ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μελέτη της ρινικής φορείας Staphylococcus aureus σε παιδιατρικό πληθυσμό παιδιατρικού Νοσοκομείου κατά τη χρονική περίοδο 2011-2015» Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: κα Κυριαζοπούλου Βενετσάνα ΓΕΩΡΓΟΥΛΙΑ Δ. ΓΕΩΡΓΙΑ Α.Μ.: 2303 Πάτρα, 2017 Σελίδα 1 από 83

ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μελέτη της ρινικής φορείας Staphylococcus aureus σε παιδιατρικό πληθυσμό παιδιατρικού Νοσοκομείου κατά τη χρονική περίοδο 2011-2015» Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: κα Κυριαζοπούλου Βενετσάνα ΓΕΩΡΓΟΥΛΙΑ Δ. ΓΕΩΡΓΙΑ Α.Μ.: 2303 Πάτρα, 2017 Σελίδα 2 από 83

ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: Βενετσάνα Κυριαζοπούλου Καθηγήτρια Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας, Πρύτανις Πανεπιστημίου Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1) Κυριαζοπούλου Βενετσάνα, Καθηγήτρια Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας Πανεπιστημίου Πατρών. 2) Γώγος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογίας Πανεπιστημίου Πατρών 3) Βανταράκης Απόστολος, Αναπλ. Καθηγητής Υγιεινής Πανεπιστημίου Πατρών Σελίδα 3 από 83

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πίνακας Περιεχομένων 4 Αφιέρωση 6 Ευχαριστίες 8 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9 Εισαγωγή 10 Ανατομία της μύτης 10 Φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα 12 Μικροβιοφορία 12 Σταφυλόκοκκος 14 Γενικά στοιχεία 14 Χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus) 16 Ένζυμα και τοξίνες 18 Μικροβιακή αντοχή 21 Σύντομη ιστορική αναδρομή 23 Κλινική σημασία 24 Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) 25 Πρόληψη λοίμωξης από MRSA 26 Επιδημιολογικά στοιχεία-mrsa 27 Επιδημιολογικά στοιχεία ρινικής φορείας Staph. aureus 31 Επιδημιολογικά στοιχεία ρινικής φορείας MRSA 33 2. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 35 Σκοπός 36 Υλικό-Μέθοδοι 36 Αποτελέσματα 52 Σελίδα 4 από 83

Συζήτηση 62 3. Περίληψη (Ελληνικά) 66 4. Περίληψη (Αγγλικά) 68 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 70 Σελίδα 5 από 83

Σελίδα 6 από 83 Στους γονείς μου

Σελίδα 7 από 83

Ευχαριστίες Αρχικά θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στην Επιβλέπουσα της διπλωματικής αυτής εργασίας, κα Βενετσάνα Κυριαζοπούλου, Καθηγήτρια Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας και Πρύτανη του Πανεπιστημίου Πατρών, για την ανάθεση της παρούσης μελέτης και την άριστη συνεργασία μας καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησής της. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω τον κον Χαράλαμπο Γώγο, Καθηγητή Παθολογίας και τον κον Βανταράκη Απόστολο, Αναπληρωτή Καθηγητή Υγιεινής, για την τιμή που μου έκαναν να συμμετάσχουν στην τριμελή επιτροπή αυτής της διπλωματικής εργασίας. Επιπροσθέτως, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την κα Αντωνία Μακρή, καθώς και την κα Δασκαλάκη Μαρία, Διευθύντρια και Επιμελήτρια αντίστοιχα του Μικροβιολογικού Τμήματος του Γ. Ν. Παίδων Πεντέλης, για την άριστη συνεργασία τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στον σύζυγό μου Πέτρο, για την ανιδιοτελή συνεργασία του, την αγάπη, την ηθική στήριξη και το χρόνο που αφιέρωσε προκειμένου να πραγματοποιηθεί το παρόν εγχείρημα. Τέλος, και πάνω από όλα, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στους γονείς μου για την αμέριστη αγάπη, τη συνεχή στήριξη και ενθάρρυνση που μου παρέχουν σε όλα μου τα βήματα. Σελίδα 8 από 83

1.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σελίδα 9 από 83

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΗΣ ΜΥΤΗΣ (1-3) Η μύτη είναι ένα πολύπλοκο όργανο όσον αφορά την κατασκευή και τη λειτουργία του. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αναπνοή, την αίσθηση της όσφρησης και συμβάλλει στην γενικότερη αισθητική του προσώπου. Προβλήματα που αφορούν τη μύτη μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά την αναπνοή, ενώ μπορεί να προκύψουν, μεταξύ άλλων, διαταραχές της όσφρησης, καθώς και κεφαλαλγία. Ανατομικά η μύτη χωρίζεται σε δύο μέρη, το εξωτερικό και το εσωτερικό. Το εξωτερικό μέρος, η έξω ρις, είναι η κατασκευή εκείνη, σχήματος τρίπλευρης πυραμίδας, που προεξέχει από το πρόσωπο και προσφύεται στο μέτωπο με τη ρίζα της ρινός. Η ελεύθερη κορυφή της, το ακρορίνιο, καταλήγει σε δύο εξωτερικά στόμια, τους ρώθωνες ή μυκτήρες. Κάθε ένας από αυτούς αποτελείται προς τα έξω από το πτερύγιο της ρινός, ενώ προς τα έσω από το ρινικό διάφραγμα. Ο σκελετός της έξω ρινός σχηματίζεται προς τα άνω από τα ρινικά οστά, τις μετωπιαίες αποφύσεις της άνω γνάθου και τη ρινική απόφυση του μετωπιαίου οστού, ενώ προς τα κάτω σχηματίζεται από τον άνω και κάτω ρινικό χόνδρο αλλά και τον χόνδρο του διαφράγματος. Το εσωτερικό μέρος αποτελείται από τα στοιχεία εκείνα που εισχωρούν στην κοιλότητα του προσώπου. Χωρίζεται από το ρινικό διάφραγμα σε δύο κοιλότητες, τις ρινικές θαλάμες. Το ρινικό διάφραγμα αποτελείται από τον τετράπλευρο χόνδρο, την ύνιδα και το κάθετο πέταλο του ηθμοειδούς οστού. Κάθε μία από τις ρινικές θαλάμες παρουσιάζουν την είσοδο που ονομάζεται πρόδρομος, την κυρίως θαλάμη και το οπίσθιο άκρο που καταλήγει στον ρινοφάρυγγα μέσω των ρινικών χοανών. Κάθε Σελίδα 10 από 83

ρινική θαλάμη διακρίνεται σε κάτω τοίχωμα ή έδαφος, άνω τοίχωμα ή οροφή και έσω τοίχωμα. Στο έξω τοίχωμα απαντώνται οι ρινικές κόγχες (άνω, μέση, κάτω), με την περιοχή μεταξύ αυτών να ορίζει τους αντίστοιχους ρινικούς πόρους. Οι ρινικές θαλάμες καλύπτονται, εκτός από την περιοχή του προδρόμου, από δύο ειδών βλεννογόνο, τον αναπνευστικό και τον οσφρητικό. Ο αναπνευστικός βλεννογόνος επενδύει το κάτω τμήμα των ρινικών θαλαμών, με το επιθήλιο εδώ να είναι ψευδοπολύστιβο κροσσωτό, ενώ στις λειτουργίες του συμπεριλαμβάνονται η εφύγρανση, το φιλτράρισμα και η θέρμανση του εισπνεόμενου αέρα. Ο οσφρητικός βλεννογόνος καλύπτει το άνω τμήμα της άνω ρινικής κόγχης καθώς επίσης και την ανώτερη περιοχή του ρινικού διαφράγματος και της ρινικής θαλάμης. Εξυπηρετεί την αίσθηση της όσφρησης υποδεχόμενος τα οσφρητικά ερεθίσματα μέσω εξειδικευμένων νευρικών κυττάρων των οποίων οι κεντρικοί άξονες διέρχονται μέσα από το τετρημένο πέταλο του ηθμοειδούς για να καταλήξουν στον οσφρητικό λοβό. Η νεύρωση για την γενική αισθητικότητα της ρινικής κοιλότητας προέρχεται από το τρίδυμο νεύρο και δύο κλάδους αυτού, το οφθαλμικό και το άνω γναθικό νεύρο. Το κύτος της ρινός αιματούται, κυρίως, από την σφηνοϋπερώια αρτηρία, η οποία αποτελεί κλάδο της έσω γναθιαίας αρτηρίας, Αιμάτωση δέχεται και από την πρόσθια και οπίσθια ηθμοειδή αρτηρία καθώς και από κλάδους της έξω γναθιαίας αρτηρίας. Σελίδα 11 από 83

Φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα (4-7) Ο όρος «φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα» χρησιμοποιείται προκειμένου να περιγράψει τον πληθυσμό εκείνο των μικροοργανισμών που διαβιούν στο δέρμα και τους βλεννογόνους των υγιών φυσιολογικών ατόμων. Διάφορες έρευνες ως τώρα έχουν δείξει ότι αποτελεί μια πρώτη γραμμή άμυνας κατά παθογόνων μικροοργανισμών, δρουν συνεπικουρικά στην πέψη, συμμετέχουν στην αποδόμηση διαφόρων τοξινών, και συμβάλλουν στην ωρίμανση του ανοσοποιητικού συστήματος. Αποτελείται από μικροοργανισμούς των οποίων οι φυσιολογικές, μορφολογικές και γενετικές ιδιότητες τους επιτρέπουν να αποικίζουν και να πολλαπλασιάζονται κάτω από τις συνθήκες που επικρατούν σε συγκεκριμένες θέσεις, να συνυπάρχουν με τους άλλους μικροοργανισμούς που αποικίζουν τις συγκεκριμένες περιοχές. Οι διάφοροι μικροοργανισμοί που απαρτίζουν τη φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα μπορεί να έχουν μια συμβιωτική σχέση με τον ξενιστή η οποία είτε θα είναι επωφελής για αυτόν είτε ουδέτερη. Διακρίνονται σε μόνιμη, σταθερή μικροβιακή χλωρίδα όπου ανήκουν μικροοργανισμοί που συνήθως και σταθερά απομονώνονται από συγκεκριμένες ανατομικές θέσεις και στην παροδική μικροβιακή χλωρίδα η οποία αποτελείται από μη παθογόνους ή δυνητικά παθογόνους μικροοργανισμούς οι οποίοι αποικίζουν παροδικά το δέρμα ή τους διάφορους βλεννογόνους. Η παροδική μικροβιακή χλωρίδα δεν προκαλεί νόσο στον ξενιστή εφόσον η μόνιμη μικροβιακή χλωρίδα δεν διαταράσσεται, άλλως οι μικροοργανισμοί που την απαρτίζουν πολλαπλασιάζονται και μπορούν να γίνουν παθογόνοι. Μικροβιοφορία Ο όρος «μικροβιοφορία» χρησιμοποιείται προκειμένου για να περιγράψει την κατάσταση κατά την οποία ανευρίσκονται δυνητικά παθογόνοι μικροοργανισμοί σε Σελίδα 12 από 83

συγκεκριμένες ανατομικές θέσεις. Παράδειγμα τέτοιας κατάστασης αποτελεί το γεγονός ότι ο Streptococcus pneumoniae και η Neisseria meningitidis, αιτίες όπως είναι γνωστό πνευμονίας και μηνιγγίτιδας αντίστοιχα, μπορεί να απομονωθούν από τον φάρυγγα του 5-40% των υγιών ατόμων (6, 7). Οι ρώθωνες της μύτης έχουν παρόμοια μικροβιακή χλωρίδα με το δέρμα, ενώ είναι η κύρια εστία φορείας του χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου, ο οποίος απομονώνεται σε ένα 25-30% των υγιών ατόμων ως χρόνια φορεία, ενώ ένα επιπλέον 30-60% είναι παροδικοί περιστασιακοί φορείς (transient) ή παρουσιάζουν με διαλείποντα τρόπο περιόδους φορείας (intermittent). Μπορεί οι συνηθέστερες θέσεις αποικισμού του Staphylococcus aureus να είναι οι ρώθωνες, αλλά ο συγκεκριμένος μικροοργανισμός αποικίζει και τις μασχαλιαίες κοιλότητες, το περίνεο, τον λάρυγγα, τη περιπρωκτική περιοχή, καθώς και τα χέρια και τους όνυχες. Χρησιμοποιώντας συμβατικές μεθόδους καλλιεργειών, η συχνότητα ανέρχεται περίπου στο 20% για το περίνεο και 5-10% για τα μεσοδακτύλια διαστήματα των ποδών και τις μασχαλιαίες κοιλότητες (8, 9). Η μικροβιοφορία του χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου στις ρινικές κοιλότητες καθώς και στο δέρμα ξεκινά μόλις λίγες μέρες μετά την γέννηση των νεογνών και φθάνει να απομονώνεται στο 100% των νεογνών την πρώτη εβδομάδα ζωής αυτών, ενώ στη συνέχεια το ποσοστό αυτό μειώνεται σε περίπου 25% μέχρι και την ηλικία των 6 ετών απ όπου πλέον αγγίζει τα ποσοστά του γενικού πληθυσμού (25-30%) (5). Γενικότερα η μικροβιακή χλωρίδα της μύτης περιλαμβάνει επίσης και corynobacteria, στρεπτόκοκκους καθώς και Staphylococcus epidermidis. Περαιτέρω, από τον ρινοφάρυγγα απομονώνονται σε υγιείς φορείς οι δυνητικά παθογόνοι μικροοργανισμοί Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, καθώς και group A streptococci, ενώ μέλη της μόνιμης μικροβιακής Σελίδα 13 από 83

χλωρίδας αποτελούν είδη της Neisseria, πρασινίζοντες στρεπτόκοκκοι, Moraxella και Peptostreptococcus (6, 7). Σταφυλόκοκκος (4-7) Γενικά στοιχεία Οι σταφυλόκοκκοι αφορούν σφαιρικούς Gram θετικούς (+) κόκκους διαμέτρου περίπου 1 μm. Είναι δυνητικά αναερόβιοι, καταλάση θετικοί μικροοργανισμοί ενώ το όνομά τους προέρχεται από τις ελληνικές λέξεις σταφύλι και κόκκος, μιας και στο μικροσκόπιο φαίνεται να διατάσσονται σε ακανόνιστες συστάδες ομοιάζουσες με τσαμπί από σταφύλι. Ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των Micrococcaceae που περιλαμβάνει και το γένος Micrococcus, από το οποίο διαχωρίζονται βάσει της ικανότητας τους να διασπούν την γλυκόζη αερόβια και αναερόβια, εν αντιθέσει με τα μέλη του τελευταίου που το πραγματοποιούν μόνον υπό αερόβιες συνθήκες. Το γένος του σταφυλόκοκκου περιλαμβάνει 40 διαφορετικά είδη βακτηρίων, από τα οποία τα περισσότερα είναι ακίνδυνα και διαβιούν ως μέλη της φυσιολογικής χλωρίδας σε διάφορες περιοχές του ανθρώπινου σώματος και κυρίως στο δέρμα και στους βλεννογόνους, όπως αυτούς του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος. Οι σταφυλόκοκκοι δύνανται να αναπτυχθούν in vitro σε ένα πλήθος καλλιεργητικών υλικών υπό αερόβιες ή δυνητικά αναερόβιες συνθήκες και σε θερμοκρασία 37 ο C, ενώ σε θερμοκρασία δωματίου σχηματίζουν ιδανικά τη χρωστική που χαρακτηρίζει τις αποικίες τους. Αξιοσημείωτο είναι ότι υπό αναερόβιες συνθήκες δεν παράγουν αυτήν τη χρωστική. Οι σταφυλόκοκκοι αντέχουν στην ξηρασία, τις υψηλές συγκεντρώσεις άλατος (9% NaCl) αλλά και τις υψηλές θερμοκρασίες, επιβιώνοντας στους 50 ο C για 30 λεπτά και ως εκ τούτου, είναι καλά προσαρμοσμένοι στο ενδιαίτημά τους, το ανθρώπινο σώμα. Σελίδα 14 από 83

Παρόλα ταύτα, είναι μπορούν και εύκολα σχετικά να εξουδετερωθούν από συγκεκριμένες χημικές ουσίες όπως π.χ. η hexachlorophene 3%. Το πολυσακχαριδικό τοίχωμα των σταφυλόκοκκων περιέχει πεπτιδογλυκάνη η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά την διάρκεια μιας λοίμωξης, ενεργοποιώντας το συμπλήρωμα, προκαλώντας την παραγωγή IL-1 και οψωνινοποιών αντισωμάτων και δρώντας χημειοτακτικά για τα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα. Το κυτταρικό τοίχωμα τους περιέχει ακόμα τειχοϊκά οξέα, ενώ κάποια στελέχη Staphylococcus aureus φέρουν στην επιφάνεια τους την πρωτεΐνη Α καθώς και ένα πολυσακχαριδικό έλυτρο. Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus) αποτελεί τον κύριο παθογόνο μικροοργανισμό, ενώ ακολουθεί ο Staphylococcus epidermidis. Ο τελευταίος, μαζί με τους υπόλοιπους σταφυλόκοκκους, αποτελούν μια ομάδα που ονομάζεται κοαγκουλάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι ή αλλιώς coagulase negative. Αυτοί οι κοαγκουλάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι αποικίζουν φυσιολογικά το δέρμα και προκαλούν αφενός ευκαιριακές λοιμώξεις σε ασθενείς με ξένα σώματα ή προσθετικές συσκευές (Staphylococcus epidermidis) και αφετέρου λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος (Staphylococcus saprophyticus). Το γεγονός ότι ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος είναι αυτός που μελετήθηκε, αλλά και μελετάται ακόμα, φανερώνει τη μεγάλη σημασία που έχει ως παθογόνος μικροοργανισμός καθώς και τις σοβαρές επιπτώσεις που μπορεί να συνοδεύσουν μια λοίμωξη από αυτόν. Σελίδα 15 από 83

Χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus) (4-7) Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος είναι ένας Gram θετικός, ακίνητος, μη σπορογόνος κόκκος, με διάμετρο περίπου 1μm. Διατάσσεται, όπως και τα άλλα μέλη του ιδίου γένους, σε αθροίσματα που μοιάζουν με τσαμπιά από σταφύλια. Μετά την καλλιέργεια του σε κατάλληλα θρεπτικά υλικά και την επώασή του για 24 ώρες στους 37 ο C, οι αποικίες του είναι κυκλικές με ομαλή γυαλιστερή επιφάνεια, αδιαφανείς και συχνά εμφανίζουν ένα χαρακτηριστικό χρυσοκίτρινο χρώμα απ όπου έλαβαν και το όνομά τους (aureus, χρυσίζων). Χαρακτηρίζεται από την ικανότητά του να προκαλεί πήξη του πλάσματος in vitro, λόγω της παρουσίας του ενζύμου πηκτάσης ή Εικόνα 1. Staphylococcus aureus. (10) κοαγκούλασης. Εικόνα 2. Τρυβλίο φέρον καλλιέργεια Staph. aureus σε αιματούχο άγαρ. Ο διαχωρισμός του από το στρεπτόκοκκο γίνεται με την αντίδραση της καταλάσης, ενώ με την αντίδραση της θερμοανθεκτικής DNase πραγματοποιείται η διαφοροποίηση του από τους κοαγκουλάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους (CoNS). Συγκεκριμένα η δοκιμασία Dnase ελέγχει την παρουσία της εξωκυττάριας DNάσης Σελίδα 16 από 83

που υδρολύει το αδιάλυτο σε ΗCL DNA σε διαλυτά ολιγονουκλεοτίδια. Τα στελέχη Staph. aureus, μόνον, παράγουν μια θερμοανθεκτική DNase η οποία δεν καταστρέφεται στους 100ºC για 15 min, ενώ το αντίστοιχο ένζυμο των άλλων βακτηρίων είναι ευαίσθητο στη θερμοκρασία και καταστρέφεται μετά από θέρμανση σε θερμοκρασία >44ºC. C. Η δοκιμασία καταλάσης, χρησιμοποιείται προκειμένου για τον έλεγχο παραγωγής του ενζύμου καταλάση, που διασπά το παραγόμενο κατά τη διάσπαση των υδατανθράκων υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) σε Η 2 Ο και Ο 2. Έτσι προστίθεται μια σταγόνα διαλύματος 3% υπεροξειδίου του υδρογόνου πάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα μαζί με δείγμα καθαρής αποικίας. Σε περίπτωση παρουσίας του ενζύμου, οπότε και η δοκιμασία χαρακτηρίζεται θετική, παρατηρείται ο σχηματισμός φυσαλίδων λόγω απελευθέρωσης οξυγόνου. Εικόνα 3. Αντίδραση καταλάσης. Εικόνα 4. Αντίδραση DNase. Πέραν του πεπτιδογλυκανικού τοιχώματος, το οποίο περιέχει τειχοϊκά οξέα, ο S. aureus φέρει στην επιφάνειά του και την πρωτεΐνη Α η οποία παρά το ότι στο μεγαλύτερο μέρος της συνδέεται με την πεπτιδογλυκάνη, μέρος αυτής απαντάται και ελεύθερο στο περιβάλλον. Η πρωτεΐνη αυτή ανήκει σε μια ευρύτερη ομάδα Σελίδα 17 από 83

προσκολλητινών (adhesins) που ονομάζονται MSCRAMMS (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) και μέσω των οποίων συνδέονται με τα κύτταρα του ξενιστή. Ειδικότερα, η πρωτεΐνη Α συνδέεται μη ειδικά με το Fc τμήμα των ανοσοσφαιρινών (κυρίως IgG, εκτός της IgG 3 ) και αυτή της η σύνδεση είναι που προκαλεί μια σειρά από βιολογικά φαινόμενα, όπως η αναστολή της οψωνινοποιού δράσεως των αντισωμάτων, τα οποία και εξυπηρετούν τον αποικισμό και την εισβολή των σταφυλόκοκκων στον ξενιστή. Τα περισσότερα στελέχη S. aureus, και έχοντα κλινική σημασία, διαθέτουν στο εξωτερικό τους και μια πολυσακχαριδική κάψα η οποία τα προστατεύει από την φαγοκυττάρωση από τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα. Ένζυμα και τοξίνες (4-7) Οι τοξίνες αυτές είναι υπεύθυνες για πολλές διαταραχές που προκαλούνται στον άνθρωπο ενώ, μεταξύ άλλων, κάποια από τα ένζυμα χρησιμοποιούνται και για την τυποποίηση του μικροοργανισμού. Αρχικά, οι σταφυλόκοκκοι μπορούν να παράγουν καταλάση, ένα ένζυμο το οποίο μετατρέπει το υπεροξείδιο του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο και το οποίο τους διαχωρίζει από τους στρεπτόκοκκους οι οποίοι δεν το διαθέτουν. Ο Staph. aureus παράγει χαρακτηριστικά κοαγκουλάση ή πηκτάση η οποία συνδέεται με την προθρομβίνη μεταπίπτοντας σε ένα ενεργό ενζυμικό σύμπλοκο που προκαλεί τον πολυμερισμό του ινώδους. Επίσης προάγει την εναπόθεση ινώδους στην επιφάνεια των σταφυλόκοκκων γεγονός το οποίο πιθανότατα τους προσδίδει μια σχετική άμυνα έναντι της φαγοκυττάρωσης και της μετέπειτα ενδοκυττάριας αποδόμησης τους. Ο παράγοντας συσσωμάτωσης, ο οποίος παράγεται από τον χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο, ευθύνεται για την προσκόλληση αυτού στο ινώδες και το ινωδογόνο. Έτσι αν αναμιχθεί, πάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα, μια σταγόνα Σελίδα 18 από 83

πλάσματος με δείγμα από αποικία Staph. aureus, τότε θα παρατηρηθεί ο σχηματισμός συσσωματωμάτων με τη μορφή κροκίδων, εξαιτίας της σύνδεσης του ινώδους με τον μικροοργανισμό. Αξίζει να σημειωθεί ότι η κοαγκουλάση και ο μηχανισμός με τον οποίο προκαλεί πήξη του πλάσματος διαφέρει από τον φυσιολογικό μηχανισμό πήξης του πλάσματος μιας και δεν χρειάζεται τη παρουσία ιόντων ασβεστίου και δεν αναστέλλεται από τη δράση της ηπαρίνης. Άλλα ένζυμα τα οποία παράγονται από τους σταφυλόκοκκους είναι η σταφυλοκινάση η οποία προκαλεί διάσπαση του ινώδους, η υαλουρονιδάση, διάφορες πρωτεϊνάσες, λιπάσες και β-λακταμάσες οι οποίες όπως είναι γνωστό τους προσδίδουν αντοχή έναντι των β-λακταμικών αντιβιοτικών. Οι αιμολυσίνες είναι μια άλλη ομάδα ενζύμων που παράγονται από τους σταφυλόκοκκους. Σημαντικότερη αυτών είναι η α-αιμολυσίνη η οποία έχει την δυνατότητα να προκαλεί τη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων αλλά και να δρα επί μιας ευρείας ποικιλίας ευκαρυωτικών μεμβρανών. Άλλες αιμολυσίνες αποτελούν η β, δ και η γ-αιμολυσίνη. Η τελευταία μπορεί να αλληλοεπιδράσει με δύο πρωτεϊνικά τμήματα της Panton-Valentine λευκοκτονίνης (PVL, Panton-Valentine Leucocidin) προκειμένου να σχηματίσει έξι νέες διμερείς τοξίνες οι οποίες λύουν τα λευκά αιμοσφαίρια, οδηγώντας κατά αυτόν τον τρόπο στην απελευθέρωση φλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-8, ισταμίνη, κ.α.) και επακόλουθα στην πρόκληση νεκρώσεων και υψηλής εντάσεως φλεγμονή. Η Panton-Valentine λευκοκτονίνη (PVL), μία ακόμη τοξίνη που παράγεται από τους σταφυλόκοκκους και συγκεκριμένα από τον CA-MRSA (Community Acquired Methicillin Resistant Staph. Aureus), του οποίου αποτελεί σημαντικό παράγοντα λοιμογονικότητας, είναι υπεύθυνη για την καταστροφή των λευκών αιμοσφαιρίων του ανθρώπου προκαλώντας την απελευθέρωση λυσοσωμιακών ενζύμων εντός του Σελίδα 19 από 83

κυτταροπλάσματος αυτών. Ανακαλύφθηκε το 1894 από τον Van develde, ενώ έλαβε το όνομά της από τους ερευνητές Sir Philip Noel Panton και Francis Valentine όταν πρώτοι αυτοί διαπίστωσαν τη σχέση της με λοιμώξεις μαλακών μορίων το 1932. Τα συγκεκριμένα στελέχη σταφυλόκοκκου, τα οποία παράγουν την ανωτέρω τοξίνη, προκαλούν μια επιθετική μορφή πνευμονίας σε νέα άτομα της οποίας η επίπτωση δείχνει να αυξάνει τα τελευταία έτη και χαρακτηρίζεται από ταχεία εξέλιξη, λευκοπενία και αιμόπτυση. Επιπλέον, έχουν απομονωθεί με συνεχώς αυξανόμενη συχνότητα και από λοιμώξεις μαλακών μορίων. Χαρακτηριστικά, τα στελέχη αυτά MRSA, σε αντίθεση με τα αντίστοιχα ενδονοσοκομειακής προέλευσης, είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά με γνωστή αντισταφυλοκοκκική δράση όπως οι τετρακυκλίνες, οι κινολόνες, η κλυνδαμυκίνη, κ.α. H PVL αποτελείται χαρακτηριστικά από δύο κλάσματα, το F (Fast) και το S (Slow), τα οποία και κωδικοποιούνται από τα γονίδια lukf-pv και luks-pv αντίστοιχα. Στην ομάδα αυτή των τοξινών ανήκουν και η λευκοκτονίνη LukE/D και LukM/F -PV like. Οι επιδερμολυτικές τοξίνες, Α και Β, προκαλούν μια γενικευμένη απολέπιση της επιδερμίδας, προσβάλλοντας το βλεννοπολυσακχαριδικό στοιχείο αυτής. Αποτελούν υπεραντιγόνα, όπως βέβαια και η τοξίνη του τοξικού σταφυλοκοκκικού συνδρόμου (Toxic Shock Syndrome Toxin-1, TSST-1) η οποία παράγεται από την πλειοψηφία των στελεχών χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου και συνδέεται με μόρια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τύπου II (MHC-II) προκαλώντας διέγερση των Τ κυττάρων. Η παραγωγή διαφόρων εντεροτοξινών (A E, G J, K R and U, V) αποτελεί χαρακτηριστική ιδιότητα στελεχών του Staphylococcus aureus και συγκεκριμένα περίπου του 50% αυτών. Θεωρούνται, όπως και η TSST-1, υπεραντιγόνα, ενώ μαζί με τις επιδερμολυτικές τοξίνες κωδικοποιούνται από γονίδια που εδράζονται σε μια Σελίδα 20 από 83

συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή που ονομάζεται νήσος παθογονικότητας. Τέτοια εντεροτοξινογόνα στελέχη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου απομονώνονται συχνά από τη ρινική κοιλότητα υγιών φορέων και ειδικότερα ατόμων που απασχολούνται στον τομέα των τροφίμων. Ευνοϊκά θρεπτικά υποστρώματα για την ανάπτυξη αυτών των στελεχών αποτελούν τα γαλακτομικά προϊόντα και το κρέας, ενώ όσο μεγαλύτερος είναι ο χρόνιος παραμονής του τρόφιμου σε θερμοκρασίες ευνοϊκές για τον πολλαπλασιασμό του μικροοργανισμού τόσο αυξάνεται η παραγωγή εντεροτοξινών. Συχνότερος τύπος εντεροτοξίνης είναι ο τύπος Α η οποία είναι ανθεκτική στην επίδραση οξέων, ενώ δεν χάνει την τοξική της δράση σε θερμοκρασίες έως 100 ο C για 30 λεπτά. Επιπλέον, οι εντεροτοξίνες είναι ανθεκτικές και στην επίδραση των ενζύμων του γαστρεντερικού σωλήνα. Κατανάλωση περίπου 25 μg εντεροτοξίνης B έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση διάρροιας και εμέτων. Ο μηχανισμός με τον οποίο η εντεροτοξίνη προκαλεί έμετο δεν είναι εξακριβωμένος, με έρευνες να δείχνουν ότι οφείλεται πιθανότατα σε κεντρική δράση στο κέντρο του εμέτου στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) μέσω ειδικών υποδοχέων που ανευρίσκονται στον γαστρεντερικό σωλήνα. Επίσης, σύμφωνα με τελευταίες μελέτες φαίνεται ότι μέσω αναστολής της απορρόφησης νατρίου και νερού στο επίπεδο του λεπτού εντέρου, προκαλεί πιθανότατα διάρροιες. Μικροβιακή αντοχή (4-7) Οι σταφυλόκοκκοι φαίνεται να παρουσιάζουν διαφόρου βαθμού ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά μέσω διαφόρων μηχανισμών που περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, την παραγωγή β-λακταμασών που τους προσδίδουν ανθεκτικότητα σε διάφορες πενικιλίνες και ρυθμίζεται από πλασμίδια. Πλασμιδιο-διαμεσολαβούμενη φαίνεται να είναι και η αντίσταση που συχνά παρουσιάζουν και έναντι άλλων αντιβιοτικών όπως οι αμινογλυκοσίδες, τετρακυκλίνη και ερυθρομυκίνη. Σελίδα 21 από 83

Η αντίσταση στην ναφσιλλίνη (nafcillin) καθώς και στην οξασιλλίνη και τη μεθικιλλίνη φαίνεται να μη σχετίζεται με την παραγωγή β-λακταμασών. Ρυθμίζεται από την έκφραση μιας αλληλουχίας γονιδίων που εντοπίζονται σε μια περιοχή του χρωμοσώματος που ονομάζεται SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec) και συγκεκριμένα από το γονίδιο meca το οποίο κωδικοποιεί μια πενικιλλινοδεσμευτική πρωτείνη χαμηλής συγγένειας (PbP2a) για τα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Η δομή της περιοχής αυτής mec του MRSA επιτρέπει την ενσωμάτωση και άλλων γονιδίων που κωδικοποιούν παράγοντες αντοχής στα αντιβιοτικά, με συνέπεια τα συγκεκριμένα στελέχη να είναι πολυανθεκτικά και οι λοιμώξεις που προκαλούν να είναι δύσκολο να αντιμετωπισθούν, ιδίως σε ασθενείς με υποκείμενη νόσο. Έχει πιστοποιηθεί η ύπαρξη 12 διαφορετικών τύπων τέτοιων περιοχών SCCmec, με τους πρώτους τρεις τύπους να θεωρούνται υπεύθυνοι για ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις, ενώ ο τέταρτος έχει βρεθεί σε στελέχη CA-MRSA (Community-Acquired Methicillin-Resistant S. Aureus) που ευθύνονταν για διάφορες εξάρσεις στις ΗΠΑ και την Ευρώπη τα τελευταία έτη και χαρακτηρίζονταν από ασθενέστερη αντίσταση και υψηλότερη μεταδοτικότητα. Ένας άλλος μηχανισμός αντίστασης έχει να κάνει με την αυξημένη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος και διάφορες άλλες αλλαγές σε αυτό που προσδίδουν σε συγκεκριμένα στελέχη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου μια ενδιάμεση αντοχή έναντι της βανκομυκίνης. Τα στελέχη αυτά Staph. Aureus (VISA, Vancomycin-Intermediate Staph. Aureus), τα οποία απαντώνται κυρίως στην Ιαπωνία και τις ΗΠΑ, είναι συνήθως και ανθεκτικά στην ναφσιλλίνη, ενώ είναι ευαίσθητα στις οξαζολιδινόνες και την κινουπριστίνηδαλφοπριστίνη. Ανησυχητική είναι και η ανεύρεση στελεχών χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου με πλήρη αντίσταση στην βανκομυκίνη (VRSA, Vancomycin- Resistant Staph. Aureus) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο αντοχής vana. Σελίδα 22 από 83

Σύντομη ιστορική αναδρομή O Sir Alexander Ogston (1844-1929 μ.χ.) (11) χρησιμοποίησε το 1882 μ.χ. για πρώτη φορά την ονομασία «Staphylococcus» προκειμένου να περιγράψει σφαιρικά βακτήρια τα οποία παρατηρώντας τα στο μικροσκόπιο φαινόταν να διατάσσονται σε σωρούς που έμοιαζαν με τσαμπιά από σταφύλια. Αργότερα, το 1884 μ.χ., ο Anton J. Rosenbach (1842-1923 μ.χ.) (12), ένας Γερμανός χειρουργός, απομόνωσε δύο διαφορετικά στελέχη σταφυλόκοκκου, τον Staphylococcus aureus (χρυσίζων σταφυλόκοκκος) και albus (λευκός, αργότερα επονομασθείς epidermidis), με βάση το χρώμα των σχηματιζόμενων αποικιών κατά την καλλιέργεια τους. Μια πρώτη απόπειρα ορολογικής ταξινόμησης των σταφυλόκοκκων πραγματοποιείται το 1902 μ.χ. από τους Kolle και Otto (13), βασισμένη σε μεθόδους αιμοσυγκόλλησης. Πολύ σύντομα μετά την εισαγωγή της πενικιλίνης ως αποτελεσματική θεραπεία του σταφυλόκοκκου (1941 μ.χ.), την δεκαετία των 50 s άρχισαν να απομονώνονται τα πρώτα ανθεκτικά στελέχη στην πενικιλίνη. Δια τούτο το 1960 εισήχθησαν στην θεραπευτική οι ημισυνθετικές πενικιλίνες (π.χ. μεθικιλλίνη, κ.α.) προκειμένου για την αντιμετώπιση των ανθεκτικών αυτών στελεχών που παρήγαγαν β-λακταμάσες. Είναι το 1961, όμως, στην Αγγλία, που η Patricia Devons (14) απομόνωσε τα πρώτα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη S. aureus (MRSA) από ένα συγκεκριμένο νοσοκομείο της Μ. Βρετανίας και 2 ασθενείς. Ακολούθησαν στη συνέχεια, μεταξύ άλλων και από την ίδια ερευνήτρια και τους συνεργάτες της (T. Parker and P. Jevons) (15), μελέτες προκειμένου να τεκμηριωθεί το ποσοστό και η διασπορά των MRSA στην Αγγλία αλλά και σε άλλες περιοχές της Ευρώπης, καθώς και στην Ασία, την Σελίδα 23 από 83

Αυστραλία και Αμερική (16-20). Παρά την πρόσκαιρη, όπως αποδείχθηκε, παρατηρηθείσα μείωση των περιστατικών λοίμωξης από MRSA την δεκαετία του 1970, τα επόμενα έτη έως και σήμερα σημειώνονται επιδημίες από το συγκεκριμένο ανθεκτικό στέλεχος σε νοσοκομεία διαφόρων χωρών ανά τον κόσμο. Μάλιστα, πλέον απομονώνονται στελέχη που εμφανίζουν ανθεκτικότητα σε ένα ευρύ φάσμα χημειοθεραπευτικών καθώς και στην βανκομυκίνη (Vancomycin Resistant Staph. Aureus, VRSA). Κλινική σημασία (4, 5) Ο Staph. aureus αποικίζει το ρινικό βλεννογόνο των ανθρώπων (του υγιούς πληθυσμού) σε ποσοστό περίπου 30-50%, ενώ συχνά απαντάται και στο δέρμα. Προκαλεί λοιμώξεις σε θέσεις μειωμένης αντίστασης του ξενιστή, όπως σε λύσεις της συνέχειας του δέρματος ή των βλεννογόνων. Πιο συγκεκριμένα ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος καθώς και τα άλλα στελέχη του ιδίου γένους, μπορούν να προκαλέσουν σοβαρές λοιμώξεις διαφόρων ιστών και οργάνων εκ των οποίων μερικές μπορούν να αποτελέσουν απειλή για τη ζωή των πασχόντων ατόμων, όπως: Λοιμώξεις του δέρματος (περίπου 36%). Πιο συγκεκριμένα μπορεί να προκαλέσει δοθιήνωση, θυλακίτιδα, μολυσματικό κηρίο, ψευδάνθρακα, παρωνυχία, απόστημα, κυτταρίτιδα και στις γυναίκες που θηλάζουν μαστίτιδα, η οποία μπορεί να απελευθερώσει βακτήρια στο μητρικό γάλα. Λοίμωξη των οστών (οστεομυελίτιδα) που εμφανίζεται κυρίως σε άρρενα άτομα ηλικίας 3-10 ετών. Απαντάται συνηθέστερα στη μετάφυση των μακρών οστών των κάτω άκρων. Σε άτομα μεγαλύτερης ηλικίας ο σταφυλόκοκκος είναι υπεύθυνος για οστεομυελίτιδα των σπονδύλων, ενώ εμφανίζεται Σελίδα 24 από 83

συνήθως μετά από λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος και επεμβάσεις του προστάτη. Μετεγχειρητικές λοιμώξεις χειρουργικών τραυμάτων. Ενδοκαρδίτιδα. Το ποσοστό θνητότητας αγγίζει το 40%, ενώ το 25-35% των λοιμώξεων αυτών οφείλονται σε λοίμωξη από το χρυσίζων σταφυλόκοκκο. Πνευμονία. Λοιμώξεις κατώτερου αναπνευστικού (ποσοστό περίπου 23%). Σηψαιμία-βακτηριαιμία (ποσοστό περίπου 22%). Νεκρωτικές λοιμώξεις των μαλακών μορίων. Τροφική δηλητηρίαση, καθώς ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος απελευθερώνει στις τροφές μια τοξίνη που προκαλεί ταχεία έναρξη σοβαρής ναυτίας και εμέτου. Επίσης, αξίζει να σημειωθεί, ότι δεν είναι λίγες οι φορές που η λοίμωξη από σταφυλόκοκκο ξεκινάει μέσα στο νοσοκομείο, συνήθως μετά από κάποια χειρουργική επέμβαση ή μετά από κάποιο τραυματισμό. Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) (21) Πρόκειται για στέλεχος Staph. aureus ανθεκτικό στις αντισταφυλοκοκκικές πενικιλλίνες όπως η μεθικιλλίνη, οξασιλλίνη και η φλουκλοξασιλλίνη καθώς και σε όλα τα β-λακταμικά αντιβιοτικά συμπεριλαμβανομένων και των καρβαπενεμών (ιμιπενέμης και μεροπενέμης). Αποτελεί σημαντική αιτία ενδονοσοκομειακών (Healthcare Acquired-Methicillin Resistant Staph. Aureus, HA-MRSA) αλλά και της κοινότητας (Community Acquired- Methicillin Resistant Staph. Aureus, CA-MRSA) λοιμώξεων σε παγκόσμια κλίμακα και σίγουρα από της εμφανίσεως αυτού του στελέχους έχουν απασχολήσει και απασχολούν σοβαρά την παγκόσμια ιατρική κοινότητα. Τα στελέχη αυτά έχουν την ιδιότητα να ενσωματώνουν στο γονιδίωμα τους εξωγενή γενετικά στοιχεία που φέρουν γονίδια αντοχής σε αντιβιοτικά, με την Σελίδα 25 από 83

ταυτοποίηση νέων κλώνων MRSA να φανερώνει πόσο ευέλικτο είναι το γονιδίωμα τους. Ο στελέχη αυτά σταφυλόκοκκου διασπείρονται εύκολα μεταξύ των ασθενών και οι λοιμώξεις που ενδεχομένως θα προκύψουν απαιτούν θεραπεία πιο επιθετική και εξειδικευμένη, από αυτήν που συνήθως χρησιμοποιείται σε λοιμώξεις από στελέχη ευαίσθητα στη μεθικιλλίνη. Με τον όρο «ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις» εννοούμε τις λοιμώξεις αυτές που συμβαίνουν είτε μετά από 48 ώρες από την εισαγωγή κάποιου ατόμου στο νοσοκομείο, είτε έως 3 ημέρες μετά το εξιτήριο, καθώς και έως και 30 ημέρες μετά από κάποια χειρουργική επέμβαση Δεν αποτελεί απειλή για τα υγιή, ανοσοεπαρκή άτομα, τα οποία, όμως, μπορεί να είναι αποικισμένα από το συγκεκριμένο σταφυλόκοκκο σε ένα αρκετά μεγάλο ποσοστό (50-60%) χωρίς να νοσούν. Αντίθετα, άτομα με μειωμένους μηχανισμούς άμυνας μπορεί να παρουσιάσουν σοβαρές λοιμώξεις όπως βακτηριαιμία, λοιμώξεις του αναπνευστικού και λοιμώξεις των οστών. Λοιμώξεις από MRSA συχνά παρατηρούνται σε ασθενείς μετά από βαριές χειρουργικές επεμβάσεις, ή σε άτομα που έχουν νοσηλευτεί σε μονάδες εντατικής θεραπείας ή ανήκουν σε άλλες ευπαθείς ομάδες. Οι ομάδες πληθυσμού με αυξημένο κίνδυνο για MRSA της κοινότητας (CA- MRSA, Community Acquired-MRSA) είναι οι ασθενείς οι αθλητές ομαδικών αθλημάτων, οι χρήστες ενδοφλέβιων τοξικών ουσιών, οι ομοφυλόφιλοι, τρόφιμοι ιδρυμάτων, οι άστεγοι, οι ασθενείς με υποτροπιάζουσες λοιμώξεις των μαλακών μορίων καθώς και οι ασθενείς με ιστορικό λοίμωξης από MRSA. Όπως αναφέρεται χαρακτηριστικά οι παράγοντες μετάδοσης μπορούν να συνοψιστούν στους εξής: την επαφή, τα μολυσμένα αντικείμενα, την έλλειψη καθαριότητας, τον συνωστισμό και τη ρήξη της συνέχειας του δέρματος (22). Πρόληψη λοίμωξης από MRSA (21) Σελίδα 26 από 83

Η πρόληψη των λοιμώξεων από τον MRSA απαιτεί συνεχή επιτήρηση, έγκαιρη και αξιόπιστη εργαστηριακή ανίχνευση, απομόνωση των αποικισμένων ασθενών κατά την εισαγωγή τους στο νοσοκομείο, σχολαστική εφαρμογή των πρακτικών υγιεινής (όπως είναι η συμμόρφωση με τις οδηγίες υγιεινής των χεριών), αποτελεσματικά προγράμματα πρόληψης των νοσοκομειακών λοιμώξεων και ορθολογική χρήση των αντιβιοτικών. Το συνηθέστερο μέσο που χρησιμοποιείται προκειμένου για την εκρίζωση του μικροβίου από τις θέσεις αποικισμού είναι το αντιβιοτικό mupirocin, του οποίου διενεργείται τοπική εφαρμογή στο εσωτερικό των ρωθώνων της μύτης, που αποτελεί και τη συχνότερη θέση αποικισμού του σταφυλόκοκκου αυτού. Η εφαρμογή της γίνεται καθημερινά κάθε 12 ώρες για 5-7 ημέρες (22, 23). Το φάρμακο αυτό έχει θεωρητικά μικρές πιθανότητες εμφάνισης διασταυρούμενης αντοχής, μιας και η χημική της δομή διαφέρει από τα άλλα αντιβιοτικά. Επιπροσθέτως, συστήνεται το πλύσιμο του σώματος και του τριχωτού της κεφαλής με αλκοολούχο χλωρεξιδίνη επί ένα μήνα, καθώς και το πλύσιμο των εσωρούχων σε 70 ο C, χρήση των πετσετών μία φορά και αλλαγή των κλινοσκεπασμάτων κάθε 48 ώρες (22, 23). Όταν o MRSA εγκατασταθεί στο νοσοκομειακό χώρο απαιτείται συντονισμένη προσπάθεια όλου του προσωπικού, ιατρικού και νοσηλευτικού, προκειμένου να αντιμετωπιστεί σωστά και αποτελεσματικά. Στα νοσοκομεία, η συνηθέστερη και σημαντικότερη πηγή MRSA είναι οι μολυσμένοι ή αποικισμένοι ασθενείς, αν και τα μέλη του προσωπικού των νοσοκομείων μπορεί να είναι και αυτά αποικισμένα. Βασικό στοιχείο, για την αντιμετώπιση του MRSA είναι η πρόληψη της μετάδοσής του, με τα χέρια να είναι ο σημαντικότερος τρόπος μετάδοσης του σταφυλόκοκκου ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη, ενώ δεν μεταδίδεται μέσω του αέρα. Άρα είναι απαραίτητη η εφαρμογή αυστηρών κανόνων υγιεινής των χεριών διότι όπως Σελίδα 27 από 83

χαρακτηριστικά αναφέρεται στις οδηγίες από το ΚΕΕΛΠΝΟ ο μικροοργανισμός αυτός «δύσκολα εκριζώνεται, εύκολα μεταδίδεται, δύσκολα θεραπεύεται, ενώ ελέγχεται και θεραπεύεται με υψηλό κόστος» (21). Επιδημιολογικά στοιχεία-mrsa Τα τελευταία χρόνια φαίνεται ότι ο αριθμός των στελεχών MRSA που απομονώνονται σταθεροποιείται ή και μειώνεται στις περισσότερες Ευρωπαϊκές χώρες, με την επίπτωση αυτού να σημειώνει σημαντική μείωση, χωρίς όμως ακόμα να αφήνει περιθώρια για άκρατη αισιοδοξία και εφησυχασμό μιας και σε 8 από τις 29 χώρες, κυρίως στην Νοτιοανατολική Ευρώπη, το ποσοστό του MRSA παραμένει πάνω από 25%. Για το έτος 2015, τα ποσοστά απομόνωσης κυμαίνονταν από 0% στην Ισλανδία, έως 57.2% στη Ρουμανία. Επιπλέον, το μέσο ποσοστό απομόνωσης του MRSA μειώθηκε από 18.6% το 2011, σε 16.8% το 2015 (24, 25). Σελίδα 28 από 83

Εικόνα 5. Staphylococcus aureus. Ποσοστό (%) απομονωθέντων στελεχών MRSA, ανά χώρα, 2015 (24). Το CDC (10) δημοσίευσε μια μελέτη όπου φαίνεται ότι ο αριθμός των λοιμώξεων από διεισδυτικά στελέχη MRSA σε νοσοκομειακές εγκαταστάσεις μειώνονται τα τελευταία χρόνια. Συγκεκριμένα οι ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις από MRSA μειώθηκαν κατά 54% από το 2005 ως το 2011, ενώ παράλληλα μειώθηκε και η θνητότητα από αυτού του είδους τις λοιμώξεις. Η μελέτη αυτή έρχεται να συμπληρώσει δεδομένα από National Healthcare Safety Network (NHSN) τα οποία δείχνουν μια πτώση της τάξης του 50% στις αιματογενείς λοιμώξεις από MRSA κατά τη χρονική περίοδο 1997-2007. Επίσης από το CDC, δεδομένα που αφορούν τη χρονική περίοδο 2008-2012 φανερώνουν μια σταθερή πτώση της επίπτωσης των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων από MRSA, από 27,08 λοιμώξεις ανά 100,000 πληθυσμού το 2008, σε 18,74 το 2012 (10). Σύμφωνα με στοιχεία από το πρόγραμμα Active Bacterial Core Surveillance (ABCs) (26) του CDC, το 2014, σε σύγκριση με το 2005 η υπολογιζόμενη επίπτωση των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων από MRSA είχε μειωθεί κατά 44.87% ενώ η συνολική επίπτωση εκτιμάται ότι είχε μειωθεί κατά 39.51%. Σε σύγκριση με τη διετία 2007-2008 υπήρξε μια μείωση της τάξης του 36,11% στις ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις από MRSA, ενώ σε σύγκριση με το 2013, η επίπτωση αντίστοιχα μειώθηκε κατά 5,36%, ενώ συχνότητα εμφάνισης της λοίμωξης της κοινότητας που σχετίζεται με MRSA αυξήθηκε κατά 1,57%. Στην Ελλάδα το ποσοστό απομόνωσης MRSA παρέμεινε σταθερό με 39.2% το 2011 και 39.4% το 2015, παρά την διαφαινόμενη μείωση το 2014 (37.1%) (24, 25). Σύμφωνα με στοιχεία από το ΚΕΕΛΠΝΟ (21) (Κέντρο Ελέγχου & Πρόληψης Σελίδα 29 από 83

Νοσημάτων), ο επιπολασμός του MRSA στα Ελληνικά νοσοκομεία εξακολουθεί να κυμαίνεται σε υψηλά επίπεδα, παρόλο που η συχνότητά του ανευρίσκεται σε σχετικά πτωτική τάση, από το 45% το 2003 στο 41% το 2012. Ειδικό ρόλο στην επιδημιολογία του MRSA φαίνεται να παίζει ο ST80-IV κλώνος, που ανευρίσκεται τόσο στην κοινότητα όσο και στα νοσοκομεία, όπου φαίνεται διαχρονικά να επικρατεί (27, 28). Η πλειοψηφία των διαφόρων μελετών που έχουν πραγματοποιηθεί μέχρι σήμερα στην Ελλάδα και αφορούν τη φορεία MRSA, δεν περιλαμβάνουν διαχωρισμό των περιστατικών σε νοσοκομειακά (HA-MRSA) και μη. Το 1997, σε μια μελέτη από την κα Καντζάνου Μαρία και τους συνεργάτες της, φάνηκε ότι από το σύνολο των απομονωθέντων στελεχών Staphylococcus aureus που προήλθαν από επτά ελληνικά νοσοκομεία, το 41% ήταν MRSA (29). Επιπλέον, δεδομένα από μια άλλη μελέτη που διεξάχθηκε στο Λαϊκό Νοσοκομείο της Αθήνας ανέδειξαν μια αύξηση του ποσοστού των MRSA στελεχών επί του συνόλου των στελεχών Staph. aureus που απομονώθηκαν από νοσοκομειακούς ασθενείς από 33% το 1994 σε 50,1% το 2001 (30). Σε μελέτη της κας Βουρλή και των συνεργατών της, η οποία διεξάχθηκε στο Γενικό Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης το 2004, και αφορούσε 129 εξωτερικούς ασθενείς που προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία με δερματικές και μαλακών ιστών λοιμώξεις, ο Staph. aureus και ο MRSA απομονώθηκε σε ένα ποσοστό 77,4% και 22,2% αντίστοιχα (31). Επίσης, σε μια μελέτη της κας Σούλη Μαρίας και των συνεργατών της, η οποία δημοσιεύθηκε το 2015 και αφορούσε την χρονική περίοδο 04/2012-05/2013, συμμετείχαν 30 νοσοκομεία από όλη την Ελλάδα, και το ποσοστό MRSA, επί του συνόλου των απομονωθέντων στελεχών Staph. aureus, ήταν 39% (32). Στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Πάτρας βρέθηκε ότι το 2002 η συχνότητα των νοσοκομειακών MRSA στελεχών επί του συνόλου των στελεχών Staph. aureus Σελίδα 30 από 83

που απομονώθηκαν επί μια διετία, ήταν 14,4% (33). Σε μελέτη της κας Πετινάκη Ε. και των συνεργατών της, η οποία αναφερόταν στη χρονική περίοδο 1999-2000 και αφορούσε τα 5 μεγαλύτερα νοσοκομεία της Θεσσαλίας η συχνότητα του MRSA ήταν 14,8%. (34). Επιδημιολογικά στοιχεία ρινικής φορείας Staph. aureus Τα ποσοστά ρινικής φορείας S. aureus φαίνεται να εξαρτώνται από τα εξής: Φυλή (υψηλότερα ποσοστά στα άτομα λευκής φυλής) Φύλο (υψηλότερα ποσοστά στους άνδρες) Ηλικία Ομάδες ασθενών με μεγαλύτερα ποσοστά ρινικής φορείας S. aureus είναι και οι εξής: Ασθενείς με ΣΔ Ασθενείς σε αιμοκάθαρση ή περιτοναϊκή διάλυση Ασθενείς με τελικού σταδίου ηπατική νόσο Ασθενείς με HIV Παχύσαρκοι ασθενείς Ασθενείς με ιστορικό αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου Ασθενείς με δερματικές παθήσεις Εστιάζοντας στη ρινική φορεία του Staph. aureus στον γενικό πληθυσμό, διαπιστώνει κανείς μια διακύμανση στα ανευρισκόμενα ποσοστά σε παγκόσμια Σελίδα 31 από 83

κλίμακα. Πιο συγκεκριμένα, από στοιχεία της NHANES (National Health and Nutrition Examination Survey) στις ΗΠΑ ο επιπολασμός της ρινικής φορείας Staph. aureus κατά τη χρονική περίοδο 2001-2004, ήταν 30.4% (35). Αντίστοιχα, σε μελέτες που αφορούσαν την Δυτική Ευρώπη, το ποσοστό ρινικής φορείας Staph. aureus ήταν 24-25.2% στην Ολλανδία (36, 37), 36.4% στην Ελβετία (38), και περίπου 27% στη Νορβηγία (39, 40). Όσον αφορά τη Νότια και Νοτιοανατολική Ασία μεγάλες διακυμάνσεις έχουν παρατηρηθεί σε διάφορες μελέτες, από ένα διαπιστωθέν ποσοστό φορείας στην Ινδονησία 9.1% (41), σε ένα ποσοστό 29.4% στην Ινδία (42). Στην Ιαπωνία το αντίστοιχο ποσοστό φέρεται να είναι 35.7% μεταξύ υγιών εθελοντών (43), ενώ στην Κίνα η ρινική φορεία Staph. aureus βάσει μιας πρόσφατης μελέτης που αφορούσε φοιτητές Ιατρικής προκλινικών ετών φοίτησης ήταν 23.1% (44). Στην Αφρική έχουν παρατηρηθεί ποσοστά ρινικής φορείας που ανέρχονται σε 13% στην Τυνησία (45), 18.3% στην Κένυα (46) και 29% στην Γκαμπόν (47). Στο Μεξικό το αντίστοιχο ποσοστό είναι 37.1% (48), ενώ στον Αμαζόνιο 57.8% (49). Στην Βραζιλία, και σε μια μελέτη που αφορούσε υγιείς ενήλικες φοιτητές, το ποσοστό ρινικής φορείας Staph. aureus ήταν 40,8% (50). Στην Ελλάδα, σε μια μελέτη που αφορούσε το ποσοστό ρινικής φορείας Staph. aureus σε βρέφη και τις μητέρες τους, Staph. aureus απομονώθηκε από το 15,7% των ρινικών επιχρισμάτων που ελήφθησαν από αυτές τις μητέρες (51). Στην ίδια μελέτη, όπως και σε άλλες (36), φάνηκε ότι η ρινική φορεία Staph. aureus στα βρέφη συσχετιζόταν στατιστικά σημαντικά με την αντίστοιχη ρινική φορεία στις μητέρες αυτών. Σε μια άλλη μελέτη η γονική ρινική φορεία Staph. aureus φάνηκε να αποτελεί ισχυρό παράγοντα κινδύνου για αντίστοιχη ρινική φορεία στα βρέφη αυτών (52). Σελίδα 32 από 83

Στον παιδιατρικό πληθυσμό βάσει δεδομένων από διάφορες μελέτες, φαίνεται ότι ο επιπολασμός της ρινικής φορείας Staphylococcus aureus είναι περίπου ίδιος με αυτόν του ενήλικου πληθυσμού, κυμαινόμενος από 18% έως 38,5% (53-58). Στην Ελλάδα, και πιο συγκεκριμένα στην Πάτρα, σύμφωνα με μια μελέτη του κου Σδούγκου και των συνεργατών του τη διετία 2005-2006, η οποία φορούσε 123 υγιή παιδιά, η ρινική φορεία Staph. aureus ανερχόταν σε ένα ποσοστό 59% (59). Επιπλέον τα παιδιά, όπως αναφέρεται σε διάφορες μελέτες, απαντώνται υψηλότερα ποσοστά εμμένουσας ρινικής φορείας Staph. aureus συγκριτικά με τους ενήλικες. Επιδημιολογικά στοιχεία ρινικής φορείας MRSA Σε μια μελέτη, κυριότερος παράγοντας κινδύνου για την ρινική φορεία MRSA στα παιδιά φάνηκε να είναι η φορεία του συγκεκριμένου στελέχους στους γονείς (60) και στην μητέρα ειδικότερα. Όσον αφορά την ρινική φορεία του MRSA, στοιχεία από διάφορες μελέτες αναφέρουν ποσοστά απομόνωσης που κυμαίνονται από 1% έως και περίπου 6% (Πίνακας 1) (53-58). Χώρα Χρονολογία διεξαγωγής της μελέτης Αριθμός συμμετεχόντων Επιπολασμός Staphylococcus aureus (συνολικά) Επιπολασμός MRSA Γκαμπόν 2009 500 29% 6.28% Κολομβία 2009 104 38.5% 4.8% Χονγκ-Κονγκ 2009-2011 2211 27.6% 1.3% Περού 2010-2011 452 (ενήλικες και παιδιά) 24.6% 0.9% Σελίδα 33 από 83

Κίνα 2005-2007 2008-2010 2373 18.12% 6.28% Ρωσία 2011 63 31.7% Πίνακας 1. Μελέτες σχετικά με τον επιπολασμό της ρινικής φορείας Staphylococcus aureus στα παιδιά. MRSA, Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (53-58). Στην Ελλάδα, και πιο συγκεκριμένα στην Πάτρα, σύμφωνα με μια μελέτη του κου Σδούγκου και των συνεργατών του τη διετία 2005-2006, η οποία φορούσε 123 υγιή παιδιά, η ρινική φορεία MRSA ανερχόταν σε ένα ποσοστό 5,5% (59). Σε μελέτη του Χατζάκη και των συνεργατών του, η οποία αφορούσε υγιή νεογνά και βρέφη έως 1 έτους, η ρινική φορεία MRSA προσέγγιζε το 43,6% των απομονωθέντων στελεχών Staph. aureus (17,7% επί του συνόλου των ρινικών επιχρισμάτων) (51). Όσον αφορά τον ενήλικο πληθυσμό στην Ελλάδα, σε μελέτη η οποία διεξάχθηκε από τον κον Καραψιά και τους συνεργάτες του και αφορούσε 959 υγιείς ενήλικες, η ρινική φορεία MRSA ήταν περίπου 1% (61). Σελίδα 34 από 83

2.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σελίδα 35 από 83

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ Γενικά, έως σήμερα, δεν υπάρχουν αρκετές μελέτες οι οποίες να αφορούν τη ρινική φορεία Staph. aureus και ειδικότερα MRSA στην Ελλάδα, σε παιδιατρικό πληθυσμό. Στοιχεία που προέρχονται από τις λιγοστές μελέτες που αφορούν την Ελλάδα, αναφέρουν ένα ποσοστό ρινικής φορείας Staph. aureus και MRSA σε υγιή παιδιά, 59% και 5,5% αντίστοιχα (59), ενώ σε ενήλικες ένα ποσοστό ρινικής φορείας Staph. aureus και MRSA, 15,7% και περίπου 1% (61) αντίστοιχα. Ο σκοπός της εργασίας αυτής είναι η καταγραφή σε παιδιατρικούς ασθενείς του Γενικού Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης πάσχοντες από εμμένουσα αλλεργική ρινίτιδα, παραρρινοκολπίτιδα και δερματική βλάβη στην ρινική περιοχή, της συχνότητας της ρινικής φορείας του Staphylococcus aureus αλλά και ειδικότερα του Σελίδα 36 από 83

MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus) καθώς και της ευαισθησίας αυτών στα αντιβιοτικά, κατά τη χρονική περίοδο 2011-2015. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χώρος και χρόνος διεξαγωγής της μελέτης Η παρούσα μελέτη διεξάχθηκε στο Γενικό Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης την πενταετία 2011-2015. Το νοσοκομείο καλύπτει υγειονομικά και υποδέχεται ασθενείς από μια ευρεία περιοχή επεκτεινόμενη αρκετά μακρύτερα από τα στενά όρια του οικείου δήμου. Συγκεκριμένα η περιοχή αυτή εκτείνεται προς τον βορρά ως την περιοχή της Άνοιξης, δυτικά ως το δήμο Γαλατσίου, Νέας Ιωνίας και Λυκόβρυσης, νότια ως την περιοχή των Σπάτων και της Αρτέμιδας, και ανατολικά ως την περιοχή Ραφήνας και της Νέας Μάκρης. Συνολικά, πρόκειται για μια περιοχή ενός εκατομμυρίου κατοίκων περίπου. Σελίδα 37 από 83

Εικόνα 6. Απεικόνιση της περιοχής που καλύπτει το Γενικό Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης (62). Τα ρινικά επιχρίσματα συλλέχθηκαν είτε από τους ιατρούς των εξωτερικών ιατρείων (μικροβιολόγους, παιδιάτρους, ωτορινολαρυγγολόγους) ανάλογα με την περίπτωση κάθε φορά, είτε από τους ιατρούς των κλινικών. Όλα τα δείγματα μεταφέρθηκαν στο μικροβιολογικό εργαστήριο του νοσοκομείου και εξετάστηκαν από τους ιατρούς του τμήματος. Τα δείγματα ελάμβαναν έναν μοναδικό αριθμητικό κωδικό κατά την παραλαβή τους στο μικροβιολογικό τμήμα και τα αποτελέσματα καταγράφονταν σε βιβλία του αυτού τμήματος. Σελίδα 38 από 83

Δείγμα Την χρονική περίοδο 2011-2015 εξετάσθηκαν 459 δείγματα ρινικού επιχρίσματος από παιδιά ηλικίας από 20 ημερών έως 16 ετών (μέση ηλικία 5,56 έτη ± 3,9). Από αυτά τα παιδιά το 59% ήταν αγόρια, ενώ το 41% ήταν κορίτσια. Η πλειοψηφία των δειγμάτων μας ήταν από τα εξωτερικά ιατρεία και αφορούσαν εξωτερικούς ασθενείς. Πιο συγκεκριμένα μόνο το 10% των δειγμάτων προερχόταν από τις κλινικές, ενώ το 90% προερχόταν από τα εξωτερικά ιατρεία του νοσοκομείου και συγκεκριμένα τα δείγματα αυτά προέρχονταν από παιδιατρικούς ασθενείς που προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία του νοσοκομείου μας είτε με αναφερόμενη εμμένουσα ρινίτιδα, είτε με πυώδες ρινικό έκκριμα, είτε με δερματική βλάβη στην ρινική περιοχή. Ακόμα και το προαναφερθέν 10% που προερχόταν από τις κλινικές αφορούσε παιδιατρικούς ασθενείς που προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία και τελικά αποφασίστηκε η νοσηλεία τους οπότε και το ρινικό επίχρισμα ελήφθηκε κατά την εισαγωγή τους ή τουλάχιστον εντός 48 ωρών από αυτήν, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων. Στον αριθμό των δειγμάτων δεν συμπεριλήφθηκαν αυτά που ελήφθησαν στη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας. Λήψη ρινικού επιχρίσματος Η διαδικασία που ακολουθήθηκε προκειμένου για τη λήψη του ρινικού επιχρίσματος ήταν η εξής βάσει των οδηγιών του CDC (Centers for Disease Control and Prevention) (10): 1) Εφύγρανση βαμβακοφόρου στυλεού με στείρο φυσιολογικό ορό (N/S 0.9%). 2) Εισαγωγή στυλεού στο ρώθωνα 1-2 cm, παράλληλα με την υπερώα. 3) Λήψη επιχρίσματος με περιστροφή του στυλεού. 4) Μεταφορά των στυλεών σε υλικό μεταφοράς Stuart. Σελίδα 39 από 83

Προετοιμασία και εμβολιασμός Για την διενέργεια του επόμενου βήματος ήταν απαραίτητος ο κάτωθι εξοπλισμός: Κλίβανος (Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany). Κρίκοι και κρικοφόροι στυλεοί. Τρυβλία. Θρεπτικά/ καλλιεργητικά υλικά. Με βάση τα βιβλία του εργαστηρίου, όλα τα δείγματα έλαβαν ένα ξεχωριστό αριθμητικό κωδικό και αύξοντα αριθμό. Ακολουθήσε ο εμβολιασμός του δείγματος σε όλα τα απαραίτητα θρεπτικά υλικά και η επώαση αυτών στον κλίβανο. Τα θρεπτικά καλλιεργητικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: Αιματούχο άγαρ. *(ανεύρεση σταφυλόκοκκου και στρεπτόκοκκου) Σοκολατόχρωμο άγαρ. *(ανεύρεση Moraxella και Haemophilus) Αξίζει να σημειωθεί εδώ ότι στη βιβλιογραφία αναφέρεται και ο ολονύχτιος εμπλουτισμός του δείγματος σε TSB (Tryptic Soy Broth) και ο εμβολιασμός του στα τρυβλία μετά από 24 ώρες. Ο ζωμός αυτός χρησιμοποιείται για τον εμπλουτισμό και στη συνέχεια την καλλιέργεια των αερόβιων αλλά και δυνητικά αναερόβιων μικροοργανισμών. Εξαιτίας της εμπλουτιστικής του αυτής ικανότητας, χρησιμοποιείται ως θρεπτικό μέσο ανάπτυξης των μικροοργανισμών, πριν τον ενοφθαλμισμό τους στα κατάλληλα θρεπτικά υλικά. Εμπλουτιστικά θεωρούνται τα θρεπτικά υλικά που διαθέτουν ουσίες που καταστέλλουν την ανάπτυξη κάποιων και προάγουν την ανάπτυξη κάποιων άλλων μικροοργανισμών. Μολαταύτα, το εμπλουτιστικό αυτό μέσο δεν είναι κατάλληλο για την καλλιέργεια μικροοργανισμών όπως π.χ., Haemophilus ή Neisseria spp., καθώς και για την ανίχνευση και ανάκτηση Σελίδα 40 από 83

αυστηρών αναερόβιων μικροοργανισμών, και δεδομένου ότι στα ρινικά επιχρίσματα στην παρούσα μελέτη σκοπός δεν ήταν η αναζήτηση μόνον Staph. aureus αλλά και των ανωτέρω μικροοργανισμών, δεν επιλέχθηκε η χρησιμοποίησή του (63). Όσον αφορά την απομόνωση MRSA, σε συγκεκριμένη μελέτη αναφέρεται ότι ο αρχικός εμπλουτισμός σε TSB με 6,5% NaCl μπορεί να βελτιώσει κατά 9% το ποσοστό απομόνωσης του αυτού μικροοργανισμού (64). Σε καλλιέργειες όπου αναπτύχθηκαν μικροοργανισμοί ελήφθηκε δείγμα καθαρής αποικίας προκειμένου για χρώση Gram και ταυτοποίηση αυτών με το αυτοματοποιημένο σύστημα Vitek ΙΙ (biomerieux, Marcy-l'Étoile, France). Η χρώση Gram διενεργήθηκε ως εξής: 1. Διενέργεια λήψης δείγματος καθαρής αποικίας από το τρυβλίο όπου είχε αναπτυχθεί, με ένα κρικοφόρο στυλεό και εξάπλωση της ομοιόμορφα σε αντικειμενοφόρο πλάκα μαζί με μία σταγόνα N/S 0.9% για να σχηματιστεί ένα λεπτό επίχρισμα. 2. Αφέθηκε στη συνέχεια να στεγνώσει στον αέρα. 3. Διενεργήθηκε μονιμοποίηση του επιχρίσματος με θερμότητα, περνώντας γρήγορα δύο έως τρεις φορές μέσα από μια φλόγα. Δόθηκε προσοχή ώστε να μην υπερθερμανθεί, ώστε να αποφευχθεί η στρέβλωση. Εναλλακτικά, το επίχρισμα μπορεί να μονιμοποιηθεί με μεθανόλη αντ αυτού, με την προσθήκη 1-2 σταγόνων μεθανόλης επί του αποξηρανθέντος επιχρίσματος, αποστραγγίζοντας την περίσσεια μεθανόλης, και αφήνοντας το να στεγνώσει στον αέρα. Η μεθανόλη έχει το πλεονέκτημα ότι δεν προκαλεί λύση των ερυθρών κυττάρων και ελαχιστοποιεί την ζημιά στα κύτταρα του ξενιστή, δίνοντας ένα καθαρότερο υπόβαθρο. Σελίδα 41 από 83

4. Το επίχρισμα περιλούστηκε με κρυσταλλικό ιώδες και τηρήθηκε αναμονή 30 δευτερόλεπτων. Το κρυσταλλικό ιώδες (CV) διασπάται σε υδατικά διαλύματα σε CV+ και ανιόντα χλωρίου (Cl-). Αυτά τα ιόντα διεισδύουν διαμέσου του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταρικής μεμβράνης και των Gram-θετικών και των Gram-αρνητικών κυττάρων. Το CV+ κατιόν αλληλεπιδρά με αρνητικά φορτισμένα συστατικά των βακτηριακών κυττάρων και βάφει τα κύτταρα μωβ. 5. Το κρυσταλλικό ιώδες ξεπλύθηκε απαλά με νερό της βρύσης με προσοχή ώστε να μην ξεπλυθεί υπερβολικά, το οποίο θα μπορούσε να αφαιρέσει την χρώση από τα Gram θετικά βακτήρια. 6. Διενεργήθηκε προσθήκη ιωδίου στο επίχρισμα, περιλούζοντας το με αυτό και αφέθηκε για τουλάχιστον τρία δευτερόλεπτα. Ιώδιο, υπό τη μορφή αρνητικά φορτισμένα ιόντων, αλληλεπιδρά με CV+ για να σχηματίσουν μεγάλα σύμπλοκα κρυσταλλικού ιώδους και ιωδίου (CV-Ι σύμπλοκα) εντός των εσωτερικών και εξωτερικών στοιβάδων του κυττάρου. Το ιώδιο δρα ως παράγων παγίδευσης για να διατηρήσει το πορφυρό χρώμα του κρυσταλλικού ιώδους στο κύτταρο. 7. Ξέπλυμα του ιωδίου με νερό της βρύσης. 8. Διενέργεια αποχρωματισμού με προσθήκη αλκοόλης ή ακετόνης στο επίχρισμα, ενώ η αντικειμενοφόρος πλάκα συγκρατείται υπό γωνία για να αποστραγγίσει την περίσσεια. Διακοπή μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα, όταν η απορροή γίνεται πλέον διαυγής. Το στάδιο αποχρωματισμού είναι κρίσιμο και πρέπει να χρονομετρείται σωστά. Εάν αφεθεί για πάρα πολύ χρόνο, ο παράγοντας αποχρωματισμού θα αφαιρέσει τη χρώση κρυσταλλικού ιώδους και από τα Gram(+) και από τα Gram(-) κύτταρα. Τα μέσα αποχρωματισμού Σελίδα 42 από 83

όπως η αλκοόλη ή η ακετόνη, αλληλεπιδρούν με τα λιπίδια της μεμβράνης του βακτηριακού κυττάρου. Ένα Gram(-) βακτήριο θα χάσει την εξωτερική του μεμβράνη, επιτρέποντας στα CV-Ι σύμπλοκα να ξεπλυθούν, συμπαρασυρόμενα από αυτήν. Αντιθέτως, ένα Gram(+) κύτταρο θα αφυδατωθεί από την αιθανόλη, παγιδεύοντας τα μεγάλα CV-Ι σύμπλοκα εντός του πολυστρωματικού κυτταρικού του τοιχώματος πεπτιδογλυκάνης. Μετά από αποχρωματισμό, το Gram(+) κύτταρο παραμένει μωβ και το Gram(-) κύτταρο χάνει την πορφυρή χρώση. 9. Απαλό ξέπλυμα της περίσσειας του μέσου αποχρωματισμού με νερό της βρύσης. 10. Διαβροχή του επιχρίσματος με σαφρανίνη (αντιχρωστικό). Αναμονή για τριάντα δευτερόλεπτα. Το αντιχρωστικό εφαρμόζεται τελευταίο για να βαφτούν τα αποχρωματισμένα Gram-αρνητικά βακτήρια ένα ροζ ή κόκκινο χρώμα. Η βασική φουξίνη, η οποία βάφει τα αναερόβια βακτήρια πιο έντονα, μπορεί να είναι υποκαταστήσει τη σαφρανίνη, αλλά είναι λιγότερο συχνά χρησιμοποιούμενη. 11. Απαλό ξέπλυμα της περίσσειας σαφρανίνης με νερό της βρύσης. 12. Η αντικειμενοφόρος πλάκα αποστραγγίστηκε και αφέθηκε να στεγνώσει στον αέρα. Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόροι πλάκες εξετάστηκαν κάτω από το μικροσκόπιο, όπου τα Gram(+) βακτήρια, εμφανίζονταν, όπως ήταν αναμενόμενο, με μωβ χρώση κρυσταλλικoύ ιώδους, η οποία παγιδεύεται μέσα στα παχιά κυτταρικά τους τοιχώματα. Τα Gram(-) βακτήρια εμφανίζονται ροζ όπως χρωματίζονται από τη Σελίδα 43 από 83

σαφρανίνη, καθώς τα λεπτά τοιχώματα των κυττάρων τους επιτρέπουν τα σύμπλοκα κρυσταλλικού ιώδους να ξεπλυθούν κατά τη διάρκεια του αποχρωματισμού. Εικόνα 7. Staphylococcus aureus όπως φαίνεται χαρακτηριστικά στο μικροσκόπιο μετά από Gram χρώση. Σελίδα 44 από 83

Εικόνα 8. Streptococcus spp όπως όπως φαίνεται χαρακτηριστικά στο μικροσκόπιο μετά από Gram χρώση. Στα δείγματα όπου αναπτύχθηκαν μετά την αρχική καλλιέργεια περισσότεροι του ενός μικροοργανισμοί, ακολούθησε ανακαλλιέργεια των παρατηρούμενων μικροοργανισμών. Στα δείγματα όπου επιλέχθηκε να πραγματοποιηθεί Gram χρώση και βάσει χαρακτηριστικής μορφολογίας (σαφώς διαφοροποιούμενη από την αντίστοιχη των στρεπτόκοκκων) ταυτοποιήθηκε η παρουσία του σταφυλόκοκκου, πραγματοποιήθηκαν οι εξής κλασικές δοκιμασίες προκειμένου για το διαχωρισμό μεταξύ CoNS και Staphylococcus aureus: A. Δοκιμασία DNase. Ελέγχει την παρουσία της εξωκυττάριας DNάσης που υδρολύει το αδιάλυτο σε ΗCL DNA σε διαλυτά ολιγονουκλεοτίδια. Τα στελέχη Staph. aureus, μόνον, παράγουν μια θερμοανθεκτική DNase η οποία δεν καταστρέφεται στους 100ºC για 15 min, ενώ το αντίστοιχο ένζυμο των άλλων βακτηρίων είναι ευαίσθητο στη θερμοκρασία και καταστρέφεται μετά από Σελίδα 45 από 83

θέρμανση σε θερμοκρασία >44ºC. Για την διενέργεια αυτής της δοκιμασίας χρησιμοποιούμε: Τρυβλίο με DNase άγαρ. Πρακτικά πρόκειται για άγαρ περιέχον DNA υλικό. Κρικοφόρος στυλεός με τον οποίο διενεργείται ενοφθαλμισμός στο ανωτέρω υλικό, δείγματος καθαρής αποικίας σχηματίζοντας επί αυτού γραμμή μήκους 3-4 cm. Κλίβανος όπου πραγματοποιείται επώαση στους 35-37 ο C για 18-24 ώρες. Διάλυμα 1Ν (3.6%) ΗCL με το οποίο ακολουθεί πλημμύρισμα του καλλιεργήματος. Μετά από λίγα λεπτά (περίπου 5 min) ελέγχουμε για τον σχηματισμό διαυγούς άλω. Αν διαπιστωθεί παρουσία διαυγούς άλω τότε η δοκιμασία θεωρείται θετική και ο μικροοργανισμός για τον Staph. aureus. B. Δοκιμασία πηκτάσης (coagulase)-latex σταφυλόκοκκου. Χρησιμοποιείται προκειμένου για τον έλεγχο της ικανότητας των στελεχών Staphylococcus να προκαλούν πήξη του πλάσματος με τη βοήθεια του ενζύμου κοαγκουλάση το οποίο και παράγουν σε δύο μορφές, τη συνδεδεμένη στο κυτταρικό τοίχωμα (clumbing factor) και την ελεύθερη. Κατά την δοκιμασία πλακός την οποία χρησιμοποιούμε ώστε να πιστοποιήσουμε την πιθανή παρουσία του παράγοντα συσσωμάτωσης (clumbing factor), πάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα με εναιώρημα σταφυλόκοκκου προστίθεται αντιδραστήριο με σωματίδια latex. Αν παρατηρηθεί παραγωγή κροκίδων, τότε η δοκιμασία χαρακτηρίζεται ως θετική. Αδρά, και μόνον, προκειμένου για την ταυτοποίηση άλλων μικροοργανισμών εκτός από τους σταφυλόκοκκους, ακολουθήθηκαν τα κάτωθι βήματα: Σελίδα 46 από 83

1) Αν έχουμε ανάπτυξη στρεπτόκοκκου στην καλλιέργειά μας, τότε λαμβάνουμε αποικία του μικροοργανισμού την οποία ανακαλλιεργούμε σε ένα τρυβλίο με αιματούχο άγαρ. Στη συνέχεια τοποθετούμε επί αυτού ένα δισκίο βακιτρακίνης 0,04 IU και επωάζουμε για 24 ώρες στους 35 ο C. Η ανάπτυξη οποιασδήποτε διαυγούς άλου γύρω από το δισκίο βακιτρακίνης (ζώνη αναστολής) ερμηνεύεται ως θετική και υποδηλώνει ανάπτυξη πυογόνου στρεπτόκοκκου. 2) Αν έχουμε ανάπτυξη μικροοργανισμών στο σοκολατόχρωμο άγαρ, αυτοί μπορεί να είναι είτε αιμόφιλος είτε ναϊσσέριες. Αν είναι αιμόφιλος, τότε σε τρυβλίο Mueller-Hinton άγαρ προστίθενται δισκία εμποτισμένα με παράγοντες ταυτοποίησης των αιμόφιλων. Οι παράγοντες αυτοί είναι: X (NAD) V (αιμίνη) X+V (NAD + αιμίνη) Ακολουθεί επώαση σε 5% CO 2 για 18-24 ώρες οπότε και ελέγχουμε για ανάπτυξη γύρω από τους δίσκους (εξάρτηση από το συγκεκριμένο παράγοντα). Η ταυτοποίηση της ναϊσσεριών, γίνεται ήδη από την όψη τους και τη μορφή τους στο τρυβλίο, αφού είναι χαρακτηριστικός ο τρόπος που αυτές ανασηκώνονται από το τρυβλίο με τη βοήθεια του κρικοφόρου στυλεού. Στη συνέχεια κάνουμε δοκιμασία DNase για να διαπιστώσουμε αν πρόκειται για Moraxella catarrhalis, η οποία θεωρείται και παθογόνος. Σε κάθε περίπτωση που από το τρυβλίο και με τις ανωτέρω αναφερθείσες δοκιμασίες δε μπορούμε να ταυτοποιήσουμε το μικρόβιο, χρησιμοποιούμε το αυτοματοποιημένο σύστημα Vitek ΙΙ (biomerieux, Marcy-l'Étoile, France). Σελίδα 47 από 83

Γενικότερα όμως, το αποφεύγουμε όσο μπορούμε γιατί έχει υψηλό κόστος και προϋποθέτει την ύπαρξη καλών ανακαλλιεργειών προκειμένου να έχουμε μεμονωμένες αποικίες. Συνολικά, στο τέλος, ακολούθησε ο προσδιορισμός της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά η οποία και έγινε με τη μέθοδο διάχυσης δίσκων (Kirby-Bauer Disk Susceptibility Test) σε Mueller-Hinton άγαρ, με τη μέθοδο Etest (Etest, biomerieux) και με το αυτοματοποιημένο σύστημα Vitek II (biomerieux, Marcyl'Étoile, France). Τα αντιβιοτικά τα οποία ελέγχθηκαν ήταν: Πενικιλλίνη Οξασιλλίνη Κεφοξιτίνη Γενταμυκίνη Αμικασίνη Ερυθρομυκίνη Κλυνδαμυκίνη Κοτριμοξαζόλη (Τριμεθοπρίμη-σουφαμεθοξαζόλη) Σιπροφλοξασίνη Φουσιδικό οξύ Νοβοβιοκίνη Τομπραμυκίνη Τεϊκοπλανίνη Λινεζολίδη Ριφαμπικίνη Τετρακυκλίνη Σελίδα 48 από 83

Η οξασιλλίνη και η κεφοξιτίνη είναι τα δύο αντιβιοτικά η αντοχή των οποίων δηλώνει και την αντοχή στα β-λακταμικά. Η κεφοξιτίνη θεωρείται καλύτερος δείκτης με εγκυρότερα και περισσότερο αναπαραγώγιμα αποτελέσματα σε σύγκριση με την οξασιλλίνη, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι η ανθεκτικότητα στην οξασιλλίνη δεν είναι ενδεικτική για την ύπαρξη MRSA. Η ζώνη αναστολής πάνω από την οποία το στέλεχος θεωρείται ευαίσθητο στην κεφοξιτίνη είναι > 22 mm. Ειδικότερα, η μέθοδος διάχυσης δίσκων (Kirby-Bauer Disk Susceptibility Test), η οποία φαίνεται να ξεκίνησε το 1940 από τον G. N. Heatley (65) και τυποποιήθηκε τα επόμενα έτη από τους Kirby και Bauer με μελέτες που δημοσίευσαν το 1959 και το 1966 (66, 67), εμπλέκει τη χρήση δίσκων αντιβιοτικών οι οποίοι αποτελούνται από διηθητικό χαρτί, έχουν διάμετρο περίπου 6 mm αλλά και συγκεκριμένη συγκέντρωση του αντιβιοτικού. Το πρωτόκολλο εφαρμογής της μεθόδου σύμφωνα με την Αμερικανική Εταιρία Μικροβιολογίας (ASM, American Society of Microbiology) (68) έχει ως εξής: Αρχικά το τρυβλίο αφήνεται να αποκτήσει θερμοκρασία δωματίου κι αν στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού (Mueller-Hinton άγαρ) παρατηρείται παρουσία υγρού, τότε το τρυβλίο τοποθετείται ανεστραμμένο πάνω στο καπάκι του προκειμένου η περίσσεια υγρού να αποστραγγιστεί και να εξατμιστεί. Επίσης τα τρυβλία δύνανται να τοποθετηθούν σε κλίβανο προς επώαση στους 35 C ή σε ένα απαγωγό/ θάλαμο νηματικής ροής σε θερμοκρασία δωματίου, όπου συνήθως απαιτούνται περίπου 10-30 λεπτά ωσότου στεγνώσουν. Χρησιμοποιώντας έναν αποστειρωμένο κρικοφόρο στυλεό λαμβάνονται 4-5 αποικίες του μικροοργανισμού και αναμειγνύονται με 2 ml στείρου φυσιολογικού ορού (N/S 0.9%) μέσα σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα. Σελίδα 49 από 83

Ακολουθεί ανάδευση προκειμένου να επιτευχθεί η παρασκευή ενός ομοιόμορφου εναιωρήματος, για το οποίο λαμβάνεται φροντίδα έτσι ώστε η θολερότητα αυτού να είναι ίση με την θολερότητα του προτύπου θολοσιμετρικού διαλύματος της κλίμακας ΜcFarland No 0.5, ενώ είναι απαραίτητο πλέον να χρησιμοποιηθεί εντός των επόμενων 15 λεπτών. Εμβαπτίζεται ένας στείρος βαμβακοφόρος στυλεός εντός του παρασκευασθέντος εναιωρήματος και περιστροφικά πιέζεται επί των τοιχωμάτων του δοκιμαστικού σωλήνα, εξερχόμενος αυτός, προκειμένου να αποστραγγιστεί η περίσσεια του προσροφηθέντος υγρού. Ακολουθεί ενοφθαλμισμός της επιφάνειας του τρυβλίου με το Mueller-Hinton άγαρ με επίστρωση σε 3 διευθύνσεις με περιστροφή του τρυβλίου κάθε φορά κατά 60 ο. Τα τρυβλία αφήνονται με το καπάκι τους μισάνοιχτο σε θερμοκρασία δωματίου για <15 λεπτά (συνήθως 3-5 λεπτά) προκειμένου η επιφάνεια του θρεπτικού υλικού να στεγνώσει. Εν συνεχεία τοποθετούνται με μεγίστη προσοχή οι αντιβιοτικοί δίσκοι, ένας κάθε φορά, πάνω στην επιφάνεια του ενοφθαλμισμένου θρεπτικού υλικού με μια αποστειρωμένη λαβίδα, και χρησιμοποιώντας έναν οδηγό προκειμένου για την ακριβή τοποθέτηση αυτών. Οι αντιβιοτικοί δίσκοι θα πρέπει να τοποθετούνται σε απόσταση 24 mm μεταξύ των κέντρων τους, ενώ μέριμνα θα πρέπει να λαμβάνεται ώστε να μην είναι κοντά στην άκρη/όχθη του τρυβλίου (69). Η αποστείρωση της λαβίδας μπορεί να επιτευχθεί με εμβάπτιση αυτής σε αλκοολικό διάλυμα και στη συνέχεια περνώντας την από φλόγα. Σελίδα 50 από 83

Όταν πλέον έχουν τοποθετηθεί όλοι οι αντιβιοτικοί δίσκοι το τρυβλίο καλύπτεται με το καπάκι του, αναστρέφεται και τοποθετείται σε έναν κλίβανο προς επώαση στους 35 C για 24 ώρες. Μετά την επώαση ακολουθεί η ανάγνωση των αποτελεσμάτων με την ακριβή μέτρηση της διαμέτρου των ζωνών αναστολής. Σαν όριο της ζώνης αναστολής θεωρείται το σημείο όπου δεν παρατηρείται μικροβιακή ανάπτυξη με γυμνό μάτι. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται βάσει των οδηγιών του CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) (70). Προκειμένου για την ανίχνευση MRSA στελεχών, εξετάστηκε η ευαισθησία των εξεταζόμενων στελεχών σταφυλόκοκκου στην κεφοξιτίνη και την οξασιλλίνη, με μεγαλύτερη ακρίβεια να αποδίδει η πρώτη εξ αυτών. Τα στελέχη που ευρέθηκαν, με την ανωτέρω μέθοδο, ανθεκτικά στην κεφοξιτίνη ή/και στην οξασιλλίνη χαρακτηρίστηκαν ως MRSA. Εικόνα 9. Kirby-Bauer μέθοδος προκειμένου για έλεγχο ευαισθησίας στα αντιβιοτικά στελέχους Staphylococcus aureus (71). Σελίδα 51 από 83

Το Etest, ως μέθοδος, παρουσιάστηκε για πρώτη φορά το 1988 σε ένα συνέδριο στο Los Angeles (Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, ICAAC) (72), ενώ το 1991 έλαβε την έγκριση από τον FDA (Food and Drug Administration) στις ΗΠΑ (73). Με το Etest (Etest, biomerieux) χρησιμοποιήθηκαν ταινίες οι οποίες κατά μήκος τους έχουν προκαθορισμένη κλίση συγκέντρωσης του συγκεκριμένου αντιβιοτικού και η οποία άμεσα διαχέεται στην επιφάνεια του ενοφθαλμισμένου με δείγμα καλλιεργήματος του υπο εξέταση μικροοργανισμού, θρεπτικού υλικού (Mueller-Hinton άγαρ). Για κάθε στέλεχος τοποθετήθηκε μία ταινία Etest και ακολούθησε επώαση στους 35 ο C για 24 ώρες για τους S. aureus. Μετά την παρέλευση του ανωτέρω χρονικού διαστήματος, απαραίτητου για την επώαση, σχηματίστηκε μια ελλειπτοειδής ζώνη αναστολής οπότε και ακολούθησε η ανάγνωση και ερμηνεία της τιμής της MIC (Minimum Inhibitory Concentration), διαβάζοντας απλά την τιμή που αναγράφεται στην ταινία στο σημείο που σταματάει η ανάπτυξη του βακτηρίου συμπεριλαμβάνοντας ακόμα και τις μεμονωμένες αποικίες (74, 75). Με τη συγκεκριμένη μέθοδο, επιλέγεται πολλές φορές, να πραγματοποιηθεί και ο έλεγχος της ευαισθησίας των στελεχών MRSA στο αντιβιοτικό mupirocin. Σελίδα 52 από 83

Εικόνα 10. Εικόνα Etest Staphylococcus aureus μετά από επώαση αυτού σε Mueller- Hinton άγαρ για 18-24 ώρες. MIC 3 mcg/ml για την κεφοξιτίνη (76). Στατιστική ανάλυση Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD, και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο p <0.05. Η κανονικότητα των μεταβλητών εξετάστηκε με one-sample Kolmogorov-Smirnov δοκιμασίες. Οι μέσες τιμές συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων με one-way ANOVA και post hoc ανάλυση χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία LSD, και με independent-samples t-test ή Mann-Whitney U test για τις μεταβλητές χωρίς κανονική κατανομή. Συντελεστές συσχέτισης (Spearman) διεξήχθησαν για την ποσοτικοποίηση των συσχετίσεων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 24 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σε 345 δείγματα (75,2%) ανιχνεύτηκαν 489 παθογόνα βακτήρια. Στην πλειοψηφία αυτών των 345 δειγμάτων, και συγκεκριμένα στο 69,5% αυτών, ανιχνεύτηκαν περισσότερα του ενός βακτήρια. Οι μικροοργανισμοί που απομονώθηκαν ήταν: Σελίδα 53 από 83

Staphylococcus aureus: 36,8% H. influenzae: 20,9% M.catarrhalis: 22,7% S. pneumoniae: 12,5% S. pyogenes: 5,1% Gram αρνητικά βακτήρια 2% Staphylococcus aureus H. influenzae M.catarrhalis S. pneumoniae S. pyogenes Gram (-) 5,10% 2,00% 12,50% 36,80% 22,70% 20,90% Εικόνα 11. Μικροοργανισμοί που απομονώθηκαν κατόπιν καλλιέργειας των ρινικών επιχρισμάτων κατά το χρονικό διάστημα 2011-2015. Η ηλικία των ασθενών (6,5 ± 4,6 έτη) στους οποίους δεν απομονώθηκε κανένας μικροοργανισμός από το ληφθέν ρινικό επίχρισμα, ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη συγκριτικά με αυτήν στους ασθενείς από των οποίων το ρινικό επίχρισμα απομονώθηκαν 1 μικροοργανισμός (One-Way ANOVA, LSD Post Hoc test, p< 0,05). Αριθμός μικροοργανισμών που απομονώθηκαν από το p Σελίδα 54 από 83

ρινικό επίχρισμα (Ν) 0 1 2 3 4 5 6 Αριθμός (Ν) ασθενών Μέση ηλικία ± SD (έτη) 115 232 89 23 0 0 0 6,5 ± 4,6 5,3 ± 3,6 5,2 ± 3,8 4,6 ± 2,7 < 0,05 Πίνακας 2. Μέση ηλικία ασθενών με βάση τον αριθμό των μικροοργανισμών που απομονώθηκαν από το ρινικό επίχρισμα. Ρινική φορεία Staph. aureus. Έτος Ποσοστό (%) με ρινική φορεία Staph. aureus επί του συνόλου των δειγμάτων ανά έτος 2011 37,4 2012 34,5 2013 48,2 2014 34,8 2015 43,5 Πίνακας 3. Χρονική διακύμανση ρινικής φορείας S. aureus κατά τα έτη 2011-2015. Στα δείγματα όπου διαπιστώθηκε αποκλειστική ανάπτυξη, ο Staphylococcus aureus απομονώθηκε σε ποσοστό 53% αυτών. Η φορεία από χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο ανήλθε κατά την διάρκεια της πενταετίας στο 39,2%, παρουσιάζοντας την κάτωθι χρονική διακύμανση (Πίνακας 3, Εικόνα 12), χωρίς να υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των μελετημένων ετών (p> 0,05). Σελίδα 55 από 83

Ρινική φορεία Staph. aureus (%) 60,00% 50,00% 48,20% 43,50% 40,00% 37,40% 34,50% 34,80% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 2011 2012 2013 2014 2015 Staph. aureus Εικόνα 12. Χρονική διακύμανση της ρινικής φορείας S. aureus κατά τα έτη 2011-2015. Όσον αφορά την διακύμανση της ρινικής φορείας του Staph. aureus κατά την διάρκεια του έτους, βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (p< 0,05) μεταξύ των μηνών, με τον Ιανουάριο και τον Σεπτέμβριο να συνεισφέρουν περισσότερο σε αυτό. Ο μεν Ιανουάριος σχετιζόταν με χαμηλότερα ποσοστά απομόνωσης Staph. aureus και ο δε Σεπτέμβριος με υψηλότερα αντίστοιχα. Γενικά, μεγαλύτερα ποσοστά παρατηρήθηκαν τον Απρίλιο, Αύγουστο και Σεπτέμβριο (Εικόνα 13). Σελίδα 56 από 83

Ρινική φορεία Staph. aureus 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Staph. aureus Εικόνα 13. Διακύμανση ανά μήνα της ρινικής φορείας Staph. aureus. Δεν αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό ρινικής φορείας Staph. aureus μεταξύ των δύο φύλων. Η ρινική φορεία Staph. aureus βρέθηκε να σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με την ηλικία, με τα άτομα από το ρινικό επίχρισμα των οποίων απομονώθηκε ο συγκεκριμένος μικροοργανισμός, να έχουν στατιστικά μεγαλύτερη ηλικία (Mann-Whitney test, Staph. aureus+ 6 ± 4 έτη, Staph. aureus- 5,3 ± 3,8 έτη; p<0.05). Οι ηλικίες των ασθενών ομαδοποιήθηκαν ως εξής: Νεογνά: <28 ημερών Βρέφη: >28 ημερών & < 1 έτους Νήπια: > 1έτους & 3 ετών Προσχολική ηλικία: >3 ετών & 5 ετών Πρώιμη και μέση σχολική ηλικία: > 5 ετών & 12 ετών Εφηβική ηλικία: > 12 ετών & 16 ετών Σελίδα 57 από 83

Ηλικιακή ομάδα Αριθμός (Ν) Ποσοστό (%) επί του συνόλου Ποσοστό (%) απομόνωσης Staph. aureus επί του συνόλου αυτών Νεογνά 6 1,3 2,2 Βρέφη 34 7,4 6,7 Νήπια 105 22,9 19,4 Προσχολική ηλικία 137 29,8 24,4 Πρώιμη και μέση σχολική ηλικία 147 32 50,3 Εφηβική ηλικία 30 6,5 36,7 Πίνακας 4. Αριθμός και ποσοστό επί του συνόλου των ασθενών με βάση την ηλικιακή ομάδα και ποσοστά απομόνωσης Staph. aureus από το ρινικό επίχρισμα. Η απομόνωση ή όχι Staph. aureus από το ρινικό επίχρισμα των ασθενών φάνηκε να έχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την ηλικιακή ομάδα στην οποία ανήκαν οι ασθενείς (Chi-Square test, p< 0,05), με την ομάδα της πρώιμης και μέσης σχολικής ηλικίας να είναι αυτή που συνεισέφερε περισσότερο σε αυτό. Ρινική φορεία MRSA Ειδικότερα, για τον MRSA, δηλαδή τον χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο που είναι ανθεκτικός στη μεθικιλλίνη, η ρινική φορεία ανήλθε κατά την διάρκεια της πενταετίας στο 2,88%, ενώ η κατανομή ανά έτος φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 5) και διαγραμματικά στην Εικόνα 14, ενώ δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ετών. Σελίδα 58 από 83

Απόλυτος Ποσοστό (%) MRSA αριθμός (n) των επί του συνόλου των Ποσοστό (%) με ρινική φορεία Έτος δειγμάτων όπου δειγμάτων με ρινική MRSA επί του συνόλου των απομονώθηκε φορεία Staph. aureus δειγμάτων ανά έτος MRSA ανά έτος ανά έτος 2011 1 2,3 0,9 2012 2 6,9 2,4 2013 0 0 0 2014 1 3,2 1,1 2015 1 2 0,9 Πίνακας 5. Χρονική διακύμανση ρινικής φορείας MRSA κατά τα έτη 2011-2015. Ρινική φορεία MRSA 8,0% 7,0% 6,90% 6,0% 5,0% 4,0% 3,0% 2,0% 2% 3,20% 2% 1,0% 0,0% 0% 2011 2012 2013 2014 2015 Εικόνα 14. Χρονική διακύμανση ρινικής φορείας MRSA κατά τα έτη 2011-2015. Ρινική φορεία λοιπών μικροοργανισμών Η χρονική διακύμανση της ρινικής φορείας H. Influenzae, M. Catarrhalis, Strep. Pneumoniae, Strep. Pyogenes και των Gram (-) μικροοργανισμών φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 6) και σχηματικά στην Εικόνα 15. Σελίδα 59 από 83

Ποσοστό (%) ρινικής φορείας επί του συνόλου των δειγμάτων ανά έτος Έτος H. influenzae M. catarrhalis S. pneumoniae S. Gram pyogenes (-) 2011 32,2 29,6 20 6,1 0 2012 8,3 21,4 13,1 4,8 1,2 2013 28,6 23,2 1,8 3,6 7,1 2014 22,5 21,3 16,9 7,9 2,2 2015 19,1 23,5 9,6 4,3 2,6 Πίνακας 6. Χρονική κατανομή ρινικής φορείας λοιπών απομονωθέντων μικροοργανισμών κατά τα έτη 2011-2015. 40,00% Ρινική φορεία (%) 35,00% 30,00% 32,20% 29,60% 28,60% 25,00% 20,00% 20,00% 21,40% 23,20% 22,50% 21,30% 16,90% 23,50% 19,10% 15,00% 13,10% 10,00% 5,00% 0,00% 9,60% 8,30% 7,90% 7,10% 6,10% 4,80% 3,60% 4,30% 1,20% 1,80% 2,20% 2,60% 0,00% 2011 2012 2013 2014 2015 H.influenzae M.catarrhalis S.pneumoniae S.pyogenes Gram(-) Εικόνα 15. Χρονική διακύμανση ρινικής φορείας λοιπών απομονωθέντων μικροοργανισμών κατά τα έτη 2011-2015. Σελίδα 60 από 83

Ευαισθησία στα αντιβιοτικά Ο έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο διάχυσης δίσκων (Kirby-Bauer Disk Susceptibility Test) σε Mueller-Hinton άγαρ, με τη μέθοδο Etest (Etest, biomerieux) καθώς και με τη χρήση του αυτοματοποιημένου συστήματος Vitek II (biomerieux). Τα αντιβιοτικά τα οποία ελέγχθηκαν ήταν: Πενικιλλίνη Οξασιλλίνη Κεφοξιτίνη Γενταμυκίνη Αμικασίνη Ερυθρομυκίνη Κλυνδαμυκίνη Κοτριμοξαζόλη (Τριμεθοπρίμη-σουφαμεθοξαζόλη) Σιπροφλοξασίνη Φουσιδικό οξύ Νοβοβιοκίνη Τομπραμυκίνη Τεϊκοπλανίνη Λινεζολίδη Ριφαμπικίνη Τετρακυκλίνη Η οξασιλλίνη και η κεφοξιτίνη είναι τα δύο αντιβιοτικά η αντοχή των οποίων δηλώνει και την αντοχή στα β-λακταμικά. Η κεφοξιτίνη θεωρείται καλύτερος δείκτης με εγκυρότερα και περισσότερο αναπαραγώγιμα αποτελέσματα συγκριτικά με την οξασιλλίνη, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι η ανθεκτικότητα στην οξασιλλίνη δεν είναι Σελίδα 61 από 83

ενδεικτική για την ύπαρξη MRSA. Η ζώνη αναστολής πάνω από την οποία το στέλεχος θεωρείται ευαίσθητο στην κεφοξιτίνη είναι > 22 mm (10). Τα απομονωθέντα στελέχη Staphylococcus aureus ήταν ανθεκτικά στην πενικιλλίνη σε ένα ποσοστό 87%. Αποκλειστικά και μόνον ανθεκτικά στην πενικιλλίνη και ευαίσθητα σε όλα τα υπόλοιπα αντιβιοτικά που δοκιμάστηκαν ήταν σε ένα ποσοστό 62%. Στις φθοριοκινολόνες τα στελέχη Staph. aureus ήταν ανθεκτικά σε ένα ποσοστό 15%. Τα στελέχη MRSA ήταν επιπλέον ανθεκτικά στην τετρακυκλίνη σε ένα ποσοστό 2%, στη ριφαμπικίνη σε ένα ποσοστό 3% και στις φθοριοκινολόνες 25%. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Ποσοστό (%) ανθεκτικότητας του Staph. aureus στα αντιβιοτικά Πενικιλλίνη Φθοριοκινολόνες Εικόνα 16. Ποσοστό (%) ανθεκτικότητας του Staph. aureus στα αντιβιοτικά. 30% 25% Ποσοστό (%) ανθεκτικότητας MRSA στα αντιβιοτικά 25% 20% 15% 10% 5% 2% 3% 0% Τετρακυκλίνη Ριφαμπικίνη Φθοριοκινολόνες Εικόνα 17. Ποσοστό (%) ανθεκτικότητας του MRSA στα αντιβιοτικά. Σελίδα 62 από 83

Εικόνα 18. Χαρακτηριστική απεικόνιση αποτελεσμάτων ευαισθησίας στα αντιβιοτικά ενός στελέχους MRSA από το αυτοματοποιημένο σύστημα Vitek II (biomerieux, Marcy-l'Étoile, France). Σελίδα 63 από 83