ΤΣΙΜΠΛΙΑΡΑΚΗΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Επιδράσεις Υψηλών και Χαμηλών Θερμοκρασιών και του Μεγέθους των Ατόμων στην Επιβίωση και την Αναπαραγωγική Δραστηριότητα του Δάκου της Ελιάς (Bactrocera oleae) Πτυχιούχος Γεωπόνος Α.Π.Θ ΤΣΙΜΠΛΙΑΡΑΚΗΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ Επιβλέπων καθηγητής ΚΩΒΑΙΟΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

Στους γονείς μου και την αδελφή μου

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 5 ABSTRACT 7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1.1 Ιστορικό της ελιάς 9 1.1.2 Η καλλιέργεια της ελιάς 10 1.1.3 Ασθένειες και εχθροί της ελιάς 12 1.2 Ο δάκος της ελιάς 13 1.2.1 Συστηματική κατάταξη 13 1.2.2 Γεωγραφική κατανομή 14 1.2.3 Μορφολογία του εντόμου 15 1.3 Βιολογία του εντόμου 16 1.3.1 Ξενιστές του εντόμου 16 1.3.2 Βιολογικός κύκλος 17 1.4 Συμβιωτικοί μικροοργανισμοί 19 1.5 Μέθοδοι ελέγχου του δάκου της ελιάς 20 1.6 Χημική καταπολέμηση 21 1.6.1 Δολωματικοί Ψεκασμοί 21 1.6.2 Ψεκασμοί Καλύψεως 22 1

1.7 Βιοτεχνικές μέθοδοι καταπολέμηση 22 1.7.1 Μαζική παγίδευση 22 1.7.2 Παρεμπόδιση σύζευξης 23 1.7.3 Τεχνική στείρων εντόμων 23 1.8 Βιολογική Καταπολέμηση 23 1.8.1 Χρήση εντομοπαθογόνων μικροοργανισμών 24 1.9 Σκοπός της διατριβής 26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Επιδράσεις υψηλών και χαμηλών θερμοκρασιών στην επιβίωση και αναπαραγωγική ικανότητα ενηλίκων διαφορετικών ηλικιών του δάκου της ελιάς (Diptera: Tephritidae) 2.1 Εισαγωγή 27 2.1.1 Επιδράσεις των χαμηλών και υψηλών θερμοκρασιών στον δάκο της ελιάς 27 2.1.2 Μηχανισμοί αντοχής των εντόμων σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες. 28 2.1.2.1 Μηχανισμοί αντοχής σε χαμηλές θερμοκρασίες 28 2.1.2.2 Μηχανισμοί αντοχής σε υψηλές θερμοκρασίες 29 2.1.2.3 Βλάβες που προκαλούνται στα ενήλικα έντομα εξαιτίας της σύντομης έκθεσης σε χαμηλές και υψηλές θερμοκρασίες. 30 2.1.2.4 Αλλαγές στην θερμοαντοχή των ενήλικων εντόμων οι οποίες συσχετίζονται με την ηλικία 31 2.2 Υλικά και μέθοδοι 32 2.2.1 Διατήρηση της αποικίας του εντόμου 32 2.2.2 Επιδράσεις στην επιβίωση και στην αναπαραγωγική ικανότητα ενήλικών ατόμων μετά από δίωρη έκθεση σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες 33 2

2.2.3 Στατιστική Επεξεργασία 34 2.3 Αποτελέσματα 35 2.3.1 Επιβίωση ατόμων διαφορετικών ηλικιών μετά από έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες 35 2.3.2 Επιβίωση ατόμων διαφορετικών ηλικιών μετά από έκθεση σε χαμηλές θερμοκρασίες 38 2.3.3 Διάρκεια ζωής ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς μετά από έκθεση τους σε υψηλές θερμοκρασίες σε διαφορετικές ηλικίες 41 2.3.4 Διάρκεια ζωής ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς μετά από έκθεση τους σε χαμηλές θερμοκρασίες σε διαφορετικές ηλικίες 43 2.3.5 Ωοπαραγωγή θηλυκών ατόμων δάκου ελιάς όταν σε διαφορετικές ηλικίες εκτέθηκαν σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες 45 2.4 Συζήτηση 47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Επίδραση του μεγέθους των ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς στην σύζευξη και την ωοπαραγωγή 3.1 Εισαγωγή 49 3.1.1 Η σύζευξη του δάκου της ελιάς 49 3.1.2 Το μέγεθος και η σύζευξη στα έντομα 51 3.2 Υλικά και μέθοδοι 53 3.2.1 Διατήρηση της αποικίας του εντόμου 53 3.2.2 Μελέτη της επίδραση του μεγέθους των ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς στην σύζευξη και την ωοπαραγωγή 53 3.2.3 Στατιστική Επεξεργασία 55 3.3 Αποτελέσματα 56 3.3.1 Προσδιορισμός του μέσου βάρους και μέσου μήκους των ενηλίκων θηλυκών και αρσενικών του δάκου της ελιάς 56 3.3.2 Η επιρροή του μεγέθους στην επιλογή ατόμων για σύζευξη 58 3

3.3.3 Προσδιορισμός της ώρας έναρξης και η διάρκεια σύζευξης για τα άτομα διαφορετικών μεγεθών 62 3.3.4 Διάρκεια σύζευξης ατόμων διαφορετικών μεγεθών 64 3.3.5 3.4 Η ωοπαραγωγή θηλυκών ατόμων διαφορετικών μεγεθών Συζήτηση 64 66 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ 68 69 76 4

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο δάκος της ελιάς Bactrocera oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae) είναι ένας από τους σοβαρότερους εχθρούς της ελιάς και κάθε χρόνο προκαλεί μεγάλες οικονομικές ζημιές. Εντοπίζεται κυρίως στην λεκάνη της μεσογείου, είναι μονοφάγο έντομο, και αναπτύσσεται αποκλειστικά στο μεσοκάρπιο της καλλιεργούμενης ελιάς και αγριελιάς. Το έντομο στην Ελλάδα αναπτύσσει 3-4 γενεές το έτος. Ο κυριότερος τρόπος καταπολέμησης του είναι οι δολωματικοί ψεκασμοί από εδάφους, οι οποίοι έχουν ελάχιστες δυσμενείς επιπτώσεις στο οικοσύστημα. Η μέθοδος αυτή είναι απολύτως συμβατή με τους στόχους της ολοκληρωμένης καταπολέμησης. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, μελετήθηκε με πειράματα εργαστηρίου η επίδραση της έκθεσης ενηλίκων ατόμων του δάκου της ελιάς διαφορετικών ηλικιών (4, 5, 15, 20, 30, 45, 50 και 55 ημερών) σε μία σειρά υψηλών (38,2 C, 38,5 C και 39 C) και χαμηλών (-5 C, -5,5 C και -6 C) θερμοκρασιών. Χρησιμοποιήθηκαν άτομα ενός πληθυσμού που προέρχονταν από την περιοχή της Θέρμης Θεσσαλονίκης. Συγκεκριμένα προσδιορίσθηκε το ποσοστό επιβίωσης, η διάρκεια ζωής και η ωοπαραγωγή μετά από βραχύχρονη έκθεση ενηλίκων ατόμων διαφορετικών ηλικιών σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες. Διαπιστώθηκε ότι, μετά από βραχύχρονη έκθεση σε υψηλές ή χαμηλές θερμοκρασίες τα ποσοστά επιβίωσης ενηλίκων ατόμων ηλικίας 4 και 15 ημερών είναι υψηλότερα ενώ βρέθηκε να είναι σημαντικά μικρότερα σε άτομα μεγάλης ηλικίας 30, 45, 50 και 55 ημερών. Ο αριθμός των αυγών που αποτέθηκαν από τα θηλυκά άτομα μετά από έκθεση σε υψηλή 38,5 C ή χαμηλή θερμοκρασία -5 C, υπήρξε σημαντικά μειωμένος σε σχέση με τα αυγά που απέθεσε ο μάρτυρας. Η μείωση αυτή παρατηρήθηκε σε άτομα όλων των ηλικιών που δοκιμάστηκαν και ήταν ιδιαίτερα έντονη σε άτομα μεγάλης ηλικίας. Η διάρκεια ζωής μετά από έκθεση σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες μειώθηκε σημαντικά σε σχέση με την διάρκεια ζωής των ατόμων του μάρτυρα. Η μείωση αυτή παρατηρήθηκε σε άτομα όλων των ηλικιών που δοκιμάστηκαν και ήταν ιδιαίτερα έντονη σε άτομα μεγάλης ηλικίας. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η αντοχή των ατόμων του δάκου της ελιάς στην επίδραση υψηλών ή χαμηλών θερμοκρασιών επηρεάζεται από την ηλικία και είναι μικρότερη στα νεαρά σε σχέση με ηλικιωμένα άτομα. Επίσης μελετήθηκε σε έναν πληθυσμό του δάκου της ελιάς που αναπτυσσόταν στο εργαστήριο σε ελαιόκαρπο, εάν το μέγεθος (βάρος και μήκος σώματος) 5

επηρεάζει την επιλογή των ατόμων για σύζευξη. Για τον σκοπό αυτό, διαχωρίσαμε μεγαλόσωμα και μικρόσωμα παρθένα θηλυκά και αρσενικά άτομα και την 12 η ημέρα της ηλικίας τους τα μεταφέραμε σε κλωβούς και καταγράψαμε την δημιουργία ζευγών. Συγκεκριμένα καταγράφηκε η ώρα έναρξη των συζεύξεων, η διάρκεια σύζευξης, και η ωοπαραγωγή των συζευγμένων θηλυκών για ένα χρονικό διάστημα 10 ημερών μετά την σύζευξη. Διαπιστώθηκε ότι τα μεγαλόσωμα άτομα είναι αυτά που συζεύγνυνται κατά προτεραιότητα. Πιο συγκεκριμένα τις πρώτες ώρες μετά την μεταφορά των παρθένων ατόμων στα κλουβιά, τα πλείστα άτομα που συζεύχθηκαν ήταν μεγαλόσωμα θηλυκά και αρσενικά. Ο αριθμός των αυγών που στη συνέχεια απέθεσαν τα μεγαλόσωμα άτομα ήταν σημαντικά μεγαλύτερος σε σχέση με τον αριθμό των αυγών που απέθεσαν τα μικρόσωμα θηλυκά. Αντίθετα, η διάρκεια σύζευξης δεν διέφερε μεταξύ μεγαλόσωμων και μικρόσωμων ατόμων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το μέγεθος των ενηλίκων του δάκου της ελιάς επιδρά στην σύζευξη και την ωοπαραγωγή τους. Συμπερασματικά φαίνεται ότι, οι υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες σε ενήλικα άτομα διαφορετικών ηλικιών επηρεάζουν την επιβίωση, την διάρκεια ζωής και την ωοοπαραγωγή σε μεγαλύτερο βαθμό στα γηραιότερα σε σχέση με τα νεαρότερα άτομα του δάκου της ελιάς. Το μέγεθος τον ατόμων του δάκου της ελιάς επιδρά στην επιλογή για σύζευξη. Τα αποτελέσματα μπορεί να είναι χρήσιμα από οικολογικής πλευράς και να εξηγούν σε έναν βαθμό πληθυσμιακές μεταβολές του εντόμου στο ύπαιθρο, αλλά και να οδηγούν στην βελτίωση της μαζικής εργαστηριακής εκτροφής του εντόμου. 6

ABSTRACT The olive fruit fly, Bactrocera oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae) is a major pest of olives, it causes important economical damage every year, and it is widespread throughout the Mediterranean Basin. The females lay eggs in the mesocarp of cultivated and wild olive fruits, and the larva grows in the fruit and pupates in the soil. In most regions of Greece it has 3-4 generations per year. The major means of controlling the population of the pest are ground based bait sprays. This method is used in a large scale in Greece and has very little effect to the ecosystem. It is also completely compatible with the goal of integrated pest management. The experiments of the present thesis were carried out in the laboratory in exposure of adults of a variety of ages (4, 5, 15, 20, 30, 45, 50 and 55 days old) of the olive fruit fly to a series of high (38,2 C, 38,5 C and 39 C) and low (-5 C, -5,5 C and -6 C) temperatures. The stock colony, was established with adults emerged from field collected infested olive fruits in the region of Thermi. In particular, the ability of survival, the longevity and egg production were specified, after short term exposure in high and low temperatures of adults of different ages. It is concluded that after short term exposure in high or low temperatures, the survival percentage in adults of 4 and 15 days old is higher. Adults of ages 30, 45, 50 and 55 days old, have significantly reduced survival percentage. The number of eggs layed by females after exposure in high 38,5 C or low -5 C temperature where significantly reduced compared with a layed eggs of the control. This reduction was observed through adults of all ages tested and was more intense among adults of older age. The longevity expectancy after exposure to high and low temperatures was significantly reduced compared to the life expectancy of the control. This reduction was also observed throught adults of all ages tested and was more intense among adults of older age. The results shows that tolerance of the olive fruit fly in response to high or low temperatures is affected by age and is more reduced in younger ages than in older adults. In another experiment, the effect of adult size in mating and egg production of Bactrocera olea was studied in the laboratory. Adults which had developed from an egg through pupa in olive fruits were separated in size classes according to their body weight and length and were allowed to mate. It was studied whether the size of the adults is associated with the choice of mate for reproduction. In particular, the onset 7

and duration of mating, and the egg production for 10 days after mating were recorded. It is concluded that big size females and males mated first. In particular, during the first hours after putting virgin females in the cages, most adults mating were big sized females and males. The number of eggs layed by the big sized females were was significantly higher compared to the number of eggs layed by the smaller ones. In addition, the duration of mating had no significant differences among big and small sized adults. The results show us that the size of the adults of olive fruit fly does matter in mating and egg production. It is concluded that the old flies are more sensitive than the younger ones to the effects of high and low temperatures. The size of adults of olive fruits fly affects the choice of the sexual mate. The results could be useful to explain up to one point the population change of the insects in the fields, and also lead to the improvement of mass rearing of the olive fruit fly. 8

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ιστορικό της ελιάς Η ελιά είναι ένα από τα παλαιότερα καλλιεργούμενα φυτικά είδη. Ευρήματα ελιάς έχουν μελετηθεί με τη βοήθεια της παλαιοβοτανικής σε απολιθώματα που βρέθηκαν στη Σαντορίνη και τη Νίσυρο (Rhizopoulou, 2007). Επίσης, απολιθωμένα φύλλα ελιάς, ηλικίας 50.000 έως 60.000 ετών, κοσμούν το μουσείο ελιάς της Σπάρτης όπως και ξύλο ελαιόδεντρου από 43.980 έτη π.χ που βρέθηκε στην κοιλάδα του Ιορδάνη. Στον ελλαδικό χώρο βρέθηκαν σε νεολιθικό οικισμό της Μάνης απολιθώματα ελιάς που χρονολογούνται πριν από την 4η χιλιετία π.χ, ενώ η ελαιοκαλλιέργεια αρχίζει στην Ελλάδα από την 3η χιλιετία π.χ και εντατικοποιείται κατά την ύστερη εποχή του χαλκού από το 1600 έως το 1100 π.x (Θεριός, 2005). Οι πρώτες γραπτές μαρτυρίες για την ελιά ανακαλύφθηκαν στα ανάκτορα της Κνωσού (14 ος αιώνα π.χ) και της Πύλου (13 ος αιώνας π.χ). Βρίσκονται σε πήλινες πινακίδες και είναι γραμμένες στην γραμμική Β γραφή (Rhizopoulou, 2007). Πολλοί υποστηρίζουν ότι η καταγωγή της ελιάς είναι η Μικρά Ασία ενώ άλλοι η Αβησσυνία, η Αίγυπτος, ο Λίβανος (Θεριός, 2005; Rhizopoulou, 2007). Η ελαιοκαλλιέργεια προωθήθηκε μέσω της Κύπρου προς την Ανατολία, την Αίγυπτο και την Κρήτη έως ότου καθιερώθηκε σε όλες τις χώρες τις Μεσογείου. Από τον 15 ος αιώνα μ.χ τα υπερωκεάνια ταξίδια βοήθησαν στην εξάπλωση της ελαιοκαλλιέργειας σε όλο τον Nέο Κόσμo. Σήμερα καλλιεργείται στην Νότια Αφρική, στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής (Καλιφόρνια), Κίνα, Ιαπωνία, Αυστραλία. Η χρήση του ελαιολάδου είναι γνωστή σε πολλές θρησκείες και πολιτισμούς. Το ελαιόλαδο και οι ελιές αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι της μεσογειακής διατροφής. Στην αρχαία Ελλάδα η ελιά είχε σπουδαίο ρόλο στην διατροφή των ανθρώπων και ήταν σημαντική καύσιμη ύλη για φωτισμό (λυχνίες). Επίσης ήταν συνδεδεμένη με μύθους, ιερούς συμβολισμούς και θεωρείται ότι μέσω του εμπορίου αποτέλεσε την οικονομική βάση για την στήριξη του ελληνικού πολιτισμού. Στην Αγία Γραφή και στο Κοράνι εμφανίζεται ως το πιο ιερό και σεβαστό δέντρο και χρησιμοποιείται εκτός των άλλων, κατά τη διάρκεια θρησκευτικών τελετών π.χ. στο μυστήριο της βάπτισης. 9

1.1.2 Η καλλιέργεια της ελιάς Η ελιά, Olea europae L. ανήκει στην οικογένεια Oleaceae. Άλλα σημαντικά γένη της οικογένειας είναι τα Ligustrum, Jasminum, Fraxinus. Η καλλιεργούμενη ελιά ανήκει στο γένος Olea, είδος europaea και υποείδος sativa. Το γένος Olea περιλαμβάνει τουλάχιστον 30 35 είδη που ανήκουν στην οικογένεια Oleaceae και στη υποοικογένεια Oleoideae με χ=23 χρωμοσώματα. Η ελιά είναι το μοναδικό παραμεσόγειο είδος. Το είδος Olea europaea διακρίνεται στην καλλιεργούμενη ποικιλία Olea europaea var. sativa και στην άγρια ποικιλία Olea europaea var. oleaster [subsp. oleaster (Hoffm. & Link.) Hegi] ή Olea europaea var. sylvestris [var. sylvestris (Mill.) Lehr. = var. oleaster (Hoffm. & Link.)] (Rhizopoulou, 2007). Η Olea europaea L. πιθανολογείται ότι προήλθε από μετάλλαξη και υβριδισμό από τα τροπικά και υποτροπικά Αφροασιατικά είδη όπως Olea europaea var. chrysophilla και Olea europaea var. laperrinii, τα οποία πιθανώς να έχουν λάβει μέρος στην εξέλιξη της καλλιέργειας (Walton, 1995). Μια άλλη άποψη, υποστηρίζει ότι είναι αποτέλεσμα της εξημέρωσης της άγριας ελιάς Olea europaea var. οleaster που εμφανίζεται στην ευρύτερη λεκάνη της Μεσογείου (Rhizopoulou, 2007 και οι αναφορές που δίνει). Η καλλιεργούμενη ελιά (Olea europaea L.) είναι αειθαλές δένδρο αργά αναπτυσσόμενο είδος, ανθεκτικό στην ξηρασία με προσδόκιμο ζωής τα 500 χρόνια. Το είδος Olea europaea L. απαρτίζεται από 2600 ποικιλίες, πολλές από τις οποίες μπορεί να είναι μόνο οικότυποι (Θεριός, 2005). Στις θερμές περιοχές με ξηρασία καλλιεργούνται κυρίως ελαιοποιήσιμες ποικιλίες ενώ στις περιοχές με πολλές βροχοπτώσεις κυρίως επιτραπέζιες. Η ελιά είναι ένα δέντρο που ευδοκιμεί σε ξηροθερμικές συνθήκες και παράγει καρπό ακόμη και σε πετρώδη και άγονα εδάφη. Ωστόσο, στα βραχώδη και άγονα εδάφη καρποφορεί κάθε 2 με 4 χρόνια και οι αποδόσεις του είναι πολύ μικρές. Σε γόνιμες και αρδευόμενες περιοχές παρουσιάζει γρήγορη και έντονη ανάπτυξη καθώς και υψηλές αποδόσεις. Η ελιά είναι δέντρο αείφυλλο, αιωνόβιο, αποκτά ύψος 15 με 20 μέτρα, στην πράξη όμως με το κλάδεμα αποκτά ύψος 4 με 5 μέτρα. Η ταξιανθία είναι βότρυς και ο καρπός της είναι δρύπη (Θεριός, 2005). Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της καρποφορίας είναι οι αυξομειώσεις που έχει από χρόνο σε χρόνο. Το φαινόμενο προκαλείται από την παρενιαυτοφορία, και προκαλεί 10

μείωση της παραγωγής. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την εμφάνιση της είναι γενετικά αίτια, περιβαλλοντολογικά αίτια και εσωτερικοί παράγοντες του ιδίου του δέντρου. Σημαντικό ρόλο φαίνεται να έχουν τα θρεπτικά στοιχεία του αζώτου, φωσφόρου και καλίου, η περιεκτικότητα των οποίων μειώνεται στο φυτό κατά της χρονιές αυξημένης καρποφορίας (Ποντίκης, 1992) Η καλλιέργεια της ελιάς είναι εφικτή σε όλη την εύκρατη και υποτροπική ζώνη. Ευδοκιμεί σε περιοχές με υψόμετρο έως 900 μέτρα, θερμοκρασίες από -4 C έως 40 C, με βροχοπτώσεις από 300 έως 600 χιλιοστά το χρόνο σε αβαθή, ουδέτερα, αλκαλικά εδάφη. Οι ιδανικές ελαιοπαραγωγικές περιοχές χαρακτηρίζονται από ήπιους, βροχερούς χειμώνες και μακριά, θερμά και ξηρά καλοκαίρια (Ayerz and Sibbett, 2001). Θερμοκρασίες χαμηλότερες από τους -10 C δεν είναι ευνοϊκές για το δέντρο καθώς προκαλούν ζημιά στους βραχίονες ή και σε ολόκληρο το δέντρο της ελιάς. Γενικά η καλλιέργεια της ελιάς απαιτεί χρόνο, καθώς η πρώτη αποδοτική παραγωγή υπολογίζεται µετά από 8-10 χρόνια. Σε πρόσφατη αναφορά του Διεθνούς Συμβουλίου Ελαιολάδου (International Olive Council) του 2010, το δέντρο της ελιάς στην Ελλάδα καλλιεργείται σε περίπου 11,6 εκατομμύρια στρέμματα γης, με πάνω από 170 εκατομμύρια ελαιόδεντρα, κατέχοντας από την άποψη αυτή την 4η θέση παγκοσμίως μετά την Ισπανία, Τυνησία και Ιταλία. Στον τομέα του ελαιολάδου, η Ελλάδα με μια μέση ετήσια παραγωγή τα τελευταία χρόνια γύρω στους 380 (300-435) χιλιάδες τόνους, έρχεται 3η μετά την Ισπανία και την Ιταλία. Στον τομέα της επιτραπέζιας ελιάς, με μια μέση ετήσια παραγωγή 108 (90-120) χιλιάδων τόνων, έρχεται 5η μετά την Ισπανία, Αίγυπτο, Τουρκία και Συρία. Σε παγκόσμια κλίμακα η παραγωγή ανέρχεται πάνω από 900 εκατομμύρια ελαιόδεντρα που περιλαμβάνονται σε περίπου 10 εκατομμύρια εκτάρια από τα οποία το 95% βρίσκεται στην λεκάνη της Μεσογείου (Walton, 1995). Η κατανάλωση ελαιολάδου όσο και επιτραπέζιας ελιάς παρουσιάζουν σταθερά αυξητικές τάσεις (Γιαννοπολίτης, 2009). 11

1.1.3 Ασθένειες και εχθροί της ελιάς Η ελιά προσβάλλεται από πολλούς εχθρούς (έντομα, ακάρεα, νηματώδεις κ.ά.) και ασθένειες. Από τους εχθρούς, τρία έντομα προκαλούν κάθε χρόνο τις σοβαρότερες ζημιές. Ο δάκος [Bactrocera (Dacus) oleae] (Rossi) (Diptera: Tephritidae) ο οποίος είναι το αντικείμενο μελέτης αυτής της εργασίας, ο πυρηνοτρήτης (Prays oleae) (Bernard) (Lepidoptera: Yponomeutidae) μικρό λεπιδόπτερο γκρίζου χρωματισμού του οποίου η προνύμφη του προσβάλλει άνθη, φύλλα, βλαστούς και καρπούς, και το λεκάνιο [(Saissetia oleae) (Olivier), (Homoptera: Coccidae)] κοκκοειδές όπου οι ζημιές που προκαλεί είναι άμεσες μέσω της αναρρόφησης φυτικών χυμών και έμμεσες μέσω της έκκρισης μελιτώματος που ευνοεί την ανάπτυξης της καπνιάς (Μπρούμας και Κατσόγιαννος, 2009). Άλλοι εχθροί με μικρή σημασία για την ελιά είναι η Μαργαρόνια (Palpita unionalis) [(Hubner ) (Lepidoptera: Pyralidae)] και (Lobesia botrana) (Den. & Schiff.), (Lepidoptera: Tortricidae), το σκαθάρι (Phloeotribus scarabaeoides) (Bernard) (Coleptera: Scolytidae), η ψύλλα της ελιάς (Euphyllura olivine) (Hemiptera: Psyllidae), ο ρυχγχίτης (Rynchites cribripennis) (Desbrochers), τα κοκκοειδή [Aspidiotus nerii (Bouche) (Homoptera: Diaspididae)], (Parlatoria oleae) (Colvee) (Homoptera: Diaspididae)] κ.τ.λ. (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Οι συγκεκριμένοι εχθροί μπορούν να προκαλέσουν οικονομική ζημία σε περιπτώσεις όπου η ηλικία του ελαιοδέντρου, οι κλιματικές συνθήκες ή άλλοι παράγοντες (θανάτωση αρπακτικών και παρασίτων) ευνοήσουν την ανάπτυξη τους. Οι σοβαρότερες ασθένειες της ελιάς είναι οι εξής : α) το Κυκλοκόνιο Spilocaea οleagina (Cycloconium oleaginum). Κύριο σύμπτωμα της ασθένειας αυτής είναι η εμφάνιση χαρακτηριστικών κυκλικών κηλίδων ( μάτια παγωνιού ) στην πάνω επιφάνεια των φύλλων και προκαλεί φυλλόπτωση. β) O Καρκίνος της ελιάς ο οποίος προκαλείται από το βακτήριο Pseudomonas syringae pv. savastanoi (Janse) και προκαλεί το σχηματισμό εξογκωμάτων (καρκινωμάτων) στα κλαδιά, στους κλάδους, στον κορμό, ακόμα και στις ρίζες. γ) Η Ξεροβούλα σαποβούλα (Camarosporium dalmatica) (Thϋm) που είναι πολύ διαδεδομένη στην χώρα μας. Ο μύκητας προσβάλλει μόνο τους καρπούς προκαλώντας σήψεις και συνήθως ακολουθεί την προσβολή από τον δάκο της ελιάς, η σοβαρότητά της ασθένειας είναι ανάλογη με την προσβολή του δάκου στις διάφορες περιοχές (Καλομοίρα και Αλιβιζάτος, 2009). Δ) 12

Η καπνιά είναι μια ασθένεια της ελιάς η οποία προκαλείται από τους μύκητες Fumago Vacans (Pers) και Antennariia elaeophila (Mont) οι οποίοι αναπτύσσονται στα εκκρίματα των κοκκοειδών και φράσουν τα στομάτια των φύλλων ή αναπτύσσονται πάνω στον καρπό. 1.2 Ο δάκος της ελιάς 1.2.1 Συστηματική κατάταξη Η τάξη των Διπτέρων (Diptera) περιλαμβάνει την οικογένεια Tephritidae, στην οποία ανήκει το είδος του δάκου της ελιάς (Bactocera oleae). Στην οικογένεια αυτή ανήκουν οι λεγόμενες μύγες των φρούτων (fruit flies), έντομα με μεγάλη οικονομική σημασία καθώς προσβάλουν την πλειονότητα των προϊόντων της αγροτικής παραγωγής. Η οικογένεια Tephritidae αποτελείται από έξι υποοικογένειες (Tachiniscinae, Blepharoneurinae, Phytamiinae, Dacinae, Trypetinae και Tephritinae) και 27 φυλές (Korneyev, 1999). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός της αναθεώρησης της συστηματικής των Tephritidae, το έντομο κατατάχθηκε από το γένος Dacus στο γένος Bactocera. Ο δάκος της ελιάς κατατάχθηκε στο γένος Bactrocera λόγω της μορφολογίας των κοιλιακών του τεργιτών. Tα είδη του γένους Bactrocera χαρακτηρίζονται από διακριτούς κοιλιακούς τεργίτες και προσβάλουν κυρίως τροπικά και υποτροπικά είδη φρούτων. Αντίθετα τα είδη του γένους Dacus προσβάλουν κυρίως ενδημικά φυτά των οικογενειών Asclepiadaceae και Cucurbitaeae. Στην οικογένεια Tephritidae και ειδικότερα στην υποοικογένεια Dacinae στην οποία ανήκει ο δάκος της ελιάς, δεν υπάρχουν σαφείς ταξινομικοί χαρακτήρες με αποτέλεσμα να υπάρχουν αρκετά προβλήματα στην συστηματική τους κατάταξη. Ο Gmelin είναι ο πρώτος ο οποίος κατέταξε τον δάκο της ελιάς αρχικά ως Musca oleae (1790), στη συνέχεια κατατάχθηκε ως Dacus ( Daculus) oleae, Dacus (Polistomimetes) oleae και Daculus oleae, για να καταλήξει στο σημερινό όνομα Bactrocera (Daculus) oleae (Drew, 1989). Σήμερα η συστηματική κατάταξη του δάκου κατά White and Elson Haris 1992 όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. 13

Εικόνα 1. Ο δάκος της ελιάς ΦΥΛΟ ΥΠΟΦΥΛΟ ΚΛΑΣΗ ΥΠΟΚΛΑΣΗ ΔΙΑΙΡΕΣΗ ΤΑΞΗ ΥΠΟΤΑΞΗ ΔΙΑΙΡΕΣΗ ΤΜΗΜΑ ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΥΠΟΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΓΕΝΟΣ ΥΠΟΓΕΝΟΣ ΕΙΔΟΣ Arthropoda Atelocerata Insecta Neoptera Holometabola Diptera Brachycera Schizophora Acalyptratae Tephritoidea Tephritidae Dacinae Bactrocera Daculus oleae Πίνακας 1.1. Συστηματική κατάταξη του δάκου της ελιάς (White and Elson Harris, 1992). 1.2.2 Γεωγραφική κατανομή Η ζώνη της γεωγραφικής εξάπλωσης του δάκου της ελιάς Bactrocera oleae περιλαμβάνει την πλειονότητα των περιοχών στις οποίες γίνεται εντατική καλλιέργεια ελαιόδεντρων καθώς και χωρών όπου τα άγρια ελαιόδεντρα είναι αυτόχθονα είδη. Ο δάκος της ελιάς είναι διαδεδομένος στις παραμεσόγειες χώρες, υπάρχουν όμως και αναφορές παρουσίας του σε διάφορες περιοχές σε όλο τον κόσμο συμπεριλαμβανομένης της Νότιας και Κεντρικής Αφρικής (Rice, 2000), της Εγγύς και Μέσης Ανατολής, της Κεντρικής Αμερικής (Μεξικό) και της Καλιφόρνιας των ΗΠΑ (Nardi et al., 2005). Η παρουσία του εντόμου αναφέρθηκε και στη Σερβία η οποία πιθανώς αποτελεί και το βορειότερο όριο εξάπλωσης του εντόμου (Κωβαίος 14

και συνεργάτες, 2001, και αναφορές που δίνουν). Ωστόσο, δεν έχει αναφερθεί ακόμη η παρουσία του στην Νότια Αμερική, Αυστραλία και Κεντρική Κίνα (Tzanakakis, 2006). Η παρουσία του δάκου στο Νέο Κόσμο συνδέεται πιθανά με την πρόσφατη εισαγωγή των ελαιόδεντρων για γεωργικούς σκοπούς. Ο δάκος της ελιάς φαίνεται να έχει την ικανότητα να αποικίζει γρήγορα νέες περιοχές και γι αυτό το λόγο κάθε χώρα που έχει ελαιοπαραγωγή θεωρείται ότι κινδυνεύει από εισβολή δάκου (Smith, 2001). Είναι φανερό ότι η λεπτομερής γνώση της βιολογίας, της γενετικής δομής και της γεωγραφικής ποικιλότητας που παρουσιάζει ένα είδος είναι βασική προϋπόθεση στο σχεδιασμό της στρατηγικής ελέγχου, μείωσης της εξάπλωσης και τελικού αφανισμού του κινδύνου (Roderick and Navajas, 2003). 1.2.3 Μορφολογία του εντόμου Το έντομο θεωρείται ότι είναι ένα από τα μικρότερα σε μέγεθος είδη του γένους Bactrocera (Weems and Nation, 2009). Το ενήλικο είναι μια μύγα και έχει μήκος 5mm με άνοιγμα πτερύγων 10 mm. Η κεφαλή έχει ανοιχτό καστανό χρώμα και οι σύνθετοι οφθαλμοί φέρουν πρασινωπές μεταλλικές ανταύγειες που στο νεκρό και αποξηραμένο έντομο γίνονται κοκκινωπές. Ο θώρακας είναι σκοτεινότερος στα νώτα και έχει συνήθως 2-4 κατά μήκος σκοτεινές ταινίες (γκρι ή μαύρες) και υπόλευκο ή υποκίτρινο θυρεό (scutellum), όπως επίσης υπόλευκες ή υποκίτρινες κηλίδες στα πλάγια. Οι πτέρυγες είναι διαφανείς, ιριδίζουσες, με ένα σκοτεινό στίγμα στην άκρη και ξεχωρίζουν από τις αντίστοιχες άλλων ειδών που είναι συνήθως έγχρωμες ή φέρουν μοτίβα. Στα θηλυκά η κοιλία καταλήγει σε ισχυρό ευδιάκριτο ωοθέτη, έξω εκτατό και ισομήκη με την κοιλία. Οι αλτήρες είναι λευκοί και τα πόδια κιτρινοκόκκινα (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Η νύμφη έχει σχήμα ελλειψοειδές, είναι ανοιχτοκάστανη και έχει ως περίβλημα το σκληρυμένο δερμάτιο της αναπτυγμένης προνύμφης, το μέγεθος της είναι περίπου 4-5mm (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Για την έξοδο του ενήλικου εντόμου, σχηματίζεται χαρακτηριστική κυκλική σχισμή (κυκλόραφα) στο ένα άκρο του περιβλήματος της νύμφης (Μπρούμας και Κατσόγιαννος, 2009). Η προνύμφη είναι υπόλευκη ή ανοιχτοκίτρινη, τελικού μήκους 7-8 mm, με το πρόσθιο μέρος του σώματος στενότερο από το οπίσθιο και χωρίς κεφαλική κάψα, όπως συμβαίνει σε προνύμφες 15

άλλων ειδών της οικογένειας Tephritidae. Στο πρόσθιο μέρος του σώματος των προνυμφών υπάρχουν τα στοματικά γναθικά άγκιστρα, όπως σε όλα τα κυκλόραφα δίπτερα, τα οποία είναι σκούρου χρώματος καθώς επίσης και ο υπόλοιπος κεφαλοφαρυγγικός σκελετός. Το αυγό είναι πολύ στενόμακρο με μήκος περίπου 0,7 mm, οξύ στον ένα πόλο, λευκού χρώματος και εισάγεται με τη βοήθεια του ωοθέτη στο μεσοκάρπιο του ελαιοκάρπου (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Ο Tzanakakis (2006) αναφέρει ότι υπάρχουν διαφορές στο μέγεθος, μεταξύ των πληθυσμών καθώς επίσης και μεταξύ των ατόμων τα οποία ως προνύμφες αναπτύσσονται σε τροφή (καρποί ελιάς ή τεχνητή τροφή) με διαφορετική περιεκτικότητα σε θρεπτικά συστατικά. 1.3 Βιολογία του εντόμου 1.3.1 Ξενιστές του εντόμου Ο δάκος χαρακτηρίζεται από πολλούς συγγραφείς ως μονοφάγο έντομο και προσβάλλει τους καρπούς τριών ειδών του γένους Olea: Olea europaea var. sativa (L.), Olea europaea var cuspidata (Link), Olea europaea var chrysophilla (Lam) (Tzanakakis, 2006). Τα ενήλικα άτομα του δάκου τρέφονται με νέκταρ φυτών, γύρη, μελιτώματα προερχόμενα από έντομα (κοκκοειδή) και από άλλες υγρές τροφές που εκκρίνονται από τραύματα καρπών, φύλλων και βλαστών (Mohammad, 2005). Τις παραπάνω ουσίες τα άτομα του δάκου της ελιάς δεν τις παίρνουν μόνο από τα ελαιόδεντρα αλλά και από άλλα φυτά τα οποία βρίσκονται δίπλα ή μακριά από τους ελαιώνες (Tzanakakis, 2006). Η αναζήτηση τροφής είναι μια καθημερινή διαδικασία για τα ενήλικα, τα οποία εντούτοις στη φάση που μόλις έχουν εξέλθει μπορούν να επιβιώσουν 1-2 μέρες χωρίς τροφή, αφού χρησιμοποιούν αποθέματα που φέρουν από το προνυμφικό στάδιο. Για την επιβίωση και αναπαραγωγή του εντόμου τα απαραίτητα στοιχεία της δίαιτας είναι αμινοξέα, βιταμίνες, μεταλλικά στοιχεία, υδατάνθρακες και νερό (Tsiropoulos, 1977). Η γνώση των θρεπτικών απαιτήσεων του δάκου της ελιάς είναι κρίσιμης σημασίας για την επιλογή πηγών ενέργειας και τροφής, ώστε να είναι δυνατή η εκτροφή και διατήρηση αποικιών στο εργαστήριο. Σε μελέτες που έγιναν με προνύμφες δάκου, βρέθηκε ότι τρέφονται και αναπτύσσονται ικανοποιητικά σε ώριμους καρπούς τομάτας καθώς τα αναπτυχθέντα 16

σε τομάτα ενήλικα άτομα παρουσίασαν ικανοποιητική ωοπαραγωγή και γονιμότητα (Navrozidis and Tzanakakis, 2005). Οι ποικιλίες που προτιμούνται περισσότερο από τον δάκο είναι οι μεγαλόκαρπες και αυτές με μεγάλη περιεκτικότητα σε νερό (επιτραπέζιες) από ότι οι μικρόκαρπες και ελαιοποιήσιμες. Μία εξήγηση είναι ότι οι μεγαλόκαρπες δίνουν μεγαλύτερο αριθμό προνυμφών με μεγαλύτερη επιβίωση. Επίσης, οι μεγάλοι σε μέγεθος καρποί είναι πιο ευπρόσβλητοι από το δάκο λόγω της μειωμένης αντοχής του φλοιού τους (πιο μαλακός). Στην Ελλάδα μία ποικιλία που έχει μερικώς ανοχή είναι η Κορωνέικη σε σχέση με την μεγαλόκαρπη ποικιλία Τσουνάτη (Rice, 2000). 1.3.2 Βιολογικός κύκλος Η ανάπτυξη, αναπαραγωγική ικανότητα και δυναμική των πληθυσμών του δάκου της ελιάς επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από ορισμένους αβιοτικούς παράγοντες όπως μεταξύ άλλων τη θερμοκρασία, φωτοπερίοδο και σχετική υγρασία (ΣΥ) (Tzanakakis and Koveos, 1986; Koveos and Tzanakakis, 1990, 1993; Koveos, 2001; Broufas et al., 2009 και αναφορές που δίνουν). Κατά τη διάρκεια του έτους ο δάκος συναντάται σε διάφορες μορφές και συμπληρώνει, ανάλογα με τις συνθήκες που επικρατούν, περισσότερους από ένα βιολογικούς κύκλους. Στις παραμεσόγειες χώρες όπως η Ελλάδα, ο αριθμός των γενεών κυμαίνεται μεταξύ 2 με 5, στην χώρα μας κυρίως έχει 3 με 4 γενεές (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Στην Κεντρική Ελλάδα η πρώτη γενεά εμφανίζεται με την έναρξη του καλοκαιριού (Ιούνιο Ιούλιο) και οι επόμενες δύο εμφανίζονται το φθινόπωρο μέχρι και τον χειμώνα (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Ο αριθμός των γενεών ποικίλει ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν την κάθε χρονιά και τις διαθέσιμες ελιές για ωοτοκία. Το ενήλικο και η νύμφη διαχειμάζουν σε σχισμές του δέντρου ή σε μικρό βάθος στο έδαφος (1 έως 6 εκατοστά). Ο δάκος της ελιάς θεωρείται ομοδυναμικό έντομο, δηλαδή έντομο που δεν διαπαύει. Στην Κρήτη βρέθηκε ότι διαχειμάζει σε όλα τα ανήλικα στάδια αλλά και ως ενήλικο, ενώ στην Κέρκυρα κυρίως ως νύμφη στο έδαφος. Στη Θεσσαλονίκη διαπιστώθηκε ότι μέχρι τα μέσα Δεκεμβρίου μέρος του διαχειμάζοντος πληθυσμού του εντόμου βρίσκεται στο στάδιο της προνύμφης ή και της νύμφης, ενώ μετά τον Ιανουάριο ο πληθυσμός του εντόμου αποτελείται 17

αποκλειστικά από ενήλικα άτομα (Κωβαίος και συνεργάτες, 2001 και οι αναφορές που δίνουν). Σε περιοχές με ήπιο χειμώνα (παράλια νότιας Ελλάδας και ορισμένων νησιών) όταν υπάρχει στα δέντρα κατάλληλος καρπός, είναι δυνατόν να συνυπάρχουν στον ελαιώνα όλα τα στάδια του εντόμου (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Η ωοτοκία στις νότιες περιοχές της Μεσογείου πραγματοποιείται από τον Ιούλιο και αργότερα (Tzanakakis, 2006). Την περίοδο αυτή οι ελιές έχουν αποκτήσει το τελικό τους μέγεθος και έχουν υποστεί αρκετή ωρίμανση ώστε να είναι εύκολο για το ενήλικο θηλυκό να διατρυπήσει τον καρπό με τον ωοθέτη του. Τα ενήλικα θηλυκά του δάκου της ελιάς από την άνοιξη έως τα μέσα καλοκαιριού δεν παρουσιάζουν ωρίμανση των ωαρίων τους δηλαδή χαρακτηριστικά μιας αναπαραγωγικής διάπαυσης (Tzanakakis and Koveos, 1986). Η ωοπαραγωγή των θηλυκών επηρεάζεται από τις κλιματικές συνθήκες, την ποιότητα της δίαιτας του θηλυκού και τη διαθεσιμότητα καρπών. Η ύπαρξη ώριμων καρπών φαίνεται να είναι κρίσιμης σημασίας για την αναπαραγωγική ετοιμότητα των θηλυκών. Οι ώριμοι καρποί χρησιμοποιούνται ως πηγή αμινοξέων, βιταμινών και άλλων αυξητικών παραγόντων που χρειάζονται για να επιτευχθεί η ωρίμανση των ωαρίων. Εικάζεται ότι ο καρπός της ελιάς περιέχει συγκεκριμένες χημικές ουσίες που διεγείρουν την ωρίμανση των ωαρίων στις ωοθήκες λειτουργώντας μέσω του νευρικού ή του ενδοκρινικού συστήματος. Η ύπαρξη ή όχι καρπών ελιάς έδειξε να έχει θετική συσχέτιση στην ωρίμανση των ωαρίων ανεξάρτητα από άλλους παράγοντες και αυτό εξηγείται καθώς αποτελούν πηγή βιταμινών και αμινοξέων (Koveos and Tzanakakis, 1990). Έχουν μελετηθεί διάφοροι παράγοντες που πιθανά επηρεάζουν την ωριμότητα των ωαρίων (Κoveos and Tzanakakis, 1989; Tzanakakis and Koveos, 1986). Η επίδραση του ελαιόκαρπου στον αριθμό των αποτιθέμενων αυγών (ωοπαραγωγή) και στη διάρκεια ζωής θηλυκών ατόμων του δάκου της ελιάς μελετήθηκε σε θερμοκρασία 25ºC και φωτοπερίοδο ΦΣ 16:8. Βρέθηκε ότι η επαφή με τον ελαιόκαρπο σε συνδυασμό με μία τουλάχιστον ωοτοκία σε αυτόν, ευνοούν ιδιαίτερα την ωοπαραγωγή των θηλυκών, ενώ αντίθετα μόνο η επαφή με τον ελαιόκαρπο χωρίς ωοτοκία, δεν έχει ευνοϊκή επίδραση στην ωοπαραγωγή (Κωβαίος και συνεργάτες, 2007). Συνήθως εισάγεται ένα αυγό ανά καρπό, ωστόσο σε περιπτώσεις υψηλών πληθυσμών και περιορισμένης καρποφορίας μπορεί να αναπτυχθούν δύο ή περισσότερες προνύμφες στον ίδιο καρπό. Το θηλυκό αφού ανοίξει μία χαρακτηριστική μικρή τριγωνική οπή στον ελαιόκαρπο αποθέτει ένα αυγό. Σε 18

ευνοϊκές συνθήκες τα θηλυκά αποθέτουν 13-40 αυγά ημερησίως (Tzanakakis, 2006), και στο σύνολο της ζωής τους 150 με 400 (Μπρούμας και Κατσόγιαννος, 2002). Μετά την απόθεση του αυγού, το θηλυκό αναρροφά χυμό από τον ελαιόκαρπο που εκρέει από την οπή ωοτοκίας και στην συνέχεια, τον αλείφει στην επιφάνεια γύρω από την οπή. Αυτό λειτουργεί αποτρεπτικά σε άλλα θηλυκά να ωοτοκήσουν τον ίδιο καρπό. Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρεάζουν άμεσα και έμμεσα το βιολογικό κύκλο του δάκου. Έμμεσα μέσω της επιρροής τους στην ωρίμανση και τη σύσταση του καρπού της ελιάς. Η αυξημένη ατμοσφαιρική υγρασία ενισχύει την αύξηση του μεγέθους των καρπών καθώς και την εκροή μελιτωμάτων από τα δέντρα που αποτελούν πηγή ενέργειας για το έντομο. Η θερμοκρασία από την άλλη πλευρά, επηρεάζει άμεσα όλα τα στάδια του βιολογικού κύκλου. Σε σταθερές θερμοκρασίες, εργαστηριακές μελέτες έδειξαν ότι σε θερμοκρασία των 35 C ο δάκος της ελιάς παρουσιάζει την μεγαλύτερη ταχύτητα ανάπτυξης για την ολοκλήρωση των σταδίων του αυγού και της προνύμφης αλλά επιφέρει θνησιμότητα στο στάδιο της νύμφης. Το κατώτατο όριο ουδός ανάπτυξης για τα ανήλικα στάδια του δάκου της ελιάς για το αυγό, την προνύμφη και την νύμφη είναι 9.19 C, 13.94 C και 12.36 C, αντίστοιχα. Η βέλτιστη θερμοκρασία για την ανάπτυξη και επιβίωση των ανήλικων σταδίων είναι η 27 C. (Genç and Nation, 2008). 1.4 Συμβιοτικοί μικροοργανισμοί Πολλά έντομα έχουν σχέσεις συμβίωσης με προκαρυωτικούς και ευκαριωτικούς οργανισμούς κυρίως μύκητες και βακτήρια. Η σημασία των τελευταίων είναι πολύ μεγάλη για την επιβίωση και την αναπαραγωγή των εντόμων αυτών. Γενικά οι συμβιωτές έχουν ένζυμα για την πέψη ορισμένων συστατικών της τροφής του εντόμου, τα οποία δεν τα έχει το έντομο ή δίνουν στο έντομο ορισμένες βιταμίνες, αμινοξέα, ή άλλες θρεπτικές ουσίες που το έντομο δεν μπορεί να συνθέσει ή να πάρει από την τροφή του. Τις ουσίες αυτές που του παρέχουν οι συμβιωτικοί μικροοργανισμοί, είτε τις παίρνει από τον περιβάλλοντα χώρο είτε πέπτοντας τα κύτταρα των συμβιωτών. Πρώτος ο Petri (1909) ανακάλυψε την ύπαρξη συμβιωτικών βακτηρίων εξωκυτταρικά στον δάκο της ελιάς. Το βακτήριο στους ενήλικους δάκους βρίσκεται σε οισοφαγικούς θύλακες στην κεφαλή και στο ορθό του εντόμου και εκβάλει στον ωαγωγό (Kenneth and Hagen, 1966). Το βακτήριο πολλαπλασιάζεται 19

στον οισοφάγο σχηματίζοντας μάζες οι οποίες μεταφέρονται στο μέσο έντερο όπου πιθανόν χρησιμοποιείται ως πηγή αζώτου στα ενήλικα (Sacchetti et al., 2008). Κατά την διάρκεια της ωοτοκίας το αυγό επαλείφετε με το βακτήριο, εισέρχεται μέσω της μικροπύλης στο εσωτερικό και εγκαθίσταται στον πεπτικό σωλήνα της προνύμφης. Στην προνύμφη τα βακτήρια αναπτύσσονται στο μπροστινό τμήμα του μέσου εντέρου και από εκεί μεταφέρονται στο ενήλικο όπου ενσωματώνονται στους οισοφαγικούς θύλακες. Ο Petri (1909) πίστευε ότι ο συμβιωτής ήταν το βακτήριο Pseudomonas syrignea pv savastani που προκαλεί την ασθένεια, καρκίνος της ελιάς αλλά που όμως έως τώρα δεν έχει απομονωθεί. Έχουν απομονωθεί 16 είδη βακτηρίων από τον οισοφαγικό θύλακα και τον ωοθέτη του εντόμου εκ των οποίων τέσσερα ανήκουν στο γένος Pseudomonas κανένα δεν ανήκει στο είδος savastanoi (Tzanakakis, 2006). Η δραστηριότητα των βακτηρίων είναι πολύ σημαντική για την μεταβολική λειτουργία της νεαρής προνύμφης των πρώτων γενεών ώστε να μπορέσει να διασπάσει τις πρωτεΐνες του μεσοκάρπιου της ελιάς σε αμινοξέα, όταν οι ελιές είναι άγουρες (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Εναλλακτικά, τα βακτηριακά κύτταρα μπορούν καταναλωθούν ως τροφή παρέχοντας στις προνύμφες αμινοξέα, αζωτούχες ενώσεις και άλλα θρεπτικά συστατικά που είναι ελάχιστα στο μεσοκάρπιο της ελιάς. 1.5 Μέθοδοι ελέγχου του δάκου της ελιάς Ο δάκος είναι ένας από τους σοβαρότερους εχθρούς της ελιάς. Εκτιμάται ότι στις μεσογειακές χώρες κάθε χρόνο παρότι γίνονται προσπάθειες αντιμετώπισης του, προκαλεί μεγάλες οικονομικές ζημιές της τάξης του 15% στις ελαιοπαραγωγικές περιοχές (Mazomenos et al., 2002). Όταν οι συνθήκες ευνοούν μεγάλες πυκνότητες πληθυσμών σε αγροτεμάχια που δεν έχουν γίνει ενέργειες αντιμετώπισής τους, το ποσοστό οικονομικής ζημίας εκτοξεύεται έως 80% με μέσο όρο 40% με 50%. (Haniotakis, 2005 και αναφορές που δίνει). Επίσης έμμεσα η οπή ωοτοκίας του δάκου (νύγμα) βοηθά την εγκατάσταση του μύκητα Camarosporium dalmaticum Berl. and Volg. που προκαλεί την ξεροβούλα στις άγουρες και τη σαποβούλα στις ώριμες ελιές. Στη θέση ωοτοκίας του εντόμου ακολουθεί συχνά ωοτοκία του Prolasioptera berlesiana, που βοηθά στην εξάπλωση του μύκητα στον ελαιόκαρπο και πιθανότατα τον μεταφέρει εκεί (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Για την καταπολέμηση του δάκου της ελιάς στις μέρες μας εφαρμόζεται με 20

επιτυχία η χημική μέθοδος. Γίνονται ψεκασμοί καλύψεως και δολωματικοί ψεκασμοί. Επίσης δοκιμάζονται και υπάρχει τάση ανόδου για εναλλακτικές βιολογικές μέθοδοι όπως η μαζική παγίδευση, εξαπόλυση φυσικών εχθρών κυρίως παρασιτοειδών και εξαπόλυση στείρων εντόμων. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται σε μεγάλη κλίμακα στην Ελλάδα είναι οι δολωματικοί ψεκασμοί από εδάφους οι οποίοι έχουν ελάχιστες δυσμενείς επιπτώσεις στα οικοσυστήματα. Επίσης η μέθοδος αυτή είναι απολύτως συμβατή με τις επιδιώξεις της ολοκληρωμένης καταπολέμησης. 1.6 Χημική καταπολέμηση 1.6.1 Δολωματικοί Ψεκασμοί Είναι μία προληπτική μέθοδος αντιμετώπισης όπου χρησιμοποιείται εντομοκτόνο με ελκυστικό διάλυμα μίας υδρολυμένης πρωτεΐνης με αποτέλεσμα τα έντομα να προσελκυθούν, να τραφούν και να θανατωθούν πριν ξεκινήσουν να ωοτοκούν (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Για τους δολωματικούς ψεκασμούς χρησιμοποιούνται εντομοκτόνα οργανοφωσφορικά, πυρεθροειδή και σπινοσίνες. Οι ψεκασμοί αυτοί γίνονται με ψεκαστήρες πλάτης και γεωργικά μηχανήματα με αντλίες πιέσεως. Η ιδιαιτερότητα τους βρίσκεται στο ότι η κάλυψη με ψεκαστικό υγρό γίνεται μόνο σε ένα μέρος της κόμης του δέντρου υπό μορφή χοντρών σταγόνων σε ποσότητα περίπου 300 κ.ε. ανά δέντρο. Προϋπόθεση για να είναι αποτελεσματική μία τέτοια μέθοδος είναι να εφαρμόζεται σε μεγάλες εκτάσεις με την εποπτεία του κράτους. Ο χρόνος έναρξης των ψεκασμών καθορίζεται από τα εξής κριτήρια, την πυκνότητα του πληθυσμού, την αναλογία θηλυκών αρσενικών (1:1), την παρουσία ώριμων ωαρίων στα θηλυκά να είναι άνω του 5% και ευνοϊκές για ωοτοκία καιρικές συνθήκες (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Για την παρακολούθηση της πυκνότητας πληθυσμού των ενηλίκων, χρησιμοποιούνται γυάλινες παγίδες τύπου McPhail με δόλωμα ελκυστικό υδατικό διάλυμα θεϊκής αμμωνίας ή υδρολυμένης πρωτεΐνης και βόρακα. Η προϋπόθεση επιτυχίας της μεθόδου είναι να γίνουν οι ψεκασμοί στον σωστό χρόνο, ειδικά για τον πρώτο ψεκασμό ώστε να υπάρξει αποτελεσματικός έλεγχος της πρώτης γενεάς. Οι επόμενοι ψεκασμοί λαμβάνουν χώρα όταν συλλαμβάνονται 5 με 20 ενήλικα ανά παγίδα ανά πενθήμερο, η αναλογία θηλυκών αρσενικών (1:1) και άνω και η γονιμότητα των θηλυκών είναι σχετικά 21

μεγάλη. Συνήθως πραγματοποιούνται 1-2 θερινοί ψεκασμοί και 2-3 φθινοπωρινοί. Για να μην υπάρχει κίνδυνος τοξικών υπολειμμάτων συνιστάται μετά τα μέσα Σεπτεμβρίου η χρήση μικρής τοξικότητας και μειωμένης λιποδιαλυτότητας εντομοκτόνων (Μπρούμας και Κατσόγιαννος, 2009). 1.6.2 Ψεκασμοί Καλύψεως Οι ψεκασμοί καλύψεως είναι μία θεραπευτική μέθοδος με στόχο την καταπολέμηση του σταδίου της προνύμφης και του αυγού εντός του ελαιοκάρπου. Στους ψεκασμούς καλύψεως το δέντρο ψεκάζεται ολόκληρο με υδατικά διαλύματα εγκεκριμένων για την καλλιέργεια εντομοκτόνων. Η μέθοδος αυτή είναι αποτελεσματική ακόμα και αν εφαρμόζεται σε μεμονωμένα δέντρα. Τα όρια τα οποία μας επιτρέπουν να ψεκάσουμε είναι 5% προσβολή σε ελαιόκαρπο σε ελαιοποιήσιμες ποικιλίες από γόνιμη δακοπροσβολη (προνύμφη, νύμφη, προνυμφικές στοές ) και 2% για τις βρώσιμες ελιές. Ο τελευταίος ψεκασμός θα πρέπει να τηρεί τα ημερολογιακά όρια που αναγράφονται στην ετικέτα του εντομοκτόνου ώστε να μην βρεθούν τοξικά υπολείμματα στο προϊόν (Μπρούμας και Κατσόγιαννος, 2009). Η χημική καταπολέμηση βασίζεται στα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα (Dimethoate). Επίσης, χρησιμοποιούνται τα πυρεθροειδή και το spinosad αλλά σε μικρότερο βαθμό (Skouras et al., 2007). 1.7 Βιοτεχνικές μέθοδοι καταπολέμησης 1.7.1 Μαζική παγίδευση Ο σκοπός της μεθόδου αυτής είναι η σύλληψη όσο το δυνατόν μεγαλύτερου πληθυσμού ενήλικων ατόμων ώστε να μειωθεί ο πληθυσμός του σε ανεκτά επίπεδα που δεν προκαλούν οικονομική ζημία. Η αποτελεσματικότητα της καθορίζεται από τον πληθυσμό του δάκου και από το κατά πόσο μια ελαιοπαραγωγική περιοχή είναι απομονωμένη από γειτονικές. Όταν όμως ο πληθυσμός του εντόμου προβλέπεται πυκνός, είναι αναγκαίοι ένας ή και δύο δολωματικοί ψεκασμοί (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Οι τύποι των παγίδων που χρησιμοποιούνται στην μέθοδο αυτή είναι οι χρωματικές που έχουν μεγάλη ελκυστικότητα αλλά μικρή ακτίνα δράσης και 22

προσελκύουν και ωφέλιμα έντομα. Οι τροφικές παγίδες με ελκυστικό τροφής κυρίως υδρολυμένη πρωτεΐνη ή αμμωνιακά άλατα και οι φερομονικές με ελκυστικό φερομόνης είναι μη αποτελεσματικές σε χαμηλές θερμοκρασίες φθινοπώρου. Ανεβαίνει η αποτελεσματικότητα σε συνδυασμό με ελκυστικό τροφής. 1.7.2 Παρεμπόδιση σύζευξης Στόχος της μεθόδου είναι η συσσώρευση της φερομόνης του εντόμου στο περιβάλλον του, ώστε να έρθει σε σύγχυση και να μην γνωρίζει την φυσική προέλευση της φερομόνης (Montiel and Jones, 2002). Στην περίπτωση του δάκου είναι γνωστό ότι το θηλυκό χρησιμοποιεί σεξουαλική φερομόνη για την προσέλκυση του αρσενικού. Η φερομόνη των θηλυκών είναι ένα μείγμα 4 ουσιών με αφθονότερο και πλέον ελκυστικό το συστατικό 1,7 διοξασπείρο (5,5) ενδεκάνιο το οποίο παράγεται συνθετικά και κυκλοφορεί στο εμπόριο. 1.7.3 Τεχνική στείρων εντόμων Η εξαπόλυση στειρωμένων εντόμων με ακτίνες γ είναι μία τεχνική που έχει ως στόχο την μείωση του αναπαραγωγικού πληθυσμού του εντόμου για την αποτροπή δημιουργίας απογόνων. Για να πραγματοποιηθεί ο παραπάνω σκοπός της μεθόδου, η τεχνική στειρώσεως πρέπει να μη μειώνει σε μεγάλο βαθμό την ικανότητα των εντόμων να ζουν, να αναζητούν στη φύση το άλλο φύλο και να συζεύγνυνται με επιτυχία. Μαζικές εξαπολύσεις στειρωμένων εντόμων σε συνδυασμό με δυο δολωματικούς ψεκασμούς διατήρησαν τον πληθυσμό του δάκου σε χαμηλά επίπεδα. Όμως, τεχνικές απαιτήσεις της μεθόδου καθώς και άλλοι λόγοι δεν ευνόησαν την εφαρμογή της σε ευρείες περιοχές (Τζανακάκης, 1995; Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). 1.8 Βιολογική Καταπολέμηση Η βιολογική καταπολέμηση χρησιμοποιεί αρπακτικά, παρασιτικά είδη και παθογόνους μικροοργανισμούς με σκοπό των έλεγχο των βλαβερών εντόμων. Ένας σημαντικός φυσικός εχθρός του δάκου είναι το Prolasioptera berlesiana το οποίο 23

θεωρείται σαν ένα αρπακτικό αυγών. Εναποθέτει τα αυγά του σε καρπούς στους οποίους έχει προηγηθεί η απόθεση των αυγών του δάκου. Το αρπακτικό αυτό μπορεί άμεσα ή έμμεσα να καταστρέψει ένα ποσοστό 30-50% των αυγών του δάκου της ελιάς. Όμως, παρά την σημαντική του δράση θεωρείται υπεύθυνο για την μεταφορά του μύκητα Macrophoma dalmatica ο οποίος προκαλεί σοβαρές ζημιές στον ελαιόκαρπο (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Τα παρασιτοειδή υμενόπτερα αποθέτουν μέσω κεντρίσματος τα ωάρια τους στην αιμoκοιλιακή κοιλότητα των ξενιστών τους. Με βάση την τροφική τους δραστηριότητα χωρίζονται σε αυτά που αναπτύσσονται εντός του σώματος των ξενιστών τους (ενδοπαράσιτα) τρεφόμενα από το εσωτερικό τους, και αυτά που αναπτύσσονται εξωτερικά με τα στοματικά μόρια βυθισμένα στο σώμα των ξενιστών. Τα σπουδαιότερα ιθαγενή παράσιτα του δάκου της ελιάς είναι τα Eupelmus urozonus, Pnigalio mediterraneus, Eurytoma martelli, Cyrtoptyx latipes (Eupelmidae: Hymenoptera). Τα εκτοπαράσιτα της υπεροικογένειας Chalcidoidae: Hymenoptera θεωρούνται αναποτελεσματικά για την βιολογική καταπολέμηση λόγω του ότι περιορίζεται η δράση τους το καλοκαίρι ενώ μεγάλοι πληθυσμοί εμφανίζονται τον Φεβρουάριο. Στην Ελλάδα πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες βιολογικής καταπολέμησης του δάκου της ελιάς με μαζικές εξαπολύσεις με το εισαγόμενο παρασιτοειδές Opius concolor (Braconidae: Hymenoptera) το οποίο είναι ένα ενδοπαράσιτο. Οι προσπάθειες αυτές δεν έδωσαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα και έτσι δεν συνεχίστηκαν (Τζανακάκης και Κατσόγιαννος, 2003). Τα αρπακτικά έντομα που τρέφονται με τις νύμφες του δάκου της ελιάς στο έδαφος είναι τα Carabus banozi, Licinus aegyptiacus, Pterostichus creticus της οικογένεια Carabidae, και τα Ocypus oleus, Ocypus fulvipennis της οικογένειας Staphylinidae. 1.8.1 Χρήση εντομοπαθογόνων μικροοργανισμών Η βιολογική καταπολέμηση των εντόμων με την χρήση μικροοργανισμών βασίζεται στην χρησιμοποίηση παθογόνων μικροοργανισμών (βακτήρια, μύκητες, ιοί, πρωτόζωα) που επιφέρουν τόσο ασθένειες όσο και τον θάνατο. Για την οικογένεια Tephritidae, αν και υπάρχουν αναφορές, συνήθως δεν χρησιμοποιείται η μέθοδος αυτή. Ο ιός CrPV (Cricket Paralysis Virus), αναφέρεται ως πιθανός παράγοντας 24

βιολογικού ελέγχου του Βactrοcera oleae (Bourtzis and Miller, 2003, και αναφορές που δίνουν). Επιπλέον, απομονωμένα στελέχη Bacillus thuringiensis εμφάνισαν τοξικότητα σε εργαστηριακά άτομα δάκου, τόσο σε προνύμφες όσο και σε ενήλικα, μέσω της πρόσληψης της τροφής (Karamanlidou et al., 1991). Ενθαρρυντικά αποτελέσματα έδωσε επίσης και η εφαρμογή ψεκασμών ελαιώνων με σπόρια και κρυστάλλους στελεχών Bacillus thuringiensis. Συγκεκριμένα παρατηρήθηκαν μειώσεις του ποσοστού των νυγμάτων στους ελαιόκαρπους και της απόθεσης αυγών αλλά και μείωση της αναλογίας του αριθμού ενηλίκων που εξέρχονται από το στάδιο της νύμφης (Navrozidis et al., 2000). 25

1.9 Σκοπός της διατριβής Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η επίδραση θερμοκρασιακών καταπονήσεων τόσο με υψηλές όσο και με χαμηλές θερμοκρασίες στην επιβίωση, τη διάρκεια ζωής και την ωοπαραγωγή ενήλικων ατόμων του δάκου της ελιάς, Bactrocera oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae) διαφορετικών ηλικιών. O στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί εάν η θερμοκρασιακή αντοχή των ενήλικων του δάκου της ελιάς, μεταβάλλεται με την αύξηση της ηλικίας. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση του μεγέθους των ατόμων στη συμπεριφορά σύζευξης και την ωοπαραγωγή. Στόχος αυτών των πειραμάτων ήταν να διερευνηθεί εάν το μέγεθος των εντόμων επηρεάζει την επιλογή ατόμων του άλλου φύλου για σύζευξη και την μεγιστοποίηση του αναπαραγωγικού δυναμικού του. Η έρευνα που πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας, μπορεί να βοηθήσει στην κατανόηση των παραγόντων που επηρεάζουν την ανάπτυξη των πληθυσμών του εντόμου και στον αποτελεσματικότερο σχεδιασμό στρατηγικών καταπολέμησης τους. 26

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Επιδράσεις υψηλών και χαμηλών θερμοκρασιών στην επιβίωση και αναπαραγωγική ικανότητα ενηλίκων διαφορετικών ηλικιών του δάκου της ελιάς (Bactrocera olea)(diptera: Tephritidae) 2.1 Εισαγωγή Η θερμοκρασία επηρεάζει άμεσα την ανάπτυξη των εντόμων και είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της γεωγραφικής κατανομής και της αφθονίας των ποικιλόθερμων ειδών (Bowler and Terblanche, 2008). Για τα έντομα που είναι ποικιλόθερμα ζώα, η θερμοκρασία έχει καθοριστική επίδραση στην ανάπτυξη πληθυσμών τους και επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την αφθονία των ειδών και την γεωγραφική κατανομή τους. Η θερμοκρασία ποικίλλει ανάλογα με τη διάρκεια της ημέρας και την εποχή. Οι πληθυσμοί εντόμων συχνά εκτίθενται σε θερμοκρασιακή καταπόνηση δηλαδή σε ακραίες για την επιβίωση των ατόμων θερμοκρασίες. Η ικανότητα των εντόμων να προσαρμοστούν και να ανεχτούν τέτοιες καταστάσεις είναι ζωτικής σημασίας για την διατήρηση των πληθυσμών και την επιβίωση των ατόμων. Στις εύκρατες χώρες, τα είδη πρέπει να ανεχτούν τις χαμηλές θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια του χειμώνα, τις υψηλές θερμοκρασίες και την χαμηλή σχετική υγρασία το καλοκαίρι. Για τους παραπάνω λόγους έχουν αναπτύξει μια ποικιλία προσαρμοστικών μηχανισμών όπως για παράδειγμα την εμφάνιση διάπαυσης, παραγωγή των αντιψυκτικών ουσιών, πρωτεϊνών θερμικής καταπόνησης (hsp) και άλλων μηχανισμών. 2.1.1 Επιδράσεις των χαμηλών και υψηλών θερμοκρασιών στον δάκο της ελιάς Οι υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες έχουν επίδραση στην επιβίωση των ενήλικων και ανήλικων ατόμων καθώς στην ωοπαραγωγή και την μακροζωία των θηλυκών ατόμων του δάκου της ελιάς (Koveos, 2001; Pappas et al., 2011). Οι επιδράσεις αυτές των υψηλών και χαμηλών θερμοκρασιών, ιδιαίτερα στα ενήλικα άτομα, μπορεί να επηρεάζονται από προηγούμενη έκθεση σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες (εγκλιματισμό) (Pappas et al., 2011). Οι Fletcher et al., (1978) αναφέρουν ότι κατά την διάρκεια των καλοκαιρινών μηνών, η υψηλή θερμοκρασία και η χαμηλή σχετική υγρασία σε συνδυασμό με την έλλειψη ελαιοκάρπου, 27

εμποδίζουν την ωρίμανση (ανάπτυξη) των ωαρίων στα θηλυκά άτομα του δάκου της ελιάς. 2.1.2 Μηχανισμοί αντοχής των εντόμων σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες. 2.1.2.1 Μηχανισμοί αντοχής σε χαμηλές θερμοκρασίες Τα αρθρόποδα έχουν δύο γενικές στρατηγικές για να επιβιώσουν σε χαμηλές θερμοκρασίες, η πρώτη είναι η ανοχή στον σχηματισμό πάγου στους ιστούς του σώματος (freeze tolerance) και η δεύτερη, η αποφυγή σχηματισμού πάγου στους ιστούς του (freeze intolerance or avoidance) (Κoveos, 2001). Στον πρώτο μηχανισμό (freeze tolerance) τα έντομα ανέχονται την ύπαρξη εξωκυτταρικού πάγου στους ιστούς τους, γεγονός το οποίο επιτυγχάνεται με παρουσία παγοπυρηνοποιητικών ουσιών στην αιμόλεμφο τους (πολυαλκοόλες). Οι ουσίες αυτές προκαλούν έναρξη του παγώματος σε σχετικά υψηλότερες υπό το μηδέν θερμοκρασίες. Το πάγωμα συνεχίζεται με την πτώση της θερμοκρασίας, συνεπώς είναι βαθμιαίο και επιτρέπει την επιβίωση του εντόμου (Τζανακάκης, 1995). Το φθινόπωρο και στις αρχές του χειμώνα συνθέτουν παγοπυρηνοποιητικές ουσίες στην αιμόλεμφο προκαλώντας δημιουργία πάγου στους μεσοκυττάριους χώρους σε θερμοκρασίες άνω των 10 C. Μόλις δημιουργηθεί ο πάγος, το νερό κινείται προοδευτικά έξω από τα κύτταρα δια μέσου της κυτταρικής μεμβράνης για να επέλθει η ωσμωτική ισορροπία (αφυδάτωση κυττάρων), αποφεύγοντας την ενδοκυτταρική δημιουργία πάγου, η οποία μπορεί να επιφέρει τον θάνατο. Το χειμώνα τα έντομα συσσωρεύουν πολύ-υδροξυ-αλκοόλες και σάκχαρα, μεταξύ των οποίων η γλυκερόλη είναι η πιο κοινή και άφθονη. Άλλες πολύ-υδροξυ-αλκοόλες είναι η σορβιτόλη, η θρεϊτόλη, η ερυθριόλη και τα σάκχαρα φρουκτόζη, σακχαρόζη και τρεαλόζη. Οι κρυοπροστατευτικές αυτές ουσίες προστατεύουν το έντομο με αύξηση της ικανότητας αυτών των ουσιών να δεσμεύουν μόρια νερού, μειώνοντας έτσι το ποσοστό της δημιουργίας πάγου και την συνολική περιεκτικότητα του πάγου. Επίσης αυτές οι ουσίες έχουν την ικανότητα να σταθεροποιούν την δομή των πρωτεϊνών και να απομονώνουν τους ηλεκτρολύτες ή να μειώνουν την ροή νερού μέσω των μεμβρανών και τη διατήρηση του όγκου των κυττάρων πάνω από την κρίσιμη ελάχιστη (Bale, 2002 και οι αναφορές που δίνει). 28