Στην συνέχεια ευχαριστούμε θερμά τον Αναπληρωτή καθηγητή κ. Δρόσο Κουτσούμπα για την συμμετοχή του στην τριμελή εξεταστική επιτροπή.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Αρχικά θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Επίκουρο καθηγητή του τμήματος Επιστημών της Θάλασσας κ. Β. Μπακόπουλο για τις πολύτιμες συμβουλές του, το χρόνο που ξόδεψε και το ενδιαφέρον που έδειξε για την εκπόνηση της παρούσας εργασίας. Επίσης θα θέλαμε να εκφράσουμε τις ευχαριστίες μας στην Επίκουρη καθηγήτρια του τμήματος Επιστημών της Θάλασσας κ. Μ. Καραντανέλλη, την κ. Ν. Αλεξίου και τον κ. Α. Πέτσα για τη βοήθειά τους στα πρωταρχικά στάδια της έρευνας αυτής. Στην συνέχεια ευχαριστούμε θερμά τον Αναπληρωτή καθηγητή κ. Δρόσο Κουτσούμπα για την συμμετοχή του στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Τέλος ευχαριστούμε ιδιαιτέρως τις οικογένειες και τους φίλους μας για την συμπαράσταση, την υπομονή και πολύτιμη βοήθεια όλων αυτών τον χρόνων. 1

ABSTRACT The aim of this study was to determine the bacterial load in the tank water, the food and the water supply at a larvae hatchery. It was also studied the resistance to various antibiotics used commonly in aquaculture. Samples were collected from two different tanks, from each food which was used and from the water supply. The results showed that the bacterial numbers differed in different larval stages and the bacterial load depends on the live feed. A total of 11 bacterial isolates isolated from tank water, water supply and live feed, were examined for their resistance to five antibiotics. Most of the microorganisms were characterized as sensitive to most of these antibiotics. 2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η μελέτη του μικροβιακού φορτίου στις δεξαμενές ανάθρεψης των νυμφών σε εγκατάσταση εκκολαπτηρίου αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την ανάπτυξη των νυμφών και την καταλληλότητα του περιβάλλοντος τους. Στα πλαίσια της παρούσης εργασίας γίνεται καταμέτρηση του βακτηριακού φορτίου στην παροχή νερού, τις τροφές και το νερό των δεξαμενών, της προέλευσης των μικροοργανισμών καθώς και της αντιβιοανθεκτικότητας τους. Πραγματοποιηθήκαν 7 δειγματοληψίες από 2 διαφορετικές δεξαμενές ανάθρεψης, από τις ζωντανές και την τεχνητή τροφή. Από την ανάλυση των δειγμάτων προέκυψαν 11 καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών, οι οποίες αντιπροσώπευαν την γενική εικόνα του μικροβιακού φορτίου όλων των δειγματοληψιών, ώστε να γίνει μια προσέγγιση της προέλευσης αυτών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το μικροβιακό φορτίο που προέκυψε, προέρχεται από τις εισροές στις δεξαμενές (εισροή νερού, τροφές). Στην συνέχεια ελέγχθηκε η ανθεκτικότητα τους σε κοινά αντιβιοτικά για την πιθανή αντιβιοανθεκτικότητα που θα μπορούσε να μεταφερθεί σε παθογόνους μικροοργανισμούς των ψαριών, όπου η πλειοψηφία των μικροοργανισμών παρουσίασε αρκετή ευαισθησία στα αντιβιοτικά. Παρατηρήθηκε έντονο μικροβιακό φορτίο στις δεξαμενές της ζωντανής τροφής (τροχόζωα, artemia) καθώς και του φυτοπλαγκτού το οποίο παρουσιάστηκε και στις δεξαμενές ανάθρεψης, το γεγονός αυτό οφείλεται στον εμπλουτισμό των τροχοζώων και της artemia καθώς και στο ότι το φυτοπλαγκτό βρισκόταν στο ζενίθ της αυξητικής του φάσης. 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Γενικά... 1.2 Υδατοκαλλιέργειες στην Ελλάδα... 1.3 Στάδια παραγωγής μιας ιχθυοκαλλιέργειας... 1.4 Διαδικασία ελέγχου... 1.5 Λειτουργία εκκολαπτηρίων... 1.6 Προβλήματα στα εκκολαπτήρια από μικροοργανισμούς... 1.7 Τρόποι αντιμετώπισης μικροοργανισμών στα εκκολαπτήρια... 1.8 Νομοθεσία υγειονομικού ελέγχου σε είδη υδατοκαλλιέργειας... 1.9 Σκοπός εργασίας... 2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2.1 Περιοχή μελέτης... 2.2 Δειγματοληψίες... 2.3 Επεξεργασία δειγμάτων- καλλιέργεια αποικιών... 2.4 Πειραματικά στάδια... 2.4.1 Χρώση Gram... 2.4.2 Κινητικότητα... 2.4.3 Παραγωγή οξειδάσης... 2.5 Αντιβιόγραμμα... 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 3.1 Καλλιέργεια αποικιών... 4

3.1.1 Καταμέτρηση... 3.1.2 Μεταβολή βακτηρίων ανά δειγματοληψία... 3.1.3 Καθαρές καλλιέργειες... 3.2 Αποτελέσματα χρώσης Gram, κινητικότητας και οξειδάσης.. 3.3 Αντιβιοτικά... 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 5

1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Γενικά Με τον όρο υδατοκαλλιέργειες εννοείται το σύνολο των δραστηριοτήτων που αποβλέπουν στην παραγωγή υδρόβιων ζωικών και φυτικών οργανισμών που καταναλώνονται ή χρησιμοποιούνται από τον άνθρωπο. Ως εκ τούτου οι υδατοκαλλιέργειες έχουν τους ίδιους στόχους με τη γεωργία, και κατά συνέπεια διέπονται από τις ίδιες βασικές αρχές. Η διαφορά έγκειται στο γεγονός ότι διεξάγονται σε ένα τελείως διαφορετικό περιβάλλον, δεδομένο που επηρεάζει τόσο την τεχνολογία όσο και την παραγωγική διαδικασία( Μ.Κεντούρη, Υδατοκαλλιέργειες Παγκόσμια Πρακτική και Αποδόσεις, 2008). Αρχικές μορφές υδατοκαλλιεργειών παρατηρούνται σε ευρήματα από την προϊστορική εποχή, ανά την υφήλιο. Με το πέρασμα των αιώνων οι τεχνικές μέθοδοι και η τεχνολογία για την εκτροφή θαλασσίων ειδών, είτε στο περιβάλλον τους είτε εκτός αυτού, αναπτύχθηκαν με ταχείς ρυθμούς καθώς πολλές παράκτιες περιοχές πλέον εξαρτιόντουσαν οικονομικά από την παραγωγή και πώληση διαφόρων ειδών οικονομικού ενδιαφέροντος. Βασικές μέθοδοι καλλιέργειας υδρόβιων οργανισμών παρατίθενται παρακάτω: Εκτατική υδατοκαλλιέργεια σε γλυκά ύδατα Υδατοκαλλιέργεια θαλασσίων ειδών σε εγκαταστάσεις ξηράς Εκτατική υδατοκαλλιέργεια σε υφάλμυρα ύδατα Εντατική υδατοκαλλιέργεια σε γλυκά ύδατα Θαλάσσια υδατοκαλλιέργεια σε κλωβό Οστρακοκαλλιέργεια (http://www.live-avles.gr/to_arthro_mas_idatokalliergeies.php) Κατά τη λειτουργία μιας μονάδας, οι συνθήκες καλλιέργειας των ειδών είναι ελεγχόμενες ώστε να μην προσβάλλονται από ασθένειες που θα έχει σαν αποτέλεσμα οικονομικές απώλειες. Παρόλα αυτά το νερό, όπου όλα τα είδη αναπτύσσονται, φέρει πλήθος μικροοργανισμών κάποιοι από τους οποίους μπορεί να είναι παθογόνοι. Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί προκαλούν ασθένειες οι οποίες κάποιες φορές θεραπεύονται με φάρμακα και προλαμβάνονται με εμβολιασμούς, ενώ άλλες φορές πολλαπλασιάζονται και οδηγούν στο θάνατο. Όταν όμως μεγάλος 6

πληθυσμός π.χ ψαριών σε μια ιχθυοκαλλιέργεια νοσήσει και δεν ανακάμψει, η εταιρεία έχει ζημία. 1.2 Υδατοκαλλιέργειες στην Ελλάδα Οι υδατοκαλλιέργειες σαν κλάδος παρουσίασε ταχεία ανάπτυξη τα τελευταία χρόνια τόσο σε ευρωπαϊκό όσο και σε εθνικό επίπεδο χάρη στην επιτυχή αντιμετώπιση κάποιων βιολογικών προβλημάτων που δεν επέτρεπαν την βιομηχανική εκτροφή ορισμένων μεγάλης εμπορικής σημασίας ψαριών. Με την εμφάνιση του κλάδου των υδατοκαλλιεργειών στη χώρα μας, και με την ραγδαία ανάπτυξή τους τα τελευταία χρόνια, έχει φτάσει η ιχθυοκαλλιέργεια να αντιπροσωπεύει το 50% της ευρωπαϊκής παραγωγής σε τσιπούρα και λαβράκι. Βέβαια το ποσοστό είναι αρκετά υψηλό λαμβάνοντας υπόψην ότι η συνολική παραχώρηση που έχει δοθεί στις εταιρείες ιχθυοκαλλιέργειας πανελλαδικά είναι μόλις 7,8 τετραγωνικά χλμ. (http://www.liveavles.gr/to_arthro_mas_idatokalliergeies.php) Η Ευρωπαική Ένωση από τη μεριά της επιδοτεί τις ιχθυοκαλλιέργειες που αναπτύσσονται στη χώρα μας καθώς στόχος της είναι η προώθηση του ανταγωνισμού με τις άλλες χώρες αλλά και η προβολή του τομέα αυτού καθώς δεν υπάρχει επαρκής ενημέρωση για τη λειτουργία τους. Αποτέλεσμα της άγνοιας, είναι πολύς κόσμος να θεωρεί πως τα ψάρια από τις ιχθυοκαλλιέργειες δεν πληρούν τους κανόνες υγιεινής καθώς δεν γνωρίζουν ότι πραγματοποιούνται όλοι οι απαραίτητοι έλεγχοι ώστε το προϊόν που φτάνει στον καταναλωτή να είναι απόλυτα ασφαλές για την υγεία του. (http://www.liveavles.gr/to_arthro_mas_idatokalliergeies.php) Επιπροσθέτως, πολλοί είναι εκείνοι οι οποίοι ισχυρίζονται πως οι τροφές που χρησιμοποιούνται για την εκτροφή των ψαριών παραμένουν στο θαλάσσιο περιβάλλον προκαλώντας ευτροφισμό. Οι υδατοκαλλιέργειες όμως, είναι από τις πλέον φιλικές προς το περιβάλλον πρακτικές παραγωγής προϊόντων διατροφής, όταν τηρούνται οι διεθνώς αναγνωρισμένοι κανόνες ορθής πρακτικής. Το σημαντικότερο γεγονός βέβαια, είναι ότι συμβάλλουν στη μείωση της υπεραλίευσης κάτι που η χώρα έχει ανάγκη καθώς το 90% των αποθεμάτων στη χώρα μας έχει αλιευθεί πέρα από τη μέγιστη βιώσιμη απόδοσή τους. (http://www.live-avles.gr/to_arthro_mas_idatokalliergeies.php 7

1.3 Στάδια παραγωγής μιας ιχθυοκαλλιέργειας Σε μια ολοκληρωμένη μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας, ακολουθούνται συγκεκριμένα στάδια εκτροφής ώστε το προϊόν να φτάσει στον καταναλωτή. Παρακάτω παρουσιάζονται συνοπτικά τα τρία στάδια παραγωγής: 1. Γονοκαλλιέργεια: παραγωγή γόνου μέχρι το βάρος αυτών να γίνει 2-3 γρ. Μπορεί να υπάρχουν ανεξάρτητες γονοκαλλιέργειες οι οποίες πωλούν το γόνο σε μονάδες ιχθυοκαλλιεργειών (πάχυνσης). 2. Καλλιέργεια- πάχυνση: η καλλιέργεια αυτή αφορά μονάδες οι οποίες ασχολούνται με την ανάπτυξη γόνου ώσπου να φτάσει το βάρος τους τα 300-350γρ ( εμπορεύσιμο βάρος) ή και παραπάνω ανάλογα με την πολιτική της εταιρείας. Το στάδιο αυτό λαμβάνει χώρα εντός της θάλασσας σε ειδικά κλουβιά με δίχτυα, ιχθυοκλωβούς. 3. Τυποποίηση και πωλήσεις: το στάδιο αυτό περιλαμβάνει την τυποποίηση, ψύξη, επεξεργασία, κατάψυξη και πώληση των ψαριών. Τα ψάρια κατατάσσονται σε κατηγορίες με διαφορετικές τιμές ανάλογα με το είδος τους και το μέγεθός τους. Σε όλα τα στάδια παραγωγής της εκάστοτε ιχθυοκαλλιέργειας, πραγματοποιούνται έλεγχοι από επιστημονικό προσωπικό σύμφωνα με της νομοθεσίας και τις προδιαγραφές της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Τέτοιοι έλεγχοι αφορούν την τροφή που χορηγείται, ο κατάλληλος εμπλουτισμός της για πιο ταχεία ανάπτυξη, αλλά και μικροβιολογικοί και χημικοί έλεγχοι οι οποίοι επιτρέπουν την πιστοποίηση ότι το προϊόν που παράγεται είναι απόλυτα ασφαλές και υγιεινό για το καταναλωτικό κοινό. 1.4 Διαδικασία ελέγχου Μια ιχθυοκαλλιέργεια θεωρείται επιχείρηση. Όπως λοιπόν σε κάθε επιχείρηση, έτσι και στις ιχθυοκαλλιέργειες υπάρχουν πρότυπα που θεσπίζουν τις ελάχιστες απαιτούμενες προδιαγραφές για την ορθή λειτουργία της. Τα πρότυπα αυτά εκδίδονται είτε από τον Διεθνή Οργανισμό Προτύπων ISO ή από την Ευρωπαϊκή Ένωση και επιμέρους εθνικούς φορείς προτύπων. Στην Ελλάδα αρμόδιος φορέας για την έκδοση των προτύπων είναι ο Ελληνικός Οργανισμός Τυποποίησης (ΕΛΟΤ). 8

Για μια επιχείρηση δεν αρκεί απλά να τηρεί τις σχετικές προδιαγραφές, αλλά να φέρει και το σχετικό πιστοποιητικό, το οποίο κατοχυρώνει και αποδεικνύει πως η επιχείρηση τηρεί τις θεσπισμένες και διεθνώς αποδεκτές προδιαγραφές. Το πιστοποιητικό ενός προτύπου απονέμεται σε μια επιχείρηση μετά από κατάλληλη επιθεώρησή της. Ο έλεγχος διενεργείται από ειδικά εξουσιοδοτημένους φορείς πιστοποίησης οι οποίοι αδειοδοτούνται και επιθεωρούνται από το κράτος. Οι φορείς πιστοποίησης ενδέχεται να είναι άλλοι δημόσιοι οργανισμοί ή ιδιωτικές εταιρείες. Η εφαρμογή και πιστοποίηση των προτύπων είναι άλλοτε υποχρεωτική βάση νομοθεσίας και άλλοτε εθελοντική. Πέρα από το γενικό πλάνο που έχει μια μονάδα σαν επιχείρηση, η λειτουργία της βασίζεται στις καθημερινές εργασίες. Είναι λοιπόν απαραίτητο να πραγματοποιούνται έλεγχοι όσον αφορά την τροφή, την ποιότητα του νερού που φιλοξενεί τους οργανισμούς, συντήρηση των εγκαταστάσεων και των οργάνων που χρησιμοποιούνται κλπ. Η συχνότητα εξαρτάται κυρίως από το είδος της εκτροφής(εντατική, ημιεντατική κλπ.). Η ποιότητα του νερού συγκεκριμένα, που θα μας απασχολήσει στην παρούσα εργασία, ελέγχεται με μικροβιολογικό και χημικό έλεγχο από επιστημονικό προσωπικό λαμβάνοντας δείγματα τα οποία εξετάζονται. Πιο συγκεκριμένα στο μικροβιολογικό έλεγχο, κύριο μέλημα στην εξέταση είναι να μην υπάρξουν παθογόνοι μικροοργανισμοί που θα μπορούσαν να προσβάλλουν τον πληθυσμό της καλλιέργειας. Στην περίπτωση βέβαια που ανιχνευθούν, λαμβάνονται τα κατάλληλα μέτρα για την αποτελεσματική θεραπεία τους. Κύριοι παθογόνοι μικροοργανισμοί που απαντώνται στις ιχθυοκαλλιέργειες είναι οι εξής: Vibrio, Photobacterium damsela subsp piscicida, Cytophaga/Flexibacter βακτήρια, Aeromonas και Gram θετικά βακτήρια. Μάλιστα, ενώ τα είδη του γένους Vibrio είναι αυτά που παρουσιάζουν μεγαλύτερα ποσοστά, τα P.damsela piscicida και Cytophaga/Flexibacter βακτήρια είναι αυτά που προκαλούν τη μεγαλύτερη θνησιμότητα ( Eddy and Jones, 2002). 9

1.5 Λειτουργία εκκολαπτηρίων Οι διαχειριστικές πρακτικές των εκκολαπτηρίων, ανεξάρτητα από το εκτρεφόμενο είδος, είναι παρόμοιες όσον αφορά τους κανόνες υγιεινής, τη διαχείριση των γεννητόρων, την αναπαραγωγή και τη φροντίδα κατά τη διάρκεια των νυμφικών σταδίων. Υπάρχουν όμως διαφορές στην τεχνολογία εκτροφής και το διαχειριστικό σχέδιο καθώς και εάν το εκτρεφόμενο ψάρι είναι του γλυκού, του υφάλμυρου ή του θαλασσινού νερού. Σε πολλά είδη ψαριών, μέσα σε αυτά και το λαβράκι( Dicentrarchus labrax), τα αυγά συλλέγονται από τις δεξαμενές ωοτοκίας και στη συνέχεια επωάζονται σε ειδικούς επωαστήρες ή μέσα στη δεξαμενή εκτροφής. Όσον αφορά την πρώτη διατροφή τους, τα περισσότερα εκτρεφόμενα θαλάσσια είδη ψαριών χρειάζονται στην αρχή της διατροφής τους, ζωντανούς πλαγκτονικούς οργανισμούς. Το μέγεθος της τροφής που μπορούν να καταναλώσουν εξαρτάται από τις διαστάσεις του στόματος των νυμφών. Το λαβράκι συγκεκριμένα μπορεί να καταναλώσει τροφή μεγέθους ίσου με 0,4 mm (Μ.Κεντούρη, Εκτροφή Ιχθύων-Εκκολαπτήρια, 2008). Οι πιο κοινές ζωντανές τροφές που χρησιμοποιούνται είναι τα τροχόζωα και η artemia. Βέβαια και οι τροφές αυτές παρουσιάζουν ελλείψεις κυρίως σε ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, απαραίτητα για τα νεαρά ψάρια, και για το λόγο αυτό πριν εισαχθούν στις δεξαμενές εκτροφής, εμπλουτίζονται με τα απαραίτητα στοιχεία. Σε γενικές γραμμές η χρήση ζωντανών τροφών πλεονεκτεί έναντι των βιομηχανικών τροφών. Αρχικά, το ζωοπλαγκτόν που χρησιμοποιείται ως ζωντανή τροφή, κολυμπά στη στήλη του νερού δίνοντας τη δυνατότητα στις νύμφες να τα καταναλώσουν πιο εύκολα. Αντίθετα οι βιομηχανικές τροφές συσσωρεύονται στην επιφάνεια και στη συνέχεια βυθίζονται στον πυθμένα των δεξαμενών καθιστώντας τη μη προσβάσιμη στα ψάρια. Επιπλέον, εφόσον τα ψάρια πρέπει να κυνηγούν την τροφή τους, τους δημιουργείται αυτό το αίσθημα από τη νεαρή τους ηλικία. Τέλος, η ζωντανή τροφή αποτελείται από λεπτό εξωσκελετό, μεγάλη περιεκτικότητα σε νερό (συνήθως > 80%) και είναι πιο εύγεστη και εύκολα να ληφθούν από το στόμα σε σχέση με την σκληρή ξηρά τροφή. Πάντα όμως από κάποια ηλικία και μετά η ζωντανή τροφή αντικαθίσταται από βιομηχανικές τροφές. Την περίοδο της 10

αλλαγής μάλιστα παρατηρείται υψηλή θνησιμότητα και έντονος κανιβαλισμός (Μ.Κεντούρη, Εκτροφή Ιχθύων-Εκκολαπτήρια, 2008). Σε κάθε εκκολαπτήριο, το σύστημα εκτροφής διαφέρει καθώς εξαρτάται από κάποιες παραμέτρους. Οι μέθοδοι παραγωγής λοιπόν, διαφοροποιούνται μεταξύ τους ανάλογα με : Την πυκνότητα εκτροφής Το μέσο εκτροφής Την προέλευση της τροφής Τον τύπο του περιβάλλοντος(νερού) Τον τύπο του κυκλώματος νερού (Μ.Κεντούρη, Εκτροφή Ιχθύων- Εκκολαπτήρια, 2008). 1.6 Προβλήματα στα εκκολαπτήρια από μικροοργανισμούς Οι παράγοντες που ευθύνονται κυρίως για την εμφάνιση αλλά και την ανάπτυξη μικροοργανισμών στις δεξαμενές των εκκολαπτηρίων είναι η παροχή του νερού, η ζωντανή τροφή που εισάγεται και το φυτοπλαγκτόν. Τα βακτήρια, είτε είναι παθογόνα ή όχι, αποτελούν κομμάτι της μικροχλωρίδας των θαλασσίων ψαριών. Στα εκκολαπτήρια όμως έχουν αποδειχθεί ως παράγοντες για ασθένειες και μαζικές θνησιμότητες καθώς το οργανικό υλικό στις δεξαμενές είναι αυξημένο με αποτέλεσμα τον ταχύ πολλαπλασιασμό ευκαιριακών παθογόνων βακτηρίων (Hansen and Olafsen,1989;Skjermo and Vadstein,1999). Το νερό που εισάγεται από τη θάλασσα στα εκκολαπτήρια μπορεί να περιέχει βακτήρια τα οποία να προσβάλλουν τις νύμφες που εκτρέφονται και να υπάρχει θνησιμότητα καθώς σε αυτό το στάδιο ζωής τους δεν έχουν ανεπτυγμένο ανοσοποιητικό σύστημα. Όσον αφορά το φυτοπλαγκτόν, κατά την καλλιέργειά του, υψηλό οργανικό φορτίο συσσωρεύεται διαρκώς το οποίο αποτελεί το υπόστρωμα για πολλαπλασιασμό βακτηρίων. Τα μικροφύκη και τα βακτήρια που αναπτύσσονται, βρίσκονται σε συνεχή αλληλεπίδραση όπου άλλοτε καταλήγει στον περιορισμό της ανάπτυξης των βακτηρίων και άλλοτε στη μειωμένη ανάπτυξη των μικροφυκών. Το αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων αυτών μπορεί να οφείλεται στην μέθοδο που ακολουθείται για την καλλιέργεια των μικροφυκών, στα είδη 11

καλλιέργειας, στα μέσα που χρησιμοποιούνται και στην ποιότητα του θαλασσινού νερού (Salvesen et al.,2009; Makridis et al. 2006). Επίσης, σε μια μη επιτυχημένη καλλιέργεια μικροφυκών, που χαρακτηρίζεται από μικρή ανάπτυξη και εκτεταμένη φάση υστέρησης, παρουσιάζεται αυξημένο ποσοστό βακτηρίων ( Nicolas et al. 1989; Salvesen et al. 2000). Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας των τροχοζώων και του εμπλουτισμού τους ευκαιριακά βακτήρια που παρουσιάζονται μπορεί να είναι καταστρεπτικά για την ανάπτυξη και επιβίωση των νυμφών (Skjermo & Vadstein 1999). Με την έκπλυση όμως των τροχοζώων πριν εισαχθούν στις δεξαμενές, ένα μεγάλο τμήμα του βακτηριακού φορτίου αφαιρείται. Το ίδιο συμβαίνει και κατά την εκκόλαψη της artemia με τη μόνη διαφορά ότι όταν έχει αφεθεί για εμπλουτισμό πάνω από 24h, τα βακτήρια με πλύσιμο είναι δύσκολο να αφαιρεθούν. Επίσης, το ποσοστό βακτηρίων που εντοπίζεται στην artemia, εξαρτάται και από το υλικό εμπλουτισμού. 1.7 Τρόποι αντιμετώπισης μικροοργανισμών στα εκκολαπτήρια Μαζί με την ανάπτυξη των υδατοκαλλιεργειών, εξελίχθηκε και ο επιστημονικός κλάδος που αφορά την αντιμετώπιση προβλημάτων και δυσλειτουργιών που παρουσιάζονται κατά την λειτουργία τους. Κύριο πρόβλημα, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, αποτελούν τα βακτήρια. Παρακάτω αναφέρονται κάποιοι τρόποι οι οποίοι έχουν εφαρμοσθεί και έχουν αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματικοί ως προς τον σκοπό τους. Αρχικά, το νερό που εισάγεται στις δεξαμενές περνάει από κάποια επεξεργασία ώστε να αφαιρεθεί το μεγαλύτερο ποσοστό βακτηρίων καθώς οι οργανισμοί που βρίσκονται στο νυμφικό στάδιο, είναι πιο ευαίσθητοι στο να νοσήσουν από ένα παθογόνο μικροοργανισμό. Η διήθηση είναι ένας τρόπος ο οποίος βέβαια μπορεί να είναι αποτελεσματικός, σύμφωνα με μελέτες, αλλά τα φίλτρα που χρησιμοποιούνται πρέπει να έχουν τα κατάλληλα χαρακτηριστικά (Dickenson, 1992). Επίσης, η χρήση ακτινοβολίας UV και όζοντος, έχουν αποδειχθεί πολύ καλά απολυμαντικά μέσα, μόνο που απαιτείται η χρήση εξειδικευμένου εξοπλισμού και η βαθμονόμησή του ώστε να λειτουργεί αποτελεσματικά (DeManche et al., 1975). 12

Ένας άλλος τρόπος απολύμανσης του νερού είναι η θέρμανσή του σε θερμοκρασίες παστερίωσης, και στη συνέχεια η ψύξη του σε θερμοκρασία κατάλληλη ώστε να καλλιεργηθούν οι νύμφες. Βέβαια αυτή η μέθοδος είναι πολυδάπανη για μεγάλους όγκους νερού (Wheaton, 1977). Τέλος, στο σύστημα ανακύκλωσης του νερού στις ιχθυοκαλλιέργειες έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζονται μεγαλύτεροι αριθμοί βακτηρίων αλλά υπάρχει σταθερή δομή όσον αφορά την ποικιλία βακτηρίων. Πολλές φορές μάλιστα είναι πιο σημαντική η κατάλληλη βιοκοινότητα των βακτηρίων για την καλή ανάπτυξη των νυμφών, παρά ο αριθμός τους, αρκεί και αυτός να μην είναι υπερβολικός (Munro et al.,1995; Verner-Jeffreys et al., 2004). Πιο έμμεσοι τρόποι είναι η χρήση αντιβιοτικών ώστε να εξαλειφθούν οι υπάρχοντες μικροοργανισμοί. Έχει παρατηρηθεί όμως πως δημιουργούνται στελέχη ανθεκτικά ως προς τα αντιβιοτικά με συνέπεια να αναπτύσσονται στο περιβάλλον των ψαριών δημιουργώντας προβλήματα στην ανάπτυξη ακόμα και στην επιβίωση των νυμφών ( Le Pennec and Prieur, 1977). Άλλες τεχνικές που εφαρμόζονται, σχετίζονται με τη στοχευμένη χρήση συγκεκριμένων μικροοργανισμών. Μια τεχνική είναι ο βιοέλεγχος, όπου τοποθετούνται αυτόχθονοι μικροοργανισμοί στις δεξαμενές, με αποτέλεσμα να καταστέλλουν την ανάπτυξη παθογόνων βακτηρίων στο περιβάλλον εκτροφής αφού έχει ήδη καταληφθεί ο διαθέσιμος χώρος (Nogami and Maeda,1992; Maeda, 1994; Riquelme et al., 1997). Άλλος τρόπος αντιμετώπισης είναι τα προβιοτικά. Τα προβιοτικά είναι μικροβιακά κύτταρα που χορηγούνται με τέτοιο τρόπο ώστε να εισέρχονται στο γαστρεντερικό σωλήνα, να παραμένουν ζωντανά, έτσι ώστε να βελτιώνουν την υγεία του ξενιστή ( Gatesoup, 1999). Τα τελευταία χρόνια η χρήση των προβιοτικών έχει γίνει πολύ δημοφιλής καθώς η ανθεκτικότητα που έχουν αποκτήσει τα βακτήρια στα αντιβιοτικά τα καθιστά μη χρήσιμα πλέον. Άλλωστε η χρήση προβιοτικών στον άνθρωπο έχει επιτυχία και το ίδιο έδειξαν έρευνες που πραγματοποιήθηκαν και σε υδατοκαλλιέργειες. Έτσι από τα πρώτα στάδια ανάπτυξης, χορηγούνται στις λάρβες προβιοτικά είτε μέσω της ζωντανής τροφής, είτε μέσω του νερού που καλλιεργούνται, ώστε να συνηθίζει το πεπτικό τους σύστημα και να βελτιώνεται η ανάπτυξή τους. 13

1.8 Νομοθεσία υγειονομικού ελέγχου σε είδη υδατοκαλλιέργειας Οδηγία 2006/88/ΕΚ του Συμβουλίου Ρυθμίζει κάθε διάθεση προϊόντος στην αγορά εντός κάθε κράτους μέλους, μεταξύ των διαφόρων κρατών μελών και τις εισαγωγές στην Ε.Ε. Αυτό σημαίνει ότι τα ζώα υδατοκαλλιέργειας και τα προϊόντα που προέρχονται τόσο από χώρες εντός της Ε.Ε. όσο και από τρίτες χώρες πρέπει να πληρούν σε γενικές γραμμές παρόμοιες απαιτήσεις για την υγεία των ζώων, προτού μπορούν να μετακινηθούν. Η βασική αρχή των κανονισμών αυτών είναι ότι τα ζώα υδατοκαλλιέργειας που προορίζονται για ένα κράτος μέλος, ζώνη ή διαμέρισμα που έχει χαρακτηρισθεί απαλλαγμένο ή βρίσκεται υπό την επιτήρηση ή έχει πρόγραμμα εξάλειψης όσον αφορά μια καταχωρημένη ασθένεια, πρέπει να προέρχονται από Τρίτη χώρα, κράτος μέλος, ζώνη ή διαμέρισμα που χαρακτηρίζεται ως απαλλαγμένη από ασθένειες εφόσον τα ζώα είναι ευαίσθητα ή μπορούν να λειτουργήσουν ως φορέας για την εν λόγω νόσο. Κατά συνέπεια εάν υπάρχει κίνηση η οποία είναι σύμφωνα με τους κανόνες υγιεινής των ζώων για διάθεση στην αγορά/εισαγωγή, θα καθορίζεται κυρίως από τους εξής παράγοντες: Η κατάσταση της υγείας στον τόπο προορισμού όσον αφορά τις ασθένειες που αναφέρονται στο μέρος II του παραρτήματος IV της οδηγίας. Το σχετικό ζήτημα θα είναι αν ο τόπος προορισμού έχει χαρακτηρισθεί ως απαλλαγμένο από ή είναι υπό τη επιτήρηση ή βρίσκεται σε πρόγραμμα εκρίζωσης. Τα εν λόγω είδη. Το σχετικό ζήτημα θα είναι αν τα ζώα της αποστολής είναι ευαίσθητα ή θεωρούνται ως είδη-φορείς για τις ασθένειες που αναφέρονται στο μέρος II του παραρτήματος IV της οδηγίας. Η κατάσταση της υγείας στον τόπο καταγωγής. Οδηγία 2008/53/ΕΚ της Επιτροπής της Ε.Ε. Αφορά την τροποποίηση της Οδηγίας 2006/88/ΕΚ όσον αφορά την εαρινή ιαιμία του κυπρίνου. 14

Εκτελεστική Οδηγία 2012/31/ΕΚ Δημιουργήθηκε για την τροποποίηση του παραρτήματος IV της οδηγίας 2006/88/ΕΚ του Συμβουλίου σχετικά με τον κατάλογο με τα είδη ψαριών που είναι ευπαθή στην ιογενή αιμορραγική σηψαιμία και για την απάλειψη της εγγραφής για το επιζωοτικό ελκογόνο σύνδρομο. 1.9 Σκοπός εργασίας Ο σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν ο μικροβιολογικός έλεγχος του νερού στις δεξαμενές ανάθρεψης των νυμφών σε εγκατάσταση εκκολαπτηρίου της εταιρίας SELONDA στην περιοχή Λουτρών Λέσβου. Πιο συγκεκριμένα να μελετηθεί το βακτηριακό φορτίο στην παροχή νερού, τις τροφές και το νερό των δεξαμενών ανάλογα με τις συνθήκες που επικρατούσαν σε κάθε δειγματοληψία. Επίσης, να διεξαχθούν βασικές μικροβιολογικές αναλύσεις, και να διερευνηθεί η πιθανή προέλευση των μικροοργανισμών. Τέλος, να γίνει έλεγχος της ευαισθησίας των μικροοργανισμών που απομονώθηκαν σε κοινά αντιβιοτικά και αναφορά σε πιθανή υποβόσκουσα αντιβιοανθεκτικότητα που θα μπορούσε να μεταφερθεί σε παθογόνους μικροοργανισμούς των ψαριών. 15

2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2.1 Περιοχή μελέτης Η διεξαγωγή των δειγματοληψιών πραγματοποιήθηκε στην περιοχή των Λουτρών Λέσβου, στο εκκολαπτήριο της εταιρίας Selonda. 2.1.α. Σύστημα εκτροφής νυμφών Το σύστημα, που εφαρμόζεται στη μονάδα αυτή ονομάζεται "Βluewater Recirculation System και αποτελεί μία διαφορετική προσέγγιση της ιχθυοκαλλιέργειας διότι: όλη η διαδικασία της εκτροφής των ψαριών πραγματοποιείται σε χερσαίες εγκαταστάσεις και επομένως τα υποπροϊόντα της εκτροφής δεν έρχονται σε επαφή με το θαλάσσιο περιβάλλον, τα υποπροϊόντα αυτά με ειδική επεξεργασία συμπυκνώνονται και επανεπεξεργάζονται πριν την απελευθέρωσή τους, με αποτέλεσμα τα (ούτως ή άλλως οργανικά) «απόβλητα» της μονάδας να έχουν πολύ χαμηλότερη συγκέντρωση σε ουσίες που επιβαρύνουν το περιβάλλον, λόγω της ανακύκλωσης παρέχεται η δυνατότητα πλήρους αποστείρωσης του εισερχόμενου θαλασσινού νερού, με αποτέλεσμα την ανυπαρξία ασθενειών και κατ επέκταση της ανάγκης χρήσης φαρμάκων και χημικών Η συγκεκριμένη εταιρεία διαθέτει επίσης τις εξής πιστοποιήσεις: ISO 22000 Σύστημα διαχείρισης ασφάλειας τροφίμων. ISO 9001 Σύστημα διαχείρισης ποιότητας. ISO14001 Σύστημα περιβαλλοντικής διαχείρισης. OHSAS 18001 Σύστημα διαχείρισης της υγείας και ασφάλειας στην εργασία. Κατά την διαδικασία της εκκόλαψης των νυμφών τηρείται ένα πρωτόκολλο λειτουργιών για την ορθή ανάπτυξη των λαρβών ακολουθώντας τις παραπάνω πιστοποιήσεις. Αυτό το μοτίβο βασίζεται σε συγκεκριμένες παραμέτρους και τις αντίστοιχες τιμές τους: Θερμοκρασία (15-20 C) Παροχή (1,8-8%,αντιστοιχεί στο ποσοστό ανανέωσης του νερού ανα ώρα) ph (7-7.5) Φως (μηδενικό έως και πολύ χαμηλό μέχρι την τελευταία μέρα τις εκκόλαψης) Αλατότητα (30-32) 16

2.2 Δειγματοληψίες Πραγματοποιήθηκαν 7 δειγματοληψίες σε διάστημα 4 εβδομάδων από τις 20/03/2012 έως τις 24/04/2012 από την 12 η μέρα εκκόλαψης των νυμφών έως την 45 η ημέρα (ημέρα μεταφοράς στις εξωτερικές δεξαμενές) οι οποίες επικεντρώθηκαν στις περιόδους εκείνες που συνέβαινε κάποια νέα παρέμβαση πάνω στην εκτροφή του (π.χ. εισαγωγή artemia, τεχνητής τροφής). Η πρώτη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε 20/03 την 7 η ημέρα της ζωής των νυμφών όπου είχαν είδη τοποθετηθεί στις δεξαμενές εκκόλαψης, η δεύτερη την 13 η ήμερα της εκκόλαψης, η τρίτη την 19 η, η τέταρτη την 25 η, η πέμπτη την 31 η, η έκτη την 38 η και η έβδομη δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε 23/04 την τελευταία μέρα της διαμονής των ιχθύων (45 η ) στις δεξαμενές εκκόλαψης, πριν την μεταφορά τους στις εξωτερικές δεξαμενές για την πλήρη ανάπτυξη τους, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 2.1 Οι δειγματοληψίες έγιναν σε όσο το δυνατό άσηπτες συνθήκες με αποστειρωμένα φιαλίδια και χρήση αντισηπτικού υγρού. Σε κάθε δειγματοληψία υπήρχαν τουλάχιστον 5 δείγματα, κάθε δείγμα ήταν των 100ml ύδατος και λαμβάνονταν από την παροχή δύο συγκεκριμένων δεξαμενών, από νερό των δεξαμενών ανάθρεψης (Δ6 και Δ10), και από τον εκάστοτε παράγοντα (φυτοπλαγκτόν, τροχόζωα, artemia και τεχνητή τροφή) ανάλογα με το τι είδους τροφή χορηγούνταν. Όλα τα δείγματα πάρθηκαν ακριβώς μέσα από τις δεξαμενές μέσα από ειδικό φίλτρο (εσωτερικά τις δεξαμενής) που υπάρχει ώστε να μην επηρεαστούν από τις δειγματοληψίες αυτές οι νύμφες. Τα δείγματα μεταφέρονταν στο εργαστήριο για την επεξεργασία τους μέσα σε πάγο σε διάστημα λιγότερο των 2 ωρών. Ο πίνακας 2.1. παρουσιάζει το πλάνο δειγματοληψιών και τα σημεία από όπου ελήφθησαν τα δείγματα. 17

Πίνακας 2.1: Πλάνο δειγματοληψιών Δείγμα Δειγματοληψία- Ημερομηνια 1 ο 2 ο 3 ο 4 ο 5 ο 6 ο 7 ο 20/03/12 Παροχή Δ6 Δ10 Φυτοπλαγκτόν Τροχόζωα 23/03/12 Παροχή Δ6 Δ10 Φυτοπλαγκτόν Τροχόζωα 26/03/12 Παροχή Δ6 Δ10 Φυτοπλαγκτόν Τροχόζωα Artemia 29/03/12 Παροχή Δ6 Δ10 Φυτοπλαγκτόν Τροχόζωα Artemia 05/04/12 Παροχή Δ6 Δ10 Φυτοπλαγκτόν Τροχόζωα Artemia 10/04/12 Παροχή Δ6 Δ10 Artemia 23/04/12 Παροχή Δ6 Δ10 Artemia Τροφή Εικόνα 2. 1 Καλλιέργεια φυτοπλαγκτό και τροχόζωων Το φυτοπλαγκτό και τα τροχόζωα καλλιεργούνται σε ξεχωριστες δεξαμενές με την χρήση αποχλωριωμένου νερού. Γίνονται συχνές αραιώσεις (οι οποίες δεν είναι σταθερές κάθε φορά) και στην συνέχεια εισέρχονται στις δεξαμενές εκκόλαψης. εκκόλαψης υπάρχει η εισαγωγή τους στις δεξαμενές. Η εισαγωγή του φυτοπλαγκτού αποσκοπεί στην κατανάλωση του από τα τροχόζωα (τροφική αλυσίδα).από την 7 η έως και την 35 η περίπου ημέρα τις Η αρχική μορφή της artemia είναι σε αυγά, όπου με ειδική επεξεργασία σε δεξαμενές γίνεται η εκκόλαψη τους με μικρά και μεγάλα άτομα, και στην συνέχεια η μεταφορά τους στις δεξαμενές των νυμφών. Η εισαγωγή της artemia πραγματοποιείτε την 14 η 15 η μέρα τις εκκόλαψης. Εικόνα 2. 3 Καλλιέργεια artemia Εικόνα 2. 2 Τεχνητή τροφή Η τεχνητή τροφή που χρησιμοποιείται στις εγκαταστάσεις τις εταιρίας SELONDA είναι η Caviar, σε μορφή λεπτών κόκκων, η διάμετρος 18

των κόκκων χωρίζεται σε τρείς κατηγορίες 100-200μm, 200-300μm και 300-500μm (όπου είναι και η τροφή που μελετήσαμε). Η εισαγωγή της στις δεξαμενές εκκόλαψης πραγματοποιείται την 25 η ημέρα των νυμφών μέχρι και το πέρας τις εκκόλαψης και την μεταφορά τους στις εξωτερικές δεξαμενές. 2.3 Επεξεργασία δειγμάτων- Καλλιέργεια αποικιών Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε ψυγείο σε θερμοκρασία 4 C εντός 40-60min στο εργαστήριο υδατοκαλλιεργειών και ιχθυοπαθολογίας του Τμήματος Επιστημών της Θάλασσας. Στη συνέχεια διηθήθηκαν κάτω από άσηπτες συνθήκες με διηθητικό χαρτί και τοποθετήθηκαν σε σωλήνες φυγοκέντρησης των 50ml (100ml ανά δείγμα). Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 20min επί τρείς φορές σε 1800 στροφές το λεπτό, εναλλάξ ώστε να τοποθετούνται στο ψυγείο για να διατηρείται η θερμοκρασία τους χωρίς να υπερθερμανθούν. Με το πέρας τις φυγοκέντρησης απορρίφθηκε το υπερκείμενο υγρό και διαλυτοποιήθηκε το υποκείμενο ίζημα με αποστειρωμένο 2%NaCl. Η διαλυτοποίηση του ιζήματος ακολουθήθηκε από διαδοχικές αραιώσεις των δειγμάτων με το τελευταίο διάλυμα, για την επίτευξη της καταμέτρησης μικροοργανισμών. Με πιπέτα ακριβείας τοποθετήθηκε 1ml διαλύματος σε τρυβλίο petri με TSA 2%NaCl. Με αποστειρωμένη υάλινη ράβδο απλώθηκε ποσότητα 1ml στο τρυβλίο ώστε να αναπτυχθούν οι αποικίες. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 22 C για 48 ώρες και κατόπιν οι αποικίες που είχαν αναπτυχθεί καταμετρήθηκαν. Από κάθε δειγματοληψία και κάθε δείγμα ξεχωριστά δημιουργήθηκαν καθαρές καλλιέργειες, ώστε να μπορέσουν να προσδιοριστούν οι αποικίες. Τέλος με το πέρας των δειγματοληψιών από τις 7 δειγματοληψίες επιλέχθηκαν 4 στις οποίες υπήρχε μεταβατικό στάδιο στις διαδικασία της εκτροφής των εκκολαπτόμενων λαυρακιών. 19

Από τις τέσσερις αυτές δειγματοληψίες πάρθηκαν καθαρές καλλιέργειες για την διεκπεραίωση των πειραματικών σταδίων που σκοπό έχουν τον προσδιορισμό των αποικιών. Η επιλογή ήταν αντιπροσωπευτική για κάθε αποικία που αναπτύχθηκε κατά την διάρκεια όλων των δειγματοληψιών. Στην πρώτη δειγματοληψία επιλέχθηκαν 3 καθαρές καλλιέργειες, στην τρίτη 2, στην έκτη 3 και από την έβδομη 1. 2.4. Πειραματικά στάδια Για τον προσδιορισμό των αποικιών ακολουθήθηκαν μια σειρά πειραματικών μετρήσεων οι οποίες ήταν οι εξής: χρώση Gram, κινητικότητα και οξειδάση. 2.4.1. Χρώση Gram (Gram stain) Ονομάζεται μια απλή μέθοδος η οποία κατατάσσει τα είδη των βακτηρίων σε δύο μεγάλες ομάδες, τα Gram (+) και τα Gram(-). Η μέθοδος οφείλει το όνομά της στον Δανό ερευνητή βακτηριολόγο Χανς Κρίστιαν Γιόαχιμ Γκραμ (Hans Christian Joachim Gram, 1853-1938). Στην Gram (+) τα βακτήρια διατηρούν το μπλε-ιώδες χρώμα της πρώτης χρώσης, ενώ στην Gram (-) λαμβάνουν ερυθρό χρώμα οφειλόμενο στη δεύτερη χρώση. Η διαφορά αυτή οφείλεται στη χημική σύσταση του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων και ιδιαίτερα στην ύπαρξη ή μη πεπτιδογλυκάνης. 2.4.2. Κινητικότητα Πραγματοποιήθηκε η μέθοδος της «εκκρεμούς» σταγόνας. Σε μια καλυπτρίδα προστέθηκε μια σταγόνα από το διάλυμά μας (μικροοργανισμοί και 2 % NaCl). Τοποθετείται στις γωνίες τις καλυπτρίδας μικρή ποσότητα βαζελίνης ώστε να δημιουργήσει στηρίγματα με την αντικειμενοφόρο και παρατηρούμε στο μικροσκόπιο την κινητικότητα. Τα δείγματα παρατηρήθηκαν αρχικά με μικρή μεγέθυνση στο κέντρο της σταγόνας και στην συνέχεια σε μεγέθυνση 40x για την ακριβή παρατήρηση της κίνησης. 20

2.4.3. Παραγωγή οξειδάσης Είναι ένα τεστ ώστε να διαπιστωθεί αν τα βακτήρια παραγάγουν cytochrome c οξειδάση. Το τεστ λειτουργεί σαν τεχνητός δότης ηλεκτρονίων για την παραγωγή οξειδάσης, πραγματοποιείται με ταινίες εμποτισμένες σε ειδικά αντιδραστήρια, κατά τις οποίες όταν η ταινία επικαλυφτεί με τον μικροοργανισμό η αλλαγή χρώματος της ταινίας υποδηλώνει την παραγωγή οξειδάσης. Στο εργαστήριο χρησιμοποιήθηκαν oxidase strips της εταιρίας Fluka Analytical. Εικόνα 2. 4 strips οξειδάσης 2.5 Αντιβιόγραμμα Η συνηθέστερη μέθοδος για την παρατήρηση της αντίδρασης των μικροοργανισμών στα αντιβιοτικά είναι η χρήση εμποτισμένων δίσκων. Στο εργαστήριο επικαλύφθηκαν μικροοργανισμοί πάνω σε θρεπτικό υπόστρωμα Muller-Ηinton με προσθήκη 2% NaCl και στην συνέχεια τοποθετήθηκαν 5 αντιβιοτικοί δίσκοι. Οι οργανισμοί επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου 22-23 C για δυο ημέρες, παρατηρήθηκε η ανάπτυξη των μικροοργανισμών και η διακύμανση της απόστασης τους από τους αντιβιοτικούς δίσκους. Με τον τρόπο αυτό εξακριβώνεται ο βαθμός δραστικότητας των αντιβιοτικών στον εκάστοτε μικροοργανισμό. Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: 1. Όνομα: O129, κωδικός: 129/10 2. Όνομα: Flumequine, κωδικός: UB/30, ( Rikker Labs 1973) 3. Όνομα: Oxolinic acid, κωδικός OA/2, (Ιαπωνία 1970) 4. Όνομα: Ampicillin, κωδικός: AMP/10, (British company Beecham, 1961) 5. Όνομα: Oxytetracycline, κωδικός: OT/30, ( Robert B Woodward, 1950) Κάθε μικροοργανισμός αντιδρά διαφορετικά στο εκάστοτε αντιβιοτικό, οι διάμετροι που δημιουργούνται γύρω από τους δίσκους ποικίλουν. Η ανθεκτικότητα ή μη του εκάστοτε μικροοργανισμού εξαρτάται από την ζώνη αναστολής η οποία θα παρουσιαστεί αναλυτικότερα παρακάτω. 21

Οι μικροοργανισμοί θεωρήθηκαν ευαίσθητοι, ανθεκτικοί ή αρκετά ευαίσθητοι ανάλογα με το μέγεθος της διαμέτρου(σε cm) της ζώνης αναστολής ανάπτυξης γύρω από το δισκίο που είχε εμποτιστεί με αντιβιοτικό( Acar & Goldstein,1986), ως εξής: ανθεκτικοί όταν το μέγεθος της διαμέτρου ήταν < 0.6 cm, ευαίσθητοι όταν η διάμετρος κυμαινόταν μεταξύ 0.6-1.2 cm και αρκετά ευαίσθητοι όταν η διάμετρος ήταν > 1.2 cm. 22

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 3.1.1. ΚΑΤΑΜΕΤΡΗΣΗ Δείγματα από την παροχή νερού των δεξαμενών, από δύο επιλεγμένες δεξαμενές, καθώς και από τις εισροές που διενεργήθηκαν για την ανάπτυξη των νυμφών( φυτοπλαγκτόν, τροχόζωα, artemia και βιομηχανική τροφή), αναλύθηκαν μικροβιολογικά. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων παρουσιάζονται στους πίνακες 3.1-3.7. 1 η Δειγματοληψία ( 7 η ημέρα νυμφών) Στην πρώτη δειγματοληψία που πραγματοποιήθηκε οι νύμφες λαβρακίου βρίσκονταν στην 7 η ημέρα ζωής τους. Οι τροφές που εισάγονταν στις δεξαμενές για την ανάπτυξή τους ήταν φυτοπλαγκτόν και τροχόζωα, τα οποία εισάγονται από την 1 η έως και την 37 η ημέρα ζωής τους. Η θερμοκρασία των δεξαμενών εκείνη την ημέρα ήταν 15 C, η οποία παραμένει η ίδια από την 1 η -18 η ημέρα των νυμφών. Πίνακας 3. 1 Αριθμός και χαρακτηρισμός αποικιών ανά δείγμα. ΔΕΙΓΜΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ/L ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ 1ο (παροχή) 1000 Λεία, λευκή, στρογγυλή, διαμέτρου 7χιλιοστών 2ο (δεξαμενή 6) 1.051.000 Κίτρινη στρογγυλή Πορτοκαλί στρογγυλή 3ο (δεξαμενή 10) 3.564.000 Κίτρινη επίπεδη 4ο (φυτοπλαγκτόν) 33.000 Πορτοκαλί στρογγυλή Λευκή στρογγυλή 5ο (τροχόζωα) Κίτρινη, στρογγυλή 23

*όλοι οι μικροργανισμοί ειχαν μέγεθος διαμέτρου 2-3 χιλιοστά εκτος από καποιες μεμονομένες περιπτώσεις όπου σημειώθηκε η έντονη διαφοροποίηση. 2 η Δειγματοληψία ( 13 η ημέρα νυμφών) Κατά τη 2 η δειγματοληψία, οι νύμφες βρίσκονταν στην 13 η ημέρα ζωής τους και στη διατροφή τους δεν υπήρχε κάποια μεταβολή αλλά ούτε και στη θερμοκρασία. Πίνακας 3. 2 Αριθμός και χαρακτηρισμός αποικιών ανά δείγμα. ΔΕΙΓΜΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ/L ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ 1ο (παροχή) 4.000 Κίτρινη, στρογγυλή Λευκή, στρογγυλή Πορτοκαλί, στρογγυλή 2ο (δεξαμενή 6) 2.160.000 Κίτρινη, επίπεδη, στρογγυλή Λευκή, επίπεδη, στρογγυλή 3ο (δεξαμενή 10) 2.196.000 Κίτρινη,επίπεδη, στρογγυλή 4ο (φυτοπλαγκτόν) 555.000 Λευκή Πορτοκαλί 5ο (τροχόζωα) Κίτρινη Λευκή *όλοι οι μικροργανισμοί ειχαν μέγεθος διαμέτρου 2-3 χιλιοστά εκτος από καποιες μεμονομένες περιπτώσεις όπου σημειώθηκε η έντονη διαφοροποίηση. 24

3 η Δειγματοληψία (19 η ημέρα νυμφών) Στην 19 η ημέρα της ζωής των λαρβών, όπου πραγματοποιήθηκε και η 3 η δειγματοληψία, εκτός από φυτοπλαγκτόν και τροχόζωα που εισάγονταν, προστέθηκε και η artemia η οποία χρησιμοποιείται μέχρι και την 45 η ημέρα της ζωής των νυμφών. Την ίδια ημέρα μάλιστα η θερμοκρασία αυξήθηκε στους 15,5 C. Πίνακας 3. 3 Αριθμός και χαρακτηρισμός αποικιών ανά δείγμα. ΔΕΙΓΜΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ/L ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ 1ο (παροχή) 3.000 Λευκή, επίπεδη 2ο (δεξαμενή 6) 2.013.000 Κίτρινη, στρογγυλή Λευκή, στρογγυλή 3ο (δεξαμενή 10) 2.113.000 Λευκή, στρογγυλή 4ο (τροχόζωα) Ανοιχτόχρωμη, διάμετρος 1 χιλιοστό 5ο (φυτοπλαγκτόν) 938.000 Σκούρα πορτοκαλί ρέουσα Ανοιχτόχρωμη, στρογγυλή, διάμετρος 1 χιλιοστό 6ο (artemia) Ανοιχτόχρωμη, διάμετρος 1χιλιοστό *όλοι οι μικροργανισμοί ειχαν μέγεθος διαμέτρου 2-3 χιλιοστά εκτος από καποιες μεμονομένες περιπτώσεις όπου σημειώθηκε η έντονη διαφοροποίηση. 25

4 η Δειγματοληψία ( 25 η ημέρα νυμφών) Στην 4 η δειγματοληψία, η μόνη μεταβολή που πραγματοποιήθηκε ήταν η αλλαγή της θερμοκρασίας που βρισκόταν στους 17 C. Μεσολάβησαν κάποιες αυξήσεις στη θερμοκρασία καθώς την 20 η -21 η ημέρα η θερμοκρασία βρισκόταν στου 16 C και την 22 η -23 η ημέρα στους 16,5 C. Στους 17 C παρέμειναν οι δεξαμενές στην 24 η -25 η ημέρα. Πίνακας 3. 4 Αριθμός και χαρακτηρισμός αποικιών ανά δείγμα. ΔΕΙΓΜΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ/L ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ 1ο (παροχή) 5.000 Πορτοκαλί, στρογγυλή 2ο (δεξαμενή 6) 432.000 Κίτρινη Πορτοκαλί 3ο (δεξαμενή 10) 1.809.000 Κίτρινη, στρογγυλή Λευκή Καφέ ρέουσα 4ο (φυτοπλαγκτόν) 2.450.000 Λευκή, στρογγυλή ρέουσα 5ο (τροχόζωα) Ανοιχτόχρωμη, επίπεδη, διάμετρος 1 χιλιοστό 6ο (artemia) Ανοιχτόχρωμη, επίπεδη, διάμετρος 1 χιλιοστό *όλοι οι μικροργανισμοί ειχαν μέγεθος διαμέτρου 2-3 χιλιοστά εκτος από καποιες μεμονομένες περιπτώσεις όπου σημειώθηκε η έντονη διαφοροποίηση. 26

5 η Δειγματοληψία ( 31 η ημέρα νυμφών) Στην 5 η δειγματοληψία οι τροφές παρέμεναν στα ίδια δεδομένα, ενώ η θερμοκρασία είχε φτάσει πλέον τους 19 C. Την 26 η -27 η ημέρα αυξήθηκε στους 17,5 C και την 28 η -29 η ημέρα στους 18 C. Στους 19 C η θερμοκρασία βρισκόταν την 30 η -31 η ημέρα. Πίνακας 3. 5 Αριθμός και χαρακτηρισμός αποικιών ανά δείγμα. ΔΕΙΓΜΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ/L ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ 1ο (παροχή) 12.000 Λευκή, επίπεδη 2ο (δεξαμενή 6) 176.000 Κίτρινη 3ο (δεξαμενή 10) 129.000 Κίτρινη,στρογγυλή 4ο (τροχόζωα) 17.000 Πορτοκαλί, στρογγυλή 5ο (φυτοπλαγκτόν) 113.000 Λευκή στρογγυλή, διάμετρος 5 χιλιοστά 2 έντονες πορτοκαλί 6ο (artemia) Λευκή *όλοι οι μικροργανισμοί ειχαν μέγεθος διαμέτρου 2-3 χιλιοστά εκτος από καποιες μεμονομένες περιπτώσεις όπου σημειώθηκε η έντονη διαφοροποίηση. 6 η Δειγματοληψία ( 38 η ημέρα νυμφών) Στην 6 η δειγματοληψία, όπως και φαίνεται και στον πίνακα, έχει αφαιρεθεί από την τροφή το φυτοπλαγκτόν και τα τροχόζωα και έχει μείνει μόνο η artemia. Επίσης, η θερμοκρασία αυξήθηκε στους 19,5 C η οποία είχε μεταβληθεί από την 32 η ημέρα ζωής των λαρβών και θα παρέμενε στο ύψος αυτό μέχρι τη 39 η ημέρα. 27

Πίνακας 3. 6 Αριθμός και χαρακτηρισμός αποικιών ανά δείγμα. ΔΕΙΓΜΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ/L ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ 1ο (παροχή) 18.000 Στρογγυλή, λευκή 2ο (δεξαμενή 6) 61.000 Κίτρινη, στρογγυλή Λευκή, στρογγυλή 3ο (δεξαμενή 10) 80.000 Πορτοκαλί Λευκή 4ο (artemia) 621.000 Λευκή *όλοι οι μικροργανισμοί ειχαν μέγεθος διαμέτρου 2-3 χιλιοστά εκτος από καποιες μεμονομένες περιπτώσεις όπου σημειώθηκε η έντονη διαφοροποίηση. 7 η Δειγματοληψία ( 45 η ημέρα νυμφών) Στην τελευταία δειγματοληψία εκτός από την artemia που παρέμενε ως τροφή, προστέθηκε βιομηχανοποιημένη τροφή. Όσον αφορά τη θερμοκρασία από την 40 η ημέρα έως την 45 η, που είναι και η τελευταία ημέρα παραμονής των ιχθυδίων στις δεξαμενές ανάπτυξης, έχει φτάσει τους 20 C. Πίνακας 3. 7 Αριθμός και χαρακτηρισμός αποικιών ανά δείγμα. ΔΕΙΓΜΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ/L ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΙΚΙΩΝ 1ο (παροχή) 0-2ο (δεξαμενή 6) 1.107.000 Σκούρα λευκή 3ο (δεξαμενή 10) 1.148.000 Σκούρα λευκή ρέουσα 4ο (artemia) 756.000 Λευκή 5ο (τροφή) Λευκή *όλοι οι μικροργανισμοί ειχαν μέγεθος διαμέτρου 2-3 χιλιοστά εκτος από καποιες μεμονομένες περιπτώσεις όπου σημειώθηκε η έντονη διαφοροποίηση. 28

3.1.2. ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΑΡΙΘΜΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΑΝΑ ML ΣΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΣ Παρακάτω παρουσιάζεται η μεταβολή του βακτηριακού φορτίου ανά ml στην παροχή, στις δύο δεξαμενές (Δ6 και Δ10), στο φυτοπλαγκτόν, τα τροχόζωα και την artemia, καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στο γράφημα 3.1 παρατίθενται η μεταβολή του βακτηριακού φορτίου ανά ml στις δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν. Γράφημα 3. 1 Μεταβολή βακτηριακού φορτίου/lt στις δειγματοληψίες παροχής. Όπως φαίνεται και στο γράφημα 3.1, τα βακτήρια στις δειγματοληψίες που αφορούν την 7 η -25 η ημέρα ανάπτυξης των νυμφών, έχουν κάποιες αυξομειώσεις, χωρίς να υπάρχει μεγάλη διακύμανση μεταξύ τους. Στην 38 η ημέρα όμως αρχίζει μια ταχεία αύξηση φτάνοντας στο μέγιστό της την 38 η ημέρα με αρκετά υψηλό αριθμό βακτηριακού φορτίου. Αντίθετα την τελευταία ημέρα (45 η ), το δείγμα νερού από την παροχή, είχε μηδενικό βακτηριακό φορτίο. 29

Γράφημα 3. 2 Δειγματοληψίες δεξαμενής Δ6, βακτήρια/lt. Φυτοπλαγκτόν, τροχόζωα, artemia arte mia artemia, τροφή Φυτοπλαγκτόν, τροχόζωα Στη δεξαμενή 6, όπως φαίνεται στο γράφημα 3.2, τα βακτήρια στην 1 η και 2 η δειγματοληψία παρουσιάζουν αύξηση, από την 3 η έως την 6 η παρατηρείται μείωση ενώ στην τελευταία δειγματοληψία παρατηρείται πάλι αύξηση. Όσον αφορά την τροφή, στην 1 η και 2 η δειγματοληψία, η τροφή που εισήχθηκε στις δεξαμενές ήταν τροχόζωα και φυτοπλαγκτόν. Στις επόμενες δειγματοληψίες έχει προστεθεί στη ζωντανή τροφή των λαρβών και η artemiα. Στην 6 η δειγματοληψία που πραγματοποιήθηκε, η μόνη ζωντανή τροφή που χρησιμοποιήθηκε ήταν η artemia όπου και παρατηρείται ο πιο χαμηλός αριθμός βακτηρίων. Τέλος, η βιομηχανική τροφή που έχει προστεθεί στο τέλος τείνει να αυξάνει τον αριθμό των καταμετρούμενων βακτηρίων. 30

Γράφημα 3. 3 Δειγματοληψίες δεξαμενής Δ10, βακτήρια/lt. Φυτοπλαγκτόν, τροχόζωα, artemia artemia, τροφή arte mia Φυτοπλαγκτόν, τροχόζωα Στη δεξαμενή 10, όπως φαίνεται στο γράφημα 3.3, παρατηρείται ότι στην 1 η δειγματοληψία ο αριθμός των βακτηρίων είναι ο τριπλάσιος περίπου από τη δεξαμενή 6. Από την 2 η έως και την 6 η δειγματοληψία όμως ακολουθείται το ίδιο μοτίβο μείωσης όπως και στην δεξαμενή 6. Επίσης, ο αριθμός των βακτηρίων κυμαίνεται περίπου στα ίδια επίπεδα στις δυο δεξαμενές, εκτός από την 4 η δειγματοληψία που είναι εμφανώς αυξημένος στην δεξαμενή 10. Παρόλα αυτά, είναι πιθανό οι αλλαγές στην ζωντανή τροφή και έπειτα στη βιομηχανοποιημένη, να προκαλούν αυξομειώσεις στο βακτηριακό φορτίο του νερού καλλιέργειας στις δεξαμενές. Να σημειωθεί στο σημείο αυτό ότι το πρόγραμμα διατροφής όπως και οι συνθήκες ανάπτυξης των λαρβών ήταν οι ίδιες και στις δύο δεξαμενές. 31

Γράφημα 3. 4 Δειγματοληψίες φυτοπλαγκτόν, βακτήρια/lt. Φυτοπλαγκτόν Το βακτηριακό φορτίο στο φυτοπλαγκτό παρουσιάζει διακυμάνσεις ανάλογα με την ημέρα ανάθρεψης, όπου υφίστανται διαφορετική αραίωση πριν εισαχθεί στις δεξαμενές με τις νύμφες. Τις πρώτες ημέρες ανάθρεψης τα μικροφύκη κυμαίνονται στα 150ml/δεξαμενή και όσο μεγαλώνουν οι νύμφες μειώνονται σταδιακά μέχρι τα 60ml. Παρατηρείται από το γράφημα 3.4, ότι το μικροβιακό φορτίο κατά την 25 η ημέρα παρουσίασε έντονη αύξηση σε αντίθεση με τις υπόλοιπες μέρες οι οποίες παρατηρούνται σε σχετικά κοινά επίπεδα. Πίνακας 3. 8 Δειγματοληψίες τροχοζώων, βακτήρια/lt. 1 η 2 η 3 η 4 η 5 η 17.000 Όπως φαίνεται και στον πίνακα 3.8, η ακριβής μέτρηση για τον αριθμό των βακτηρίων στα τροχόζωα δεν ήταν εφικτή. Πίνακας 3. 9 δειγματοληψίες artemia, βακτήρια/lt. 3 η 4 η 5 η 6 η 7 η 621.000 756.000 32

Στην artemia παρατηρείται από τον πίνακα 3.9 πως υπάρχουν αποτελέσματα παρόμοια με τα τροχόζωα. Κάποιες αναλύσεις δηλαδή δεν απέδωσαν συγκεκριμένο αριθμό βακτηρίων. Τα παραπάνω αποτελέσματα εκπίπτουν από όλο το διάστημα των δειγματοληψιών που έλαβαν χώρα στο διάστημα 20/03/12-23/04/12 3.1.3. ΚΑΘΑΡΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Στη συνέχεια της εργαστηριακής μελέτης των δειγμάτων επιλέχθηκαν συγκεκριμένες αποικίες μικροοργανισμών και πραγματοποιήθηκαν καθαρές καλλιέργειες για περαιτέρω μελέτη. Χαρακτηριστικό των καλλιεργειών των δειγμάτων ήταν ότι παρουσιάζονταν κοινές αποικίες μικροοργανισμών σε όλα τα δείγματα. Έτσι οι καθαρές καλλιέργειες που προέκυψαν προέρχονταν από τα πιο αντιπροσωπευτικά δείγματα. Σε δείγματα όπου η καλλιέργεια των μικροοργανισμών ήταν πολύ έντονη και δεν ήταν εύκολη η απομόνωση των μικροοργανισμών (π.χ. φυτοπλαγκτόν και τροχόζωα πρώτων δειγματοληψιών) πάρθηκε δείγμα από αντίστοιχες αντιπροσωπευτικές δειγματοληψίες. Οι αποικίες που παρατηρήθηκαν σε πληθώρα ήταν αυτές με λευκό και κίτρινο χρώμα ακολούθησαν αυτές με το πορτοκαλί και σε λιγότερη ποσότητα οι πιο σκούρες αποικίες (σκούρο πορτοκαλί-καφέ). Στον πίνακα 3.10 που ακολουθεί, παρουσιάζονται οι αποικίες που επιλέχθηκαν, απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε καθαρή μορφή. 33

Δείγμα 1ο μεγάλη, λεία, λευκή στρογγυλή αποικία 1η Δείγμα 3ο πορτοκαλί, στρογγυλή αποικία κίτρινη, στρογγυλή αποικία Δείγμα 4ο λευκή, στρογγυλή αποικία ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΕΣ 3η Δείγμα 2ο Δείγμα 5ο λευκή, στρογγυλή αποικία κίτρινη, στρογγυλή αποικία σκούρα πορτοκαλί αποικία που ρέει Δείγμα 1ο μεγάλη, στρογγυλή λευκή αποικία 6η Δείγμα 2ο πορτοκαλί αποικία Δείγμα 3ο κίτρινη, στρογγυλή αποικία 7η Δείγμα 2ο σκούρα λευκή αποικία Πίνακας 3. 10 Οι αποικίες που επιλέχθηκαν για καθαρές καλλιέργειες Ο λόγος που χρησιμοποιήθηκαν τα αποτελέσματα των δειγματοληψιών αυτών, ήταν κυρίως γιατί συμπεριλαμβάνονται όλα τα στάδια διατροφής των νυμφών λαβρακιού που εκτρέφονταν στα εκκολαπτήρια. Από αυτές τις δειγματοληψίες στη συνέχεια, κρατήθηκαν προς μελέτη έντεκα αποικίες οι οποίες παρουσίαζαν διαφορετικό χρώμα κ μέγεθος. Παρακάτω παρουσιάζονται οι φωτογραφίες των δειγμάτων που απομονώθηκαν σε καθαρές καλλιέργειες. 34

Εικόνα 3. 1 Μεγάλη, λεία, λευκή στρογγυλή αποικία 1 ης δειγματοληψίας 35

Εικόνα 3. 3 Σκούρα πορτοκαλί ρέουσα αποικία 3 ης δειγματοληψίας Εικόνα 3. 2 Μεγάλη στρογγυλή λευκή αποικία 6 ης δειγματοληψίας Εικόνα 3. 4 Πορτοκαλί αποικία 6 ης δειγματοληψίας 36

Στον πίνακα 3.11 παρουσιάζεται ο αριθμός που έχει αντιστοιχηθεί για κάθε εικόνα ξεχωριστά ώστε να είναι πιο εύκολη η μετέπειτα ανάγνωση των πινάκων 3.12 και 3.13. 37

3.2 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΧΡΩΣΗΣ GRAM, ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΟΞΕΙΔΑΣΗΣ Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε χρώση Gram στις καθαρές καλλιέργειες των δειγμάτων που απομονώθηκαν, έλεγχος της κινητικότητας στο μικροσκόπιο και έλεγχος για παραγωγή οξειδάσης. Τα αποτελέσματα των παραπάνω αναλύσεων παρουσιάζονται στον πίνακα 3.12. Πίνακας 3. 11 Συγκεντρωτικός πίνακας αποτελεσμάτων χρώσης Gram, κινητικότητας και παραγωγής οξειδάσης. Αριθμός αποικίας Χρώση Κινητικότητα Οξειδάση Gram 1 - Όχι + 2 - Όχι - 3 + Ναι - 4 - Όχι + 5 - Όχι + 6 - Όχι + και - 7 + Ναι + και - 8 - Όχι - 9 + Όχι + 10 + Όχι + 11 + Όχι + 38

3.3 ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Η τελική φάση της εργαστηριακής μελέτης των καθαρών αποικιών που επιλέχθηκαν, ήταν η μελέτη της ευαισθησίας των μικροοργανισμών αυτών σε κάποια αντιβιοτικά. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων παρατίθενται στον πίνακα 3.13. Οι μικροοργανισμοί θεωρήθηκαν αρκετά ευαίσθητοι όταν η διάμετρος της ζώνης αναστολής γύρω από το δισκίο ήταν > 1.2 cm, ευαίσθητοι όταν η διάμετρος βρισκόταν μεταξύ 0.6-1.2 cm και ανθεκτικοί όταν η διάμετρος ήταν < 0.6 cm. Πίνακας 3. 12 Ευαισθησία των μικροοργανισμών στα αντιβιοτικά. Όπου VS: αρκετά ευαίσθητοι, S: ευαίσθητοι και R: ανθεκτικοί. ΔΕΙΓΜΑΤΑ 129 10 ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ UB 30 OA 2 AMP 1 VS VS VS VS VS 2 VS S R VS VS 3 R VS S VS VS 4 R VS VS VS VS 5 VS VS VS R VS 6 VS VS R VS VS 7 VS S R VS VS 8 S VS R VS VS 9 VS VS VS VS VS 10 VS VS VS R VS 11 VS VS VS R VS 10 0T 30 Η πλειψηφία των μικροοργανισμών που μελετήθηκαν παρουσίασαν έντονη ευαισθησία στα αντιβιοτικά. Παρατηρείται ότι στο αντιβιοτικό Oxytetracycline (ΟΤ 30) κανένας μικροοργανισμός δεν είναι ανθεκτικός, στην συνέχεια στο αντιβιοτικό Flumequine (UB 30) οι οργανισμοί είναι από αρκετά ευαίσθητοι έως και ευαίσθητοι. Ανθεκτικότητα παρουσιάζεται κυρίως στα αντιβιοτικά Ampicillin (AMP 10) και Oxolinic acid (ΟΑ 2). Ιδιαίτερη σημασία έχει οτι κανένας απο τους μικροοργανισμούς που μελετήθηκαν δεν παρουσιάζει ανθεκτικότητα και στα πέντε αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν. 39

40

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό να μελετηθεί το βακτηριακό φορτίο σε μια μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας στο στάδιο της ανάθρεψης νυμφών λαβρακιού. Να εκτιμηθεί η πιθανή προέλευση των μικροοργανισμών αυτών στα δείγματα νερού από δύο επιλεγμένες δεξαμενές, από την παροχή νερού και από τα δείγματα ζωντανής (φυτοπλαγκτόν, τροχόζωα, artemia) αλλά και βιομηχανοποιημένης τροφής. Τέλος, να γίνει διερεύνηση της ανθεκτικότητας επιλεγμένων μικροοργανισμών σε κοινά αντιβιοτικά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις των ζωντανών τροφών, φαίνεται ότι κάποια βακτήρια που έχουν αναπτυχθεί στις τροφές αυτές θα εισέλθουν στο νερό των δεξαμενών που καλλιεργούνται οι νύμφες. Συγκεκριμένα, στο φυτοπλαγκτόν, στο διάγραμμα 3.4 φαίνεται η συνεχής αύξηση του βακτηριακού του φορτίου κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας και εμπλουτισμού του με ιδιαίτερα έντονη αύξηση κατά την 25 η ημέρα ανάθρεψης. Η αιτία είναι πως την ημέρα της δειγματοληψίας αυτής, τα κύτταρα του φυτοπλαγκτού βρίσκονταν στο ζενίθ της αυξητικής τους φάσης με αποτέλεσμα το επίσης αυξημένο βακτηριακό φορτίο. Η ανάπτυξη των βακτήριων αυτών, οφείλεται κυρίως στην παροχή αέρα και το οξυγόνο που είναι απαραίτητα για την καλλιέργεια του φυτοπλαγκτού, και στο υψηλό οργανικό φορτίο που συσσωρεύεται δημιουργώντας υπόστρωμα για τον πολλαπλασιασμό τους. Τα βακτηριακά κύτταρα μπορεί να προσκολληθούν με τα κύτταρα των μικροφυκών ή μπορεί να πολλαπλασιαστούν στο νερό. Τα βακτήρια που σχετίζονται με τα μικροφύκη μπορεί να φθάσουν σε πολύ υψηλά ποσοστά καλλιεργήσιμων βακτηρίων (Salvesen, et al. 2000). Η ποσότητα των μικροφυκών που εισάγεται στις δεξαμενές με τις νύμφες, κυμαίνεται από τα 100lt/M³ έως 300lt/15M³. Μία πιθανή περίπτωση επηρεασμού του μικροβιακού φορτίου είναι και η αλλαγή των αραιώσεων κατά τη διάρκεια καλλιέργειας του φυτοπλαγκτού πριν αυτό εισαχθεί στις δεξαμενές των νυμφών. Από αναλύσεις που έχουν πραγματοποιηθεί, έχει βρεθεί ένα ευρύ φάσμα ειδών που ανήκουν στις ομάδες α-πρωτεοβακτήρια, β-πρωτεοβακτήρια, γ- Πρωτεοβακτήρια, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), Actinobacteria και Bacillus. Στις καλλιέργειες των μικροφυκών, καλλιεργήσημα βακτήρια του γένους Vibrio απουσίαζαν ή παρουσιάζονταν σε πολύ χαμηλά ποσοστά ( Salvesen 41

et al. 2000; Tendencia & dela Peña 2003; Sainz-Hernandez & Maeda-Martinez 2005; Makridis et al. 2006). Όπως φαίνεται όμως στο διάγραμμα 3.4 από την 7 η ημέρα εκκόλαψης έως την 19 η και την 25 η ημέρα το βακτηριακό φορτίο έχει σχετικά χαμηλές τιμές στην πλειοψηφία των δειγματοληψιών. Πιθανή αιτία μπορεί να είναι η μη ανάπτυξη των ευκαιριακών βακτηρίων ή λόγω της αντιμικροβιακής δράσης των εκχυλισμάτων των μικροφυκών ( Duff & Bruce 1966; Austin & Day 1990; Austin, Baudet & Stobie 1992; Tendencia & dela Peña 2003) αλλά και βακτηρίων που έχουν απομονωθεί από τα καλλιεργούμενα μικροφύκη ( Makridis et al. 2006). Αυτή η αντιμικροβιακή δράση μπορεί να προέρχεται από μικροχλωρίδα σχετική με την καλλιέργεια ( Makridis et al. 2006), αντιμικροβιακές πρωτείνες ή λιπαρά οξέα που παράγονται από κύτταρα των μικροφυκών ( Kokou et al. 2007), ή ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που παράγονται από τη φωτοσυνθετική δραστηριότητα των κυττάρων των μικροφυκών ( Marshall, et al. 2005). Κατά την καλλιέργεια των δειγμάτων των τροχοζώων, πραγματοποιήθηκαν διαφορετικές αραιώσεις με σκοπό τη καλύτερη προσέγγιση του μικροβιακού φορτίου. Παρ όλα αυτά στα πρώτα δείγματα ήταν αδύνατη η καταμέτρηση των αποικιών. Αποτελέσματα από τις αραιώσεις παρουσιάστηκαν στο τελευταίο δείγμα όπου πραγματοποιήθηκε μια μοναδική καταμέτρηση. Πιθανότερη αιτία που υπήρχε μη προσδιορίσιμος αριθμός βακτηρίων είναι ότι τα κάποια δείγματα τροχοζώων λήφθηκαν μάλλον πριν την τελευταία τους έκπλυση που γίνεται πριν εισαχθούν ως τροφή στις δεξαμενές. Όπως και στο φυτοπλαγκτόν, έτσι και στα τροχόζωα κατά την καλλιέργειά τους παρουσιάζεται αυξημένος αριθμός βακτηρίων. Κατά τον εμπλουτισμό τους όμως το ποσοστό αυτό μπορεί να αυξηθεί τόσο ώστε να αποδειχθεί καταστρεπτικό για τις νύμφες των ψαριών που θα χορηγηθεί ως τροφή ( Skjermo & Vadstein 1999). Έτσι, πραγματοποιείται ένα ξέπλυμα μετά την εκκόλαψη των τροχοζώων, μέσω του οποίου αφαιρείται κάποιος αριθμός βακτηρίων, και το επόμενο μετά τον εμπλουτισμό τους, όπου αφαιρείται ακόμα μεγαλύτερος αριθμός χωρίς όμως να αφαιρούνται τελείως. Συγκρίνοντας τα γραφήματα 3.2 και 3.3, παρατηρείται ότι στην δεξαμενή 6 από την πρώτη δειγματοληψία μέχρι τη δεύτερη υπάρχει αύξηση στο βακτηριακό φορτίο ενώ μετά υπάρχει ελαφριά πτώση στην τρίτη δειγματοληψία με έντονη πτώση από την τέταρτη και μετά. Αντίθετα στην δεξαμενή 10, η πτώση 42