ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΝΕΧΟΜΕΝΟΙ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ

ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ - ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ» ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ - ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ - ΕMΒΡYΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ: ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΑΡΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΝΕΧΟΜΕΝΟΙ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ ΣΤΑΥΡΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2007

ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ» ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ - ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ - ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ: ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΑΡΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΝΕΧΟΜΕΝΟΙ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ ΣΤΑΥΡΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2007

i Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Ηλίας Λαμπίρης (επιβλέπων) Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Ιωάννης Βαράκης (μέλος) Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Ηλίας Παναγιωτόπουλος (μέλος) Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Επταμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Σοφία Δ. Παντελιού (μέλος) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Μηχανολόγων Μηχανικών και Αεροναυπηγών Ελένη Παπαδάκη-Πέτρου (μέλος) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη (μέλος) Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής Νίκος Καραμάνος (μέλος) Καθηγητής Τμήματος Χημείας

ii Ευχαριστίες Η συγκεκριμένη διατριβή αποτέλεσε την αφορμή να συνεργαστούν και να παραθέσουν τις επιστημονικές τους γνώσεις ειδήμονες από διαφορετικά επιστημονικά πεδία. Το ενδιαφέρον που έδειξαν για την ολοκλήρωση και την επιτυχή έκβαση της ερευνητικής αυτής προσπάθειας θεωρώ ότι είναι αξιόπιστο κριτήριο για τη σπουδαιότητα των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης. Η απόδοση ευχαριστιών σε αυτούς τους ανθρώπους αποτελεί για εμένα τον επίλογο του έργου. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στην αναπληρώτρια καθηγήτρια του τμήματος μηχανολόγων μηχανικών και αεροναυπηγών του πανεπιστημίου Πατρών Σοφία Δ. Παντελιού, αφενός μεν για τη δυνατότητα που μου προσέφερε ως υπεύθυνη του συγκεκριμένου ερευνητικού προγράμματος να συμμετάσχω σε μια τόσο σημαντική ερευνητική προσπάθεια, αφετέρου δε για την επιστημονική επίβλεψη, την ηθική και ψυχολογική στήριξη της καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής. Οι συμβουλές και τα λόγια της θα με ακολουθούν σε όλη μου τη ζωή. Από την ορθοπαιδική κλινική του γενικού περιφερειακού πανεπιστημιακού νοσοκομείου Πατρών θα ήθελα να ευχαριστήσω τους καθηγητές Ηλία Λαμπίρη και Ηλία Παναγιωτόπουλο για το ρόλο τους ως επιστημονικοί επιβλέποντες της διατριβής καθώς και για τις επιστημονικές λύσεις που πρότειναν κάθε φορά που παρουσιαζόταν κάποια δυσκολία στην πορεία του έργου. Από το εργαστήριο ανατομίας-ιστολογίας και εμβρυολογίας της ιατρικής σχολής του πανεπιστημίου Πατρών θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή Ιωάννη Βαράκη, ο οποίος από την πρώτη στιγμή δέχτηκε να στεγάσει στο εργαστήριό του την ερευνητική αυτή προσπάθεια στηρίζοντας ηθικά και υλικά κάθε βήμα της δουλειάς μας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την αναπληρώτρια καθηγήτρια Ελένη Παπαδάκη Πέτρου για τις επιστημονικές της συμβουλές κατά την εκτέλεση των πειραμάτων ανοσοϊστοχημείας, καθώς και για τη βοήθεια της στη διερεύνηση και επεξήγηση των αποτελεσμάτων που προέκυπταν από κάθε πειραματική προσπάθεια. Από το τμήμα χημείας του πανεπιστημίου Πατρών θα ήθελα να εκφράσω τις βαθιές μου ευχαριστίες στον καθηγητή Νίκο Καραμάνο για τη συμμετοχή του στην συγγραφή των επιστημονικών άρθρων που προέκυψαν από τη παρούσα μελέτη, καθώς και για την ηθική του υποστήριξη και παρότρυνση για τη διεκπεραίωση της διατριβής. Από την παιδοενδοκρινολογική κλινική του γενικού περιφερειακού πανεπιστημιακού νοσοκομείου Πατρών θα ήθελα να ευχαριστήσω την αναπληρώτρια καθηγήτρια Μπέσσυ Σπηλιώτη-Γκρέκα για τις επιστημονικές της γνώσεις στο ρυθμιστικό ρόλο της λεπτίνης στη φυσιολογία του ανθρώπου και του επίμυ. Από την ορθοπαιδική κλινική του γενικού νοσοκομείου ΚΑΤ θα ήθελα να ευχαριστήσω τον αναπληρωτή καθηγητή Γεώργιο Λυρίτη για την προσφορά της συσκευής pqct.

iii Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την παθολογοανατόμο ιατρό Λούμπνα Χάλντι για την επιστημονική κατάρτιση και τη βοήθειά της στα πειράματα ιστομορφομετρίας, καθώς και τους ορθοπαιδικούς ιατρούς Γιώργο Σαλάππα και Σπύρο Σύγγελο για την εκτέλεση των ωοθηκεκτομών στους επίμυες. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τη συνάδελφο Βιολόγο Τζίνα Χριστοπούλου, η οποία υπήρξε συνεργάτης και συνοδοιπόρος σε όλη τη διάρκεια του ερευνητικού έργου. Η άψογη συνεργασία μας θέλω να πιστεύω πως ήταν η απόρροια μιας ιδιαίτερης φιλίας που αναπτύχθηκε μεταξύ μας όλα αυτά τα χρόνια Ο τρίτος της παρέας, ο συνάδελφος μηχανολόγος μηχανικός Γιώργος Αναστασόπουλος υπήρξε πέρα από εξαίρετος συνεργάτης και ένας καλός και έμπιστος φίλος. Τον ευχαριστώ πολύ. Κλείνοντας, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου λέγοντας ένα μεγάλο ευχαριστώ στους φίλους μου και στην οικογένεια μου οι οποίοι όντας δίπλα μου σε κάθε βήμα μου, μου έδιναν κουράγιο και δύναμη να συνεχίζω να μάχομαι τις αντιξοότητες που προέκυπταν κατά τη διάρκεια της διατριβής. Η πολύχρονη πορεία μου στα πανεπιστημιακά θρανία είναι αφιερωμένη σε αυτούς. Ευχαριστώ τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας για την οικονομική στήριξη του ερευνητικού προγράμματος ΠΕΝΕΔ 2001.

iv ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το αξιόπιστο πειραματικό μοντέλο της ωοθηκεκτομής σε επίμυες εφαρμόστηκε για τη μελέτη των παθογενετικών μηχανισμών της οστεοπόρωσης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης (OPG) στην εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Για την διεκπεραίωση της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν 40 ενήλικοι θηλυκοί επίμυες ηλικίας 9 μηνών οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ωοθηκεκτομή. Πριν την ωοθηκεκτομή στους επίμυες εφαρμόστηκε η τεχνική της ποσοτικής υπολογιστικής τομογραφίας (pqct) παράλληλα με την πρωτοποριακή μη επεμβατική τεχνική του εσωτερικού συντελεστή απόσβεσης (MDF) ώστε να διαπιστωθεί η κατάσταση της οστικής πυκνότητας των πειραματόζωων. Σε χρονικά διαστήματα 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή πραγματοποιήθηκαν τυχαίες ομαδικές θυσίες με σκοπό τη συλλογή αίματος και την απομόνωση μηριαίων οστών και οστών κνήμης. Την 60 η ημέρα πριν τη θυσία στην τελευταία ομάδα των ωοθηκεκτομηθέντων επίμυων επαναλήφθηκαν οι μετρήσεις pqct και MDF για να διαπιστωθεί η εγκατάσταση σοβαρής οστεοπόρωσης με τη λήξη του πειραματικού πρωτοκόλλου. Πραγματοποιήθηκε συλλογή ορών αίματος σε όλα τα χρονικά πειραματικά σημεία, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης των βιοχημικών δεικτών του οστικού μεταβολισμού NTx και οστεοκαλσίνης καθώς και της ελεύθερης λεπτίνης με την τεχνική της ενζυμικής ανοσοπροσρόφησης (ELISA). Στα οστά της κνήμης εφαρμόστηκε η τεχνική της ιστομορφομετρίας για τη μελέτη των μεταβολών της μικροαρχιτεκτονικής δομής των οστών κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Επιπρόσθετα η τεχνική της ανοσοϊστοχημείας εφαρμόστηκε στα οστά της κνήμης για τη διερεύνηση των μεταβολών που προκαλεί η ωοθηκεκτομή στα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης στους οστικούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Στα μηριαία οστά εφαρμόστηκαν οι τεχνικές της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE electrophoresis) και του ανοσοστυπώματος (Western Blot) για να συλλεχθούν επιπλέον πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης κατά την εξέλιξη της οτεοπόρωσης. Από την εφαρμογή της μεθόδου MDF προέκυψε ότι πρόκειται για μέθοδο αξιολόγησης της δομικής ακεραιότητας των οστών. Η εφαρμογή της στην οστεοπόρωση επιβεβαίωσε ότι συνιστά ένα αξιόπιστο εργαλείο παρακολούθησης των μεταβολών της ποιότητας των οστών, παρέχοντας πρώιμη διάγνωση της οστεοπόρωσης σε σχέση με τη συμβατική μέθοδο, με μη επεμβατική διαδικασία και απλό εξοπλισμό. Τα συμπεράσματα που διεξάγονται από τα επιμέρους πειραματικά δεδομένα επιβεβαιώνουν την υπόθεση ότι η λεπτίνη κατέχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του οστικού

v μεταβολισμού και συμμετέχει ενεργά μέσω κάποιου άγνωστου μέχρι στιγμής μηχανισμού στη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής στην οστεοπόρωση. Σε ότι αφορά στις ρυθμιστικές κυτοκίνες της οστεοκλαστογένεσης RANKL και OPG, διαπιστώθηκε ότι μεταβάλλονται σημαντικά κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης στους ωοθηκεκτομηθέντες επίμυες, υποδηλώνοντας τη σημαντικότητα του ρόλου τους στον οστικό μεταβολισμό.

vi ABSTRACT Ovariectomy in mature rats mimics the changes in bone metabolism observed in postmenopausal women and results in osteoporosis. The aim of this thesis was the investigation of the role of leptin and cytokine RANKL and Osteoprotegerin (OPG) in the progression of ovariectomy-induced osteoporosis. Nine month-old female Wistar rats were bilaterally ovariectomized (n=40). Before the operation, pqct and MDF technology were applied on rats in order to estimate the animals bone mineral density and bone quality. On days 20, 40 and 60 after the operation the rats were randomly sacrificed and blood samples, dissected knees and femurs were collected. On day 60, pqct and MDF techniques were applied again in order to confirm the establishment of osteoporosis until the end of the experimental procedure. Leptin, and biochemical markers of bone metabolism, osteocalcin and NTx, were measured in blood serum during all time points, by an ELISA method. Bone sections from the knees of the rats were examined by histomorphometric techniques in order to investigate the alterations in the micro-architectural structure of the skeleton caused by ovariectomy. Furthermore, immunohistochemistry was applied on knee sections and SDS-PAGE electrophoresis and western blot techniques were performed in femur homogenized tissues, in order to investigate whether the expression levels of leptin receptor, RANKL and OPG were altered during the progression of osteoporosis. The results indicate that leptin is involved in the molecular mechanisms of bone remodeling in osteoporosis. The regulators of osteoclastogenesis, RANKL and OPG are also important players in the field of bone metabolism

vii ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Δομή επταμελούς επιτροπής..i Ευχαριστίες...ii Περίληψη...iv Περιεχόμενα...vii Κατάλογος σχημάτων και πινάκων...xiii Δημοσιεύσεις-Συμμετοχή σε συνέδρια...xix Δομή διδακτορικής διατριβής...xxi Κεφάλαιο 1: Φυσιολογία του οστίτη ιστού 1.1. Δομικά χαρακτηριστικά...1 1.2. Φυσιολογία της θεμέλιας ουσίας του οστίτη ιστού...2 1.3. Φυσιολογία οστεοβλαστών...2 1.3.1. Διαφοροποίηση οστεοβλαστών...2 1.3.2. Η διαδικασία της οστικής παραγωγής...4 1.4. Φυσιολογία Οστεοκυττάρων...4 1.5. Φυσιολογία επενδυματικών κυττάρων...5 1.6. Φυσιολογία Οστεοκλαστών....5 1.6.1. Διαφοροποίηση οστεοκλαστών...6 1.6.2. Διαδικασία της οστικής απορρόφησης...7 1.7. Οστική ανακατασκευή...8 1.7.1. Στάδια οστικής ανακατασκευής...9 Παθολογία του οστίτη ιστού-οστεοπόρωση...11 1.8. Ιστορική αναδρομή...11 1.8.1. Ορισμός της Οστεοπόρωσης...11 1.8.2. Κριτήρια διάγνωσης της οστεοπόρωσης...12 1.9. Μορφολογία οστεοπορωτικών οστών...12 1.10. Pόλος των φυλετικών ορμονών στη φυσιολογία του οστίτη ιστού...13 1.10.1. Οιστρογονικοί υποδοχείς στον οστίτη ιστό...14 1.11. Πειραματικά μοντέλα μελέτης της οστεοπόρωσης...14 1.11.1. Ωοθηκεκτομή σε επίμυες...14 1.11.2. Οστικές ανατομικές ομοιότητες μεταξύ επίμυ-ανθρώπου...15 1.11.3. Οστικές ανατομικές διαφορές μεταξύ επίμυ-ανθρώπου...15 Αναφορές κεφαλαίου 1...16

viii Κεφάλαιο 2: Μέθοδοι μέτρησης δομικής ακεραιότητας οστών Εισαγωγή...19 2.1. Ραδιολογικές-Απεικονιστικές τεχνικές μέτρησης οστικής πυκνότητας...19 2.1.1. DΕXA (Dual Εnergy X-ray Absosptiometry)...19 2.1.2. pdexa (peripheral Dual Εnergy X-ray Absosptiometry)...21 2.1.3. QCT (Quantitative Computed Tomography)...21 2.1.4. pqct (peripheral Quantitative Computed Tomography)...22 2.1.5. Υπέρηχοι (Ultrasound)...25 2.1.6. Εσωτερικός συντελεστής απόσβεσης (Modal Damping Factor, MDF)..25 2.2 Βιοχημικές αναλυτικές μετρήσεις...27 2.2.1. Βιοχημικοί δείκτες οστικού μεταβολισμού...29 2.2.1.1. Βιοχημικοί δείκτες οστικής απορρόφησης...30 2.2.1.2. Αμινοτελικό πεπτίδιο του κολλαγόνου τύπου Ι (ΝΤx)...30 2.2.2. Βιοχημικοί δείκτες οστικής παραγωγής...31 2.2.2.1. Οστεοκαλσίνη...31 2.2.2.1.1 Δομή της οστεοκαλσίνης...31 2.2.2.1.2. Κατανομή της οστεοκαλσίνης...32 2.3. Οστική Ιστομορφομετρία...33 2.3.1. Πλεονεκτήματα της χρήσης ρητινών στις ιστολογικές μελέτες...33 2.3.2. Μειονεκτήματα της ιστομορφομετρίας...34 2.4. Ανοσοϊστοχημεία...35 2.5. Μοριακές τεχνικές...36 2.5.1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου (SDS PAGE Electrophoresis)...36 2.5.2. Ανοσοστύπωμα (Western Blot)...37 Αναφορές κεφαλαίου 2...38 Κεφάλαιο 3: Νέα βιολογικά μόρια σχετιζόμενα με τον οστικό μεταβολισμό Εισαγωγή...41 3.1. Λεπτίνη...41 3.1.1. Δομή των υποδοχέων της λεπτίνης...42 3.1.2. Εντοπισμός των υποδοχέων λεπτίνης...43 3.1.3. Ενδοκυτταρικός μηχανισμός δράσης της λεπτίνης...44 3.1.3.1. Το σηματοδοτικό μονοπάτι JAK2/STAT..45 3.1.3.2. Εναλλακτικά σηματοδοτικά μονοπάτια της λεπτίνης...45 3.1.4. Λειτουργικός ρόλος της λεπτίνης...46

ix 3.1.5. Ρυθμιστικοί παράγοντες...47 3.2. Δράση της Λεπτίνης στον Οστίτη Ιστό...47 3.2.1. Κεντρική δράση της λεπτίνης στον οστίτη ιστό...48 3.2.2. Περιφερειακή δράση της λεπτίνης στον οστίτη ιστό...49 Αναφορές κεφαλαίου 3...51 Κεφάλαιο 4: Νέα βιολογικά μόρια σχετιζόμενα με τον οστικό μεταβολισμό Εισαγωγή...53 4.1 Το ρυθμιστικό μονοπάτι RANKL-OPG-RANK...53 4.2. RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor (NF) kb Ligand)...54 4.2.1. Δομή της κυτοκίνης RANKL...54 4.2.2. Εντόπιση της κυτοκίνης RANKL...55 4.2.3. Ρύθμιση της κυτοκίνης RANKL...55 4.2.4. Ρόλος της κυτοκίνης RANKL...55 4.2.5. Το σηματοδοτικό μονοπάτι ενεργοποίησης του RANKL...56 4.2.6. Δράση των οιστρογόνων στα επίπεδα έκφρασης του RANKL...57 4.3. OΣΤΕΟΠΡΟΤΕΓΕΡΙΝΗ (OPG)...57 4.3.1. Δομή της οστεοπροτεγερίνης...58 4.3.2. Εντόπιση της οστεοπροτεγερίνης...58 4.3.3 Ρύθμιση της οστεοπροτεγερίνης...59 4.3.4. Δράση των οιστρογόνων στην έκφραση της Οστεοπροτεγερίνης..59 4.3.5.Μηχανισμός δράσης της οστεοπροτεγερίνης στον οστικό μεταβολισμό 60 4.4. RANK (Receptor activator of NF-kB)...60 4.4.1. Δομή του υποδοχέα RANK...60 4.4.2. Δράση του υποδοχέα RANK...61 4.4.3. Εντόπιση του υποδοχέα RANK...61 4.4.4. Ρύθμιση του υποδοχέα RANK...61 4.4.5. Δράση των οιστρογόνων στην έκφραση του RANK...61 4.5. Δράση της Λεπτίνης στο σύστημα OPG-RANKL...61 Αναφορές κεφαλαίου 4...63 Κεφάλαιο 5: Μεθοδολογικές προσεγγίσεις Εισαγωγή...65 5.1. Χειρισμός Πειραματόζωων...66 5.2. Μέτρηση οστικής πυκνότητας με τη μέθοδο pqct...67 5.3. Μέτρηση Θερμοδυναμικού Συντελεστή Απόσβεσης...69

x 5.4. Βιοχημικές αναλύσεις...70 5.4.1. Υλικά και αντιδραστήρια...70 5.4.2. Απομόνωση ορού αίματος...70 5.4.3. Μέτρηση των επιπέδων του NTx στον ορό του αίματος των επίμυων 70 5.4.4. Καθορισμός της Οστεοκαλσίνης στον ορό του αίματος των επίμυων.71 5.4.5. Καθορισμός της Λεπτίνης στον ορό του αίματος των επίμυων...72 5.5. Ιστομορφομετρία (Histomorphometry)...73 5.5.1. Υλικά και αντιδραστήρια...73 5.5.2. Πειραματική πορεία...73 5.5.3. Χρώση Goldner s Trichrome...74 5.5.4. Συλλογή και ανάλυση ιστομορφομετρικών παραμέτρων...74 5.5.5. Ιστομορφομετρικές παράμετροι...75 5.6. Ανοσοϊστοχημεία (Immunohistochemistry)...76 5.6.1. Υλικά και αντιδραστήρια...76 5.6.2. Διαλύματα ανοσοϊστοχημείας...76 5.6.3. Πειραματική πορεία...77 5.6.3.1. Αποπλαστικοποίηση και ενυδάτωση των τομών...77 5.6.3.2. Tεχνική αποκάλυψης του αντιγόνου...77 5.6.3.3. Καταστροφή της ενδογενούς υπεροξειδάσης του οστού...78 5.6.3.4. Ανοσοεντόπιση του αντιγόνου...78 5.7. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου -Ανοσοστύπωμα (SDS-PAGE Electrophoresis) (Western Blot)...79 5.7.1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE electrophoresis)...79 5.7.1.1. Υλικά και αντιδραστήρια...79 5.7.1.2. Διαλύματα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών...80 5.7.1.3. Πειραματική πορεία...81 5.7.1.3.1. Διαλυτοποίηση μηριαίων οστών...81 5.7.1.3.2. Απομόνωση ολικών πρωτεϊνών του οστίτη ιστού...82 5.7.1.3.3. Ηλεκτροφόρηση οστικών πρωτεϊνών...82 5.7.2. Μεταφορά οστικών πρωτεϊνών -Ανοσοστύπωμα (Western Blot)...82 5.7.2.1. Υλικά και αντιδραστήρια...83 5.7.2.2. Διαλύματα μεταφοράς οστικών πρωτεϊνών...83 5.7.2.3. Πειραματική πορεία...84

xi 5.7.2.4. Ανίχνευση με την τεχνική του ανοσοστυπώματος του υποδοχέα λεπτίνης...84 5.7.2.5. Ανίχνευση με την τεχνική του ανοσοστυπώματος της RANKL πρωτεΐνης...85 5.7.2.6. Ανίχνευση με την τεχνική του ανοσοστυπώματος της OPG πρωτεΐνης...85 5.7.2.7. Ανίχνευση με την τεχνική του ανοσοστυπώματος της ολικής πρωτεϊνικής συγκέντρωσης των οστικών δειγμάτων...86 Αναφορές κεφαλαίου 5...87 Κεφάλαιο 6: Πειραματικά αποτελέσματα Εισαγωγή...89 6.1. Μέτρηση οστικής πυκνότητας με τη μέθοδο pqct...89 6.2. Μέτρηση οστικής πυκνότητας με τη μέθοδο MDF...91 6.3. Μέτρηση ιστομορφομετρικών οστικών παραμέτρων...94 6.3.1. Ιστομορφομετρική μελέτη των οστικών επιφανειών...94 6.3.2. Ιστομορφομετρική μελέτη της οστικής μάζας...95 6.3.3. Ιστομορφομετρική μελέτη της μικροαρχιτεκτονικής δομής του σπογγώδους...97 6.4. Μέτρηση βάρους σώματος επίμυων...98 6.5. Μέτρηση βιοχημικών δεικτών οστικού μεταβολισμού...99 6.5.1. Μέτρηση επιπέδων ΝΤx στον ορό...99 6.5.2. Μέτρηση επιπέδων οστεοκαλσίνης στον ορό...100 6.6. Μέτρηση επιπέδων λεπτίνης στον ορό...100 6.7. Συσχέτιση λεπτίνης και βιοχημικών δεικτών...102 6.8. Ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματα...103 6.8.1. Ανοσοεντόπιση του υποδοχέα της λεπτίνης(ob-rb)...103 6.8.1.1. Έκφραση του υποδοχέα της λεπτίνης στον οστίτη ιστό...103 6.8.1.2. Έκφραση του υποδοχέα της λεπτίνης στο συζευκτικό χόνδρο...104 6.8.2. Ανοσοεντόπιση της κυτοκίνης RANKL...105 6.8.2.1 Έκφραση της κυτοκίνης RANKL στα κύτταρα του οστίτη ιστού...106 6.8.2.2. Έκφραση της κυτοκίνης RANKLστο συζευκτικό χόνδρο...107 6.8.3. Ανοσοεντόπιση της οστεοπροτεγερίνης (OPG)...108 6.8.3.1. Έκφραση της οστεοπροτεγερίνης στους οστικούς κυτταρικούς πληθυσμούς...108 6.8.3.2. Έκφραση της οστεοπροτεγερίνης στο περιόστεο...110

xii 6.8.3.3. Έκφραση της οστεοπροτεγερίνης στο συζευκτικό χόνδρο...111 6.8.3.4. Έκφραση της οστεοπροτεγερίνης στις οστικές δοκίδες...111 6.9. Αποτελέσματα Ηλεκτροφόρησης-Ανοσοστυπώματος...113 6.9.1. Πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα της λεπτίνης (OB-Rb)...113 6.9.2. Πρωτεϊνική έκφραση της κυτοκίνης RANKL...114 6.9.3. Πρωτεϊνική έκφραση της Οστεοπροτεγερίνης (OPG)...116 Κεφάλαιο 7: Συμπεράσματα αποτελεσμάτων Εισαγωγή...118 7.1. Συμπεράσματα από την ωοθηκεκτομή στους επίμυες...118 7.2. Συμπεράσματα μετρήσεων οστικής πυκνότητας...118 7.3. Συμπεράσματα μετρήσεων θερμοδυναμικού συντελεστή απόσβεσης...119 7.4. Συμπεράσματα ιστομορφομετρίας...120 7.5. Συμπεράσματα βιοχημικών δεικτών οστικού μεταβολισμού...123 7.5.1. Σχετικά με το ΝΤx...123 7.5.2. Σχετικά με την οστεοκαλσίνη...123 7.6. Συμπεράσματα λεπτίνης...124 7.6.1. Συμπεράσματα συσχέτισης λεπτίνης και βιοχημικών δεικτών 126 7.7. Συμπεράσματα ανοσοϊστοχημείας...126 7.7.1. Σχετικά με τον υποδοχέα λεπτίνης...127 7.7.2. Σχετικά με την κυτοκίνη RANKL...128 7.7.3. Σχετικά με την Οστεοπροτεγερίνη...129 7.8. Συμπεράσματα Ηλεκτροφόρησης-Western blot...130 7.8.1. Σχετικά με τον υποδοχέα λεπτίνης (OB-Rb)...130 7.8.2. Σχετικά με την κυτοκίνη RANKL...131 7.8.3. Σχετικά με την οστεοπροτεγερίνη...131 Αναφορές κεφαλαίου 7...132 Μελλοντική προοπτική έρευνας...135

Κατάλογος Σχημάτων και Πινάκων Κεφάλαιο 1 Εικόνα 1.1. Ανατομία μακρών οστών...1 Εικόνα 1.2. Πορεία διαφοροποίησης των μεσενχυματικών κυττάρων προς οστεοβλάστες....3 Εικόνα 1.3. Πρωτεϊνικοί δείκτες που εκφράζονται κατά την πορεία διαφοροποίησης των πρόδρομων μεσενχυματικών κυττάρων σε λειτουργικούς οστεοβλάστες..3 Εικόνα 1.4. Δομή του οστεοκλάστη και ενδοκυτταρικός μηχανισμός της οστικής απορρόφησης 5 Εικόνα 1.5 Πορεία διαφοροποίησης των οστεοκλαστών από τα πρόδρομα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος...6 Εικόνα 1.6 Δράση των OPG-RANKL στη διαδικασία ωρίμανσης του οστεοκλάστη..7 Εικόνα 1.7 Φάσεις της οστικής ανακατασκευής 9 Εικόνα 1.8 Διαφορές στη δομή και στην αρχιτεκτονική μεταξύ φυσιολογικού και οστεοπορωτικού οστού.. 13 Κεφάλαιο 2 Εικόνα 2.1. Τυπική μετρητική διάταξη της τεχνικής DEXA..19 Εικόνα 2.2. Απεικόνιση με τη DEXA της οστικής πυκνότητας της σπονδυλικής στήλης..20 Εικόνα 2.3. Αποτελέσματα μετρήσεων που παρέχει η τεχνική pdexa..21 Εικόνα 2.4. Αποτελέσματα μετρήσεων με τη τεχνική QCT..22 Εικόνα 2.5. Μετρητική διάταξη pqct.. 23 Εικόνα 2.6. Θέση μέτρησης κνήμης με τη pqct-εγκάρσια τομή κνήμης..23 Εικόνα 2.7. Απεικόνιση της εγγύς μετάφυσης της κνήμης με την τεχνική pqct..24 Εικόνα 2.8. Αποτελέσματα μετρήσεων τομών κνήμης με τη μέθοδο pqct..24 Εικόνα 2.9. Απεικόνιση της ελεύθερης ταλάντωσης ενός συστήματος με απόσβεση..26 Εικόνα 2.10. Η τεχνική της ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής ανάλυσης στερεάς φάσεως.....27 Εικόνα 2.11. Βιοχημικοί δείκτες οστικού μεταβολισμού....28 Πίνακας 2.1. Συγκεντρωτικός πίνακας βιοχημικών δεικτών οστικής απορρόφησης.29 Εικόνα 2.12. Δομή του NTx..30 Πίνακας 2.2. Συγκεντρωτικός πίνακας βιοχημικών δεικτών οστικής παραγωγής.. 31 Εικόνα 2.13. Η δευτεροταγής δομή της οστεοκαλσίνης στον άνθρωπο..32 xiii

xiv Εικόνα 2.14. Η πορεία σύνθεσης της οστεοκαλσίνης..32 Εικόνα 2.15. Ηλεκτρονικός εξοπλισμός μέτρησης της τεχνικής της ιστομορφομετρίας.33 Εικόνα 2.16. Τομές κρανιακού οστού εμβαπτισμένες σε μεθυλ-μεθακρυλικό και βαμμένες με τη χρωστική Goldner.....34 Εικόνα 2.17. Σχηματική απεικόνιση της τεχνικής της ανοσοϊστοχημείας σε τομές ιστών..35 Εικόνα 2.18. Σχηματική αναπαράσταση της μεθοδολογίας της ηλεκτροφόρησης...36 Εικόνα 2.19. Σχηματική αναπαράσταση της μεθοδολογίας του ανοσοστυπώματος..37 Κεφάλαιο 3 Εικόνα 3.1. Η δράση της λεπτίνης μέσω του OB-Rb υποδοχέα στους ιστούς 42 Εικόνα 3.2. Δομή των ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης......43 Εικόνα 3.3. Σηματοδοτικά μονοπάτια ενεργοποίησης μέσω του OB-Rb υποδοχέα...44 Εικόνα 3.4. Ρόλος της λεπτίνης στην παθογένεια της παχυσαρκίας.. 46 Εικόνα 3.5. Ανασταλτικός μηχανισμός δράσης της λεπτίνης στην οστική παραγωγή..48 Εικόνα 3.6. Συγκεντρωτικά συμπεράσματα της περιφερειακής δράσης της λεπτίνης στα κύτταρα του οστίτη ιστό.. 49 Κεφάλαιο 4 Εικόνα 4.1. Μηχανισμός ωρίμανσης και ενεργοποίησης των οστεοκλαστών μέσω του συστήματος RANKL-OPG-RANK.. 54 Εικόνα 4.2. Το μονοπάτι των δευτερογενών μηνυμάτων που ενεργοποιείται από την πρόσδεση του RANKL στον υποδοχέα RANK..56 Εικόνα 4.3.Η δράση των οιστρογόνων στο λόγο RANKL/OPG..57 Εικόνα 4.4. Η δράση της οστεοπροτεγερίνης στον οστικό μεταβολισμό..59 Εικόνα 4.5. Δράση της λεπτίνης στον οστικό μεταβολισμό μέσω του συστήματος OPG-RANKL..62 Κεφάλαιο 5 Σχήμα 5.1. Πρωτόκολλο εργασίας κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής...66 Εικόνα 5.2. Η μετρητική διάταξη της τεχνικής pqct.... 67 Εικόνα 5.3. Τοποθέτηση πειραματόζωου στη θέση μέτρησης της συσκευής pqct....68

Εικόνα 5.4. Μηχανισμός επίδεσης του πειραματόζωου στη συσκευή pqct...68 Εικόνα 5.5. Μέτρηση MDF στην κνήμη των πειραματόζωων....69 xv Κεφάλαιο 6 Σχήμα 6.1. Μέτρηση της ογκομετρικής ολικής οστικής πυκνότητας (vtot BMD) πριν την ωοθηκεκτομή και την 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή......89 Σχήμα 6.2. Μέτρηση της ογκομετρικής οστικής πυκνότητας του σπογγώδους (vtrab BMD) πριν την ωοθηκεκτομή και την 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή...90 Πίνακας 6.1. Η μέση τιμή ογκομετρικής ολικής οστικής πυκνότητας (vtot BMD) και της ογκομετρικής οστικής πυκνότητας του σπογγώδους (vtrab BMD) των οστών της κνήμης των επίμυων πριν και την 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή.....90 Σχήμα 6.3. Μεταβολές του εσωτερικού συντελεστή απόσβεσης (MDF) και της ολικής ογκομετρικής οστικής πυκνότητας (vtotbmd) πριν και την 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή.....91 Σχήμα 6. Μεταβολές του συντελεστή ποιότητας και της ογκομετρικής ολικής οστικής πυκνότητας (vtotbmd) πριν και την 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή.... 92 Σχήμα 6.5. Μεταβολές του εσωτερικού συντελεστή απόσβεσης (MDF) και της ογκομετρικής οστικής πυκνότητας του σπογγώδους (vtrabbmd) πριν την ωοθηκεκτομή και την 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή....92 Σχήμα 6.6. Μεταβολές συντελεστή ποιότητας (QF) και ογκομετρικής οστικής πυκνότητας του σπογγώδους (vtrabbmd) πριν και την 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή....93 Πίνακας 6.2. Η μέση τιμή του θερμοδυναμικού συντελεστή εσωτερικής απόσβεσης και του συντελεστή ποιότητας των οστών της κνήμης φυσιολογικών επίμυων πριν την ωοθηκεκτομή και την 60 η ημέρα μετά την χειρουργική επέμβαση.....93 Πίνακας 6.3. Ιστομορφομετρικές παράμετροι σχετιζόμενες με τις μεταβολές των οστικών επιφανειών της κνήμης των επίμυων κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης.....95 Πίνακας 6.4. Ιστομορφομετρικές παράμετροι σχετιζόμενες με τις μεταβολές της οστικής μάζας των οστών της κνήμης των επίμυων κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης...96 Πίνακας 6.5. Ιστομορφομετρικές παράμετροι σχετιζόμενες με τις μεταβολές της μικροαρχιτεκτονικής δομής του σπογγώδους τμήματος των οστών της κνήμης των επίμυων κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης.....97

xvi Σχήμα 6.7. Μέτρηση του βάρους σώματος (g) των επίμυων πριν την ωοθηκεκτομή, την 20 η, 40 η και 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή.....98 Σχήμα 6.8. Μέτρηση NTx (nm BCE) στον ορό πριν την ωοθηκεκτομή (n=18), την 20 η, 40 η και 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή... 99 Σχήμα 6.9. Μέτρηση οστεοκαλσίνης (ng/ml) στον ορό των επίμυων πριν την ωοθηκεκτομή, την 20 η, 40 η και 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή...100 Σχήμα 6.10. Μέτρηση λεπτίνης (pg/ml) στον ορό των επίμυων πριν την ωοθηκεκτομή, την 20 η, 40 η και 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή...101 Πίνακας 6.6 Συγκεντρωτικές μετρήσεις των επιπέδων του NTx, της οστεοκαλσίνης, και της λεπτίνης στον ορό του αίματος των επίμυων πριν την ωοθηκεκτομή και σε χρονικά διαστήματα 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή..101 Πίνακας 6.7. Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson s (r) μεταξύ των επιπέδων της λεπτίνης του NTx και της οστεοκαλσίνης και του βάρους του σώματος πριν την ωοθηκεκτομή και σε χρονικά διαστήματα 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή..102 Εικόνα 6.11.1. Απουσία έκφρασης του OB-Rb στους οστεοβλάστες πριν την ωοθηκεκτομή.. 104 Εικόνα 6.11.2. Μέτρια έκφραση του OB-Rb στους οστεοβλάστες στο διάστημα των 20 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή....104 Εικόνα 6.11.3. Απουσία έκφρασης του OB-Rb στους οστεοβλάστες 40 και 60 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή....... 104 Εικόνα 6.11.4. Απουσία έκφρασης του OB-Rb στη ζώνη υπερτροφίας του συζευκτικού χόνδρου πριν την ωοθηκεκτομή....105 Εικόνα 6.11.5. Ασθενής έκφραση του OB-Rb στη ζώνη υπερτροφίας του συζευκτικού χόνδρου 20 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή......105 Εικόνα 6.11.6. Υπερέκφραση του OB-Rb στη ζώνη υπερτροφίας του συζευκτικού χόνδρου 40 και 60 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή....105 Εικόνα 6.11.7. Απουσία έκφρασης του RANKL στους οστεοβλάστες πριν την ωοθηκεκτομή......106 Εικόνα 6.11.8. Υπερέκφραση του RANKL στους οστεοβλάστες 20 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή...... 106 Εικόνα 6.11.9. Μέτρια έκφραση του RANKL στους οστεοβλάστες 40 και 60 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή... 106 Εικόνα 6.11.10. Μέτρια έκφραση του RANKL στην ζώνη υπερτροφίας του συζευκτικού χόνδρου πριν την ωοθηκεκτομή....107

xvii Εικόνα 6.11.11. Μέτρια έκφραση του RANKL στην ζώνη υπερτροφίας του συζευκτικού χόνδρου 20 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή......107 Εικόνα 6.11.12. Έντονη έκφραση του RANKL στην ζώνη υπερτροφίας του συζευκτικού χόνδρου 40 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή......107 Εικόνα 6.11.13. Μέτρια έκφραση του RANKL στην ζώνη υπερτροφίας του συζευκτικού χόνδρου 60 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή.. 107 Εικόνα 6.11.14. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στους οστεοβλάστες πριν την ωοθηκεκτομή....109 Εικόνα 6.11.15. Έντονη έκφραση της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στους οστεοβλάστες 20 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή.. 109 Εικόνα 6.11.16. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στους οστεοβλάστες 40 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή..109 Εικόνα 6.11.17. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στους οστεοβλάστες 60 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή..109 Εικόνα 6.11.18. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στη στοιβάδα των οστεοπρογονικών κυττάρων του περιοστέου πριν την ωοθηκεκτομή... 110 Εικόνα 6.11.19. Υπερέκφραση της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στη στοιβάδα των οστεοπρογονικών κυττάρων του περιοστέου στο διάστημα των 20 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή......110 Εικόνα 6.11.20. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στη στοιβάδα των οστεοπρογονικών κυττάρων του περιοστέου στο διάστημα των 40 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή......110 Εικόνα 6.11.21. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στη στοιβάδα των οστεοπρογονικών κυττάρων του περιοστέου στο διάστημα των 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή......110 Εικόνα 6.11.22. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στον επιφυσιακό δίσκο πριν την ωοθηκεκτομή.111 Εικόνα 6.11.23. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στον επιφυσιακό δίσκο 20 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή...111 Εικόνα 6.11.24. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στον επιφυσιακό δίσκο 40 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή...111 Εικόνα 6.11.25. Απουσία έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στον επιφυσιακό δίσκο 60 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή......111 Εικόνα 6.11.26. Ασθενής έκφραση της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στις επιμεταλλωμένες επιφάνειες των οστικών δοκίδων πριν την ωοθηκεκτομή.....112

xviii Εικόνα 6.11.27. Έντονη έκφραση της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στις επιμεταλλωμένες επιφάνειες των οστικών δοκίδων 20 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή.....112 Εικόνα 6.11.28. Έντονη έκφραση της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στις επιμεταλλωμένες επιφάνειες των οστικών δοκίδων 40 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή......112 Εικόνα 6.11.29. Μέτρια έκφραση της οστεοπροτεγερίνης (OPG) στις επιμεταλλωμένες επιφάνειες των οστικών δοκίδων 60 ημέρες μετά την ωοθηκεκτομή......112 Σχήμα 6.12. Απεικόνιση τριών αντιπροσωπευτικών πειραμάτων ηλεκτροφόρησης και ανοσοστυπώματος για την ανίχνευση του υποδοχέα της λεπτίνης σε μηριαία οστά πριν την ωοθηκεκτομή και στα χρονικά διαστήματα των 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή... 113 Σχήμα 6.13. Απεικόνιση των μεταβολών των επιπέδων έκφρασης του υποδοχέα της λεπτίνης πριν την ωοθηκεκτομή και την 20 η, 40 η και 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή......114 Σχήμα 6.14 Απεικόνιση τριών αντιπροσωπευτικών πειραμάτων ηλεκτροφόρησης και ανοσοστυπώματος για την ανίχνευση της κυτοκίνης RANKL σε μηριαία οστά πριν την ωοθηκεκτομή και στα χρονικά διαστήματα των 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή.. 115 Σχήμα 6.15. Απεικόνιση των μεταβολών των επιπέδων έκφρασης της κυτοκίνης RANKL πριν την ωοθηκεκτομή και την 20 η, 40 η και 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή......116 Σχήμα 6.16. Απεικόνιση δύο αντιπροσωπευτικών πειραμάτων ηλεκτροφόρησης και ανοσοστυπώματος για την ανίχνευση της πρωτεΐνης οστεοπροτεγερίνης σε μηριαία οστά πριν την ωοθηκεκτομή και μετά από χρονικά διαστήματα 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή... 117 Σχήμα 6.17. Απεικόνιση των μεταβολών των επιπέδων έκφρασης της οστεοπροτεγερίνης πριν την ωοθηκεκτομή και την 20 η, 40 η και 60 η ημέρα μετά την ωοθηκεκτομή..118

xix Α. ΔΙΕΘΝΗ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ 1. Anastasia Stavropoulou, Gina E. Christopoulou, George Anastassopoulos, Sofia D. Panteliou, George P. Lyritis, Bessie E. Spiliotis, Nikos K. Karamanos, Elias Panagiotopoulos and Elias Lambiris. Alteration in serum leptin correlates with alterations in serum N-telopeptide of collagen type I and serum osteocalcin during the progression of osteoporosis in ovariectomized rats, Clin Chem Lab Med 2005; 43(12):1359 1365. 2. G.E. Christopoulou, A. Stavropoulou, G. Anastassopoulos, S.D. Panteliou, E. Papadaki, N. K. Karamanos, E. Panagiotopoulos. Evaluation of modal damping factor as a diagnostic tool for osteoporosis and its relation with serum osteocalcin and collagen I N-telopeptide for monitoring the efficacy of alendronate in ovariectomized rats, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006. 3. G.T. Anastassopoulos, S.D. Panteliou, G.E. Christopoulou, A. Stavropoulou, E. Panagiotopoulos, G.P. Lyritis, L. Khaldi, J.Varakis. Vibrational Bone Characteristics vs Bone Density in Assessing Osteoporosis, Journal of Biomechanical Engineering, 2006. Β. ΣΥΝΕΔΡΙΑ 1. 7 th Annual Meeting of the Hellenic Research Club for Connective Tissue and Matrix Biology Πάτρα, 8-9 Απριλίου 2005 Α. Stavropoulou, G.E. Christopoulou, G. Anastassopoulos, S. D. Panteliou, E. Papadaki, G. P. Lyritis, E. Lampiris. «Serum Leptin and Biochemical Markers of Bone Metabolism: A Positive Correlation in Ovariectomized Rats». (Προφορική ανακοίνωση). G.E. Christopoulou, A. Stavropoulou, G. Anastassopoulos, S. D. Panteliou, E. Papadaki, P. Raptou, E. Panagiotopoulos. «The effects of Aledronate on Osteoporosis Induced by Ovariectomy in Rats». (Προφορική ανακοίνωση). 2. 13 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ελληνικής Εταιρείας Μελέτης του Μεταβολισμού των Οστών (ΕΕΜΜΟ) Αθήνα, 22-24 Απριλίου 2005 ΒΡΑΒΕΙΟ «ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΚΑΛΟΣ» (ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΒΑΣΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ)

xx Α. Σταυροπούλου, Γ.Ε. Χριστοπούλου, Γ. Αναστασόπουλος, Μ. Ασημακοπούλου, Σ.Δ. Παντελιού, Ε. Παπαδάκη, Π. Ράπτου, Η. Λαμπίρης. «Συσχέτιση Επιπέδων Λεπτίνης και Βιοχημικών Δεικτών Κατά την Εξέλιξη της Οστεοπόρωσης σε Ωοθηκεκτομηθέντες Επίμυες». (Προφορική ανακοίνωση). Γ. Ε. Χριστοπούλου, Α. Σταυροπούλου, Γ. Αναστασόπουλος, Μ. Ασημακοπούλου, Σ. Δ. Παντελιού, Ε. Παπαδάκη, Γ. Π. Λυρίτης, Η. Παναγιωτόπουλος. «Δράση της Ατορβαστατίνης στην Αντιμετώπιση της Οστεοπόρωσης. Νέα Θεραπευτική Προσέγγιση». (Αναρτημένη ανακοίνωση). 3. 1 ο Συνέδριο Βιοεπιστημών Πανεπιστημίου Πατρών Πάτρα, 19-20 Μαΐου 2005 Α. Stavropoulou, G.E. Christopoulou, M. Assimakopoulou, G. Anastassopoulos, S.D. Panteliou, G.P. Lyritis, E. Lampiris. «The Alteration in Serum Leptin Levels Correlates with Alterations in Serum N-Telopeptide of Collagen Type I (NTx) and Serum Osteocalcin Levels in Osteoporotic Rats». (Αναρτημένη ανακοίνωση). G.E. Christopoulou, A. Stavropoulou, M. Assimakopoulou, G. Anastassopoulos, S. D. Panteliou, P. Raptou, E. Panagiotopoulos. «Administration of Aledronate Sodium Significantly Decelerates Osteoporosis Induced by Ovariectomy in Rats». (Αναρτημένη ανακοίνωση). M. Orkoula, C. Kontoyannis, G. Anastassopoulos, S. D. Panteliou, G. E. Christopoulou, A. Stavropoulou, M. Assimakopoulou, E. Panagiotopoulos, G. P. Lyritis. «Evaluating Osteoporosis with Raman Spectroscopy». (Αναρτημένη ανακοίνωση) 4. 7th Congress of the European Federation of National Association of Orthopedics and Traumatology (EFORT) Λισσαβώνα, 4-7 Ιουνίου 2005 Α. Stavropoulou, G.E. Christopoulou, M. Assimakopoulou, E. Panagiotopoulos. «Serum Leptin and Biochemical Markers of Bone Metabolism: A Positive Correlation in Ovariectomized Rats». (Αναρτημένη ανακοίνωση). G.E. Christopoulou, A. Stavropoulou, M. Assimakopoulou, G. Anastassopoulos, S. D. Panteliou, E. Panagiotopoulos. «The Effects of Atorvastatin and Aledronate on Osteoporosis Induced by Ovariectomy in Rats Modal Damping Factor: A New Assessment Method for Osteoporosis». (Αναρτημένη ανακοίνωση).

xxi ΔΟΜΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Ανατομίας- Ιστολογίας και Εμβρυολογίας του Ιατρικού τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών σε συνεργασία με το τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών και Αεροναυπηγών του Πανεπιστημίου Πατρών, στο πλαίσιο του χρηματοδοτούμενου από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας προγράμματος ΠΕΝΕΔ 2001 με τίτλο «Μεθοδολογίες ελέγχου δομικής ακεραιότητας σπογγωδών οστών». Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης νέων βιολογικών μορίων στην παθογένεια της οστεοπόρωσης και ειδικότερα του πιθανού ρόλου τους κατά την εξελικτική πορεία εμφάνισης της νόσου. Συγκεκριμένα στο πειραματικό μοντέλο των ωοθηκεκτομηθέντων επίμυων μελετήθηκαν οι μεταβολές των επιπέδων έκφρασης της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και OPG πριν την ωοθηκεκτομή και κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Η παρακολούθηση της δράσης των συγκεκριμένων παραγόντων σε τακτά χρονικά διαστήματα κατά την εκδήλωση της νόσου δεν έχει διαπιστωθεί βιβλιογραφικά στο παρελθόν και αποτελεί την πρωτοτυπία της παρούσας ερευνητικής προσπάθειας. Η διατριβή αποτελείται από τα εξής κεφάλαια: Κεφάλαιο 1: Στο πρώτο μέρος του κεφαλαίου γίνεται αναφορά για τη φυσιολογία των οστών. Περιγράφονται αναλυτικά τα αρχιτεκτονικά, δομικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά του οστίτη ιστού. Στο δεύτερο μέρος παρατίθενται βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με την παθογένεια της οστεοπόρωσης. Κεφάλαιο 2: Περιγράφονται οι πιο σημαντικές τεχνικές απεικόνισης και αξιολόγησης της δομικής ακεραιότητας των οστών. Κεφάλαιο 3: Διερευνάται η πρωτεΐνη του λιπώδους ιστού λεπτίνη, ένας πρόσφατα εμπλεκόμενος παράγοντας στη παθογένεια της οστεοπόρωσης. Γίνεται αναφορά στη δομή και τη δράση της λεπτίνης στον οστικό μεταβολισμό. Κεφάλαιο 4: Γίνεται αναφορά στο σύστημα RANKL-OPG-RANK και το ρόλο του στη φυσιολογία του οστίτη ιστού. Κεφάλαιο 5: Παρουσιάζονται αναλυτικά οι πειραματικές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πορεία της διατριβής. Κεφάλαιο 6: Αναφέρεται στα αποτελέσματα των αναλυτικών πειραματικών μετρήσεων. Κεφάλαιο 7: Αναλύονται και αξιολογούνται τα αποτελέσματα όλων των πειραματικών διαδικασιών, διεξάγονται συμπεράσματα και γίνεται αναφορά στις μελλοντικές προοπτικές έρευνας.

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΟΣΤΙΤΗ ΙΣΤΟΥ 1.1. Δομικά χαρακτηριστικά Ο σκελετός αποτελεί όργανο υψηλής ειδίκευσης και δυναμικής. Αποτελείται από κύτταρα με εξειδικευμένη δράση, επιμεταλλωμένες και μη-επιμεταλλωμένες επιφάνειες συνδετικού ιστού και από κενούς χώρους μεταξύ των οποίων εντοπίζεται η κοιλότητα του μυελού των οστών, οι κοιλότητες των αγγείων και τα οστικά βοθρία. Μακροσκοπικά τα μακρά οστά αποτελούνται περιφερειακά από τις επιφύσεις στο εσωτερικό των οποίων εντοπίζονται περιοχές με διαπλεκόμενες κοιλότητες που αποτελούν τη σπογγώδη μοίρα του οστού, και κεντρικά από τη διάφυση, μια περιοχή χωρίς κοιλότητες που αποτελεί τη συμπαγή μοίρα του οστού [1]. Εικόνα 1.1. Ανατομία μακρών οστών Το ώριμο οστό αποτελείται σε ποσοστό 25% από οργανική ουσία, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων τύπων οστικών κυττάρων (2-5%), κατά 5% από ύδωρ και κατά 70% από ανόργανα μέταλλα, κυρίως μόρια υδροξυαπατίτη ([Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ]). Η σύνδεση του υδροξυαπατίτη με τις ίνες κολλαγόνου είναι υπεύθυνη για τη χαρακτηριστική σκληρότητα και αντίσταση του οστού. Το νεο-σχηματιζόμενο οστό πριν τη διαδικασία της προσθήκης ανόργανων αλάτων, δηλαδή τη διαδικασία της επιμετάλλωσης της θεμέλιας ουσίας, αποτελείται σε ποσοστό 94% από ίνες κολλαγόνου και ονομάζεται οστεοειδές. Διάφορες πρωτεΐνες μοναδικές στο οστό, όπως η

2 οστεοκαλσίνη, παγιδεύονται στη θεμέλια ουσία και ρυθμίζουν τη διαδικασία της επιμετάλλωσης ή μεταβιβάζουν λειτουργικά σήματα μεταξύ των κυτταρικών πληθυσμών [1]. 1.2. Φυσιολογία της θεμέλιας ουσίας του οστίτη ιστού Η οργανική θεμέλια ουσία του οστίτη ιστού αποτελεί ένα καλά οργανωμένο δίκτυο πρωτεϊνών. Η κύρια συστατική ύλη είναι το κολλαγόνο τύπου Ι, ενώ οι μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες της θεμέλιας ουσίας καταλαμβάνουν το 10% της συνολικής πρωτεϊνικής σύστασης. Μία πληθώρα πρωτεϊνών της θεμέλιας ουσίας έχουν ανιχνευθεί, συμπεριλαμβανομένων της οστεοκαλσίνης (osteocalcin), της οστεοποντίνης (osteopontin), της οστεονεκτίνης (osteonectin), της οστικής σιαλοπρωτεϊνης (bone sialoprotein), της ντεκορίνης (decorin) και της μπιγλυκάνης (biglycan) [2,3]. Η οστεοκαλσίνη και η οστική σιαλοπρωτεΐνη κατά αποκλειστικότητα είναι ειδικές του οστίτη ιστού, ενώ οι υπόλοιπες ανιχνεύονται και σε μη ασβεστοποιημένους ιστούς [4]. 1.3. Φυσιολογία οστεοβλαστών Οι οστεοβλάστες είναι τα υπεύθυνα κύτταρα του οστίτη ιστού για το σχηματισμό της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και τη ρύθμιση της απόθεσης των ανόργανων συστατικών. Μορφολογικά, έχουν κυβοειδές σχήμα και εντοπίζονται στις οστικές επιφάνειες μαζί με τις πρόδρομες μορφές τους, σχηματίζοντας μια συνεχή κυτταρική στιβάδα. Μία πληθώρα κυτταρικών υποδοχέων και διαμεμβρανικών πρωτεϊνών έχουν ανιχνευθεί στην κυτταρική μεμβράνη των οστεοβλαστών με σκοπό την επικοινωνία με τα υπόλοιπα κύτταρα του οστίτη ιστού και τη θεμέλια ουσία και την απόκριση σε μεταβολικά και μηχανικά ερεθίσματα [5]. Ο χρόνος ζωής των οστεοβλαστών στον άνθρωπο κυμαίνεται στις 8 εβδομάδες κατά το οποίο αποθέτουν 1.5-15 μm οστεοειδούς την ημέρα. Μετά την ωρίμανσή τους ορισμένοι οστεοβλάστες παγιδεύονται στη θεμέλια ουσία, μεταβάλλουν το φαινότυπό τους και διαφοροποιούνται σε οστεοκύτταρα. 1.3.1. Διαφοροποίηση οστεοβλαστών Οι οστεοβλάστες προέρχονται από πολυδύναμα αδιαφοροποίητα μεσενχυματικά κύτταρα που έχουν την ικανότητα να διαφοροποιηθούν σε χονδροκύτταρα, οστικά κύτταρα, μυϊκά κύτταρα ή λιποκύτταρα μετά από την επίδραση τοπικών ή ορμονικών παραγόντων. Παρόλο που στο στρώμα του μυελού των οστών δεν έχουν ανιχνευθεί πρόδρομα αδιαφοροποίητα κύτταρα, in vitro και in vivo πειράματα δείχνουν την ύπαρξη ενός κοινού προγονικού κυττάρου μεταξύ των λιποκυττάρων και των οστεοβλαστών [6].

3 Εικόνα 1.2. Πορεία διαφοροποίησης των μεσενχυματικών κυττάρων προς οστεοβλάστες Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ο πρώιμος καθορισμός των πρόδρομων μεσενχυματικών κυττάρων προς συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο οφείλεται στην έκφραση ειδικών μεταγραφικών παραγόντων. Η έκφραση του παράγοντα Cbfa1 ή Runx2 είναι καθοριστική για την διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και την οστική παραγωγή. Ο μεταγραφικός παράγοντας Cbfa1 προσδένεται στην OSE2 αλληλουχία των υποκινητών διαφόρων γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων της α1 αλυσίδας του κολλαγόνου τύπου Ι, της οστικής σιαλοπρωτεΐνης, της οστεοποντίνης, του TGF-β και της οστεοκαλσίνης επάγοντας τους μηχανισμούς έκφρασής τους στο οστό [7]. Εικόνα 1.3. Πρωτεϊνικοί δείκτες που εκφράζονται κατά την πορεία διαφοροποίησης των πρόδρομων μεσενχυματικών κυττάρων σε λειτουργικούς οστεοβλάστες.

4 Πληθώρα αυξητικών παραγόντων κατέχουν σημαντική θέση στη ρύθμιση της οστεοβλαστογένεσης, όπως ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού (Transforming Growth Factor-β, TGF-β), ο οποίος έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την έκφραση του Cbfa1 σε καλλιέργειες οστεοβλαστικών κυττάρων, ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factor- 2, FGF-2) που φαίνεται να συμμετέχει κυρίως στην πορεία διαφοροποίησης των χονδροκυττάρων και οι μορφογενετικές πρωτεΐνες του οστού (Bone Morphogenetic Proteins BMPs), οι οποίες επάγουν in vitro την έκφραση του Cbfa1 [8]. Κατά την πορεία διαφοροποίησης των πρόδρομων μεσενχυματικών κυττάρων προς ώριμους οστεοβλάστες, μια αλληλουχία γεγονότων οδηγεί στην έκφραση ειδικών πρωτεϊνών χαρακτηριστικών του οστεοβλαστικού φαινοτύπου. Ως πρώιμος δείκτης των οστεοπρογονικών κυττάρων έχει αναφερθεί η οστική αλκαλική φωσφατάση (bone alkaline phosphatase, balp), την έκφραση της οποίας ακολουθεί το κολλαγόνο τύπου Ι και οι πρωτεΐνες της θεμέλιας ουσίας. Αυξανόμενη έκφραση της οστεοκαλσίνης και της οστικής σιαλοπρωτεΐνης παρατηρείται με την έναρξη της εναπόθεσης μετάλλων στο οστεοειδές από τους ώριμους οστεοβλάστες [9]. 1.3.2. Διαδικασία της οστικής παραγωγής Ο ρυθμός της οστικής παραγωγής καθορίζεται από την ενεργότητα των ώριμων οστεοβλαστών και από τον αριθμό των πρόδρομων οστεοβλαστικών κυττάρων που αρχίζουν να διαφοροποιούνται από το μυελό των οστών κατά τη διάρκεια της φάσης της οστικής παραγωγής [10]. Η οστική παραγωγή είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει τον καθορισμό της πορείας διαφοροποίησης (commitment) των πρόδρομων μεσενχυματικών κυττάρων προς τη κυτταρική σειρά των οστεοπρογονικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων μορφών των οστεοβλαστών και την προοδευτική διαφοροποίησή τους σε ώριμους λειτουργικούς οστεοβλάστες. Παρόλο που η κύρια λειτουργία των οστεοβλαστών είναι να συνθέτουν, να οργανώνουν και να επιμεταλλώνουν τη θεμέλια ουσία του οστού, τα κύτταρα της οστεοβλαστικής σειράς κατέχουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της οστικής ανακατασκευής. 1.4. Φυσιολογία Οστεοκυττάρων Τα οστεοκύτταρα, η πολυπληθέστερη ομάδα κυττάρων του οστίτη ιστού, είναι προϊόντα διαφοροποίησης των ώριμων οστεοβλαστών κατά τη διάρκεια της επιμετάλλωσης της θεμέλιας ουσίας του οστού. Είναι μικρότερα σε μέγεθος από τους οστεοβλάστες, περιέχουν λιγότερα κυτταροπλασματικά οργανίδια και ο πυρήνας τους καταλαμβάνει μεγάλο μέρος του κυτταροπλάσματος. Τα οστεοκύτταρα με τον εγκλεισμό τους στη θεμέλια ουσία σταματούν να πολλαπλασιάζονται και σχηματίζουν μέσω χασματοσυνδέσεων δίκτυα επικοινωνίας με τους

5 οστεοβλάστες, μεταβιβάζοντας σε αυτούς τα σήματα από τα μηχανικά φορτία που ασκούνται στην επιφάνεια του οστού [11]. 1.5. Φυσιολογία επενδυματικών κυττάρων Οι οστικές επιφάνειες κατά τη φάση ηρεμίας καλύπτονται από ένα στρώμα πάχους 1-2μm μη-επιμεταλλωμένης θεμέλιας ουσίας στην επιφάνεια της οποίας ανιχνεύεται μία στοιβάδα επίπεδων και επιμηκών κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται επενδυτικά κύτταρα και προέρχονται από οστεοβλάστες που έχουν επιτελέσει τη οστεοπαραγωγική τους λειτουργία. Ο ρόλος των επενδυτικών κυττάρων είναι να προφυλάσσουν τη θεμέλια ουσία από τη δράση των οστεοκλαστών, οι οποίοι δεν έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν μη-επιμεταλλωμένες οστικές επιφάνειες. Πιθανολογείται ότι τα επενδυτικά κύτταρα δέχονται σήματα από τα οστεοκύτταρα για να προσανατολίσουν χημειοτακτικά τις πρόδρομες μορφές οστεοκλαστών προς συγκεκριμένες θέσεις του οστού κατά την έναρξη της οστικής ανακατασκευής [12]. 1.6. Φυσιολογία Οστεοκλαστών Οι οστεοκλάστες είναι υψηλής ειδίκευσης κύτταρα εντοπισμένα στις ενδοοστικές επιφάνειες του οστού. Πρόκειται για μεγάλα πολυπύρηνα κύτταρα (10-20 πυρήνες / οστεοκλάστη) με μικρή συχνότητα εμφάνισης (2-3 οστεοκλάστες/mm 3 ). Χαρακτηριστικό γνώρισμα των οστεοκλαστών είναι η «πτυχωτή παρυφή», η επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης του οστεοκλάστη που βρίσκεται σε στενή επαφή με την προς απορρόφηση οστική επιφάνεια. Εικόνα 1.4. Δομή του οστεοκλάστη και ενδοκυτταρικός μηχανισμός της οστικής απορρόφησης Σε ιστολογικές τομές οστού οι οστεοκλάστες μπορούν να αναγνωριστούν από τη χαρακτηριστική τους μορφολογία, το μέγεθος, τον μεγάλο αριθμό πυρήνων και την ηωσινόφιλη κυτταροπλασματική τους χρώση. Επιπλέον ο εντοπισμός τους πάνω σε οστικές επιφάνειες ή κοντά

6 σε βοθρία του Howship διευκολύνει την ανίχνευσή τους. Η παρουσία όμως ενεργοποιημένων μακροφάγων ή πολυκύτταρων μακροφάγων κοντά στις οστικές επιφάνειες κυρίως σε παθολογικές καταστάσεις των οστών δυσχεραίνει την αναγνώρισή τους. Ειδικοί φαινοτυπικοί κυτταρικοί δείκτες, όπως ο υποδοχέας της βιτρονεκτίνης ή η ανθεκτική στο τρυγικό οξύ φωσφατάση (tartrateresistant acid phosphatase, TRAP) εφαρμόζονται συχνά για την ανίχνευση των οστεοκλαστών, παρόλο που και οι δύο δείκτες εκφράζονται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα [13]. Η χρήση του υποδοχέα της καλσιτονίνης ο οποίος εκφράζεται αποκλειστικά στην επιφάνεια των πρόδρομων αλλά και των ώριμων οστεοκλαστών αποτελεί μια εναλλακτική προσέγγιση στο διαχωρισμό των δύο κυτταρικών πληθυσμών [14]. Ο χρόνος ζωής των οστεοκλαστών στον άνθρωπο δεν είναι γνωστός. Η απόπτωση των οστεοκλαστών ρυθμίζεται από τοπικούς και συστημικούς παράγοντες [15]. 1.6.1. Διαφοροποίηση οστεοκλαστών Οι οστεοκλάστες προέρχονται από πρόδρομες μορφές κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος και συγκεκριμένα συγκαταλέγονται στην οικογένεια των μονοκυττάρων, των μακροφάγων και των πολυπύρηνων μακροφάγων με τα οποία μοιράζονται κοινά μορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, όπως την υψηλή έκφραση λυσοσωματικών ενζύμων και την ικανότητα φαγοκυττάρωσης [16]. Εικόνα 1.5. Πορεία διαφοροποίησης των οστεοκλαστών από τα πρόδρομα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος. Η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών απαιτεί την στενή επαφή των αδιαφοροποίητων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών με τους οστεοβλάστες ή με τα κύτταρα του

7 στρώματος του οστού. Ορμονικοί παράγοντες και κυτοκίνες που απελευθερώνονται από τους συγκεκριμένους κυτταρικούς πληθυσμούς ρυθμίζουν την παραγωγή των οστεοκλαστών [17]. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται οι μεταγραφικοί παράγοντες PU.1, FOS, NF-κB και MI καθώς και η κυτοκίνη M-CSF (Macrophage Colony-Stimulating Factor) ή αλλιώς CSF1 και η SRC κινάση της τυροσίνης [18]. Πρόσφατα ανακαλύφθηκαν δύο πολύ σημαντικά μόρια που ρυθμίζουν την οστεοκλαστογένεση, οι κυτοκίνες RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor NFkB-Ligand) και OPG (Osteoprotegerin), οι οποίες μαζί με την κυτοκίνη M-CSF δρουν στις πρόδρομες μορφές των οστεοκλαστών επάγοντας την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό τους [19]. Εικόνα 1.6. Δράση των OPG-RANKL στη διαδικασία ωρίμανσης του οστεοκλάστη 1.6.2. Διαδικασία της οστικής απορρόφησης Η οστική απορρόφηση από τους ώριμους οστεοκλάστες πραγματοποιείται στη μικροκοιλότητα που σχηματίζεται μεταξύ της πτυχωτής παρυφής του οστεοκλάστη και της οστικής επιφάνειας η οποία ονομάζεται βοθρίο του Howship. Η προσκόλληση των οστεοκλαστών στις οστικές επιφάνειες επιτελείται από ιντεγκρίνες που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας, συμπεριλαμβανομένων της οστεοποντίνης και της οστικής σιαλοπρωτεϊνης μέσω ειδικών δομών που καλούνται «ποδοσώματα». Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερείς γλυκοπρωτεϊνικοί υποδοχείς αποτελούμενοι από α- και β- υπομονάδες οι οποίες αναγνωρίζουν μεγάλο πλήθος κυτταρικών και εξωκυτταρικών προσδεμάτων. Οι εξωκυττάριες πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τις ιντεγκρίνες μέσω μιας τριπεπτιδικής αλληλουχίας (αργινίνη-γλυκίνηασπαρτικό οξύ) [20]. Κατά την ενεργοποίηση των ιντεγκρινών, τα ποδοσώματα συγκεντρώνονται στην κυτταρική περιφέρεια σχηματίζοντας μια μεγάλη κυκλική δομή, το δακτύλιο ακτίνης. Η ενεργότητα των οστεοκλαστών απαιτεί το σχηματισμό του δακτυλίου ακτίνης και η διάσπασή του αναστέλλει την οστική απορρόφηση. Η α ν β 3 ιντεγκρίνη ή αλλιώς ο υποδοχέας της βιτρονεκτίνης αποτελεί την κύρια ιντεγκρίνη των οστεοκλαστών, η οποία κατέχει καθοριστικό ρόλο στα

8 γεγονότα προσκόλλησης και στην απορροφητική ικανότητα των οστεοκλαστών. Αναστολή της δράσης της α ν β 3 ιντεγκρίνη μέσω αντισωμάτων που παρεμποδίζουν την επαφή της με τη θεμέλια ουσία του οστού, προκαλεί αναστολή της απορροφητικής δράσης των οστεοκλαστών [21]. Με σκοπό να απορροφηθεί η επιμεταλλωμένη θεμέλια ουσία, οι οστεοκλάστες παράγουν ιόντα υδρογόνου ώστε να διαλυτοποιηθούν τα μεταλλικά στοιχεία και πρωτεολυτικά ένζυμα για να αποικοδομηθεί η οργανική ουσία του οστού. Η οξίνιση της επιμεταλλωμένης θεμέλιας ουσίας εξαρτάται από τη δράση της καρβονικής ανυδράσης ΙΙ, η απουσία της οποίας οδηγεί σε οστεοπέτρωση λόγω πλήρους αναστολής της οστικής απορρόφησης. Η αποικοδόμηση του κολλαγόνου σε χαμηλό ph επιτελείται από τις καθεψίνες (cathepsins), εξειδικευμένα ένζυμα που παράγονται από τους οστεοκλάστες και απελευθερώνονται στο βοθρίο του Howship. Οι οστεοκλάστες παράγουν επίσης μεταλλοπρωτεϊνάσες της θεμέλιας ουσίας (MMP-1 και MMP-9), ο ρόλος των οποίων στην οστική απορρόφηση δεν έχει αποσαφηνιστεί καθώς είναι ανενεργές στο χαμηλό ph που υπάρχει στο βοθρίο. Έχει διαπιστωθεί ότι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της θεμέλιας ουσίας είναι απαραίτητες για τη μετανάστευση των οστεοκλαστών κατά τη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής. 1.7. Οστική ανακατασκευή Ο οστίτης ιστός χαρακτηρίζεται από αξιοσημείωτη δυνατότητα συνεχούς ανακατασκευής σε όλη τη διάρκεια της ζωής λόγω της συνεχούς απόκρισης του σε φυσικά φορτία και τάσεις που δέχεται το σκελετικό σύστημα και σε μεταβολές του μικροπεριβάλλοντός του. Η δομική ακεραιότητα των οστών διατηρείται μέσω μιας δυναμικής ισορροπιστικής διαδικασίας που είναι γνωστή ως οστική ανακατασκευή (Βone Τurnover). Η οστική ανακατασκευή είναι το αποτέλεσμα δύο αντίρροπων λειτουργικών διαδικασιών, της οστικής παραγωγής που επιτελείται από τους οστεοβλάστες και της οστικής απορρόφησης που επιτελείται από τους οστεοκλάστες. Διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ οστικής παραγωγής και οστικής απορρόφησης οδηγεί στην εμφάνιση μεταβολικών νοσημάτων των οστών όπως η οστεοπόρωση [22]. Η οστική ανακατασκευή ρυθμίζεται από αυξητικούς και ορμονικούς παράγοντες, καθώς και από μηχανικές και ηλεκτρικές δυνάμεις που ασκούνται στον σκελετό [23]. Σε μικροσκοπικό επίπεδο η οστική ανακατασκευή λαμβάνει χώρα σε μικρές περιοχές της σπογγώδους και φλοιώδους επιφάνειας του οστού, γνωστές ως βασικές πολυκυτταρικές μονάδες (Bone Multicellular Units, BMU). Η οστική απορρόφηση προηγείται πάντα της οστικής παραγωγής και στο νεανικό σκελετό το ποσό του οστού που απορροφάται είναι σχεδόν ίσο με το ποσό του οστού που σχηματίζεται εκ νέου. Για το λόγο αυτό η οστική ανακατασκευή υπό φυσιολογικές συνθήκες θεωρείται ισορροπημένη διαδικασία στο χώρο και στο χρόνο. Η οστική ανακατασκευή παρουσιάζει θετικό ισοζύγιο οστικής μάζας μέχρι την τρίτη δεκαετία της ζωής στον άνθρωπο και διατηρείται σε υψηλά επίπεδα με μικρές διακυμάνσεις μέχρι την ηλικία των 50