμεράση, η οποία ολοκληρώνει τη σύνθεση των συμπληρωματικών αλυσίδων. Ο χρόνος επώασης στους 72 0 C ποικίλει ανάλογα με το μέγεθος του DNA στόχου που πρόκειται να ενισχυθεί. 44

Εικόνα 12: Συνοπτική παρουσία των στάδιων της PCR (https://www.flmnh.ufl.edu/cowries/amplify.html) Οι συνθήκες των αντιδράσεων PCR που πραγματοποιήθηκαν ήταν οι παρακάτω: Για τον ets-2: Primers: sense: 5 -cgc agc ggc agg atg aat g-3 antisense: 5 -agg aac gga ggt gag gtg tg-3 Aντιδραστήρια Ποσότητες 10xBuffer 2,5 λ MgCl2 3 λ dntps 0,5 λ Pr: ets-2for 0,5 λ Pr: ets-2rev 0,5 λ Taq pol 0,2 λ cdna 1 λ Η2Ο 16,8 45

Συνθήκες Αντίδρασης Θερμοκρασία Χρόνος 95 o C 5 min 95 o C 1 min 59 o C 1 min 72 o C 45 sec 72 o C 10 min x 38 κύκλους Για τη β 2 Μ: Primers: sense 5 -ccc cca ctg aaa aag atg ag-3 antisense 5 -tca tcc aat cca aat gcg gc- 3 Aντιδραστήρια Ποσότητες 10xBuffer 2,5 λ MgCl2 3 λ dntps 0,5 λ Pr: β 2 Μ for 0,5 λ Pr: β 2 Μ rev 0,5 λ Taq pol 0,2 λ cdna 1 λ Η2Ο 16,8 Συνθήκες Αντίδρασης Θερμοκρασία Χρόνος 95 o C 5 min 95 o C 30 sec 55 o C 30 sec 72 o C 30 sec 72 o C 10 min x 36 κύκλους 46

Hλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της PCR πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης επιτρέπει το διαχωρισμό, το χαρακτηρισμό και την απομόνωση τμημάτων DNA. Η βασική αρχή της μεθόδου είναι ότι εφόσον τα μόρια DNA τοποθετηθούν σε ηλεκτρικό πεδίο, λόγω του αρνητικού φορτίου του φωσφορικού σκελετού θα μετακινηθούν προς το θετικό πόλο του πεδίου, με ταχύτητες διαφορετικές και αντιστρόφως ανάλογες με το μέγεθος τους. Κατά συνέπεια, τα μεγάλα τμήματα DNA μεταναστεύουν πιο αργά κατά μήκος του πηκτώματος, ενώ τα μικρότερα πλησιάζουν τον θετικό πόλο πολύ γρηγορότερα. Για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία: Η αγαρόζη διαλύεται σε διάλυμα 1Χ TBE με βρασμό. Ανάλογα με τον όγκο ΤΒΕ που θα χρησιμοποιήσουμε προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης Το διάλυμα ζεσταίνεται και κατόπιν προστίθεται EtBr σε τελική συγκέντρωση 0,25 μg\ml για την οπτικοποιήση των αποτελεσμάτων Με το βρασμό, η αγαρόζη διαλύεται και δημιουργεί ένα ομοιογενές διάφανο μείγμα το οποίο μεταφέρεται στο ειδικό καλούπι όπου παραμένει έως ότου ψυχθεί και στερεοποιηθεί Για να ποσοτικοποιήσουμε τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήσαμε το πρόγραμμα Ιmage J. Με τη χρήση του συγκεκριμένου προγράμματος, αξιολογήσαμε τη σχετική ποσοτική μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των ζωνών της ηλεκτροφόρησης, με γονίδιο αναφοράς για κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων, την οπτική πυκνότητα της ζώνης της β2-μικρογλοβουλίνης (β2m). 47

Εικόνα 13: Α) Πήκτωμα αγαρόζης στο οποίο φαίνονται οι ζώνες της ηλεκτροφόρησης μετά την έκθεση τους σε υπεριώδη ακτινοβολία Β) Συσκευή ηλεκτροφόρησης Αποµόνωση πρωτεϊνών από τα κύτταρα Απαραίτητη προϋπόθεση για την πραγματοποίηση των πειραμάτων Western Blot, ήταν η απομόνωση πρωτεϊνών από τα κύτταρα. Ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία: Διάλυμα λύσης (Ripa buffer) προστέθηκε στην πελέτα των κυττάρων (1ml Ripa buffer/ 10 7 κύτταρα) Tα δείγματα τοποθετήθηκαν σε πάγο για 15min και ανά 5min γινόταν vortex Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 15, στα 14000g, στους 4 o C Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο Eppendorf Προστέθηκε στα δείγματα διάλυμα 2 Χ Sample buffer και μερκαπταιθανόλης (1ml Sample buffer - 50λ μερκαπταιθανόλη, αναλογία Ripa-protein / Sample buffer-μερκαπταιθανόλη:1-1) Aκολούθησε βρασμός των δειγμάτων στους 95 0 C για 5 min Tα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -20 0 C 48

Western Blot Με την τεχνική Western Blot είναι δυνατή η ανίχνευση μιας πρωτεΐνης σε ένα μείγμα πρωτεϊνών, όπως και ο προσδιορισμός του μεγέθους της και της περιεκτικότητάς της στο μείγμα. Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGΕ Ο διαχωρισμός του μείγματος των πρωτεϊνών πραγματοποιείται σε gel SDSpolyacrylamide όπου διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος τους. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE ήταν η παρακάτω: Παρασκευάστηκε το πήκτωμα διαχωρισμού των πρωτεϊνών (separating gel), το οποίο φορτώθηκε στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, καλύπτοντας περίπου τα 3:4 αυτής Στη συνέχεια παρασκευάστηκε το πήκτωμα πακεταρίσματος (stacking gel) το οποίο φορτώθηκε πάνω στο separating gel που είχε πήξει. Στη συσκευή τοποθετήθηκαν τα ειδικά χτενάκια, προκειμένου να δημιουργηθούν οι θέσεις φόρτωσης των δειγμάτων Όταν το πήκτωμα είχε πήξει και ήταν έτοιμο για χρήση, η συσκευή τοποθετήθηκε στο δοχείο ηλεκτροφόρησης, στο οποίο είχαμε ήδη προσθέσει το running buffer και αφαιρέθηκαν τα χτενάκια Φορτώθηκαν τα δείγματα και η συσκευή ηλετροφόρησης ρυθμίστηκε αρχικά στα 24 ma μέχρι η χρωστική να εισέλθει στο πήκτωμα διαχωρισμού και μετά η ένταση αυξήθηκε στα 48 ma Ανοσοαπoτύπωμα western Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, πραγματοποιήθηκε μεταφορά των δειγμάτων που αναλύθηκαν (transfer) σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα (transfer buffer) με 10% μεθανόλη, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου έντασης 300mA, για 2 ώρες 49

Mετά τη διαδικασία του transfer πραγματοποιήθηκε η κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος στη μεμβράνη με τη χρήση διαλύματος blocking buffer. Το blocking buffer είναι διάλυμα 5% γάλακτος σε PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) και προστέθηκε στις μεμβράνες για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου Ακολούθησε η επώαση των μεμβρανών στο πρώτο αντίσωμα υπό κίνηση σε θερμοκρασία δωματίου, για 2 ώρες ή Ο/Ν. Το αντίσωμα διαλύθηκε σε διάλυμα blocking buffer Ακολούθησε μια γρήγορη πλύση των μεμβρανών με PBS (1x) και ακολούθησαν μια 15 λεπτη και δυο 5 λεπτες πλύσεις με PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) Ακολούθησε η επώαση των μεμβρανών στο δεύτερο αντίσωμα υπό ανάδευση για μια ώρα και τριάντα λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου Ακολούθησαν οι ίδιες ακριβώς πλύσεις με προηγουμένως Το δεύτερο αντίσωμα φέρει στο άκρο του την HRP (Horse Radish Peroxidase) που προκαλεί φωταύγεια στο κατάλληλο υπόστρωμα. Το σήμα ανιχνεύθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου ECL και αποτυπώθηκε σε φωτογραφικό φιλμ, σε σκοτεινό δωμάτιο Eικόνα 14: Συσκευή ηλεκτροφόρησης (αριστερά), συσκευή για τη διαδικασία του transfer (δεξιά) ( http://www.bio-rad.com/en-us/category/wet-tank-blotting-systems) Τα πειράματα Western που πραγματοποιήθηκαν έγιναν με σκοπό να ανιχνευθούν οι πρωτεΐνες: Εts-2, NfAT2, NF-κΒ p65, CDK10, c-jun σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυττάρων Jurkat, H938 και HEK. Tα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν σε gel 50

ακρυλαμιδίου 12%. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κάθε πρωτεΐνη ήταν τα παρακάτω: Για την πρωτεΐνη Εts-2 και τις κυτταρικές σειρές Jurkat και Η938, ως πρώτο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα Ets-2 c20 (συγκέντρωσης 1:500) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα, ενώ για την κυτταρική σειρά HEK χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα Ets-2 F4 (συγκέντρωσης 1:500) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα. Το δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-rabbit (συγκέντρωσης 1:2000) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα για τις πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκε το Ets-2 c20 και anti-mouse (συγκέντρωσης 1:1500) για τις πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκε το Ets-2 F4 Για την πρωτεΐνη NFAT2 σε όλες τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκε ως πρώτο αντίσωμα το μονοκλωνικό αντίσωμα NFATc1 (συγκέντρωσης 1:500) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα. Tο δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-mouse (συγκέντρωσης 1:1500) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα. Για την πρωτεΐνη NF-κΒ p65 χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές ως πρώτο αντίσωμα το πολυκλωνικό αντίσωμα NF-κΒ p65 (συγκέντρωσης 1:500) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα. Tο δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-rabbit (συγκέντρωσης 1:2000) σε διάλυμα 1Χ PBS- Tween - 5% γάλα Για την πρωτεΐνη CDK10 χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές ως πρώτο αντίσωμα το πολυκλωνικό αντίσωμα CDK10 συγκέντρωσης 1:500) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα. Tο δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-goat (συγκέντρωσης 1:2000) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα Για την πρωτεΐνη c-jun χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές ως πρώτο αντίσωμα το πολυκλωνικό αντίσωμα c-jun (συγκέντρωσης 1:500) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα. Tο δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-rabbit (συγκέντρωσης 1:2000) σε διάλυμα 1Χ PBS-Tween - 5% γάλα Σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η β-τουμπουλίνη (b-tubulin). Για την ανίχνευση της χρησιμοποιήθηκε ως πρώτο αντίσωμα το αντίσωμα της b-tubulin (συγκέντρωσης 1:2000). Το δεύτερο αντίσωμα ήταν anti-mouse (συγκέντρωσης 1:1500). 51

AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 52

Μελέτη έκφρασης του παράγοντα Εts-2 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές Για την πραγματοποίηση των πειραμάτων διαμόλυνσης, με σκοπό τη μελέτη του ρόλου του Εts-2 στη ρύθμιση της έκφρασης των υπο μελέτη παραγόντων, ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna σε οχτώ κυτταρικές σειρές, πριν και μετά την ενεργοποίηση τους με μιτογόνα. Αναλυτικότερα, ελέγχθηκαν οι Τ λεμφοκυτταρικές H938 και Jurkat, οι Β λεμφοκυτταρικές σειρές U266, HS-Sultan, Raji, IM9 και RPMI και η νεφρική εμβρυϊκή κυτταρική σειρά ΗΕΚ 293. Μετά την καλλιέργεια των παραπάνω κυτταρικών σειρών, απομονώθηκε RNA από τα κύτταρα και μετά τη δημιουργία cdna, ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του ets-2 με PCR. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν απεικονίζονται στο γράφημα 1. Γράφημα 1: Έκφραση του ets-2 mrna σε ποικίλες κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιήθηκαν δυο Τ λεμφοκυτταρικές σειρές, πέντε Β λεμφοκυτταρικές σειρές και μια νεφρική εμβρυϊκή κυτταρική σειρά. 53

Από το γράφημα 1 παρατηρείται έκφραση του ets-2 mrna σχεδόν σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Αναλυτικά, στις συνθήκες CM, oι Β κυτταρικές σειρές παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna συγκριτικά με τις Τ λεμφοκυτταρικές σειρές Jurkat και Η938 και την κυτταρική σειρά ΗΕΚ. Επίσης, σύμφωνα με το γράφημα παρατηρείται ότι στις κυτταρικές σειρές Sultan, IM9 και HEK, στις συνθήκες P/I τα επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna είναι αυξημένα και διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα επίπεδα έκφρασης των κυττάρων που παρέμειναν στις συνθήκες CM. Aντιθέτως, στις κυτταρικές σειρές RPMI, Raji, Jurkat και H938, στις συνθήκες P/I τα επίπεδα έκφρασης του ets-2 είναι μειωμένα και παρουσιάζουν στατιστικώς σημαντική διαφορά από τα υψηλότερα επίπεδα που παρουσίασαν τα κύτταρα τα οποία δεν ενεργοποιήθηκαν. Yπερέκφραση του Εts-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του ets-2 σε επίπεδο mrnα Η κυτταρική σειρά Jurkat επιλέχθηκε για την πραγματοποίηση των πειραμάτων διαμόλυνσης, διότι στις συνθήκες CM παρουσιάζει ικανοποιητικά επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna. Μετά την πραγματοποίηση των πειραμάτων, προκειμένου να εξακριβωθεί εάν έχει γίνει σωστά η διαμόλυνση των κυττάρων και έχει επιτευχθεί υπερέκφραση του ets-2 σε μεταγραφικό επίπεδο πραγματοποιήθηκε PCR για το γονίδιο του ets-2. Τα δείγματα της κυτταρικής σειράς Jurkat τα οποία εξετάστηκαν χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλάμβανε τα κύτταρα τα οποία παρέμειναν στο καλλιεργητικό υλικό χωρίς ενεργοποίηση και η δεύτερη ομάδα αυτά που ενεργοποιήθηκαν με μιτογόνα και απομονώθηκαν έξι ώρες μετά την ενεργοποίησή τους. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν παρουσιάζονται στο γράφημα 2. 54

Γράφημα 2: Έκφραση του ets-2 mrna σε κύτταρα Jurkat τα οποία διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pcdna-ets2. Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν σύμφωνα με τα επίπεδα έκφρασης της β2m. Από το γράφημα 2 παρατηρείται ότι έχει επιτευχθεί υπερέκφραση του ets-2 σε επίπεδο mrna, καθώς αυξανομένης της ποσότητας εξωγενούς ets-2 αυξάνεται και η έκφραση του γονιδίου αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα τα οποία δεν διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο έχουν χαμηλά επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna, τα οποία διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα επίπεδα έκφρασης των κυττάρων τα οποία διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Αυτή η στατιστικώς σημαντική διαφορά παρατηρείται τόσο στα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM, όσο και στα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν. Επίσης στο διάγραμμα φαίνεται oτι η ενεργοποίηση των κυττάρων προκαλεί μείωση των ενδογενών επιπέδων του ets-2, διότι τα ενεργοποιημένα κύτταρα που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση, παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης, συγκριτικά με τα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM. 55

Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο Επόμενο βήμα ήταν η εξακρίβωση της υπερέκφρασης του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκαν πρωτεΐνες από τα κύτταρα Jurkat τα οποία ήταν σε συνθήκες καλλιέργειας και μετά από έξι ώρες ενεργοποίησης τους. Στη συνέχεια, αφού οι πρωτεΐνες υπέστησαν κατάλληλη επεξεργασία, πραγματοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση τους σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου. Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το πολυκλωνικό αντίσωμα Ets-2 c20. Η ζώνη που μετρήθηκε ήταν μεγέθους 55kDa και τα αποτελέσματα απεικονίζονται στην εικόνα 15 και στο γράφημα 3. Εικόνα 15: Western blot ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης Ets-2 σε κύτταρα Jurkat τα οποία έχουμε διαμολύνει με το πλασμίδιο pcdna-ets2. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρας για την ισοφόρτωση των δειγμάτων Γράφημα 3: Έκφραση της πρωτεΐνης Εts-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat μετά τα πειράματα διαμόλυνσης. 56

Aπό το γράφημα 3 προκύπτει ότι η προσθήκη εξωγενούς ets-2 συνάδει με αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης Εts-2. Συγκεκριμένα όσο αυξάνεται η ποσότητα του εξωγενούς ets-2, παρατηρείται σταδιακή αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης. Tόσο στις συνθήκες CM όσο και στις συνθήκες P/I, η έκφραση της πρωτεΐνης στα κύτταρα που δεν διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο διαφέρει στατιστικώς σημαντικά από την έκφραση της πρωτεΐνης στα κύτταρα που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Συγκρίνοντας τα κύτταρα στα οποία δεν πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση, παρατηρείται ότι χαμηλότερα πρωτεϊνικά επίπεδα παρουσιάζουν τα ενεργοποιημένα κύτταρα και αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα προηγούμενα αποτελέσματα, όπου παρουσιάστηκε αντίστοιχη μείωση στην έκφραση του ets-2 mrna στις συνθήκες P/I. Επίσης και τα υπόλοιπα δείγματα ενεργοποιημένων κυττάρων στα οποία έχουν προστεθεί αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου, έχουν μικρότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Εts-2 σε σχέση με τα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM. Πρωτεϊνική έκφραση ΝFAT2 Για να μελετηθεί η πρωτεϊνική έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα NFAT2 μετά τα πειράματα υπερέκφρασης του Εts-2, πραγματοποιήθηκαν πειράματα Western blot. Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μονοκλωνικό αντίσωμα NFATc1. H πρωτεΐνη NFAT2 μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου και τη χρήση του αντισώματος που αναφέρθηκε δίνει τρείς διαφορετικές ζώνες, μεγέθους 90, 110 και 140 kda.tα αποτελέσματα που προέκυψαν απεικονίζονται στην εικόνα 16 και στο γράφημα 4. Εικόνα 16: Western blot ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης NFAT2 στην κυτταρική σειρά Jurkat 57

Γράφημα 4: Έκφραση της πρωτεΐνης NFAT2 στην κυτταρική σειρά Jurkat. Από το γράφημα 4 παρατηρείται ότι στις συνθήκες CM δεν υπάρχει έκφραση της πρωτεΐνης NFAT2 και αυτό εξηγείται από τη φύση του συγκεκριμένου παράγοντα, ο οποίος αποτελεί δείκτη ενεργοποίησης. Αντιθέτως, στα ενεργοποιημένα κύτταρα παρατηρείται σταδιακή αύξηση έκφρασης της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, η αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 συνοδεύεται από αύξηση των επιπέδων του NFAT2. Tα κύτταρα τα οποία δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση, παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης, τα οποία διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα επίπεδα έκφρασης των κυττάρων τα οποία διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου pcdna-ets2. Πρωτεϊνική έκφραση NF-κB p65 Προκειμένου να ελεγχθεί πώς η υπερέκφραση του Ets-2 επιδρά στα επίπεδα έκφρασης του ΝF-κB p65, πραγματοποιήθηκαν όπως και προηγουμένως πειράματα Western Blot. To αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το πολυκλωνικό αντίσωμα NF-κB p65. H ζώνη που μετρήθηκε μετά την πραγματοποίηση των πειραμάτων ήταν 58

μεγέθους 65kDa. Tα αποτελέσματα παρουσιάζονται στην εικόνα 17 και στο γράφημα 5. Εικόνα 17: Western blot ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης NF-κB p65 στην κυτταρική σειρά Jurkat Γράφημα 5: Έκφραση της πρωτεΐνης NF-κB p65 στην κυτταρική σειρά Jurkat. Στο γράφημα 5 παρατηρείται ότι τόσο στις συνθήκες CM, όσο και στις συνθήκες P/I υπάρχει σταδιακή αύξηση έκφρασης του NF-κB p65. Ειδικότερα, με την αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 παρατηρείται αύξηση των επιπέδων του ΝF-κB p65. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης στα κύτταρα που παρέμειναν σε καλλιεργητικό υλικό και δεν διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο είναι χαμηλά και 59

διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Eπίσης στο διάγραμμα προκύπτει ότι τα ενεργοποιημένα κύτταρα τα οποία δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση, αλλά και αυτά τα οποία διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pcdna-ets2, έχουν υψηλότερα πρωτεϊνικά επίπεδα συγκριτικά με τα αντίστοιχα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM. Πρωτεϊνική έκφραση c-jun Για να δειερευνηθεί πώς επηρεάζονται τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-jun από την υπερέκφραση του Ets-2, πραγματοποιήθηκαν πειράματα Western blot και χρησιμοποιήθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα c-jun το οποίο δίνει ζώνη μεγέθους 39kDa. Tα αποτελέσματα που προέκυψαν παρουσιάζονται στην εικόνα 18 και στο γράφημα 6. Εικόνα 18: Επίπεδα της πρωτεΐνης c-jun που προέκυψαν από Western blot ανάλυση Γράφημα 6: Επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης c-jun στην κυτταρική σειρά Jurkat. 60

Από το γράφημα 6 παρατηρείται ότι η αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 συνοδεύεται από αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης c-jun. Τόσο στις συνθήκες CM, όσο και στις συνθήκες P/I, τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Συγκρίνοντας τα κύτταρα τα οποία παρέμειναν σε συνθήκες CM με τα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν, παρατηρείται ότι αυξανομένης της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης c-jun παρουσιάζουν τα μη ενεργοποιημένα κύτταρα. Yπερέκφραση του Εts-2 στην κυτταρική σειρά Η938 Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του ets-2 σε επίπεδο mrna Πειράματα διαμόλυνσης με το πλασμίδιο pcdna-ets2 πραγματοποιήθηκαν και στην κυτταρική σειρά Η938. Η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά επιλέχθηκε διότι στις συνθήκες CM παρουσιάζει ικανοποιητικά επίπεδα έκφρασης του est-2. Πρώτο βήμα και σε αυτή την περίπτωση ήταν να εξακριβωθεί εάν έχει επιτευχθεί υπερέκφραση του est-2 σε επίπεδο mrna. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν απεικονίζονται στο γράφημα 7. Γράφημα 7: Επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna σε κύτταρα H938 τα οποία διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pcdna-ets2. 61

Από το γράφημα 7 επιβεβαιώνεται ότι έχει πραγματοποιηθεί η υπερέκφραση του ets-2 σε μεταγραφικό επίπεδο, καθώς όσο αυξάνεται η ποσότητα του εξωγενούς ets-2, αυξάνεται και η έκφραση του γονιδίου. Συγκεκριμένα, τόσο στις συνθήκες CM, όσο και στις συνθήκες P/I, τα κύτταρα τα οποία δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση έχουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna, τα οποία διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα επίπεδα έκφρασης των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Επίσης από το διάγραμμα παρατηρείται ότι τα ενεργοποιημένα κύτταρα τα οποία δεν διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο, αλλά και τα κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου έχουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ets-2 σε σχέση με τα αντίστοιχα μη ενεργοποιημένα κύτταρα. Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο Επόμενο βήμα και σε αυτή την περίπτωση, ήταν η πραγματοποίηση πειραμάτων Western blot, προκειμένου να ελεγχθεί αν μετά τα πειράματα διαμόλυνσης έχει επιτευχθεί υπερέκφραση του Εts-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Χρησιμοποιήθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα Ets-2 c20 και τα αποτελέσματα που προέκυψαν απεικονίζονται στην εικόνα 19 και στο γράφημα 8. Εικόνα 19: Western blot ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης Ets-2 στην κυτταρική σειρά H938 μετά τα πειράματα υπερέκφρασης του Εts-2 62

Γράφημα 8: Έκφραση της πρωτεΐνης Ets-2 μετά τα πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων H938 με το πλασμίδιο pcdna-ets2 Aπό το γράφημα 8 επιβεβαιώνεται ότι έχει επιτευχθεί η υπερέκφραση του Εts- 2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο, διότι αυξανομένης της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 υπάρχει σταδιακή αύξηση έκφρασης της πρωτεΐνης. Ειδικότερα, στις συνθήκες CM αλλά και στις συνθήκες P/I, τα επίπεδα του Ets-2 στα κύτταρα που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση είναι αρκετά χαμηλά και διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα επίπεδα των κυττάρων τα οποία διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Από το διάγραμμα παρατηρείται επίσης, ότι τόσο τα ενεργοποιημένα κύτταρα στα οποία δεν πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση, όσο και τα ενεργοποιημένα κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου, παρουσιάζουν ελαφρώς αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα των κυττάρων που παρέμειναν σε συνθήκες CM. 63

Πρωτεϊνική έκφραση ΝFAT2 Προκειμένου να ελεγχθεί πώς η υπερέκφραση του Εts-2 επηρεάζει την έκφραση της πρωτεΐνης NFAT2, πραγματοποιήθηκαν πειράματα Western blot με χρήση του αντισώματος NFATc1. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στην εικόνα 20 και στο γράφημα 9. Εικόνα 20: Επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ΝFAT2 στην κυτταρική σειρά Η938 που προέκυψαν από Western blot ανάλυση Γράφημα 9: Έκφραση της πρωτεΐνης NFAT2 σε H938 κύτταρα. Σύμφωνα με το γράφημα 9 παρατηρείται ότι αυξανομένης της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 υπάρχει σταδιακή αύξηση των επιπέδων του NFAT2. Συγκεκριμένα, 64

τόσο στις συνθήκες CM, όσο και στις συνθήκες P/I παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά στα επίπεδα του NFAT2, μεταξύ των κυττάρων που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση και των κυττάρων τα οποία διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Επίσης, από το διάγραμμα προκύπτει ότι τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που παρέμειναν σε καλλιεργητικό υλικό είναι πολύ χαμηλά συγκριτικά με τα επίπεδα των κυττάρων που ενεργοποιήθηκαν με μιτογόνα. Πρωτεϊνική έκφραση NF-κB p65 Για να διερευνηθούν τα επίπεδα έκφρασης του NF-κB p65 μετά την υπερέκφραση του Εts-2 έγιναν πειράματα Western blot και χρησιμοποιήθηκε όπως και προηγουμένως το πολυκλωνικό αντίσωμα NF-κB p65. Tα αποτελέσματα που προέκυψαν απεικονίζονται στην εικόνα 21 και στο γράφημα 10. Eικόνα 21: Western blot ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης NF-κB p65 στην κυτταρική σειρά H938 65

Γράφημα 10: Επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ΝF-κB p65 στην κυτταρική σειρά Η938. Από το γράφημα 10 παρατηρείται ότι η αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 συνοδεύεται από αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης ΝF-κΒ p65. Ειδικότερα, στις συνθήκες CM τα επίπεδα των κυττάρων τα οποία δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα επίπεδα των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Αντιθέτως, τα επίπεδα των ενεργοποιημένων κυττάρων δεν παρουσιάζουν κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά. Συγκρίνοντας τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που ενεργοποιήθηκαν με αυτά των μη ενεργοποιημένων κυττάρων, παρατηρείται ότι ελαφρώς πιο αυξημένα είναι τα επίπεδα των ενεργοποιημένων κυττάρων. Πρωτεϊνική έκφραση c-jun Για να διερευνηθεί πώς επηρεάζονται τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-jun από την υπερέκφραση του Εts-2, εφαρμόστηκε πάλι η τεχνική Western blot και με τη χρήση του πολυκλωνικού αντίσωματος c-jun προέκυψαν τα αποτελέσματα που φαίνονται στην εικόνα 22 και στο γράφημα 11. 66

Εικόνα 22: Western blot ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης c-jun σε H938 κύτταρα Γράφημα 11: Έκφραση της πρωτεΐνης c-jun στην κυτταρική σειρά Η938. Στο γράφημα 11 παρατηρείται ότι στις συνθήκες CM αλλά και στις συνθήκες P/I, η αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 συνοδεύεται από σταδιακή αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης c-jun. Στατιστικώς σημαντική διαφορά παρατηρείται μεταξύ των πρωτεϊνικών επιπέδων των κυττάρων που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση και των επιπέδων των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου, τόσο στα κύτταρα που παρέμειναν σε καλλιεργητικό υλικό, όσο και στα κύτταρα τα οποία ενεργοποιήθηκαν με μιτογόνα 67

Πρωτεϊνική έκφραση CDK10 Για να μελετηθούν τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CDK10 μετά τα πειράματα υπερέκφρασης του Εts-2, έγιναν πειράματα Western blot και χρησιμοποιήθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα CDK10. H ζώνη που μετρήθηκε ήταν μεγέθους 38,5 kda και τα αποτελέσματα απεικονίζονται στην εικόνα 23 και στο γράφημα 12. Εικόνα 23: Western blot ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης CDK10 στην κυτταρική σειρά H938 Γράφημα 12: Eπίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CDK10 σε κύτταρα Η938. 68

Aπό το γράφημα 12 δεν προκύπτουν σαφή συμπεράσματα σχετικά με τα αποτελέσματα που έχει η υπερέκφραση του Εts-2 στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CDK10. Στα ενεργοποιημένα κύτταρα παρατηρείται ότι η αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 φαίνεται να προκαλεί αύξηση στα επίπεδα της CDK10. Το συμπέρασμα αυτό προκύπτει κυρίως από τα αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα των κύτταρων που έχουν διαμολυνθεί με 1000ng του pcdna-ets2, τα οποία παρουσιάζουν στατιστικώς σημαντική διαφορά σε σχέση με τα επίπεδα των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 500ng του πλασμιδίου. Αντιθέτως, μεταξύ των κυττάρων που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση και των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 500ng του pcdna-ets2, δεν παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά στα επίπεδα της CDK10. Στις συνθήκες CM, τα επίπεδα της CDK10 των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 500ng του πλασμιδίου ήταν πολύ μειωμένα και διέφεραν στατιστικώς σημαντικά από τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που δεν διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά ανάμεσα στα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 500ng του πλασμιδίου και των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. Yπερέκφραση του Εts-2 στην κυτταρική σειρά ΗEK Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του ets-2 σε επίπεδο mrna Πειράματα διαμόλυνσης με το πλασμίδιο pcdna-ets2 πραγματοποιήθηκαν και στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ. H συγκεκριμένη κυτταρική σειρά επιλέχθηκε διότι παρουσιάζει ικανοποιητικά επίπεδα σύνθεσης του ets-2 mrna στις συνθήκες CM, αλλά και λόγω των υψηλών ποσοστών δεκτικότητας που παρουσιάζει στα πειράματα διαμόλυνσης. Μετά τη διαμόλυνση των κυττάρων με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου, εξακριβώθηκε όπως και προηγουμένως, η υπερέκφραση του ets-2 σε επίπεδο mrna. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο γράφημα 13. 69

Γράφημα 13: Επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ μετά τα πειράματα διαμόλυνσης με το πλασμίδιο pcdna-ets2. Από το γράφημα 13 προκύπτει οτι έχει πραγματοποιηθεί υπερέκφραση του ets-2 σε επίπεδο mrna. Συγκεκριμένα, η διαμόλυνση των κυττάρων με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου οδηγεί σε σταδιακή αύξηση της έκφρασης του ets-2 mrna, τόσο στα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM, όσο και στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Eιδικότερα, τα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM και διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου, παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα έκφρασης, τα οποία διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα επίπεδα έκφρασης των κυττάρων τα οποία δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση. Αντίστοιχη στατιστικώς σημαντική διαφορά παρατηρείται και στα ενεργοποιημένα κύτταρα. Επίσης, από το διάγραμμα παρατηρείται ότι αυξανομένης της ποσότητας του εξωγενούς ets-2, τα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του ets-2 mrna, συγκριτικά με τα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν με μιτογόνα. 70

Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο Μετά την εξακρίβωση της υπερέκφρασης του ets-2 σε μεταγραφικό επίπεδο, πραγματοποιήθηκαν πειράματα Western blot και επιβεβαιώθηκε η υπερέκφρασή του σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Στη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα Ets-2 F4, το οποίο μετά την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου δίνει ζώνη μεγέθους 55kDa. Tα αποτελέσματα που προέκυψαν παρουσιάζονται στην εικόνα 24 και στο γράφημα 14. Εικόνα 24: Western blot ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Εts-2 σε κύτταρα ΗΕΚ, μετά τη διαμόλυνση με το πλασμίδιο pcdna-ets2 Γράφημα 14: Επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Εts-2 στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ μετά τα πειράματα υπερέκφρασης του Εts-2. 71

Σύμφωνα με το γράφημα 14 παρατηρείται ότι έχει επιτευχθεί η υπερέκφραση του Ets-2 σε πρωτεΐνικό επίπεδο. Τόσο στα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM, όσο και στα ενεργοποιημένα κύτταρα, η αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 συνοδεύεται από σταδιακή αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης. Ειδικότερα, τα επίπεδα έκφρασης του Ets-2, στα κύτταρα που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου, είναι αρκετά ψηλά και διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση. Eπίσης, από το διάγραμμα παρατηρείται ότι τα επίπεδα έκφρασης του Εts-2 παρουσιάζονται περισσότερα αυξημένα στα ενεργοποιημένα κύτταρα, συγκριτικά με τα επίπεδα των κυττάρων που παρέμειναν στο καλλιεργητικό υλικό. Πρωτεϊνική έκφραση c-jun Αφού εξακριβώθηκε η υπερέκφραση του Ets-2 σε πρωτεϊνικό επίπεδο, διερευνήθηκε η επίδραση που έχει στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης c-jun. Mε την πραγματοποίηση πειραμάτων Western blot και τη χρήση του πολυκλωνικού αντισώματος c-jun, προέκυψαν τα αποτελέσματα που απεικονίζονται στην εικόνα 25 και στο γράφημα 15. Eικόνα 25: Western blot ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης c-jun στην κυτταρική σειρά HEK 72

Γράφημα 15: Έκφραση της πρωτεΐνης c-jun στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ. Aπό το γράφημα 15 παρατηρείται ότι η υπερέκφραση του Ets-2 έχει διαφορετική επίδραση στα κύτταρα που παρέμειναν σε καλλιεργητικό υλικό και διαφορετική στα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν με μιτογόνα. Στα κύτταρα που παρέμειναν σε συνθήκες CM, η αύξηση της ποσότητας του εξωγενούς ets-2 προκαλεί σταδιακή αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης c-jun. Ειδικότερα, τα επίπεδα της c- Jun των κυττάρων που έχουν διαμολυνθεί με 1000ng του pcdna-ets2 έχουν στατιστικώς σημαντική διαφορά από τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που δεν έχουν υποστεί διαμόλυνση. Αντιθέτως, στα κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν με μιτογόνα, η διαμόλυνση με αυξανόμενες ποσότητες του πλασμιδίου, προκαλεί μείωση των επιπέδων της c-jun. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα τα οποία δεν διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο έχουν υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης, τα οποία διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από τα πρωτεϊνικά επίπεδα των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με 1000ng του πλασμιδίου. 73

Πρωτεϊνική έκφραση CDK10 Για να ελεγχθεί πώς επηρεάζεται η έκφραση της πρωτεΐνης CDK10 από την υπερέκφραση του Εts-2, πραγματοποιήθηκαν όπως και προηγουμένως πειράματα Western blot και χρησιμοποιήθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα CDK10. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν παρουσιάζονται στην εικόνα 26 και στο γράφημα 16. Eικόνα 26: Western blot ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης CDK10 στην κυτταρική σειρά HΕΚ Γράφημα 16: Επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CDK10 στην κυτταρική σειρά ΗΕΚ. 74