Τρυφινοπούλου Κυριακή Ιατρός Βιοπαθολόγος

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΥΓΙΕΙΝΗΣ, ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗΣ ιευθυντής: Καθηγητής Α. Χατζάκης ιδακτορική διατριβή «Πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά Gram-αρνητικά βακτηρίδια: παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης νοσοκοµειακής λοίµωξης και επίδραση στην έκβασή της. Αναζήτηση της µοριακής βάσης της πολυαντοχής-ο ρόλος των integrons» Τρυφινοπούλου Κυριακή Ιατρός Βιοπαθολόγος Αθήνα, Μάρτιος 2013

«Η έγκρισις της διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστηµίου Αθηνών δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωµών του συγγραφέως» (Οργανισµός του Πανεπιστηµίου Αθηνών, άρθρον 202, παρ 2, Νόµος 5343)

ΣΤΟΙΧΕΙΑ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Ηµ/νία αιτήσεως του υποψηφίου 22-5-2002, αρ.πρωτοκόλλου 7668 Ηµ/νία ορισµού 3µελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Μέλη της 3µελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, κ.κ: Βικτωρία Καλαποθάκη, Καθηγήτρια Παν/µίου Αθηνών, (Επιβλέπον µέλος) Αλκιβιάδης Βατόπουλος, Επίκουρος Καθηγητής Παν/µίου Αθηνών Γεώργιος Πετρίκκος, Αναπληρωτής Καθηγητής Παν/µίου Αθηνών 27-6-2002, αρ.πρωτοκόλλου 8665 Ηµ/νία ορισµού θέµατος 24-7-2002, αρ.πρωτοκόλλου 964 Αίτηση αλλαγής 3µελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής (αντικατάσταση του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Α. Βατόπουλου από την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Ευαγγελία Ξηρουχάκη) 15-1-2004, αρ.πρωτοκόλλου 4413 Ηµ/νία κατάθεσης 1 ης έκθεσης προόδου 28-4-2004, αρ.πρωτοκόλλου 8191 Ηµ/νία κατάθεσης 2 ης έκθεσης προόδου 13-12-2004, αρ.πρωτοκόλλου 3658 Ηµ/νία κατάθεσης 3 ης έκθεσης προόδου 29-10-2007, Αίτηση αλλαγής 3µελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής (αντικατάσταση της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κας Ευαγγελίας Ξηρουχάκη από τον Καθηγητή κ. Άγγελο Χατζάκη) αρ.πρωτοκόλλου 1941 12-11-2012, αρ.πρωτοκόλλου 1907 Ηµ/νία κατάθεσης της διδακτορικής διατριβής 25-1-2013, αρ.πρωτοκόλλου 4530 Ορισµός της 7µελούς Εξεταστικής Επιτροπής 7/2/2013 αρ.πρωτοκόλλου 5285 Μέλη της 7µελούς Εξεταστικής Επιτροπής, οι κ.κ.: Βικτωρία Καλαποθάκη, Οµότιµη Καθηγήτρια Παν/µίου Αθηνών (επιβλέπον µέλος) Γεώργιος Πετρίκκος, Καθηγητής Παν/µίου Αθηνών (µέλος 3µελούς) Άγγελος Χατζάκης, Καθηγητής Παν/µίου Αθηνών (µέλος 3µελούς) Γεώργιος αΐκος, Αν. Καθηγητής Παν/µίου Αθηνών Αναστασία Αντωνιάδου, Επικ. Καθηγήτρια Παν/µίου Αθηνών Μαρία Σουλή, Επικ. Καθηγήτρια Παν/µίου Αθηνών Ιωσήφ Παπαπαρασκευάς, Επικ. Καθηγητής Παν/µίου Αθηνών Ηµ/νία κρίσεως διδακτορικής διατριβής: 19-3-2013 Βαθµός «ΑΡΙΣΤΑ»

ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Ονοµατεπώνυµο Ηµεροµηνία γέννησης Τόπος γέννησης Υπηκοότητα Οικογενειακή κατάσταση ιεύθυνση εργασίας Τηλέφωνο εργασίας Ηλεκτρονικό ταχυδροµείο Παρούσα θέση Προϋπηρεσία ως Βιοπαθολόγος Κυριακή Τρυφινοπούλου 26 Μαΐου 1973 Θεσσαλονίκη Ελληνική Έγγαµος µε δύο παιδιά Κεντρικό Εργαστήριο ηµόσιας Υγείας, Αλ. Φλέµινγκ 34, 16672, Βάρη, Αττική 210 8921077, -78 k.tryfinopoulou@otenet.gr tryfinopoulou@keelpno.gr Βιοπαθολόγος, από 1-10-2009 Ιατρός του ΚΕ.ΕΛ.Π.ΝΟ. µε τοποθέτηση στο Κεντρικό Εργαστήριο ηµόσιας Υγείας (Κ.Ε..Υ) στο Εργαστήριο Μελέτης Μικροβιακής Aντοχής και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων. Από 29-5-2007 έως 31-5-2009 Επιµελήτρια Β Ιατρικής Βιοπαθολογίας του κλάδου ιατρών ΕΣΥ επί θητεία στο Γενικό Νοσοκοµείο Καστοριάς, στο Μικροβιολογικό-Βιοχηµικό Τµήµα, σύµφωνα µε την υπό αριθµό Υ10α/Γ.π13022/2-5-2007 απόφαση του Υπουργείου Υγείας και Κοινωνικής Αλληλεγγύης. Από 1-8-2006 έως 24-5-2007, επικουρική ιατρός στο ΓΝΑ «O Ευαγγελισµός» µε την υπ αριθµό Υ10α/ Γ.Π ΟΙΚ 89088/20-7-06 απόφαση του Υπουργείου Υγείας και Κοινωνικής Αλληλεγγύης µε σύµβαση εργασίας Ιδιωτικού ικαίου ορισµένου χρόνου, τµήµα Αιµοδοσίας. Προϋπηρεσία πριν τη λήψη του τίτλου ειδικότητας Εξετάσεις για τη λήψη τίτλου ειδικότητας Ηµ/νία χορήγησης τίτλου ειδικότητας Ιατρικής Βιοπαθολογίας Στη δευτεροβάθµια περίθαλψη: υποχρεωτική τρίµηνη εκπαίδευση στο Νοµαρχιακό Γενικό Νοσοκοµείο Χανίων «Ο ΑΓΙΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ», από 21-12-98 έως και 21-3-99 που προσµετρείται στο χρόνο άσκησης ειδικότητας Στην πρωτοβάθµια περίθαλψη: υποχρεωτική υπηρεσία υπαίθρου στο Π.Ι. Πλατάνου Κ.Υ. Κισσάµου νοµού Χανίων από 22-3-1999 έως και 16-5-2000 Στην τριτοβάθµια περίθαλψη: συνέχιση άσκησης ειδικότητας Βιοπαθολογίας στο Τζάνειο Γενικό Νοσοκοµείο Πειραιά από 15-6-2000 έως και 18-3-2005. Περίοδος Απριλίου 2005 (18-20 Απριλίου). 9-5-05, αρ. πρωτοκόλλου 9056

Σπουδές Προπτυχιακές σπουδές Μεταπτυχιακές σπουδές Τµήµα Ιατρικής, Σχολή Επιστηµών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης. Εισαγωγή µε εισιτήριες (πανελλήνιες) εξετάσεις. Ηµεροµηνία αποφοίτησης: 19-11-1998. Βαθµός πτυχίου «ΛΙΑΝ ΚΑΛΩΣ» Πτυχιούχος της Εθνικής Σχολής ηµόσιας Υγείας µε την 199/7-5-2007 απόφαση του Συλλόγου Καθηγητών της Ε.Σ..Υ, κατόπιν φοίτησης στο Μεταπτυχιακό Πρόγραµµα ηµόσιας Υγείας κατά το ακαδηµαϊκό έτος 2005-2006. Βαθµός «Άριστα»

Επιστηµονικό έργο ηµοσιεύσεις σε διεθνή περιοδικά 1. Maltezou HC, Tryfinopoulou K, Katerelos P, Ftika L, Pappa O, Tseroni M, Kostis E, Kostalos C, Prifti H, Tzanetou K, Vatopoulos A: Consecutive Serratia marcescens multiclone outbreaks in a neonatal intensive care unit. Am J Infect Control. 2012 Sep; 40(7):637-42. Epub 2012 Jan 20. 2. Papagiannitsis CC, Tryfinopoulou K, Giakkoupi P, Pappa O, Polemis M, Tzelepi E, Tzouvelekis LS; Carbapenemase Study Group, Vatopoulos AC: Diversity of acquired β-lactamases amongst Klebsiella pneumoniae in Greek hospitals. Int J Antimicrob Agents. 2012 Feb;39(2):178-80. Epub 2011 Nov 21. 3. Giakkoupi P, Papagiannitsis CC, Miriagou V, Pappa O, Polemis M, Tryfinopoulou K, Tzouvelekis LS, Vatopoulos AC: An update of the evolving epidemic of blakpc-2-carrying Klebsiella pneumoniae in Greece (2009-10). J Antimicrob Chemother. 2011 Jul; 66(7):1510-3. Epub 2011 May 4. 4. Papagiannitsis CC, Giakkoupi P, Vatopoulos AC, Tryfinopoulou K, Miriagou V, Tzouvelekis LS:Emergence of Klebsiella pneumoniae of a new sequence type (ST383) producing VIM-4, KPC-2 and CMY-4 β-lactamases. Int J Antimicrob Agents. 2010 Dec; 36(6):573-4. Epub 2010 Sep 21 5. Michael N. Zairis MD, Olga A. Papadaki MD, Paraskevi K. Psarogianni MD, Maria A. Thoma MD, George K. Andrikopoulos MD, Pelagia C. Batica RN, Christina G. Poulopoulou MD, Kyriaki G. Tryfinopoulou MD, Christopher D. Olympios MD, and Stefanos G. Fousas MD, FESC, FACC Department of Cardiology, Tzanio Hospital, Piraeus, Greece: Serologic markers of persistent Chlamydia pneumoniae infection and long-term prognosis after successful coronary stenting. American Heart Journal, December 2003, Volume 146, Issue 6, Pages 1082-1089 ηµοσιεύσεις σε ελληνικά περιοδικά 1.. Γιαννέλη, Κ. Τρυφινοπούλου, Κ. Βαρυτιµιάδης, Ι. Τσιµέττας, Γ. Χρύσος, Χ. Νικολοπούλου : Μηνιγγίτιδα από β-αιµολυτικό στρεπτόκοκκο οµάδας Β σε ενήλικα. Περιγραφή της περίπτωσης και ανασκόπηση της βιβλιογραφίας. ΕΛΤΙΟΝ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΕΤΑΙΡΕΙΑΣ-Αcta Microbiologica Hellenica, Ιούλιος- Αύγουστος 2004, τόµος 49, τεύχος 4, σελίδες 266-274 2. Μ. Κοµπότη, Σ. ριµής, Ο. Ζαρκωτού, Α. Παπαδάκη, Κ. Κοτσοµύτης, Κ. Τρυφινοπούλου,. Γιαννέλη,. Βουτσινάς: Επιπολασµός ρινικής φορείας Staphylococcus aureus σε ασθενείς της κοινότητας κατά την εισαγωγή στο νοσοκοµείο Ιατρική, Νοέµβριος 2006, Τόµος 90, τεύχος 5, σελίδες 418-423

Εκπαιδευτικό έργο Ως εκπαιδεύτρια Ως εκπαιδευόµενη (συµµετοχή στα πλέον πρόσφατα διεθνή σεµινάρια) ιοργάνωση 4 σεµιναρίων σχετικών µε τη «ιαχείριση Βιολογικού κινδύνου-το µοντέλο AMP» και εκπαίδευση συνολικά 76 ατόµων, ως συνέχεια της εκπαίδευσής µου ως εκπαιδεύτριας στο πρόγραµµα εκπαίδευσης εκπαιδευτών του Π.Ο.Υ «WHO Biorisk Management Advanced Trainer Programme, Training trainers in Biorisk assessment, biorisk mitigation, performance and adult learning techniques: designing & delivering learning programmes, Prague, Czech Republic 12-22 September 2011.Τα 4 σεµινάρια έλαβαν χώρα: 13-14 Μαρτίου 2012, ΚΕ Υ, 18 συµµετέχοντες 29-30 Μαρτίου 2012, ΚΕ Υ, 22 συµµετέχοντες 10-11 Μαΐου 2012, ΚΕ Υ, 13 συµµετέχοντες 21-22 Μαΐου 2012, Ινστιτούτο Κτηνιατρικών Ερευνών, 23 συµµετέχοντες ύο εισηγήσεις στα πλαίσια του µαθήµατος «Λοιµώξεις» για το Γ Εξάµηνο του Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών «ΜΕΘ & Επείγουσα Νοσηλευτική» κατ έτος από το 2010 µε θέµα: 1. «Στοιχεία Κλινικής Μικροβιολογίας, Ταξινόµηση, οµή, Μορφολογία, Φυσιολογία Μικροοργανισµών» 2. «Η µοριακή τυποποίηση στη διερεύνηση επιδηµικών επεισοδίων λοιµώξεων» Εκπαιδεύτρια στο εργαστηριακό µέρος του ESCMID Postgraduate Education Course Carbapenemase-producing Gram-negative Microorganisms: Detection, Epidemiology and Therapeutic Challenges, ΕΣ Υ, Αθήνα 1-2 εκεµβρίου 2011 1. Course Biological waste management and decontamination, June 11, 2012, 15 th annual Conference of the European Biosafety Association, June 11-13, 2012, Manchester, UK 2. Σεµινάριο εκπαίδευσης εκπαιδευτών στη διαχείριση βιολογικού κινδύνου του Π.Ο.Υ: WHO Biorisk Management Advanced Trainer Programme, Training trainers in Biorisk assessment, biorisk mitigation, performance and adult learning techniques: designing & delivering learning programmes, Prague, Czech Republic 12-22 September 2011. 3. Εκπαιδευτικό σεµινάριο ABC in Epidemiology & Biostatistics που συνδιοργανώθηκε από το Εργαστήριο Υγιεινής, Επιδηµιολογίας &Ιατρικής Στατιστικής και το Centre for Applied Medical Statistics, Institute of Public Health, University of Cambridge, Σεπτέµβριος- Νοέµβριος 2011, Αθήνα 4. ESCMID Postgraduate Education Course on Carbapenemase producing Gram-negative Microorganisms: Detection, Epidemiology and Therapeutic Challenges, NSPH, 1-2 December 2011, Athens

Επιστηµονικές ανακοινώσεις σε συνέδρια εξωτερικού (30) 1. Consecutive outbreaks of Serratia marcescens infections in a neonatal ICU are due to the repeated introduction of new clones. K. Tryfinopoulou*, O. Pappa, M. Polemis, H. Prifti, K. Vatzeli, L. Ftika, HC. Maltezou, K. Tzanetou, A. Vatopoulos (Athens, GR). 21 st ECCMID-27 th ICC, Milan-Italy, 7-10 May 2011 2. Bacteraemia and antibiotic resistance of its pathogens reported in Greece between 2000 and 2009: trend analysis. M. Polemis*, K. Tryfinopoulou, S. Chrisochoidou, M. Panopoulou, E. Platsouka, K. Tzanetou, V. Galanopoulou, E. Skouteli, C. Koutsia- Carouzou, K. Poulopoulos, M. Anagnostopoulou, M. Toutouza, K. Aveliodi, A. Pasxali, K. Dimarogona, P. Karampogia, A. Petridis, A. Mavridis, E. Tsorlini, E.M. Fakiri, S. Nikolaou, E. Kaitsa-Tsiopoulou, G. Stamatopoulou, A. Vatopoulos (Vari, Thessaloniki, Alexandroupolis, Athens, Corfu, Ioannina, Xanthi, GR) 21 st ECCMID-27 th ICC, Milan-Italy, 7-10 May 2011 3. Surveillance of beta-lactamase production in a recent sample of Klebsiella pneumoniae isolated in Greek hospitals. C.C. Papagiannitsis*, K. Tryfinopoulou, P. Giakkoupi, O. Pappa, M. Polemis, E. Malamou-Lada, M. Orfanidou, S. Tsiplakou, V. Papaioannou, H. Fakiri, K. Stamoulos, D. Kairis, H. Papoutsidou, H. Katsifa, F. Kesidou, E. Tsafaraki, A. Tsouri, E. Platsouka, Z. Roussou, H. Kaitsa-Tsiopoulou, P. Kazila, E. Tzelepi, A. Vatopoulos (Athens, Thessaloniki, Chania, GR) 21 st ECCMID-27 th ICC, Milan-Italy, 7-10 May 2011 4. Epidemiology of Serratia marcescens colonisations and infections in a neonatal intensive care unit. M. Papadimitriou*, K. Tryfinopoulou, D. Kyriakou, A. Doudoulakakis, O. Pappa, J. Kapetanakis, A. Vatopulos, E. Lebessi (Athens, GR) 21 st ECCMID-27 th ICC, Milan-Italy, 7-10 May 2011 5. Outbreak of Pseudomonas (Flavimonas) oryzihabitans bacteraemia in a neonatal intensive care unit. H. Prifti*, D. Oikonomidou, O. Pappa, K. Tryfinopoulou, K. Vatzeli K. Karaiskos, E. Kostis, A. Vatopoulos, K. Tzanetou (Athens, GR) 21 st ECCMID-27 th ICC, Milan-Italy, 7-10 May 2011 6. Outbreak of Burkholderia cenocepacia bacteraemia in an intensive care unit: an epidemiologic and molecular study. M. Katsiari*, Z. Roussou, A. Xydaki, K. Tryfinopoulou, A. Vatopoulos, E. Platsouka, A. Maguina (Athens, GR) 21 st ECCMID-27 th ICC, Milan-Italy, 7-10 May 2011 7. Carbapenemase producing clinical isolates among non-fermenting bacteria from a tertiary hospital. D. Perimeni, K. Tryfinopoulou, P. Giakouppi, S. Vourli, A. Alevizos O. Zarkotou, I. Tsimettas, D. Gianneli, V. Kalapothaki, A. Vatopoulos 25 th ICC- 17 th ECCMID, Munich /Germany, 31 March-3 April 2007 8. Patient demant for prescription. An often-neglected cause of antibiotic resistance in the community. A.Alevizos, D.Perimeni, G. Larios, C. Mihas, D. Fanou, M. Papathanasiou, K. Tryfinopoulou, K. Stamatiou, K. Kintzoglanakis, A. Mariolis 25 th ICC- 17 th ECCMID, Munich /Germany, 31 March-3 April 2007 9. Screening for the presence of class 1 and 2 integrons in non-fermenting isolates from a tertiary hospital: association with antibiotic resistance phenotypes. D. Perimeni, K. Tryfinopoulou, P. Giakouppi, S. Vourli, I. Tsimettas, D. Gianneli, A. Vatopoulos 16 th ECCMID, Nice, France 1-4 April 2006

10. Class I integrons in Enterobacteriaceae strains isolated from bloodstream infections. K. Tryfinopoulou 1, 2, D. Perimeni 1, 2, S. Vourli 2, P. Giakouppi 2,O. Zarkotou 1, D. Gianneli 1, L. Tzouvelekis 3, V. Kalapothaki 4, A. Vatopoulos 2. 7 th European Congress of Chemotherapy and Infection, Florence, Italy, October 19-22, 2005 11. Class 1 integrons in non-fermenting Gram-negative clinical isolates. D. Perimeni 1, 2, K. Tryfinopoulou 1, 2 S. Vourli 2, P. Giakouppi 2, O. Zarkotou 1, D. Gianneli 1, L. Tzouvelekis 3, V. Kalapothaki 4, A. Vatopoulos 2. 7 th European Congress of Chemotherapy and Infection, Florence, Italy, October 19-22, 2005 12. Resistance patterns of staphylococci in nasal carriage. O. Zarkotou 1, I. Petraki 1, K. Tryfinopoulou 1, M. Kimouli 1, J. Tsimettas 1, M. Kompoti 2, S. Drimis 2, D. Voutsinas 2, D. Gianneli 1. 7 th European Congress of Chemotherapy and Infection, Florence, Italy, October 19-22, 2005 13. Microbiology of urinary tract infections (UTIs) in children: a 3-year study. O. Zarkotou 1, V. Avramioti 1, K. Tryfinopoulou 1, P. Manzouratou 1, C. Goga 2, T. Vlassopoulou 2, D. Gianneli 1. 3rd annual meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases - ESPID, Valencia, Spain, May 18-20, 2005 14. Community-acquired methicillin-resistant S. aureus nasal carriage: prevalence and risk factors. M. Kompoti, S. Drimis, K. Kotsomytis, A. Papadaki, K. Tryfinopoulou, M. Kimouli, O. Zarkotou, D. Gianneli, D. Voutsinas. 15 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, Denmark, 2-5 April 2005. 15. Antimicrobial resistance rates in nosocomial catheter-associated urinary tract infections. M. Kompoti, S. Drimis, K. Kontos, A. Georgopali, O. Zarkotou, K. Tryfinopoulou, C. Nikolopoulou, D. Voutsinas. 15 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, Denmark, 2-5 April 2005. 16. Emerging antimicrobial resistance in bacterial strains isolated from intensive care unit patients with bacteraemia. D. Gianneli, O. Zarkotou, D. Perimeni, K. Tryfinopoulou, J. Tsimettas, E. Psevedourou, C. Nikolopoulou. 14 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,Prague, Czech Republic 1-4 May 2004. 17. Comparative evaluation of uropathogenic E. coli resistance during a 5-year period. D. Gianneli, O. Zarkotou, P. Kanellopoulou, K. Tryfinopoulou, C. Nikolopoulou, G. Chrysos. 14 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Prague, Czech Republic 1-4 May 2004. 18. Resistance of enterococci: an increasing problem. D. Gianneli 1, E. Psevedourou 1, D. Perimeni 1, K. Tryfinopoulou 1, G. Chrysos 2, C. Nikolopoulou 1. 5 th European Congress of Chemotherapy and Infection, Rhodes, Greece, 17-20 October 2003. 19. Antibiotic resistance of Acinetobacter baumannii: a study of 232 clinical isolates. Tryfinopoulou K, Gianneli D, Zarkotou O, Mantzouratou P, Tsimettas J, Gerakari S, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004 20. Antimicrobial resistance of tracheobronchial aspiration isolates in ICU-patients. Tryfinopoulou K, Gianneli D, Zarkotou O, Tsimettas J, Kimouli M, Perimeni D, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004. 21. ΜRSA resistance phenotypes during a two-year period. Zarkotou O, Tryfinopoulou K, Gianneli D, Zafiropoulou D, Tsimettas J, Kokoris S, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004.

22. In vitro antibacterial activity of ertapenem against Enterobacteriaceae clinical isolates. Zarkotou O, Tryfinopoulou K, Gianneli D, Perimeni D, Mantzouratou P, Nitsotolis T, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004. 23. Group B streptococcus meningitis in an adult diabetic woman. Gianneli D, Tryfinopoulou K, Zarkotou O, Mikros S, Kokkoris S, Mantzouratou P, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004. 24. Trends in resistance of Pseudomonas aeruginosa. Gianneli D, Zarkotou O, Tryfinopoulou K, Mantzouratou P, Nitsotolis T, Gerakari S, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004. 25. Resistance patterns of uropathogenic E. coli and incidence of ESBLs. Gianneli D, Zarkotou O, Tryfinopoulou K, Mantzouratou P, Tsimettas J, Mikros S, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004 26. Microbiology of bacteremias in ICU-patients: a 4-year study. Zarkotou O, Gianneli D, Petraki I, Perimeni D, Tryfinopoulou K, Mantzouratou P, Nikolopoulou C, Chrysos G. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004 27. Pulmonary actinomycosis presented as a malignant tumor. Chrysos G, Zarkotou O, Mikros S, Pastelli A, Tryfinopoulou K, Nitsotolis T, Bolanos N, Gianneli D. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004. 28. Nasal carriage of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus at hospital admission. Kompoti Maria, Drimis Stelios, Papadaki Artemis, Kotsomytis Konstantinos, Tryfinopoulou Kyriaki, Zarkotou Olympia, Gianneli Dimitra, Voutsinas Dionisios. 14 th Mediterranean Congress of Chemotherapy & 3rd Pancyprian Congress of Chemotherapy & Infectious Diseases, Limasol, Cyprus, 25-28 November 2004 29. Increasing antibiotic resistance of enterococci in a tertiary care hospital of Greece. Gianelli D, Psevedourou E, Perimeni D, Tryfinopoulou K, Chrysos G, Nikolopoulou 23rd International Congress of Chemotherapy, Durban, South Africa, 7-9 June 2003 30. In vitro susceptibility testing of Ertapenem to resistant enterobactericeae clinical isolates. O. Zarkotou, P. Kanellopoulou, D. Gianneli, I. Tsimettas, D. Perimeni, K. Tryfinopoulou, Ch. Nikolopoulou. Microbiologia balkanica 2003, 3rd Balkan Conference of Microbiology, Istanbul, September 4-6 2003

Επιστηµονικές ανακοινώσεις σε πανελλήνια συνέδρια (58) 1. Μοριακή τυποποίηση στελεχών Acinetobacter baumannii που αποµονώθηκαν από νοσοκοµειακές λοιµώξεις το β εξάµηνο 2011. Π. Γιακκούπη, Ο. Παππά, Κ. Τρυφινοπούλου, Μ. Πολέµης, Ι. Καρατζόγλου, Ε. Σούκη, Α. Φέρκε, Α. Βατόπουλος 6ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, 27-28 Φεβρουαρίου & 1 Μαρτίου 2013 2. Εµφάνιση πανανθεκτικών στελεχών P.mirabilis σε τριτοβάθµιο Νοσοκοµείο Σ. Τσιπλάκου, Κ. Καφαντόγια, Κ. Τρυφινοπούλου, Σ. Καµαριώτης, Π. Γιακκούπη, Ο. Παππά, Β. Παπαϊωάννου, Α. Βατόπουλος, Κ. Μούτα 6 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, 27-28 Φεβρουαρίου & 1 Μαρτίου 2013 3. Παραγωγή της KPC-2 β-λακταµάσης από Εντεροβακτηριακά πλην K. pneumoniae. Π. Γιακκούπη, Κ. Τρυφινοπούλου, Ο. Παππά, Κ. Παπαγιαννίτσης, Α. Βατόπουλος. 9 ο Πανελλήνιο Συνέδριο ηµόσιας Υγείας & Υπηρεσιών Υγείας, 26-28 Μαρτίου 2012, Αθήνα 4. Ανίχνευση στελεχών Klebsiella pneumoniae που παράγουν KPC και MBL καρβαπενεµάσες, σε γενικό Νοσοκοµείο. Ν. Χαραλαµπάκη, Α.Κυράτσα, Ι. Γραφάκος, Π. Γιακκούπη, Κ. Τρυφινοπούλου, Π. Γιαννοπούλου, Α. Βατόπουλος. 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, 15-17 Μαρτίου 2012, Αθήνα 5. Ανίχνευση και µικροβιακή αντοχή στελεχών P.aeruginosa σε Μονάδες Τεχνητού Νεφρού στον Ελλαδικό χώρο. Ι. Σπηλιοπούλου, Κ. Τρυφινοπούλου, Κ. Αϊβαλιώτη, Α. Θεοφίλου, Ε. Βελονάκης, Α. Βατόπουλος. 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, 15-17 Μαρτίου 2012, Αθήνα 6. Αποµόνωση στελεχών P.aeruginosa ανθεκτικών σε καρβαπενέµες από το δίκτυο ύδρευσης Νοσοκοµείων του Ελληνικού χώρου. Ι. Σπηλιοπούλου, Κ. Τρυφινοπούλου, Π. Γιακκούπη, Ε. Βελονάκης, Α. Βατόπουλος. 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, 15-17 Μαρτίου 2012, Αθήνα 7. Πολυανθεκτικά στελέχη Klebsiella pneumoniae που παράγουν καρβαπενεµάσες στο Α.Ν.Θ. «Θεαγένειο». Σ. Καραµπά, Β. Ζιούτας, Σ. Γαντά, Π. Γιακκούπη, Ο. Παππά, Κ. Τρυφινοπούλου, Α. Κωνσταντούλα, Α. Βατόπουλος, Ε. Καΐτσα. 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, 15-17 Μαρτίου 2012, Αθήνα 8. Αποµόνωση στελεχών KPC(+) Klebsiella pneumoniae σε περιφερειακό νοσοκοµείο. Α. Τατσιόπουλος, Ε. Κολιοδέδε, Σ. Μπαζίγος, Π. Ζησιµοπούλου, Κ. Τρυφινοπούλου, Ε. Λάκκη, Α. Λιακόπουλος, Θ. Αργυρόπουλος, Ε. Πετεινάκη. 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, 15-17 Μαρτίου 2012, Αθήνα 9. Εντεροβακτηριακά που παράγουν καρβαπενεµάσες σε παιδιατρικό νοσοκοµείο. Ε. Αλεξάνδρου-Αθανασούλη, Κ. Τρυφινοπούλου, Π. Γιακκούπη, Α. Χαρισιάδου, Κ. Ξερακιά, Κ. Καλογριοπούλου, Ε. Κυρήκου, Α. Βατόπουλος, Α. Πάγκαλη. 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, 15-17 Μαρτίου 2012, Αθήνα 10. Ο ρόλος της µοριακής τυποποίησης στη διερεύνηση επιδηµικών εξάρσεων λοιµώξεων από S. marcescens σε Μονάδα Εντατικής Νοσηλείας νεογνών. Κ. Τρυφινοπούλου 1, Ο. Παππά 1, Μ. Πολέµης 1, Ε. Πρίφτη 2, Κ. Βατζέλη 2, Λ. Φτίκα 3,Ε. Μαλτέζου 3, Κ. Τζανέτου 2, Α. Βατόπουλος 1,4. 5 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, Φεβρουάριος 2011, Αθήνα 11. Xαρτογράφηση β-λακταµασών σε πρόσφατο αντιπροσωπευτικό δείγµα νοσοκοµειακών στελεχών Klebsiella pneumoniae. K.X. Παπαγιαννίτσης 1, Κ. Τρυφινοπούλου 2, Π. Γιακκούπη 1, Ο. Παππά 2, Ε. Μαλάµου-Λαδά 3, Μ. Ορφανίδου 3, Σ. Τσιπλάκου 4, Β. Παπαιωάννου 4, Ε. Φακίρη 5 Κ. Σταµούλος 5,. Καΐρης 6, Ε. Παπουτσίδου 6, Ε. Κατσίφα 7, Φ. Κεσίδου 7, Αικ. Τσαφαράκη 8, Α. Τσουρή 8, Ε. Πλατσούκα 9, Ζ. Ρούσσου 9, Ε. Καΐτσα-Τσιοπούλου 10, Π. Καζήλα 10, Ε. Τζελέπη 11, Α. Βατόπουλος 1,2. 5 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, Φεβρουάριος 2011, Αθήνα

12. Αίτια βακτηριαιµίας και αντοχή των υπεύθυνων παθογόνων στα αντιβιοτικά στη διάρκεια µιας δεκαετίας (2000-2009): ανάλυση τάσεων. Μ. Πολέµης 1, Κ. Τρυφινοπούλου 1, ίκτυο Καταγραφής Μικροβιακής Αντοχής, Α. Βατόπουλος 2. 5 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, Φεβρουάριος 2011, Αθήνα 13. Επιδηµιολογική διερεύνηση αποικισµού και λοίµωξης από Serratia marcescens σε τµήµα νεογνών Μ. Παπαδηµητρίου 1, Κ. Τρυφινοπούλου 2,. Κυριακού 3, Α. ουδουλακάκης 1, Ο. Παππά 2, Ι. Καπετανάκης 3, Α. Βατόπουλος 2, Ε. Λεµπέση 1 5ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, Φεβρουάριος 2011, Αθήνα 14. MLST τυποποίηση των K.pneumoniae KPC-2(+) που αποµονώνονται στην Ελλάδα. Π. Γιακκούπη 1, Κ.Χ. Παπαγιαννίτσης 1, Ο. Παππά 2, Μ. Πολέµης 2, Κ. Τρυφινοπούλου 2, Α.Κ. Βατόπουλος 1,2. 5ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, Φεβρουάριος 2011, Αθήνα 15. Βακτηριαιµία από Pseudomonas (Flavimonas) oryzihabitans σε πρόωρα νεογνά. Ε. Πρίφτη 1, Ν. Οικονοµίδου 2, Ο. Παππά 3, Κ. Τρυφινοπούλου 3, Κ. Βατζέλη 4, Κ. Καραΐσκος 1, Ε. Κωστής 4, Α. Βατόπουλος 3, Κ. Τζανέτου 1. 5 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας & Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, Φεβρουάριος 2011, Αθήνα 16. Επιτήρηση και ανάλυση της αντοχής σε τριτοβάθµιο Νοσοκοµείο. Ε.Αλεξάνδρου- Αθανασούλη 1, Μ. Ζιώγα 1, Α. Πιστιόλη 1, Κ. Τρυφινοπούλου 2, Ο. Παππά 2, Α. Χαρισιάδου 1, Λ. Ζαχαριάδου 1, Α. Βατόπουλος 2, Α. Πάγκαλη 1. 6 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Απρίλιος 2010, Αθήνα 17. In vitro δραστικότητα της τιγκεκυκλίνης σε κλινικά στελέχη K.pneumoniae µε καρβαπενεµάση τύπου KPC. Κυριακή Τρυφινοπούλου 2, Παναγιώτα Γιακκούπη 1, Όλγα Παππά 2, Μιχάλης Πολέµης 2, Αλκιβιάδης Βατόπουλος 1,2. 8 ο Πανελλήνιο Συνέδριο ηµόσιας Υγείας και Υπηρεσιών Υγείας, Μάρτιος 2010, Αθήνα 18. ιερεύνηση της επιδηµίας KPC producing K.pneumoniae στα ελληνικά νοσοκοµεία. Παναγιώτα Γιακκούπη 1, Όλγα Παππά 2, Μιχάλης Πολέµης 2, Κυριακή Τρυφινοπούλου 2, Αλκιβιάδης Βατόπουλος 1. 8 ο Πανελλήνιο Συνέδριο ηµόσιας Υγείας και Υπηρεσιών Υγείας, Μάρτιος 2010, Αθήνα 19. Έλεγχος παραγωγής καρβαπενεµασών τύπου KPC και VIM σε µικροβιακά στελέχη Klebsiella pneumoniae. Γ Σιδηράς 1, Π. Γιακκούπη 2, Ε Κάντζιου 1, Ο Σωτηρίου 1, Κ Τρυφινοπούλου 1, Σ Πατιάκας 1, Μιχόπουλος 1, Α. Βατόπουλος. 2 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ελέγχου Λοιµώξεων, 13-14 Νοεµβρίου 2009, Αθήνα, Ξενοδοχείο Classical Athens Imperial 20. Επιπολασµός της σύφιλης στον αιµοδοτικό πληθυσµό του νοµού Καστοριάς για χρονικό διάστηµα 9 ετών. Τ Σούρµπα 1, Ι Πασσαλίδου 2, Κ Τρυφινοπούλου 3, Ε Κάντζιου 3, Γ Σιδηράς 3, Χ Ουζούνης 1, Ο Σωτηρίου 3, Μιχόπουλος 3. 20ο Πανελλήνιο Αιµατολογικό Συνέδριο, 4-7 Νοεµβρίου 2009, Χερσόνησος Ηρακλείου Κρήτης, Ξενοδοχείο Creta Maris 21. Εθελοντική Αιµοδοσία στο νοµό Καστοριάς. Τ Σούρµπα 1, Γ Σιδηράς 3,Ι Πασσαλίδου 2, Κ Τρυφινοπούλου 3, Χ Ουζούνης 1, Ε Κάντζιου 3, Ο Σωτηρίου 3, Μιχόπουλος 3. 20 ο Πανελλήνιο Αιµατολογικό Συνέδριο, 4-7 Νοεµβρίου 2009, Χερσόνησος Ηρακλείου Κρήτης, Ξενοδοχείο Creta Maris 22. Συσχέτιση αυξηµένων τιµών οµοκυστεΐνης µε βιταµίνη Β12 και φολικό οξύ. Ι. Πασσαλίδου, Π. Καραπαυλίδου, Α. Χάσιου, Ο. Σωτηρίου, Κ. Τρυφινοπούλου. 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοχηµείας, 26-29 Μαρτίου 2009, Ξενοδοχείο DIVANI CARAVEL, Αθήνα 23. Αξιολόγηση και συσχέτιση του MCV µε την Β12 και φερριτίνη ορού. Π. Καραπαυλίδου, Ι. Πασσαλίδου, Κ. Τρυφινοπούλου, Ο. Σωτηρίου, Μ. Χάσιος. 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοχηµείας, 26-29 Μαρτίου 2009, Ξενοδοχείο DIVANI CARAVEL, Αθήνα

24. Εργαστηριακή διερεύνηση της αναιµίας σε ασθενείς του Νοσοκοµείου Καστοριάς. Π. Καραπαυλίδου, Ι. Πασσαλίδου, Ο. Σωτηρίου, Κ.Τρυφινοπούλου, Α. Χάσιου. 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοχηµείας, 26-29 Μαρτίου 2009, Ξενοδοχείο DIVANI CARAVEL, Αθήνα 25. Παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης βακτηριαιµίας από θετικά για ιντεγκρόνια τάξης 1 εντεροβακτηριακά Gram αρνητικά βακτηρίδια. Τρυφινοπούλου Κ¹ ², Περιµένη ¹ ², Βουρλή Σ¹, Γιακκούπη Π¹, Ζαρκωτού Ο², Γιαννέλη ², Βατόπουλος Α¹, Καλαποθάκη Β³. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 26. Εντεροβακτηριακά στελέχη ως αίτια νοσοκοµειακής λοίµωξης έναντι λοίµωξης κοινότητας: σύγκριση ως προς το φαινότυπο αντοχής και την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1. Τρυφινοπούλου Κ¹ ², Περιµένη ¹ ², Βουρλή Σ¹, Γιακκούπη Π¹, Ζαρκωτού Ο², Γιαννέλη ², Βατόπουλος Α¹, Καλαποθάκη Β³. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων,12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 27. Αποµόνωση στελέχους K. pneumoniae από ασθενή της κοινότητας µε ικανότητα παραγωγής εκτεταµένου φάσµατος β-λακταµάσης τύπου CTX-M. Τρυφινοπούλου Κ 1, Σιδηράς Γ 1, Γιακκούπη Π 2, Κάντζιου Ε 1, Σωτηρίου Ο 1, Μιχόπουλος 1, Βατόπουλος Α 2. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων,12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 28. Αποµονωθέντα µικρόβια από κολποτραχηλικά επιχρίσµατα γυναικών. Τρυφινοπούλου Κ, Σωτηρίου Ο, Κάντζιου Ε, Σιδηράς Γ, Σούρπα Τ, Πατιάκας Σ, Μιχόπουλος. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, 12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 29. Ανοσιακή κατάσταση γυναικών ως προς τον µεγαλοκυτταροιό (CMV) στo πλαίσιο προγεννητικού ελέγχου (µελέτη Νοσοκοµείου Καστοριάς). Ι. Πασσαλίδου, Π. Καραπαυλίδου, Κ. Τρυφινοπούλου, Τ. Σούρµπα, E. Κάντζιου, Α. Καρύπη. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, 12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 30. Ανοσιακή κατάσταση γυναικών ως προς την ερυθρά στo πλαίσιο προγεννητικού ελέγχου (µελέτη Νοσοκοµείου Καστοριάς). Ι. Πασσαλίδου, Π. Καραπαυλίδου, Κ. Τρυφινοπούλου, Τ. Σούρµπα, Α. Καρύπη. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων,12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 31. ιερεύνηση της ανοσιακής κατάστασης έναντι της Ηπατίτιδας Β σε γυναικείο πληθυσµό. Π. Καραπαυλίδου, Ο. Σωτηρίου, Κ. Τρυφινοπούλου, Π. Ζαβαρόπουλος, Ι. Πασσαλίδου. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων,12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 32. Ορολογικός έλεγχος ηπατίτιδας Β σε ασθενείς του Νοσοκοµείου Καστοριάς. Π. Καραπαυλίδου Ι. Πασσαλίδου, Ο. Σωτηρίου, Κ. Τρυφινοπούλου, Γ. Σιδηράς. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων,12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 33. Εκτίµηση της ανοσιακής κατάστασης έναντι της Ηπατίτιδα Α σε ασθενείς του Νοσοκοµείου Καστοριάς. Π. Καραπαυλίδου Ι. Πασσαλίδου, Κ. Τρυφινοπούλου, Ο. Σωτηρίου, Γ. Σιδηράς. 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων, 12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 34. Σύνδροµο λοιµώδους µονοπυρήνωσης στο Νοσοκοµείο Καστοριάς. Ι. Πασσαλίδου, Π. Καραπαυλίδου, Κ. Τρυφινοπούλου, Ε. Καντζιου, Π. Ζαβαρόπουλος, Α. Καρύπη, 4 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων,12-14 Φεβρουαρίου 2009, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα

35. Αντοχή µικροβιακών στελεχών στο Γενικό Νοσοκοµείο Καστοριάς. Τρυφινοπούλου Κ, Πατιάκας Σ, Κάντζιου Ε, Σιδηράς Γ, Σωτηρίου Ο, Σούρπα Τ, Μιχόπουλος. 1 ο Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Ελέγχου Λοιµώξεων, 14-15 Νοεµβρίου 2008, Ξενοδοχείο Classical Athens Imperial, Αθήνα 36. Αντισώµατα έναντι του HTLV I/II: εµπειρία µιας οκταετίας.. Ζούλας, Κ. Τρυφινοπούλου, Α. Κωστούρου, Π. Κουτσογιάννη, Σ. Σαριδάκης, Ε. Γεροβαγγέλη, Α. Μεγάλου, Ε. Καπασούρη, Μ. Μόσχου-Παραρά. 3 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας- 9 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων και Υγιεινής, 6-8 Φεβρουαρίου 2007, Πολεµικό Μουσείο, Αθήνα 37. Eρωτηµατολόγιο ικανοποίησης αιµοδοτών ως µέσο για προώθηση εθελοντικής αιµοδοσίας. Κυριακή Τρυφινοπούλου, Ακριβή Κωστούρου, Παναγιώτα Κουτσογιάννη, Στυλιανός Σαριδάκης, Ελένη Γεροβαγγέλη, Αγγελική Μεγάλου, Ελισάβετ Καπασούρη, Μυρσίνη Μόσχου-Παραρά. 2 ο Πανελλήνιο Συνέδριο για τη ιοίκηση, τα Οικονοµικά και τις Πολιτικές Υγείας,13-16 Νοεµβρίου 2006, HILTON,Αθήνα 38. Ιντεγκρόνια τάξης 1 και 2 σε κλινικά στελέχη Εντεροβακτηριακών Gram αρνητικών βακτηριδίων. Τρυφινοπούλου Κ 1,2, Περιµένη 1,2, Βουρλή Σ 2, Γιακκούπη Π 2, Τσιµέττας Ι 1, Γιαννέλη 1, Βατόπουλος Α 2. 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας,12-15 Απριλίου 2006, HILTON,Αθήνα. 39. Αντοχή στα αντιβιοτικά στελεχών σταφυλοκόκκου από ρινική φορεία. Ο. Ζαρκωτού 1, Κ. Τρυφινοπούλου 1, Ι. Πετράκη 1, Μ. Κιµούλη 1, Ι. Τσιµέττας 1, Μ. Κοµποτή 2, Σ. ριµής 2,. Βουτσινάς 2,. Γιαννέλη 1. 4 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας,12-15 Απριλίου 2006, HILTON,Αθήνα. 40. Θεραπεία λοιµώξεων από πολυανθεκτικά στελέχη Gram-αρνητικών βακτηριδίων µε κολιµυκίνη. Ο. Ζαρκωτού 1, Ε. Μπαλής 2, Κ. Τρυφινοπούλου 1, Π. Τσελιώτη 2, Ι. Τσιµέττας 1,. Μαλτέζος 2, Α. Πρεκατές 2,. Γιαννέλη 1. 31 ο Ετήσιο Πανελλήνιο Συνέδριο, 17-21 Μαΐου 2005, HILTON, Αθήνa 41. Η επίδραση των επιπέδων της λιποπρωτείνης Α [LP(A)] στον ορό στην αποτελεσµατικότητα της ενδοφλέβιας θροµβόλυσης στο οξύ έµφραγµα του µυοκαρδίου µε ανάσπαση του ST. O. Αµπαρτζίδου, Ν. Πατσουράκος, Σ. Μακρυγιάννης, Κ. Βαγιανός, Π. Μπατίκα, Ε. Στρουµπούλη, Χ. Κάτσαρης, Κ. Τρυφινοπούλου, Μ. Ζαΐρης, Σ. Φούσας. 31 ο Ετήσιο Πανελλήνιο Συνέδριο, 17-21 Μαΐου 2005, HILTON, Αθήνα 42. Ο ρόλος της προεµφραγµατικής στηθάγχης στην αποτελεσµατικότητα της ενδοφλέβιας θροµβόλυσης µετά από έµφραγµα του µυοκαρδίου µε ανάσπαση του ST. Φ. Αναστασιάδης, Ν. Πατσουράκος, Μ. Γλύπτης, Κ. Κοντός, Σ. Παρλάκογλου, Κ. Τρυφινοπούλου, Ν. Τελλής, Χ. Πουλοπούλου, Μ. ήµου, Ν. Κάσσινος, Σ. Φούσας. 31 ο Ετήσιο Πανελλήνιο Συνέδριο, 17-21 Μαΐου 2005, HILTON, Αθήνα 43. Ιντεγκρόνια τάξης 1 σε κλινικά στελέχη Εντεροβακτηριακών. Τρυφινοπούλου Κ 1,2, Περιµένη 1,2, Βουρλή Σ 2, Γιακκούπη Π 2,Ζαρκωτού Ο 1, Γιαννέλη 1, Νικολοπούλου Χ 1, Τζουβελέκης Λ 3, Καλαποθάκη Β 4, Βατόπουλος Α 2. 2 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας - 8 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων & Υγιεινής, Αθήνα, Πολεµικό Μουσείο, 24-26 Φεβρουαρίου 2005 44. Παρουσία ιντεγκρονίων κλάσης 1 σε κλινικά στελέχη αζυµωτικών Gramαρνητικών βακτηριδίων Περιµένη 1,2, Τρυφινοπούλου Κ 1,2, Βουρλή Σ 2, Γιακκούπη Π 2, Ζαρκωτού Ο 1, Γιαννέλη 1, Νικολοπούλου Χ 1, Τζουβελέκης Λ 3, Καλαποθάκη Β 4, Βατόπουλος Α 2. 2 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας - 8 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων & Υγιεινής, Αθήνα, Πολεµικό Μουσείο, 24-26 Φεβρουαρίου 2005 45. Μικροβιακή χλωρίδα της ρινικής κοιλότητας σε ασθενείς της κοινότητας κατά την εισαγωγή στο νοσοκοµείο. Παπαδάκη Άρτεµις, Κοµπότη Μαρία, Κοτσοµύτης Κωνσταντίνος, ριµής Στέλιος, Τρυφινοπούλου Κυριακή, Κιµούλη Μαρία, Γιαννέλη ήµητρα, Βουτσινάς ιονύσιος. 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Λοιµώξεων, 18-20 Φεβρουαρίου 2005, Αθήνα, Ξενοδοχείο Divani Caravel

46. Μελέτη των φαινοτύπων αντοχής των µεθικιλλίνη ανθεκτικών στελεχών S. aureus (MRSA) κατά τη διετία 2002-2003. Ο. Ζαρκωτού, Κ. Τρυφινοπούλου,. Ζαφειροπούλου, Π. Μαντζουράτου,. Γιαννέλη, Χ. Νικολοπούλου. 30 ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο, Αθήνα, Ξενοδοχείο HILTON, 27 Απριλίου -1 Μαΐου 2004 47. Αντοχή στα αντιβιοτικά κλινικών στελεχών Pseudomonas aeruginosa σε Γενικό Νοσοκοµείο την τελευταία πενταετία.. Γιαννέλη, Π. Μαντζουράτου, Ο. Ζαρκωτού, Κ. Τρυφινοπούλου, Λ. Καράµπαλη, Χ. Νικολοπούλου. 30 ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο, Αθήνα, Ξενοδοχείο HILTON, 27 Απριλίου -1 Μαΐου 2004 48. Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά κλινικών στελεχών Acinetobacter baumannii. Κ. Τρυφινοπούλου,. Γιαννέλη, Π, Μαντζουράτου, Ο. Ζαρκωτού, I. Tσιµέττας, Χ. Νικολοπούλου. 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Θεσ/νικη, 31 Μαρτίου - 3 Απριλίου 2004, Ξενοδοχείο Μακεδονία Palace 49. Μικρόβια αποµονωθέντα από τραχειοβρογχικές εκκρίσεις ασθενών της Μονάδας Εντατικής Θεραπείας και η αντοχή τους στα αντιβιοτικά κατά την τριετία 2000-2002. Κ. Τρυφινοπούλου,. Περιµένη, Ε. Ψεβεδούρου,. Γιαννέλη, Ι. Τσιµέττας, Χ. Νικολοπούλου. 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Θεσ/νικη, 31 Μαρτίου - 3 Απριλίου 2004, Ξενοδοχείο Μακεδονία Palace 50. Εργαστηριακή διερεύνηση βακτηριαιµιών σε Μονάδα Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ) κατά την τελευταία τριετία.. Περιµένη, Ε. Ψεβεδούρου, Κ. Τρυφινοπούλου,. Γιαννέλη, Ι. Τσιµέττας, Χ. Νικολοπούλου. 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Θεσ/νικη, 31 Μαρτίου - 3 Απριλίου 2004, Ξενοδοχείο Μακεδονία Palace 51. Αντοχή σταφυλοκόκκων στα αντιβιοτικά από κλινικά δείγµατα ασθενών το έτος 2002.. Γιαννέλη, Π. Μαντζουράτου, Ο. Ζαρκωτού, Κ. Τρυφινοπούλου, Β. Παπανικολοπούλου, Χ. Νικολοπούλου. 3 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Θεσ/νικη, 31 Μαρτίου - 3 Απριλίου 2004, Ξενοδοχείο Μακεδονία Palace 52. Αντοχή των εντεροκόκκων σε επιλεγµένα αντιβιοτικά κατά την τριετία 2000-2002 σε τριτοβάθµιο Νοσοκοµείο.. Γιαννέλη, Ε. Ψεβεδούρου,. Περιµένη, Κ. Τρυφινοπούλου, Χ. Νικολοπούλου. 29 ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο, Αθήνα, 20-24 Μαΐου 2003, Ξενοδοχείο DIVANI CARAVEL 53. Οροθετικότητα έναντι Chlamydia pneumoniae σε ασθενείς µετά από αγγειοπλαστική µε stent. Χ. Πουλοπούλου 1, Κ. Τρυφινοπούλου 1, Α. Λαζαρίδου 1, Μ. Ζαΐρης 2, Ο. Παπαδάκη 2, Σ. Φούσας 2, Χ. Νικολοπούλου 1. 20 ο Εθνικό συνέδριο Μικροβιολογίας- 2 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Αθήνα, 13-16 Μαρτίου 2002, Ξενοδοχείο INERCONTINENTAL 54. Πρόσθετη προγνωστική αξία της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης επί του TIMI risk score σε ασθενείς µε στεφανιαία σύνδροµα χωρίς ανάσπαση του ST. Μ. Ζαΐρης, Ν. Πατσουράκος, Β. Τσιριµπής, Ν. Παπαδάτου, Χ. Ντέλλος, Α. Μανώλης, Ε. Στρουµπούλη, Β. Παναγιωτίδης, Κ. Τρυφινοπούλου, Χ. Νικολοπούλου, Χ. Πουλοπούλου, Σ. Φούσας. 25 ο Πανελλήνιο Καρδιολογικό Συνέδριο, Αθήνα, 17-20 Νοεµβρίου 2004 55. Επίδραση των επιπέδων ουρικού οξέος στη µακροπρόθεσµη καρδιαγγειακή θνητότητα σε ασθενείς µε οξέα στεφανιαία σύνδροµα. Αποτελέσµατα από τη µελέτη BIAS (Biochemical Indices in Acute Coronary Syndromes) Γ. Μπιµπής, Μ. Ζαΐρης,. Ξένος, Φ. Αναστασιάδης, Ο. Αµπαρτζίδου, Σ. Αργυράκης, Κ. Κοντός, Λ. Σίνος, Μ. Θωµά, Ε. Αδαµοπούλου, Κ. Τρυφινοπούλου, Σ. Φούσας. 25 ο Πανελλήνιο Καρδιολογικό Συνέδριο, Αθήνα, 17-20 Νοεµβρίου 2004 56. Μηνιγγίτιδα από στρεπτόκοκκο οµάδας Β σε ενήλικη διαβητική γυναίκα.. Γιαννέλη, Ι. Λέντζας, Κ. Τρυφινοπούλου, Κ. Βαρυτιµιάδης, Σ. Αναγνωστόπουλος, Α. Καµαράτος, Σ. Μικρός, Α. Μελιδώνης, Π. Μαντζουράτου, Χ. Νικολοπούλου, Γ. Χρύσος. 16 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Γενικής Ιατρικής, Κως, 14-18 Απριλίου 2004, Ξενοδοχείο Κυπριώτης Village

57. ιαφορές στην αντοχή του κολοβακτηριδίου µεταξύ διαβητικών και µη διαβητικών ασθενών. Γ. Χρύσος, Ι. Λέντζας, Γ. Λεπενιώτης, Κ. Βαρυτιµιάδης, Α. Καµαράτος, Φ. Στασινή, Σ. Μικρός, Α. Μελιδώνης,. Γιαννέλη, Κ. Τρυφινοπούλου, Χ. Νικολοπούλου. 16 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Γενικής Ιατρικής, Κως, 14-18 Απριλίου 2004, Ξενοδοχείο Κυπριώτης Village 58. Χρόνια λοίµωξη από Χλαµύδια πνευµονίας και µακροχρόνια πρόγνωση σε ασθενείς που υποβάλλονται σε επιτυχή αγγειοπλαστική των στεφανιαίων και τοποθέτηση Stent. Τέσσερα χρόνια προοπτικής παρακολούθησης στη µελέτη GENERATION(Global Evaluation of New Events) M. Zαΐρης, Α. Καρδούλας,. Περιµένη, Α. Λαζαρίδου, Κ. Τρυφινοπούλου, Χ. Πουλοπούλου, Χ. Νικολοπούλου, Κ. Κατσάρος, Ν. Κάσινος, Σ. Χαντανής, Σ. Αργυράκης, Σ. Φούσας. 24 ο Πανελλήνιο Καρδιολογικό Συνέδριο, Ρόδος, 2-4 Οκτωβρίου 2003

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΚΑΙ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ήδη από τις αρχές της δεκαετίας του 2000 άρχισε να διαφαίνεται στη χώρα µας, αλλά και παγκοσµίως, µια αυξητική τάση της αντοχής των Gram-αρνητικών βακτηριδίων γενικά και των µελών της Οικογένειας Enterobacteriaceae ειδικότερα. Η ολοένα αυξανόµενη αντοχή των Εντεροβακτηριακών στα αντιβιοτικά είναι σηµαντικό πρόβληµα καθώς δυσχεραίνει τη θεραπεία των σοβαρών λοιµώξεων που προκαλούν και απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή. Οι µικροοργανισµοί αυτοί άρχισαν να καθίστανται πολυανθεκτικοί, αποκτώντας αφανώς κινητές γενετικές δοµές, συνήθως µεγάλα πλασµίδια, µε πολλαπλούς καθοριστές αντοχής για τις περισσότερες οµάδες αντιβιοτικών (β-λακταµάσες, τροποποιητικά ένζυµα των αµινογλυκοσιδών κ.α). Μεγάλο µέρος ενός πλασµιδίου αντοχής είναι επίκτητο και τα γονίδια αντοχής βρίσκονται σε αυτά ακριβώς τα επίκτητα τµήµατα DNA ενός πλασµιδίου (µεταθετά, ένθετες αλληλουχίες, ιντεγκρόνια). Τα ιντεγκρόνια είναι γενετικά στοιχεία που µπορούν να αναγνωρίζουν και να παγιδεύουν γονίδια, κυρίως αντοχής, που κυκλοφορούν µε τη µορφή γονιδιακών κασετών και να εξασφαλίζουν την έκφρασή τους. Εξάλλου, χάρη στη δυνατότητα ενσωµάτωσής τους ως επίκτητα τµήµατα DNA σε συζευκτικά πλασµίδια αντοχής, µπορούν να µεταφερθούν µέσω σύζευξης σε ένα ευρύ φάσµα ξενιστών. Μπορούµε εποµένως να τα θεωρήσουµε ως φυσικώς απαντώντα οχήµατα συσσώρευσης, έκφρασης αλλά και µετάδοσης γονιδίων αντοχής en bloc. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να προσθέσει στην ήδη υπάρχουσα βιβλιογραφία τα αποτελέσµατα από τη µελέτη των παραγόντων κινδύνου για λοίµωξη (βακτηριαιµία) από πολυανθεκτικά στελέχη εντεροβακτηριακών, καθώς και την επίδραση της πολυαντοχής στην έκβαση της λοίµωξης. Επιπλέον να προσθέσει ευρήµατα από την αναζήτηση της µοριακής βάσης της πολυαντοχής σε αυτούς τους µικροοργανισµούς µελετώντας τους υπεύθυνους µηχανισµούς αντοχής και κυρίως τον ρόλο των ιντεγκρονίων στον φαινότυπο πολυαντοχής των κλινικών αυτών στελεχών. Η παράθεση αυτών των αποτελεσµάτων που αφορούν ευρήµατα της περιόδου 2002-2004 θα µπορούσε να είναι χρήσιµη για συγκρίσεις τόσο µε σχετικές µελέτες που έγιναν στον Ελλαδικό χώρο σχεδόν την ίδια χρονική περίοδο αλλά σε διαφορετικούς νοσοκοµειακούς πληθυσµούς και τύπο νοσοκοµείου [Daikos G et al 2007, (συλλογή 2003-2005), Psichogiou et al 2008, (συλλογή 2004-2006), Koratzanis E et al 2011,(συλλογή 2004-2005)] καθώς και για συγκρίσεις µε τρέχουσες µελέτες

µηχανισµών αντοχής ή µικροβιακών πολυανθεκτικών κλώνων εντεροβακτηριακών, τόσο για σύγκριση δοµών ιντεγκρονίων γενικά και VIM-ιντεγκρονίων ειδικότερα, αλλά και για σύγκριση και άλλων µηχανισµών αντοχής που δεν εδράζονται σε ιντεγκρόνια, όπως η εµφάνιση πλασµιδιακής προέλευσης κεφαλοσπορινάσης CMY σε στελέχη P.mirabilis. (D.Andrea Μ et al, 2011, ελληνική συµµετοχή µε στελέχη P.mirabilis περιόδου 2005-2008). Το παρόν κείµενο αποτελείται από ένα γενικό µέρος, όπου περιγράφονται συνοπτικά τα χαρακτηριστικά των λοιµώξεων από µέλη της Οικογένειας Enterobacteriaceae και οι µηχανισµοί ανάπτυξης και διασποράς της αντοχής αυτών των µικροοργανισµών στα αντιβιοτικά, µε ιδιαίτερη µνεία στην ανάπτυξη πολυαντοχής, στην οριζόντια µεταφορά γενετικού υλικού και στα ιντεγκρόνια. Ακολουθεί το ειδικό µέρος όπου περιγράφεται ο σκοπός και ο σχεδιασµός της παρούσας µελέτης, οι µικροβιολογικές µέθοδοι και οι µέθοδοι µοριακής βιολογίας µε τα αντίστοιχα πρωτόκολλα, η µεθοδολογία της στατιστικής επεξεργασίας των αποτελεσµάτων, τα αποτελέσµατα και στο τέλος ακολουθεί η συζήτηση των ευρηµάτων της µελέτης. Τα αποτελέσµατα χωρίζονται σε τέσσερα κύρια µέρη: α) Παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στελέχη β) Επίδραση της πολυαντοχής των υπεύθυνων µικροοργανισµών στην έκβαση της βακτηριαιµίας γ) Πολυαντοχή εντεροβακτηριακών και ιντεγκρόνια τάξης 1 και 2 και δ) Πολυαντοχή των εντεροβακτηριακών στελεχών, ιντεγκρόνια και τύπος βακτηριαιµίας (κοινότητας, σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας και νοσοκοµειακή βακτηριαιµία). Στο τέταρτο µέρος παρατίθεται και η αναλυτική περιγραφή των κλινικών και επιδηµιολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών καθώς και των µικροβιολογικών χαρακτηριστικών, των ιντεγκρονίων και άλλων µηχανισµών αντοχής των υπεύθυνων µικροοργανισµών στα επεισόδια νοσοκοµειακής βακτηριαιµίας από: i) πολυανθεκτικά στελέχη VIM-θετικών µικροοργανισµών, ii) πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis και iii) πολυανθεκτικά στελέχη Enterobacter spp. Ακολούθως υπάρχει ένα µικρό κεφάλαιο όπου παρατίθενται τα αποτελέσµατα από τον έλεγχο επιπρόσθετων στελεχών και από κλινικά δείγµατα αποικισµένων ασθενών καθώς και η µελέτη της συµβολής των ιντεγκρονίων στην πολυαντοχή του συνόλου του µικροβιακού πληθυσµού ασχέτως κλινικής σηµασίας της εστίας προέλευσης (λοιµώξεις και αποικισµοί).

Το εργαστηριακό τµήµα της ιδακτορικής ιατριβής εκπονήθηκε αρχικά στο εργαστήριο Μικροβιολογίας της Εθνικής Σχολής ηµόσιας Υγείας και µετέπειτα στο Εργαστήριο Μελέτης Μικροβιακής Αντοχής και Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων του Κεντρικού Εργαστηρίου ηµόσιας Υγείας και αποτελεί τµήµα ευρύτερης συνεργασίας µε το εργαστήριο Υγιεινής και Επιδηµιολογίας του Πανεπιστηµίου Αθηνών. Η µικροβιακή συλλογή προέρχεται από το Μικροβιολογικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκοµείου Πειραιά «ΤΖΑΝΕΙΟ», από στελέχη που αποµονώθηκαν από κλινικά δείγµατα ασθενών που νοσηλεύθηκαν κατά τη χρονική περίοδο από τον Απρίλιο 2002 έως το εκέµβριο 2004, διάστηµα κατά το οποίο ήµουν ειδικευόµενη Ιατρός του νοσοκοµείου για τη λήψη του τίτλου της ειδικότητας της Ιατρικής Βιοπαθολογίας. Για την εκπόνηση και την ολοκλήρωση της διδακτορικής µου διατριβής υπήρξε πολύτιµη βοήθεια από πολλούς στους οποίους εκφράζω τη βαθειά µου ευγνωµοσύνη. Χρονολογικά οφείλω να ευχαριστήσω την τέως ιευθύντρια του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του «Τζάνειου» Γ.Ν. Πειραιά κα Χρυσούλα Νικολοπούλου για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε και την ευκαιρία που µου έδωσε να ξεκινήσω διδακτορική διατριβή φέρνοντάς µε σε επαφή µε τον Επίκουρο Καθηγητή, τότε Επιδηµιολογίας και Προληπτικής Ιατρικής και µετέπειτα Καθηγητή Μικροβιολογίας στην Εθνική Σχολή ηµόσιας Υγείας κύριο Αλκιβιάδη Βατόπουλο. ράττοµαι εδώ της ευκαιρίας να τον ευχαριστήσω ακόµη µία φορά όχι µόνο για την ανάθεση του θέµατος, αλλά και την εµπιστοσύνη και κατανόηση που µου έδειξε όλο αυτό το διάστηµα καθώς και για όλες τις πολύ µεγάλες ευκαιρίες που µου έχει δώσει µέχρι σήµερα. Ακολούθως οφείλω ένα µεγάλο ευχαριστώ στην Οµότιµη Καθηγήτρια Προληπτικής Ιατρικής κα Βικτωρία Καλαποθάκη, επιβλέπουσα της διατριβής, για την καθοριστικής πραγµατικά σηµασίας προσφορά, καθοδήγηση και υποστήριξη που µου προσέφερε σε όλη τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας. Θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωµοσύνη µου στον Καθηγητή Παθολογίας κ. Γεώργιο Πετρίκκο και ότι θεωρώ µεγάλη µου τιµή να συµµετέχει ως µέλος στην 3µελή Συµβουλευτική Επιτροπή µου από την αρχή της εκπόνησης της διδακτορικής µου διατριβής. Ευχαριστώ τον Καθηγητή Επιδηµιολογίας και Προληπτικής Ιατρικής κύριο Άγγελο Χατζάκη για την αποδοχή της πρότασης να αντικαταστήσει την κυρία Ευαγγελία Ξηρουχάκη στη 3µελή Συµβουλευτική Επιτροπή µου και το ενδιαφέρον του για την ολοκλήρωση της εργασίας αυτής.

Θα ήταν παράλειψή µου να µην εκφράσω τις ευχαριστίες µου σε όλο το προσωπικό του Εργαστηρίου του ΓΝ Πειραιά «ΤΖΑΝΕΙΟ», και ειδικά στην Επιµελήτρια Α κα Ολυµπία Ζαρκωτού για την απλόχερη βοήθειά της όποτε την χρειάστηκα, καθώς και σε όσους κλινικούς γιατρούς και διοικητικό προσωπικό µε καλή διάθεση µε βοήθησαν κατά το στάδιο συλλογής των κλινικοεπιδηµιολογικών δεδοµένων των ασθενών. Ευγνωµοσύνη χρωστάω στη φίλη και συνάδελφο Βιολόγο ρα Σοφία Βουρλή για τις πολύτιµες γνώσεις και την αµέριστη βοήθειά της σε δύσκολες περιόδους, χωρίς την οποία απλά δεν θα τα είχα καταφέρει. Ευχαριστώ για τις πολύτιµες συµβουλές και τη συνεργασία µας όλα αυτά τα χρόνια καθώς και την εποικοδοµητική της κριτική στο τελικό κείµενο τη φίλη και συνάδερφο Βιολόγο ρα Παναγιώτα Γιακκούπη και στον ξενιτεµένο φίλο ρα Κώστα Παπαγιαννίτση για την αρωγή του σε τµήµα του πειραµατικού µέρους Σε επίπεδο καθαρά προσωπικό, δεν θα τα είχα καταφέρει χωρίς την υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια του συζύγου µου γιατρού Παθολόγου Μανώλη Νταουντάκη και χωρίς τη δύναµη που παίρνω από τους δυο γιους µας στους οποίους αφιερώνω τη διατριβή αυτή. Ευχαριστώ τέλος τους γονείς µου Γιώργο και Μαρία Τρυφινοπούλου και τους φίλους µου Στάθη Καστρίτη και Έλενα Θανασιά γιατί δε σταµάτησαν ποτέ να µε παροτρύνουν να συνεχίσω και να ολοκληρώσω την προσπάθεια αυτή.

Στους γιους µου Λεωνίδα και Γιώργο

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Eυρετήριο πινάκων i-iii Ευρετήριο εικόνων A. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Νοσοκοµειακές λοιµώξεις... 2 Gram-αρνητικά βακτηρίδια της Οικογένειας Enterobacteriaceae. 5 Μικροβιακή αντοχή στα αντιβιοτικά πολυαντοχή. 7 Οριζόντια µεταφορά γενετικού υλικού.. 9 Ιντεγκρόνια Integrons... 12 Β. ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Σκοπός... 27 2. Υλικό. 28 2.1 Σχεδιασµός µελέτης... 28 2.2 ιευκρινίσεις ορισµοί.. 29 3. Μέθοδοι. 31 3.1 Συνοπτική περιγραφή µικροβιολογικών και µοριακών µεθόδων... 31 3.2 Αναλυτική περιγραφή-πρωτόκολλα.. 33 3.3 Στατιστική επεξεργασία. 53 4. Αποτελέσµατα... 54 4.1 Πληθυσµός µελέτης 54 4.2 Μικροοργανισµοί συγκεντρωτικά στοιχεία. 57 4.3 Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά. 59 4.4 Κλινική έκβαση βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά... 66 4.4.1 ιάρκεια νοσηλείας µετά την έναρξη λοίµωξης και συνολική διάρκεια νοσηλείας. 66 4.4.2 Αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας 70 4.5 Μοριακή βάση της πολυαντοχής ο ρόλος των ιντεγκρονίων... 76 4.6 Ιντεγγκρόνια και τύπος βακτηριαιµίας... 88 4.7 Βακτηριαιµία από VIM-θετικά πολυανθεκτικά στελέχη εντεροβακτηριακών... 97 4.8 Βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis. 104 iv-v

4.9 Βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά στελέχη Enterobacter spp... 106 4.10 Εντεροβακτηριακά στελέχη από αποικισµούς ασθενών και ιντεγκρόνια. 107 4.11 Ιντεγκρόνια τάξης 2... 112 5. Συζήτηση συµπεράσµατα... 114 5.1 Παράγοντες κινδύνου λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά.. 116 5.2 Επίδραση της αποµόνωσης πολυανθεκτικού στελέχους στην έκβαση της λοίµωξης. 119 5.3 Μοριακή βάση της πολυαντοχής ο ρόλος των ιντεγκρονίων... 122 Περίληψη... 128 Βιβλιογραφία. 132 Παράρτηµα 142

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Αριθµός πίνακα Τίτλος πίνακα Σελίδα 1 Γονιδιακές κασέτες αντοχής που βρίσκονται σε ιντεγκρόνια 19 2 β-λακταµάσες τάξης Α κατά Ambler εδραζόµενες σε ιντεγκρόνια από Εντεροβακτηριακά Gram-αρνητικά βακτήρια 3 β-λακταµάσες τάξης Β κατά Ambler εδραζόµενες σε ιντεγκρόνια από Εντεροβακτηριακά Gram-αρνητικά βακτήρια 4 β-λακταµάσες τάξης D κατά Ambler εδραζόµενες σε ιντεγκρόνια από Εντεροβακτηριακά Gram-αρνητικά βακτήρια 5 Χαρακτηριστικά του πληθυσµού της µελέτης µε βακτηριαιµία από Εντεροβακτηριακό στέλεχος 6 Συγκεντρωτικά στοιχεία ανά είδος εντεροβακτηριακού ως προς την εµφάνιση πολυαντοχής, την αντοχή στις κυριότερες οµάδες αντιβιοτικών και την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 7 Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά Μονοπαραγοντική ανάλυση 8 Ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για λοίµωξη από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος Πολυπαραγοντική ανάλυση 9 Ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου µέσα στο νοσοκοµείο για λοίµωξη από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος- Πολυπαραγοντική ανάλυση 10 Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά σε 95 αρρώστους που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ Μονοπαραγοντική ανάλυση 11 Παράγοντες σχετιζόµενοι µε αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες για 116 ασθενείς µε βακτηριαιµία από Εντεροβακτηριακά στελέχη - Μονοπαραγοντική ανάλυση 12 Παράγοντες σχετιζόµενοι µε αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες για 89 ασθενείς που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ Μονοπαραγοντική ανάλυση 20 21 22 56 58 60 62 62 64 72 74 i

Αριθµός πίνακα Τίτλος πίνακα Σελίδα 13 Αδρή θνητότητα σε 89 αρρώστους (που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ) µε βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακά µετά από 75 διάστρωση των αρρώστων βάσει του είδους του υπεύθυνου εντεροβακτηριακού και κατανοµής σε ασθενείς-µάρτυρες βάσει εµφάνισης ή όχι πολυαντοχής των στελεχών 14 Παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 στους µικροοργανισµούς που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες ασθενών-µαρτύρων 15 Μέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίων τάξης 1 σε σχέση µε την πολυαντοχή των στελεχών που τα φέρουν 16 Παρουσία και µεγέθη ιντεγκρονίων τάξης 1 ανά είδος εντεροβακτηριακού 17 Γονιδιακό περιεχόµενο ιντεγκρονίων τάξης 1 σε σχέση µε την πολυαντοχή στα αντιβιοτικά 18 Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά εντεροβακτηριακών από καλλιέργειες αίµατος 19 Παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 σε σχέση µε τύπο βακτηριαιµίας 20 Μεγέθη ιντεγκρονίων τάξης 1 σε σχέση µε την προέλευση της βακτηριαιµίας 21 Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά εντεροβακτηριακών υπαίτιων βακτηριαιµίας κοινότητας 22 Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά και την τυποποίηση εντεροβακτηριακών υπαίτιων νοσοκοµειακής βακτηριαιµίας και βακτηριαιµίας σχετιζόµενης µε υπηρεσίες υγείας 23 Παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης λοίµωξης από πολυανθεκτικό στέλεχος που παράγει το µεταλλοένζυµο VIM- Μονοπαραγοντική ανάλυση 24 Κλινικά και επιδηµιολογικά χαρακτηριστικά ασθενών µε βακτηριαιµία από VIM-θετικό στέλεχος και µικροβιολογικά στοιχεία των αντίστοιχων στελεχών 77 79 82 85 87 91 92 93 95 99 101 ii

Αριθµός πίνακα Τίτλος πίνακα Σελίδα 25 Κλινικά και επιδηµιολογικά χαρακτηριστικά ασθενών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά στελέχη P. mirabilis και µικροβιολογικά στοιχεία των αντίστοιχων στελεχών 105 26 Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά εντεροβακτηριακών στελεχών από αποικισµούς ασθενών 27 Αντοχή στα αντιβιοτικά του συνόλου των εντεροβακτηριακών στελεχών σε σχέση µε την παρουσία ιντεγκρονίου τάξης 1. 28 Αντοχή σε συγκεκριµένα αντιβιοτικά ως προγνωστικός δείκτης παρουσίας ιντεγκρονίου τάξης 1 στο µικροβιακό πληθυσµό της µελέτης (Πολυπαραγοντική ανάλυση) 29 Πολυαντοχή και παραγωγή ευρέος φάσµατος και µεταλλο-βλακταµασών σε σχέση µε την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 στο σύνολο των 170 στελεχών (λοιµώξεις και αποικισµοί) 109 110 111 111 iii

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ Αριθµός εικόνας Τίτλος εικόνας Σελίδα 1 Συχνότητα αποµόνωσης στελεχών K.pneumoniae από 3 καλλιέργειες αίµατος και αντοχή σε κεφταζιντίµη και ιµιπενέµη στη διάρκεια µιας δεκαετίας (2000-2009)- WHOnet-Greece (21 st ECCMID-27 th ICC, Milan, Italy, 7-10 May 2011) 2 Μηχανισµοί αντοχής των Gram-αρνητικών βακτηριδίων και αντιβιοτικά που επηρεάζονται 3 Οι τρεις µηχανισµοί οριζόντιας µεταφοράς γενετικού υλικού µεταξύ των βακτηρίων (τροποποιηµένο από Nature Reviews 2006) 4 Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής ιντεγκρονίου τάξης 1 και ενός µοντέλου ενσωµάτωσης µιας γονιδιακής κασέτας 5 Σχηµατική αναπαράσταση των ιντεγκρονίων τάξης 2 στο τρανσποζόνιο Tn7 και στα συγγενή του τρανσποζόνια Tn1825 και Tn1826 6 Σχηµατική δοµή ιντεγκρονίου τάξης 3 που βρέθηκε ως τµήµα του Tn402 7 α ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία στους ασθενείς που επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος 7 β ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη συνολική διάρκεια νοσηλείας στους ασθενείς που επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος 8 α ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία στους ασθενείς που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ και επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος 8 β ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη συνολική διάρκεια νοσηλείας στους ασθενείς που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ και επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος 8 10 15 16 16 67 67 68 69 iv

Αριθµός εικόνας Τίτλος εικόνας Σελίδα 9 ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία στους επιβιώσαντες που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ 10 ιάγραµµα κατανοµής των 33 θανάτων σε σχέση µε το χρόνο από την εµφάνιση της βακτηριαιµίας 11 ιάγραµµα κατανοµής των 33 θανάτων σε σχέση µε το χρόνο από την εµφάνιση της βακτηριαιµίας και την πολυαντοχή του στελέχους 12 Εκατοστιαία αναλογία ανά βακτηριακό είδος στο σύνολο των πολυανθεκτικών στελεχών εντεροβακτηριακών 13 Εκατοστιαία αναλογία θετικών για ιντεγκρόνια τάξης 1 εντεροβακτηριακών στελεχών σε σχέση µε την εµφάνιση πολυαντοχής στα αντιβιοτικά 14 Μέσο µέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 σε σχέση µε την πολυαντοχή των στελεχών 15 Σχέση πολυαντοχής µε οµαδοποιηµένο µέγεθος ιντεγκρονίων τάξης 1 16 Σύγκριση µεγέθους ιντεγκρονίων σε εντεροβακτηριακά στελέχη από αιµοκαλλιέργειες ασθενών σε σχέση µε το τµήµα νοσηλείας 17 Μέσο µέγεθος ιντεγκρονίων τάξης 1 σε στελέχη εντεροβακτηριακών αναλόγως της προέλευσης της βακτηριαιµίας 18 Σύγκριση µέσου µεγέθους (mean ±2SE) ιντεγκρονίων τάξης 1 σε στελέχη εντεροβακτηριακών αναλόγως της προέλευσης της βακτηριαιµίας 19 Μεγέθη ιντεγκρονίων τάξης 1 από στελέχη που αποµονώθηκαν από αποικισµούς ασθενών σε σχέση µε την πολυαντοχή των στελεχών 20 Παρουσία ιντεγκρονίου τάξης 2 σε σχέση µε το είδος του εντεροβακτηριακού ανεξαρτήτως εστίας αποµόνωσης 69 70 71 76 77 78 80 81 89 90 108 113 v

Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1

1. Νοσοκοµειακές λοιµώξεις Οι λοιµώξεις παραδοσιακά ως προς την προέλευσή τους διακρίνονται σε νοσοκοµειακές ή κοινότητας, σύµφωνα µε τον κλασικό ορισµό του Εθνικού Συστήµατος Καταγραφής και Επιδηµιολογικής Επιτήρησης Νοσοκοµειακών Λοιµώξεων του CDC (National Nosocomial Infections Surveillance System, NNIS), (Garner JS et al, 1988) Οι νοσοκοµειακές λοιµώξεις αποτελούν ένα µεγάλο πρόβληµα δηµόσιας υγείας που θέτει σε κίνδυνο την ασφάλεια των ασθενών και εκφράζεται µε σηµαντική αύξηση των δεικτών της νοσηρότητας, της θνησιµότητας, καθώς επίσης της διάρκειας και του κόστους νοσηλείας. Στην ευρωπαϊκή ένωση υπολογίζεται ότι κάθε χρόνο, περίπου 4.100.000 ασθενείς εµφανίζουν νοσοκοµειακή λοίµωξη, µε τον εκτιµώµενο αριθµό θανάτων να αγγίζει τις 37.000 (ECDC, Technical report, 2011) Οι συνηθέστερες νοσοκοµειακές λοιµώξεις είναι αυτές του ουροποιητικού συστήµατος, του ανώτερου και κατώτερου αναπνευστικού συστήµατος, του χειρουργικού πεδίου και του αίµατος (βακτηριαιµίες). Οι βακτηριαιµίες θεωρούνται σηµαντικό αίτιο νοσηρότητας και θνησιµότητας παγκοσµίως. Η αναφερόµενη επίπτωση νοσοκοµειακής βακτηριαιµίας κυµαίνεται από 1,3 έως 18,4 επεισόδια ανά 1000 εισαγωγές στο νοσοκοµείο, ανάλογα µε τα χαρακτηριστικά του υπό µελέτη πληθυσµού, του µεγέθους του νοσοκοµείου, του τοµέα νοσηλείας και της συνολικής διάρκειας νοσηλείας (Suljanic V, et al, 2005). Πολλές µελέτες διεθνώς καταδεικνύουν αύξηση στη συχνότητά τους, αλλά και αλλαγή στα χαρακτηριστικά τους. Έτσι, τη δεκαετία του 70 οι Gram-αρνητικοί µικροοργανισµοί ήταν το πιο συχνό αίτιο, ενώ αργότερα, τη δεκαετία του 90 και αργότερα τους διαδέχτηκαν οι Gram-θετικοί κόκκοι και µάλιστα οι κοαγκουλάσηαρνητικοί σταφυλόκοκκοι, ο S. αureus και οι εντερόκοκκοι. (Bearman G et al, 2005, Ho J et al, 2010). Παρόλο που η πολυαντοχή µεταξύ των Gram-θετικών κόκκων και συγκεκριµένα η αντοχή του S.aureus στη µεθικιλλίνη (MRSA) και των εντεροκόκκων στη βανκοµυκίνη (VRE) κέρδισε το φως της δηµοσιότητας αλλά και την προσοχή της φαρµακοβιοµηχανίας προς τη δηµιουργία νέων δραστικών αντιβιοτικών, µια παράλληλη και ίσως πιο ανησυχητική εξέλιξη διαµορφώθηκε: η εµφάνιση πολυαντοχής στα Gram-αρνητικά βακτηρίδια (Nicasio A et all, 2008). Μάλιστα φαίνεται ότι οι οργανισµοί αυτοί επανέρχονται ως σηµαντικά αίτια βακτηριαιµίας ειδικά, αλλά και νοσοκοµειακών λοιµώξεων γενικότερα (Gaynes R et al, 2005, Ho J 2

et al, 2010). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει προκαλέσει η ανάδυση εντεροβακτηριακών στελεχών που παράγουν β-λακταµάσες µε υδρολυτικές ικανότητες έναντι όλων σχεδόν των β-λακταµικών αντιβιοτικών περιλαµβανοµένων και των καρβαπενεµών. Σε µία πρόσφατη ανάλυση των διαχρονικών τάσεων ως προς τη σχετική συχνότητα αποµόνωσης και την αντοχή στα αντιβιοτικά των σηµαντικότερων παθογόνων-αιτίων βακτηριαιµίας την τελευταία δεκαετία (2000-2009) στη χώρα µας (Polemis M et al, 2011) διαπιστώθηκε µία στατιστικά σηµαντική αύξηση στη συχνότητα αποµόνωσης στελεχών K. pneumoniae από καλλιέργειες αίµατος τόσο νοσηλευόµενων στη ΜΕΘ όσο και στις κλινικές 21 νοσοκοµείων που περιλήφθηκαν στη µελέτη µε ταυτόχρονη διαχρονική αύξηση της αντοχής στα νεότερα β-λακταµικά αντιβιοτικά (εικόνα 1). Resistance & isolation frequency of K.pneumoniae in wards Resistance & isolation frequency of K.pneumoniae in I.C.U. 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 16,0% 14,0% 12,0% 10,0% 8,0% 6,0% 4,0% 2,0% 0,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% (>) Isolation frequency (secondary axis) (>) %Resistance to imipenem (primary axis) (>) %Resistance to ceftazidime (primary axis) (Figure 3) (>) Isolation frequency (secondary axis) (>) %Resistance to imipenem (primary axis) (>) %Resistance to ceftazidime (primary axis) (Figure 4) Εικόνα 1: Συχνότητα αποµόνωσης στελεχών K.pneumoniae από καλλιέργειες αίµατος και αντοχή σε κεφταζιντίµη και ιµιπενέµη στη διάρκεια µιας δεκαετίας (2000-2009)- WHOnet-Greece (21 st ECCMID-27 th ICC, Milan, Italy, 7-10 May 2011) Oι βακτηριαιµίες παραδοσιακά διακρίνονται σε νοσοκοµειακές και κοινότητας. Τα τελευταία χρόνια όµως στις αναπτυγµένες χώρες παρατηρούνται αλλαγές στα συστήµατα παροχής υπηρεσιών υγείας που έχουν µετατοπίσει ένα σηµαντικό µέρος της φροντίδας των ασθενών από το νοσοκοµείο σε µονάδες παροχής υγείας στην κοινότητα, όπως κλινικές, κέντρα αποκατάστασης, οίκους ευγηρίας, ακόµη και ως εξειδικευµένη νοσηλεία κατ οίκον. Αυτή η τάση, καθώς και άλλοι παράγοντες, δηµιούργησε ένα µεγάλο πληθυσµό ασθενών που χρειάζονται συχνή επαφή µε τα συστήµατα υγειονοµικής περίθαλψης. Λοιµώξεις που διαγιγνώσκονται 3

µέσα στις πρώτες 48 ώρες από την εισαγωγή ασθενούς µε πρόσφατη νοσηλεία, ή διαµένοντα σε κλινική ή ίδρυµα ή υποβαλλόµενου σε παρεµβατικούς ιατρικούς χειρισµούς σε εξωνοσοκοµειακό περιβάλλον είναι δύσκολο να ταξινοµηθούν. Η αυστηρή διάκριση εποµένως µεταξύ νοσοκοµειακής ή από την κοινότητα προέλευσης της λοίµωξης έχει καταστεί λιγότερο σαφής µε ορισµένες λοιµώξεις να έχουν µικτά χαρακτηριστικά των δύο τύπων αιτιολογικής προέλευσης. Το ερώτηµα λοιπόν που προέκυψε ήδη από τις αρχές της δεκαετίας, ήταν µήπως χρειάζεται µια επιπλέον κατηγορία, προκειµένου να συµπεριληφθούν λοιµώξεις που εµφανίζονται σε εξωνοσοκοµειακούς ασθενείς που έχουν όµως τακτική ή πρόσφατη επαφή µε το διευρυµένο πλέον σύστηµα παροχής υπηρεσιών υγείας. Σε µια µελέτη-ορόσηµο από τους Friedman et al (Freidman ND et al, 2002) προτάθηκε να προστεθεί µια τρίτη κατηγορία στον αρχικό ορισµό του CDC, αυτή της λοίµωξης που σχετίζεται µε υπηρεσίες υγείας. Στη µελέτη αυτή, που περιορίζεται στη διάκριση των βακτηριαιµιών σε σχέση µε την προέλευσή τους, προτάθηκε το εξής σύστηµα ταξινόµησης των βακτηριαιµιών: Νοσοκοµειακή βακτηριαιµία: επί θετικής αιµοκαλλιέργειας σε ασθενείς που ήδη νοσηλεύονταν για 48 ώρες ή περισσότερο. Εφόσον ο άρρωστος διακοµίστηκε από άλλο νοσοκοµείο, η διάρκεια της παραµονής στο νοσοκοµείο υπολογίζεται από την ηµέρα της εισαγωγής στο πρώτο νοσοκοµείο Βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας: θετική αιµοκαλλιέργεια κατά την εισαγωγή ή εντός 48 ωρών από την εισαγωγή, εφόσον ο ασθενής πληροί οποιοδήποτε από τα παρακάτω κριτήρια: i. Είχε λάβει στο σπίτι ενδοφλέβια αντιβιοτική αγωγή, ή εξειδικευµένη νοσηλευτική φροντίδα έως και 30 ηµέρες πριν τη βακτηριαιµία ii. Επισκεπτόταν νοσοκοµείο ή κλινική για αιµοκάθαρση ή για λήψη ενδοφλέβιας χηµειοθεραπείας iii. Είχε νοσηλευθεί για 2 ή περισσότερες ηµέρες σε νοσοκοµείο έως και 90 ηµέρες (3 µήνες) πριν την εκδήλωση της βακτηριαιµίας iv. ιαµένει σε οίκο ευγηρίας ή κέντρο αποκατάστασης ή κλινική 4

Βακτηριαιµία κοινότητας: θετική αιµοκαλλιέργεια κατά την εισαγωγή ή εντός 48 ωρών από την εισαγωγή, εφόσον ο ασθενής δεν πληροί τα παραπάνω κριτήρια για βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας. Αυτό το προτεινόµενο σχήµα ταξινόµησης της βακτηριαιµίας ισχυροποιήθηκε και από τα ευρήµατα µεταγενέστερων µελετών (Shorr A et al 2006, Marschal J et al, 2009, Lenz R et al, 2012) και χρησιµοποιείται στις περισσότερες µελέτες προοπτικές ή αναδροµικές που ασχολούνται µε ασθενείς µε βακτηριαιµία. Μεταξύ των σηµαντικότερων αιτιολογικών παραγόντων βακτηριαιµίας είναι µέλη της Οικογένειας Enterobacteriaceae. 2. Οικογένεια Enterobacteriaceae Γενικά χαρακτηριστικά Τα Εντεροβακτηριακά είναι µια Οικογένεια Gram αρνητικών βακτηριδίων που ευθύνεται για ένα ευρύ φάσµα λοιµώξεων τόσο νοσοκοµειακών όσο και κοινότητας. Βρίσκονται στο περιβάλλον (έδαφος και νερό) και αποτελούν µέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου των ανθρώπων και των ζώων. Μερικά µέλη της οικογένειας είναι πάντοτε παθογόνα για τον άνθρωπο, όπως τα είδη που ανήκουν στα γένη Shigella, Salmonella και το είδος Y.pestis, ενώ άλλα είδη όπως Ε.coli, K.pneumoniae, P.mirabilis αποτελούν µέλη της φυσιολογικής χλωρίδας και είναι δυνατό να προκαλέσουν ευκαιριακές λοιµώξεις. Τα µέλη της οικογένειας των Εντεροβακτηριακών είναι από τα συχνότερα παθογόνα που µολύνουν τον άνθρωπο παγκοσµίως. Είναι επίσης σηµαντικό να τονιστεί ότι, ως µέλη της φυσιολογικής χλωρίδας του γαστρεντερικού σωλήνα, η αποµόνωσή τους µπορεί να αντανακλά αποικισµό και όχι πραγµατική λοίµωξη (Goldman s Cecil Medicine, 2012). Κλινικά σύνδροµα Παρ ότι ορισµένα στελέχη E. coli είναι αυστηρώς εντερικά παθογόνα, προκαλώντας γαστρεντερίτιδα µε ποικίλους παθογενετικούς µηχανισµούς, οι εξωεντερικές λοιµώξεις είναι τα κυρίαρχα νοσήµατα από Gram-αρνητικά βακτηρίδια. Κάθε όργανο ή κοιλότητα του σώµατος µπορεί να προσβληθεί, κάτι που εξαρτάται από το µικρόβιο, αλλά και από τον ίδιο τον ξενιστή. Το E.coli και σε µικρότερο βαθµό η Klebsiella και ο Proteus είναι υπεύθυνα για τις περισσότερες εξωεντερικές 5

λοιµώξεις από Gram-αρνητικά βακτηρίδια και είναι οι πιο λοιµογόνοι µικροοργανισµοί αυτής της Οικογένειας. Όµως και άλλα γένη καθίστανται σηµαντικά µε ολοένα αυξανόµενο βαθµό, κυρίως σε νοσοκοµειακούς ασθενείς ή ασθενείς που διαµένουν σε ιδρύµατα ή κλινικές. Αυτό οφείλεται στην ενδογενή, αλλά κυρίως στην επίκτητη αντοχή αυτών των µικροοργανισµών στα αντιβιοτικά, καθώς και στον συνεχώς αυξανόµενο αριθµό ατόµων µε επηρεασµένο το ανοσολογικό τους σύστηµα. Τυπικό παράδειγµα είναι το γένος Enterobacter που αναδεικνύεται σε σηµαντικό νοσοκοµειακό παθογόνο (Harrison s Principles of Internal Medicine, 2008). Βακτηριαιµία από µέλη της Οικογένειας Enterobacteriaceae Βακτηριαιµία από E.coli µπορεί να ανακύψει από πρωτοπαθή λοίµωξη σε οποιαδήποτε εξωεντερική θέση. Η αποµόνωση E.coli στο αίµα είναι πάντοτε κλινικά σηµαντική, καθώς τυπικά συνοδεύεται από σηπτικό σύνδροµο, βαριά σήψη ή σηπτικό shock. Το ουροποιητικό σύστηµα είναι η συχνότερη πρωτοπαθής εστία βακτηριαιµίας από E.coli, υπολογίζοντας ότι τα µισά έως τα δύο τρίτα των επεισοδίων προέρχονται από αυτό. Η βακτηριαιµία από το ουροποιητικό είναι συχνή σε ασθενείς µε πυελονεφρίτιδα, απόφραξη ή παρεµβατικούς χειρισµούς στο ουροποιητικό σύστηµα. Η κοιλία είναι η δεύτερη συχνότερη πηγή βακτηριαιµίας από E.coli προκαλώντας το ένα τέταρτο των επεισοδίων κυρίως λόγω απόφραξης των χοληφόρων (λιθίαση, όγκος) και εµφανούς ρήξης εντέρου. Τέλος λοιµώξεις µαλακών µορίων, οστών, πνευµόνων και ενδοφλεβίων καθετήρων µπορεί επίσης να αποτελέσουν την πρωτοπαθή εστία για βακτηριαιµία από E.coli. Ως προς τα στελέχη του είδους K.pneumoniae, λοίµωξη οποιουδήποτε οργάνου µπορεί να αποτελέσει αίτιο βακτηριαιµίας. Λοιµώξεις των ουροφόρων, του αναπνευστικού συστήµατος και της κοιλίας (κυρίως ηπατικά αποστήµατα) ευθύνονται έκαστες για το 15-30% των επεισοδίων βακτηριαιµίας από K.pneumoniae. Ενδοφλέβιοι καθετήρες ευθύνονται για άλλο ένα 5-15% των επεισοδίων και λοιµώξεις χειρουργικού πεδίου ή άλλες για το υπόλοιπο. Η πλειοψηφία των βακτηριαιµιών από P.mirabilis ξεκινούν από τον ουροποιητικό σωλήνα, αν και άλλες εστίες όπως και ενδοφλέβιοι καθετήρες αποτελούν σπάνιες αλλά δυνητικές πηγές. 6

Η ικανότητα να προκαλέσουν σηπτικό shock είναι ένα καθοριστικό χαρακτηριστικό αυτών των µικροβίων. Τα Gram-αρνητικά βακτηρίδια είναι τα συχνότερα αίτια αυτού του δυνητικά θανατηφόρου κλινικού συνδρόµου. Το λιπίδιο Α του λιποπολυσακχαρίτη (LPS) της εξωτερικής µεµβράνης και πιθανόν και άλλοι βακτηριακοί παράγοντες προκαλούν µια προφλεγµονώδη απόκριση του ξενιστή, η οποία αν είναι υπερβολική καταλήγει σε καταπληξία (shock). ιάγνωση Η αποµόνωση Gram-αρνητικού βακτηριδίου από φυσιολογικώς στείρες ανατοµικές περιοχές είναι πάντοτε ενδεικτική λοίµωξης, η αποµόνωσή τους όµως από µη στείρες περιοχές, ιδίως από ανοιχτά τραύµατα και το αναπνευστικό µπορεί να αντανακλά αποικισµό και όχι πραγµατική λοίµωξη. Θνητότητα Η θνητότητα λοιµώξεων από Εντεροβακτηριακά είναι σηµαντική και συσχετίζεται µε τη σοβαρότητα της κλινικής εικόνας. Ιδιαιτέρως προβληµατική είναι η πνευµονία και η βακτηριαιµία (από οποιαδήποτε πρωτοπαθή εστία) όταν επιπλέκεται από ανεπάρκεια οργάνου (σοβαρή σήψη) ή/και σηπτική καταπληξία, µε ποσοστά θνητότητας 20-50%. (Harrison s Principles of Internal Medicine, 2008) 3. Αντοχή στα αντιβιοτικά Αν και η αντοχή των µικροβίων στα αντιβιοτικά απασχολεί την επιστηµονική κοινότητα από τα πρώτα κιόλας χρόνια εισαγωγής της πενικιλλίνης στη θεραπευτική των λοιµώξεων, τις τελευταίες δύο δεκαετίες έχει πάρει εφιαλτικές πραγµατικά διαστάσεις. Η προσοχή στρέφεται κυρίως στα Gram-αρνητικά βακτηρίδια, λόγω της επίκτητης αντοχής τους στις περισσότερες οµάδες αντιβιοτικών µέσω απόκτησης κινητών γενετικών δοµών που σε συνδυασµό µε την έλλειψη νέων δραστικών φαρµάκων αποτελούν σηµαντικό πρόβληµα καθώς δυσχεραίνεται η θεραπεία των σοβαρών λοιµώξεων που προκαλούν (Bush K, 2010). Υπάρχουν διάφοροι µηχανισµοί µε τους οποίους οι Gram-αρνητικοί µικροοργανισµοί αναπτύσσουν αντοχή στα αντιβιοτικά, που αποδίδονται σχηµατικά 7

στην εικόνα 2, οι κυριότεροι των οποίων είναι η παραγωγή ενζύµων που υδρολύουν ή τροποποιούν το αντιβιοτικό (πχ β-λακταµάσες και αµινογλυκοσιδοτροποποιητικά ένζυµα), οι µεταλλαγές στις θέσεις-στόχους του αντιβιοτικού, η ελαττωµένη πρόσληψη του αντιβιοτικού και η ενεργός απέκκριση του αντιβιοτικού από το βακτηριακό κύτταρο. Τροποποιηµένο από: Peleg A et al, N Engl J Med, 2010 Εικόνα 2: Μηχανισµοί αντοχής των Gram-αρνητικών βακτηριδίων και αντιβιοτικά που επηρεάζονται: Οκτώ διαφορετικοί µηχανισµοί ανάπτυξης αντοχής στα αντιβιοτικά φαίνονται σε αυτό το Gram-αρνητικό βακτηρίδιο, γενετικές πληροφορίες για τους περισσότερους από τους οποίους υπάρχουν σε ένα κινητό πλασµίδιο. Αυτοί περιλαµβάνουν: 1. Απώλεια πορινών που προκαλεί µειωµένη είσοδο του αντιβιοτικού µέσω της µεµβράνης 2. Παρουσία β-λακταµασών στον περιπλασµικό χώρο που καταστρέφουν τα β- λακταµικά αντιβιοτικά 3. Υπερέκφραση αντλίας εκροής που αποµακρύνει το αντιβιοτικό προτού δράσει 4. Τροποποιητικά ένζυµα που µεταβάλλουν τη δοµή του αντιβιοτικού 5. Μεταλλαγές του στόχου-δράσης του αντιβιοτικού 6. Μεταλλαγές ή τροποποιήσεις των ριβοσωµατίων που οδηγούν σε αδυναµία πρόσδεσης του αντιβιοτικού και αναστολής της πρωτεινοσύνθεσης 7. Παράκαµψη στόχων 8. Μεταλλαγές του πολυσακχαρίτη που οδηγούν σε αδυναµία πρόσδεσης του αντιβιοτικού 8

Πολυαντοχή στα αντιβιοτικά Η ανάπτυξη αντοχής σε πολλαπλούς αντιµικροβιακούς παράγοντες εξελίσσεται σε σηµαντικό πρόβληµα δηµόσιας υγείας, καθώς αφήνει µικρά περιθώρια, αν όχι ανύπαρκτα, για χορήγηση αποτελεσµατικής θεραπείας. Παραπάνω από ένας µηχανισµοί µπορεί να βρίσκονται στο ίδιο βακτηριακό κύτταρο, προκαλώντας έτσι έναν πολυανθεκτικό φαινότυπο αντοχής. Η πολυαντοχή στα αντιβιοτικά µπορεί να συµβεί σε ένα ή περισσότερα στάδια: Oριζόντια µεταφορά γενετικού υλικού-απόκτηση πλασµιδιακού DNA (ή DNA από µεταθετά στοιχεία-transposons) που φέρει πολλαπλά γονίδια αντοχής. Στην περίπτωση αυτή η πολυαντοχή µπορεί να προκύψει µέσω µιας διαδικασίας ενός σταδίου (µεταφορά πλασµιδίου πολυαντοχής µέσω σύζευξης). Τα γονίδια αντοχής που βρίσκονται σε πλασµίδια συχνά αποτελούν τµήµα µεταθετών στοιχείων και /ή ιντεγκρονίων. Ο µηχανισµός αυτός ευθύνεται συχνότερα για απόκτηση πολυαντοχής σε µέλη της οικογένειας των εντεροβακτηριακών και περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω µε έµφαση κυρίως στο ρόλο των ιντεγκρονίων. Πολυαντοχή που οφείλεται σε ένα µόνο γονίδιο, συνήθως µια αντλία εκροής (efflux pump) που προσδίδει αντοχή σε διαφορετικές κατηγορίες αντιβιοτικών. Οι αντλίες αυτές µπορεί να βρίσκονται στο βακτηριακό χρωµόσωµα, αλλά και σε πλασµίδια, τρανσποζόνια και ιντεγκρόνια. Συσσώρευση διαφορετικών άσχετων µεταξύ τους µεταλλαγών που προϋποθέτει περισσότερα του ενός, διαδοχικά στάδια. Οριζόντια µεταφορά γενετικού υλικού Η ανταλλαγή γενετικού υλικού µεταξύ των µικροοργανισµών έχει ως αποτέλεσµα τον εµπλουτισµό τους µε νέα γονίδια. Οι κύριοι µηχανισµοί µεταφοράς γενετικής πληροφορίας µεταξύ των βακτηρίων είναι η µεταµόρφωση (transformation), η µεταγωγή (transduction) και η σύζευξη (conjugation). (εικόνα 3) 9

Εικόνα 3: οι τρεις µηχανισµοί οριζόντιας µεταφοράς γενετικού υλικού µεταξύ των βακτηρίων (τροποποιηµένο από Nature Reviews 2006) Η µεταµόρφωση αφορά στην ικανότητα του βακτηρίου να προσλαµβάνει και να ενσωµατώνει γυµνό DNA, το οποίο απελευθερώνεται στο περιβάλλον µετά από αυτόλυση βακτηρίων. Στην οριζόντια µεταφορά, µε τη διαδικασία της µεταµόρφωσης, των αντίστοιχων γονιδίων µεταξύ των διαφόρων οροτύπων πνευµονιοκόκκου ή µεταξύ πνευµονιοκόκκων και πρασινιζόντων στρεπτοκόκκων οφείλεται η εµφάνιση ανθεκτικών στην πενικιλλίνη στελεχών πνευµονιοκόκκου. Η µεταγωγή ορίζεται ως η µεταφορά τµήµατος DNA ενός βακτηρίου σε ένα άλλο βακτήριο µέσω φάγου. Η µεταγωγή αποτελεί σηµαντικό µηχανισµό εµπλουτισµού βακτηρίων µε γονίδια παθογονικότητας. Όσον αφορά τη µετακίνηση γονιδίων αντοχής φαίνεται ότι η µεταγωγή είναι µάλλον ασυνήθιστος τρόπος. Παράδειγµα απόκτησης νέου γενετικού υλικού µε µεταγωγή αποτελεί η µεταφορά µε φάγο του γονιδίου tox που κωδικογραφεί την αντίστοιχη εξωτοξίνη στα λυσιγόνα στελέχη του κορυνοβακτηριδίου της διφθερίτιδας. 10

Η σύζευξη αποτελεί το συχνότερο µηχανισµό οριζόντιας µεταφοράς γενετικού υλικού. Κατά τη διαδικασία αυτή µέσω της φυσικής επαφής δύο µικροβιακών κυττάρων και παραγωγής συζευκτικού ινιδίου µεταβιβάζει το ένα κύτταρο στο άλλο αντίγραφο του πλασµιδίου του. Η σύζευξη είναι ιδιότητα του πλασµιδίου και όχι του βακτηριακού κυττάρου. Ανάλογα µε την ικανότητα τους να µεταφέρουν αντίγραφά τους σε άλλα βακτήρια, τα πλασµίδια διακρίνονται σε συζευκτικά ή µη. Επιπρόσθετα τα συζευκτικά πλασµίδια έχουν την ικανότητα να κινητοποιούν µη συζευκτικά πλασµίδια. Τέλος ανάλογα µε την ικανότητά τους να συνυπάρχουν στο ίδιο βακτηριακό κύτταρο, τα πλασµίδια ταξινοµούνται σε οµάδες ασυµβατότητας. (Summers A, 2006) Τονίζεται ότι η µετακίνηση γενετικού υλικού που κωδικοποιεί αντοχή δεν απαιτεί παρουσία αντιβιοτικού. Πρόκειται για αυτόµατες βιολογικές διαδικασίες στα πλαίσια διατήρησης της γενετικής ποικιλότητας. Συχνά τα γονίδια αντοχής φέρονται από κινητά στοιχεία, πλασµίδια και µεταθετά, τα οποία µεταβάλλονται αυτόµατα προσλαµβάνοντας ή χάνοντας γονίδια αντοχής. Η ανακάλυψη πλασµιδίων µε ευρύ φάσµα ξενιστών αποτελεί ένδειξη για το σηµαντικό ρόλο των πλασµιδίων στην ανταλλαγή γενετικού υλικού µεταξύ µη συγγενικών οργανισµών. Τα πλασµίδια είναι φορείς σηµαντικών µηχανισµών αντοχής ( β-λακταµάσες, τροποποιητικά των αµινογλυκοσιδών κ.α). Μεγάλο µέρος ενός πλασµιδίου αντοχής είναι επίκτητο και τα γονίδια αντοχής βρίσκονται σε αυτά ακριβώς τα επίκτητα τµήµατα DNA ενός πλασµιδίου ( µεταθετά, ένθετες αλληλουχίες, ιντεγκρόνια). Κινητικότητα γονιδίων αντοχής Η ανακάλυψη των µεταθετών στοιχείων τη δεκαετία του 1970 έδωσε την απάντηση στο ερώτηµα σχετικά µε τη δυνατότητα των πλασµιδίων να αποκτούν τόσο εύκολα γονίδια αντοχής. Η µετάθεση αφορά στη µετακίνηση ενός τµήµατος DNA σε µία άλλη περιοχή του ίδιου ή άλλου µορίου, χωρίς να είναι απαραίτητη η οµολογία στις αλληλουχίες µεταξύ αυτών των τµηµάτων ούτε η µεσολάβηση ενδιάµεσων φορέων, όπως φάγων ή πλασµιδίων. Τα τµήµατα DNA που έχουν την ικανότητα µετάθεσης λέγονται µεταθετά στοιχεία (transposons). Έχουν περιγραφεί τρεις κατηγορίες µεταθετών στοιχείων οι ένθετες αλληλουχίες (IS), τα σύνθετα µεταθετά 11

στοιχεία (τρανσποζόνια τάξης Ι) και τα µεταθετά στοιχεία της οικογένειας Tn3- Tn21 (τρανσποζόνια τάξης ΙΙ). Χαρακτηριστικό της δοµής των µεταθετών στοιχείων είναι η παρουσία µικρού µήκους οµόλογων ανεστραµµένων αλληλουχιών στα άκρα τους. Συζευκτικά µεταθετά στοιχεία ( conjugative transposons) είναι τµήµατα DNA που έχουν την ικανότητα να αποκόπτονται από το µόριο του DNA και να δηµιουργούν ενδιάµεσα κυκλικά προϊόντα που µπορούν να ενσωµατωθούν στο DNA του ίδιου ή µέσω σύζευξης στο DNA άλλου βακτηριακού κυττάρου. Επιπλέον έχουν την ικανότητα να κινητοποιούν µη συζευκτικά πλασµίδια, αλλά και άλλα ενσωµατωµένα στο DNA στοιχεία. Τα πλασµίδια και τα τρανσποζόνια έχουν µελετηθεί εκτενώς. Στη συνέχεια περιγράφονται τα ιντεγκρόνια, δοµές που είναι σε στενή σχέση µε πλασµίδια και µεταθετά στοιχεία. Ιντεγκρόνια Τη δεκαετία του 80 περιγράφηκαν γενετικές δοµές µε ικανότητα ενσωµάτωσης ή απώλειας γονιδίων κυρίως αντοχής που ονοµάστηκαν ιντεγκρόνια (Integrons). Αναλυτικότερα, ως ιντεγκρόνια ορίζονται γενετικά στοιχεία που περιέχουν τους απαραίτητους καθοριστές ενός συστήµατος ανασυνδυασµού ειδικής θέσης, µε τη βοήθεια του οποίου µπορούν να αναγνωρίζουν και να παγιδεύουν γονίδια, κυρίως αντοχής, που κυκλοφορούν µε τη µορφή γονιδιακών κασετών και να τα θέτουν υπό το µεταγραφικό έλεγχο ενός ισχυρού υποκινητή, εξασφαλίζοντας µε αυτόν τον τρόπο την έκφρασή τους. (Carattoli A, 2001). Βασικά στοιχεία αυτού του συστήµατος παγίδευσης γονιδίων είναι η θέση ανασυνδυασµού atti, στην οποία πρόσθετο DNA µπορεί να ενσωµατωθεί ή να αποκοπεί µε ανασυνδυασµό ειδικής θέσης, το γονίδιο inti που κωδικοποιεί για το ένζυµο ιντεγκράση που ελέγχει και µεσολαβεί για τα γεγονότα αυτά και ο υποκινητής P. Τα ιντεγκρόνια µπορεί να εδράζονται στο βακτηριακό χρωµόσωµα ή σε πλασµίδια ευρέος φάσµατος ξενιστών. εν κινούνται τα ίδια, αλλά χρησιµοποιούν τα µεταθετά σαν οχήµατα. Κάποια τρανσποζόνια µάλιστα είναι γνωστό ότι σχετίζονται µε την κινητοποίηση των ιντεγκρονίων. Ιντεγκρόνια τάξης 1 και 2 πολύ συχνά 12

µεταφέρονται από τα Tn21 και Tn7 µεταθετά στοιχεία αντίστοιχα. Επιπλέον, κάποια ιντεγκρόνια αναγνωρίστηκαν σε στενή συσχέτιση ή και ακριβώς δίπλα σε ένθετες αλληλουχίες (IS, Insertion Sequences). Τέλος, ιντεγκρόνια ενσωµατώνονται ως επίκτητα τµήµατα DNA σε συζευκτικά πλασµίδια αντοχής µε συνέπεια τη µεταφορά τους µέσω σύζευξης σε ένα ευρύ φάσµα ξενιστών. Μπορούµε εποµένως να τα θεωρήσουµε ως φυσικώς απαντώντα οχήµατα συσσώρευσης, έκφρασης αλλά και µετάδοσης γονιδίων αντοχής en bloc. Είναι προφανές ότι ο συνδυασµός ενός πολύ αποτελεσµατικού συστήµατος παγίδευσης γονιδίων αντοχής και έκφρασής τους µε την ικανότητα για κάθετη ή οριζόντια µεταφορά καθιστά τα ιντεγκρόνια ένα ισχυρό όπλο των βακτηρίων στην απειλή των αντιβιοτικών (Carattoli A, 2001). Ταξινόµηση και δοµή ιντεγκρονίων Τα ιντεγκρόνια µπορούν να διακριθούν σε δύο µεγάλες κατηγορίες: τα ιντεγκρόνια αντοχής (Resistance Integrons RI) και τα Super-Integrons SI. Τα ιντεγκρόνια αντοχής φέρουν κασέτες, συνήθως λιγότερες από 10, που κωδικοποιούν για αντοχή σε αντιβιοτικά και απολυµαντικά και µπορεί να εδράζονται σε τρανσποζόνια, πλασµίδια ή και στο χρωµόσωµα των βακτηρίων διαφόρων ειδών. Αντίθετα τα Super-Integrons είναι πολύ µεγάλα ιντεγκρόνια που βρίσκονται µόνο στο χρωµόσωµα, µπορεί να περιέχουν πάνω από 100 γονιδιακές κασέτες µε ποικίλες ιδιότητες και είναι ειδικά του είδους (Fluit AC and Schmitz FJ. 2004, Mazel D. 2006) Αρκετές τάξεις ιντεγκρονίων είναι γνωστές µέχρι σήµερα. Η διάκριση σε τάξεις βασίζεται στην οµολογία των ιντεγκρασών. Τρεις τάξεις (οι τάξεις 1,2 και 3) έχουν µελετηθεί καλά και σχετίζονται µε τη µικροβιακή αντοχή. Ένα ιντεγκρόνιο που περιγράφηκε αρχικά ως τάξης 4 πλέον θεωρείται ως το Super-Integron του Vibrio cholerae. Στην τάξη 1 η ιντεγκράση IntI1 είναι µια πρωτεΐνη µε 337 αµινοξέα. Αναγνωρίζει τρεις θέσεις ανασυνδυασµού: atti1, attc και δευτεροταγούς δοµής σηµεία. Η ιντεγκράση IntI2 των ιντεγκρονίων τάξης 2 παρουσιάζει 46% οµολογία µε την IntI1 και το µόριο της είναι κολοβωµένο κατά 12 αµινοξέα. Η ιντεγκράση IntI2 θεωρείται µη λειτουργική εξαιτίας της παρουσίας ενός εσωτερικού κωδικονίου λήξης (TAA). Ο λόγος ύπαρξης αυτού του κωδικονίου δεν είναι ξεκάθαρος, ίσως όµως το 13

γονίδιο να είναι ένα ψευδογονίδιο. Η µη λειτουργική ιντεγκράση µπορεί να είναι η αιτία της µικρής ποικιλίας διαφορετικών γονιδιακών κασετών που παρατηρούνται στα τάξης 2 ιντεγκρόνια σε σχέση µε τα τάξης 1. Το 1995 περιγράφηκε και τρίτη τάξη ιντεγκρονίων που η ιντεγκράση τους IntI3 παρουσιάζει 61% οµολογία µε την IntI1. Η ιντεγκράση IntI3 έχει λειτουργικότητα ανάλογη µε την IntI1 και αναγνωρίζει και µπορεί να ενσωµατώσει ή να αποκόψει από τη θέση atti3 πλήθος διαφορετικών γονιδιακών κασετών (Fluit AC and Schmitz FJ, 2004) Τα περισσότερα ιντεγκρόνια ανήκουν στην τάξη 1 και έχουν περιγραφεί σε πολλά γένη Gram αρνητικών βακτηρίων (Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Burkholderia, Campylobacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella και Vibrio). Υπάρχουν όµως και δηµοσιεύσεις για παρουσία ιντεγκρονίων µεταξύ Gramθετικών βακτηρίων, όπως σε στέλεχος Corynebacterium glutamicum, (Nesvera et al, 1998), ενώ και µια γονιδιακή κασέτα που προσδίδει αντοχή στις αµινογλυκοσίδες έχει βρεθεί σε Enterococcus faecalis (Clark et al,1999). Μια πιο πρόσφατη δηµοσίευση παρουσιάζει ένα διαφορετικό σκηνικό. Οι ερευνητές αναφέρουν την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 σε σταφυλοκόκκους, αερόκοκκους και κορυνοβακτηρίδια που αποµονώθηκαν από περιττώµατα πουλερικών από φάρµες εκτροφής, στις οποίες γινόταν προφυλακτική χρήση αντιβιοτικών και µάλιστα ότι τα Gram-θετικά βακτήρια φαίνεται ότι αποτελούν µια µεγάλη δεξαµενή γονιδίων αντοχής που σχετίζονται µε ιντεγκρόνια τάξης 1 σε αυτό το περιβάλλον. (Nandi S et al, το 2004) Τα ιντεγκρόνια τάξης 1 είναι ο κυριότερος εκπρόσωπος και έχει µελετηθεί εκτενέστερα. Αποτελούνται από δύο συντηρηµένες περιοχές DNA, δηλαδή περιοχές µε σηµαντική οµοιότητα στην αλληλουχία βάσεων, τo 5 και 3 συντηρηµένο τµήµα αντίστοιχα (5 -conserved segment, 5-CS, 3 -conserved segment, 3-CS) µεταξύ των οποίων παρεµβάλλεται άλλοτε άλλου µεγέθους τµήµα DNA που περιλαµβάνει τις γονιδιακές κασέτες που έχουν ενσωµατωθεί σε γραµµική µορφή. Το 5 -συντηρηµένο άκρο (5-CS) έχει µέγεθος 1360 βάσεις και περιέχει το γονίδιο inti1, που κωδικοποιεί για το ένζυµο ιντεγκράση που είναι υπεύθυνο για την ενσωµάτωση των γονιδίων σε ειδική θέση (aati), την παρακείµενη αυτή θέση που αναγνωρίζεται από την ιντεγκράση και λειτουργεί ως υποδοχέας για τις γονιδιακές κασέτες δηλαδή την aati, και τους υποκινητές (promoters) των γονιδίων αντοχής. Υπάρχουν δύο υποκινητές, ο P 1 (λέγεται και P ANT ) και ο P 2. Ο δεύτερος συνήθως 14

είναι ανενεργός. Έχουν περιγραφεί τουλάχιστον πέντε διαφορετικοί P 1 και δύο διαφορετικοί P 2 και παρατηρούνται διάφοροι συνδυασµοί τους. Το 3 -συντηρηµένο άκρο φέρει το γονίδιο αντοχής στις σουλφοναµίδες (sul1), το γονίδιο αντοχής στις ενώσεις του τεταρτοταγούς αµµωνίου (qace1), καθώς και 2 ανοιχτές περιοχές ανάγνωσης (ORF5 και ORF6). Είναι χαρακτηριστικό ότι η οµοιότητα των 3 -τµηµάτων στα διάφορα ιντεγκρόνια έχει βρεθεί ότι είναι µικρότερη σε σύγκριση µε τα 5 -τµήµατα. Στα ιντεγκρόνια τάξης 1 έχουν περιγραφεί από 0 έως και 8 διαφορετικές γονιδιακές κασέτες, όπως στο ιντεγκρόνιο In53 (Νaas et al, 2001), ενώ και περισσότερα από ένα ιντεγκρόνια έχουν περιγραφεί στο ίδιο βακτηριακό κύτταρο (Carattoli A, 2001). Μέχρι στιγµής έχουν περιγραφεί περισσότερες από 60 διαφορετικές κασέτες. Η σχηµατική δοµή ιντεγκρονίου τάξης 1 φαίνεται αµέσως παρακάτω (εικόνα 4): Από Carattoli A, 2001 Εικόνα 4: Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής ιντεγκρονίου τάξης 1 και ενός µοντέλου ενσωµάτωσης µιας γονιδιακής κασέτας Τα ιντεγκρόνια τάξης 2 εδράζονται σε τρανσποζόνια της οικογένειας Tn7. Το ιντεγκρόνιο του Tn7 περιέχει τρία συγκεκριµένα γονίδια αντοχής, πάντα τα ίδια (dhfra1, sat και aada1), ενώ στα παράγωγα τρανσποζόνια Tn1825 και Tn1826 παρατηρείται µια µικρή παραλλαγή κατά την οποία λείπει το γονίδιο dhfra1. Αυτό φαίνεται στο σχήµα που ακολουθεί: 15

Από Hansson et al, 2002 Εικόνα 5: Σχηµατική αναπαράσταση των ιντεγκρονίων τάξης 2 στο τρανσποζόνιο Tn7 και στα συγγενή του τρανσποζόνια Tn1825 και Tn1826. Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν πολύ περιορισµένες αναφορές για ιντεγκρόνια τάξης 3 σε στελέχη εντεροβακτηριακών. Το ιντεγκρόνιο τάξης 3 που αποµονώθηκε από στέλεχος ανθεκτικό στις καρβαπενέµες από τους Arakawa et al και µελετήθηκε εκτενέστερα από τους Collis et al, 2002, βρέθηκε να έχει 5 συντηρηµένο άκρο ανάλογης δοµής µε τα ιντεγκρόνια τάξης 1, να αποτελεί τµήµα του τρανσποζονίου Tn402 και η ιντεγκράση IntI3 βρέθηκε να έχει λειτουργικότητα ανάλογη της IntI1 (εικόνα 6). Τροποποιηµένο από Collis et al, 2002 Εικόνα 6: Σχηµατική δοµή ιντεγκρονίου τάξης 3 που βρέθηκε ως τµήµα του Tn402 Είναι σηµαντικό να τονιστεί ότι παρά τις διαφορές στις ιντεγκράσες και τις θέσεις ανασυνδυασµού οι ίδιες γονιδιακές κασέτες µπορούν να παγιδευτούν και από τις τρεις τάξεις ιντεγκρονίων. Η παρατήρηση αυτή δείχνει ότι οι ειδικές της τάξης ιντεγκράσες δρουν σε µια κοινή δεξαµενή γονιδίων αντοχής. 16

Η προέλευση των γονιδιακών κασετών δεν είναι ξεκάθαρη. Οι κασέτες των γονιδίων αντοχής υπάρχουν ελεύθερες ως οµοιοπολικώς κλειστά κυκλικά µόρια που προέκυψαν από αποκοπή γονιδίων που είχαν προηγούµενα ενσωµατωθεί στο ίδιο ή διαφορετικό ιντεγκρόνιο µε τη µεσολάβηση από την ιντεγκράση. Οι γονιδιακές κασέτες µετά την ενσωµάτωσή τους βρίσκονται ως γραµµικές αλληλουχίες µέσα στη µεταβλητή περιοχή του ιντεγκρονίου. Θεωρείται ότι η κύρια πηγή των κασετών είναι γονίδια αντοχής από ανθεκτικά µικρόβια ή µικροοργανισµούς που παράγουν αντιβιοτικά και ειδικότερα από είδη που είχαν super integrons στο χρωµόσωµά τους. Γονιδιακές κασέτες Οι κασέτες των γονιδίων αντοχής αποτελούνται από µια ολοκληρωµένη ανοιχτή περιοχή ανάγνωσης ORF που συνήθως είναι κάποιο γονίδιο αντοχής και από µία θέση ανασυνδυασµού γνωστή ως «στοιχείο 59 ζευγών βάσεων» που βρίσκεται πάντα προσκολληµένο στο 3 άκρο του γονιδίου. Το «στοιχείο 59 ζευγών βάσεων» παίζει σηµαντικό ρόλο στη διαδικασία ενσωµάτωσης ή αποκοπής της κασέτας. Είναι σηµαντικό να τονιστεί ότι οι γονιδιακές κασέτες στερούνται υποκινητή, δηλαδή δεν µπορούν να εκφραστούν εκτός και αν ενσωµατωθούν µέσα σε ένα ιντεγκρόνιο, οπότε τίθενται υπό τον µεταγραφικό έλεγχο του υποκινητή του ιντεγκρονίου. Στον κανόνα αυτό έχουν περιγραφεί ως εξαίρεση κάποιες σπάνιες γονιδιακές κασέτες που φαίνεται ότι είχαν τους δικούς τους υποκινητές, όπως οι κασέτες cmla, cmla2, qaqf (Ploy et al, 2000) και οι cmla5 και qaqi που βρίσκονται στη µεταβλητή περιοχή του ιντεγκρονίου In53 (Fluit AC and Schmitz FJ, 2004). Ο βαθµός έκφρασης εξαρτάται από την απόσταση της κασέτας από τον υποκινητή, µε την κασέτα που ενσωµατώθηκε τελευταία και άρα είναι αµέσως παρακείµενη του υποκινητή να εκφράζεται ισχυρότερα και τις αποµακρυσµένες κασέτες να εκφράζονται ασθενέστερα. Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν το επίπεδο έκφρασης των ενσωµατωµένων κασετών είναι η ισχύς του υποκινητή, η παρουσία επιπρόσθετου υποκινητή και ο αριθµός των αντιγράφων της γονιδιακής κασέτας. Έτσι ένας ισχυρός υποκινητής ή η παρουσία και δεύτερου καθώς και η ύπαρξη πάνω από ένα αντιγράφων της γονιδιακής κασέτας εξασφαλίζουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του γονιδιακού περιεχοµένου της µεταβλητής περιοχής του ιντεγκρονίου (Weldhagen GF, 2004). 17

Ιντεγκρόνια και µικροβιακή αντοχή στα αντιβιοτικά Οι γονιδιακές κασέτες που περιγράφονται σε ιντεγκρόνια προσδίδουν αντοχή σε πολλές οµάδες αντιβιοτικών. Αφορούν σε γονίδια αντοχής για αµινογλυκοσίδες, τριµεθοπρίµη, χλωραµφαινικόλη, πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, προσφάτως δε και εκτεταµένου φάσµατος κεφαλοσπορίνες και καρβαπενέµες. Επίσης έχουν περιγραφεί ως κασέτες µέσα σε ιντεγκρόνια γονίδια που προσδίδουν αντοχή στη ριφαµπικίνη και την ερυθροµυκίνη καθώς και σε αντισηπτικά και απολυµαντικά. Τέλος τουλάχιστον έξι ανοικτά φράγµατα ανάγνωσης (ORF) άγνωστης λειτουργίας έχουν περιγραφεί ως τµήµατα της µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίων. Μέχρι και το 1999 όλες σχεδόν οι γνωστές γονιδιακές κασέτες κωδικοποιούσαν για αντοχή στις παλαιότερες οµάδες αντιβιοτικών. Τα τελευταία όµως χρόνια περιγράφεται ένας αυξανόµενος αριθµός νέων κασετών που προσδίδουν αντοχή στα καινούρια αντιβιοτικά. Τέτοια παραδείγµατα αποτελούν οι β-λακταµάσες τάξης Α και Β κατά Ambler καθώς και τροποποιητικά ένζυµα για τις νεότερες αµινογλυκοσίδες. Πρόσφατα εξάλλου περιγράφηκαν σε σύνθετα ιντεγκρόνια, τα Ιn36 και Ιn37 που φέρονται από πλασµίδια πολυαντοχής των εντεροβακτηριακών, τα γονίδια qnr. Προϊόν του γονιδίου qnr αποτελεί µια πρωτεΐνη µήκους 218 αµινοξέων που προστατεύει τη DNA γυράση, όχι όµως και την τοποϊσοµεράση IV από τη δράση της σιπροφλοξασίνης, προσδίδοντας έτσι αντοχή στις κινολόνες. Τα γονίδια αυτά προέρχονται µάλλον από θαλάσσιους µικροοργανισµούς (Shewanella algae). Πρέπει όµως να τονιστεί ότι ένα µεγάλο ποσοστό γονιδιακών κασετών που εξακολουθούν να περιγράφονται σήµερα προσδίδουν αντοχή σε στρεπτοµυκίνη και σπεκτινοµυκίνη (aada τύπος κασετών), παρά το γεγονός ότι τα συγκεκριµένα αντιβιοτικά έχουν πάψει να χρησιµοποιούνται στην κλινική πράξη εδώ και πολλά χρόνια. Παρακάτω ακολουθεί ο πίνακας 1, όπου περιγράφονται αναλυτικά οι γονιδιακές κασέτες που έχουν βρεθεί στη µεταβλητή περιοχή ιντεγκρονίων και των τριών τάξεων. Τα είδη των γονιδιακών κασετών είναι σαφώς περιορισµένα στα ιντεγκρόνια τάξης 2 και 3 σε σχέση µε τα τάξης 1, για τα οποία υπάρχει πλουσιότατη βιβλιογραφία και έχουν µελετηθεί εκτενέστατα. 18

Πίνακας 1: Γονιδιακές κασέτες αντοχής που βρίσκονται σε ιντεγκρόνια Ιντεγκρόνια ταξης 1 Ιντεγκρόνια τάξης 2 Ιντεγκρόνια τάξης 3 Είδη Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae P. aeruginosa P. aeruginosa Acinetobacter S. marcescens Acinetobacter K. pneumoniae Γονιδιακές κασέτες αντοχής 1. Αντοχή σε β-λακτάµες β-λακταµάσες τάξεων A,Β,D κατά Ampler 2. Αντοχή σε αµινογλυκοσίδες Αδενυλτρανσφεράσες (aada4,aada5,aada6, aada8, aada10) Ακετυλτρανσφεράσες (aac(3)-ib/aac(6)-ib, aac29b,aacaib/orfg Αδενυλ-/ακετυλτρανσφεράσες (Αnt-(3 )-Ii-aac(6)-IId) Φωσφοτρανσφεράση (apha15) 3. Αντοχή στη χλωραµφαινικόλη Ακετυλτρανσφεράσες (cmla,cmla2, cmla5) Μη ενζυµατικός µηχανισµός (cat) 4.Αντοχή στην τριµεθοπρίµη Αναγωγάσες διυδροφολικού (dhfr13,dhfr17,dhfra17) 5. Αντοχή στη ριφαµπικίνη ADP-ribosyl τρανσφεράση (arr2) 6. Αντοχή στην ερυθροµυκίνη Εστεράση (erea) 7. Αντοχή σε ενώσεις τεταρτοταγούς αµµωνίου Αντλίες (qaqf, qaqi) 8. Αντοχή σε κινολόνες (qnr) 9.Open reading frames (>6) 1. Αντοχή σε αµινογλυκοσίδες Αδενυλτρανσφεράσες (aada1) 2.Αντοχή σε στρεπτοθρυψίνη ακετυλτρανσφεράση (sat) 3. Αντοχή σε τριµεθοπρίµη αναγωγάση διυδροφολικού (dhfri) A. xylosoxidans 1. Αντοχή σε β-λακτάµες β-λακταµάσες Β 2.Αντοχή σε αµινογλυκοσίδες ακετυλτρανσφεράσες Τροποποιηµένος από Ploy et al, 2000 19

Αναλυτικότερα β-λακταµάσες που έχουν βρεθεί σε ιντεγκρόνια που αποµονώθηκαν από Εντεροβακτηριακά παγκοσµίως παρατίθενται στους παρακάτω πίνακες: Πίνακας 2: β-λακταµάσες τάξης Α κατά Ambler εδραζόµενες σε ιντεγκρόνια από Εντεροβακτηριακά Gram-αρνητικά βακτήρια β-λακταµάση Είδος ξενιστή Προέλευση VEB-1 K.pneumoniae Βιετνάµ Ε. coli Βιετνάµ C.freundii Ταϊλάνδη GES-1 K.pneumoniae Γαλλική Γουινέα K.pneumoniae α Πορτογαλία GES-3 E.coli Ελλάδα GES-4 K.pneumoniae Ελλάδα ΙBC-1 E. cloacae Ελλάδα Κ.pneumoniae Ελλάδα CTX-M-1 P.mirabilis Ελλάδα CTX-M-2 S. enterica Αργεντινή P.mirabilis Αργεντινή CTX-M-9 E.coli Ισπανία Τροποποιηµένο από Weldhagen G, 2004 Όλα τα αναγραφόµενα γονίδια εδράζονται σε κλάσης 1 ιντεγκρόνια, µε κάποιες εξαιρέσεις α Σε κλάσης 3 ιντεγκρόνιο 20

Πίνακας 3: β-λακταµάσες τάξης Β κατά Ambler εδραζόµενες σε ιντεγκρόνια από Εντεροβακτηριακά Gram-αρνητικά βακτήρια β-λακταµάση Είδος ξενιστή Προέλευση IPM-1 S.marcescens α Ιαπωνία K.pneumoniae K.oxytoca Ιαπωνία E.aerogenes E.cloacae Ιαπωνία E.coli Ιαπωνία P.vulgaris Ιαπωνία IPM-3 S. flexneri Ιαπωνία IPM-4 C.youngae Κίνα C. freundii Χογκ-Κογκ IPM-6 S.marcescens Ιαπωνία IPM-8 K.pneumoniae Ταϊβάν E.cloacae Ταϊβάν VIM-1 E.coli Ελλάδα K.pneumoniae Ελλάδα P.mirabilis Ελλάδα E.cloacae Ελλάδα E.aerogenes Ελλάδα M.morganii Ελλάδα VIM-2 E.coli Ελλάδα E.cloacae Κορέα S.marcescens Κορέα C.freundii Ταϊβάν VIM-4 E.cloacae Ιταλία K.pneumoniae Ιταλία VIM-12 K.pneumoniae Ελλάδα VIM-19 K.pneumoniae Ελλάδα VIM-27 K.pneumoniae Ελλάδα Τροποποιηµένο από Weldhagen G, 2004 Όλα τα αναγραφόµενα γονίδια εδράζονται σε κλάσης 1 ιντεγκρόνια, µε κάποιες εξαιρέσεις α Σε κλάσης 3 ιντεγκρόνιο 21

Πίνακας 4: β-λακταµάσες τάξης D κατά Ambler εδραζόµενες σε ιντεγκρόνια από Εντεροβακτηριακά Gram-αρνητικά βακτήρια Β-λακταµάση Είδος ξενιστή Προέλευση OXA-1 S. enterica Ιταλία OXA-9 E.aerogenes Γαλλία OXA-30 E.coli Γαλλία Τροποποιηµένο από Weldhagen G, 2004 Όλες αυτές οι γονιδιακές κασέτες που κωδικοποιούν για β-λακταµάσες και καρβαπενεµάσες συνυπάρχουν και εκφράζονται ταυτόχρονα µε άλλες κασέτες που κωδικοποιούν για αντοχή σε αµινογλυκοσίδες ή/και τριµεθοπρίµη ή/και χλωραµφαινικόλη ως αποτέλεσµα της ενσωµάτωσης τους σε ιντεγκρόνια. Το γεγονός αυτό, δηλαδή η συνύπαρξη σε µια κοινή δοµή γονιδίων αντοχής για διαφορετικές οµάδες αντιβιοτικών, ενέχει τον κίνδυνο της επικράτησης γονιδίων που προσδίδουν αντοχή σε εκτεταµένου φάσµατος β-λακτάµες ή καρβαπενέµες λόγω πίεσης επιλογής από µια άσχετη οµάδα αντιβιοτικών πχ αµινογλυκοσίδες. (Weldhagen G, 2004). Γενετικό περιβάλλον ιντεγκρονίων Τα ιντεγκρόνια µπορεί να εδράζονται στο βακτηριακό χρωµόσωµα ή σε πλασµίδια ευρέος φάσµατος ξενιστών. εν κινούνται τα ίδια, αλλά χρησιµοποιούν τα µεταθετά σαν οχήµατα. Κάποια τρανσποζόνια µάλιστα είναι γνωστό ότι σχετίζονται µε την κινητοποίηση συγκεκριµένων ιντεγκρονίων. Ιντεγκρόνια τάξης 1 και 2 πολύ συχνά µεταφέρονται από τα Tn21 και Tn7 µεταθετά στοιχεία αντίστοιχα. Επιπλέον, κάποια ιντεγκρόνια αναγνωρίστηκαν σε στενή συσχέτιση ή και ακριβώς δίπλα σε ένθετες αλληλουχίες (IS, Insertion Sequences). Τέλος, ιντεγκρόνια ενσωµατώνονται ως επίκτητα τµήµατα DNA σε συζευκτικά πλασµίδια αντοχής µε συνέπεια τη µεταφορά τους µέσω σύζευξης σε ένα ευρύ φάσµα ξενιστών. Αναλυτικότερα, τα ιντεγκρόνια βρίσκονται συχνά ως τµήµατα διαφόρων µεταθετών στοιχείων (Transposons), όπως Tn21, Tn1403, Tn1404, Tn1696, Tn1412 και Tn2000. Τα τρανσποζόνια αυτά µπορεί να εδράζονται στο βακτηριακό χρωµόσωµα ή σε πλασµίδιο. Στη δεύτερη περίπτωση πρόκειται για µεγάλα συζευκτικά πλασµίδια (>100kb) που συνήθως ανήκουν στις οµάδες IncFI, IncFII ή IncL/M. (Fluit AC, Schmitz FJ). Τα ιντεγκρόνια τάξης 1 έχουν συσχετισθεί επίσης και µε µια µεγάλη 22

ποικιλία ένθετων αλληλουχιών, περιλαµβανοµένων των IS26, IS1999, IS2000, IS6100. Η αδιάκοπη κίνηση γενετικού υλικού συνδυαζόµενη µε την πίεση επιλογής οδηγεί στο σχηµατισµό συγκροτηµάτων πολυαντοχής, όπως αυτά που έχουν βρεθεί σε Gram αρνητικά µικρόβια στα ελληνικά νοσοκοµεία. Πρόκειται για µεγάλα τµήµατα DNA (µέχρι 100kb) σε πλασµίδια ή χρωµοσώµατα. Περιλαµβάνουν πολλαπλά γονίδια αντοχής καθώς και αλληλουχίες µεταθετών και ιντεγκρονίων (Miriagou 2005). Εν κατακλείδι τα ιντεγκρόνια φαίνεται ότι παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο στην πολυαντοχή στα αντιβιοτικά, όχι µόνο λόγω των γονιδιακών κασετών αντοχής για διαφορετικές οµάδες αντιβιοτικών που περιέχουν, αλλά και λόγω του ότι οι φορείς τους, δηλαδή τα πλασµίδια και τα τρανσποζόνια, συµµεταφέρουν και άλλα γονίδια αντοχής. Ο κίνδυνος της συµµεταφοράς πολλαπλών γονιδίων αντοχής από τέτοιες κινητές δοµές γενετικού υλικού έγκειται στη δυνατότητα µεταβίβασης της πολυαντοχής, ακόµη και αν η πίεση επιλογής προέρχεται από ένα αντιβιοτικό. (Enne VI et al, 2001). Επιδηµιολογία Μέχρι το 1999 υπήρχαν λίγες αναφορές σχετικά µε την επιδηµιολογία των ιντεγκρονίων τάξης 1, ήδη όµως είχε τονιστεί η πιθανότητα της ευρείας παγκόσµιας διασποράς των γενετικών αυτών δοµών κυρίως στα Εντεροβακτηριακά καθώς και ο ρόλος τους στην αντοχή στα αντιβιοτικά. (Fluit AC, 1999). Στις µέρες µας πλήθος µελετών διεθνώς έχουν εµπλουτίσει τις γνώσεις µας γύρω από την επιδηµιολογία και το ρόλο των ιντεγκρονίων κυρίως τάξης 1 στην αντοχή των µικροβίων στα αντιβιοτικά. Στην ελληνική και τη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν πολλές αναφορές για ιντεγκρόνια σε εντεροβακτηριακά που αποµονώνονται από ασθενείς µε νοσοκοµειακές λοιµώξεις (Daikos et al, 2007) ή σε στελέχη που ευθύνονται για επιδηµικές εξάρσεις στο χώρο του νοσοκοµείου (Vourli et al 2006, Iconomidis et al 2005, Nijssen S et al, 2005, Leverstein-van Hall et al, 2002). Η πηγή των ιντεγκρονίων στο χώρο του νοσοκοµείου παραµένει άγνωστη, αν και µελέτες σε ασθενείς µε λοιµώξεις κοινότητας σε Ευρώπη (Leverstein-van-Hall et al,2002, Vassilakopoulou et al, 2009), Αφρική (Frank T et al, 2007) και Ασία (Mathai et al, 2004) δείχνουν ότι η κοινότητα είναι µια πιθανή δεξαµενή. 23

Πολλές µελέτες έχουν αναφέρει ανίχνευση ιντεγκρονίων σε στελέχη που αποµονώθηκαν από ζώα, όπως βοοειδή (Sandvang D et al, 2000), χοίρους (Sunde M et al, 2001, Machado E et al, 2008), πουλερικά ( Baas L et al, 1999, Vasilakopoulou A et al, 2009) και ψάρια (Rosser SJ et al, 1999). Επιπρόσθετα, ιντεγκρόνια έχουν περιγραφεί σε στελέχη από κατοικίδια ζώα (Sanchez S et al, 2002, Goldstein C et al, 2001) και ζώα ζωολογικών κήπων. Τέλος ιντεγκρόνια έχουν βρεθεί όχι µόνο σε παθογόνα στελέχη ανθρώπων και ζώων, αλλά και σε βακτήρια από περιβαλλοντικά δείγµατα, όπως δείγµατα νερού από ιχθυοκαλλιέργειες (Schmidt AS et al, 2001), από δίκτυο άρδευσης (Roe et al, 2003), από ποτάµια (Alexopoulos A et al, 2006). Φαίνεται λοιπόν ότι τα ιντεγκρόνια είναι ευρέως διεσπαρµένα στο περιβάλλον και η σύνδεση µεταξύ των διάφορων δεξαµενών είναι αναπόφευκτη. Η στενή σχέση των ιντεγκρονίων µε συζευκτικά πλασµίδια και τρανσποζόνια εξηγεί την ευρύτατη αυτή διασπορά. Η χρήση αντιβιοτικών στις φάρµες για αύξηση της παραγωγής και προφύλαξη από ζωονόσους θεωρείται πολύ σηµαντικός παράγοντας που συνεισφέρει στην επιλογή µικροβίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά. Η έκθεση σε πολυανθεκτικά βακτήρια µέσω της τροφικής αλυσίδας θεωρείται ένας δυνητικός κίνδυνος για την ανθρώπινη υγεία µέσω οριζόντιας µεταφοράς ιντεγκρονίων από βακτήρια από ζώα που εκτρέφονται σε φάρµες σε βακτήρια παθογόνα για τον άνθρωπο (Levenstein-van Hall et al, 2002, Kang HY et al, 2005, Vassilakopoulou A et al, 2009). Όσον αφορά την επιδηµιολογία του γονιδιακού περιεχοµένου των ιντεγκρονίων, κάποιοι συνδυασµοί γονιδιακών κασετών φαίνεται πως έχουν περιορισµένη τοπική κατανοµή ενώ άλλοι είναι ευρέως διεσπαρµένοι. Οι ακριβείς λόγοι της ευρείας διασποράς ιντεγκρονίων µε συγκεκριµένο συνδυασµό γονιδιακών κασετών είναι προς το παρόν άγνωστοι. Μία εξήγηση θα µπορούσε να είναι ότι αποτελούν τµήµα κάποιων πολύ επιτυχηµένων πλασµιδίων µε ευρεία, ακόµη και παγκόσµια διασπορά (Sunde M, 2005) Πιο περιορισµένη είναι η γνώση για την επιδηµιολογία των ιντεγκρονίων τάξης 2. Υπάρχουν αναφορές για ανεύρεση τους σε στελέχη Acinetobacter από όλο τον κόσµο, αλλά και σε εντεροβακτηριακά. Συγκεκριµένα, ιντεγκρόνια τάξης 2 έχουν βρεθεί σε στελέχη E.coli και P.mirabilis από ασθενείς µε ουρολοιµώξεις (White et al, 2001, Solberg et al, 2006), σε κλινικά στελέχη Salmonella spp και E.coli από πουλερικά, βοοειδή και ερπετά (Goldstein C et al, 2001), σε στελέχη E.coli από δείγµατα νερού άρδευσης και ιλύος µολυσµένων από περιττώµατα ζώων σε φάρµες (Roe et al) και σε στελέχη E.coli από κρέας και προϊόντα κρέατος (Sunde M, 2005). 24

Σε όλες αυτές τις αναφορές η παρουσία τα ιντεγκρονίων τάξης 2 είχε σαφώς πιο περιορισµένη διασπορά σε σχέση µε τα τάξης 1. Επιπρόσθετα, όσον αφορά το γονιδιακό τους περιεχόµενο στις περισσότερες δηµοσιεύσεις καταδεικνύεται η επικράτηση του ιντεγκρονίου τάξης 2 που σχετίζεται µε το τρανσποζόνιο Tn7 και την ήδη γνωστή σειρά γονιδιακών κασετών (dfra1-sat1- aada1), ενώ η ανίχνευση των ιντεγκρονίων τάξης 2 που σχετίζονται µε τα παράγωγα τρανσποζόνια Tn1825 και Tn1826 είναι σαφώς πιο περιορισµένη. Υπάρχουν όµως και δύο δηµοσιεύσεις για την περιγραφή σε εντεροβακτηριακά στελέχη δύο ασυνήθιστων ιντεγκρονίων τάξης 2 που σχετίζονται µε το τρανσποζόνιο Tn7. Το πρώτο περιείχε τις κασέτες sat1-erea-aada1 (Biskri et al,2003), και το δεύτερο τις κασέτες sat-sat1-aada1(ahmed et al, 2005), δηλαδή αντικαταστάθηκε η κασέτα αντοχής για την τριµεθοπρίµη (dfra1) από τις κασέτες για αντοχή σε ερυθροµυκίνη (erea) και στρεπτοθρυψίνη (sat) αντίστοιχα. Όσον αφορά την επιδηµιολογία ιντεγκρονίων τάξης 2 σε κλινικά στελέχη εντεροβακτηριακών στον ελλαδικό χώρο, δεν υπάρχουν προς το παρόν ανάλογες δηµοσιεύσεις. Μία µόνο δηµοσίευση αναφέρει την ανεύρεση ιντεγκρονίων τάξης 2 σε δύο περιβαλλοντικά στελέχη E.coli από δείγµατα µολυσµένου νερού από τις όχθες των ποταµών Έβρου και Άρδα στη Θράκη (Alexopoulos et al, 2006). 25

Β. ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 26

1. Σκοπός O σκοπός της µελέτης ήταν να αναζητηθούν παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης λοίµωξης από πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά στελέχη εντεροβακτηριακών, να εκτιµηθεί η επίδραση της αποµόνωσης πολυανθεκτικών στελεχών στην έκβαση της λοίµωξης και να διερευνηθεί η µοριακή βάση της πολυαντοχής και συγκεκριµένα η παρουσία και ο ρόλος των ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2. Αναλυτικότερα, προς τούτο: 1.1 Ελέγχθηκαν στελέχη εντεροβακτηριακών που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε λοιµώξεις (βακτηριαιµίες) σε ένα µεγάλο νοσοκοµείο. 1.2 Καταγράφηκαν τα χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών προκειµένου να προσδιοριστούν τυχόν παράγοντες κινδύνου λοίµωξης από πολυανθεκτικούς στα αντιβιοτικά µικροοργανισµούς. 1.3 Εκτιµήθηκε η επίδραση της αποµόνωσης πολυανθεκτικών στελεχών από λοιµώξεις στη διάρκεια νοσηλείας µετά την έναρξη της βακτηριαιµίας και στην τελική έκβαση της λοίµωξης. 1.4 Ελέγχθηκε η συχνότητα παρουσίας ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 στα υπό µελέτη κλινικά στελέχη 1.5 Χαρακτηρίστηκαν τα ιντεγκρόνια ως προς τον αριθµό, την τάξη, το µέγεθος και την αλληλουχία των γονιδιακών κασετών που περιέχουν και συσχετίστηκαν τα χαρακτηριστικά αυτά µε το φαινότυπο αντοχής των στελεχών που τα φέρουν αλλά και τον τύπο της βακτηριαιµίας, δηλαδή βακτηριαιµία κοινότητας, ή σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας ή νοσοκοµειακή, σύµφωνα µε την ταξινόµηση κατά Friedman et al. 27

2. Υλικό 2.1 Σχεδιασµός της µελέτης Για τους σκοπούς αυτούς πραγµατοποιήθηκε µια αναδροµική µελέτη από τον Απρίλιο του 2002 έως και το εκέµβριο του 2004 στο «Τζάνειο» Γενικό Νοσοκοµείο Πειραιά που είναι νοσοκοµείο τριτοβάθµιας περίθαλψης µε 480 κλίνες ασθενών, Μονάδα Εντατικής Θεραπείας 10 κλινών καθώς και Καρδιολογική Μονάδα 10 κλινών. Ανασκοπήθηκαν τα αποτελέσµατα των αιµοκαλλιεργειών του µικροβιολογικού εργαστηρίου του νοσοκοµείου και όλοι οι ασθενείς ηλικίας 18 ετών µε θετική καλλιέργεια αίµατος για Εντεροβακτηριακό στέλεχος κατά το διάστηµα Απρίλιος 2002 - εκέµβριος 2004 εντάχθηκαν στη µελέτη. Το σηµείο σύγκρισης για την κατάταξη ενός νοσηλευόµενου ατόµου στην οµάδα των ασθενών ή των µαρτύρων ήταν η εµφάνιση πολυαντοχής, δηλαδή αντοχής σε τρεις ή περισσότερες οµάδες αντιβιοτικών, των στελεχών που αποµονώθηκαν από τις καλλιέργειες αίµατος των αρρώστων µε βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακά στελέχη. Την οµάδα των ασθενών αποτέλεσαν οι άρρωστοι µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά, ενώ την οµάδα των µαρτύρων οι νοσηλευόµενοι κατά την ίδια χρονική περίοδο µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά. Κάθε άρρωστος περιελήφθη στη µελέτη µόνο µία φορά και µελετήθηκε µόνο το πρώτο χρονικά αποµονωθέν στέλεχος εντεροβακτηριακού από καλλιέργεια αίµατος του κάθε αρρώστου. Πληροφορίες σχετικά µε τους αρρώστους, τόσο για την έκθεση σε πιθανούς παράγοντες κινδύνου όσο και για την έκβαση της λοίµωξης, συλλέχθηκαν µε βάση ένα προσχεδιασµένο ερωτηµατολόγιο (βλ Παράρτηµα) και περιελάµβαναν: δηµογραφικά στοιχεία ασθενούς, τµήµα νοσηλείας, αιτία εισόδου, υποκείµενα νοσήµατα και βαρύτητα γενικής κατάστασης, προηγούµενες νοσηλείες, παρεµβατικούς χειρισµούς και χειρουργική επέµβαση έως 72 ώρες πριν την εµφάνιση βακτηριαιµίας, προηγούµενη χορήγηση αντιβιοτικών τους τελευταίους 3 µήνες, διευκρίνιση της προέλευσης της βακτηριαιµίας από την κοινότητα ή το νοσοκοµείο, πιθανή πηγή της βακτηριαιµίας, υπεύθυνο µικροοργανισµό και αντοχή στα αντιβιοτικά, συνολική διάρκεια νοσηλείας και κλινική έκβαση λοίµωξης. 28

Όσον αφορά την επίδραση της αποµόνωσης πολυανθεκτικού στελέχους εντεροβακτηριακού στην έκβαση της λοίµωξης εκτιµήθηκαν οι εξής παράµετροι: 1. διάρκεια νοσηλείας µετά την εµφάνιση βακτηριαιµίας και µέχρι την έξοδο του ασθενούς από το νοσοκοµείο και συνολική διάρκεια νοσηλείας για τους ασθενείς που εξήλθαν ζώντες από το νοσοκοµείο. 2. πολυαντοχή υπεύθυνου για τη βακτηριαιµία εντεροβακτηριακού και αδρή θνητότητα από όλες τις αιτίες στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας για τους αρρώστους που απεβίωσαν. Όλα τα στελέχη εντεροβακτηριακών που αποµονώθηκαν από καλλιέργειες αίµατος φυλάχθηκαν στους -80 C για περαιτέρω µελέτη µετά την ταυτοποίηση και τον αρχικό έλεγχο ευαισθησίας τους στα αντιβιοτικά στο εργαστήριο του νοσοκοµείου. Προκειµένου να ελεγχθεί ο ρόλος των ιντεγκρονίων στην εµφάνιση πολυαντοχής, µελετήθηκε η παρουσία ιντεγκρονίων και το γονιδιακό τους περιεχόµενο στα στελέχη που αποµονώθηκαν από τους ασθενείς των 2 οµάδων (βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό ή µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος) και επιπρόσθετα µελετήθηκαν διαφορές ως προς τη συχνότητα, την τάξη, το µέγεθος και το γονιδιακό περιεχόµενο µεταξύ στελεχών υπεύθυνων για βακτηριαιµία νοσοκοµειακής προέλευσης ή προέλευσης από την κοινότητα. Τέλος και µόνο για τη µελέτη µικροβιολογικών δεδοµένων της σχέσης ιντεγκρονίων µε την αντοχή στα αντιβιοτικά, περιελήφθησαν στη µελέτη και εντεροβακτηριακά στελέχη κατεξοχήν ανθεκτικά στα αντιβιοτικά που αποµονώθηκαν από νοσηλευόµενους ασθενείς την ίδια περίοδο από εστίες του σώµατος ενδεικτικές για αποικισµό (τραύµατα, έλκη, βρογχικές εκκρίσεις). Οι ασθενείς αυτοί δεν περιελήφθησαν στη µελέτη για αναζήτηση παραγόντων κινδύνου ανάπτυξης λοίµωξης, ούτε κατεγράφησαν πληροφορίες από τους ιατρικούς φακέλους τους µε βάση το ερωτηµατολόγιο. 2.2 ιευκρινίσεις-ορισµοί Βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακά ορίστηκε ως η αποµόνωση από καλλιέργεια αίµατος οποιουδήποτε µικροβιακού είδους που ανήκει στην οικογένεια των Εντεροβακτηριακών. Η έναρξη της βακτηριαιµίας ορίστηκε ως η ηµεροµηνία που ελήφθη η πρώτη θετική αιµοκαλλιέργεια για κάθε ασθενή. 29

Πολυµικροβιακή θεωρήθηκε η βακτηριαιµία αν αποµονώθηκαν και άλλοι µικροοργανισµοί εκτός του εντεροβακτηριακού στελέχους από την ίδια καλλιέργεια αίµατος ή αν αποµονώθηκαν περισσότερα του ενός εντεροβακτηριακά στελέχη. Τα επεισόδια βακτηριαιµίας κατατάχθηκαν σε µία από τις τρεις κατηγορίες, σύµφωνα µε την ταξινόµηση κατά Friedman, νοσοκοµειακή βακτηριαιµία ή σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας και βακτηριαιµία κοινότητας. H πιθανή πρωτοπαθής εστία της βακτηριαιµίας ορίστηκε µε βάση κλινικά κριτήρια ή/και την αποµόνωση του ίδιου µικροοργανισµού και από άλλη εστία πλην του αίµατος. Συγκεκριµένα, η εστία της λοίµωξης ήταν: άγνωστη (πρωτοπαθής βακτηριαιµία) ή επί δευτεροπαθούς βακτηριαιµίας το ουροποιητικό ή η κοιλία ή το αναπνευστικό ή οι ενδοφλέβιοι καθετήρες, σύµφωνα µε την ταξινόµηση του CDC (1988). Πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος ορίστηκε κάθε στέλεχος ανθεκτικό σε 1 αντιβιοτικό από 3 από τις παρακάτω διαφορετικές κατηγορίες αντιβιοτικών: Πενικιλλίνες, συνδυασµοί πενικιλλίνης µε αναστολείς β-λακταµασών, συνδυασµοί αντιψευδοµοναδικών πενικιλλινών µε αναστολείς β-λακταµασών, κεφαµυκίνες, 1 ης & 2 ης γενιάς κεφαλοσπορίνες, 3 ης & 4 ης γενιάς κεφαλοσπορίνες, µονοµπακτάµες, καρβαπενέµες, αµινογλυκοσίδες (εκτός στρεπτοµυκίνης), φθοριοκινολόνες, κοτριµοξαζόλη, χλωραµφενικόλη και τετρακυκλίνη. Εφόσον κάποιο βακτηριακό είδος έχει εγγενή αντοχή σε κάποιον παράγοντα µιας οµάδας ή και σε όλη την οµάδα, ο παράγοντας αυτός (ή όλη η οµάδα) δεν προσµετράται κατά την εφαρµογή του αριθµητικού κριτηρίου προκειµένου να ταξινοµηθεί το στέλεχος ως πολυανθεκτικό. (Mayorakos AR et al, 2011). 30

3. Μέθοδοι 3.1 Συνοπτική περιγραφή Μικροβιολογικές µέθοδοι Οι καλλιέργειες αίµατος επωάστηκαν στο BACTEC 9240 Automated Blood Culture System (Becton and Dickinson). Από τις θετικές φιάλες πραγµατοποιήθηκαν η χρώση κατά Gram και οι ανακαλλιέργειες σε Mc Conkey, αιµατούχο και σοκολατόχρωµο άγαρ. Οι καλλιέργειες των άλλων κλινικών δειγµάτων πλην του αίµατος έγιναν µε τις κλασικές µικροβιολογικές µεθόδους. Η ταυτοποίηση των µικροβίων σε επίπεδο είδους βασίστηκε σε βιοχηµικές διαφορές µε το σύστηµα API20E (biomerieux). Η ευαισθησία των στελεχών στα αντιβιοτικά προσδιορίστηκε o µε τη µέθοδο διάχυσης των δίσκων σύµφωνα µε τις οδηγίες της NCCLS /CLSI και o µε τη µέτρηση της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό (Sensititre, UK). Aνάλογα το φαινότυπο έγινε επιπλέον o έλεγχος παραγωγής ευρέος φάσµατος β-λακταµασών (ESBL) µε τη δοκιµασία συνέργειας δίσκων (Double Disk Synergy Test- DDST). H δοκιµασία αυτή ελέγχει την παρουσία εκτεταµένου φάσµατος β-λακταµασών (ESBL) στα εντεροβακτηριακά στελέχη. Οι εκτεταµένου φάσµατος β-λακταµάσες προσδίδουν αντοχή στις κεφαλοσπορίνες τρίτης και τέταρτης γενιάς και στις µονοµπακτάµες, αλλά είναι ευαίσθητες στους αναστολείς των β-λακταµασών (κλαβουλανικό οξύ και ταζοµπακτάµη). Για το λόγο αυτόν, η συνέργεια (διεύρυνση της αναστολής) στη γειτνίαση µε δισκίο αµοξικιλλίνης/κλαβουλανικού των δίσκων των κεφαλοσπορινών και της αζτρεονάµης είναι ενδεικτική παραγωγής ESBL. o έλεγχος παραγωγής µεταλλο-β-λακταµασών (ΜBL) µε τη δοκιµασία συνέργειας µε ΕDTA. Η δοκιµασία αυτή ανιχνεύει την παρουσία µεταλλο-β-λακταµασών στα υπό εξέταση µικροβιακά στελέχη. Η αρχή της µεθόδου βασίζεται στο γεγονός ότι το EDTA ως 31

χηλικός παράγοντας έχει την ικανότητα να δεσµεύει δισθενή κατιόντα, όπως ο ψευδάργυρος που υπάρχει στο ενεργό κέντρο των µεταλλο-β-λακταµασών, µειώνοντας ή αναστέλλοντας πλήρως την ενζυµική ενεργότητα αυτών των ενζύµων. Η επίδραση αυτή του EDTA έχει ως αποτέλεσµα διεύρυνση της άλω αναστολής κάποιου από τα αντιβιοτικά ιµιπενέµη, µεροπενέµη, κεφταζιντίµη στη γειτνίαση µε το EDTA Μοριακές µέθοδοι Η αποµόνωση του γενετικού υλικού όλων των µικροβίων στηρίχθηκε σε επιλεγµένο πρωτόκολλο για παραλαβή DNA, µε χρήση πρωτεϊνάσης Κ 200µg/ml σε διάλυµα λύσης (lysis buffer) του κυτταρικού τοιχώµατος των µικροβίων που περιείχε Tris-Cl 50mM, Triton X-100 1% και EDTA 1mM. Ο προκαταρκτικός µαζικός έλεγχος (screening) για την ύπαρξη ή µη ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 σε όλα τα στελέχη έγινε µε βάση την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) µε τη χρήση ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών µε οµολογία στα γονίδια των ιντεγκρασών τάξης 1 και 2. Στα στελέχη που βρέθηκαν να φέρουν ιντεγκρόνια τάξης 1 έγινε προσδιορισµός του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων αυτών µε PCR µε τη χρήση ζεύγους ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών µε οµολογία στα συντηρηµένα άκρα 5 CS και 3 CS των ιντεγκρονίων τάξης 1. Με αλληλούχιση (sequencing) πραγµατοποιήθηκε µελέτη του γενετικού περιεχοµένου επιλεγµένων ιντεγκρονίων που ανευρέθηκαν στα εξεταζόµενα στελέχη και αναγνώριση των γονιδίων αντοχής που περιέχουν συγκρινόµενα µε κατατεθειµένες αλληλουχίες βάσεων στη βάση δεδοµένων GeneBank του PubMed. Με χαρτογράφηση µε PCR και µε τη χρήση διαφόρων εκκινητών πραγµατοποιήθηκε µελέτη και επιπρόσθετων ιντεγκρονίων εκτός αυτών στα οποία έγινε αλληλούχιση. Στα στελέχη µε ιντεγκρόνια τάξης 2 έγινε αντίστοιχα µελέτη του µεγέθους µε PCR µε τη χρήση ζεύγους ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών µε οµολογία στο γονίδιο της ιντεγκράσης τάξης 2 και του γονιδίου aada1 αντίστοιχα, σύµφωνα µε τη σχετική βιβλιογραφία. 32

Στα στελέχη στα οποία η φαινοτυπική δοκιµασία µε EDTA ήταν ενδεικτική της παραγωγή µεταλλο-β-λακταµασών έγινε ανίχνευση των αντίστοιχων bla VIM γονιδίων που εδράζονται σε ιντεγκρόνια µε PCR. Σε κάθε εντεροβακτηριακό είδος έγινε τυποποίηση των στελεχών νοσοκοµειακής προέλευσης µε ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consencus elements) για την πιθανή γενετική συσχέτιση των στελεχών που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε νοσοκοµειακή βακτηριαιµία. Η ERIC-2 PCR ανήκει στην κατηγορία των REP-PCR (Repetitive extragenic palindromic PCR). Η τυποποιητική αυτή µέθοδος εκµεταλλεύεται την παρουσία επαναλαµβανόµενων αλληλουχιών στο χρωµόσωµα ορισµένων βακτηριακών ειδών. Με τη χρήση εκκινητών ειδικών για τις αλληλουχίες αυτές, πολλαπλασιάζονται τα τµήµατα DNA που βρίσκονται µεταξύ τους, τα οποία ονοµάζονται ενδο-επαναλαµβανόµενα τµήµατα (inter-repeat fragments). Οι περιοχές µεταξύ των επαναλαµβανόµενων στοιχείων διαφέρουν σε µέγεθος στα διαφορετικά στελέχη, µε αποτέλεσµα να παράγονται τµήµατα διαφορετικών µεγεθών για κάθε στέλεχος, και συνεπώς να προκύπτουν διαφορετικά ηλεκτροφορητικά πρότυπα. Σε επιλεγµένα στελέχη έγινε επιπρόσθετα τυποποίηση και µε ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE). Πειράµατα βακτηριακής σύζευξης. Τα πειράµατα αυτά περιορίστηκαν σε επιλεγµένα στελέχη που παρήγαγαν το µεταλλοένζυµο bla VIM. Τα πειράµατα αυτά έγιναν προκειµένου να διερευνηθεί αν το VIM-ιντεγκρόνιο εδράζεται σε συζευκτικό πλασµίδιο ή όχι. Παρακάτω παρατίθενται αναλυτικά τα πρωτόκολλα των φαινοτυπικών δοκιµασιών συνέργειας και των µοριακών µεθόδων ενώ ενδεικτικές φωτογραφίες των πειραµάτων βρίσκονται στο παράρτηµα. 3.2 Αναλυτική περιγραφή - πρωτόκολλα Φαινοτυπικές διαγνωστικές δοκιµασίες συνέργειας Κατά τον διεξοδικό έλεγχο του φαινοτύπου αντοχής των στελεχών χρησιµοποιήθηκε συγκεκριµένη διάταξη των δίσκων των αντιβιοτικών που επέτρεψε την πρόσθετη και ταυτόχρονη στο ίδιο τρυβλίο διενέργεια των δύο διαγνωστικών φαινοτυπικών µεθόδων συνέργειας: 33

Μέθοδος συνέργειας δίσκων (DDST) ιαδικασία Σε επιστρωµένο τρυβλίο Μueller-Ηinton agar µε βακτηριακό εναιώρηµα θολερότητας ίσης µε 0,5 της κλίµακας McFarland τοποθετείται δίσκος αµοξυκιλλίνης/κλαβουλανικού (AMC 20g/10g) σε απόσταση 30mm κέντρο µε κέντρο από δίσκους κεφταζιντίµης (CAZ 30µg), κεφοταξίµης (CTX 30µg), κεφεπίµης (FEP 30µg) και αζτρεονάµης (ATM 30µg). Επώαση σε 35 C σε αερόβιες συνθήκες για 16-18 ώρες. Επισηµαίνεται ότι για τα στελέχη Enterobacter spp έγινε η ίδια δοκιµασία αλλά σε θρεπτικό υλικό µε ενσωµατωµένη κλοξακιλλίνη σε συγκέντρωση 250µg/ml προκειµένου να ανασταλεί η χρωµοσωµική τους AmpC κεφαλοσπορινάση και να καταστεί δυνατή η ανίχνευση ευρέος φάσµατος β-λακταµάσης ή εναλλακτικά µε ενστάλαξη φαινυλβορονικού οξέος σε όλα τα δισκία της δοκιµασίας. οκιµασία µε EDTA (approximation test) ιαδικασία Στο ήδη επιστρωµένο τρυβλίο Μueller-Ηinton agar µε βακτηριακό εναιώρηµα θολερότητας ίσης µε 0,5 της κλίµακας McFarland τοποθετείται δίσκος διηθητικού χαρτιού εµποτισµένος µε 10µl διαλύµατος EDTA 0,1Μ σε απόσταση 20mm κέντρο µε κέντρο από δίσκους κεφταζιντίµης (CAZ 30µg), ιµιπενέµης (IPM 10µg) και µεροπενέµης (ΜΕΜ 10µg). Επώαση σε 35 C σε αερόβιες συνθήκες για 16-18 ώρες. Μοριακές µέθοδοι Aποµόνωση ολικού DNA από τα εντεροβακτηριακά στελέχη Υλικά και διαλύµατα Θρεπτικό υλικό Nutrient agar Ρυθµιστικό διάλυµα λύσης, 50mM Tris-Cl ph7,5, 1% Triton X-100, 1 mm EDTA Φυσιολογικός ορός Πρωτεϊνάση Κ, συγκέντρωσης 20mg/ml 34

ιαδικασία Συλλογή µικροβιακών αποικιών από υγρό ή στερεό καλλιέργηµα σε 1,5ml φυσιολογικό ορό σε σωληνάριο eppendorf. Φυγοκέντρηση στις 6000 στροφές για 5 λεπτά Απόρριψη υπερκείµενου υγρού, αποστράγγιση σωληναρίου από τυχόν υπολείµµατα υγρού ιάλυση του εναποµείναντος ιζήµατος στον πυθµένα του σωληναρίου σε 100µl διαλύµατος λύσης (Lysis buffer) Προσθήκη πρωτεϊνάσης Κ σε συγκέντρωση 200µg/ml Kαλή ανάδευση Επώαση των σωληναρίων σε υδατόλουτρο στους 56 C για 1 ώρα Βρασµός για 20 λεπτά Φυγοκέντρηση στις 12.000 στροφές για 10 λεπτά Μεταφορά υπερκείµενου που περιέχει το DNA σε καινούριο σωληνάριο Απόρριψη του ιζήµατος Παρασκευή του Lysis buffer 100ml 50mM Tris-Cl ph7.5 0.6055g 1% Triton X-100 1ml 1mM EDTA 0.0370g Υλικά, διαλύµατα και όργανα για τα πειράµατα µε τη µέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές σε συγκέντρωση 10µΜ. Οι αλληλουχίες τους δίνονται σε κάθε ένα πρωτόκολλο χωριστά. Προµηθευτής Invitrogen, Germany Μίγµα τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (dntps) γουανίνης, αδενίνης, θυµίνης και κυτοσίνης που περιείχε 10mMαπό το καθένα Ρυθµιστικό διάλυµα της Taq DNA πολυµεράσης χωρίς µαγνήσιο (10Χ) ιάλυµα MgCl 2 25mM Taq DNA πολυµεράση (ΑΒgene) συγκέντρωσης 5u/µl Θερµικός κυκλοποιητής PTC-100, MJ Research ή Touchgene Gradient, TECHNE Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR σε πήκτωµα αγαρόζης Υλικά, διαλύµατα και όργανα 35

Σκόνη αγαρόζης Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης ΤΒΕ 0,045 Tris-borate και 0,001M EDTA (0,5X) ιάλυµα χρωστικής 0,25% µπλε της βρωµοφαινόλης, 0,25% κυανό της ξυλόλης και 0,3% γλυκερόλη σε νερό (6Χ) ιάλυµα αιθιδίου του βρωµίου 2% w/v σε νερό Συσκευή ηλεκτροφόρησης 200/2.0 POWER SUPPLY, BioRAD ή EC ιαδικασία 250-90, Thermo Electron Corporation Παρασκευή πηκτώµατος αγαρόζης 1-2% σε διάλυµα ηλεκτροφόρησης Ενσωµάτωση στο πήκτωµα αιθιδίου του βρωµίου σε συγκέντρωση 0,2µl/ml για την ανίχνευση του DNA σε υπεριώδες φως Ανάµειξη των προϊόντων της PCR µε το διάλυµα χρωστικής και τοποθέτησή τους στο πήκτωµα (1 µl χρωστικής/5µl δείγµατος) Εφαρµογή τάσης 1-2V/cm (απόσταση µεταξύ των ηλεκτροδίων) στα άκρα του πηκτώµατος (Maniatis et al, 1989) 36

Πρωτόκολλα PCR i. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για µαζικό έλεγχο (screening) ύπαρξης ιντεγκρονίων τάξης 1 Η ανίχνευση ιντεγκρονίων τάξης 1 πραγµατοποιήθηκε µε ενίσχυση τµήµατος του γονιδίου IntI1 που κωδικοποιεί την ιντεγκράση τάξης 1. Χρησιµοποιήθηκε ζεύγος εκκινητών µε τις εξής αλληλουχίες (Maguire A et al, 2001): IntI1-F (5 - GAC GAT GCG TG GAGA CC-3 ) και IntI1-R (5 -CTT GCT GCT TGG ATG CC-3 ) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 3µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 1,5µl dntps 10mM 0,5µl Eκκινητές 1 µl έκαστος Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 15,3 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5 min και στη συνέχεια σε 30 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 30 sec o υβριδισµό σε 54ºC για 30 sec o επιµήκυνση σε 72ºC για 30 sec και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. 37

ii. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για µαζικό έλεγχο (screening) ύπαρξης ιντεγκρονίων τάξης 2 Η ανίχνευση ιντεγκρονίων τάξης 2 πραγµατοποιήθηκε µε ενίσχυση τµήµατος του γονιδίου IntI2 που κωδικοποιεί την ιντεγκράση τάξης 2. Χρησιµοποιήθηκε ζεύγος εκκινητών µε τις εξής αλληλουχίες (Goldstein C et al, 2001): INTI2- F (5 -TTA TTG CTG GGA TTA GGC-3 ) INTI2-R (5 -ACG GCT ACC CTC TGT TAT C-3 ) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 3µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 3µl dntps 10mM 0,5µl Eκκινητές 1 µl έκαστος Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 13,8 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5 min και στη συνέχεια σε 30 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94 ºC για 30 sec o υβριδισµό σε 50 ºC για 30 sec o επιµήκυνση σε 72 ºC για 30 sec και τελική επιµήκυνση σε 72 ºC για 10 min Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. 38

iii. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για µελέτη του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων τάξης 1 Στα στελέχη που βρέθηκαν να φέρουν ιντεγκρόνια τάξης 1 έγινε προσδιορισµός του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων αυτών µε ενίσχυση της µεταβλητής περιοχής µε PCR µε τη χρήση ζεύγους ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών µε οµολογία στα συντηρηµένα άκρα 5 CS και 3 CS των ιντεγκρονίων τάξης 1 και τις εξής αλληλουχίες (Levesque et al, 1995): 5 -CS ( GGC ATC CAA GCA GCA AGC) 3 -CS (AAG CAG ACT TGA CCT GAT) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 3µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 2µl dntps 10mM 0,5µl Eκκινητές 0,5 µl έκαστος Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 15,8 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 1min o υβριδισµό σε 54ºC για 1min o επιµήκυνση σε 72ºC για 2min και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min 39

iv. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για τον προσδιορισµό του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων τάξης 2 Στα στελέχη µε ιντεγκρόνια τάξης 2 έγινε προσδιορισµός του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής µε PCR µε τη χρήση ζεύγους ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών µε οµολογία στο γονίδιο της ιντεγκράσης τάξης 2 και του γονιδίου aada1 αντίστοιχα, σύµφωνα µε τη σχετική βιβλιογραφία: INTI2- F (5 - TTA TTG CTG GGA TTA GGC-3 ) aada1r (5 -ATT GCC AGT CGG CAG GCG-3 ) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 3µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 2µl dntps 10mM 0,5µl Eκκινητές 0,5 µl έκαστος Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 15,8 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 1min o υβριδισµό σε 52ºC για 1min o επιµήκυνση σε 72ºC για 1min και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min 40

v. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για ενίσχυση του γονιδίου blavim Η παρουσία γονιδίου στα υπό µελέτη κλινικά στελέχη ελέγχθηκε µε τη χρήση ζεύγους εκκινητών VIMcF (5 - TGG GCC ATT CAG CCA GAT C -3 ) T m = 62 VIMcB (5 - ATG GTG TTT GGT CGC ATA TC -3 ) T m 58 (Poirel L et al, 2000) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 3µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 2 µl dntps 10mM 1 µl Eκκινητές 1 µl Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 14,3 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 30 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 30sec o υβριδισµό σε 58ºC για 30sec o επιµήκυνση σε 72ºC για 60sec και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. 41

vi. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για ενίσχυση του γονιδίου blakpc Η παρουσία γονιδίου στα υπό µελέτη κλινικά στελέχη ελέγχθηκε µε τη χρήση ζεύγους εκκινητών (Naas T et al, 2008) KPC-F (5 - ATG TCA CTG TAT CGC CGT CT -3 ) KPC-R (5 - TTT TCA GAG CCT TAC TGC CC -3 ) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 3µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 2 µl dntps 10mM 1 µl Eκκινητές 1 µl Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 14,3 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 30 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 30sec o υβριδισµό σε 58ºC για 30sec o επιµήκυνση σε 72ºC για 60sec και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες 42

vii. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για ενίσχυση του γονιδίου blacmy Η παρουσία γονιδίου στα υπό µελέτη κλινικά στελέχη ελέγχθηκε µε τη χρήση ζεύγους εκκινητών (D Andrea MM et al, 2011) Ε4/F (TGG GTT CAG GCC AAC ATG GAT GC) E7/R (TGC CAG CAT CAC GAT GCC AAG G) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 5µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 1,5µl dntps 10mM 1µl Eκκινητές 1,5 µl Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 11,8 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 30sec o υβριδισµό σε 65ºC για 30sec o επιµήκυνση σε 72ºC για 30sec και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min Το αναµενόµενο µέγεθος προϊόντος ήταν 323bp. Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. 43

viii. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για χαρτογράφηση του γονιδίου bla CMY µε τη χρήση ζεύγους εκκινητών (D Andrea MM et al, 2011): KOXf (ISEcp1/F) (CAT GCT CTG CGG TCA CTT C) E7/R (TGC CAG CAT CAC GAT GCC AAG G) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 50 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 5µl Buffer 10x 5µl MgCl 2 25mM 3µl dntps 10mM 1µl Eκκινητές,έκαστος 2,5 µl Taq πολυµεράση 0,4µl Aπεσταγµένο νερό 30,6 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 95ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 1min o υβριδισµό σε 60ºC για 1min o επιµήκυνση σε 72ºC για 2min και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. 44

ix. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για χαρτογράφηση του γονιδίου bla CMY µε τη χρήση ζεύγους εκκινητών (D Andrea MM et al, 2011): Ε4/F (TGG GTT CAG GCC AAC ATG GAT GC) SugE/R (GCC TGA TAT GTC CTG GAT CGT) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 50 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 5µl Buffer 10x 5µl MgCl 2 25mM 3µl dntps 10mM 1µl Eκκινητές,έκαστος 2,5 µl Taq πολυµεράση 0,4µl Aπεσταγµένο νερό 30,6 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 1min o υβριδισµό σε 65ºC για 30min o επιµήκυνση σε 72ºC για 2min και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. 45

x. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για ενίσχυση του γονιδίου blashv Η παρουσία γονιδίου στα υπό µελέτη κλινικά στελέχη ελέγχθηκε µε τη χρήση ζεύγους εκκινητών SHV-F (GAC GCC CGC GAC ACC ACT A) SHV-R (TGC TTT GTT ATT CGG GCC AA) (Tzelepi E et al, 2003) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 3µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 1,5µl dntps 10mM 1 µl Eκκινητές έκαστος 1 µl Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 14,8 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 30 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 30sec o υβριδισµό σε 60 ºC για 30 sec o επιµήκυνση σε 72ºC για 30sec και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min Όλες οι PCR περιελάµβαναν θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες 46

xi. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για χαρτογράφηση VIM-ιντεγκρονίων τάξης 1 Οι 4 διαφορετικές PCR που έγιναν προκειµένου να χαρτογραφηθούν VIMιντεγκρόνια καθώς και οι αλληλουχίες των εκκινητών και τα πρωτόκολλα περιγράφονται παρακάτω: Eκκινητές Αλληλουχία 5 CS GGC ATC CAA GCA GCA AGC- 3 CS AAG CAG ACT TGA CCT GAT- VIMc1 ATG GTG TTT GGT CGC ATA TC VIMc2 TGG GCC ATT CAG CCA GAT C dhfr-r GTT AGA GGC GAA GTC TTG GG aada1r ATT GCC CAG TCG GCA GCG Οι PCR που έγιναν για τη χαρτογράφηση του VIM-ιντεγκρονίου ήταν οι εξής: 1. 5 CS-VIMc2 2. VIMc1-3 CS Το µίγµα των PCR είχε συνολικό όγκο 50 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 5µl Buffer 10x 5µl MgCl 2 25mM 3µl dntps 10mM 1 µl Eκκινητές 1 µl έκαστος Taq πολυµεράση 0,5 µl Aπεσταγµένο νερό 33,5 µl Οι ίδιες συνθήκες χρησιµοποιήθηκαν και για τις δύο αυτές PCR. Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 30sec o υβριδισµό σε 52ºC για 60sec o επιµήκυνση σε 72ºC για 120sec και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min 47

3. VIMc1-aadA1R 4. VIMc1-dhfrR Το µίγµα των PCR είχε συνολικό όγκο 50 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 5µl Buffer 10x 5µl MgCl 2 25mM 3µl dntps 10mM 1 µl Eκκινητές 1 µl έκαστος Taq πολυµεράση 0,5 µl Aπεσταγµένο νερό 33,5 µl Κοινές συνθήκες χρησιµοποιήθηκαν και για τις δύο PCR. Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 60sec o υβριδισµό σε 58ºC για 60sec o επιµήκυνση σε 72ºC για 120sec και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min 48

xii. ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus 2- Polymerase Chain Reaction) Αλληλουχία του ERIC-2 εκκινητή: 5 - AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3 (Hulton CS et al, 1991) Το µίγµα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης είχε συνολικό όγκο 25 µl και αναλυτικά οι συγκεντρώσεις ήταν: DNA 2µl Buffer 10x 2,5µl MgCl 2 25mM 3 µl dntps 10mM 1 µl Eκκινητής 1 µl Taq πολυµεράση 0,2µl Aπεσταγµένο νερό 15,3 µl Τα δείγµατα υποβλήθησαν αρχικά σε αποδιάταξη DNA σε 94ºC για 5min και στη συνέχεια σε 35 κύκλους που ο καθένας συνίστατο σε o αποδιάταξη σε 94ºC για 1 min o υβριδισµό σε 45ºC για 1 min o επιµήκυνση σε 72ºC για 5 min και τελική επιµήκυνση σε 72ºC για 10min 49

PFGE P.mirabilis ιαδικασία ΜΕΡΑ 1η: Ανακαλλιέργεια των υπό εξέταση δειγµάτων σε Νutrient agar και επώαση στους 35 ± 2 C για 16-18 ώρες. ΜΕΡΑ 2η: 1. Παρασκευή 1% αγαρόζης SeaKem Gold:1% SDS σε διάλυµα TE buffer και διατήρηση στους 55-60 C στο υδατόλουτρο. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ PLUGS 2. Παρασκευή µικροβιακού εναιωρήµατος σε 2ml ΤE οπτικής απορρόφησης 1.4-1.5 στα 600nm 3. Μεταφορά 300µl σε σωληνάριο τύπου eppendorf 4. Προσθήκη 20 µl lysozyme 5. Ανάµειξη 300 µl από την αγαρόζη µε το παραπάνω εναιώρηµα. 6. Μεταφορά 300 µl σε δυο plugs για το κάθε δείγµα. 7. Αφήνονται τα plugs να πήξουν και στα συνέχεια τοποθετούνται στο ψυγείο για 20. ΛΥΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 8. Σε νέα σωληνάρια τύπου eppendorf τοποθετούνται και τα δυο plugs από το κάθε δείγµα και προστίθενται 500 µl EC. 9. Επώαση στους 37 C για 1 ώρα σε επωαστικό κλίβανο (λύση του κυτταρικού τοιχώµατος). Μετά το πέρας της ώρας τοποθετούνται ξανά στους 4 C για 10. 10. Αφαιρείται το EC µε πιπέττα προσεκτικά και προσθέτουµε 850 µl EDTA ph 9.0 για 30 (σε αυτό το σηµείο της διαδικασίας τα plugs µπορούν να παραµείνουν σε θερµοκρασία 2-8 C ακόµη και για 48 ώρες). 11. Αφαιρείται το EDTA και προστίθεται διάλυµα 500 µl ESP+proK (500µgr/ml). 12. Ακολουθεί επώαση στους 56 C σε υδατόλουτρο για 16-18 ώρες. ΜΕΡΑ 3η: Τα plugs µεταφέρονται σε µεγαλύτερα σωληνάκια (50ml) και ακολουθούν πλυσίµατα: συνολικά έξι πλυσίµατα µε 2,5ml ΤΕ και κάθε φορά τοποθετούνται σε επωαστικό κλίβανο στους 35 ± 2 C µε ανακίνηση για 30. ΜΕΡΑ 4η: 1. Μετά τα πλυσίµατα τα plugs τοποθετούνται στους 5 ± 3 C για 20. 2. Αφαιρείται το TE και κόβεται από το κάθε plug τµήµα του 2-3mm, το οποίο 50

τοποθετείται σε νέο σωληνάριο τύπου eppendorf. Το υπόλοιπο φυλάσσεται σε διάλυµα ΤΕ 500µl. 3. Παρασκευάζεται το διάλυµα πέψης 200µl όπου για κάθε 3mm plug περιέχεται: 10u NotΙ, 20 µl Buffer και 180µl Η 2 Ο (Aragon L.M et al, 2008) 4. Επώαση στους 35 ± 2 C για 16-18 ώρες ΜΕΡΑ 5η: 1. Την επόµενη µέρα τοποθετούνται στους 5 ± 3 C για 20. 2. Αφαιρείται το διάλυµα πέψης 3. Προστίθενται 200µl από διάλυµα ΤΕ και ξανά στους 5 ± 3 C για 30. 4. Αφαιρείται το παραπάνω διάλυµα και προστίθενται 200µl από διάλυµα 0.5x TBE και ξανά στους 5 ± 3 C για 30. 5. Παρασκευή αγαρόζης πυκνότητας 1% σε 100ml διαλύµατος 0.5x TBE 6. Τοποθέτηση των plugs στις θέσεις της αγαρόζης. 7. Ρύθµιση της συσκευής ηλεκτροφόρησης στις κατάλληλες συνθήκες: 6V/cm και 120 1 ο blog : αρχικός χρόνος 1sec, τελικός χρόνος 30sec για 8 ώρες 2 ο blog: αρχικός χρόνος 30sec, τελικός χρόνος 70sec για 16 ώρες ΜΕΡΑ 6η: 1. Την επόµενη µέρα ακολουθεί χρώση του gel αγαρόζης σε διάλυµα: 1x working solution 100ml = 30µl GelRed απο το stock solution, 10ml 1M NaCl σε 90ml αποστειρωµένο αποσταγµένο H 2 O. 2. Τέλος, το gel αγαρόζης φωτογραφίζεται υπό λάµπα UV σε συσκευή DOLPHIN DOC και αποθηκεύεται ψηφιακά στον υπολογιστή. Γίνεται εκτίµηση της οµοιότητας των στελεχών µε οπτική παρατήρηση των µοριακών αποτυπωµάτων βάσει των κριτηρίων Tenover (Tenover F. C. et al, 1995), καθώς και επεξεργασία της ηλεκτροφορητικής εικόνας από το πρόγραµµα Gel Compar II Η οπτική παρατήρηση είναι επαρκής για την εκτίµηση της γενετικής οµοιότητας σχετικά λίγων στελεχών, ενώ η επεξεργασία της ηλεκτροφορητικής εικόνας από το πρόγραµµα Gel Compar II θα επιβεβαιώσει την γενετική οµοιότητα και θα εντάξει τα συγκεκριµένα στελέχη σε µια γενικότερη βάση δεδοµένων και θα εκτιµήσει τη συγγένειά τους µε κλώνους που έχουν αποµονωθεί σε άλλα νοσοκοµεία άλλες χρονικές περιόδους. 51

Πρωτόκολλο βακτηριακής σύζευξης Υλικά και διαλύµατα Εργαστηριακό στέλεχος ανθεκτικό στη στρεπτοµυκίνη ως δέκτης (E.coli 1R716) Τρυβλία επιλογής Mc Conkey agar + amp 100µg/ml ή caz 1µg/ml+ str 1000µg/ml Τρυβλία ελέγχου: o Mc Conkey agar + amp 100µg/ml o Mc Conkey agar + str 1000µg/ml ιάλυµα LB ιαδικασία Καλλιέργεια δότη και δέκτη σε Mc Conkey agar σε 35±2ºC για 16-18 ώρες. Αντιβιόγραµµα δότη και δέκτη και υγρή ανακαλλιέργεια δότη σε 5ml LB και δέκτη σε 4,5ml LB και ολονύκτια επώαση σε 35±2ºC, υπό ανακίνηση. Ανάµειξη 4,5ml υγρού καλλιεργήµατος δέκτη µε 1ml υγρού καλλιεργήµατος δότη και 4,5ml διαλύµατος LB και επώαση της µικτής καλλιέργειας σε 35±2ºC για 4 ώρες. Παρασκευή διαδοχικών αραιώσεων της µικτής καλλιέργειας µέχρι 10-6 Επίστρωση 100 µl από την αναραίωτη µικτή καλλιέργεια καθώς και από τις αραιώσεις 10-1 έως 10-4 σε τρυβλία επιλογής. Επίστρωση 100µl από τις αραιώσεις 10-5 και 10-6 σε τρυβλία Mc Conkey agar χωρίς αντιβιοτικό, προκειµένου να καταµετρηθούν οι αποικίες δότη και δέκτη στη µικτή καλλιέργεια. Επίστρωση 100µl από καλλιέργειες δότη και δέκτη σε τρυβλία ελέγχου και σε τρυβλία επιλογής. Επώαση όλων των τρυβλίων σε 35±2 ºC για 16-18 ώρες. Έλεγχος τρυβλίων, καταµέτρηση τυχουσών αποικιών στα τρυβλία επιλογής καθώς και των αποικιών του δότη στα τρυβλία χωρίς επιλογή. Ανακαλλιέργεια ύποπτων αποικιών διασυζευκτικών κλώνων σε τρυβλίο επιλογής Αντιβιόγραµµα των αποικιών αυτών και έλεγχος µε PCR για την ύπαρξη του γονιδίου blavim και χαρτογράφηση του VIM-ιντεγκρονίου Υπολογισµός της συχνότητας µεταβίβασης σύµφωνα µε τον τύπο: o Αριθµός αποικιών διασυζευκτικών κλώνων x αντίστροφο αραίωσης x 10 /αριθµός αποικιών δότη x αντίστροφο αραίωσης x 10 52

3.3 Στατιστική επεξεργασία Η στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων έγινε µε τη βοήθεια του προγράµµατος Statistical Package for the Social Sciences software (SPSS, version 11.5). Σε πρώτη φάση έγινε µονοπαραγοντική ανάλυση της σχέσης των πιθανών παραγόντων κινδύνου µε την ανάπτυξη λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά και της αδρής θνητότητας στις 30 ηµέρες µε τον υπολογισµό του κριτηρίου χ² ή του Fisher s exact test προκειµένου για ποιοτικές µεταβλητές και του Student s t-test ή του Mann-Whitney U-test για συνεχείς µεταβλητές. Σε δεύτερη φάση έγινε πολυπαραγοντική ανάλυση µε τη χρήση της παλίνδροµης δεσµευµένης λογαριθµιστικής εξάρτησης (backward stepwise logistic regression analysis) για τον προσδιορισµό παραγόντων µε ανεξάρτητη συσχέτιση µε τη βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά καθώς και την αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας από εντεροβακτηριακά. Μόνο µεταβλητές για τις οποίες η τιµή του p ήταν <0,05 στη µονοπαραγοντική µελέτη περιελήφθησαν στην πολυπαραγοντική µελέτη. Υπολογίστηκαν επίσης ο σχετικός κίνδυνος (OR) και το 95% διάστηµα εµπιστοσύνης (95% CI). Όλες οι αναλύσεις ήταν two-tailed και τιµές p-values <0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές. 53

4. Aποτελέσµατα 4.1 Πληθυσµός µελέτης Συνολικά µελετήθηκαν 130 ασθενείς µε βακτηριαιµία από Gram-αρνητικό στέλεχος της Οικογένειας Enterobacteriaceae. Από τρεις αρρώστους αποµονώθηκαν στο ίδιο επεισόδιο βακτηριαιµίας 2 διαφορετικού είδους στελέχη εντεροβακτηριακών. Έτσι συνολικά µελετήθηκαν 130 επεισόδια βακτηριαιµίας από ισάριθµους αρρώστους από τα οποία αποµονώθηκαν 133 στελέχη εντεροβακτηριακών. Μεταξύ των 130 επεισοδίων βακτηριαιµίας, 56 (43,1%) ήταν νοσοκοµειακές, 16 (12,3%) ήταν βακτηριαιµίες σχετιζόµενες µε υπηρεσίες υγείας (2 διέµεναν σε ιδρύµατα, 8 είχαν νοσηλευθεί σε νοσοκοµείο το τελευταίο τρίµηνο, 2 βρίσκονταν υπό ενδοφλέβια χηµειοθεραπεία, ένας υπό αιµοκάθαρση και 3 δέχονταν εξειδικευµένη νοσηλεία κατ οίκον) και 58 (44,6%) προέρχονταν από την κοινότητα. Εξήντα επτά νοσηλευόµενοι (51,5%) ήταν γυναίκες και 63 (48,5%) ήταν άνδρες. Η µέση ηλικία των ασθενών ήταν 66,15±16,8 έτη (19-94 ετών). Εβδοµήντα επτά (59,2%) ασθενείς νοσηλεύονταν σε παθολογικές κλινικές, 21 (16,2%) σε χειρουργικές κλινικές και 32 ασθενείς νοσηλεύονταν στη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ) του νοσοκοµείου. Τρεις ασθενείς από χειρουργικά τµήµατα µεταφέρθηκαν στη ΜΕΘ µε αποτέλεσµα συνολικά να νοσηλευθούν στη ΜΕΘ 35 άρρωστοι ενώ οι υπόλοιποι 95 νοσηλεύτηκαν αποκλειστικά σε κλινικές του παθολογικού και χειρουργικού τοµέα. Εκατόν είκοσι ασθενείς έπασχαν από τουλάχιστον ένα υποκείµενο νόσηµα. Καρδιακή νόσο εµφάνιζαν 40 ασθενείς, σακχαρώδη διαβήτη 34, πνευµονική νόσο 19, συµπαγή όγκο 16, νεφρική ανεπάρκεια κάποιου σταδίου 14, αιµατολογική κακοήθεια 5 και κίρρωση ήπατος 5 ασθενείς. Τέλος 15 ασθενείς βρίσκονταν υπό τρέχουσα ανοσοκατασταλτική θεραπεία. Η πιθανή εστία των µικροοργανισµών που αποµονώθηκαν από τις καλλιέργειες αίµατος ήταν το ουροποιητικό σε 60 περιπτώσεις, η κοιλία σε 26, οι ενδοφλέβιοι καθετήρες σε 12 και το κατώτερο αναπνευστικό σε 9. Σε 26 περιπτώσεις η πύλη εισόδου του µικροβίου στο κυκλοφορικό σύστηµα δεν κατέστη δυνατό να προσδιορισθεί. Η µέση διάρκεια νοσηλείας πριν και µετά την εµφάνιση της βακτηριαιµίας αλλά και η συνολική διάρκεια νοσηλείας στους αρρώστους που δεν χρειάστηκαν 54

νοσηλεία στη ΜΕΘ ήταν [µέση τιµή ± τυπική απόκλιση (ελάχιστη-µέγιστη), ηµέρες]: 3,96±12,01 (0-81), 11,2±8,09 (0-40) και 15,16±16,46 (1-103) αντίστοιχα. Οι αντίστοιχες τιµές για τους αρρώστους που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ ήταν µέση τιµή ± τυπική απόκλιση (ελάχιστη-µέγιστη), ηµέρες: 28,23±21,23 (6-104), 24,09±28,33 (2-122) και 52,54±36,83 (13-167). Επιπρόσθετα η µέση διάρκεια νοσηλείας των αρρώστων αυτών στη ΜΕΘ ήταν 45,69±38,63 (4-167). Σύµφωνα µε τον ορισµό που αναφέρεται στις διευκρινίσεις, συνολικά δεκαεπτά επεισόδια βακτηριαιµίας θεωρήθηκαν πολυµικροβιακά. Στην ίδια καλλιέργεια αίµατος αποµονώθηκε ταυτόχρονα µε το εντεροβακτηριακό στέλεχος και Gram-θετικός κόκκος (5 Εnterococcus spp και 4 Coagulase-negative Stapylococcus) σε εννιά ασθενείς και στέλεχος P.aeruginosa σε άλλους πέντε ασθενείς. Σε τρεις ασθενείς αποµονώθηκαν συγχρόνως στην ίδια καλλιέργεια αίµατος 2 εντεροβακτηριακά στελέχη διαφορετικού είδους. 55

Πίνακας 5: Χαρακτηριστικά του πληθυσµού της µελέτης µε βακτηριαιµία από Εντεροβακτηριακό στέλεχος Χαρακτηριστικό n (%) ηµογραφικά στοιχεία Ηλικία, µέση±sd, έτη 66,15 ±16,8 Φύλο Άνδρες 63 (48,5%) Γυναίκες 67 (51,5%) Τύπος βακτηριαιµίας Λοίµωξη κοινότητας 58 (44,6%) Σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας 16 (12,3%) Νοσοκοµειακή 56 (43,1%) Εστία βακτηριαιµίας Ουροποιητικό 60 (46,1%) Κοιλία 26 (20%) Ενδοφλέβιος καθετήρας 13 (10%) Αναπνευστικό 9 (6,9%) Άγνωστη 26 (20%) Τµήµα νοσηλείας Παθολογικό 77 (59,2%) Χειρουργικό 21 (16,2%) ΜΕΘ 32 (24,6%) Νοσηλεία στη ΜΕΘ κατά την παραµονή στο νοσοκοµείο 35 (26,92%) Υποκείµενο νόσηµα Καρδιακή νόσος 40 (30,7%) Σακχαρώδης διαβήτης 34 (26,1%) Πνευµονική νόσος 19 (14,6%) Συµπαγής όγκος 16 (12,3%) Νεφρική νόσος 14 (10,7%) Αιµατολογική κακοήθεια 5 (3,8%) Κίρρωση ήπατος 5 (3,8%) Κανένα 10 (7,7%) Τρέχουσα ανοσοκατασταλτική αγωγή 15 (11,5%) 56

4.2 Μικροοργανισµοί που αποµονώθηκαν από καλλιέργειες αίµατος του υπό µελέτη πληθυσµού- συγκεντρωτικά στοιχεία Συνολικά αποµονώθηκαν 133 στελέχη εντεροβακτηριακών από τις καλλιέργειες αίµατος των 130 προαναφερόµενων αρρώστων. Τα 61 ταυτοποιήθηκαν ως E.coli, τα 31 ως K.pneumoniae, τα 29 ως Enterobacter spp (16 E.aerogenes, 10 E.cloacae, 3 E.agglomerans), τα 11 ως P.mirabilis και ένα στέλεχος ως Salmonella spp. Πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά σύµφωνα µε τον ορισµό βρέθηκαν 60 (45,1%) στελέχη που αποµονώθηκαν από 57 αρρώστους οι οποίοι αποτέλεσαν την οµάδα των ασθενών. Τα υπόλοιπα 73 (54,9%) στελέχη βρέθηκαν να είναι ευαίσθητα ή ανθεκτικά σε λιγότερες από 3 τάξεις αντιβιοτικών και θεωρήθηκαν µη πολυανθεκτικά. Αυτά αποµονώθηκαν από 73 ασθενείς, που αποτέλεσαν την οµάδα ελέγχου. Στο σύνολο των 133 µικροοργανισµών και σε σχέση µε τις κυριότερες κατηγορίες αντιβιοτικών που χρησιµοποιούνται στη θεραπεία λοιµώξεων από Εντεροβακτηριακά, αντοχή σε µια τουλάχιστον αµινογλυκοσίδη εµφάνισαν οι 50 (37,6%), σε φθοριοκινολόνες οι 51 (38,3%) και σε κοτριµοξαζόλη οι 65 (48,9%). Ως προς τα β-λακταµικά, αντοχή σε πιπερακιλλίνη-ταζοµπακτάµη παρουσίασαν οι 45, σε κεφαλοσπορίνες 3 ης γενιάς οι 51 και σε καρβαπενέµες οι 11, ευρέος φάσµατος β- λακταµάσες βρέθηκε να παράγουν οι 38 (28,6%), µεταλλοένζυµο VIM οι 17 (12,8%) και πλασµιδιακής προέλευσης κεφαλοσπορινάση CMY οι 6 (4,5%). Εβδοµήντα ένας µικροοργανισµοί (53,4%) βρέθηκαν θετικοί για την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και έντεκα (8,3%) θετικοί για ιντεγκρόνιο τάξης 2. Μεταξύ των θετικών στελεχών για ιντεγκρόνια, 9 στελέχη έφεραν ταυτόχρονα ιντεγκρόνια τάξεων 1 και 2. Η παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 ανά είδος εντεροβακτηριακού ήταν ως εξής: Ιντεγκρόνιο τάξης 1 έφεραν 21/61 Ε.coli (34,4%), 19/31 K.pneumoniae (61,3%), 23/29 Enterobacter spp (80%), 8/11 P.mirabilis (72,7%) 0/1 Salmonella spp (0%). Ιντεγκρόνιο τάξης 2 έφεραν 2/61 E.coli (3,3%), 1/31 K.pneumoniae (3,2%) και 8/11 P.mirabilis (72,7%). Τα συγκεντρωτικά αποτελέσµατα της αντοχής στις κύριες οµάδες αντιβιοτικών, αλλά και της συχνότητας παρουσίας ιντεγκρονίων ανά είδος εντεροβακτηριακού παρατίθενται στον πίνακα 6 που ακολουθεί: 57

Πίνακας 6: Συγκεντρωτικά στοιχεία ανά είδος εντεροβακτηριακού ως προς την εµφάνιση πολυαντοχής, την αντοχή στις κυριότερες οµάδες αντιβιοτικών και την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 Αντοχή Πολυανθεκτικό (αντοχή 3 κατηγορίες αντιβιοτικών) β-λακταµικά E.coli (n=61) K.pneumoniae (n=31) Είδος εντεροβακτηριακού Enterobacter spp (n=29) P.mirabilis (n=11) Salmonella spp (n=1) Σύνολο 9 (14,8%) 18 (58,1%) 25 (86,2%) 8 (72,7%) 0 60 Πιπερακιλλίνη/ταζοµπακτάµη 4 (6,6%) 14 (45,2%) 27 (93,1%) 0 0 45 Κεφαµυκίνες 3 (4,9%) 14 (45,2%) Εγγενής αντοχή 2 (18,2%) 0 19 Κεφαλοσπορίνες 3 ης γενιάς 3 (4,9%) 17 (54,8%) 25 (86,2%) 6 (54,5%) 0 51 Μονοµπακτάµες 2(3,3%) 13 (41,9%) 25 (86,2%) 0 0 40 Καρβαπενέµες 0 7 (19,3%) 4 (13,8%) 0 0 11 Αµινογλυκοσίδες (εκτός στρεπτοµυκίνης) 4 (6,6%) 18 (58,1%) 21 (72,4%) 7 (63,6%) 0 50 Κινολόνες 8 (13,1%) 15 (48,4%) 22 (75,9%) 6 (54,5%) 0 51 Κοτριµοξαζόλη 17 (27,9%) 18 (58,1%) 21 (72,4%) 9 (81,8%) 0 65 Ιντεγκρόνιο τάξης 1 21 (34,4%) 19(61,3%) 23 (79,3%) 8 (72,7%) 0 71 Ιντεγκρόνιο τάξης 2 2 (3,3%) 1 (3,2%) 0 8 (72,7%) 0 11 58

4.3 Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά στελέχη Εντεροβακτηριακών Στον πίνακα 7 που ακολουθεί παρουσιάζεται η µονοπαραγοντική ανάλυση ενδογενών (δηµογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των αρρώστων) και εξωγενών (χαρακτηριστικά νοσηλείας και επεµβατικοί χειρισµοί) παραγόντων που σχετίστηκαν µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά. εν βρέθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δύο οµάδων (των ασθενών µε λοίµωξη από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος έναντι των µαρτύρων µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος) ως προς την ηλικία, το φύλο, τη βαρύτητα της γενικής κατάστασης λόγω υποκείµενων νοσηµάτων. Ως προς την εστία της βακτηριαιµίας, η οµάδα των ασθενών είχε εµφανίσει συχνότερα πρωτοπαθή βακτηριαιµία (p=0,001), αλλά και δευτεροπαθή βακτηριαιµία µε πιθανή εστία κεντρικούς ενδοφλέβιους καθετήρες (p<0,001). Ως προς τους εξωγενείς παράγοντες, βρέθηκε ότι στην οµάδα των ασθενών η αναλογία των αρρώστων που είχαν αναπτύξει νοσοκοµειακή λοίµωξη, είχαν νοσηλευθεί στη ΜΕΘ, είχαν υποβληθεί σε παρεµβατικούς χειρισµούς και είχαν λάβει αντιβιοτικά κατά το προηγούµενο τρίµηνο ήταν σε στατιστικά σηµαντικό βαθµό µεγαλύτερη από αυτήν της οµάδας των µαρτύρων (όλα p<0,001). Τέλος η οµάδα των ασθενών ήταν πιο πιθανό να έχει µεγάλη διάρκεια νοσηλείας πριν την εµφάνιση της βακτηριαιµίας (p<0,001) αλλά και λοίµωξη από Enterobacter spp (p<0,001). 59

Πίνακας 7: Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά Μονοπαραγοντική ανάλυση Μεταβλητή Ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=57) Ασθενείς µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=73) OR (95%CI) p-value Μεγάλη ηλικία 32 (56,1%) 45 (61,6%) 0,796 0,526 (>65 ετών) (0,394-1,611) Φύλο Άνδρες 33 (57,9%) 30 (41,1%) 1,971 0,057 (0,976-3,980) Τύπος βακτηριαιµίας Κοινότητας 0 (0%) 58 (79,5%) - <0,001 Σχετιζόµενη µε 10 (17,5%) 6 (8,2%) 2,376 0,108 υπηρεσίες υγείας (0,808-6,987) Νοσοκοµειακή 47 (82,5%) 9 (12,3%) 33,42 <0,001 Βαρύτητα Πολύ καλή γενική κατάσταση Μέτρια γενική κατάσταση, µερική αυτοεξυπηρέτηση Κατάκοιτος/κακή (12,59-88,7) 14 (24,5%) 16 (21,9%) 1,16 (0,511-2,63) 25 (43,9%) 41 (56,2%) 0,61 (0,303-1,226) 18 (31,6%) 14 (21,9%) 1,64 (0,74-3,612) γενική κατάσταση Εστία βακτηριαιµίας Ουροποιητικό 15 (25%) 45 (61,6%) 0,207 0,723 0,164 0,214 <0.001 (0,098-0,440) Κοιλία 7 (11,7%) 19 (26%) 0,375 0,038 (0,146-0,967) Πνεύµονες 7 (11,7%) 2 (2,7%) 4,689 0,041 (0,936-23,48) Ενδοφλέβιοι 12 (20%) 0 - <0,001 καθετήρες Άγνωστη 19 (31,7%) 7 (9,6%) 4,369 0,001 (1,689-11,3) Τοµέας νοσηλείας κατά την έναρξη βακτηριαιµίας Παθολογικός 17 (29,8%) 60 (82,2%) 0,092 (0,04-0,21) <0,001 Χειρουργικός 8 (14%) 13 (17,8%) 0,754 0,562 (0,289-1,964) Μονάδα Εντατικής 32(56,2%) 0 <0,001 Νοσηλείας Παρεµβατικός χειρισµός έως 72 ώρες πριν την έναρξη της βακτηριαιµίας Ουροκαθετήρας 50 (87,7%) 6 (8,2%) 79,76 <0.001 (25,2-251,97) Κεντρικός φλεβικός 38 (66,7%) 2 (2,7%) 71 <0,001 καθετήρας (15,69-321,1) ιασωλήνωση 35 (61,4%) 0 - <0,001 60

Πίνακας 7 (συνέχεια) Ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά Μεταβλητή (n=57) Χειρουργική επέµβαση πριν τη βακτηριαιµία 24 (42,1%) 5 (6,8%) Λήψη αντιβιοτικών το τελευταίο τρίµηνο Ασθενείς µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=73) 55 (96,5%) 17 (23,3%) OR (95%CI) p-value 9,89 (3,46-28,24) <0,001 90,58 (19,97-410,7) <0,001 Μεγάλη διάρκεια νοσηλείας πριν την εµφάνιση βακτηριαιµίας (>7 ηµέρες) 41 (71,9%) 7 (9,6%) 24,16 (9,16-63,73) <0,001 ιάρκεια νοσηλείας πριν την εµφάνιση βακτηριαιµίας 15 (4,5-29,5) 0 (0-0) <0,001 α [median (lowerupper percentile) days] Υπεύθυνος µικροοργανισµός E.coli 9 (15%) 52 (71,2%) 0,071 <0,001 (0,030-0,170) K.pneumoniae 18 (30%) 13 (17,8%) 1,978 0,098 (0,875-4,47) Enterobacter spp 25 (41,7%) 4 (5,5%) 12,32 <0,001 (3,97-38,18) P.mirabilis 8 (13,3%) 3 (4,1%) 3,59 0,055 (0,908-14,19) α Mann-Whitney U test Από την πολυπαραγοντική ανάλυση σε µια πρώτη φάση (πίνακας 8) µελέτης των παραγόντων που βρέθηκαν στατιστικά σηµαντικοί κατά τη µονοπαραγοντική ανάλυση, οι παράγοντες που παρέµειναν ως ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου εµφάνισης βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στο σύνολο των ασθενών ήταν η προηγούµενη χορήγηση αντιβιοτικών κατά το τελευταίο τρίµηνο (p<0,001) και η νοσοκοµειακή προέλευση της βακτηριαιµίας (p<0,001) 61

Πίνακας 8: Ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για λοίµωξη από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος Πολυπαραγοντική ανάλυση Μεταβλητή p-value Adjusted OR (95%CI) Νοσοκοµειακή βακτηριαιµία <0,001 10,255 (3,259-32,273) Προηγούµενη λήψη αντιβιοτικών <0,001 33,543 (6,844-164,392) Μεταβλητές που εισήχθησαν στο µοντέλο πολυπαραγοντικής ανάλυσης: νοσοκοµειακή βακτηριαιµία, µεγάλη διάρκεια νοσηλείας (>7 ηµέρες) προ βακτηριαιµίας, προηγούµενη λήψη αντιβιοτικών, πρωτοπαθής βακτηριαιµία, λοίµωξη από Enterobacter spp Nagelkerke R Square: 0,732 και Hosmer and Lemeshow Test: 0,691 Σε δεύτερη φάση, εστιάζοντας στους εξωγενείς παράγοντες κινδύνου από το χώρο του νοσοκοµείου που βρέθηκαν στατιστικώς σηµαντικοί κατά τη µονοπαραγοντική ανάλυση, µε πολυπαραγοντική ανάλυση (πίνακας 9) ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου µέσα στο χώρο του νοσοκοµείου λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά παρέµειναν η νοσηλεία στη ΜΕΘ και η τοποθέτηση ουροκαθετήρα έως και 72 ώρες πριν τη βακτηριαιµία. Πίνακας 9: Ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου µέσα στο νοσοκοµείο για λοίµωξη από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος Πολυπαραγοντική ανάλυση Μεταβλητή p-value Adjusted OR (95%CI) Ουροκαθετήρας έως και 72 ώρες πριν τη <0,001 30,629 λοίµωξη (8,596-109,132) Νοσηλεία στη ΜΕΘ 0,038 10,625 (1,145-98,588) Μεταβλητές που εισήχθησαν στο µοντέλο πολυπαραγοντικής ανάλυσης: µεγάλη διάρκεια νοσηλείας (>7 ηµέρες) προ βακτηριαιµίας, τοποθέτηση ουροκαθετήρα, κεντρικού φλεβικού καθετήρα ή χειρουργική επέµβαση πριν την εµφάνιση βακτηριαιµίας και νοσηλεία στη ΜΕΘ Nagelkerke R Square: 0,826 και Hosmer and Lemeshow Test: 0,738 Κρίθηκε σκόπιµο να γίνει και περαιτέρω ανάλυση, µε κριτήριο τη νοσηλεία ή όχι στη ΜΕΘ του νοσοκοµείου και να ελεγχθούν χωριστά οι παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στους νοσηλευόµενους που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ του νοσοκοµείο. 62

Στον πίνακα 10 που ακολουθεί, παρουσιάζεται η µονοπαραγοντική ανάλυση των ενδογενών και των εξωγενών παραγόντων που σχετίζονταν µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά για τους 95 νοσηλευόµενους που νοσηλεύτηκαν αποκλειστικά σε κλινικές του παθολογικού και χειρουργικού τοµέα του νοσοκοµείου. Μεταξύ των 95 αυτών ασθενών οι 23 εµφάνισαν βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά και αποτέλεσαν την υποοµάδα των ασθενών και οι 72 είχαν βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό και αποτέλεσαν την αντίστοιχη υποοµάδα των µαρτύρων. εν βρέθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δύο οµάδων ως προς την ηλικία. Οι ασθενείς ήταν σε µεγαλύτερη αναλογία κατάκοιτοι σε σχέση µε τους µάρτυρες (p=0,032) ενώ παρατηρήθηκε και µια µεγαλύτερη αναλογία του ανδρικού φύλου σε σχέση µε την οµάδα των µαρτύρων (p=0,037). Ως προς τους εξωγενείς παράγοντες, βρέθηκε ότι η οµάδα των ασθενών είχε συχνότερα λοίµωξη νοσοκοµειακή ή σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας (p<0,001), είχε υποβληθεί συχνότερα σε παρεµβατικούς χειρισµούς, όπως τοποθέτηση ουροκαθετήρα (p<0,001) και τοποθέτηση κεντρικού φλεβικού καθετήρα (p=0,012) πριν το επεισόδιο της βακτηριαιµίας και είχε συχνότερα λάβει αντιβιοτικά κατά το προηγούµενο τρίµηνο (p<0,001) από την οµάδα ελέγχου. Τέλος η οµάδα των ασθενών ήταν πιο πιθανό να έχει µεγάλη διάρκεια νοσηλείας (>7 ηµέρες) πριν την εµφάνιση της βακτηριαιµίας (p=0,002), αλλά και λοίµωξη από P.mirabilis (p=0,002) και Enterobacter spp (p=0,021). 63

Πίνακας 10: Παράγοντες κινδύνου για ανάπτυξη βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά σε 95 αρρώστους που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ Μονοπαραγοντική ανάλυση Μεταβλητή Ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=23) Ασθενείς µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=72) OR (95%CI) p-value Ηλικία 73,9±10,94 69,25±14,64 0,163 (µέση±τυπική απόκλιση, έτη) Φύλο- Άνδρες 15(65,2%) 29(40,3%) 2,78 0,037 (1,04-7,4) Τύπος βακτηριαιµίας Κοινότητας 0 58 (80,6%) <0,001 Σχετιζόµενη µε 10 (43,5%) 6 (8,3%) 8,46 <0,001 υπηρεσίες υγείας (2,6-27,37) Νοσοκοµειακή 13 (56,5%) 8 (11,1%) 10,4 <0,001 Βαρύτητα Πολύ καλή γενική κατάσταση Μέτρια γενική κατάσταση, µερική αυτοεξυπηρέτηση Κατάκοιτος/κακή (3,4-31,38) 3(13%) 16(22,2%) 0,525 (0,138-1,91) 10 (43,5%) 41 (56,9%) 0,582 (0,226-1,5) 10 (43,5%) 15 (20,8%) 2,92 (1,07-7,9) γενική κατάσταση Εστία βακτηριαιµίας Ουροποιητικό 13 (56,5%) 45 (62,5%) 0,78 (0,3-2) Κοιλία 3(13%) 18(25%) 0,45 (0,12-1,69) Πνεύµονες 1(4,3%) 2(2,8%) 1,591 (0,138-18,39) Άγνωστη 6(26,1%) 7 (9,7%) 3,277 (0,97-11,03) Τοµέας νοσηλείας 0,567 κατά την έναρξη (0,18-1,73) βακτηριαιµίας Παθολογικός 17(73,9%) 60(83,3%) Χειρουργικός 6(26,1%) 12 (16,7%) Παρεµβατικός χειρισµός έως 72 ώρες πριν την έναρξη στις βακτηριαιµίας Ουροκαθετήρας 16(69,6%) 5(6,9%) 30,6 Κεντρικός φλεβικός καθετήρας Χειρουργική επέµβαση πριν τη βακτηριαιµία (8,6-109,1) 4(17,4%) 2 (2,8) 7,36 (1,2-43,32) 5 (21,7%) 4 (5,6%) 4,7 (1,15-19,41) 0,338 0,260 0,032 0,609 0,229 0,708 0,047 0,316 <0,001 0,012 0,021 64

Πίνακας 10 (συνέχεια) Μεταβλητή Χορήγηση αντιβιοτικών το τελευταίο τρίµηνο Ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=23) Ασθενείς µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=72) OR (95%CI) 22 (95,7%) 16 (22,2%) 77 (9,6-616,1) p-value <0,001 Μεγάλη διάρκεια νοσηλείας πριν την εµφάνιση βακτηριαιµίας (>7 ηµέρες) 8(34,8%) 6 (8,3%) 5,87 (1,77-19,4) 0,002 ιάρκεια νοσηλείας πριν την εµφάνιση βακτηριαιµίας 3 (0-15) 0 (0-0) <0,001 α [median (lowerupper percentile) days] Βακτηριακό είδος E.coli 7(30,4%) 51 (70,8%) 0,18 0,001 (0,065-0,501) K.pneumoniae 5 (21,7%) 13 (18,1%) 1,261 0,695 (0,396-4,016) Enterobacter spp 5(21,7%) 4 (5,6%) 4,722 0,021 (1,14-19,41) P.mirabilis 6(26,1%) 3 (4,2%) 8,118 0,002 (1,8-35,8) α Mann-Whitney U test Από την πολυπαραγοντική ανάλυση και την εισαγωγή στο µοντέλο των παραµέτρων: νοσοκοµειακή προέλευση βακτηριαιµίας, µεγάλη διάρκεια νοσηλείας πριν τη βακτηριαιµία, τοποθέτηση ουροκαθετήρα έως και 72 ώρες πριν τη βακτηριαµία, λήψη αντιβιοτικών το τελευταίο τρίµηνο και λοίµωξη από P.mirabilis, ο µόνος παράγοντας που παρέµεινε ως ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου λοίµωξης από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στους αρρώστους που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ ήταν η τοποθέτηση ουροκαθετήρα.(p=0,010, adjusted OR= 6,889, 95% CI=1,597-29,726). (Nagelkerke R Square: 0,720 και Hosmer and Lemeshow Test: 0,753) 65

4.4 Κλινική έκβαση βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά 4.4.1. Επίδραση στις πολυαντοχής του υπεύθυνου για βακτηριαιµία εντεροβακτηριακού στελέχους στη διάρκεια νοσηλείας µετά την έναρξη της βακτηριαιµίας και στη συνολική διάρκεια νοσηλείας των ασθενών Προκειµένου να µελετηθεί η επίδραση της βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά στελέχη Εντεροβακτηριακών στην έκβαση της λοίµωξης εξαιρέθηκαν από την αρχή οι περιπτώσεις πολυµικροβιακής βακτηριαιµίας και συγκεκριµένα τα 14 επεισόδια βακτηριαιµίας στα οποία αποµονώθηκε συγχρόνως µε το εντεροβακτηριακό στέλεχος και στέλεχος P.aeruginosa ή Gram-θετικός κόκκος. Έτσι, από τους συνολικά 130 ασθενείς µελετήθηκαν οι 116. Μεταξύ των 116 αρρώστων, οι 33 απεβίωσαν έως και τριάντα ηµέρες µετά την έναρξη της βακτηριαιµίας (33/116, 28,4% 30-day-crude mortality, all cause inhospital mortality). Οι υπόλοιποι 83 άρρωστοι επιβίωσαν και εξήλθαν ζώντες από το νοσοκοµείο (83/116, 71,6%). Μεταξύ των 83 αρρώστων που εξήλθαν από το νοσοκοµείο, αυτοί που είχαν αναπτύξει βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό είχαν σε στατιστικά σηµαντικό βαθµό µεγαλύτερη διάρκεια νοσηλείας µετά το επεισόδιο της βακτηριαιµίας, σε σχέση µε τους επιβιώσαντες µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό στέλεχος [median (lower-upper quartile) = 20 (11,5-30,75) έναντι 8 (7-14), p<0,001, εικόνα 7 α ] καθώς και µεγαλύτερη συνολική διάρκεια νοσηλείας [median (lower-upper quartile) = 36 (23,5-63,5) έναντι 9 (7-16), p<0,001, εικόνα 7 β ]. 66

60 Ηµέρες νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία 40 20 0-20 Τα παραλληλόγραμμα αντιπροσωπεύουν το εύρος της διασποράς της κατανομής μεταξύ 1 ου -3 ου τεταρτημορίου των μετρήσεων [κάτω πλευρά:1 ο τεταρτημόριο (25%), άνω πλευρά: 3 ο τεταρτημόριο (75%)] και η οριζόντια γραμμή μέσα στο σχήμα αντιπροσωπεύει τη διάμεσο τιμή N = 24 Πολυανθεκτικό 59 Όχι πολυανθεκτικό Επιβιώσαντες µε βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακό στέλεχος Εικόνα 7 α : ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία στους ασθενείς που επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος. 120 110 100 Συνολική διάρκεια νοσηλείας (Ηµέρες) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0-10 N = 24 59 Πολυανθεκτικό Μη πολυανθεκτικό Επιβιώσαντες µε βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακό στέλεχος Εικόνα 7 β : ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη συνολική διάρκεια νοσηλείας στους ασθενείς που επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος 67

4.4.1.1. Ασθενείς που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ (n=89) Η διαφορά αυτή σε σχέση µε τη διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία αλλά και τη συνολική διάρκεια νοσηλείας παραµένει και µετά τη διάκριση των 116 αρρώστων µε κριτήριο τη νοσηλεία ή όχι στη ΜΕΘ. Από τους 116 αρρώστους οι 27 νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ. Από τους υπόλοιπους 89, επιβίωσαν οι 73, εκ των οποίων οι 14 που είχαν βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος νοσηλεύτηκαν συγκριτικά για µεγαλύτερο διάστηµα µετά τη βακτηριαιµία σε σχέση µε τους υπόλοιπους 59 µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό [median (lower-upper quartile), days = 16,50 (10,75-23,5) έναντι 8 (7-14), p=0,003], εικόνα 8 α ]. Οµοίως είχαν συγκριτικά µεγαλύτερη συνολική διάρκεια νοσηλείας [median (lower-upper quartile), days = 26,5 (15,25-35,25) έναντι 9 (7-16), p<0,001], εικόνα 8 β ]. 60 Ηµέρες νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία 50 40 30 20 10 0-10 N = 14 Πολυανθεκτικό 59 Όχι πολυανθεκτικό Επιβιώσαντες µε βακτηριαιµία που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ (73/89) Εικόνα 8 α : ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία στους ασθενείς που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ και επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος. 68

60 50 Συνολική διάρκεια νοσηλείας (Ηµέρες) 40 30 20 10 0-10 N = 14 Πολυανθεκτικό 59 Μη πολυανθεκτικό Επιβιώσαντες µε βακτηριαιµία που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ (73/89) Εικόνα 8 β : ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διαφορά στη συνολική διάρκεια νοσηλείας στους ασθενείς που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ και επιβίωσαν µεταξύ αυτών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό και αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος. 4.4.1.2. Ασθενείς που νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ Μεταξύ των 27 ασθενών που νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ, επιβίωσαν οι 10 οι οποίοι εξήλθαν από το νοσοκοµείο σε 44,7±41,94 ηµέρες µετά την έναρξη της βακτηριαιµίας και το 50% αυτών είχε νοσηλεία 27 ηµερών µετά τη βακτηριαιµία (median=27, (lower-upper quartile=17,5-69) ηµέρες (εικόνα 9). Σηµειώνεται ότι και οι 10 ασθενείς είχαν βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος. 120 Ηµέρες νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία 100 80 60 40 20 0-20 N = 10 Πολυανθεκτικό Επιβιώσαντες µε βακτηριαιµία και νοσηλεία στη ΜΕΘ (10/27) Εικόνα 9: ιάγραµµα box-plot όπου φαίνεται η διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία στους επιβιώσαντες που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ. 69

4.4.2. Επίδραση της πολυαντοχής του υπεύθυνου για βακτηριαιµία εντεροβακτηριακού στελέχους στην αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη στις βακτηριαιµίας 4.4.2.1 Μελέτη στο συνολικό πληθυσµό των 116 αρρώστων Μεταξύ των 116 αρρώστων, οι 33 απεβίωσαν έως και τριάντα ηµέρες µετά την έναρξη στις βακτηριαιµίας (33/116, 28,4% 30-day-crude mortality, all cause inhospital mortality). Στο διάγραµµα που ακολουθεί φαίνεται η κατανοµή των θανάτων από όλες τις αιτίες σε σχέση µε το χρόνο που πέρασε από την έναρξη της βακτηριαιµίας (εικόνα 10). Ο θάνατος αυτών των ασθενών επήλθε µετά από 7,79 ± 7,69 (mean±sd) ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας. Είκοσι δύο ασθενείς απεβίωσαν µέσα στην πρώτη εβδοµάδα, σε 28 επήλθε ο θάνατος έως και 14 ηµέρες µετά τη βακτηριαιµία και 30 πέθαναν έως και είκοσι µία ηµέρες µετά την έναρξη της βακτηριαιµίας. Τέλος, τρεις ασθενείς απεβίωσαν µετά από διάστηµα 21 ηµερών και έως 30 ηµέρες µετά τη βακτηριαιµία: 7 Αριθµός ασθενών που απεβίωσαν 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Ηµέρες µετά την έναρξη βακτηριαιµίας Εικόνα 10: ιάγραµµα κατανοµής των 33 θανάτων σε σχέση µε το χρόνο από την εµφάνιση στις βακτηριαιµίας Λαµβάνοντας υπόψη και την εµφάνιση πολυαντοχής των υπευθύνων µικροοργανισµών παρατηρούµε ότι από τους 33 ασθενείς που απεβίωσαν, οι 22 είχαν βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό και οι 11 από µη πολυανθεκτικό. Επιπρόσθετα στο διάγραµµα που ακολουθεί φαίνεται ότι όλοι οι θάνατοι ασθενών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά 70

συνέβησαν έως και 9 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας, ενώ οι θάνατοι ασθενών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά είχαν ευρύτερη χρονική κατανοµή (εικόνα 11): 7 Αριθµός ασθενών που απεβίωσαν 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 2425 26 27 28 29 30 Ηµέρες µετά την έναρξη βακτηριαιµίας Πολυανθεκτικό Μη πολυανθεκτικό Εικόνα 11: ιάγραµµα κατανοµής των 33 θανάτων σε σχέση µε το χρόνο από την εµφάνιση στις βακτηριαιµίας και την πολυαντοχή του στελέχους Προκειµένου να διευκρινιστεί εάν η πολυαντοχή των εντεροβακτηριακών που αποµονώθηκαν από τις καλλιέργειες αίµατος των 116 ασθενών είχε επίδραση στην αδρή θνητότητα, έγινε περαιτέρω ανάλυση των πιθανών παραγόντων κινδύνου για αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη στις βακτηριαιµίας. Στον πίνακα 11 που ακολουθεί παρουσιάζονται οι παράγοντες κινδύνου που σχετίζονταν µε την θνητότητα από όλες τις αιτίες για τους 116 από τους 130 ασθενείς µε βακτηριαιµία µόνο από Εντεροβακτηριακά στελέχη. Από τη µονοπαραγοντική ανάλυση, προέκυψαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ της οµάδας των αρρώστων που απεβίωσαν και της οµάδας των αρρώστων που εξήλθαν από το νοσοκοµείο. Οι άρρωστοι που πέθαναν είχαν πιο επιβαρυµένη γενική κατάσταση, παρουσίασαν σηπτική καταπληξία και νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ του νοσοκοµείου (όλα p<0,001). Ως προς τον τύπο της βακτηριαιµίας είχαν συχνότερα νοσοκοµειακής προέλευσης βακτηριαιµία (p=0,002) και δευτεροπαθή βακτηριαιµία µε πιθανή εστία άλλη πλην του ουροποιητικού συστήµατος (p=0,012). Τέλος ως προς τον υπεύθυνο µικροοργανισµό, οι 71

βακτηριαιµίες τους προκλήθηκαν συχνότερα από πολυανθεκτικά στελέχη (p<0,001, OR=4,917, 95% CI=2,069-11,68). Πίνακας 11: Παράγοντες σχετιζόµενοι µε αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες για 116 ασθενείς µε βακτηριαιµία από Εντεροβακτηριακά στελέχη Μονοπαραγοντική ανάλυση Ασθενείς µε βακτηριαιµία από Εντεροβακτηριακά (n=116) Παράγοντας Απεβίωσαν (n=33) Επιβίωσαν (n=83) OR (95%CI) p-value Μεγάλη ηλικία 24 (72,7%) 47 (56,6%) 2,043 0,108 (> 65 ετών) (0,847-4,927) Φύλο 1,262 0,574 (0,65-2,848) Άνδρες 14 (42,4%) 40 (48,2%) Γυναίκες 19 (57,6%) 43 (51,8%) Βαρύτητα Όχι υποκείµενο νόσηµα / 2 (6,1%) 25 (30,5%) 0,147 0,005 καλή γενική κατάσταση (0,033-0,663) Μέτρια γενική κατάσταση / 10 (30,3%) 48 (58,5%) 0,308 0,006 µερική αυτοεξυπηρέτηση (0,130-0,730) Κατάκοιτος / κακή γενική κατάσταση 21 (63,6%) 9 (11%) 14,19 <0,001 (5,268-38,247) Τύπος βακτηριαιµίας Κοινότητας 6 (18,2%) 51 (61,4%) 0,139 <0,001 (0,052-0,375) Σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας 7(21,2%) 8(9,6%) 2,52 0,094 (0,833-7,64) Νοσοκοµειακή 20 (60,6%) 24 (28,9%) 3,78 0,002 (1,62-8,79) Πρωτοπαθής εστία άλλη πλην 22 (66,7%) 34 (41%) 2,882 0,012 του ουροποιητικού (1,237-6,715) Σηπτική καταπληξία 16 (48,5%) 0 - <0,001 Νοσηλεία σε ΜΕΘ 17 (51,5%) 10 (12%) 7,75 (2,99-20,05) Υπεύθυνος µικροοργανισµός Πολυανθεκτικό στέλεχος 22(66,7%) 24 (28,9%) 4,917 (2,069-11,68) Βακτηριακό είδος E.coli 7 (21,2%) 50 (60,2%) 0,178 (0,069-0,451) K.pneumoniae 11 (33,3%) 15 (18,1%) 2,26 (0,098-5,65) Enterobacter spp 9 (27,3%) 12 (14,5%) 2,219 (0,832-5,9) Proteus mirabilis 6(18,2%) 5(6%) 3,467 (0,978-12,282) <0,001 <0,001 <0,001 0,075 0,106 0,044 72

Μετά την πολυπαραγοντική ανάλυση όµως και την εισαγωγή στο µοντέλο των εξής παραµέτρων: νοσοκοµειακή προέλευση βακτηριαιµίας, νοσηλεία στη ΜΕΘ, πιθανή πρωτοπαθής εστία άλλη πλην του ουροποιητικού, κακή γενική κατάσταση λόγω υποκείµενων νοσηµάτων και τέλος πολυαντοχή του υπεύθυνου µικροοργανισµού, η βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στελέχη δεν παρέµεινε ως ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες στους 116 ασθενείς µε µη πολυµικροβιακή βακτηριαιµία (p=0,733, adjusted OR= 1,384 95% CI=0,213-8,978). Αντίθετα ανεξάρτητοι παράγοντες για αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες παρέµειναν η κακή γενική κατάσταση λόγω υποκείµενων νοσηµάτων (p<0,001) και η νοσηλεία στη ΜΕΘ (p<0,001). 4.4.2.2. Μελέτη µόνο των 89 αρρώστων που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ Η θνητότητα από όλες τις αιτίες στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας µελετήθηκε και για το υποσύνολο των αρρώστων που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ, προκειµένου να ελεγχθεί η επίδραση της πολυαντοχής του υπεύθυνου µικροοργανισµού στην αδρή θνητότητα και σε αυτούς τους αρρώστους. Στον πίνακα 12 που ακολουθεί παρουσιάζονται οι παράγοντες κινδύνου που σχετίζονταν µε την θνητότητα από όλες τις αιτίες για τους 89 αρρώστους που νοσηλεύτηκαν αποκλειστικά στις κλινικές του παθολογικού και του χειρουργικού τοµέα και δεν ανέπτυξαν πολυµικροβιακή λοίµωξη. Από τη µονοπαραγοντική ανάλυση, δεν προέκυψαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ της οµάδας των ασθενών που απεβίωσαν και της οµάδας των αρρώστων που εξήλθαν από το νοσοκοµείο ως προς την εµφάνιση πολυαντοχής του υπεύθυνου µικροοργανισµού (p=0,112, OR=2,529, 95% CI=0,78-8,13). Επιπρόσθετα δεν παρουσιάστηκαν σηµαντικές διαφορές ως προς την ηλικία, το φύλο και τον τοµέα νοσηλείας. Αντίθετα, οι άρρωστοι που πέθαναν είχαν πιο επιβαρηµένη γενική κατάσταση (p<0,001), παρουσίασαν σηπτική καταπληξία (p<0,001) ενώ ως προς τον τύπο της βακτηριαιµίας είχαν συχνότερα βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας (p=0,002). Τέλος, ως προς τον υπεύθυνο µικροοργανισµό παρατηρήθηκε ότι οι άρρωστοι που απεβίωσαν είχαν συχνότερα βακτηριαιµία από P.mirabilis (p=0,002). 73

Πίνακας 12: Παράγοντες σχετιζόµενοι µε αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες για 89 ασθενείς που δεν νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ Μονοπαραγοντική ανάλυση Παράγοντας Απεβίωσαν (n=16) Επιβίωσαν (n=73) OR (95%CI) p- value Ηλικία, µέση ± SD, έτη 75±14,32 69,1±13,96 0,132 Φύλο-άνδρες 8 (50%) 32 (43,8%) 1,28 (0,43-3,78) 0,653 Βαρύτητα Όχι υποκείµενο νόσηµα / καλή γενική κατάσταση Μέτρια γενική κατάσταση / µερική αυτοεξυπηρέτηση Κατάκοιτος / κακή γενική 0 18 (24,7%) 0,026 2 (12,5%) 46 (63%) 0,084 (0,018-0,39) 14 (87,5%) 9 (12,3%) 49,7 (9,67-256) κατάσταση Πρωτοπαθής εστία Ουροποιητικό σύστηµα 10 (62,5%) 48 (65,8%) 0,868 <0,001 <0,001 0,805 (0,283-2,60) Κοιλία 2 (12,5%) 17 (23,3%) 0,471 0,34 (0,097-2,28) Αναπνευστικό 2 (12,5%) 1 (1,4%) 10,28 0,025 (0,87-121,3) Άγνωστη 2 (12,5%) 7 (9,6%) 1,347 0,727 (0,253-7,18) Σηπτική καταπληξία 7 (43,8%) 0 <0,001 Τµήµα Παθολογικός τοµέας 14 (87,5%) 60 (82,2%) 1,517 (0,307-7,5) 0,607 Χειρουργικός τοµέας 2 (12,5%) 13 (17,8%) 0,659 (0,133-3,26) Τύπος βακτηριαιµίας Κοινότητας 6 (37,5%) 51 (69,9%) 0,259 (0,084-0,8) Σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας 7 (43,8%) 8 (11%) 6,32 (1,84-21,64) Νοσοκοµειακή 3 (18,8%) 14 (19,2%) 0,973 (0,24-3,881) Πολυανθεκτικό στέλεχος 6 (37,5%) 14 (19,2%) 2,529 (0,78-8,13) Βακτηριακό είδος E.coli 6 (37,5%) 49 (67,1%) 0,294 (0,096-0,9) K.pneumoniae 4 (25%) 12 (16,4%) 1,694 (0,46-6,15) Εnterobacter spp 1 (6,3%) 7 (9,6%) 0,629 (0,07-5,5) P.mirabilis 5 (31,3%) 4 (5,5%) 7,841 (1,82-33,78) 0,607 0,015 0,002 0,969 0,112 0,027 0,419 0,672 0,002 74

Ενισχυτικό του ευρήµατος της µη συσχέτισης της πολυαντοχής µε την αδρή θνητότητα στους ασθενείς που νοσηλεύθηκαν αποκλειστικά σε κλινικές του παθολογικού και χειρουργικού τοµέα είναι και το εξής συµπέρασµα: Μεταξύ των συνολικά 16 αρρώστων που απεβίωσαν έως και τριάντα ηµέρες µετά την έναρξη της βακτηριαιµίας από τους 89 που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ, 6 είχαν βακτηριαιµία από στέλεχος E.coli, 4 από στέλεχος K.pneumoniae, 1 από στέλεχος Enterobacter spp και 5 από στέλεχος P.mirabilis. Προκειµένου να απαλειφθεί η επίδραση της διαφορετικής πιθανά λοιµογόνου δύναµης των στελεχών, λόγω του διαφορετικού βακτηριακού είδους, έγινε σύγκριση µεταξύ των δύο οµάδων ασθενών-µαρτύρων µετά από διάστρωσή τους (stratification), που βασίστηκε στο είδος του εντεροβακτηριακού που προκάλεσε τη λοίµωξη. Ως προς την αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας, όπως φαίνεται στον πίνακα 13 που ακολουθεί, δεν βρέθηκαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δύο οµάδων µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό ή µη στέλεχος µετά από τη διάστρωση των αρρώστων µε βάση το είδος του υπεύθυνου εντεροβακτηριακού ( όλα p>0,05). Πίνακας 13: Αδρή θνητότητα σε 89 αρρώστους (που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ) µε βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακά µετά από διάστρωση των αρρώστων βάσει του είδους του υπεύθυνου εντεροβακτηριακού και κατανοµής σε ασθενείς-µάρτυρες βάσει εµφάνισης ή όχι πολυαντοχής των στελεχών Θνητότητα, Μικροβιακό είδος αρ.(%) ασθενών Βακτηριαιµία από E.coli (n=55) Πολυανθεκτικό (n=6) 1 (16,7%) Όχι πολυανθεκτικό (n=49) 5 (10%) Βακτηριαιµία από K.pneumoniae (n=16) Πολυανθεκτικό (n=4) 1(25%) Όχι πολυανθεκτικό (n=12) 3 (25%) Βακτηριαιµία από Enterobacter spp (n=8) Πολυανθεκτικό (n=4) 1 (25%) Όχι πολυανθεκτικό (n=4) 0 Βακτηριαιµία από P.mirabilis(n=9) Πολυανθεκτικό (n=6) 3 (50%) Όχι πολυανθεκτικό (n=3) 2 (66,7%) p-value 0,632 1 0,285 0,635 75

4.5 Μοριακή βάση της πολυαντοχής των εντεροβακτηριακών στελεχών - ο ρόλος των ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 Προκειµένου να διερευνηθεί ο ρόλος των ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 στην εµφάνιση πολυαντοχής των στελεχών που αποµονώθηκαν από τον υπό µελέτη πληθυσµό, έγινε σύγκριση µεταξύ των στελεχών που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες της οµάδας των ασθενών (µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος) έναντι των αντίστοιχων στελεχών των ασθενών της οµάδας ελέγχου (µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό στέλεχος). Τα 60 συνολικά πολυανθεκτικά στελέχη (9 E.coli, 18 K.pneumoniae, 25 Enterobacter spp και 8 P.mirabilis, εικόνα 12) που αποµονώθηκαν από τους 57 αρρώστους της οµάδας των ασθενών βρέθηκε ότι έφεραν συχνότερα ιντεγκρόνιο τάξης 1 σε σχέση µε τα 73 µη πολυανθεκτικά στελέχη που αποµονώθηκαν από τους 73 αρρώστους της οµάδας των µαρτύρων (96,7% έναντι 17,8%, p<0,001) και οριακά συχνότερα ιντεγκρόνιο τάξης 2 (13,5% έναντι 4,3%, p=0,055) (εικόνα 13). P.mirabilis 8 / 13% E. coli 9 / 15% K.pneumoniae Enterobacter sp 18 / 30% 25 / 42% Εικόνα 12: Εκατοστιαία αναλογία ανά βακτηριακό είδος στο σύνολο των πολυανθεκτικών στελεχών εντεροβακτηριακών 76

Όχι ιντεγκρόνιο 3,3% Ναι ιντεγκρόνιο 17,8% Ναι ιντεγκρόνιο 82,2% 96,7% Όχι ιντεγκρόνιο Πολυανθεκτικά στελέχη (n=60) Μη πολυανθεκτικά στελέχη (n=73) Εικόνα 13: Εκατοστιαία αναλογία θετικών για ιντεγκρόνια τάξης 1 εντεροβακτηριακών στελεχών σε σχέση µε την εµφάνιση πολυαντοχής στα αντιβιοτικά Επιπρόσθετα, µόνο σε πολυανθεκτικά στελέχη βρέθηκαν ταυτοχρόνως περισσότερα του ενός ιντεγκρόνια τάξης 1 (p=0,056) καθώς και παρουσία του γονιδίου bla VIM που βρίσκεται ως γονιδιακή κασέτα µέσα σε ιντεγκρόνια. Τα µικροβιολογικά χαρακτηριστικά των µικροοργανισµών που αποµονώθηκαν από τους ασθενείς των δύο οµάδων παρατίθενται στον πίνακα 14 που ακολουθεί: Πίνακας 14: Παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 στους µικροοργανισµούς που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες ασθενών-µαρτύρων Μεταβλητή Ιντεγκρόνιο τάξης 1 (n=71) >1 Ιντεγκρόνιο τάξης 1 (n=14) Ιντεγκρόνιο τάξης 2 (n=11) Πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά (n=60) Μη πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά (n=73) p-value 58 (96,7%) 13 (17,8%) <0,001 14 (28%) 0 0,056 8 (13,3%) 3 (4,1%) 0,055 blavim (n=17) 17 (28,3%) 0 <0,001 77

Από τα 71 θετικά για την παρουσία ιντεγκρονίου τάξης 1 εντεροβακτηριακά που αποµονώθηκαν από καλλιέργειες αίµατος ασθενών, κατέστη δυνατό να µετρηθεί το µέγεθος της µεταβλητής περιοχής του/των ιντεγκρονίων στα 60. Σηµειώνεται ότι συχνά αναφέρονται ιντεγκρόνια τάξης 1 µε κολοβωµένο το 3 -CS άκρο τους, για τα οποία είναι δεν είναι επιτυχής η ενίσχυση της µεταβλητής περιοχής τους µε τη χρήση εκκινητών για το 5 -και 3 -CS άκρο τους (Sunde M, 2005). Από αυτά τα 60 στελέχη, τα 50 ήταν πολυανθεκτικά και τα υπόλοιπα 10 ευαίσθητα ή ανθεκτικά σε <3 τάξεις αντιβιοτικών. Το µέσο µέγεθος των ιντεγκρονίων τάξης 1 που βρέθηκαν σε πολυανθεκτικά στελέχη ήταν µεγαλύτερο από αυτό των ιντεγκρονίων που βρέθηκαν σε µη πολυανθεκτικά στελέχη (2.158±784 bp έναντι 1.276±381,5 bp (p=0,001) (εικόνα 14). Στον πίνακα 15 που ακολουθεί συγκρίνονται τα ιντεγκρόνια των 2 οµάδων ως προς το µέγεθος της µεταβλητής των περιοχής. Ιντεγκρόνια µεγάλου µεγέθους ( 3000bp) βρέθηκαν αποκλειστικά σε πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά στελέχη Εντεροβακτηριακών. 4000 Mean +- 2 SD µέγεθος ιντεγκρονίου (bp) 3000 2000 1000 0 N = 50 Ναι 10 Όχι p=0,001 Πολυανθεκτικό στέλεχος στελεχών Εικόνα 14: Μέσο µέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 σε σχέση µε την πολυαντοχή των 78

Πίνακας 15: Μέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίων τάξης 1 σε σχέση µε την πολυαντοχή των στελεχών που τα φέρουν Μέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίου/ων τάξης 1 700 bp (n=2) 900 bp (n=1) 1030 bp (n=2) 1500 bp (n=30) 1800 bp (n=1) 1900 bp (n=1) 3000 bp (n=6) 3200 bp (n=3) 1500bp & 1000bp (n=1) 1900bp & 1500bp (n=1) 3000bp & 1500bp (n=5) 3000bp & 1900bp (n=4) 3200bp & 1500bp (n=3) Εντεροβακτηριακά από αιµοκαλλιέργειες ασθενών µε ιντεγκρόνια µε µετρήσιµο µέγεθος µεταβλητής περιοχής (n=60) Πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά (n=50) Μη πολυανθεκτικά Εντεροβακτηριακά (n=10) 0 2 1 0 0 2 25 5 0 1 1 0 6 0 3 0 1 0 1 0 5 0 4 0 3 0 p-value 0,002 Η σχέση του µεγέθους του ιντεγκρονίου/ων τάξης 1 µε την εµφάνιση πολυαντοχής φαίνεται και στο διάγραµµα (εικόνα 15) που ακολουθεί στον οποίο γίνεται οµαδοποίηση των ιντεγκρονίων τάξης 1 ως προς το µέγεθός τους σε 3 κατηγορίες: 79

α) Μικρά ιντεγκρόνια µε µέγεθος 1000bp, β) Μεσαίου µεγέθους µε µέγεθος µεταβλητής περιοχής 1500 bp και 1900bp και γ) Μεγάλα µε µέγεθος 3000 bp, µε τα µικρά ιντεγκρόνια να βρίσκονται συχνότερα σε µη πολυανθεκτικά στελέχη (p<0,001) ενώ αντίθετα τα µεγάλου µεγέθους ιντεγκρόνια να βρίσκονται αποκλειστικά σε πολυανθεκτικά στελέχη (p=0,011): 40 30 Αριθµός στελεχών µε ιντεγκρόνιο τάξης 1 20 10 0 Μικρό Μεσαίο Μεγάλο Πολυαντοχή στελέχους Ναι Όχι Οµαδοπ οίηση µεγεθών ιντεγκρονίων τάξης 1 τάξης1 Εικόνα 15: Σχέση πολυαντοχής στελεχών µε οµαδοποιηµένο µέγεθος ιντεγκρονίων Επιπρόσθετα, βρέθηκε να υπάρχει σχέση ανάµεσα στο µέγεθος του ιντεγκρονίου και σε νοσηλεία ή όχι στη Μ.Ε.Θ του νοσοκοµείου: το µέσο µέγεθος των ιντεγκρονίων τάξης 1 που βρέθηκαν σε εντεροβακτηριακά στελέχη που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες ασθενών που νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ ήταν µεγαλύτερο από αυτό ιντεγκρονίων που βρέθηκαν σε στελέχη από ασθενείς που νοσηλεύτηκαν αποκλειστικά σε κλινικές του παθολογικού ή χειρουργικού τοµέα 80

(2.226,67±767,86 έναντι 1.772,59±793,85, p=0,032). Αντίθετα, δεν βρέθηκε στατιστικώς σηµαντική διαφορά ως προς το µέσο µέγεθος ιντεγκρονίων σε εντεροβακτηριακά που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες ασθενών του παθολογικού έναντι του χειρουργικού τοµέα (1.823,81±821,52 έναντι 1.593,33±726,57, p=0,541) (εικόνα 16). Α Β 3000 3000 Mean +- 2 SE µέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 2500 2000 1500 1000 N = 30 Ναι 27 Όχι Mean +- 2 SE µέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 2500 2000 1500 1000 500 N = 21 Παθολογικός 6 Χειρουργικός Νοσηλεία στη ΜΕΘ Τοµέας νοσηλείας Εικόνα 16: Σύγκριση µεγέθους ιντεγκρονίων σε εντεροβακτηριακά στελέχη από αιµοκαλλιέργειες ασθενών σε σχέση µε το τµήµα νοσηλείας Α. νοσηλεία στη ΜΕΘ ή όχι (p=0,032) Β. παθολογικός ή χειρουργικός τοµέας σε αρρώστους που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ (p=0,541) Τα αποτελέσµατα ως προς την παρουσία και το µέγεθος ιντεγκρονίου ανά είδος εντεροβακτηριακού φαίνεται στον πίνακα 16 που ακολουθεί. Τονίζεται ιδιαίτερα ότι στα στελέχη E.coli και ακολούθως σε στελέχη K.pneumoniae παρατηρήθηκε η µεγαλύτερη ποικιλία ως προς το µέγεθος των ευρισκόµενων ιντεγκρονίων. Το µοναδικό µέγεθος ιντεγκρονίου που βρέθηκε σε όλα τα υπό µελέτη είδη ήταν των 1500bp. Ιντεγκρόνια άλλου µεγέθους είχαν περιορισµένη κατανοµή στα διάφορα είδη. 81

Πίνακας 16: Παρουσία και µεγέθη ιντεγκρονίων τάξης 1 ανά είδος εντεροβακτηριακού E.coli (n=61) K.pneumoniae (n=31) E.aerogenes (n=16) E.cloacae (n=10) E.agglomerans (n=3) P.mirabilis (n=11) Salmonella spp Σύνολο Ιντεγκρόνιο τάξης 1 21 19 15 5 3 8 0 71 Θετική PCR 5-3 CS 17 15 15 3 3 7 0 60 Μικρού µεγέθους ιντεγκρόνιο τάξης 1 3 2 0 0 0 0 0 5 ( 1000 bp) Μεσαίου µεγέθους ιντεγκρόνιο τάξης 1 11 2 14 3 3 1 0 34 (1000 bp > Μέγεθος 1900 bp) Μεγάλου µεγέθους ιντεγκρόνιο τάξης 1 3 11 1 0 0 6 0 21 ( 3000 bp) >1 ιντεγκρόνιο τάξης 1 3 7 0 1 0 3 0 14 Μεγέθη ιντεγκρονίων (bp) 700 1000 1500 1800 1900 3000 700 900 1500 1900 3000 1500 3000 1000 1500 1500 1500 3200 82

Γονιδιακό περιεχόµενο ιντεγκρονίων Σχετικά µε το γονιδιακό περιεχόµενο των ιντεγκρονίων τάξης 1, τα συγκεντρωτικά αποτελέσµατα καθώς και η συσχέτισή του µε την πολυαντοχή παρατίθενται στον πίνακα 17 που ακολουθεί. Συνοπτικά βρέθηκαν τα εξής αποτελέσµατα: Ο αριθµός των ενσωµατωµένων γονιδιακών κασετών κυµάνθηκε από µία έως και τέσσερις γονιδιακές κασέτες. Ιντεγκρόνια µε µια µόνο κασέτα βρέθηκαν σχεδόν κατά αποκλειστικότητα σε µη πολυανθεκτικά στελέχη ενώ ιντεγκρόνια µε τρεις ή περισσότερες κασέτες βρέθηκαν αποκλειστικά σε πολυανθεκτικά στελέχη. Αναφορικά µε το µέγεθος του ιντεγκρονίου και τον αριθµό των περιεχόµενων κασετών βρέθηκε ότι ιντεγκρόνια τάξης 1 µε µέγεθος 700 έως 1000bp, 1500bp, 1900bp και 3000bp έφεραν µια, δύο, τρεις και τέσσερις κασέτες αντίστοιχα Υπάρχει µια σαφής επικράτηση των γονιδιακών κασετών αντοχής στις αµινογλυκοσίδες και δευτερευόντως στην τριµεθοπρίµη τόσο στα πολυανθεκτικά όσο και στα µη πολυανθεκτικά στελέχη, ανεξάρτητα από την προέλευση της βακτηριαιµίας από την κοινότητα ή το νοσοκοµείο. Η επικρατέστερη γονιδιακή κασέτα ήταν η aada1 (αντοχή σε στρεπτοµυκίνη/σπεκτινοµυκίνη) και ακολούθως η dfra1 (αντοχή στην τριµεθοπρίµη). Οι υπόλοιπες κασέτες που βρέθηκαν κωδικοποιούν i. για αµινογλυκοσιδοτροποποιητικά ένζυµα: aada2 (στρεπτοµυσίνη, σπεκτινοµυκίνη), aaca4 (αντοχή αµικασίνη, νετιλµικίνη, τοµπραµυκίνη), aaca7 και aacc1 (αντοχή σε γενταµικίνη, αστροµισίνη και σισοµισίνη) ii. για διυδροφολική αναγωγάση: dfra12 και dfra17 (αντοχή στην τριµεθοπρίµη) iii. για πενικιλλινάση PSE1 iv. για οξασιλλινάση OXA-1 v. για µεταλλο-β-λακταµάση VIM1 και VIM4 (αντοχή πρακτικά σε όλα τα β- λακταµικά εκτός αζτρεονάµης) vi. orff, άγνωστης λειτουργίας Το επικρατέστερο µέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 ήταν των 1500bp και βρέθηκαν πέντε διαφορετικοί συνδυασµοί κασετών (dfra1-aada1, dfra17-aada5, aaca4-aada1, OXA1-aadA1 και aaca4-dfra1). 83

Σε µη πολυανθεκτικά στελέχη βρέθηκαν κυρίως κασέτες που κωδικοποιούν για την αδενυλτρανσφεράση Α των αµινογλυκοσιδών (aada) και την αναγωγάση Α του διϋδροφολικού οξέος (dfra), οι οποίες προσδίδουν αντοχή στα αντιβιοτικά στρεπτοµυκίνη/σπεκτινοµυκίνη και τριµεθοπρίµη αντίστοιχα. Εξαίρεση σε αυτό αποτέλεσαν δύο µη πολυανθεκτικά στελέχη E.coli στα οποία βρέθηκαν στο ένα το γονίδιο β-λακταµάσης bla OXA-1 και στο άλλο το bla PSE-1 σε συνδυασµό µε κασέτα τύπου aada. Αντίθετα σε πολυανθεκτικά στελέχη βρέθηκαν και άλλοι τύποι κασετών που κωδικοποιούν για αντοχή σε νεότερες αµινογλυκοσίδες και σε καρβαπενέµες (VIM-1 and VIM-4). 84

Πίνακας 17: Γονιδιακό περιεχόµενο ιντεγκρονίων τάξης 1 σε σχέση µε την πολυαντοχή στα αντιβιοτικά Μέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίου /ων τάξης 1 Γονιδιακές κασέτες στη µεταβλητή περιοχή Πολυανθεκτικά (n=50) Μη πολυανθεκτικά (n=10) 700bp (n=2) aada1 0 1 dhfra7 0 1 900 bp (n=1) aada2 1 0 1000 bp (n=2) aada1 0 2 dhfra1-aada1 (n=12) 10 2 dhfra17-aada5 (n=5) 3 2 aaca4-aada1 (n=1) 1 0 1500 bp (n=30) aaca4-dhfra1 (n=1) 1 0 bla OXA1 -aada1 (n=1) 0 1 n/d (n=11) 1800 bp (n=1) bla PSE1 -aada2 0 1 1900 bp (n=1) dfra12-orff-aada2 1 0 3000 bp (n=6) bla VIM1 -aaca7-dfra1- aada1 6 0 3200 bp (n=3) aaca4-aac1 -aada1 3 0 dfra1-aada1 & 1 0 1500bp & 1000bp (n=1) 1900bp & 1500 bp (n=1) 3000bp & 1500bp (n=5) 3000bp & 1900bp (n=4) 3200bp & 1500bp (n=3) bla VIM4 dfra12-orff-aada2 & dfra1-aada1 bla VIM1 -aaca7-dfra1- aada1 & dfra1-aada1 bla VIM1 -aaca7-dfra1- aada1 & dfra12-orff-aada2 aaca4-aac1 -aada1 & dhfra1-aada1 1 0 5 0 4 0 3 0 Σύνολο 50 10 85

Στον πίνακα 18 που ακολουθεί αντιπαραβάλλεται ο φαινότυπος αντοχής των στελεχών στα αντιβιοτικά µε το γονιδιακό περιεχόµενο των ιντεγκρονίων που φέρουν. Η ισχυρότερη συσχέτιση βρέθηκε µεταξύ της ύπαρξης ιντεγκρονίου τάξης 1 που έφερε το γονίδιο της διυδροφολικής αναγωγάσης (dfra) και της φαινοτυπικής έκφρασης αντοχής στην τριµεθοπρίµη και εµµέσως στην κοτριµοξαζόλη (λόγω και της ταυτόχρονης παρουσίας του γονιδίου sul που κατά κανόνα βρίσκεται στο 3 συντηρηµένο άκρο των ιντεγκρονίων τάξης 1 που προσδίδει αντοχή στις σουλφοναµίδες) και ακολούθως µεταξύ κασετών για αµινογλυκοσιδοτροποποιητικά ένζυµα και φαινοτυπική αντοχή των αντίστοιχων στελεχών στις αµινογλυκοσίδες. Η αντοχή στα β-λακταµικά µπορεί να αποδοθεί άµεσα στην ύπαρξη ιντεγκρονίου τάξης 1 µόνο στα στελέχη που έφεραν ιντεγκρόνιο µε τις κασέτες bla PSE1, bla OXA-1, bla VIM1 και bla VIM4 καθώς δε βρέθηκαν άλλες κασέτες που κωδικοποιούν για β-λακταµάσες τύπου Α (VEB,GES, IBC, CTX-M) οι οποίες βρίσκονται σε ιντεγκρόνια τάξης 1. 86

Πίνακας 18: Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά εντεροβακτηριακών από καλλιέργειες αίµατος. Είδος Αντοχή Μέγεθος Γονιδιακές κασέτες ιντεγκρονίων τάξης 1 E.coli 0.7kb dfra7 amp, sxt 1.5kb dfra1-aada1 1.5kb dfra17-aada5 amp, c 1.5kb bla OXA1 -aada1 amp, pip 1.8kb bla PSE1 -aada2 amp, pip, c 1.0 bp aada1 amp, cip, sxt 1.5kb dfra17-aada5 1.9kb dfra12-orff-aada2 amp, gen, tob, net, cip, sxt, c 1,5kb dfra17-aada5 amp, amc, pip, tzp, cip, sxt 1.5 kb dfra17-aada5 amp, gen, tob, net, an, sxt 1.5 kb aaca4-aada1 3.0 kb bla amp, amc, fox, ctx, caz, atm,gn, VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & & cip, sxt,c 1.5 kb dfra1-aada1 amp, amc, fox, ctx, caz, tob, cip, sxt 3.0 kb & 1.9 kb bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & dfra12-orff-aada2 K.pneumoniae - 0.7kb aada1 c 0.9kb aada2 E.aerogenes E.cloacae P.mirabilis amc, pip, tzp, fox, caz, ctx, atm, ipm, gen, tob, net, an, sxt, cip, c amc, pip, tzp, fox, caz, ctx, tob, net, sxt, cip, c amc, pip, tzp, fox, caz, ctx, tob, net, an, sxt, cip, c amc, pip, tzp, tcc, fox, caz, ctx, atm, gen, tob, net, an, cip, sxt 3.0 kb bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 3.0 kb & 1.8 kb 3.0 kb & 1.5kb 3.0kb & 1.5kb bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & dfra12-orff-aada2 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & dfra1-aada1 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & n/d caz, atm, gen, tob, an, sxt 1.5kb aaca4-dfra1 pip, tzp, ctx, caz, fep, atm, tob, net, te, cip 3.0kb pip, tzp, ctx, caz, fep, atm, tob, sxt, te, cip 1.5kb dfra1-aada1 pip, tzp, ctx, caz, fep, atm, tob, sxt, te, cip 1.5kb dfra1-aada1 pip, tzp, ctx, caz, atm, tob, net, sxt amp, amc, pip, ctx, caz, tob, net, sxt, cip 1.5kb & 1kb 3.2kb 3.2kb & 1.5kb dfra1-aada1 & bla VIM4 aaca4-aacc1-aada1 aaca4-aacc1-aada1 & dfra1-aada1 amp, c, sxt 1.5kb dfra1-aada1 amp: αµπικιλλίνη, amc: αµοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό, pip: πιπερακιλλίνη, tzp: πιπερακιλλίνηταζοµπακτάµη, fox: κεφοξιτίνη, ctx: κεφοταξίµη, caz: κεφταζιντίµη, fep: κεφεπίµη, atm: αζτρεονάµη, ipm: ιµιπενέµη, gen: γενταµικίνη, an: αµικασίνη, tob: τοµπραµυκίνη, net: νετιλµικίνη, sxt: τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη, te: τετρακυκλίνη, c: χωραµφαινικόλη, cip: σιπροφλοξασίνη. 87

4.6 Ιντεγκρόνια σε εντεροβακτηριακά στελέχη αίτια βακτηριαιµίας σε σχέση µε τον τύπο της βακτηριαιµίας Ως προς την παρουσία, το µέγεθος και το γονιδιακό περιεχόµενο των ιντεγκρονίων τάξης 1 στα στελέχη εντεροβακτηριακών που αποµονώθηκαν από καλλιέργειες αίµατος, έγινε περαιτέρω µελέτη και συσχέτιση των παραµέτρων αυτών µε τον τύπο της βακτηριαιµίας, δηλαδή εάν επρόκειτο για βακτηριαιµία κοινότητας, ή βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας ή τέλος νοσοκοµειακή βακτηριαιµία. Μεταξύ των στελεχών που αποµονώθηκαν από βακτηριαιµία κοινότητας µόνο τα 9/58 (15,5%) έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1, έναντι 50/59 (84,7%) των στελεχών που αποµονώθηκαν από νοσοκοµειακή βακτηριαιµία και 12/16 (75%) των στελεχών που αποµονώθηκαν από βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας (p<0,001). Το µέσο µέγεθος των ιντεγκρονίων τάξης 1 που βρέθηκαν σε εντεροβακτηριακά στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε νοσοκοµειακή βακτηριαιµία ήταν µεγαλύτερο από αυτό ιντεγκρονίων που βρέθηκαν σε στελέχη από ασθενείς µε βακτηριαιµία κοινότητας (2.168,8±796,95 έναντι 1233,3±413,11, p=0,008), αλλά όχι στατιστικώς σηµαντικά µεγαλύτερο από αυτό ιντεγκρονίων που βρέθηκαν σε στελέχη από ασθενείς µε βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας (2.168,8±796,95 έναντι 1818,18±726,38, p=0,191) (εικόνες 17 και 18) Περισσότερα του ενός ιντεγκρόνια τάξης 1 βρέθηκαν αποκλειστικά σε στελέχη που προκάλεσαν νοσοκοµειακή βακτηριαιµία µε εξαίρεση ενός στελέχους που αποµονώθηκε από αιµοκαλλιέργεια ασθενούς µε πρόσφατη επαφή µε υπηρεσίες υγείας. Ως προς την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 2 δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη συχνότητα σε σχέση µε τον τύπο της βακτηριαιµίας. Τα αποτελέσµατα αυτά παρουσιάζονται συγκεντρωµένα στους πίνακες 19 και 20 που ακολουθούν. 88

3000 2500 95% CI µέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 2000 1500 1000 500 0 N = 6 43 11 CA HA HCA Βακτηριαιµία κατά Friedman Εικόνα 17: Μέσο µέγεθος ιντεγκρονίων τάξης 1 σε στελέχη εντεροβακτηριακών αναλόγως της προέλευσης της βακτηριαιµίας 89

3000 3000 3000 Mean +- 2 SE µέγεθος ιντεγκρονίου (bp) 2500 2000 1500 1000 500 0 N = 6 CA 43 HA mean+- 2SE µέγεθος ιντεγκρονίου (bp) 2500 2000 1500 1000 500 0 N = 43 ΗΑ 11 HCA mean+- 2 SEµέγεθος ιντεγκρονίου (bp) 2500 2000 1500 1000 500 0 N = 6 CA 11 HCA Α Β Γ Εικόνα 18: Σύγκριση µέσου µεγέθους (mean ±2SE) ιντεγκρονίων τάξης 1 σε στελέχη εντεροβακτηριακών αναλόγως της προέλευσης της βακτηριαιµίας Α. Νοσοκοµειακή έναντι Κοινότητας (p=0,007) Β. Νοσοκοµειακή έναντι Σχετιζόµενης µε υπηρεσίες υγείας (p=0,191) Γ. Κοινότητας έναντι Σχετιζόµενης µε υπηρεσίες υγείας (p=0,092) 90

Πίνακας 19: Παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2 σε σχέση µε τύπο βακτηριαιµίας Μεταβλητή Βακτηριαιµία κοινότητας (CΑ), (n=58) Νοσοκοµειακή (HA) (n=59) Σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας (HCA), (n=16) HA vs CA HA vs HCA CA vs HCA Ιντεγκρόνιο τάξης 1 9 (15,5%) 50 (84,7%) 12 (75 %) <0,001 0,361 <0,001 > 1 ιντεγκρόνιο τάξης 1 0 13(30,2%) 1 (9,1%) 0,116 0,153 0,446 Μέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 (mean ± SD) 1.233,3 ± 413,11 2.168,84 ± 796,95 1.818,18± 726,38 0,007 0,191 0,092 Ιντεγκρόνιο τάξης 2 2 (3,4%) 7 (11,9%) 2 (12,5%) 0,088 0,945 0,156 Συντοµογραφίες: ΗΑ: Hospital-acquired, Νοσοκοµειακή βακτηριαιµία HCA: Health Care Associated, Βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας CA: Community-acquired, Βακτηριαιµία κοινότητας 91

Πίνακας 20: Μεγέθη ιντεγκρονίων τάξης 1 σε σχέση µε την προέλευση της βακτηριαιµίας Μέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίων τάξης 1 700 bp (n=2) 900 bp (n=1) 1000 bp (n=2) 1500 bp (n=30) 1800 bp (n=1) 1900 bp (n=1) 3000 bp (n=6) 3200 bp (n=3) 1500bp & 1000 bp (n=1) 1900bp & 1500 bp (n=1) 3000bp & 1500 bp (n=5) 3000bp & 1900bp (n=4) 3200bp & 1500bp (n=3) Στελέχη µε µετρήσιµο µέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίων τάξης 1 (n=60) Ταξινόµηση κατά Friedman et al. Βακτηριαιµία κοινότητας (n=6) Νοσοκοµειακή βακτηριαιµία (n=43) Βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας (n=11) 2 0 0 0 0 1 0 2 0 4 20 6 0 0 1 0 0 1 0 6 0 0 2 1 0 1 0 0 1 0 0 5 0 0 4 0 0 2 1 p-value 0,002 92

Γονιδιακό περιεχόµενο ιντεγκρονίων και τύπος βακτηριαιµίας Βακτηριαιµία κοινότητας Στα ιντεγκρόνια τάξης 1 από στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε βακτηριαιµία κοινότητας παρατηρήθηκαν αποκλειστικά κασέτες που κωδικοποιούν για την αδενυλτρανσφεράση Α των αµινογλυκοσιδών (aada) και την αναγωγάση Α του διϋδροφολικού οξέος (dfra), οι οποίες προσδίδουν αντοχή στα αντιβιοτικά στρεπτοµυκίνη/σπεκτινοµυκίνη και τριµεθοπρίµη αντίστοιχα. Επίσης σε ένα ιντεγκρόνιο από στέλεχος E.coli ανιχνεύθηκε το γονίδιο bla OXA-1. Κενό ιντεγκρόνιο τάξης 1, ιντεγκρόνιο δηλαδή χωρίς ενσωµατωµένες κασέτες στη µεταβλητή του περιοχή, δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα από τα ευαίσθητα στελέχη που αποµονώθηκαν από βακτηριαιµία κοινότητας. Επίσης στα στελέχη από βακτηριαιµία κοινότητας δεν παρατηρήθηκε αντοχή σε κεφαλοσπορίνες τρίτης γενιάς και καρβαπενέµες, αµινογλυκοσίδες και κινολόνες. Η σχέση ανάµεσα στην παρουσία ιντεγκρονίου τάξης 1 και του φαινότυπου αντοχής στα στελέχη της κοινότητας φαίνεται στον πίνακα 21: Πίνακας 21. Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά εντεροβακτηριακών υπαίτιων βακτηριαιµίας κοινότητας Είδος Αντοχή Μέγεθος Γονιδιακές κασέτες ιντεγκρονίων τάξης 1 Σύνολο στελεχών E.coli amp, sxt 0.7kb dfra7 1 amp, sxt 1.5kb dfra1-aada1 2 amp, sxt 1.5kb dfra17-aada5 2 amp, c 1.5kb bla OXA1 -aada1 1 K.pneumoniae - 0.7kb aada1 1 c 0.9kb aada2 1 Συντοµογραφίες: amp: αµπικιλλίνη, sxt: τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη, c: χλωραµφαινικόλη. Βακτηριαιµία νοσοκοµειακή και σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας Αντιθέτως, στα ιντεγκρόνια από στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε νοσοκοµειακή βακτηριαιµία ή βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας, παρατηρήθηκαν και άλλοι τύποι κασετών που κωδικοποιούν για αντοχή σε νεότερες αµινογλυκοσίδες και σε καρβαπενέµες (VIM-1 and VIM-4) (µόνο σε στελέχη αρρώστων µε νοσοκοµειακή λοίµωξη). Επιπρόσθετα, στα στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε νοσοκοµειακή λοίµωξη έγινε και µοριακή τυποποίηση, προκειµένου να ελεγχθεί η γενετική 93

οµοιότητα των στελεχών για πιθανή ενδονοσοκοµειακή διασπορά σε συνδυασµό και µε τα επιδηµιολογικά δεδοµένα και να µελετηθεί η τυχούσα σχέση συγκεκριµένων ιντεγκρονίων µε συγκεκριµένους κλώνους. Η σχέση ανάµεσα στην παρουσία συγκεκριµένων ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής και την µοριακή τυποποίηση φαίνεται στον πίνακα 22 που ακολουθεί: 94

Πίνακας 22: Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά και την τυποποίηση εντεροβακτηριακών υπαίτιων νοσοκοµειακής βακτηριαιµίας και βακτηριαιµίας σχετιζόµενης µε υπηρεσίες υγείας ERIC type Είδος (no. of isolates) Αντοχή Μέγεθος Γονιδιακές κασέτες ιντεγκρονίων τάξης 1 E.coli n/d amp, cip, sxt 1.5kb dfra17-aada5 K. pneumoniae E.aerogenes n/d amp, pip 1.8kb bla PSE1 -aada2 n/d amp, cip, sxt 1.9kb dfra12-orff-aada2 A (2) amp, pip, c, 1.0kb aada1 B (1) Γ(1) (1) Ε (2) ΣΤ (1) A (6) B (4) B (2) Γ (1) (1) A (14) E.cloacae A (2) B (1) amp, gen, tob, net, cip, sxt, c amp,amc,pip,tzp,cip sxt amp, gen, tob, net, an, sxt amp, amc, fox, ctx, caz, atm, gen, cip, sxt, c amp, amc, fox, ctx, caz, tob, cip, sxt amc, pip, tzp, fox, caz, ctx, atm, ipm, gen, tob, net, an, cip, sxt c amc, pip, tzp, fox, caz, ctx, tob, net, cip, sxt, c amc, pip, tzp, fox, caz, ctx, tob, net, an, cip, sxt, c amc, pip, tzp, fox, caz, ctx, atm, gen, tob, net, an, cip, sxt caz, atm, gen, tob, an, sxt, pip, tzp, ctx, caz, fep, atm, tob, sxt, cip pip, tzp, ctx, caz, fep, atm, tob, sxt, cip pip, tzp, ctx, caz, atm, tob, net, sxt 1,5kb 1.5kb 1.5kb 3.0kb & 1.5kb 3.0kb & 1.9kb 3.0kb 3.0kb & 1.9kb 3.0kb & 1.5kb 3.0kb & 1.5kb 1.5kb 1.5kb 1.5kb 1.5kb & 1.0kb dfra17-aada5 dfra17-aada5 aaca4-aada1 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & dfra1-aada1 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & dfra12-orff-aada2 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & dfra12-orff-aada2 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & dfra1-aada1 bla VIM1 -aaca7-dfri-aada1 & n/d aaca4-dfra1 dfra1-aada1 dfra1-aada1 dfra1-aada1 & bla VIM4 95

Πίνακας 22 (συνέχεια) Είδος P.mirabilis PFGE type (no. of isolates) Αντοχή Μέγεθος amp, amc, pip, tic, Α 1 (1) ctx, caz, tob, net, 3.2kb Α 2 (2) Α 3 (1) Α 4 (2) n/d: εν προσδιορίστηκε. sxt, cip amp, amc, pip, tic, ctx, caz, tob, net, sxt, cip amp, amc, pip, tic, ctx, caz, tob, net, sxt amp, amc, pip, tic, ctx, caz, tob, net, sxt, cip 3.2kb 3.2kb & 1.5kb 3.2kb & 1.5kb Γονιδιακές κασέτες ιντεγκρονίων τάξης 1 aaca4-aacc1-aada1 aaca4-aacc1-aada1 aaca4-aacc1-aada1 & dfra1-aada1 aaca4-aacc1-aada1 & dfra1-aada1 Β (1) amp, c, sxt 1.5kb dfra1-aada1 Γ (1) amp, amc, tob, sxt, cip, c - amp: αµπικιλλίνη, amc: αµοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό, pip: πιπερακιλλίνη, tzp: πιπερακιλλίνηταζοµπακτάµη, fox: κεφοξιτίνη, ctx: κεφοταξίµη, caz: κεφταζιντίµη, fep: κεφεπίµη, atm: αζτρεονάµη, ipm: ιµιπενέµη, gen: γενταµικίνη, an: αµικασίνη, tob: τοµπραµυκίνη, net: νετιλµικίνη, sxt: τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη, te: τετρακυκλίνη, c: χλωραµφαινικόλη, cip: σιπροφλοξασίνη. Για τα 8 isolates E.coli που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες ασθενών µε νοσοκοµειακή βακτηριαιµία, µε τη µοριακή τυποποίηση βρέθηκε ότι τα τέσσερα ήταν γενετικώς διακριτά µεταξύ τους ενώ τα υπόλοιπα τέσσερα ανήκαν σε δύο διαφορετικούς τύπους έκαστος των οποίων απαρτιζόταν από δύο isolates. Αντίθετα για τα στελέχη K.pneumoniae, 12 από τα 14 που τυποποιήθηκαν ανήκαν σε έναν από δύο τύπους που απαρτιζόταν από έξι isolates ο καθένας (τύποι Α και Β). Και τα 12 αυτά στελέχη παρήγαγαν το µεταλλοένζυµο VIM και αναλύονται διεξοδικά παρακάτω. Ένα επιπρόσθετο isolate K.pneumoniae VIM-θετικό κατατάχθηκε σε ξεχωριστό τύπο (τύπος Γ). Ως προς τα isolates E.aerogenes φάνηκε µια µεγάλη γενετική οµοιοµορφία, όπως και στα isolates P.mirabilis. Χαρακτηριστικά στα τελευταία, µεταξύ των 8 που τυποποιήθηκαν µε PFGE, τα έξι βρέθηκε ότι ανήκαν στον ίδιο τύπο, αν και σε διαφορετικούς υπότυπους. 96

4.7 Βακτηριαιµία από θετικά για το µεταλλοένζυµο VIM πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά: κλινικά, επιδηµιολογικά και µικροβιολογικά χαρακτηριστικά Μεταξύ των πολυανθεκτικών στελεχών ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι µικροοργανισµοί που βρέθηκε να παράγουν µεταλλοένζυµο VIM. Συνολικά αποµονώθηκαν 17 isolates από 16 ασθενείς, 8 γυναίκες και 8 άνδρες, ηλικίας 56,63±17,28 ετών που νοσηλεύονταν οι 13 στη ΜΕΘ, 3 σε χειρουργικές κλινικές και 1 σε παθολογική κλινική. Η µέση διάρκεια νοσηλείας πριν την αποµόνωση του στελέχους µε ικανότητα παραγωγής µεταλλοενζύµου ήταν 26,81±22,6 ηµέρες, µετά την αποµόνωση 23,69±29,83 ηµέρες και η µέση συνολική διάρκεια νοσηλείας ήταν 50,88±40,219 ηµέρες. Όλες οι βακτηριαιµίες από θετικούς για παραγωγή µεταλλοενζύµου µικροοργανισµούς ήταν νοσοκοµειακές και όλα τα στελέχη ήταν πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά. Υψηλού επιπέδου αντοχή στην ιµιπενέµη παρουσίασαν µόνο τα isolates K.pneumoniae του ERIC τύπου Α (όλα MIC IPM >8µg/ml), ενώ στα υπόλοιπα isolates K.pneumoniae των ERIC τύπων Β και Γ παρατηρήθηκαν τιµές MIC IPM 2µg/ml και 4µg/ml µε την εξαίρεση ενός isolate που είχε MIC IPM =8µg/ml. Τα τρία isolates E.coli που βρέθηκε να παράγουν µεταλλοένζυµο VIM είχαν όλα MIC IPM <1µg/ml. Ταυτόχρονη παραγωγή εκτεταµένου φάσµατος β-λακταµάσης ανιχνεύθηκε σε 12 από τα 17 στελέχη. Όλα τα στελέχη έφεραν το ίδιο VIM-ιντεγκρόνιο In-e541 (5 -CS-bla VIM-1 aaca7-dhfr1-aada1-3 -CS) που περιγράφηκε από τους Miriagou et al, 2003, µε µοναδική εξαίρεση το στέλεχος E.cloacae που έφερε διαφορετικό VIM-ιντεγκρόνιο (5 -CS-bla VIM4-3 -CS). Υπήρχαν όµως διαφορές ως προς την παρουσία και δεύτερου ιντεγκρονίου τάξης 1 συγχρόνως µε το VIM-ιντεγκρόνιο καθώς και στην ταυτόχρονη παραγωγή ευρέος φάσµατος β-λακταµάσης. Ενδεικτικά τα πρώτα 6 isolates K.pneumoniae που αποµονώθηκαν από ασθενείς της ΜΕΘ σε διάστηµα δύο µηνών (4 ος -6 ος 2002) (τύπος Α) έφεραν µόνο το VIM-ιντεγκρόνιο και παρήγαγαν και ευρέος φάσµατος β-λακταµάση συγχρόνως µε το µεταλλοένζυµο VIM. Αντίθετα, isolates K.pneumoniae που αποµονώθηκαν στα τέλη του 2003-αρχές 2004 (τύπος Β) έφεραν και δεύτερο ιντεγκρόνιο µεγέθους 1,9kb ενώ δεν παρήγαγαν ευρέος φάσµατος β-λακταµάση συγχρόνως µε το µεταλλοένζυµο VIM. Πάντως και στους 2 διακριτούς µεταξύ τους τύπους VIM-θετικών στελεχών 97

K.pneumoniae µε πειράµατα βακτηριακής σύζευξης επετεύχθη η µεταβίβαση του VIM-ιντεγκρονίου. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το επεισόδιο βακτηριαιµίας ασθενούς της Νευροχειρουργικής κλινικής χωρίς νοσηλεία στη ΜΕΘ του νοσοκοµείου από το οποίο αποµονώθηκαν συγχρόνως δύο στελέχη εντεροβακτηριακών. Και τα δύο στελέχη (1 K.pneumoniae και 1 E.coli) έφεραν το ίδιο VIM-ιντεγκρόνιο, αλλά το µεν στέλεχος K.pneumoniae έφερε δεύτερο ιντεγκρόνιο 1,5kb ενώ το στέλεχος E.coli έφερε δεύτερο ιντεγκρόνιο 1,9kb. Τόσο το στέλεχος K.pneumoniae όσο και το στέλεχος E.coli ήταν γενετικώς διακριτά από αντίστοιχα VIM-θετικά στελέχη K.pneumoniae και E.coli ασθενών της ΜΕΘ. Στον πίνακα 23 που ακολουθεί παρουσιάζονται οι παράγοντες κινδύνου που σχετίζονταν µε λοίµωξη από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά που έφεραν το VIMιντεγκρόνιο (16 ασθενείς από τους οποίους αποµονώθηκαν 17 στελέχη VIM-θετικά) στο υποσύνολο των ασθενών µε λοίµωξη από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=57). (Μονοπαραγοντική ανάλυση). Από τη µονοπαραγοντική ανάλυση οι ασθενείς που ανέπτυξαν βακτηριαιµία από VIM-θετικό πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό είχαν συχνότερα νοσοκοµειακή βακτηριαιµία (p=0,03), νοσηλεία στη ΜΕΘ (p=0,007) αλλά και µεγάλο διάστηµα νοσηλείας πριν την εµφάνιση της βακτηριαιµίας (p=0,022) σε σχέση µε τους µάρτυρες µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό VIM-αρνητικό εντεροβακτηριακό. Επιπλέον οι ασθενείς έφεραν συχνότερα κεντρικό φλεβικό καθετήρα (p=0,037), βρίσκονταν σε διασωλήνωση (p=0,011) ενώ είχαν συχνότερα βακτηριαιµία από στέλεχος K.pneumoniae (p<0,001). 98

Πίνακας 23: Παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης λοίµωξης από πολυανθεκτικό στέλεχος που παράγει το µεταλλοένζυµο VIM - Μονοπαραγοντική ανάλυση Ασθενείς µε λοίµωξη από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά (n=57) Παράγοντας VIM-θετικά (n=16) VIM-αρνητικά (n=41) OR (95% CI) p-value Μεγάλη ηλικία 6(37,5%) 26 (63,4%) 0,346 0,076 (>65 ετών) (0,105-1,14) Φύλο 8 (50%) 25 (61%) 1,563 0,451 (Άνδρες) (0,48-5) Νοσοκοµειακή 16 (100%) 31 (75,6%) - 0,030 βακτηριαιµία Τµήµα νοσηλείας Παθολογικός τοµέας 1 (6,3%) 16 (39%) 0,104 0,015 (0,013-0,867) Χειρουργικός τοµέας 2 (12,5%) 6 (14,6%) 0,833 0,835 (0,15-4,63) Νοσηλεία ή/και 14 (87,5%) 20 (48,8%) 7,35 0,007 µεταφορά σε ΜΕΘ (1,479-36,52) > 7 ηµέρες νοσηλεία 15 (93,8%) 26 (63,4) 8,65 0,022 προ βακτηριαιµίας (1,037-72,21) Επεµβατικός χειρισµός Ουροκαθετήρας 16 (100%) 34 (82,9%) - 0,07 Κεντρική γραµµή 14 (87,5%) 24 (58,5%) 4,96 0,037 (0,99-24,72) Χειρουργική επέµβαση 6 (37,5%) 18 (43,9%) 0,76 0,66 (0,23-2,5) Χρήση αντιβιοτικών 16 (100%) 39 (95,1%) - 0,368 (3 µήνες πριν) Βακτηριακό είδος E.coli 3 (17,6%) 6 (14%) 1,321 0,718 (0,29-6) K.pneumoniae 13 (76,5%) 5 (11,6%) 24,7 <0,001 (5,75-106,12) Enterobacter spp 1 (5,9%) 24 (55,8%) 0,049 <0,001 (0,006-0,407) P.mirabilis 0 8 (18,6%) - 0,056 99

Από την πολυπαραγοντική ανάλυση, σε µοντέλο που εισήχθησαν η µεγάλη διάρκεια νοσηλείας πριν τη βακτηριαιµία, η νοσηλεία στη ΜΕΘ και η τοποθέτηση κεντρικής φλεβικής γραµµής, ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για εµφάνιση βακτηριαιµίας από VIM-θετικούς µικροοργανισµούς µεταξύ των ασθενών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά στελέχη εντεροβακτηριακών παρέµεινε µόνο η νοσηλεία στη ΜΕΘ (adjusted OR=7,35, 95% CI=1,479-36,52, p=0,015). Στον πίνακα 24 που ακολουθεί περιγράφονται τα επιδηµιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών που ανέπτυξαν βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακά που παρήγαγαν το µεταλλοένζυµο VIM και τα µικροβιολογικά χαρακτηριστικά των στελεχών αυτών: 100

Πίνακας 24: Κλινικά και επιδηµιολογικά χαρακτηριστικά ασθενών µε βακτηριαιµία από VIM-θετικό στέλεχος και µικροβιολογικά στοιχεία των αντίστοιχων στελεχών Ασθενής No/αα στελέχους 1/106 2/118 3/ 128 4/134 5/135 6/137 7/229 8/272 Ηµεροµηνία (εισαγωγής - εξιτηρίου ή θανάτου) 4/4/2002-28/4/2002 (θάνατος) 2/5/2002-21/5/2002(θάνατος) 22/4/02-30/5/2002 (θάνατος) 1/6/2002-5/7/2002 (θάνατος) 10/6/2002-1/7/2002 (θάνατος) 15/6/2002-30/6/2002 (θάνατος) 17/5/2003-19/6/2003 (εις Χ/Κ) 1/12/2003- ιακοµιδή σε άλλο νοσοκοµείο Είδος Ηµεροµηνία αποµόνωσης Τµήµα Τύπος K.pn 13/4/2002 ΜΕΘ A K.pn 8/5/2002 ΜΕΘ A K.pn 27/5/2002 ΜΕΘ A K.pn 17/6/2002 ΜΕΘ K.pn 19/6/2002 ΜΕΘ A K.pn 24/6/2002 ΜΕΘ A K.pn 2/6/2003 ΜΕΘ B A Άλλα γονίδια β-λακταµασών ESBL SHV-5 ESBL SHV-5 ESBL SHV-5 ESBL SHV-5 ESBL SHV-5 ESBL SHV-5 ESBL SHV-5 Αριθµός ιντεγκρονίων τάξης 1 K.pn 21/12/2003 ΜΕΘ B Όχι ESBL 2 Μέγεθος 1 3,0kb 1 3,0kb 1 3,0kb 1 3,0kb 1 3,0kb 1 3,0kb 2 3,0kb 1,9kb 3,0kb 1,9kb Integron gene cassette array bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 n/d bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 dfra12-orff-aada2 9/276 15/10/2003-20/10/2003 εις Π/Κ και 28/10/2003-26/12/2003 (θάνατος) K.pn 20/10/2003 ΜΕΘ B Όχι ESBL 2 3,0kb 1,9kb bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 dfra12-orff-aada 101

Πίνακας 24 (συνέχεια) Ασθενής No/αα στελέχους 10/282 Ηµεροµηνία (εισαγωγής - εξιτηρίου ή θανάτου) 20/12/2003-16/2/2004 (εις Χ/Κ) Είδος Ηµεροµηνία αποµόνωσης Τµήµα Τύπος Άλλα γονίδια β-λακταµασών Αριθµός ιντεγκρονίων τάξης 1 K.pn 5/2/2004 ΜΕΘ B Όχι ESBL 2 11/285 2/5/2004-26/5/2004 K.pn 18/5/2004 Π/Κ B Όχι ESBL 2 12/286 13/274 13/273 14/247 15/255 23/4/2004-7/5/2004 (εις Χ/Κ) και 22/5/2004-2/6/2004 (θάνατος) 17/9/2003-27/10/2003 και 7/11/2003-18/2/2004 17/9/2003-27/10/2003 και 7/11/2003-18/2/2004 14/4/2003-25/9/2003 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 dfra1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 5/10/2003-1/11/2003 (θάνατος) K.pn 23/5/2004 ΜΕΘ / ΧΚ / ΜΕΘ B ESBL SHV-5 K.pn 27/1/2004 Ν/Χ Γ ESBL SHV-5 E.coli 27/1/2004 Ν/Χ e ΣΤ Όχι ESBL 2 E.coli 31/5/2003 ΜΕΘ ee ESBL 2 E.coli 13/10/2003 ΜΕΘ ee ESBL 2 2 2 Μέγεθος 3,0kb/ Integron gene cassette array bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 1,9 kb dfra12-orff-aada2 3,0kb 1,5kb 3,0kb 1,5kb 3,0kb 1,5kb 3,0kb 1,9kb 3,0kb 1,5kb 3,0kb 1,5kb bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 dfra1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 dfra1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 dfra1-aada1 bla VIM-1 aaca7- dhfr1-aada1 dfra12-orff-aada2 dfra1-aada1 102

Πίνακας 24 (συνέχεια) Ασθενής No/αα στελέχους 16/288 Ηµεροµηνία (εισαγωγής - εξιτηρίου ή θανάτου) 24/9/2004-20/12/2004 (διακοµιδή σε άλλο νοσοκοµείο) Είδος Ηµεροµηνία αποµόνωσης Τµήµα Τύπος Άλλα γονίδια β-λακταµασών Αριθµός ιντεγκρονίων τάξης 1 E.cloacae 5/10/2004 ΜΕΘ e.cl B ESBL 2 Μέγεθος 1,0kb 1,5kb Integron gene cassette array bla VIM-4 dfra1-aada1 103

4.8 Βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν και τα επεισόδια βακτηριαιµίας από στελέχη πολυανθεκτικών P.mirabilis σε 8 ασθενείς, 5 άνδρες και 3 γυναίκες, µέσης ηλικίας 70,5±21,3 έτη που νοσηλεύονταν οι 6 σε παθολογικά τµήµατα και οι 2 στη ΜΕΘ. Πέντε βακτηριαιµίες ταξινοµήθηκαν ως νοσοκοµειακές και οι υπόλοιπες τρεις ως σχετιζόµενες µε υπηρεσίες υγείας. Όλα τα επεισόδια βακτηριαιµίας ήταν δευτεροπαθή µε εστία το ουροποιητικό σύστηµα. Τέσσερις ασθενείς απεβίωσαν εκ των οποίων 3 εµφάνισαν σηπτική καταπληξία. Στα έξι από τα 8 συνολικά πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis, εκτός της παρουσίας του µεγαλύτερου µεγέθους ιντεγκρονίων τάξης 1 (3.200bp) καθώς και της µεγαλύτερης συχνότητας παρουσίας ιντεγκρονίου τάξης 2 σε σχέση µε τα υπόλοιπα είδη, βρέθηκε ότι παράγουν και την πλασµιδιακής προέλευσης κεφαλοσπορινάση CMY 14. Η χαρτογράφηση του γενετικού περιβάλλοντος του bla CMY γονιδίου κατέδειξε ότι αποτελούσε µέρος της δοµής ISEcp-blc-SugE. Τα στελέχη (isolates) αυτά βρέθηκε ότι ανήκουν στον ίδιο τύπο (PFGE type A), αλλά κατανέµονταν σε τέσσερις διαφορετικούς υπότυπους (A1 έως Α4). Μόνο τα isolates που ανήκαν στους υπότυπους Α3 και Α4 έφεραν και δεύτερο ιντεγκρόνιο µεγέθους 1.5kb συγχρόνως µε το κοινό για όλους τους υπότυπους ιντεγκρόνιο των 3.2kb. Tα CMY-θετικά isolates P.mirabilis ήταν γενετικώς διακριτά από τα υπόλοιπα δύο πολυανθεκτικά CMYαρνητικά στελέχη (PFGE τύποι Β και Γ) Στον πίνακα 25 που ακολουθεί παρατίθενται λεπτοµερώς επιδηµιολογικά δεδοµένα των ασθενών και µικροβιολογικά δεδοµένα για τα πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες των ασθενών αυτών, ενώ φωτογραφίες των πειραµάτων για την ανίχνευση ιντεγκρονίων, γονιδίων αντοχής και της µοριακής τυποποίησης περιλαµβάνονται στο παράρτηµα. 104

Πίνακας 25: Κλινικά και επιδηµιολογικά χαρακτηριστικά ασθενών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis και µικροβιολογικά στοιχεία των αντίστοιχων στελεχών Αρ. Ασθενή /αα στελέχους 1/155 2/270 3/281 4/289 5/213 6/292 7/141 8/195 Ηµεροµηνία (εισαγωγής - εξιτηρίου ή θανάτου) 5/8/2002-19/9/2002 25/11/2003-29/11/2003 (θάνατος) 2/2/2004-6/2/2004 (θάνατος) 11/10/2004-8/11/2004 8/2/2003-20/3/2003 20/12/2004-8/2/2005 (θάνατος) 28/6/2002-9/7/2002 27/3/2004-31/3/2004 (θάνατος) Ηµεροµηνία αποµόνωσης 20/8/2002 Τµήµα ΜΕΝ/ Καρδιο PFGE type Μέγεθος ιντεγκρονίου Γονιδιακό περιεχόµενο (5 CS-3 CS) A1 3.2kb aaca4-aacc1-aada1 26/11/2003 Β Π A2 3.2kb aaca4-aacc1-aada1 Ναι Ιντεγκρόνιο bla CMY τάξης 2 Ναι/ CMY-14 Ναι Ναι Γονιδιακό περιεχόµενο 5/2/2004 Γ Π A2 3.2kb aaca4-aacc1-aada1 Ναι Ναι dfra1-sat1-aada1 12/10/2004 Γ Π A3 17/2/2003 ΜΕΘ A4 11/1/2005 ΜΕΘ A4 3.2kb & 1.5kb 3.2kb & 1.5kb 3.2kb & 1.5kb aaca4-aacc1-aada1 & dfra1-aada1 aaca4-aacc1-aada1 & dfra1-aada1 aaca4-aacc1-aada1 & dfra1-aada1 28/6/2002 Γ Π B 1.5kb dfra1-aada1 Όχι Όχι Ναι/ CMY-14 Ναι dfra1-sat1-aada1 Ναι Ναι dfra1-sat1-aada1 31/3/2004 Γ Π Γ - Όχι Ναι dfra1-sat1-aada1 Ναι Ναι 105

4.9 Βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά στελέχη Enterobacter spp Συνολικά αποµονώθηκαν 25 στελέχη µε πολυανθεκτικό φαινότυπο αντοχής από ισάριθµους ασθενείς, 10 γυναίκες και 15 άνδρες, ηλικίας 58,96±20,5 (εύρος 19-85) ετών που νοσηλεύονταν οι 20 στη ΜΕΘ, 4 σε χειρουργικές κλινικές και 1 σε παθολογική κλινική. Η µέση διάρκεια νοσηλείας πριν την αποµόνωση του πολυανθεκτικού στελέχους Enterobacter spp ήταν 27,5±22,6 ηµέρες, µετά την αποµόνωση 24,43±27,9 ηµέρες και η µέση συνολική διάρκεια νοσηλείας ήταν 52,13±36,98 ηµέρες. Παραγωγή εκτεταµένου φάσµατος β-λακταµάσης ανιχνεύθηκε σε 22 από τα 25 στελέχη και αξίζει να τονιστεί ότι η ανίχνευση κατέστη δυνατή µόνο µετά από τροποποίηση της µεθόδου συνέργειας µε προσθήκη κλοξακιλλίνης ή βορονικού οξέος, γεγονός που σηµαίνει ότι θα µπορούσε εύκολα να µην αναγνωριστεί κατά την αναφορά του αρχικού αντιβιογράµµατος στους κλινικούς ιατρούς. Αντοχή στις καρβαπενέµες εµφάνισαν 4 στελέχη, αλλά όλα ήταν αρνητικά στο µοριακό έλεγχο για παραγωγή µεταλλοενζύµου και καρβαπενεµάσης KPC. Σε ένα µόνο στέλεχος ανιχνεύτηκε παραγωγή ειδικής καρβαπενεµάσης (το µεταλλοένζυµο VIM 4 ),το οποίο παρουσίαζε in vitro ευαισθησία στην ιµιπενέµη (MIC= 2µg/ml). Για τα υπόλοιπα τέσσερα, ο φαινότυπος αντοχής ως προς τα β- λακταµικά θα µπορούσε να αποδοθεί στην παραγωγή της εκτεταµένου φάσµατος β- λακταµάσης µε ταυτόχρονη µειωµένη διαπερατότητα του κυτταρικού τοιχώµατος. Υπενθυµίζεται ότι µεταξύ των 60 συνολικά πολυανθεκτικών εντεροβακτηριακών στελεχών που αποµονώθηκαν από καλλιέργειες αίµατος ασθενών, τα 25 (42%) ήταν στελέχη Enterobacter, γεγονός που τα κατατάσσει πρώτα στη σχετική συχνότητα αποµόνωσης µεταξύ των πολυανθεκτικών στελεχών µε δεύτερα τα στελέχη K.pneumoniae και ακολούθως τα στελέχη E.coli και P.mirabilis. Από τους 25 ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος Εnterobacter απεβίωσαν οι 10, τρείς εκ των οποίων εκδήλωσαν σηπτική καταπληξία. 106

4.10 Εντεροβακτηριακά στελέχη από αποικισµούς ασθενών και ιντεγκρόνια Για τη µελέτη του ρόλου των ιντεγκρονίων στην εµφάνιση αντοχής στα αντιβιοτικά, περιελήφθησαν στη µελέτη και εντεροβακτηριακά στελέχη µε ποικίλου βαθµού αντοχή στα αντιβιοτικά που αποµονώθηκαν από νοσηλευόµενους ασθενείς την ίδια περίοδο από εστίες του σώµατος ενδεικτικές για αποικισµό. Τα 37 συνολικά στελέχη που συµπεριλήφθησαν ταυτοποιήθηκαν ως εξής: Ε.coli 8/37, Κ.pneumoniae 6/37, E.aerogenes 8/37, E.cloacae 8/37, P.mirabils 3/37, P.stuartii 2/37 και C.freundii 2/37. Από τα 37 αυτά στελέχη, πολυανθεκτικά ήταν τα 23, θετικά για ιντεγκρόνιο τάξης 1 ήταν τα 20 και από αυτά το µέγεθος της µεταβλητής περιοχής ήταν µετρήσιµο στα 14. Εκτεταµένου φάσµατος β-λακταµάσες ανιχνεύτηκαν σε 16 στελέχη (43,2%) και µεταλλοένζυµο VIM σε 4 (10,8%) Στο διάγραµµα (εικόνα 19) και τον πίνακα 26 που ακολουθούν φαίνονται τα ιντεγκρόνια που βρέθηκαν στα στελέχη αυτά ως προς το µέγεθος και το γονιδιακό περιεχόµενο της µεταβλητής τους περιοχής σε σχέση µε την εµφάνιση πολυαντοχής. Μεγάλα ιντεγκρόνια ( 3000bp) βρέθηκαν µόνο στα πολυανθεκτικά στελέχη ενώ ως προς το γονιδιακό περιεχόµενο της µεταβλητής περιοχής βρέθηκαν ίδια ιντεγκρόνια µε αυτά που βρέθηκαν σε στελέχη που προκάλεσαν λοίµωξη µε µόνη εξαίρεση ένα ιντεγκρόνιο µεγέθους 1500bp που περιείχε τις κασέτες aadb-aada1. H κασέτα aadb κωδικοποιεί για µια αδενυλτρανσφεράση που προσδίδει αντοχή σε γενταµικίνη, καναµυκίνη και τοµπραµυκίνη. 107

12 Αριθµός στελεχών µε ιντεγκρόνιο τάξης 1 (αποικισµοί) 10 8 6 4 2 0 1500 bp 1800 bp 3000 bp 3200 bp Πολυαντοχή Όχι Ναι Μέγεθος ιντεγκρονίου τάξης 1 Εικόνα 19: Μεγέθη ιντεγκρονίων τάξης 1 από στελέχη που αποµονώθηκαν από αποικισµούς ασθενών σε σχέση µε την πολυαντοχή των στελεχών 108

Πίνακας 26: Συσχέτιση γονιδιακού περιεχοµένου ιντεγκρονίων µε το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά εντεροβακτηριακών στελεχών από αποικισµούς ασθενών Είδος Αντοχή Μέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίου/ων τάξης 1 Γονιδιακές κασέτες ιντεγκρονίων τάξης 1: E.coli am,amc,pip,tzp,tcc,fox,caz,ctx,fep,atm,gn, 3000bp VIM1-aacA7-dfrA1-aadA1 tob,net,an, sxt,cip am,amc,pip,tzp,tcc,fox,caz,ctx,tob,net,an, sxt, 3000bp & 1500bp VIM1-aacA7-dfrA1-aadA1 & dfra1-aada1 E.aerogenes pip,tzp,ctx,caz,atm,tob,cip,sxt,c 1500bp aadb-aada1 pip,tzp,ctx,caz,atm,gn,tob,cip,sxt,c 1500bp dfra1-aada1 E.cloacae pip,tzp,ctx,caz,atm,an,cip,sxt,c 1500bp dfra1-aada1 P.mirabilis amp,amc,pip,ctx,caz,tob,net,cip,sxt,c 3200bp aaca4-aac1-aada1 amp: αµπικιλλίνη, amc: αµοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό, pip: πιπερακιλλίνη, tzp: πιπερακιλλίνη-ταζοµπακτάµη, fox: κεφοξιτίνη, ctx: κεφοταξίµη, caz: κεφταζιντίµη, fep: κεφεπίµη, atm: αζτρεονάµη, ipm: ιµιπενέµη, gen: γενταµικίνη, an: αµικασίνη, tob: τοµπραµυκίνη, net: νετιλµικίνη, sxt: τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη, c: χλωραµφαινικόλη, cip: Κιπροφλοξασίνη. 109

Για το σύνολο των 170 στελεχών εντεροβακτηριακών που µελετήθηκαν (133 από λοίµωξη και 37 από αποικισµούς), βρέθηκε ότι υπήρχε στατιστικώς σηµαντική σχέση µεταξύ της παρουσίας ιντεγκρονίου και αντοχής σε καθένα από τα αντιβιοτικά που ελέγχθηκαν (πίνακας 27). Πίνακας 27: Αντοχή στα αντιβιοτικά του συνόλου των εντεροβακτηριακών στελεχών σε σχέση µε την παρουσία ιντεγκρονίου τάξης 1. Θετικά για ιντεγκρόνιο τάξης 1 ( n=91) n (%) στελεχών µε αντοχή Αρνητικά για ιντεγκρόνιο τάξης 1 (n=79) Αντιβιοτικό p-value AMP 91 (100%) 45 (57%) <0,001 AMC 65 (71,4%) 20 (25,3%) <0,001 PIP 75 (82,4%) 21 (26,6%) <0,001 TZP 51 (56%) 11 (13,9%) <0,001 FOX 54 (59,3%) 18 (22,8%) <0,001 CTX 61 (67%) 9 (11,4%) <0,001 CAZ 62 (68,1%) 11 (13,9%) <0,001 ATM 47 (51,6%) 8 (10,5%) <0,001 IPM 10 (11%) 1(1,3%) 0,01 GN 25 (27,5%) 3 (3,8%) <0,001 AN 27 (29,7%) 4 (5,1%) <0,001 TΟΒ 60 (65,9%) 3 (3,8%) <0,001 CIP 61 (67%) 5 (6,3%) <0,001 CHL 45 (49,4%) 5 (6,3%) <0,001 SXT 82 (90,1%) 9 (11,4%) <0,001 Συντοµογραφίες: AMP: αµπικιλλίνη, AMC: αµοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό, PIP: πιπερακιλλίνη, TZP: πιπερακιλλίνη-ταζοµπακτάµη, FOX: κεφοξιτίνη, CTX: κεφοταξίµη, CAZ: κεφταζιντίµη, ATM: αζτρεονάµη, IPM: ιµιπενέµη, GN: γενταµικίνη, AN: αµικασίνη, TOB: τοµπραµυκίνη, CIP: σιπροφλοξασίνη, CHL: χλωραµφαινικόλη, SXT: τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη Προκειµένου να γίνει µια πιο ξεκάθαρη εκτίµηση της σχέσης µεταξύ ιντεγκρονίων και αντοχής σε συγκεκριµένα αντιβιοτικά έγινε πολυπαραγοντική ανάλυση, αλλά εξαιρέθηκαν από το µοντέλο τα αντιβιοτικά στα οποία στελέχη K.pneumoniae είναι ανθεκτικά λόγω της ύπαρξης της χρωµοσωµικής τους πενικιλλινάσης και αντιβιοτικά στα οποία τα στελέχη Enterobacter spp, Citrobacter spp και P.stuartii εµφανίζουν αντοχή λόγω της χρωµοσωµικής τους AmpC που δεν σχετίζονται µε ιντεγκρόνια. Έτσι στο τελικό µοντέλο περιελήφθησαν τα εξής αντιβιοτικά, για την αντοχή στα οποία έχουν περιγραφεί επίκτητοι γενετικοί καθοριστές και τα οποία ελέγχονται σε ένα κλινικό µικροβιολογικό εργαστήριο νοσοκοµείου: πιπερακιλλίνη, πιπερακιλλίνη-ταζοµπακτάµη, κεφταζιντίµη, αζτρεονάµη, ιµιπενέµη, τοµπραµυκίνη, 110

σιπροφλοξασίνη και τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη. Από την πολυπαραγοντική ανάλυση µε παλίνδροµη λογαριθµιστική εξάρτηση βρέθηκε ότι µόνο η αντοχή σε τοµπραµυκίνη και τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη παρέµειναν ως ανεξάρτητοι παράγοντες ενδεικτικοί της παρουσίας ιντεγκρονίου τάξης 1 στα στελέχη που µελετήθηκαν (και για τα δύο p<0,001, Πίνακας 28). Πίνακας 28: Αντοχή σε συγκεκριµένα αντιβιοτικά ως προγνωστικός δείκτης παρουσίας ιντεγκρονίου τάξης 1 στο µικροβιακό πληθυσµό της µελέτης. (Πολυπαραγοντική ανάλυση) Μεταβλητή p-value Adjusted OR (95%CI) Αντοχή σε τοµπραµυκίνη <0,001 13,851 (3,335-57,530) Αντοχή σε τριµεθοπρίµη-σουλφοµεθοξαζόλη <0,001 31,871 (11,234-90,413) Μεταβλητές που εισήχθησαν στο µοντέλο πολυπαραγοντικής ανάλυσης: αντοχή σε PIP, TZP, CAZ, ATM, IMI, TOB, CIP, SXT Nagelkerke R Square: 0,746 και Hosmer and Lemeshow Test: 0,554 Επιπρόσθετα σηµειώνεται ότι στο σύνολο των 170 στελεχών, εντεροβακτηριακά στελέχη που έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1 ήταν πιο πιθανό να είναι πολυανθεκτικά (OR:41,6, 95%CI: 16,7-103,2, p<0,001) ή να παράγουν ευρέος φάσµατος β-λακταµάσες (OR:10,98, 95%CI: 4,56-26,44, p<0,001) ή µεταλλο-βλακταµάσες (p<0,001) σε σχέση µε τα στελέχη που δεν έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1. (Πίνακας 29) Πίνακας 29: Πολυαντοχή και παραγωγή ευρέος φάσµατος και µεταλλο-βλακταµασών σε σχέση µε την παρουσία ιντεγκρονίων τάξης 1στο σύνολο των 170 στελεχών (λοιµώξεις και αποικισµοί) Φαινότυπος αντοχής n (%) στελεχών µε αντοχή Θετικά για ιντεγκρόνιο τάξης 1 (n=91) Αρνητικά για ιντεγκρόνιο τάξης 1 (n=79) OR (95% CI) p-value MDR 75 (82,4)% 8 (10,1%) <0,001 41,6 (16,77-103,21) ESBL 47 (51,6%) 7 (8,9%) <0,001 10,98 (4,566-26,44) VIM 21 (23,1%) 0 <0,001 111

4.11 Ιντεγκρόνια τάξης 2 Έντεκα µικροοργανισµοί που αποµονώθηκαν από καλλιέργειες αίµατος βρέθηκαν θετικοί για ιντεγκρόνιο τάξης 2 (11/133, 8,3%) εκ των οποίων 9 στελέχη έφεραν ταυτόχρονα ιντεγκρόνια και των δύο τάξεων. Ιντεγκρόνιο τάξης 2 έφεραν 2/61 E.coli (3,3%), 1/31 K.pneumoniae (3,2%) και 8/11 P.mirabilis (72,7%). Ως προς την ύπαρξη ιντεγκρονίων τάξης 2, µεταξύ των στελεχών που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε βακτηριαιµία κοινότητας µόνο δύο στελέχη από τα 58 (3,4%) (1 στέλεχος K.pneumoniae και 1 στέλεχος P.mirabilis) έφεραν ένα ιντεγκρόνιο τάξης 2. Τα δύο στελέχη ήταν ανθεκτικά στην κοτριµοξαζόλη και δεν έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1. Στα στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε νοσοκοµειακή βακτηριαιµία ιντεγκρόνια τάξης 2 βρέθηκαν σε 9 από τα 60 στελέχη (15 %) ( 1 στέλεχος E.coli και 8 στελέχη P.mirabilis). Το µέγεθος τους κατέστη δυνατό να προσδιοριστεί σε πέντε από αυτά και ήταν σε όλα 2.7kb και µε παρόµοια αλληλουχία γονιδιακών κασετών (dfra1-sat-aada1). Τα 9 αυτά στελέχη έφεραν ταυτόχρονα ιντεγκρόνια και των δύο τάξεων. Αντίστοιχα, µεταξύ των 37 στελεχών που αποµονώθηκαν από αποικισµούς, 3 βρέθηκαν θετικά για ιντεγκρόνιο τάξης 2 (3/37, 8,1%), εκ των οποίων 2 στελέχη P.mirabilis και ένα E.coli. Στο σύνολο των 170 στελεχών που µελετήθηκαν και, σε αντίθεση µε τα ιντεγκρόνια τάξης 1, παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση µεταξύ της παρουσίας ιντεγκρονίου τάξης 2 και του είδους του εντεροβακτηριακού (p<0.001), µε τα ιντεγκρόνια τάξης 2 να βρίσκονται κυρίως σε στελέχη P.mirabilis (εικόνα 20). 112

80 60 40 Αριθµός στελεχών 20 0 E. coli Enterobacter sp Ιντεγκρόνιο τάξης 2 Όχι Ναι K.pneumoniae P.mirabilis Εικόνα 20: Παρουσία ιντεγκρονίου τάξης 2 σε σχέση µε το είδος εντεροβακτηριακού ανεξαρτήτως εστίας αποµόνωσης του 113

5. Συζήτηση-συµπεράσµατα Υπάρχουν αρκετοί δυνητικοί περιορισµοί στην παρούσα µελέτη. Βέβαια, αν και η πιθανότητα για συστηµατικά σφάλµατα κατά την επιλογή των ατόµων των δύο οµάδων (selection bias), καθώς πρόκειται για αναδροµική µελέτη ασθενών- µαρτύρων, είναι υπολογίσιµη θα πρέπει να τονιστούν τα εξής σηµεία: η επιλογή των µαρτύρων έγινε από τον ίδιο (νοσοκοµειακό) πληθυσµό του ίδιου νοσηλευτικού ιδρύµατος σε σχέση µε τους ασθενείς η αναγνώριση τόσο των ασθενών όσο και των µαρτύρων έγινε µέσω του ίδιου µικροβιολογικού εργαστηρίου µε σταθερές τις µικροβιολογικές µεθόδους ελέγχου της αντιµικροβιακής αντοχής καθ όλη τη διάρκεια της µελέτης. Αυτό είναι σηµαντικό, καθώς η κατάταξη κάποιου αρρώστου στην οµάδα των ασθενών ή των µαρτύρων έγινε µε κριτήριο µόνο τα αποτελέσµατα του µικροβιολογικού ελέγχου αντοχής των στελεχών εντεροβακτηριακών που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες. Ως προς την πιθανότητα για συστηµατικά σφάλµατα κατά την κατάταξη ενός αρρώστου στην οµάδα των ασθενών ή των µαρτύρων (misclassification bias) θα πρέπει να τονιστεί ότι ο έλεγχος αντοχής στα αντιβιοτικά διενεργήθηκε πριν τη γνωστοποίηση της κατάστασης των αρρώστων ως προς την πιθανή έκθεσή τους σε διάφορους παράγοντες ή την έκβαση της λοίµωξης τους και εποµένως δεν είναι πιθανό να υπεισήλθαν. Καθώς δεν εφαρµόστηκε εξοµοίωση κατά την επιλογή των µαρτύρων, διότι τουλάχιστον για τους ασθενείς που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ δεν ήταν εφικτή, έγινε προσπάθεια να εξουδετερωθούν οι πιθανοί συγχυτικοί παράγοντες κατά τη φάση ανάλυσης των στοιχείων: Σε πρώτη φάση έγινε µονοπαραγοντική ανάλυση της σχέσης των πιθανών παραγόντων κινδύνου µε την ανάπτυξη λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά και της αδρής θνητότητας στις 30 ηµέρες και ακολούθησε δεύτερη φάση όπου έγινε πολυπαραγοντική ανάλυση µε τη χρήση της παλίνδροµης δεσµευµένης λογαριθµιστικής εξάρτησης (backward stepwise logistic regression analysis) για τον προσδιορισµό παραγόντων µε ανεξάρτητη συσχέτιση µε τη βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά καθώς και την αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας από εντεροβακτηριακά. Μόνο µεταβλητές για τις οποίες η τιµή του p ήταν <0.05 στη µονοπαραγοντική µελέτη περιελήφθησαν στην πολυπαραγοντική µελέτη. 114

Επιπρόσθετα: για την αναζήτηση παραγόντων κινδύνου λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά, έγινε και χωριστή ανάλυση του υποπληθυσµού των αρρώστων που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ του νοσοκοµείου, προκειµένου να εξουδετερωθούν συγχυτικοί παράγοντες που έχουν σχέση µε το ιδιαίτερο περιβάλλον και ιατρονοσηλευτικές πρακτικές που γίνονται κατά αποκλειστικότητα στο χώρο αυτό. Ο υποπληθυσµός των αρρώστων που νοσηλεύτηκαν µόνο στις κλινικές του νοσοκοµείου και αποτελούσε πιο οµοιογενή οµάδα ως προς την έκθεση σε εξωγενείς παράγοντες, ταξινοµήθηκε και πάλι σε ασθενείς και µάρτυρες µε µόνο κριτήριο την πολυαντοχή του στελέχους που αποµονώθηκε από την καλλιέργεια αίµατος. Για την εκτίµηση της αποµόνωσης πολυανθεκτικών στελεχών στην έκβαση της λοίµωξης έγινε και πάλι χωριστή ανάλυση του υποπληθυσµού των αρρώστων που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ του νοσοκοµείου, προκειµένου να εξουδετερωθούν συγχυτικοί παράγοντες σε σχέση µε τη βαρύτητα της κλινικής εικόνας που χαρακτηρίζει τους ασθενείς της ΜΕΘ. Εξάλλου και προκειµένου να αποκλειστούν παράγοντες όπως η διαφορετική πιθανά λοιµογόνος δύναµη των στελεχών λόγω διαφορετικού είδους έγινε και διάστρωση των ασθενών µε βάση το είδος του εντεροβακτηριακού στελέχους που αποµονώθηκε από τις καλλιέργειες αίµατός τους. Όπως σε όλες τις αναδροµικές έρευνες, έτσι και στην παρούσα υπήρχαν κάποιοι περιορισµοί ως προς τη διαθεσιµότητα ή/ και την πληρότητα των ιατρικών φακέλων των ασθενών, αλλά µελετήθηκαν µόνο παράγοντες για τους οποίους υπήρχαν δεδοµένα για το σύνολο των υπό εξέταση ασθενών. Το γεγονός εξάλλου ότι η µελέτη περιορίστηκε σε ασθενείς ενός µόνο νοσοκοµείου ίσως δεν επιτρέπει τη γενίκευση των αποτελεσµάτων και για άλλα νοσοκοµεία τουλάχιστον διαφορετικού επιπέδου περίθαλψης. 115

5.1. Παράγοντες κινδύνου για λοίµωξη από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά Η πολυπαραγοντική ανάλυση για αναζήτηση παραγόντων κινδύνου για λοίµωξη από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στελέχη κατέδειξε ως ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου την απόκτηση της λοίµωξης µέσα στο νοσοκοµείο (νοσοκοµειακή βακτηριαιµία) και την προηγούµενη κατανάλωση αντιβιοτικών έως και τρεις µήνες πριν το επεισόδιο της βακτηριαιµίας. Τα αποτελέσµατα της πολυπαραγοντικής ανάλυσης είναι συµβατά µε την ιστορική σχέση µεταξύ ενός περιβάλλοντος µε αυξηµένη πίεση επιλογής από τη χρήση αντιβιοτικών και την αύξηση της µικροβιακής αντοχής που έχει τονιστεί σε πλήθος δηµοσιευµένων µελετών (Baquero F et al 1998, Paterson DL et al 2004, Turnabellο M et al 2007, 2011,2012). Το νοσοκοµειακό περιβάλλον µε τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του έχει από νωρίς συνδεθεί µε το φαινόµενο της πολυαντοχής των µικροοργανισµών στα αντιβιοτικά µέσω του φαύλου κύκλου: ασθενείς µε εξασθενηµένο ανοσοποιητικό σύστηµα και άρα ευαίσθητοι σε λοιµώξεις, εύκολη διασπορά λοιµώξεων λόγω συνωστισµού, χορήγηση αντιβιοτικών, επικράτηση και διασπορά των ανθεκτικών µικροβιακών στελεχών, χορήγηση νέων και ισχυρότερων αντιβιοτικών, επιλογή περισσότερο ανθεκτικών µικροοργανισµών. Ως προς το εύρηµα της µελέτης για τη θετική συσχέτιση προηγούµενης κατανάλωσης αντιβιοτικών και λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στελέχη, ενισχύεται και από ανάλογα αποτελέσµατα άλλων µελετών. Οι Micek S et al, 2012, οι Johnson MT et al, 2011 αλλά και παλαιότερα οι Lautenbach E et al, 2001 κατέδειξαν τη σηµαντικά µεγαλύτερη επίπτωση λοίµωξης από πολυανθεκτικά Gramαρνητικά βακτηρίδια σε ασθενείς µε ιστορικό κατανάλωσης αντιβιοτικών το προηγούµενο διάστηµα. Τα πολυανθεκτικά Gram-αρνητικά βακτηρίδια είναι γνωστό πως προκαλούν παρατεταµένο αποικισµό του γαστρεντερικού σωλήνα ασθενών που λαµβάνουν ή έχουν λάβει αντιβιοτικά µε παράλληλη επικράτηση έναντι της φυσιολογικής χλωρίδας και τροποποίηση της άµυνας του ξενιστή. Οι αρνητικές επιπτώσεις εξάλλου από έναν πολυανθεκτικό µικροοργανισµό στη χλωρίδα του ξενιστή καθιστούν τον τελευταίο ακόµη πιο ευαίσθητο στην προσβολή από καινούρια στελέχη, µεγαλώνοντας ακόµη περισσότερο τον κίνδυνο αποικισµού από ανθεκτικά µικρόβια κατά τη διάρκεια ή µετά τη χορήγηση αντιµικροβιακής θεραπείας. (Tumbarellο M et al, 2012). 116

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση που έγινε επιπλέον µε εστίαση στους εξωγενείς παράγοντες κινδύνου του νοσοκοµειακού περιβάλλοντος, ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου εµφάνισης βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά παρέµειναν η τοποθέτηση ουροκαθετήρα (p<0,001) έως και 72 ώρες πριν την εµφάνιση βακτηριαιµίας και η νοσηλεία στη ΜΕΘ (p=0,038). Όσον αφορά τη θετική συσχέτιση της τοποθέτησης ουροκαθετήρα έως και 72 ώρες πριν την εµφάνιση της βακτηριαιµίας µε λοίµωξη από πολυανθεκτικό στέλεχος εντεροβακτηριακού, υπάρχουν πολλές µελέτες που καταδεικνύουν τη σχέση µεταξύ του καθετηριασµού της ουροδόχου κύστης και βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά, ακόµη και σε µη νοσηλευόµενους ασθενείς (Ben-Ami R, et al 2009). Οι Endimiani et al, όπως και οι Tumbarello M, et al, 2011 κατέδειξαν στις µελέτες τους τον καθετηριασµό της ουροδόχου κύστης ως ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis σε νοσηλευόµενους ασθενείς. Εξάλλου και οι Enoch DA, 2012, σε µια επιδηµιολογική µελέτη λοιµώξεων από εντεροβακτηριακά στελέχη θετικά για εκτεταµένου φάσµατος β-λακταµάσες που κατεγράφησαν σε νοσοκοµείο του Ηνωµένου Βασιλείου στη διάρκεια ενός έτους, κατέδειξαν την πρόσφατη λήψη αντιβιοτικών αλλά και την παρουσία ουροκαθετήρα ως τους κύριους παράγοντες κινδύνου λοίµωξης από πολυανθεκτικά στελέχη. Μάλιστα τονίζουν την ανάγκη για παρεµβάσεις µε σκοπό τη µείωση των µη απαραίτητων καθετηριασµών του ουροποιητικού αλλά και της άκριτης συνταγογράφησης αντιβιοτικών. Ως προς τη νοσηλεία στη ΜΕΘ, πληθώρα µελετών υποστηρίζουν ότι η ΜΕΘ αποτελεί το επίκεντρο τόσο των λοιµώξεων όσο και της πολυαντοχής των υπεύθυνων µικροοργανισµών. Μάλιστα έχει περιγραφεί και ως «εργοστάσιο παραγωγής, διασποράς και πολλαπλασιασµού της αντοχής των µικροοργανισµών στα αντιβιοτικά» (Brusselaers N et al, 2011). Ο εξαιρετικά ευπαθής πληθυσµός βαρέως πασχόντων ασθενών που νοσηλεύονται στη ΜΕΘ σε συνδυασµό µε τους παρεµβατικούς χειρισµούς που διαταράσσουν την ανατοµική ακεραιότητα των προστατευτικών φραγµών των ασθενών ευθύνεται σε πολύ µεγάλο βαθµό για τη µεγαλύτερη συχνότητα λοιµώξεων στους ασθενείς αυτούς (20-30% όλων των εισαγωγών σε ΜΕΘ) (Brusselaers N et al, 2011). Το πρόβληµα της µεγάλης επίπτωσης νοσοκοµειακών λοιµώξεων στη ΜΕΘ γίνεται ακόµη πιο δύσκολο λόγω και της παράλληλης αύξησης της πολυαντοχής των υπεύθυνων µικροοργανισµών στα αντιβιοτικά. Πολλοί παράγοντες που σχετίζονται µε τα χαρακτηριστιά της ΜΕΘ 117

ενοχοποιούνται για την εµφάνιση και την περαιτέρω µετάδοση των πολυανθεκτικών µικροοργανισµών. Οι Bonten και Mascini (2003) αναγνώρισαν 4 κινητήριες δυνάµεις πίσω από το φαινόµενο αυτό: α) επαγωγή ανθεκτικών στελεχών κατά τη διάρκεια της αντιµικροβιακής θεραπείας β) επιλογή ανθεκτικών στελεχών από τη χρήση ευρέος φάσµατος αντιµικροβιακών παραγόντων γ) εισαγωγή ανθεκτικών στελεχών και τέλος δ) διασπορά ανθεκτικών στελεχών. Από τη nested ανάλυση για αναζήτηση πιθανών παραγόντων κινδύνου εµφάνισης βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά που παράγουν το µεταλλοένζυµο VIM σε σχέση µε λοίµωξη από πολυανθεκτικά VIM-αρνητικά εντεροβακτηριακά στελέχη, βρέθηκε ότι µόνο η νοσηλεία στη ΜΕΘ παρέµεινε ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου. Η νοσηλεία στη ΜΕΘ βρέθηκε να αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου εµφάνισης βακτηριαιµίας από VIM-θετικά στελέχη K.pneumoniae και σε µια µεγάλη προοπτική µελέτη από τους Daikos G et al, 2010 που διεξήχθη σε τρία µεγάλα νοσοκοµεία της Αθήνας την περίοδο 2004-2006. Μάλιστα για τη συγκεκριµένη χρονική περίοδο, η εγκατάσταση στελεχών K.pneumoniae VIM-θετικών στις ΜΕΘ των ελληνικών νοσοκοµείων ήταν µια πραγµατικότητα που αποτυπώνεται σε διάφορες µελέτες (Psichogiou M et al 2008, Vatopoulos A, 2008, Giakkoupi et al, 2003). Στη µελέτη των Daikos et al, 2010 βρέθηκαν να σχετίζονται µε βακτηριαιµία από VIM-θετικά στελέχη K.pneumoniae επιπλέον της νοσηλείας στη ΜΕΘ και η προηγούµενη έκθεση σε >3 διαφορετικές κλάσεις αντιβιοτικών αλλά και η χρήση καρβαπενέµης. 118

5.2. Επίδραση της αποµόνωσης πολυανθεκτικού στελέχους στην έκβαση της λοίµωξης 5.2.1 ιάρκεια της νοσηλείας µετά τη λοίµωξη και έως την έξοδο των ασθενών από το νοσοκοµείο και συνολική διάρκεια νοσηλείας Από τα αποτελέσµατα της µελέτης φάνηκε ότι ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος είχαν σηµαντικά µεγαλύτερη διάρκεια νοσηλείας µετά την έναρξη του επεισοδίου και µέχρι την έξοδό τους από το νοσοκοµείο σε σχέση µε ασθενείς µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό στέλεχος (σύγκριση διαµέσων: 20 ηµέρες έναντι 8 ηµερών, p<0,001) καθώς και µεγαλύτερη συνολική διάρκεια νοσηλείας (σύγκριση διαµέσων: 36 ηµέρες έναντι 9 ηµερών, p<0,001). Η διαφορά αυτή σε σχέση µε τη διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία αλλά και τη συνολική διάρκεια νοσηλείας παρέµεινε και µετά την εξαίρεση των ασθενών που νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ (σύγκριση διαµέσων: 16,5 ηµέρες έναντι 8 ηµερών, p=0,003 και 26,5 ηµέρες έναντι 9 ηµερών p<0,001) αντίστοιχα. Παρόµοια αποτελέσµατα βρέθηκαν και από άλλες µελέτες, όπως από τους Micek S et al, 2012, οι οποίοι βρήκαν µια σηµαντική αύξηση στη διάρκεια νοσηλείας στους επιβιώσαντες από Gram-αρνητική σήψη που είχαν ιστορικό προγούµενης κατανάλωσης αντιβιοτικών και λοίµωξη από πολυανθεκτικά Gram-αρνητικά βακτηρίδια έναντι αυτών χωρίς προηγούµενη έκθεση (διάµεσος τιµή διάρκειας νοσηλείας 16 ηµέρες έναντι 9 ηµερών, p<0,001). Εξάλλου και οι Webster et al 2011, σε µελέτη βακτηριαιµιών από στελέχη E.coli και K.pneumoniae στη διάρκεια 11 ετών στο Oxfordshire, UK βρήκαν ότι η πολυαντοχή των στελεχών στα αντιβιοτικά παρέµεινε ως ο µόνος ανεξάρτητος παράγοντας αυξηµένης διάρκειας νοσηλείας στο νοσοκοµείο. Αντίστοιχα, οι Lautenbach et al, 2010 σε µελέτη βακτηριαιµιών από P.aeruginosa το διάστηµα 1989-2006, βρήκαν ότι η αποµόνωση πολυανθεκτικών ιµιπενέµη-ανθεκτικών στελεχών συσχετιζόταν µε µεγαλύτερη διάρκεια νοσηλείας µετά τη βακτηριαιµία και µεγαλύτερο κόστος νοσήλειων (και τα δύο p<0,001) σε σχέση µε την αποµόνωση από την καλλιέργεια αίµατος ιµιπενέµη ευαίσθητου στελέχους. Οι ίδιοι συγγραφείς εξάλλου σε παλαιότερη µελέτη τους κατέδειξαν τη στατιστικώς σηµαντικά µεγαλύτερη διάρκεια νοσηλείας σε ασθενείς µε λοίµωξη από στελέχη E.coli και K.pneumoniae που παρήγαγαν εκτεταµένου φάσµατος β- 119

λακταµάσες σε σχέση µε ασθενείς µε λοίµωξη από ευαίσθητα στελέχη (Lautenbach et al, 2001). 5.2.2. Αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας Από τη µονοπαραγοντική ανάλυση φάνηκε ότι, στο σύνολο των ασθενών (νοσηλεία και στη ΜΕΘ), ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος εµφάνιζαν µεγαλύτερο κίνδυνο να πεθάνουν από όλες τις αιτίες µες το νοσοκοµείο έως και 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας σε σχέση µε τους µάρτυρες µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό στέλεχος (OR=4,917, 95%CI= 2,069-11,68). Στην πολυπαραγοντική όµως ανάλυση η βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος δεν παρέµεινε ως ανεξάρτητος παράγοντας για την αδρή θνητότητα σε διάστηµα 30 ηµερών. Συµβατό µε τα παραπάνω είναι και τα αποτελέσµατα της ανάλυσης για πιθανούς παράγοντες αδρής θνητότητας όταν περιορίστηκε σε ασθενείς που δεν νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ. Από τα αποτελέσµατα ήδη της µονοπαραγοντικής ανάλυσης σε αυτό το υποσύνολο των ασθενών δεν προέκυψε ότι η βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος εντεροβακτηριακού σχετιζόταν µε µεγαλύτερη αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες σε σχέση µε τη λοίµωξη από µη πολυανθεκτικό στέλεχος (p=0,112, OR=2,529, 95%CI=0,78-8,13). Επίσης και µετά τη διάστρωση των αρρώστων µε βάση το είδος του υπεύθυνου εντεροβακτηριακού δεν προέκυψαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ως προς την αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας, µεταξύ των δύο οµάδων µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό ή µη στέλεχος ( όλα p>0,05). Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν δηµοσιευτεί και στο παρελθόν, τόσο για ασθενείς που νοσηλεύονται σε κρίσιµη κατάσταση σε ΜΕΘ (Blot S et al, 2002), όσο και σε νοσοκοµειακούς αρρώστους που νοσηλεύονται σε διάφορα τµήµατα του νοσοκοµείου (Daikos et al, 2007). Στη µελέτη των Blot et al, που ήταν περιορισµένη σε ασθενείς µε βακτηριαιµία από Gram-αρνητικά βακτήρια νοσηλευόµενους σε κρίσιµη κατάσταση σε ΜΕΘ, δεν βρέθηκε στατιστικώς σηµαντική διαφορά στην αδρή θνητότητα στις 14 ούτε στις 28 ηµέρες ούτε στο τέλος της νοσηλείας µεταξύ ασθενών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό έναντι αυτών µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό στέλεχος. Στη µελέτη των Daikos et al, τα αποτελέσµατα της µελέτης ασθενών µε βακτηριαιµία από εντεροβακτηριακά στελέχη σε ένα µεγάλο πανεπιστηµιακό 120

νοσοκοµείο της Αθήνας έδειξαν ότι ενώ στη µονοπαραγοντική ανάλυση η βακτηριαιµία από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά προέκυπτε µεταξύ άλλων ως παράγοντας κινδύνου για αδρή θνητότητα στις 14 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας, στην πολυπαραγοντική ανάλυση η πολυαντοχή του υπεύθυνου εντεροβακτηριακού δεν παρέµενε ως ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου. Από την πολυπαραγοντική ανάλυση µάλιστα προέκυπτε ότι ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για αδρή θνητότητα στις 14 ηµέρες παρέµεναν η κλινική βαρύτητα της βακτηριαιµίας (Pitt Bacteremia score 4) και η πηγή της βακτηριαιµίας να είναι οποιαδήποτε εστία πλην του ουροποιητικού, µε την προσθήκη και της βαρύτητας της γενικής κατάστασης λόγω υποκείµενων νοσηµάτων αν η ανάλυση αφορούσε αδρή θνητότητα στο τέλος της νοσηλείας αντί στις 14 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας. Αλλά και στη µεγάλη αναδροµική µελέτη βακτηριαιµιών από E.coli και K.pneumoniae στη διάρκεια µιας 11ετίας των Webster et al αναδείχτηκε η στατιστικώς σηµαντική σχέση της πολυαντοχής µε την αυξηµένη διάρκεια νοσηλείας αλλά όχι και µε την αδρή θνητότητα των ασθενών µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό στέλεχος. Από την άλλη υπάρχουν µελέτες που αναδεικνύουν την ύπαρξη σχέσης ανάµεσα στην πολυαντοχή του υπεύθυνου µικροοργανισµού και στην αδρή θνητότητα ασθενών µε λοίµωξη από Gram-αρνητικά βακτηρίδια. Μια πιθανή εξήγηση αυτής της σχέσης θα µπορούσε να είναι η καθυστέρηση στην έναρξη κατάλληλης και επαρκούς θεραπείας. Σε µία πολύ µεγάλη ανασκόπηση και µεταανάλυση της διεθνούς βιβλιογραφίας σχετικά µε προγνωστικούς παράγοντες θνητότητας από λοιµώξεις λόγω πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηρίων από τους Vardakas et al (2012), οι συγγραφείς αναφέρουν την ύπαρξη µεγάλης ετερογένειας ως προς το σχεδιασµό των µελετών και τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων. Παρόλους αυτούς τους περιορισµούς, εκτός από τη γενική κατάσταση λόγω υποκείµενων νοσηµάτων και την κλινική βαρύτητα του επεισοδίου της βακτηριαιµίας, και η πολυαντοχή σε συνδυασµό µε την ακατάλληλη θεραπεία αναγνωρίζονται ως προγνωστικοί παράγοντες θνητότητας σε 40% περίπου των ανασκοπούµενων δηµοσιεύσεων. Ένα άλλο πεδίο συγκρουόµενων απόψεων όσον αφορά µελέτες θνητότητας ασθενών µε βακτηριαιµία που επισηµαίνεται σε µια συστηµατική ανασκόπηση από τους McGregor et al, 2007, είναι αν θα πρέπει η σηπτική καταπληξία να λαµβάνεται υπόψη στις πολυπαραγοντικές αναλύσεις για ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου 121

θνητότητας. Ενώ στις περισότερες µελέτες περιλαµβάνεται, υπάρχει και η αντίθετη άποψη ότι δεν πρέπει να συνυπολογίζεται καθώς είναι αποτέλεσµα της βακτηριαιµίας και αποτελεί στάδιο του αιτιολογικού µονοπατιού προς το θάνατο. 5.3. Μοριακή βάση πολυαντοχής ο ρόλος των ιντεγκρονίων Τα αποτελέσµατα της µελέτης δίνουν σηµαντικές πληροφορίες για το ρόλο της παρουσίας των ιντεγκρονίων στην εµφάνιση αντοχής και κυρίως πολυαντοχής σε στελέχη της οικογένειας Enterobacteriaceae. Ενδεικτικά του ρόλου των γενετικών αυτών δοµών στην εµφάνιση πολυαντοχής είναι τα εξής ευρήµατα: 1) η συχνότερη παρουσία τους σε πολυανθεκτικά στελέχη σε σχέση µε στελέχη µη πολυανθεκτικά (96,7% έναντι 17,8%, p<0,001) αλλά και 2) το µεγαλύτερο µέγεθος τους (ενδεικτικό της ύπαρξης περισσότερων γονιδιακών κασετών) στα πολυανθεκτικά στελέχη (2.158±784bp έναντι 1.276±381,5bp p=0,001). Η σχέση του µεγέθους του ιντεγκρονίου/ων τάξης 1 µε την εµφάνιση πολυαντοχής φαίνεται και από το γεγονός ότι µικρά ιντεγκρόνια (<1000bp) βρέθηκαν σε µη πολυανθεκτικά στελέχη (p=0,001) ενώ αντίθετα τα µεγάλου µεγέθους ιντεγκρόνια βρέθηκαν αποκλειστικά σε πολυανθεκτικά στελέχη (p=0,012). 3) η ταυτόχρονη παρουσία περισσοτέρων του ενός ιντεγκρονίων τάξης 1 αποκλειστικά σε πολυανθεκτικά στελέχη, 4) το γονιδιακό περιεχόµενο των ιντεγκρονίων που βρέθηκαν σε πολυανθεκτικά στελέχη. Συγκεκριµένα και ενώ σε µη πολυανθεκτικά στελέχη βρέθηκαν κυρίως κασέτες που κωδικοποιούν για την αδενυλτρανσφεράση Α των αµινογλυκοσιδών (aada) και την αναγωγάση Α του διϋδροφολικού οξέος (dfra), οι οποίες προσδίδουν αντοχή στα αντιβιοτικά στρεπτοµυκίνη/σπεκτινοµυκίνη και τριµεθοπρίµη αντίστοιχα, σε πολυανθεκτικά στελέχη βρέθηκαν και άλλοι τύποι κασετών που κωδικοποιούν για αντοχή σε νεότερες αµινογλυκοσίδες (πχ aaca4 για αντοχή σε αµικασίνη, νετιλµικίνη και τοµπραµυκίνη) και σε καρβαπενέµες (VIM-1 and VIM-4). 5) Η εµφάνιση αντοχής βρέθηκε ότι ήταν σχετιζόµενη µε την παρουσία ιντεγκρονίων, όχι µόνο στα αντιβιοτικά για τα οποία υπήρχαν οι αντίστοιχες γονιδιακές κασέτες, αλλά και για άλλες τάξεις αντιβιοτικών. Το εύρηµα αυτό είναι σε συµφωνία µε τη βιβλιογραφία και θεωρείται ότι οφείλεται στο γεγονός ότι οι φορείς των ιντεγκρονίων συµµεταφέρουν και άλλα γονίδια αντοχής. 122

Όσον αφορά τα αποτελέσµατα από την τυποποίηση, φάνηκε ότι για συγκεκριµένα ιντεγκρόνια και µάλιστα για αυτά µε γονιδιακό περιεχόµενο: dfra17- aada5, bla VIM -aaca7-dfra1-aada1, dfra12-orff-aada2 και dfra1-aada1 βρέθηκε διασπορά του ίδιου ιντεγκρονίου σε διαφορετικούς κλώνους µέσα στο ίδιο είδος, αλλά και σε διαφορετικά είδη εντεροβακτηριακών. Τα ευρήµατα αυτά που βρίσκονται σε συµφωνία µε αντίστοιχα άλλων ερευνητών διεθνώς και στον Ελλαδικό χώρο και αποτελούν ενδεικτικό γεγονός της ευρείας διασποράς αυτών των ιντεγκρονίων τάξης 1. Τα ακριβή αίτια της ευρείας διασποράς κάποιων ιντεγκρονίων µε συγκεκριµένο συνδυασµό κασετών δεν είναι ακόµη ξεκάθαρα. Μία εξήγηση θα µπορούσε να είναι ότι αποτελούν τµήµα κάποιων πετυχηµένων πλασµιδίων ή τρανσποζονίων µε ευρεία ή και παγκόσµια διασπορά. Σίγουρα όµως χρειάζονται περισσότερες µελέτες για να διευκρινιστεί γιατί κάποιοι συνδυασµοί κασετών επικρατούν. Εξάλλου η συχνή παρουσία του ίδιου ακριβώς ιντεγκρονίου σε διαφορετικά είδη παρέχει ενδείξεις ότι η µεταφορά ολόκληρου του ιντεγκρονίου είναι πιο συχνό γεγονός σε σχέση µε την κινητοποίηση και ενσωµάτωση κασετών µέσω της ιντεγκράσης. Ως προς την παρουσία ιντεγκρονίων σε σχέση µε την προέλευση των µικροβιακών στελεχών, φάνηκε ότι υπάρχει σαφής υπεροχή των δοµών αυτών στο νοσοκοµειακό περιβάλλον, αν και η διασπορά τους και στην κοινότητα είναι σηµαντική. Το γεγονός ότι οι µεταβλητές περιοχές δύο ιντεγκρόνιων τάξης 1 µεγέθους 1500bp από δύο στελέχη νοσοκοµειακής και εξωνοσοκοµειακής προέλευσης ήταν ταυτόσηµες και περιείχαν τα γονίδια dfra17-aada5 και dhfra1-aada1 παρέχει ενδείξεις ότι στελέχη κοινότητας που φέρουν ιντεγκρόνια µπορεί να ευθύνονται για ένα σηµαντικό ποσοστό γονιδίων αντοχής που εισάγονται στο νοσοκοµείο. Ένα ακόµη εύρηµα που συνηγορεί σε αυτό το συµπέρασµα αλλά και είναι ενδεικτικό της πίεσης επιλογής που ασκείται µες το νοσοκοµειακό περιβάλλον είναι ότι το ιντεγκρόνιο µε τις γονιδιακές κασέτες dhfra1-aada1 που βρέθηκε ως το µοναδικό ιντεγκρόνιο σε στελέχη από βακτηριαιµίες κοινότητας βρέθηκε και σε στελέχη από νοσοκοµειακή βακτηριαιµία, ως το δεύτερο ιντεγκρόνιο. Συγκεκριµένα, βρέθηκε σε πέντε από τα δεκαεπτά στελέχη που έφεραν το VIM-ιντεγκρόνιο (2 στελέχη E.coli, 2 στελέχη K.pneumoniae και στο στέλεχος E.cloacae) καθώς και σε στελέχη 123

P.mirabilis των υποτύπων Α3 και Α4, ως το δεύτερο ιντεγκρόνιο συγχρόνως µε το ιντεγκρόνιο aaca4 -aacc1-aada1. Βέβαια τα µεγαλύτερα σε µέγεθος ιντεγκρόνια τάξης 1 καθώς και κάποιες συγκεκριµένες κασέτες αντοχής, όπως η aadb (αντοχή σε γενταµικίνη, καναµυκίνη και τοµπραµυκίνη) και η bla VIM1 (αντοχή πρακτικά σε όλα τα β-λακταµικά πλην της αζτρεονάµης) βρέθηκαν σε νοσοκοµειακά µόνο στελέχη, γεγονός που εξηγείται πιθανόν από τη µεγαλύτερη πίεση επιλογής από την αυξηµένη κατανάλωση ισχυρών αντιβιοτικών στο νοσοκοµειακό περιβάλλον. Εξάλλου και µεταξύ τµηµάτων στο χώρο του νοσοκοµείου πανανθεκτικά στελέχη που έφεραν και τα µεγαλύτερα ιντεγκρόνια αποµονώθηκαν από ασθενείς της ΜΕΘ. Από την άλλη, υπάρχει τα τελευταία χρόνια µια τάση µετατόπισης ενός σηµαντικού µέρους της φροντίδας των ασθενών από το νοσοκοµείο σε µονάδες παροχής υγείας στην κοινότητα, όπως κλινικές, κέντρα αποκατάστασης, οίκους ευγηρίας, ακόµη και ως εξειδικευµένη νοσηλεία κατ οίκον. Σε διάφορες µελέτες, όπως των Lenz et al. διαπιστώνεται ότι οι βακτηριαιµίες οι σχετιζόµενες µε υπηρεσίες υγείας αποτελούν µία ξεχωριστή κατηγορία βακτηριαιµιών µε χαρακτηριστικά ενδιάµεσα µεταξύ νοσοκοµειακών και βακτηριαιµιών κοινότητας και κυρίως µε υψηλότερα ποσοστά αντοχής σε σχέση µε τις λοιµώξεις κοινότητας. Αυτό φάνηκε και από την παρούσα µελέτη καθώς µεταξύ των στελεχών που αποµονώθηκαν από βακτηριαιµία κοινότητας µόνο τα 9/58 (15,5%) έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1, έναντι 12/16 (75%) των στελεχών που αποµονώθηκαν από βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας ( p<0,001). Το µέσο µέγεθος εξάλλου των ιντεγκρονίων τάξης 1 που βρέθηκαν σε εντεροβακτηριακά στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας ήταν µεγαλύτερο από αυτό ιντεγκρονίων που βρέθηκαν σε στελέχη από ασθενείς µε βακτηριαιµία κοινότητας (1.818,18±726,38 έναντι 1.233,3±413,11 σε επίπεδο σηµαντικότητας <0,1 (p=0,092). Η κατηγοριοποίηση των βακτηριαιµιών που εµφανίζονται σε <48 ώρες από την εισαγωγή στο νοσοκοµείο σε βακτηριαιµίες κοινότητας και βακτηριαιµίες σχετιζόµενες µε υπηρεσίες υγείας είναι χρήσιµη τόσο για την επιδηµιολογική επιτήρηση όσο και για την εµπειρική αντιµικροβιακή θεραπεία ασθενών που προσέρχονται στο νοσοκοµείο µε λοίµωξη. Όσον αφορά τα VIM-ιντεγκρόνια, αξίζει να τονιστεί ότι µια κοινή δοµή ιντεγκρονίου, το ιντεγκρόνιο In-e541, βρέθηκε σχεδόν σε όλα τα στελέχη που 124

παρήγαγαν το µεταλλοένζυµο VIM, ανεξαρτήτως µικροβιακού είδους (E.coli ή K.pneumoniae), αποτελεσµάτων µοριακής τυποποίησης, έτους αποµόνωσης και κλινικής σηµασίας (λοίµωξη ή αποικισµός). Μοναδική εξαίρεση ήταν το ιντεγκρόνιο από το στέλεχος E.cloacae, που ήταν διαφορετικό και έφερε µόνο την γονιδιακή κασέτα bla VIM στη µεταβλητή του περιοχή. Τα αποτελέσµατα αυτά είναι ανάλογα µε αυτά που δηµοσιεύτηκαν πρόσφατα από τους Koratzanis et al, 2011 και αφορούσαν στην επιδηµιολογία και το µοριακό χαρακτηρισµό στελεχών εντεροβακτηριακών που παρήγαγαν το µεταλλοένζυµο VIM και αποµονώθηκαν από µια ποικιλία κλινικών δειγµάτων ασθενών της ΜΕΘ Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου την περίοδο µεταξύ Μαρτίου 2004 -Νοεµβρίου 2005. Οι ερευνητές αναφέρουν την ανεύρεση του ίδιου VIM-ιντεγκρονίου (Ιn-e541) σε όλα τα στελέχη K.pneumoniae και E.cloacae ανεξαρτήτως κλώνου µε µοναδική εξαίρεση ενός στελέχους C.freundii που έφερε διαφορετικό VIM-ιντεγκρόνιο. Ανάλογα αποτελέσµατα αναφέρονται και από µελέτη βακτηριαιµιών σε ασθενείς που νοσηλεύονταν σε τρία πανεπιστηµιακά νοσοκοµεία της Αθήνας (Psichogiou M et al, 2008) από στελέχη που παρήγαγαν το µεταλλοένζυµο VIM και από την οποία προέκυψε η επικράτηση του ιντεγκρονίου Ιn-e541 σε όλα τα θετικά στελέχη ασχέτως των αποτελεσµάτων της µοριακής τυποποίησης. Τέλος και στη µελέτη των Daikos et al (2007) σχετικά µε βακτηριαιµίες από εντεροβακτηριακά που φέρουν ιντεγκρόνια, βρέθηκε και πάλι το ίδιο VIMιντεγκρόνιο (Ιn-e541) µε τη διαφορά ότι βρέθηκε µόνο σε στελέχη K.pneumoniae και όχι και σε άλλο µικροβιακό είδος και µάλιστα στα isolates ενός µόνο από τους διάφορους PFGE τύπους στους οποίους διαχωρίστηκαν τα isolates K.pneumoniae. Τέλος και στη µελέτη αυτή βρέθηκε και ένα άλλο είδος VIM-ιντεγκρονίου σε στέλεχος E.cloacae. Από τα ευρήµατα αυτά για τα VIM-ιντεγκρόνια, φαίνεται ο σηµαντικός ρόλος των ιντεγκρονίων τάξης 1 στην απόκτηση πολυαντοχής µεταξύ µελών της οικογένειας των Εντεροβακτηριακών, καθώς τα γονίδια που κωδικοποιούν για µεταλλο-β-λακταµάσες εδράζονται σε ιντεγκρόνιο στο οποίο συνυπάρχουν γονίδια αντοχής και για άλλες κατηγορίες αντιβιοτικών δηλαδή για αµινογλυκοσίδες και τριµεθοπρίµη. Το γεγονός αυτό, δηλαδή η συνύπαρξη σε µια κοινή δοµή γονιδίων αντοχής για διαφορετικές οµάδες αντιβιοτικών, ενέχει τον κίνδυνο της επικράτησης γονιδίων που προσδίδουν αντοχή σε εκτεταµένου φάσµατος β-λακτάµες ή 125

καρβαπενέµες λόγω πίεσης επιλογής από µια άσχετη µε τα β-λακταµικά, αλλά ευρέως χρησιµοποιούµενη οµάδα αντιβιοτικών πχ αµινογλυκοσίδες. (Weldhagen G, 2004) Ως προς τα ιντεγκρόνια τάξης 2 και σε σχέση µε τα ιντεγκρόνια τάξης 1, βρέθηκαν όχι µόνο σε λιγότερα κλινικά στελέχη, αλλά και σε συγκεκριµένα είδη κυρίως σε Proteus mirabilis και δευτερευόντως σε E.coli. Επίσης σαφώς περιορισµένος ήταν ο αριθµός και το είδος των γονιδιακών κασετών στη µεταβλητή περιοχή τους. Πιθανή αιτία της έλλειψης ποικιλίας γονιδιακών κασετών που παρατηρούνται στα τάξης 2 ιντεγκρόνια σε σχέση µε τα τάξης 1 θεωρείται η µη λειτουργική ιντεγκράση τους. Η συσχέτιση της παρουσίας τους µε τη φαινοτυπική αντοχή των στελεχών που τα φέρουν είναι επισφαλής καθώς βρέθηκε ότι συνυπάρχουν µε ιντεγκρόνια τάξης 1 στην πλειοψηφία των στελεχών. Μόνο σε τρία στελέχη που δεν έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1 και παρουσίαζαν αντοχή στην κοτριµοξαζόλη η αντοχή αυτή µπορεί να αποδοθεί εν µέρει στην ύπαρξη του ιντεγκρονίου τάξης 2 και συγκεκριµένα στην κασέτα dfra1 που προσδίδει αντοχή στην τριµεθοπρίµη. Τέλος το µέγεθος, το γονιδιακό περιεχόµενο και η συσχέτιση των ιντεγκρονίων τάξης 1 µε την εµφάνιση αντοχής και δη πολυαντοχής των εντεροβακτηριακών στελεχών φάνηκε ότι είναι ανεξάρτητο της εστίας αποµόνωσης του στελέχους, αν δηλαδή προέρχεται από φυσιολογικά στείρα ανατοµική περιοχή και είναι αίτιο λοίµωξης ή από περιοχή µε µικτή φυσιολογική χλωρίδα και είναι αίτιο αποικισµού. Ως προς την αναζήτηση της µοριακής βάσης της πολυαντοχής βρέθηκαν σηµαντικά αποτελέσµατα και για µηχανισµούς που οι γενετικοί τους καθοριστές δεν βρίσκονται ως γονιδιακές κασέτες µέσα σε ιντεγκρόνια, όπως η παρουσία της πλασµιδιακής προέλευσης κεφαλοσπορινάσης CMY14 στα πολυανθεκτικά στελέχη P.mirabilis. Τονίζεται ότι η παρουσία πλασµιδιακής προέλευσης κεφαλοσπορινάσης CMY σε στελέχη P.mirabilis παρατηρήθηκε για πρώτη φορά σποραδικά στη Γαλλία σε ασθενείς από την Ελλάδα (CMY4) και την Αλγερία (CMY12) στα τέλη της δεκαετίας του 90. ηµοσιευµένα στοιχεία για την παρουσία αυτού του µηχανισµού αντοχής σε στελέχη P.mirabilis από την Ελλάδα υπάρχουν µόνο για την περίοδο 2005-2008 από δύο νοσοκοµεία (D Andrea et al, 2011) στα οποία αποµονώθηκαν κλινικά στελέχη P.mirabilis που έφεραν ενσωµατωµένη στο χρωµόσωµά τους την πλασµιδιακής προέλευσης κεφαλοσπορινάση CMY (CMY16) σε συνδυασµό µε το µεταλλοένζυµο VIM και την πενικιλλινάση ΤΕΜ1. 126

Ένα σηµείο που τονίζεται σε σχετικές δηµοσιεύσεις είναι ότι φαίνεται να υπάρχει µια σηµαντική γενετική συνάφεια µεταξύ των στελεχών P.mirabilis που έχουν προσλάβει µε πλασµίδιο και ενσωµατώσει στο χρωµόσωµα τους την κεφαλοσπορινάση CMY συγκριτικά µε στελέχη που δεν τη φέρουν και φαίνεται ότι υπάρχει µια κοινή προέλευση των στελεχών αυτών. Είναι πιθανό να πρόκειται και για πραγµατικό διεθνή κλώνο που διασπείρεται στην Ευρώπη από τα τέλη της δεκαετίας του 90 και υπόκειται βέβαια σε διαφοροποιήσεις στο χρόνο και στον χώρο. Η συγγένεια αυτή θα µπορούσε να εξηγήσει αφενός την ανάγκη για χρησιµοποίηση µιας τυποποιητικής µεθόδου µε µεγάλη διακριτική ικανότητα (PFGE) και αφετέρου τα αποτελέσµατα της µοριακής τυποποίησης µε PFGE στα στελέχη P.mirabilis της παρούσας µελέτης που βρέθηκε να ανήκουν όλα στον ίδιο τύπο παρά την σχετικά αποµακρυσµένη χρονικά αποµόνωσή τους από ασθενείς που νοσηλεύθηκαν σε διαφορετικές κλινικές. 127

Περίληψη Σκοπός της µελέτης ήταν να αναζητηθούν παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης λοίµωξης από πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά στελέχη εντεροβακτηριακών, να εκτιµηθεί η επίδραση της αποµόνωσης πολυανθεκτικών στελεχών στην έκβαση της λοίµωξης και να διερευνηθεί η µοριακή βάση της πολυαντοχής και δη η παρουσία και ο ρόλος των ιντεγκρονίων τάξης 1 και 2. Μέθοδοι: Για την αναζήτηση παραγόντων κινδύνου, πραγµατοποιήθηκε µια αναδροµική µελέτη ασθενών-µαρτύρων στο Τζάνειο Γενικό Νοσοκοµείο από τον Απρίλιο του 2002 έως και το εκέµβριο του 2004. Όλοι οι ασθενείς ηλικίας 18 ετών µε θετική καλλιέργεια αίµατος για Εντεροβακτηριακό στέλεχος κατά το διάστηµα αυτό εντάχθηκαν στη µελέτη και όλα τα σχετικά δηµογραφικά και κλινικά δεδοµένα κατεγράφησαν σε προσχεδιασµένο ερωτηµατολόγιο. Για την εκτίµηση της επίδρασης της πολυαντοχής του υπεύθυνου µικροοργανισµού στην έκβαση της λοίµωξης οι δύο οµάδες συγκρίθηκαν ως προς τη διάρκεια νοσηλείας µετά την εµφάνιση βακτηριαιµίας και µέχρι την έξοδο του ασθενούς από το νοσοκοµείο ενώ για την επίδραση της πολυαντοχής στην αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες συγκρίθηκαν οι αποθανόντες µε τους επιβιώσαντες. Για την αναζήτηση της µοριακής βάσης της πολυαντοχής και το ρόλο των ιντεγκρονίων σε αυτήν συγκρίθηκαν οι µικροοργανισµοί που αποµονώθηκαν από τις καλλιέργειες αίµατος των δύο οµάδων ως προς την παραγωγή ευρέος φάσµατος β-λακταµασών και µεταλλοενζύµου VIM και ως προς τη συχνότητα παρουσίας ιντεγκρονίων και τον χαρακτηρισµό αυτών σχετικά µε την τάξη, το µέγεθος και την αλληλουχία των γονιδιακών κασετών που περιέχουν. Επιπλέον µελετήθηκε η συσχέτιση του φαινοτύπου αντοχής και της παρουσίας ιντεγκρονίων και σε 37 στελέχη που αποµονώθηκαν από αποικισµούς. Αποτελέσµατα: Συνολικά µελετήθηκαν 130 ασθενείς µε βακτηριαιµία από Gram-αρνητικό στέλεχος της Οικογένειας Enterobacteriaceae από τους οποίους αποµονώθηκαν 133 στελέχη εντεροβακτηριακών. Πολυανθεκτικά στα αντιβιοτικά σύµφωνα µε τον ορισµό βρέθηκαν 60 (45,1%) στελέχη που αποµονώθηκαν από 57 αρρώστους οι οποίοι αποτέλεσαν την οµάδα των ασθενών. Τα υπόλοιπα 73 (54,9%) στελέχη θεωρήθηκαν µη πολυανθεκτικά και αποµονώθηκαν από 73 ασθενείς, που αποτέλεσαν την οµάδα ελέγχου. Μεταξύ των 130 επεισοδίων βακτηριαιµίας, 56 (43,1%) ήταν νοσοκοµειακές, 16 (12,3%) ήταν βακτηριαιµίες σχετιζόµενες µε υπηρεσίες υγείας και 58 (44,6%) προέρχονταν από την κοινότητα. Ανεξάρτητοι 128

παράγοντες κινδύνου εµφάνισης βακτηριαιµίας από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στο σύνολο των ασθενών ήταν η προηγούµενη χορήγηση αντιβιοτικών κατά το τελευταίο τρίµηνο (p<0,001) και η νοσοκοµειακή προέλευση της βακτηριαιµίας (p<0,001). Σε δεύτερη φάση, εστιάζοντας µόνο στους εξωγενείς παράγοντες κινδύνου από το χώρο του νοσοκοµείου, ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου παρέµειναν η νοσηλεία στη ΜΕΘ και η τοποθέτηση ουροκαθετήρα έως και 72 ώρες πριν τη βακτηριαιµία. Οι ασθενείς µε βακτηριαιµία από πολυανθεκτικό εντεροβακτηριακό στέλεχος είχαν σηµαντικά µεγαλύτερη διάρκεια νοσηλείας µετά την έναρξη του επεισοδίου και µέχρι την έξοδό τους από το νοσοκοµείο σε σχέση µε ασθενείς µε βακτηριαιµία από µη πολυανθεκτικό στέλεχος (σύγκριση διαµέσων: 20 ηµέρες έναντι 8 ηµερών, p<0,001) καθώς και µεγαλύτερη συνολική διάρκεια νοσηλείας (σύγκριση διαµέσων: 36 ηµέρες έναντι 9 ηµερών, p<0,001. Αντίθετα η πολυαντοχή του στελέχους δεν βρέθηκε να σχετίζεται ανεξάρτητα µε την αδρή θνητότητα στις 30 ηµέρες από την έναρξη της βακτηριαιµίας. Ως προς το ρόλο των ιντεγκρονίων στην εµφάνιση πολυαντοχής, βρέθηκε ότι τα πολυανθεκτικά στελέχη που αποµονώθηκαν από αιµοκαλλιέργειες της οµάδας των ασθενών έφεραν συχνότερα ιντεγκρόνια τάξης 1 (96,7% έναντι 17,8%, p<0,001) και µάλιστα µεγαλύτερου µεγέθους (2.158±784bp έναντι 1.276±381,5bp p=0,001) ή περισσότερα του ενός (28% έναντι 0%, p=0,056) σε σχέση µε τα µη πολυανθεκτικά στελέχη της οµάδας των µαρτύρων. Επιπλέον, η εµφάνιση αντοχής βρέθηκε ότι ήταν σχετιζόµενη µε την παρουσία ιντεγκρονίων, όχι µόνο στα αντιβιοτικά για τα οποία υπήρχαν οι αντίστοιχες γονιδιακές κασέτες, αλλά και για άλλες τάξεις αντιβιοτικών. Όσον αφορά τα VIM-ιντεγκρόνια, µια κοινή δοµή ιντεγκρονίου, το ιντεγκρόνιο In-e541, βρέθηκε σχεδόν σε όλα τα στελέχη που παρήγαγαν το µεταλλοένζυµο VIM, µε εξαίρεση το ιντεγκρόνιο από ένα στέλεχος E.cloacae, που ήταν διαφορετικό και έφερε µόνο την γονιδιακή κασέτα bla VIM στη µεταβλητή του περιοχή. Ως προς τον τύπο της βακτηριαιµίας, εντεροβακτηριακά στελέχη που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε νοσοκοµειακή βακτηριαιµία έφεραν συχνότερα ιντεγκρόνια [50/59 (84,7%) έναντι 9/58 (15,5%), p<0,001] και µάλιστα µεγαλύτερου µεγέθους (2.168,8±796,95 έναντι 1.233,3±413,11, p=0,008) σε σχέση µε αυτά που αποµονώθηκαν από ασθενείς µε βακτηριαιµία κοινότητας αλλά όχι στατιστικώς σηµαντικά µεγαλύτερα από αυτά που βρέθηκαν σε στελέχη από ασθενείς µε βακτηριαιµία σχετιζόµενη µε υπηρεσίες υγείας (2.168,8±796,95 vs 1818,18±726,38, p=0,191). Τέλος στο σύνολο των 170 στελεχών εντεροβακτηριακών που µελετήθηκαν (133 από λοίµωξη και 37 από αποικισµούς) τα 129

στελέχη που έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1 ήταν πιο πιθανό να είναι πολυανθεκτικά (OR:41,6, 95%CI: 16,7-103,2, p<0,001) ή να παράγουν ευρέος φάσµατος β- λακταµάσες (OR:10,98, 95%CI: 4,56-26,44, p<0,001) ή µεταλλο-β-λακταµάσες (p<0,001) σε σχέση µε τα στελέχη που δεν έφεραν ιντεγκρόνιο τάξης 1. Συµπεράσµατα: η ανάπτυξη λοίµωξης από πολυανθεκτικά εντεροβακτηριακά στελέχη συσχετίστηκε µε το νοσοκοµειακό περιβάλλον και την προηγούµενη χορήγηση αντιβιοτικής αγωγής, φάνηκε ότι αυξάνει τη διάρκεια νοσηλείας αλλά δεν είχε δυσµενή επίδραση στην επιβίωση των ασθενών ενώ ο ρόλος των ιντεγκρονίων τάξης 1 βρέθηκε πολύ σηµαντικός για την εµφάνιση πολυαντοχής στα κλινικά στελέχη της µελέτης. Summary Objectives Τhe objectives of this study were (i) to identify risk factors associated with the acquisition of multidrug-resistant Enterobacteriaceae isolates responsible for bloodstream infections (BSIs), (ii) to estimate the impact of multidrugresistance on the outcome of such infections and (iii) to investigate the role of integrons in the multi-drug resistant phenotype in Enterobacteriaceae clinical isolates. Methods Risk factors for acquiring MDR Enterobacteriaceae BSIs were assessed in a retrospective case-control study and those associated with mortality were assessed by comparing survivors and nonsurvivors. The influence of multidrug resistance in hospital length of stay (LOS) in survivors was also evaluated. The molecular basis of multidrug resistance and especially the role of integrons was examined by comparing the presence of ESBLs, VIM metallo-b-lactamases and class 1 and 2 integrons in enterobacteriaceae isolates from patients of both groups and also in representative enterobacteriaceae isolates from colonizations. The genetic content of integrons was determined with DNA sequencing. Results A total of 130 patients with Enterobacteriaceae BSIs were identified from whom 133 isolates were recovered. Sixty isolates from 57 patients (cases) were found multidrug resistant (MDR) whereas 73 isolates from 73 patients (controls) were interpreted as non-mdr. Fifty-six Enterobacteriaceae BSIs were nosocomial, 16 were health care associated and 58 were community acquired. Prior antibiotics use and a nosocomial setting were independently associated with BSI caused by MDR 130

Enterobacteriaceae. Patients with MDR Enterobacteriaceae BSI had longer post- BSI-onset and total hospital stays (for survivors) than those with non-mdr infections but no increased crude 30-day mortality rate. MDR Enterobacteriaceae clinical isolates were more likely to harbor class 1 integrons (96,7% vs 17,8%, p<0,001) with bigger mean size (2.158±784bp vs 1.276±381,5bp p=0,001) or simultaneous presence of more than one class 1 integron (28% vs 0%, p=0,056) in relation with non-mdr Enterobacteriaceae. Among 56 nosocomial Enterobacteriaceae BSIs, integroncarrying microorganism was isolated in 50 (84,7%) in comparison with 9/58 (15.5%) of community-acquired BSIs (p<0,001). The mean size of class 1 integrons derived from isolates causing nosocomial BSIs was bigger than that of integrons derived from isolates from community-acquired BSIs (2.168,8±796,95 vs 1.233,3±413,11, p=0,008) but was not significant bigger than the size of integrons from isolates causing health care associated BSIs (2.168,8±796,95 vs 1818,18±726,38, p=0,191). Finally, integron-carrying isolates, from both BSIs and colonizations, were found more often to be multidrug resistant (OR: 41,6, 95%CI: 16,7-103,2, p<0,001) or to produce ESBLs (OR:10,98, 95%CI: 4,56-26,44, p<0,001) or metallo-β-lactamase bla VIM (p<0,001) in comparison with integron-negative isolates. Conclusions: as independent risk factors for acquisition of BSI caused by multidrug resistant Enterobacteriaceae isolate were found the prior exposure to antibiotics and the nosocomial origin of infection. Multidrug resistance of the causative microorganisms was associated with elongated post-bsi and total LOS but no significant association was found with crude 30-day mortality. Finally, integrons were found to play a crucial role in the appearance of multidrug resistance both directly and indirectly in this clinical isolates collection. 131

Βιβλιογραφία 1. Ahmed A, Nakano H and Shimamoto T. Molecular characterization of integrons in non-typhoid Salmonella serovars isolated in Japan: description of an unusual class 2 integron. J Antimicrob Chemother 2005, 55:371-374 2. Alekshun M and Levy S. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance: Cell 2007, 128:1037-1050 3. Alexopoulos A, Voidarou C, Stefanis C, Papadopoulos I, Vavias S, Tsiotsias A, Kalkani E, Charvalos E, Bezirtzoglou E. Antibiotic resistance profiles and integrons in Enterobacteriaceae from the riverside of Evros-Ardas with respect to chemical and waste pollution. Microbial Ecology in Health and Disease 2006, 18:170-176 4. Aragon L.M, Mirelis B, Miro E, Mata C, Gomez L, Rivera A, Coll P and Navarro F. Increase in β-lactam-resistant Proteus mirabilis strains due to CTX-M and CMY-type as well as new VEB-and inhibitor-resistant TEMtype β-lactamases. J Antimicrob Chemother 2008, 61: 1029-1032 5. Baas L, Liebert CA, Lee MD et al. Incidence and characterization of integrons, genetic elements mediating multiple-drug resistance, in avian Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1999, 43:2925-2929 6. Baquero F, Negri MC, Morosini MI, Blázquez J. Antibiotic-selective environments.clin Infect Dis. 1998, 27 Suppl 1:S5-11. Review. 7. Bearman GML and Wenzel RP. Bacteremias: A leading cause of death. Arch Med Res 2005, 36:646-659 8. Ben-Ami R, Rodríguez-Baño J, Arslan H, Pitout JD, Quentin C, Calbo ES, Azap OK, Arpin C, Pascual A, Livermore DM, Garau J, Carmeli Y. A multinational survey of risk factors for infection with extended-spectrum beta-lactamase-producing enterobacteriaceae in nonhospitalized patients. Clin Infect Dis. 2009, 49(5):682-90 9. Biskri L, Mazel D. Erythromycin esterase gene ere(a) is located in a functional gene cassette in an unusual class 2 integron. Antimicrob Agents Chemother. 2003, 47(10):3326-31. 10. Blot S, Vanderwoude K, De Bacquer D and Colardyn F: Nosocomial bacteremia caused by antibiotic-resistant gram-negative bacteria in clinically ill patients: Clinical outcome and length of hospitalization. Clin Infect Dis 2002, 34:1600-1606 11. Brusselaers N, Vogelaers D and Blot S: The rising problem of antimicrobial resistance in the intensive care unit. Ann Intens Care, 2011, 1:47 132

12. Bush K. Alarming b-lactamase-mediated resistance in multidrug-resistant Enterobacteriaceae. Current Opinion in Microbiology 2010, 13:558-564 13. Carattoli A. Review article, Importance of integrons in the diffusion of resistance. Vet Res 2001, 32:243-259 14. Cartelle M, Tomas M, Pertega T, Beceiro A, Dominguez MA, Velasco D, Molina F, Villanueva R, Bou G. Risk factors for colonization and infection in a hospital outbreak caused by a strain of Klebsiella pneumoniae with reduced susceptibility to expanded-spectrum cephalosporins J Clin Microbiol 2004, 42:4242-4249 15. Clark NC, Olsvik O, Swenson JM, Spiegel CA, Tenover FC. Detection of a streptomycin/spectinomycin adenylyltransferase gene (aada) in Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother 1999, 43:157-160. 16. Cohen-Nahum K, Saidel-Odes L, Riesenberg K, Schlaeffer F, Borer A. Urinary tract infections caused by multi-drug resistant Proteus mirabilis: risk factors and clinical outcames. Infection 2010, 38:41-46 17. Collis CM, Kim MJ, Partridge SR, Stokes HW, Hall RM. Characterization of the class 3 integron and the site-specific recombination system it determines. J Bacteriol. 2002, 184(11):3017-26. 18. Colodner R, Rock W, Chazan B, Keller N, Guy N, Sakran W and Raz R. Risk factors for development of Extended-Spectrum-Beta-Lactamaseproducing bacteria in nonhospitalized patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004, 23:163-167 19. Daikos GL, Vryonis E, Psichogiou M, Tzouvelekis LS, Liatis S, Petrikkos P, Kosmidis C, Tassios PT, Bamias G, Skoutelis A: Risk factors for bloodstream infection with Klebsiella pneumoniae producing VIM-1 metallo-β- lactamase. J Antimicrob Chemother 2010, 65:784-788 20. Daikos GL, Petrikkos P, Psichogiou M, Kosmidis C, Vryonis E, Skoutelis A, Georgousi K, Tzouvelekis LS, Tassios PT, Bamia C, Petrikkos G. Prospective observational study of VIM-1 metallo-β-lactamase on the outcome of patients with klebsiella pneumoniae bloodstream infections. Antimicrob Agents Chemother 2009, 53:1868-1873 21. Daikos GL, Kosmidis C, Tassios PT, Petrikkos G, Vasilakopoulou A, Psychogiou M, Stefanou I, Avlami A and Katsilambros N: Enterobacteriaceae bloodstream infections: Presence of integrons, risk factors and outcome. Antimicrob Agents Chemother 2007, 51:2366-2372 133

22. D Andrea M, Literacka E, Zioga A, Giani T, Baraniak A, Fiett J, Sadowy E, Tassios PT, Rossolini G.M, Gniadkowski M, and Miriagou V. Evolution and Spread of amultidrug-resistant Proteus mirabilis Clone with Chromosomal AmpC-Type Cephalosporinases in Europe. Antimicrob Agents Chemother 2011, 55 (6):2735-2742 23. ECDC Technical Report, Risk assessment on the spread of carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae (CPE) through patient transfer between healthcare facilities, with special emphasis on cross-border transfer. September 2011 24. Endimiani A, Luzzaro F, Brigante G, Perilli M, Lombardi G, Amicosante G, Rossolini GM, Toniolo A. Proteus mirabilis Bloodstream infections: Risk factors and treatment outcome related to the expression of Extended- Spectrum β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:2598-2605 25. Enne VI, Livermore DM, Stephens P, Hall LM. Persistence of sulphonamide resistance in Escherichia coli in the UK despite national prescribing restriction. Lancet 2001, 357:1325 1328 26. Enoch DA, Brown F, Sismey AW, Mangeni DA, Curran MD, Karas JA, Cone DB, Aliyu SH, Dhanji H, Doumith M, Maharjan S, Meunier D, N. Woodford.Epidemiology of extended-spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae in a UK district hospital; an observational study. Journal of Hospital Infection 2012, 81:270-277 27. Fluit AC and Schmitz FJ. Resistance integrons and super-integrons. Review. Clin Microbiol Infect 2004, 10:272-288 28. Fluit AC, Schmitz FJ. Class 1 integrons, gene cassettes, mobility, and epidemiology. Review. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1999, 18(11):761-70. 29. Frank T, Gautier V, Talarmin A, Bercion R Arlet G: Characterization of sulphonamide resistance genes and class 1 integron gene cassetes in Enterobacteriaceae, Central African Republic. J Antimicrob Chemother 2007, 59:742-745 30. Friedman ND, Kaye KS, Stout JE et al. Health care-associated bloodstream infections in adults: a reason to change the accepted definition of community-acquired infections. Ann Intern Med 2002, 137:791 797 31. Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC, Hughes JM: CDC definitions for nosocomial infections, 1988. Am J Infect Control 1988, 16:128-140 32. Gastmeier P: Healthcare-associated versus community-acquired infections: A new challenge for science and society Int J Med Microb 2010, 300:342-345 134

33. Gaynes R, Edwards JR. Overview of nosocomial infections caused by gramnegative bacilli. Clin Infect Dis 2005, 41:848-54 34. Giakkoupi, P, Xanthaki, A, Kanelopoulou, M et al. VIM-1 metallo-blactamase-producing Klebsiella pneumoniae strains in Greek hospitals. J Clin Microbiol 2003, 41:3893 3896. 35. Gillings M, Boucher Y, Labbate M, Holmes A, Krishnan S, Holley M Stokes HW: The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J Bacteriol 2008, 190:5095-5100 36. Goldstein C, Lee M, Sanchez S, et al : Incidence of class 1 and 2 integrases in clinical and commensal bacteria from livestock, companion animals and exotics. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45:723-726 37. Hansson K, Sundström L, Pelletier A, Roy PH. IntI2 integron integrase in Tn7 J Bacteriol. 2002, 184(6):1712-21. 38. Heir E, Lindstedt B-J, Leegaard TM, Gjernes E, Kapperud G: Prevalence and characterization of integrons in blood culture Enterobacteriaceae and gastrointestinal Escherichia coli in Norway and reporting of a novel class 1 integron-located lincosamide resistance gene. Ann Clin Microbiol Antimicrob 2004, 3:12-20 39. Ho J, Tambyah P and Paterson DL: Multiresistant Gram-negative infections: a global perspective: Current Opinion in Infectious Diseases 2010, 23:546-553 40. Hulton CS, Higings CF and Sharp PM. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria. Mol. Microbiol, 1991, 5: 825-834 41. Ikonomidis A, Tokatlidou D, Kristo I et al. Outbreaks in distinct regions due to a single Klebsiella pneumoniae clone carrying a blavim-1 metallo-blactamase gene. J Clin Microbiol 2005; 43:5344 7 42. Johnson MT, Reichley R, Hoppe-Bauer J, Dunne WM, Micek S, Kollef M. Ιmpact of previous antibiotic therapy on outcome of Gram-negative severe sepsis. Crit Care Med. 2011,39(8):1859-65 43. Kang C-I, Kim S-H, Bang J-W, Kim H-B, Kim N-J, Kim E-C, Oh M-D and Choe K-W: Community-acquired versus nosocomial Klebsiella pneumonia bacteremia: Clinical features, treatment outcomes and clinical implication of antimicrobial resistance. J Korean Med Sci 2006, 21:816-822 44. Kang C-I, Kim S-H, Park WB, Lee K-D, Kim H-B, Kim E-C, Oh M-D and Choe K-W: Bloodstream infections caused by antibiotic-resistant gramnegative bacilli: Risk factors for mortality and impact of inappropriate initial antimicrobial therapy on outcome. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:760-766 135

45. Koratzanis E, Souli M, Galani I, Chryssoulli Z, Armaganidis A, Giamarellou H: Epidemiology and molecular characterization of metallo-β-lactamaseproducing Enterobacteriaceae in a university hospital Intensive Care Unit in Greece. Int J Antimicrob Agents 2011, 38:390-397 46. Lautenbach E, Synnestvedt M, Weiner MG, Bilker WB, Vo L, Schein J, Kim M: Imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa: emergence, epidemiology, and impact on clinical and economic outcomes. Infect Control Hosp Epidemiol. 2010, 31(1):47-53. 47. Lautenbach E, Patel JB, Bilker WB, Edelstein PH and Fishman NO: Extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae: Risk factors for infection and impact of resistance on outcomes. Clin Infect Dis 2001, 32:1162-1171 48. Lenz R, Leal RJ, Church LD, Gregson BD, Ross T, Laupland BK. The distinct category of healthcare associated bloodstream infections. BMC Infectious Diseases 2012, 12:85-90 49. Leverstein-van Hall MA, Blok HEM, DondersRT, Paauw A, Fluit AC Verhoef J: Multidrug resistance among Enterobacteriaceae is strongly associated with the presence of integrons and is independent of species or isolate origin. J Infect Dis 2003, 187:251-259 50. Leverstein-van Hall MA, Paauw A, Box TA, Blok HEM, Verhoef J, Fluit AC: Presence of integrin-associated resistance in the community is widespread and contributes to multidrug resistance in the hospital. J Clin Microb 2002, 40:3038-3040 51. Levesque C, Piche L, Larose C, and Roy PH. PCR mapping of integrons reveals several novel combinations of resistance genes. Antimicrob Agents Chemother 1995, 39:185-191 52. Liu C-P, Wang N-Y, Lee C-M, Weng L-C, Tseng H-K, Liu C-W, Chiang C- S, Huang F-Y: Nosocomial and community-acquired Enterobacter cloacae bloodstream infection: risk factors for and prevalence of SHV-12 in multiresistant isolates in a medical centre. J Hosp Infect 2004, 58:63-77 53. Machado E, Coque T, Canton R, Sousa JC, and Peixe L. Antibiotic resistance integrons and extended-spectrum b-lactamases among Enterobacteriaceae isolates recovered from chickens and swine in Portugal. Journal of Antimicrob Chemother 2008, 62:296-302 54. Maguire AJ, Brown DFJ, Gray JJ, Desselberger U: Rapid screening technique for class 1 integrons in Enterobacteriaceae and nonfermenting Gram-negative bacteria and its use in molecular epidemiology. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45:1022-1029 136

55. Marschall J, Fraser JV, Doherty J, Warren KD: Between community and hospital: Healthcare-associated Gram-negative bacteremia among hospitalized patients. Infect Control Hosp Epidemiol 2009, 30:1050-1056 56. Martinez-Freijo P, Fluit AC, Schmitz F-J, Verhoef J, Jones ME: Many class 1 integrons comprise distinct structures occurring in different species of Enterobacteriaceae isolated from widespread geographic regions in Europe. Antimicrob Agents Chemother 1999, 43:686-689 57. Mathal E, Grape M, Kronvall G: Integrons and multidrug resistance among Escherichia coli causing community-acquired urinary tract infection in southern India. APMIS 2004, 112:159-164 58. Mayorakos AP, Srinivasan A, Carey RB, Carmeli Y, Falagas M, Giske CG, Harbarth S, Hindler JF, Kahlmeter G, Olsson-Liljequist B, Paterson DL, Rice LB, Stelling J, Struelens MJ, Vatopoulos A, Weber JT and DL Monnet: Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect 2012, 18:268-281 59. Mazel D: Integrons: agents of bacterial evolution, review. Nature 2006, 4:608-620 60. McGregor JC, Rich SE, Harris AD, Perencevich EN, Osih R, Lodise TP, Miller RR and Furuno JP: A systematic review of methods used to assess the association between appropriate antibiotic therapy and mortality in bacteremic patients. Clin Infect Dis 2007, 45:329-337 61. Micek S, Johnson MT, Reichley R and Kollef MH: An institutional perspective on the impact of recent antibiotic exposure on length of stay and hospital costs for patients with gram-negative sepsis. BMC Infectious Diseases 2012, 12:56-63 62. Michalopoulos A, Falagas ME, Karatza D, Alexandropoulou P, Papadakis E, Gregorakos L, Chalevelakis G and Pappas G: Epidemiologic, clinical characteristics and risk factors for adverse outcome in multiresistant gramnegative primary bacteremia of critically ill patients. Am J Infect Control 2011, 39:396-400 63. Miriagou V, Carattoli A, Tzelepi E, Villa L and Tzouvelekis L: IS26- associated In4-type integrons forming multiresistant loci in Enterobacterial plasmids. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49 (8):3541-3543 64. Miriagou V, Tzelepi E, Gianneli D et al. Escherichia coli with a selftransferable, multiresistant plasmid coding for metallo-β-lactamase VIM-1. Antimicrob Agents Chemother 2003, 47:395 397. 137

65. Naas T, Cuzon G, Villegas MV et al. Genetic structure at the original acquisition of the b-lactamase blakpc gene. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: 1257 63. 66. Naas T, Mikami Y, Imai T, Poirel L, Nordmann P: Characterization of In53, a class 1 plasmid- and composite transposon-located integron of Escherichia coli which carries an unusual array of gene cassettes. J Bacteriol 2001, 183(1):235-49. 67. Nandi S, Maurer JJ, Hofacre C, Summers AO: Gram-positive bacteria are a major reservoir of Class 1 antibiotic resistance integrons in poultry litter. Proc Nati Acad Sci USA 2004, 101 (18):7118-22 68. Nesvera J, Hochmannova J, Patek M. An integron of class 1 is present on the plasmid pcg4 from Gram-positive bacterium Corynebacterium glutamicum. FEMS Microbiol Lett 1998;169:391-395. 69. Nicasio A, Kuti J and Nicolau D: The currentstate of multidrug-resistant Gram-negative bacilli in North America: Pharmacotherapy 2008, 28:235-249 70. Nijssen S, Florijn A, Top J, Willems R, Fluit A, Bonten M. Unnoticed spread of integron-carrying Enterobacteriaceae in intensive care units. Clin Infect Dis 2005;41:1-9. 71. Paterson DL. Infections due to other members of the Enterobacteriaceae, including management of multidrug-resistant strains. Goldman s Cecil Medicine, 24 th ed. Elsevier-Saunders, 2012 72. Paterson DL. Resistance in Gram-negative bacteria: Enterobacteriaceae. American J Medicine 2006, 119 (6A): 520-528 73. Paterson DL."Collateral damage" from cephalosporin or quinolone antibiotic therapy. Clin Infect Dis. 2004, 38 Suppl 4:S341-5. 74. Peleg A, Hooper D. Hospital-acquired infections due to Gram-negative bacteria: N Engl J Med 2010, 362:1804-1813 75. Ploy MC, Denis F, Courvalin P, and Lambert T. Molecular characterization of integrons in Acinetobacter baumannii: description of a hybrid class 2 integron. Antimicrob Agents and Chemother 2000, 44(10):2684-2688 76. Poirel L, Naas T, Nicolas D, Collet L, Bellais S, Cavallo JD, Nordmann P. Characterization of VIM-2, a Carbapenem-Hydrolysing Metallo-β- Lactamase and its Plasmid- and Integron-Borne Gene from a Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolate in France. Antimicrob Agents and Chemother 2000, 44 (4):891-897 138

77. Polemis MZ, Tryfinopoulou K, Hospitals Participating in the Greek System for the Surveillance of Antimicrobial Resistance, Vatopoulos AC. Bacteraemia and antibiotic resistance of its pathogens reported in Greece between 2000 and 2009: trend analysis. 21st ECCMID & 27th ICC, Milan, Italy, 7-10 May 2011 78. Psichogiou M, Tassios PT, Avlamis A, Stefanou I, Kosmidis C, Platsouka E, Paniara O, Xanthaki A, Toutouza M, Daikos GL, Tzouvelekis LS. Ongoing epidemic of blavim-1-positive Klebsiella pneumoniae in Athens, Greece: a prospective survey. J Antimicrob Chemother 2008, 61:59-63. 79. Roe MT, Vega E, Pillai SD: Antimicrobial resistance markers of class 1 and class 2 integron-bearing Escherichia coli from irrigation water and sediments. Emerg Infect Dis 2003, 9:822-826 80. Rosser SJ, Young HK. Identification and characterization of class 1 integrons in bacteria from an aquatic environment. J Antimicrob Chemother 1999, 44:699-702 81. Russo TA. Diseases Caused by Gram-Negative Enteric Bacilli. Harrison s Principles of Internal Medicine, 17 th ed. McGraw-Hill, 2008 82. Sanchez S, McCrackin Stevenson MA, Hudson CR et al: Characterization of multidrug-resistant E.coli isolates associated with nosocomial infections in dogs. J Clin Microbiol 2002, 40:3586-3595 83. Sandvang D, Aarestrup FM: Characterization of aminoglycoside resistance genes and class 1 integrons in porcine and bovine geentamicin-resistant E.coli. Microb. Drug Resist 2000, 6:19-27 84. Schmidt AS, Bruun MS, Dalsgaard I, Larsen JL: Incidence, distribution and spread of tetracycline resistance genes among motile aeromonads from a fish farming environment. Appl Environ Microbiol 2001, 67:5675-5682 85. Schmitz FJ, Hafner D, Geisel R, Follmann P, Kirschke C, Verhoef J, Kohrer K, and Fluit AD. Increased prevalence of class 1 integrons in Escherichia coli, Klebsiella Species, and Enterobacter species isolates over a 7-year period in a German University Hospital. Journal of Clin Microb, 2001, 39(10):3724-3726 86. Shaw KJ, Rather PN, Hare RS and Miller GH: Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familiar relationships of the aminoglycoside modifying enzymes: Microbiol Rev 1993, 57:138-163 87. Shorr FA, Tabak PY, Killian DA, Gupta V, Liu ZL, Kollef HM. Healthcareassociated bloodstream infection: A distinct entity? Insights from a large U.S. database, Crit Care Med 2006, 34:2588-2595 139

88. Solberg OD, Ajiboye RM, Riley LW. Origin of class 1 and 2 integrons and gene cassettes in a population-based sample of uropathogenic Escherichia coli. J Clin Microbiol 2006, 44:1347-1351. 89. Suetens C. Healthcare-associated infections in European long-term care facilities: How big is the challenge? Euro Surveill. 2012, 17(35):pii=20259 90. Suljagic V, Cobeljic M, Jankovic S, Mirovic V, Markovic-Denic L, Romic P and Mikic D:Nosocomial bloodstream infections in ICU and non-icu patients. Am J Infect Control 2005, 33:333-340 91. Summers AO: Genetic linkage and horizontal gene transfer, the roots of the antibiotic multi-resistance problem. Anim Biotechnol 2006, 17:125-135 92. Sunde M. Prevalence and characterization of class 1 and class 2 integrons in Escherichia coli isolated from meat and meat products of Norwegian origin. Journal of Antimicrob Chemother 2005, 56:1019-1024 93. Sunde M, Sorum H. Self-transmissible multidrug resistance plasmids in Escherichia coli of the normal intestinal flora of healthy swine. Microb Drug Resist 2001, 7:191-196 94. Tzelepi E, Magana Ch, Platsouka E, Sofianou D, Paniara O, Legakis NJ, Vatopoulos AC, Tzouvelekis LS. Extended-spectrum β-lactamase types in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in two Greek hospitals. Inter Journal of Antimicrob Agents, 2003, 21 (3): 285-288 95. Τριχόπουλος. Επιδηµιολογία. Αρχές, µέθοδοι, εφαρµογές. Εκδόσεις Παρισιάνου. Αθήνα 1982 96. Tumbarello M, Trecarchi EM, Fiori B, Losito AR, D Inzeo T, Campana L, Ruggeri A, Di Meco E, Libeto E, Fadda G, Cauda R and Spanu T: Multidrug-resistant Proteus mirabilis bloodstream infections: Risk factors and outcomes. Antimicrob Agents Chemother 2012, 56:3224-3231 97. Tumbarello M, Spanu T, Di Bidino R, Marchetti M, Ruggeri M, Trecarichi EM, De Pascale G, Proli EM, Cauda R, Cicchetti A and Fadda G. Costs of bloodstream infections caused by Escherichia coli and influence of Extended-Spectrum-β-Lactamase production and inadequate initial antimicrobial treatment..antimicrob Agents Chemother 2010, 54:4085-4091 98. Tumbarello M, Sanguinetti M, Montuori E, Trecarichi EM, Posteraro B, Fiori B, Citton R, D Inzeo T, Fadda G, Cauda R and Spanu T: Predictors of mortality in patients with bloodstream infections caused by Extended- Spectrum-β-Lactamase producing Enterobacteriaceae: Importance of inadequate initial antimicrobial treatment. Antimicrob Agents Chemother 2007, 51:1987-1994 140

99. Vardakas KZ, Rafailidis PI, Konstantelias AA, Falagas ME: Predictors of mortality in patients with infections due to multi-drug resistant Gram negative bacteria: The study, the patient, the bug or the drug? J Infect 2012, article in press 100. Vassilakopoulou A, Psichogiou M, Tzouvelekis L, Tassios P, Kosmidis C, Petrikkos G, Roma E, Charvalos E, Passiotou M, Avlami A and Daikos G. Prevalence and characterization of class 1 integrons in Escherichia coli of poultry and human origin. Foodborne pathogens and disease 2009,6(10):1211-1218 101. Vatopoulos A. High rates of metallo-β-lactamase producing Klebsiella pneumoniae in Greece-a review of the current evidence. Euro Surveill 2008, 13(4):pii=8023 102. Vourli, S., H. Tsorlini, H. Katsifa, M. Polemis, L. S. Tzouvelekis, A.Kontodimou, and A. C. Vatopoulos.. Emergence of Proteus mirabilis carrying the blavim-1 metallo-β-lactamase gene. Clin. Microbiol. Infect. 2006, 12:691 694. 103. Webster DP, Young BC, Morton R, Collyer D, Batchelor B, Turton JF, Maharjan S, Livermore DM, Bejon P, Cookson BD, Bowler IC: Impact of a clonal outbreak of extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in the development and evolution of bloodstream infections by K. pneumoniae and Escherichia coli an 11 year experience in Oxford shire, UK. J Antimicrob Chemother 2011, 66:2126-2135 104. Weldhagen GF: Integrons and β-lactamases a novel perspective on resistance. Int J Antimicrob Agents 2004, 23:556-562 105. White PA, McIver CJ, Rawlinson WD: Integrons and gene cassettes in the Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45:2658-2661 106. Ye Y, Li JB, Ye DQ, Jiang ZJ: Enterobacter bacteremia: Clinical features, risk factors for multiresistance and mortality in a Chinese university hospital. Infection 2006, 34:252-257 141

Παράρτηµα ΚΑΡΤΕΛΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΗΣ ΛΟΙΜΩΞΗΣ ΚΩ ΙΚΟΣ ΑΣΘΕΝΟΥΣ ΕΠΩΝΥΜΟ ΟΝΟΜΑ ΦΥΛΟ ΕΤΟΣ ΓΕΝΝΗΣΗΣ 1. ΑΝ ΡΑΣ 2. ΓΥΝΑΙΚΑ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ: 1. Ασθενής 0 µάρτυρας ΚΛΙΝΙΚΗ ΘΑΛΑΜΟΣ ΗΗ ΜΜ ΕΕΕΕ Ηµεροµηνία εισαγωγής στo voσoκoµείo Ηµεροµηνία συµπλήρωσης του ερωτηµατολογίου Ηµέρες νοσηλείας ως την συµπλήρωση του ερωτηµατολογίου ιακοµιδή από άλλο νοσοκοµείο 0 για Όχι 1 για Ναι Αν ναι, ποιο νοσοκοµείο Εκεί, νοσηλεύθηκε σε ΜΕΘ 0 για Όχι 1 για Ναι Ηµέρες. Νοσηλείας στο άλλο νοσοκοµείο Αν όχι, έχει ξανανοσηλευθεί σε νοσοκοµείο το τελευταίο 3µηνο? 0 για Όχι 1 για Ναι ΑΙΤΙΑ ΕΙΣΟ ΟΥ Υπoκείµεvo νόσηµα

ΕΝ ΟΓΕΝΕΙΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝ ΥΝΟΥ Βαρύτητα Πολύ καλή γενική κατάσταση Μέτρια γενική κατάσταση, µερική αυτοεξυπηρέτηση Κατάκοιτος 0 1 2 Σηµειώνεται η παρουσία: Σχόλια 0 για Όχι Σακχαρώδους ιαβήτη Κίρρωσης ήπατος Χ.Α.Π. Καρδιακής ανεπάρκειας Νεφρικής ανεπάρκειας Νεοπλάσµατος 1 για Ναι Αίµατος Συµπ. Οργάνων Σηµειώνεται η παρουσία έως 72 ώρες πριν την λοίµωξη: Πολυµορφοπύρηνα <1.000 κκχ. Υπολευκωµατιναιµίας (<3gr/dl) Μετάγγιση αίµατος & παραγώγων (το τελευταίο µήνα) Άλλο Σχόλια 0 για Όχι 1 για Ναι Σηµειώνεται η λήψη φαρµάκων (πλην αντιβιοτικών) τον τελευταίο µήνα πριν την είσοδο Χηµειοθεραπεία (αντινεοπλασµατική) Σχόλια 0 για Όχι 1 για Ναι Κορτικοστεροειδή Γαστροπροστατευτικά Είδος γαστροπροστατευτικού Άλλο φάρµακο Είδος

Παρουσία παρεµβατικών τεχνικών έως 72 ώρες πριν την λοίµωξη Σχόλια Ουροκαθετήρας 0 για Όχι 1 για Ναι Ηµέρες Κλειστός Ανοικτός Ενδοφλέβια παροχή Ηµέρες Κεντρική Περιφερική Άλλες παρεµβ. Τεχνικές Περιγραφή Ηµέρες Περιγραφή Ηµέρες Περιγραφή Ηµέρες Χειρουργική επέµβαση στην παρούσα νοσηλεία στο νοσοκοµείο Aριθµός Επεµβάσεων Είδος Είδος Είδος Σχόλια Ηµ/νία Ηµ/νία Ηµ/νία

ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ (ΩΣ 3 ΜΗΝΕΣ ΠΡΙΝ ΤΗΝ ΛΟΙΜΩΞΗ) Είδος ιάρκεια (ηµεροµηνίες χορήγησης) Από (ηη/µµ/εεεε) Έως(ηη/µµ/εεεε) ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ Είδος Σχόλια 0 για Όχι 1 για Ναι Συνοδός Σηψαιµία Ηµ/vία έvαρξης λoίµωξης Ηµέρες νoσηλείας πριν την λoίµωξη Ηµέρες νοσηλείας µετά την λοίµωξη Κλιvικό Υλικό που καλλιεργήθηκε Μικρόβιo Κλινική έκβαση λοίµωξης (σηµειώστε όποιο ταιριάζει καλύτερα) Μικροβιολογική έκβαση λοίµωξης Κατηγoρία µικρoβίoυ (είδoς + αvτoχή) 1. ίαση 2. Βελτίωση 3. Θάνατος

Θεραπεία Είδος Αντιβιοτικού Από (ηη/µµ/εεεε) ιάρκεια (ηµεροµηνίες χορήγησης) Έως(ηη/µµ/εεεε) ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Πορεία ασθενούς (σηµειώστε όποιο ταιριάζει καλύτερα) Συνολικές ηµέρες νοσηλείας 1. ίαση 2. Βελτίωση 3. Θάνατος

Ενδεικτικές εικόνες πειραµάτων 1. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για µαζικό έλεγχο (screening) ύπαρξης ιντεγκρονίων τάξης 1 Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1,5% των προϊόντων της PCR για ενίσχυση του γονιδίου IntI1. 1,4,5,8: στελέχη θετικά για ιντεγκρόνιο τάξης 1 και 2,3,6,7: στελέχη αρνητικά για ιντεγκρόνιο τάξης 1, 9: αρνητικός µάρτυρας, 10: θετικός µάρτυρας, 2. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για µελέτη του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων τάξης 1 Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1% των προϊόντων της PCR για προσδιορισµό του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων τάξης 1. 4,5,7,8,10,12: στελέχη µε προσδιορίσιµο µέγεθος µεταβλητής περιοχής, 13: αρνητικός µάρτυρας, 14: θετικός µάρτυρας.

3.Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για µαζικό έλεγχο (screening) ύπαρξης ιντεγκρονίων τάξης 2 Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ladder Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1,5% των προϊόντων της PCR για την ενίσχυση του γονιδίου της Ιντεγκράσης τάξης 2 2,4,6,7,8,9,15: στελέχη θετικά για ιντεγκρόνιο τάξης 2, 1,3,5,10,11,12,13,14,16: στελέχη αρνητικά για ιντεγκρόνιο τάξης 2, 17: αρνητικός µάρτυρας, 18: θετικός µάρτυρας 4.Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για τον προσδιορισµό του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων τάξης 2 (ΙntI2f-aadA1R) Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1% των προϊόντων της PCR για προσδιορισµό του µεγέθους της µεταβλητής περιοχής των ιντεγκρονίων τάξης 2. Στελέχη 2, 3,5,7,8,10: Στελέχη µε µετρήσιµο µέγεθος µεταβλητής περιοχής ιντεγκρονίου τάξης 2, 1, 4,6,9: στελέχη µε µη µετρήσιµο µέγεθος µεταβλητής περιοχής του ιντεγκρονίου τάξης 2

5.Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για ενίσχυση γονιδίου bla VIM Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ladder Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1,5% των προϊόντων της PCR για την ενίσχυση του γονιδίου bla VIM. 2,3,6,7: στελέχη θετικά για το γονίδιο bla VIM., 9: αρνητικός µάρτυρας, 8: θετικός µάρτυρας 6. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για τη χαρτογράφηση VIMιντεγκρονίων Α) Vato2(5 CS)-VIMc2 273 274 130 288 trc285 trc134 blank Ladder Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1% των προϊόντων της PCR για χαρτογράφηση της µεταβλητής περιοχής των VIM ιντεγκρονίων

Β) VIMc1-Vato3(3 CS) 273 274 130 288 κενό trc285 trc 134 blank ladder Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1% των προϊόντων της PCR για χαρτογράφηση της µεταβλητής περιοχής των VIM ιντεγκρονίων. Γ) VIMc1-aadA1R 273 274 130 288 trc285 trc134 blank ladder Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1% των προϊόντων της PCR για χαρτογράφηση της µεταβλητής περιοχής των VIM ιντεγκρονίων. ) VIMc1-dhfrR 273 274 130 288 trc285 trc134 blank ladder Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1% των προϊόντων της PCR για χαρτογράφηση της µεταβλητής περιοχής των VIM ιντεγκρονίων.

7.Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για ενίσχυση του γονιδίου blacmy 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ruller 155 213 270 281 289 292 2a (-) (+) Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1,5% των προϊόντων της PCR για την ενίσχυση του γονιδίου blavim. 1,2,3,4,5,7: στελέχη θετικά για το γονίδιο blacmy 8: αρνητικός µάρτυρας, 9: θετικός µάρτυρας 8.Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) για χαρτογράφηση του γονιδίου blacmy. Α) 5 άκρο KOXf (ISEcp1/F) -E7/R Ruller 155 213 270 281 289 292 2a (+) (-) Β) 3 άκρο Ε4/F- SugE/R Ruller 155 213 270 281 289 292 (-) (+)

9. ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus 2-Polymerase Chain Reaction) Στελέχη K.pneumoniae VIM-θετικά τύπος Α Α Α Α Α Α Β Β Γ Β Β Β Β

10. PFGE P.mirabilis Ladder Πολυανθεκτικά, CMY-αρνητικά Πολυανθεκτικά, CMY-θετικά Ευαίσθητοcontrol

11. Bακτηριακή σύζευξη Αντιβιόγραµµα δότη K.pneumoniae 134 (VIM+ESBL) ESBLανιχνεύσιµο µόνο αν DDST στα 20mm AMC ATM AMC ATM AMC ATM Αντιβιόγραµµα δέκτη E.coli 1R716 Αντιβιόγραμμα διασυζευκτικού κλώνου trc 134

Αντιβιόγραµµα δότη K.pneumoniae 285 (VIM) AMC ATM AMC ATM Αντιβιόγραμμα διασυζευκτικού κλώνου trc 285 Αντιβιόγραµµα δέκτη E.coli 1R716 Έλεγχος µε PCR για το γονίδιο blavim στους διασυζευκτικούς κλώνους trc 134 και trc 285 trc134 trc 285 VIM(+) blank ruller