ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΥ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ Κατεύθυνση: ΣΧΟΛΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ ΑΓΩΓΗ Εκπόνηση µεταπτυχιακής διατριβής ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ, ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΚΑΙ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΣΩΜΑΤΟΣ ΜΕΤΑΞΥ ΚΩΠΗΛΑΤΩΝ ΥΨΗΛΟΥ ΕΠΙΠΕ ΟΥ ΚΑΙ ΜΗ ΑΘΛΟΥΜΕΝΩΝ της Κατσαρέλη Ελένης Θεσσαλονίκη, 2004 Τριµελής επιτροπή: Βασίλης Μούγιος, αναπληρωτής καθηγητής (επιβλέπων) Τµήµα Επιστήµης Φυσικής Αγωγής και Αθλητισµού, Α.Π.Θ. Άννα Τσιλιγκίρογλου-Φαχαντίδου, καθηγήτρια Τµήµα Επιστήµης Φυσικής Αγωγής και Αθλητισµού, Α.Π.Θ. Ηρακλής Κόλλιας, αναπληρωτής καθηγητής Τµήµα Επιστήµης Φυσικής Αγωγής και Αθλητισµού, Α.Π.Θ.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η αγωνιστική κωπηλασία θεωρείται ένα από τα πιο δύσκολα και απαιτητικά αθλήµατα, µε σκληρή προπόνηση και έντονες προσαρµογές στον οργανισµό των κωπηλατών. Αποτέλεσµα αυτών των προσαρµογών είναι οι κωπηλάτες να παρουσιάζουν διαφορές σε ορισµένες φυσιολογικές παραµέτρους σε σύγκριση µε µη αθλούµενους. Ωστόσο στη βιβλιογραφία παρουσιάζονται ελλείψεις ως προς τη διερεύνηση των παραπάνω. Σκοπός εποµένως της παρούσας έρευνας ήταν να συγκριθούν κωπηλάτες και µη αθλούµενοι ως προς αιµατολογικές και βιοχηµικές παραµέτρους, πρόσληψη θρεπτικών συστατικών και σύσταση σώµατος. Στην έρευνα έλαβαν µέρος είκοσι νέοι άντρες, από τους οποίους οι δέκα ήταν κωπηλάτες υψηλού επιπέδου και οι υπόλοιποι δέκα ήταν µη αθλούµενοι παρόµοιας ηλικίας και παρόµοιου δείκτη σωµατικής µάζας (BMI). Στους συµµετέχοντες πραγµατοποιήθηκε αιµοληψία για τον προσδιορισµό πέντε αιµατολογικών και δεκαπέντε βιοχηµικών παραµέτρων. Επιπλέον πραγµατοποιήθηκαν σωµατοµετρήσεις και µέτρηση του ποσοστού σωµατικού λίπους µε τις µεθόδους της βιοηλεκτρικής αντίστασης και της υδροστατικής ζύγισης. Τέλος, µοιράστηκαν στους συµµετέχοντες έντυπα καταγραφής της διατροφής για τρεις ηµέρες και επιτραπέζιοι ζυγοί για την καταγραφή της τροφής, ώστε να αναλυθεί ως προς την πρόσληψη των θρεπτικών συστατικών. Βρέθηκε ότι οι κωπηλάτες δεν διέφεραν σηµαντικά από τους µη αθλητές ως προς το βάρος, το ύψος, το BMI και το ποσοστό σωµατικού λίπους, µετρηµένο και µε τις δυο µεθόδους. Από τις αιµατολογικές και βιοχηµικές παραµέτρους σηµαντικές διαφορές παρουσιάστηκαν µόνο στη χοληστερόλη των υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών και στο ασβέστιο του ορού, ενώ από την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών σηµαντικές διαφορές βρέθηκαν στις φυτικές ίνες, στη βιταµίνη C, στη βιταµίνη B 1, στο φυλλικό οξύ και στο µαγγάνιο. Σε όλες τις προηγούµενες παραµέτρους οι αθλητές παρουσίασαν υψηλότερες τιµές. Τα παραπάνω αποτελέσµατα µας δίνουν τη δυνατότητα να έχουµε ένα πληρέστερο προφίλ κωπηλατών υψηλού επιπέδου σε δείκτες που σχετίζονται τόσο µε την υγεία, όσο και µε την αθλητική απόδοση. II
ABSTRACT Rowing is one of the most difficult sport events with painful training and intense adaptations. As a result, many physiological differences appeare between rowers and non-athletes. However, there are few studies with limited data on the aforementioned differences. Thus, the aim of the present study was to compare elite rowers and nonathletes in hematological and biochemical parameters, nutritient intake and body composition. Twenty young healthy men participated in the study. Ten of them were rowers and ten non-athletes, matched for age and body mass index (BMI). Blood samples were taken in order to measure five hematologic and fifteen biochemical parameters. We also measured body fat percentage by the methods of bioelectrical impendance and underwater weighing. Finally, we asked the participants to weigh and record their food intake for three days so that we could analyze their diet. There were no significant differences between rowers and non-athletes in height, weight, BMI, and body fat percentage. Rowers differed significantly from non-athletes in high-density lipoprotein cholesterol and calcium. Regarding participants diet, there were significant differences in fibers, vitamin C, vitamin B 1, folic acid, and manganese. Athletes had higher levels in all of the above parameters. In conclusion, the present study offers a comparison between elite rowers non-athletes in several health parameters. III
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη Abstract Περιεχόµενα ΙΙ ΙΙΙ ΙV Ανασκόπηση βιβλιογραφίας 2 Αιµατολογικές και βιοχηµικές παράµετροι 2 ιατροφή 5 Σύσταση σώµατος 6 Σκοπός της έρευνας 8 Σηµασία της έρευνας 8 Μεθοδολογία 9 είγµα 9 Περιγραφή δοκιµασιών 9 Αιµοληψία 9 ιατροφή 10 Σύσταση σώµατος 10 ΒΙΑ 10 Υδροστατική ζύγιση 11 Αιµατολογικοί προσδιορισµοί 12 Βιοχηµικοί προσδιορισµοί 12 Προσδιορισµός σιδήρου 13 Προσδιορισµός ολικής σιδηροδεσµευτικής ικανότητας (TIBC) 13 Υπολογισµός κορεσµού τρανσφερίνης 14 Προσδιορισµός φεριτίνης 14 IV
Προσδιορισµός γλυκόζης 14 Προσδιορισµός τριακυλογλυκερολών 15 Προσδιορισµός χοληστερόλης 16 Προσδιορισµός χοληστερόλης των HDL 17 Υπολογισµός χοληστερόλης των LDL 18 Προσδιορισµός ουρίας 18 Προσδιορισµός κρεατινίνης 19 Προσδιορισµός κρεατινικής κινάσης 20 Προσδιορισµός γ- γλουταµυλοτρανσφεράσης 21 Προσδιορισµός ασβεστίου 21 Προσδιορισµός µαγνησίου 22 Στατιστική επεξεργασία 22 Αποτελέσµατα 24 Αιµατολογικές παράµετροι 26 Βιοχηµικές παράµετροι 26 ιατροφή 28 Συζήτηση 32 Αιµατολογικές και βιοχηµικές παράµετροι 32 ιατροφή 34 Σύσταση σώµατος 35 Συµπεράσµατα 36 Βιβλιογραφία 38 Παράρτηµα Α 43 Παράρτηµα Β 44 V
VI
ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ, ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΚΑΙ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΣΩΜΑΤΟΣ ΜΕΤΑΞΥ ΚΩΠΗΛΑΤΩΝ ΥΨΗΛΟΥ ΕΠΙΠΕ ΟΥ ΚΑΙ ΜΗ ΑΘΛΟΥΜΕΝΩΝ Είναι γνωστό ότι η προπόνηση προκαλεί πληθώρα προσαρµογών στον ανθρώπινο οργανισµό. Πολλές από αυτές τις προσαρµογές ευνοούν την υγεία και την αύξηση της απόδοσης. Μια από τις πιο αντιληπτές προσαρµογές του ανθρώπινου οργανισµού στην άσκηση είναι η αλλαγή της σύστασης σώµατος, η οποία εκδηλώνεται µε µειωµένα ποσοστά σωµατικού λίπους και αύξηση της άλιπης µάζας. Επίσης, εξαιτίας της προπόνησής τους, οι αθλητές έχουν αυξηµένες διατροφικές ανάγκες και γι αυτό τα τελευταία χρόνια δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στην αθλητική διατροφή. Η διαφορετική διατροφή των αθλητών αλλά και η προπόνηση ενδέχεται να επηρεάζουν διάφορες αιµατολογικές και βιοχηµικές παραµέτρους. Η κωπηλασία θεωρείται από τα πιο δύσκολα και απαιτητικά αθλήµατα, µε µεγάλο όγκο καθηµερινής προπόνησης. Οι απαιτήσεις για καλύτερες επιδόσεις έχουν σαν αποτέλεσµα η προπόνηση να γίνεται πιο σκληρή και η ανάγκη για επιστηµονική παρακολούθηση των κωπηλατών πιο έντονη. Για τους παραπάνω λόγους είναι ενδιαφέρουσα η διερεύνηση πιθανών διαφορών των αθλητών κωπηλασίας από µη αθλούµενους ως προς αιµατολογικές και βιοχηµικές παραµέτρους, διατροφή και σύσταση σώµατος, δεδοµένου µάλιστα ότι δεν υπάρχουν µελέτες που να έχουν εξετάσει τις επιδράσεις της προπόνησης σφαιρικά στις παραπάνω παραµέτρους και, ακόµα περισσότερο, τη συσχέτισή τους. 1
ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Η κωπηλασία είναι ένα από τα πιο έντονα αερόβια Ολυµπιακά αθλήµατα (Kramer et al. 1994, Steinacker et al. 1998). Για το λόγο αυτό η προπόνησή της είναι επίπονη και απαιτητική, περιλαµβάνοντας κωπηλασία, τρέξιµο, µυϊκή ενδυνάµωση µε αντιστάσεις και ασκήσεις ευλυγισίας, ενώ διαρκεί περίπου ένα τρίωρο (Jurimae et al. 2000). Οι κωπηλάτες είναι συνήθως ψηλοί, µυώδεις και µε χαµηλό ποσοστό σωµατικού λίπους και αυτό γιατί το συγκεκριµένο άθληµα απαιτεί ενεργοποίηση του 70 % περίπου της συνολικής µυϊκής µάζας (De Garay et al. 1974, Hagerman et al. 1996). Η αγωνιστική κωπηλασία θεωρείται από τα πιο δύσκολα και απαιτητικά αθλήµατα, καθώς οι κωπηλάτες αγωνίζονται για περίπου πέντε µε έξι λεπτά, σε ελαφρώς υποµέγιστες συνθήκες (Κουτεντάκης και συν. 1998). Για το λόγο αυτό οι κωπηλάτες υψηλού επιπέδου είναι µεταξύ εκείνων των αθλητών που παρουσιάζουν τις υψηλότερες τιµές σε παραµέτρους φυσικής κατάστασης (Koutedakis & Sharp 1990). Ωστόσο, δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία σε ό,τι αφορά τις αιµατολογικές και βιοχηµικές παραµέτρους, τη διατροφή και τα σωµατοµετρικά χαρακτηριστικά των κωπηλατών. εδοµένης της µεγάλης προπονητικής επιβάρυνσής τους, οι κωπηλάτες προσφέρονται για διερεύνηση της επίδρασης της έντονης σωµατικής δραστηριότητας στις παραµέτρους αυτές. Αιµατολογικές και βιοχηµικές παράµετροι Στις αιµατολογικές και βιοχηµικές παραµέτρους βρέθηκαν λίγες έρευνες για κωπηλάτες. Πιο συγκεκριµένα µία έρευνα η οποία αξιολόγησε την επίδραση της χρόνιας προπόνησης αντοχής και δύναµης στα αιµατολογικά και βιοχηµικά χαρακτηριστικά αθλητών είναι αυτή του Spodaryk (1993), όπου συµµετείχαν δύο οµάδες αθλητών και µία ελέγχου. Η πρώτη οµάδα αθλητών αποτελούνταν από αθλητές αντοχής (ποδηλασίας, κανώ και κωπηλασίας, ν = 22), η δεύτερη από αθλητές δύναµης (άρσης βαρών και τζούντο, ν = 17) και η οµάδα ελέγχου από αγύµναστους άνδρες (ν = 48). Από την ανάλυση των δειγµάτων του αίµατος των συµµετεχόντων διαπιστώθηκε ότι η συγκέντρωση της αιµοσφαιρίνης των αθλητών αντοχής ήταν σηµαντικά χαµηλότερη από την αντίστοιχη των αθλητών δύναµης και της οµάδας ελέγχου. 2
Αντίθετα οι συγκεντρώσεις του σιδήρου, της φεριτίνης και της τρανσφερίνης στον ορό δεν παρουσίασαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των τριών οµάδων. Επίσης σε πρόσφατη µελέτη (Blinkworth et al. 2004) αναφέρθηκε φυσιολογική συγκέντρωση αιµοσφαιρίνης (13,3-13,9 g/dl) σε κωπηλάτριες. Οι Biancotti και συν. (1992) σύγκριναν 181 αθλητές από εφτά αθλήµατα, µεταξύ των οποίων και η κωπηλασία, ως προς τον αιµατοκρίτη την αιµοσφαιρίνη, τα ερυθροκύτταρα, το σίδηρο, την τρανσφερίνη και τη φεριτίνη. Από τις µετρήσεις δεν βρέθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές ως προς τις παραπάνω παραµέτρους µεταξύ των αθληµάτων. Μόνο οι δροµείς παρουσίασαν σηµαντικά χαµηλότερη αιµοσφαιρίνη από τους υπόλοιπους αθλητές. Βιοχηµικές παράµετροι αθλητών κωπηλασίας µελετήθηκαν και σε σύγκριση µε δροµείς µεσαίων αποστάσεων και οµάδα ελέγχου (Dufaux et al. 1981). Όλοι οι αθλητές ήταν υψηλού επιπέδου και οι αναλύσεις που έγιναν αφορούσαν τις συγκεντρώσεις της φεριτίνης, της τρανσφερίνης και του σιδήρου. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι οι κωπηλάτες είχαν σηµαντικά υψηλότερη φεριτίνη σε σύγκριση µε την οµάδα ελέγχου, ενώ η τρανσφερίνη και ο σίδηρος βρίσκονταν στα ίδια επίπεδα. Σε ό,τι αφορά τους δροµείς, αυτοί είχαν σηµαντικά χαµηλότερη φεριτίνη και σίδηρο από την οµάδα ελέγχου, ενώ η τρανσφερίνη δε διέφερε σηµαντικά. Επιπλέον, σε υψηλού επιπέδου κωπηλάτες έχει διερευνηθεί η µεταβολή στη γλυκόζη κατά τη διάρκεια προπόνησης δώδεκα µηνών (Petibois et al. 2003). Μέσα σε αυτούς τους δώδεκα µήνες πραγµατοποιήθηκαν δεκαεννιά αξιολογήσεις της µέγιστης απόδοσης σε κωπηλασία 18 km. Πριν και µετά την κάθε µέγιστη αξιολόγηση πραγµατοποιούνταν αιµοληψία. Από την επεξεργασία των αποτελεσµάτων διαπιστώθηκε ότι η γλυκόζη σταθεροποιήθηκε µετά από πέντε µόλις εβδοµάδες προπόνησης και δεν παρουσίασε καµία µεταβολή µέχρι την ολοκλήρωση του προγράµµατος. Σε ό,τι αφορά την κρεατινική κινάση, έχουν πραγµατοποιηθεί µελέτες τόσο σε κωπηλάτες όσο και σε κωπηλάτριες. Μια από αυτές πραγµατοποιήθηκε σε κωπηλάτες, όπου οι έξι συµµετέχοντες εφάρµοσαν για τρεις ηµέρες τρία διαφορετικά πρωτόκολλα προπόνησης, από τα οποία το πρώτο ήταν πρωτόκολλο αντοχής, το δεύτερο διαλειµµατικής προπόνησης και το τρίτο προπόνησης αντιστάσεων (Kokalas et al. 3
2004). Το πρωί, πριν την προπόνηση, πραγµατοποιούνταν αιµοληψία, η οποία επαναλαµβάνονταν αµέσως µετά το τέλος της προπόνησης, ενώ ένα τρίτο δείγµα αίµατος λαµβάνονταν τέσσερις ώρες µετά την ολοκλήρωση της προπόνησης. Από την επεξεργασία των αποτελεσµάτων διαπιστώθηκε ότι η κρεατινική κινάση δε διέφερε σηµαντικά ανάµεσα στις τρεις αιµοληψίες, τόσο κατά την ηµέρα της ξεκούρασης όσο και κατά τις τρεις ηµέρες εφαρµογής των πρωτοκόλλων. Οι µόνες σηµαντικές διαφορές που καταγράφηκαν ήταν στην τρίτη αιµοληψία, κατά τις ηµέρες εφαρµογής των πρωτοκόλλων αντοχής και αντίστασης, σε σύγκριση µε την ηµέρα ξεκούρασης, γεγονός που δηλώνει αυξηµένη µυϊκή καταστροφή. Ωστόσο, πρέπει να σηµειωθεί ότι οι τιµές που καταγράφηκαν ήταν της τάξης των 250 U/L (37 C), δηλαδή όχι ιδιαίτερα υψηλές, δείχνοντας ότι το µυϊκό σύστηµα των αθλητών ήταν καλά προσαρµοσµένο στις προπονητικές επιβαρύνσεις. Σε ό,τι αφορά το λιπιδαιµικό προφίλ των αθλητών και αθλητριών κωπηλασίας, δεν υπάρχουν στοιχεία πέρα από µια µελέτη σε αθλητές διαφόρων αθληµάτων, µεταξύ των οποίων και κωπηλάτες. Συγκεκριµένα αναφέρθηκε ότι οι αθλητές παρουσίασαν σε χαµηλότερο βαθµό υπερχοληστερολαιµία και υπερτριγλυκεριδαιµία, ενώ η χοληστερόλη των υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (HDL) ήταν αυξηµένη σε σύγκριση µε µη αθλούµενους (Saldana et al. 1995). Τέλος, σε πρόσφατη έρευνα των Nikolaidis και συν. (2003) πραγµατοποιήθηκε σύγκριση µεταξύ αιµατολογικών και βιοχηµικών παραµέτρων σε διάφορους πληθυσµούς. Πιο συγκεκριµένα στην έρευνα έλαβαν µέρος 579 αθλητές, µεταξύ των οποίων και ορισµένοι κωπηλάτες, και 241 µη αθλητές. Από τα αποτελέσµατα φάνηκαν σηµαντικές διαφορές σε αρκετές παραµέτρους, όπως η αιµοσφαιρίνη, οι τριακυλογλυκερόλες, το µαγνήσιο, η κρεατινική κινάση και η αµινοτρανσφεράση του ασπαρτικού οξέος (AST). Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, υπάρχει έλλειψη σε αιµατολογικά και βιοχηµικά δεδοµένα στο άθληµα της κωπηλασίας. Στις περισσότερες µελέτες οι κωπηλάτες αποτελούν ένα µέρος των αθλητών που εξετάζονται, ενώ παράλληλα ο αριθµός των αιµατολογικών κα βιοχηµικών παραµέτρων είναι µικρός. Κατά συνέπεια δεν υπάρχει ολοκληρωµένη εικόνα σε ό,τι αφορά τα παραπάνω. 4
ιατροφή Η κωπηλασία είναι ένα από τα αθλήµατα µε τις µεγαλύτερες ενεργειακές απαιτήσεις. Αν και το ενεργειακό κόστος ενός αγώνα κωπηλασίας 2000 m, που διαρκεί γενικά 5-6 min, είναι περίπου 200-250 kcal (Hagerman 1984, Hagerman et al. 1978, Hagerman & Hagerman 1990), η ενέργεια η οποία απαιτείται για προπόνηση 1-2 ωρών είναι 1000-2000 kcal (Hagerman 1994, Hagerman & Hagerman 1990). Μία έρευνα η οποία αξιολόγησε τη διατροφή κωπηλατριών είναι αυτή των Steen και συν. (1995), στην οποία οι ερευνητές ανέλυσαν τη διατροφή δεκαέξι κωπηλατριών, χρησιµοποιώντας τη µέθοδο της καταγραφής από τις ίδιες τις αθλήτριες για πέντε συνεχόµενες ηµέρες. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η ηµερήσια ενεργειακή πρόσληψη ήταν κατά µέσο όρο 2633 kcal, ποσό το οποίο κρίθηκε χαµηλό σε σύγκριση µε τις ηµερήσιες ενεργειακές ανάγκες που αναφέρθηκαν προηγουµένως. Από την ανάλυση της σύστασης της διατροφής διαπιστώθηκε ότι η πρόσληψη υδατανθράκων ήταν χαµηλότερη από τη συνιστώµενη, των πρωτεϊνών ήταν ικανοποιητική, ενώ του λίπους ήταν πάνω από τη συνιστώµενη. Σε ό,τι αφορά τα µικροθρεπτικά συστατικά, βρέθηκε ότι το ασβέστιο, ο ψευδάργυρος και οι βιαταµίνες B 6 και B 12 κυµαίνονταν στα 2/3 της συνιστώµενης ηµερήσιας πρόσληψης. Μεγαλύτερες τιµές ηµερήσιας ενεργειακής πρόσληψης καταγράφηκαν σε έρευνα των Hagerman και Hagerman (1990) σε 28 αθλήτριες κωπηλασίας. Η µέση ενεργειακή πρόσληψη υπολογίστηκε στις 3169 kcal, τιµή πολύ κοντινή µε τη µέση ενεργειακή δαπάνη (3177 kcal), που υπολογίστηκε στην ίδια µελέτη µέσω της µέγιστης πρόσληψης οξυγόνου και του καρδιακού ρυθµού. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η έρευνα των Xia και συν. (2001), οι οποίοι αξιολόγησαν τη διατροφή ενός µόνο κωπηλάτη, ο οποίος όµως είχε κερδίσει τρία χρυσά µετάλλια σε παγκόσµια πρωταθλήµατα κωπηλασίας. Μετά από την καταγραφή της διατροφής του αθλητή για τρεις ηµέρες, οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι διατηρούσε ενεργειακό ισοζύγιο, έχοντας ηµερήσια ενεργειακή πρόσληψη 4088 kcal και δαπάνη 4125 kcal. Επιπλέον, η σωµατική µάζα του κωπηλάτη διατηρούνταν σταθερή δίνοντας µε τον τρόπο αυτό άλλη µια ένδειξη της σταθερότητας του ενεργειακού ισοζυγίου. Η ανάλυση της ηµερήσιας ενεργειακής πρόσληψης του αθλητή έδειξε ότι το 19 % της 5
ενέργειας προερχόταν από τις πρωτεΐνες, το 51 % από τους υδατάνθρακες και το 30 % από τα λίπη. Σε µια πιο πρόσφατη έρευνα (Hill & Davies 2002) υπολογίστηκε η ηµερήσια ενεργειακή πρόσληψη επτά κορυφαίων κωπηλατριών της Αυστραλίας και διαπιστώθηκε ότι ήταν κατά µέσο όρο 2214 kcal. Ωστόσο δεν αναφέρθηκε ανάλυση της διατροφής των εθελοντριών. Από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας σε σχέση µε τη διατροφή των κωπηλατών διαπιστώνεται ότι υπάρχει έλλειψη στοιχείων και χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Σύσταση σώµατος Σε ό,τι αφορά τα σωµατοµετρικά χαρακτηριστικά, στη βιβλιογραφία βρέθηκαν µελέτες που εξέτασαν τόσο το ύψος και το βάρος των αθλητών της κωπηλασίας, όσο και το σωµατικό τους λίπος. Σε σχέση µε το ύψος και το βάρος, οι έρευνες που έχουν πραγµατοποιηθεί αφορούν αθλητές εθνικού επιπέδου, προχωρηµένους, έφηβους αθλητές και γυναίκες. Για τους αθλητές που συµµετείχαν στις εθνικές οµάδες διαφόρων χωρών, οι τιµές που έχουν καταγραφεί για το ύψος και το βάρος κυµαίνονται από 1,84 ως 1,95 m και από 80 ως 93 kg αντίστοιχα (Danuser and Buhlmann, 1983, Biersteker et al. 1986, McCully et al. 1989, de Rose et al. 1989, Secher, 1990, Hartmann et al. 1993, Roth et al. 1993 και Peltonen et al. 1995). Επίσης ο Shephard (1998) σε έρευνά του υπολόγισε το µέσο όρο του ύψους και του βάρους των κωπηλατών αυτού του επιπέδου. Χρησιµοποίησε µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν από το 1971 µέχρι το 1995 και διαπίστωσε ότι σε σύνολο δείγµατος 1153 κωπηλατών το µέσο ύψος ήταν 1,91 m. Επίσης σε σύνολο δείγµατος 1178 ατόµων το µέσο βάρος ήταν στα 89 kg. Για τους κωπηλάτες υψηλού επιπέδου, οι οποίοι όµως δε συµµετείχαν στις εθνικές οµάδες, τα αποτελέσµατα των ερευνών έδειξαν ότι το ύψος και το βάρος τους κυµαίνονταν από 1,76 ως 1,92 m και 70 ως 90 kg αντίστοιχα (Poortman et al. 1990, Roy et al. 1990, Secher 1990, Chenier & Leger 1991, Russo et al. 1992, Hanel et al. 1993, Lormes et al. 1993, Snegovskaya & Viru 1993, Steinacker et al. 1993a, Cohen et al. 1995, Nielsen et al. 1995, Oda & Moritani 1995, Beneke 1995, Beneke & von 6
Duvillard 1996, Jensen et al. 1996, Marriott & Lamb 1996 Jurimae & Jurimae 2002 και Yoshiga & Higuchi 2003). Τέλος ο Shephard (1998) υπολόγισε το µέσο ύψος 287 κωπηλατών και το µέσο βάρος 341 χρησιµοποιώντας έρευνες από το 1990 µέχρι το 1996, σε 1,84 m και 81 kg. O υπολογισµός του σωµατικού λίπους των ενήλικων αθλητών της κωπηλασίας έχει απασχολήσει τους ερευνητές και για το σκοπό αυτό έχει χρησιµοποιηθεί κυρίως η µέθοδος των δερµατοπτυχών. Τα αποτελέσµατα των ερευνών δίνουν τιµές σωµατικού λίπους που ποικίλουν: 11 % (de Pauw and Vrijens, 1971), 11% (Hagerman et al., 1979), 7,8 % (Carter, 1982a), 9,6 % (McKenzie and Rhodes, 1982) και 7,3 % (Morris and Payne, 1996). Επιπλέον σε έρευνα που πραγµατοποιήθηκε σε νεαρούς Εσθονούς κωπηλάτες µε ύψος 1,91 m και βάρος 81,1 kg, βρέθηκαν να έχουν BMI 23,9 kg/m 2 και σωµατικό λίπος 10,5 % µε τη µέθοδο των δερµατοπτυχών (Jurimae and Jurimae 2002), ενώ σε άλλη µελέτη της ίδιας ερευνητικής οµάδας τα χαρακτηριστικά των κωπηλατών ήταν 1,88 m, 82 kg και 23,7 kg/m 2 (Jurimae et al. 2000). Σε έρευνα, τέλος, των Morris και Payne (1996) µελετήθηκε η µεταβολή του βάρους 12 κωπηλατών από τη περίοδο προετοιµασίας µέχρι την αγωνιστική περίοδο. ιαπιστώθηκε ότι το βάρος τους µειώθηκε από 75,6 σε 69,8 kg, ενώ το ποσοστό σωµατικού λίπους από 10,0 σε 7,8 %, το τελευταίο µετρηµένο µε τη µέθοδο των δερµατοπτυχών. Αυτή η µείωση οφείλονταν τόσο στην άσκηση, όσο και στη µείωση της πρόσληψης ενέργειας και λιπών µέσω της τροφής. Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, οι µελέτες που έχουν πραγµατοποιηθεί στο χώρο της κωπηλασίας είναι λίγες. Σε ό,τι αφορά τα σωµατοµετρικά χαρακτηριστικά, υπάρχουν δεδοµένα για ύψος και βάρος, ωστόσο οι περισσότερες λιποµετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν µε τη µέθοδο των δερµατοπτυχών. Παράλληλα δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία για τις αιµατολογικές και για πολλές βιοχηµικές παραµέτρους. Επίσης δεν υπάρχουν στοιχεία για τη διατροφή των κωπηλατών, είτε πρόκειται για διατροφικές συνήθειες είτε για συγκεκριµένες προσλήψεις µακροθρεπτικών και µικροθρεπτικών συστατικών. Επιπλέον, στις υπάρχουσες µελέτες εξετάστηκαν µεµονωµένα ορισµένες βιοχηµικές παράµετροι, η διατροφή και η σύσταση σώµατος κωπηλατών µε αποτέλεσµα να µην υπάρχει µια ολοκληρωµένη εικόνα αυτών των πιθανώς αλληλοεξαρτώµενων παραµέτρων. 7
ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Σκοπός εποµένως της παρούσας µελέτης ήταν να συγκριθούν κωπηλάτες και µη αθλούµενοι όµοιας ηλικίας και BMI ως προς: αιµατολογικές παραµέτρους βιοχηµικές παραµέτρους πρόσληψη θρεπτικών συστατικών σύσταση σώµατος Επίσης σκοπός ήταν να εξεταστούν και πιθανές συσχετίσεις µεταξύ των παραπάνω παραµέτρων. ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Στην παρούσα έρευνα µετρήθηκαν ταυτόχρονα αιµατολογικά, βιοχηµικά, διατροφικά και σωµατοµετρικά στοιχεία, κάτι που λείπει από προηγούµενες έρευνες σε κωπηλάτες. Αυτό επέτρεψε το σχηµατισµό µιας σφαιρικής εικόνας σε δείκτες που σχετίζονται τόσο µε την υγεία, όσο και µε την αθλητική απόδοση σε ένα αρκετά διαδεδοµένο άθληµα. Επίσης, για πρώτη φορά οι αθλητές κωπηλασίας συγκρίθηκαν ως προς όλα τα παραπάνω στοιχεία µε µη αθλούµενους αντίστοιχης ηλικίας και BMI. Αυτό µε τη σειρά του βοήθησε στην εξαγωγή χρήσιµων συµπερασµάτων σχετικά µε την επίδραση της έντονης αθλητικής ενασχόλησης στις υπό µελέτη παραµέτρους. 8
ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ είγµα Στην έρευνα έλαβαν µέρος είκοσι νέοι άντρες, από τους οποίους οι δέκα ήταν κωπηλάτες υψηλού επιπέδου και οι υπόλοιποι δέκα ήταν µη αθλούµενοι (δεν συµµετείχαν σε καµία αθλητική δραστηριότητα) παρόµοιας ηλικίας και παρόµοιου BMΙ. Όλα τα άτοµα ήταν υγιή και δεν έπασχαν από κάποια οξεία ή χρόνια πάθηση, ενώ κανένας από τους συµµετέχοντες δεν χρησιµοποιούσε συµπληρώµατα διατροφής ή φάρµακα. Οι αθλητές συµµετείχαν σε 7 έως 12 προπονήσεις κάθε εβδοµάδα, διάρκειας 2 ωρών η καθεµιά. Το πρόγραµµά τους, εκτός από την κωπηλασία, περιλάµβανε µυϊκή ενδυνάµωση µε αντιστάσεις 1 µε 3 φορές την εβδοµάδα, τρέξιµο, κωπηλατοεργόµετρο και ποδηλασία, ανάλογα µε την προπονητική περίοδο στην οποία βρίσκονταν. Η VO 2 max των κωπηλατών, µετρηµένη σε κωπηλατοεργόµετρο µε µέριµνα της οµάδας τους, ήταν 64 ± 8 ml/kg/min. Οι συµµετέχοντες πήραν µέρος στην έρευνα εθελοντικά, αφού ενηµερώθηκαν γραπτά για το σχεδιασµό της. Η µελέτη πραγµατοποιήθηκε σύµφωνα µε τις κατευθυντήριες γραµµές του Κώδικα εοντολογίας Ερευνών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Περιγραφή οκιµασιών 1. Αιµοληψία Οι συµµετέχοντες προσήλθαν πρωί και µετά από ολονύκτια νηστεία στο εργαστήριο για την πραγµατοποίηση αιµοληψίας, κατά την οποία λήφθηκαν 7 ml φλεβικού αίµατος (5 ml για τη µέτρηση των βιοχηµικών παραµέτρων και 2 ml σε σωλήνα µε EDTA για τη µέτρηση των αιµατολογικών παραµέτρων) από το βραχίονα σε καθιστή θέση. Μετά την πήξη των 5 ml, το αίµα φυγοκεντρήθηκε σε φυγοκεντρητή της εταιρίας Hellenic Labware (Αθήνα) στα 1500 g για 10 λεπτά. Ο ορός που παράχθηκε, αποθηκεύθηκε στους 80 C µέχρι την ανάλυσή του. Τα 2 ml του ολικού αίµατος χρησιµοποιήθηκαν την ίδια µέρα. 9
2. ιατροφή Την ηµέρα που πραγµατοποιήθηκε η αιµοληψία, οι συµµετέχοντες συµπλήρωσαν ένα ερωτηµατολόγια σχετικό µε τις διατροφικές τους συνήθειες (Παράρτηµα Α). Επίσης µοιράστηκαν στους συµµετέχοντες έντυπα καταγραφής της διατροφής τους για τρεις ηµέρες µιας εβδοµάδας και συγκεκριµένα την Τρίτη, την Πέµπτη και την Κυριακή (Παράρτηµα Β). Για την ακριβή καταγραφή της ποσότητας των τροφίµων δόθηκε στους συµµετέχοντες επιτραπέζιος ζυγός, όπου ζύγιζαν την τροφή που κατανάλωναν. Επίσης ζητήθηκε από τους εθελοντές να µην αλλάξουν τις διατροφικές τους συνήθειες κατά την εβδοµάδα καταγραφής της διατροφής. Για την ανάλυση της διατροφής χρησιµοποιήθηκε µια βάση δεδοµένων που δηµιουργήθηκε στο εργαστήριό µας από στοιχεία της Food Standards Agency (2002) και Τριχοπούλου (1992), καθώς και από τις ετικέτες συσκευασµένων τροφίµων, σε ένα πρόγραµµα της Access της εταιρείας Microsoft. 3. Σύσταση σώµατος Κατά την επίσκεψη των εθελοντών στο εργαστήριο µετρήθηκε η σωµατική µάζα σε ηλεκτρονικό ζυγό της εταιρίας Seca (Hamburg, Γερµανία) µε ακρίβεια 0,1 kg και το ύψος µε αναστηµόµετρο, ενσωµατωµένο στον ίδιο ζυγό µε ακρίβεια 0,1 cm. Από τα δεδοµένα αυτά υπολογίστηκε ο BMI. Στη συνέχεια µετρήθηκε το ποσοστό του σωµατικού λίπους των εθελοντών µε τη µέθοδο της βιοηλεκτρικής αντίστασης (ΒΙΑ) µε τη συσκευή Bodystat 1500 της εταιρίας Bodystat (Douglas, Ηνωµένο Βασίλειο) και µε τη µέθοδο της υδροστατικής ζύγισης σε κάδο µε χρήση ειδικού προγράµµατος κατασκευασµένου από τον κ. Ηρακλή Κόλλια. Με αυτό τον τρόπο µπορέσαµε να συγκρίνουµε την πρακτική µέθοδο ΒΙΑ µε τη µέθοδο αναφοράς για την εκτίµηση του σωµατικού λίπους, την υδροστατική ζύγιση. ΒΙΑ Η εκτίµηση του σωµατικού λίπους µε τη µέθοδο BIA στηρίζεται στο ότι ο λιπώδης ιστός έχει διαφορετική ηλεκτρική αντίσταση (µεγαλύτερη) από την άλιπη µάζα του σώµατος, λόγω της µικρότερης περιεκτικότητάς του σε νερό και ηλεκτρολύτες. Για την 10
εφαρµογή της οι εξεταζόµενοι ξάπλωσαν σε ύπτια θέση και τους εφαρµόστηκαν τέσσερα ηλεκτρόδια, δύο στο δεξί χέρι και δύο στο δεξί πόδι, µέσω των οποίων διοχετεύτηκε ρεύµα χαµηλής έντασης. Από την ηλεκτρική αντίσταση που κατέγραψε το όργανο µέτρησης υπολογίστηκε το ποσοστό σωµατικού λίπους. Επειδή η µέθοδος στηρίζεται στην εκτίµηση του σωµατικού νερού, ζητήθηκε από τους συµµετέχοντες να είναι νηστικοί, να µην έχουν προσλάβει υγρά τις τελευταίες 4 ώρες, να µην έχουν ασκηθεί τις τελευταίες 12 ώρες και να µην έχουν προσλάβει καφεϊνούχα ποτά, ούτε να έχουν κάνει σάουνα τις τελευταίες 24 ώρες. Η µέθοδος BIA, εκτός από το ποσοστό σωµατικού λίπους, µας έδωσε στοιχεία και για το σωµατικό νερό, τον εκτιµώµενο βασικό µεταβολικό ρυθµό και την εκτιµώµενη ηµερήσια ενεργειακή ανάγκη στη βάση του εκτιµώµενου από τον εξεταστή επιπέδου φυσικής δραστηριότητας. Υδροστατική ζύγιση Η εκτίµηση του σωµατικού λίπους µε τη µέθοδο της υποβρύχιας ζύγισης πραγµατοποιήθηκε σε ειδικό κάδο µε νερό. Με τη µέθοδο αυτή µετρήθηκε η πυκνότητα του σώµατος και µε τη χρήση κατάλληλων εξισώσεων προσδιορίστηκε το σωµατικό λίπος, δεδοµένου ότι η άλιπη µάζα έχει διαφορετική πυκνότητα από την λιπώδη. Για την εκτίµηση του όγκου του σώµατος χρησιµοποιήθηκε η αρχή του Αρχιµήδη, σύµφωνα µε την οποία κάθε σώµα βυθιζόµενο στο νερό χάνει τόσο βάρος, όσο είναι το βάρος του νερού που εκτοπίζει. Το ποσοστό του σωµατικού λίπους υπολογίστηκε τελικά µε τη χρήση της εξίσωσης του Siri (1996) για ενήλικους άνδρες: BF% = 495/d - 450, όπου BF% το ποσοστό σωµατικού λίπους και d η πυκνότητα του σώµατος: Ba d = ( Ba Bv) ( RV + 100) dv όπου Βα το βάρος στον αέρα (σε g), Βv το βάρος στο νερό (σε g), dν η πυκνότητα του νερού (σε g/ml) και RV ο υπολειπόµενος όγκος των πνευµόνων (σε ml). Tα 100 ml που προστέθηκαν στο RV είναι ο υποτιθέµενος όγκος των αερίων που υπάρχουν στον γαστρεντερικό σωλήνα και που είναι δύσκολο να µετρηθεί. Για τον υπολογισµό του RV χρησιµοποιήθηκε η εξίσωση: 11
RV (σε L) = 0,017 (ηλικία σε έτη) + 0,06858 (ύψος σε ίντσες) - 3,477 Στη συνέχεια πραγµατοποιούνταν οι µετρήσεις και η διαδικασία ολοκληρώνονταν µετά από δέκα επαναλήψεις, από τις οποίες αποκλείονταν τελικά οι ακραίες τιµές. Αιµατολογικοί προσδιορισµοί Στο ολικό αίµα προσδιορίστηκε ο αιµατοκρίτης, η αιµοσφαιρίνη και ο αριθµός ερυθροκυττάρων για την εξέταση του συστήµατος µεταφοράς οξυγόνου, ο αριθµός λευκοκυττάρων για την εξέταση του ανοσοποιητικού συστήµατος και ο αριθµός αιµοπεταλίων ως δείκτης της πήξης του αίµατος. Οι αναλύσεις πραγµατοποιήθηκαν σε αυτόµατο αναλυτή Coulter Micro Diff II (Μαϊάµι, ΗΠΑ). Βιοχηµικοί προσδιορισµοί Στον ορό προσδιορίστηκαν οι ακόλουθες βιοχηµικές παράµετροι: Ο σίδηρος, η ολική σιδηροδεσµευτική ικανότητα (TIBC), ο κορεσµός τρανσφερίνης και η φεριτίνη για την εξέταση της κατάστασης σιδήρου. Η γλυκόζη για την εξέταση του µεταβολισµού των υδατανθράκων. Οι τριακυλογλυκερόλες ή τριγλυκερίδια (TG), η ολική χοληστερόλη (TC), η χοληστερόλη των HDL (HDLC) και η χοληστερόλη των LDL (LDLC) για την εξέταση του λιπιδαιµικού προφίλ. Η ουρία και η κρεατινίνη για την εξέταση του µεταβολισµού των πρωτεϊνών και της νεφρικής λειτουργίας. Η κρεατινική κινάση (CK) για την εξέταση µυϊκής καταπόνησης. Η γ-γλουταµυλοτρανσφεράση (γ-gt) για την εξέταση της ηπατικής λειτουργίας. Το ασβέστιο και το µαγνήσιο ως δείκτες των αντίστοιχων διατροφικών προσλήψεων. Για να αποφευχθεί η πιθανότητα διακύµανσης των αποτελεσµάτων από µέρα σε µέρα, ο προσδιορισµός κάθε παραµέτρου έγινε την ίδια µέρα. Κάθε προσδιορισµός γινόταν δύο φορές για κάθε δείγµα. Όταν οι δυο µετρήσεις απείχαν περισσότερο από 10 % της µέσης τιµής τους, πραγµατοποιούσαµε µια ακόµη µέτρηση. Από τις τρεις µετρήσεις απορρίπταµε µια ακραία (αφού τις κατατάσσαµε κατά αύξουσα σειρά), αν διέφερε από τη µεσαία περισσότερο από το διπλάσιο της διαφοράς των άλλων δύο. Από τις τιµές 12
που απέµεναν υπολογίζαµε τη µέση τιµή. Στη συνέχεια περιγράφεται η διαδικασία προσδιορισµού κάθε παραµέτρου: Προσδιορισµός σιδήρου Ο προσδιορισµός του σιδήρου είναι φωτοµετρικός. Ο σίδηρος αποδεσµεύεται από την τρανσφερίνη µε την βοήθεια παραγώγου της γουανιδίνης. Τα ελεύθερα ιόντα σιδήρου αντιδρούν µε σύµπλεγµα χρωµαζουρόλης και βρωµιούχου κετυλοτριµεθυλαµµωνίου σχηµατίζοντας ένα έγχρωµο σύµπλοκο. Η ένταση του χρώµατος είναι ανάλογη µε τη συγκέντρωση του σιδήρου. Για τον προσδιορισµό του σιδήρου χρησιµοποιήθηκε ένα σύνολο αντιδραστηρίων της Biosis (Αθήνα). Ετοιµάσαµε ένα πλαστικό δοκιµαστικό σωλήνα για το τυφλό, δύο για το πρότυπο, δύο για κάθε δείγµα και δύο για τον ορό ελέγχου. Έπειτα, τοποθετήσαµε 1,4 ml αντιδραστηρίου σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα και µε πολλαπλές αναρροφήσεις προσθέσαµε 70 µl δισαπεσταγµένου νερού, προτύπου, δείγµατος ή ορού ελέγχου αντίστοιχα. Στη συνέχεια αναδεύσαµε καλά και τα αφήσαµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 min. Έπειτα, χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε στο φασµατοφωτόµετρο µήκος κύµατος 640 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση των προτύπων ως προς το τυφλό και, αφού µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 200 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος, µετρήσαµε τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων. Προσδιορισµός ΤΙΒC Για να προσδιορίσουµε την TIBC προσθέσαµε στον ορό περίσσεια ιόντων Fe 3+ µε σκοπό να κορεσθεί η τρανσφερίνη. Στη συνέχεια καταβυθίσαµε όσο σίδηρο δεν είχε συνδεθεί µε την τρανσφερίνη µε βασικό ανθρακικό µαγνήσιο. Φυγοκεντρήσαµε και προσδιορίσαµε το σίδηρο στο υπερκείµενο υγρό. Για τον προσδιορισµό της TIBC χρησιµοποιήσαµε ένα σύνολο αντιδραστηρίων της εταιρείας Elitech (Sees France). Ετοιµάσαµε ένα φιαλίδιο eppendorf για κάθε δείγµα και ένα για τον ορό ελέγχου. Μετά προσθέσαµε 200 µl διαλύµατος και µε πολλαπλές αναρροφήσεις 100 µl δείγµατος, τα ανακατέψαµε και τα αφήσαµε για 5 min στους 20-25 C. Έπειτα προσθέσαµε στο κάθε φιαλίδιο 20 mg άλατος, τα ανακατέψαµε και τα αφήσαµε στους 20-25 C για 20 min ανακατεύοντας κάθε 5 min. Στη συνέχεια τα φυγοκεντρήσαµε για 10 min στα 1500 g. 13
Ακολούθησε ο προσδιορισµός Fe, όπως παραπάνω, χρησιµοποιώντας τα υπερκείµενα υγρά ως δείγµατα, µε τη διαφορά ότι θεωρήσαµε τη συγκέντρωση του προτύπου ως 600 mg/dl, ώστε να λάβουµε υπόψη την αραίωση του ορού στο 1/3 κατά τον κορεσµό της τρανσφερίνης µε Fe 3+. Υπολογισµός κορεσµού τρανσφερίνης Υπολογίσαµε τον κορεσµό τρανσφερίνης µε βάση τον τύπο: Κορεσµός τρανσφερίνης = σίδηρος / TIBC 100. Προσδιορισµός φεριτίνης Ο προσδιορισµός της φεριτίνης έγινε µε ενζυµικό ανοσοπροσδιορισµό. Χρησιµοποιήθηκε σύνολο αντιδραστηρίων της εταιρίας DRG (Marburg, Γερµανία). Σε µικροπλακίδιο µε βοθρία επιστρωµένα µε µονοκλωνικά αντισώµατα, τοποθετήσαµε από 20 µl πρότυπων διαλυµάτων µε συγκεντρώσεις φεριτίνης 0, 15, 80 και 250 ng/dl, δειγµάτων ορού και ορού ελέγχου. Εν συνεχεία προσθέσαµε 100 µl συζεύγµατος σε κάθε βοθρίο. Ανακινήσαµε απαλά για 30 sec και επωάσαµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 45 min. Μετά από καλό ξέπλυµα των βοθρίων µε απιοντισµένο νερό, τοποθετήσαµε 200 µl διαλύµατος Η 2 Ο 2 /ΤΜΒ και ανακινήσαµε απαλά για 5 s. Επωάσαµε στο σκοτάδι, σε θερµοκρασία δωµατίου για 20 min και σταµατήσαµε την ανάπτυξη χρώµατος µε διάλυµα τερµατισµού. Έπειτα ανακινήσαµε απαλά για 30 s για να εξασφαλίσουµε την αλλαγή του µπλε χρώµατος σε κίτρινο. Τέλος, τοποθετήσαµε το µικροπλακίδιο στη θέση υποδοχής του φωτόµετρου Anthos 2001 (Salzburg, Αυστρία) και η µέτρηση έγινε µε αυτοµατοποιηµένη µέθοδο. Προσδιορισµός γλυκόζης Ο προσδιορισµός της γλυκόζης είναι ενζυµικός φασµατοφωτοµετρικός και στηρίζεται σε δύο αντιδράσεις: Στην πρώτη αντίδραση, η γλυκόζη οξιδώνεται προς γλυκονικό οξύ και υπεροξίδιο του υδρογόνου µε οξιδωτικό το µοριακό οξυγόνο. Η αντίδραση καταλύεται από την οξιδάση της γλυκόζης: Γλυκόζη + Ο 2 + Η 2 Ο γλυκονικό οξύ + Η 2 Ο 2 14
Στη δεύτερη αντίδραση, το Η 2 Ο 2 αντιδρά µε δύο οργανικές ενώσεις (4-αµινοφαιναζόνη και φαινόλη) µε τη βοήθεια της υπεροξιδάσης. Οι ενώσεις αυτές, αντιδρώντας µε το Η 2 Ο 2, ενώνονται σχηµατίζοντας µια έγχρωµη ουσία, της οποίας τη συγκέντρωση υπολογίζουµε, µετρώντας την απορρόφησή της στα 510 nm. 2 Η 2 Ο 2 + 4-αµινοφαιναζόνη + φαινόλη 4-(π- βενζοκινονοµονοϊµινο)φαιναζόνη + 4 Η 2 Ο Ο υπολογισµός της συγκέντρωσης γλυκόζης στο δείγµα µας γίνεται µε τη βοήθεια πρότυπου διαλύµατος γλυκόζης. Χρησιµοποιήσαµε ένα σύνολο αντιδραστηρίων της εταιρείας BEST (Αθήνα). Ετοιµάσαµε δύο γυάλινους δοκιµαστικούς σωλήνες για το πρότυπο, για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετήσαµε 1,4 ml αντιδραστηρίου και προσθέσαµε 14 µl προτύπου, δείγµατος ή ορού ελέγχου. Τα αναδεύσαµε και τα επωάσαµε για 20 min στους 20-25 C. Στη συνέχεια χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε ως µήκος κύµατος στο φασµατοφωτόµετρο τα 500 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση των προτύπων ως προς το αντιδραστήριο, µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 100 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος µετρήσαµε τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων. Για την τελική τιµή υπολογίσαµε τη µέση τιµή των δύο τιµών κάθε δείγµατος, ενώ η διαδικασία της φωτοµέτρησης έπρεπε να ολοκληρωθεί σε 60 min. Προσδιορισµός TG Ο προσδιορισµός των TG είναι ενζυµικός φασµατοφωτοµετρικός. Ειδικότερα, στηρίζεται στην ενζυµική υδρόλυσή τους και την ακόλουθη µέτρηση της γλυκερόλης που απελευθερώνεται. Η µέθοδος αποτελείται από τέσσερις αντιδράσεις: Στην πρώτη αντίδραση τα TG υδρολύονται προς γλυκερόλη και 3 λιπαρά οξέα. Η αντίδραση καταλύεται από µια λιπάση. TG +3 Η 2 Ο γλυκερόλη + 3 λιπαρά οξέα Στην δεύτερη αντίδραση, η παραγόµενη γλυκερόλη φωσφορυλιώνεται από το ATP σε 3-φωσφορική γλυκερόλη, αντίδραση που καταλύεται από την κινάση της γλυκερόλης. 15
Γλυκερόλη + ATP 3-φωσφορική γλυκερόλη + ADP Στην τρίτη αντίδραση, η 3-φωσφορική γλυκερόλη αντιδρώντας µε Ο 2 παράγει φωσφορική διυδροξυκετόνη και Η 2 Ο 2. Η αντίδραση καταλύεται από την οξειδάση της φωσφορικής γλυκερόλης. 3-φωσφορική γλυκερόλη + Ο 2 φωσφορική διυδροξυακετόνη + Η 2 Ο 2 Στην τέταρτη και τελευταία αντίδραση, το Η 2 Ο 2, αντιδρά µε δυο οργανικές ενώσεις (4-αµινοαντιπυρίνη και 4-χλωροφαινόλη) µε τη βοήθεια της υπεροξειδάσης. Οι ενώσεις αυτές, αντιδρώντας µε το Η 2 Ο 2, ενώνονται σχηµατίζοντας µια έγχρωµη ουσία, της οποίας τη συγκέντρωση υπολογίζουµε µετρώντας την απορρόφηση της στα 500 nm. 2 Η 2 Ο 2 + 4-αµινοαντιπυρίνη +4-χλωροφαινόλη κινονιµίνη + 4 Η 2 Ο Η ποσότητα της έγχρωµης ουσίας που παράγεται είναι ανάλογη της ποσότητας των TG του δείγµατος. Ο προσδιορισµός των TG έγινε µε σύνολο αντιδραστηρίων της εταιρίας BEST. Για τον προσδιορισµό ετοιµάσαµε δύο γυάλινους δοκιµαστικούς σωλήνες για το πρότυπο, για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετήσαµε 1,4 ml αντιδραστηρίου και µε πολλαπλές αναρροφήσεις προσθέσαµε 14 µl προτύπου, ορού ή ορού ελέγχου. Έπειτα τα αναµείξαµε σε κυκλοµείκτη και τα επωάσαµε για 20 min στους 25 0 C. Χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε στο φασµατοφωτόµετρο µήκος κύµατος 500 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση του προτύπου ως προς το αντιδραστήριο και, αφού µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 200 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος, µετρήσαµε τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων. Για κάθε δείγµα υπολογίσαµε τη µέση τιµή των δύο προσδιορισµών. Από τις παραπάνω τιµές αφαιρούσαµε 10 mg/dl, ως διόρθωση για την ελεύθερη γλυκερόλη που υπήρχε σε κάθε δείγµα. Προσδιορισµός TC Για τον προσδιορισµό της TC χρησιµοποιήθηκε σύνολο αντιδραστηρίων της εταιρείας BEST (Αθήνα). Ο προσδιορισµός της χοληστερόλης είναι ενζυµικός φασµατοφωτοµετρικός. Η µέθοδος αποτελείται από τρεις αντιδράσεις: Στην πρώτη 16
αντίδραση, οι εστέρες της χοληστερόλης υδρολύονται µε τη βοήθεια της εστεράσης της χοληστερόλης. Εστέρας χοληστερόλης + Η 2 Ο χοληστερόλη + λιπαρό οξύ Στη δεύτερη αντίδραση, η χοληστερόλη αντιδρά µε Ο 2. Η αντίδραση καλύεται από την οξειδάση της χοληστερόλης, σχηµατίζοντας χοληστενόνη και υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ). Χοληστερόλη + Ο 2 χοληστεν-3-όνη + Η 2 Ο 2 Στην τρίτη και τελευταία αντίδραση, το Η 2 Ο 2 αντιδρά µε δύο οργανικές ενώσεις (4-αµινοαντιπυρίνη και φαινόλη), µε τη βοήθεια της υπεροξειδάσης. Οι ενώσεις αυτές, αντιδρώντας µε το Η 2 Ο 2, ενώνονται σχηµατίζοντας µια έγχρωµη ουσία, της οποίας τη συγκέντρωση υπολογίζουµε, µετρώντας την απορρόφησή της στα 500 nm. 2 Η 2 Ο 2 + 4-αµινοαντιπυρίνη + φαινόλη κινοιµίνη + 4 Η 2 Ο Η ποσότητα της έγχρωµης ουσίας που παράγεται είναι ανάλογη της ποσότητας της χοληστερόλης του δείγµατος. Για τον προσδιορισµό της TC ετοιµάσαµε δύο γυάλινους δοκιµαστικού σωλήνες για το πρότυπο, για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετήσαµε 1,4 ml αντιδραστηρίου και µε πολλαπλές αναρροφήσεις προσθέσαµε 14 µl προτύπου, ορού ή ορού ελέγχου, αντίστοιχα. Έπειτα τα αναµείξαµε σε κυκλοµείκτη και τα επωάσαµε για 20 min στους 20-25 0 C. Χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε στο φασµατοφωτόµετρο µήκος κύµατος 500 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση του προτύπου ως προς το αντιδραστήριο και, αφού µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 200 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος, µετρήσαµε τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων. Για κάθε δείγµα υπολογίσαµε τη µέση τιµή των δύο προσδιορισµών. Η διαδικασία της φωτοµέτρησης έπρεπε να ολοκληρωθεί µέσα σε 60 min. Προσδιορισµός των HDLC Η µέθοδος προσδιορισµού της HDLC διαιρείται σε δύο µέρη. Στο πρώτο, πραγµατοποιείται καταβύθιση των χυλοµικρών, VLDL και LDL µε την προσθήκη φωσφοβολφραµικού οξέος και ιόντων µαγνησίου στο δείγµα. Μετά τη φυγοκέντρηση, 17
µόνο οι HDL παραµένουν στο υπερκείµενο υγρό. Στο δεύτερο µέρος, γίνεται ο προσδιορισµός της HDLC ενζυµικά. Για την καταβύθιση χρησιµοποιήσαµε το αντιδραστήριο HDL-cholesterol της Thermo (Vantaa, Φιλλανδία). ιαλύσαµε το περιεχόµενο ενός φιαλιδίου αντιδραστηρίου σε 5 ml νερό. Σε ένα φιαλίδιο eppendorf αναµείξαµε 200 µl ορού, προτύπου από το κιτ της χοληστερόλης ή ορού ελέγχου και 20 µl αντιδραστηρίου, τα αναµείξαµε αµέσως για 5 s στον κυκλοµείκτη (vortex) και µετά από 5 min τα φυγοκεντρήσαµε στα 1500 g για 5 min. Στη συνέχεια ετοιµάσαµε ένα δοκιµαστικό σωλήνα για το τυφλό, δύο για το πρότυπο, δύο για κάθε δείγµα και δύο για τον ορό ελέγχου. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετήσαµε 1,25 ml από το αντιδραστήριο για χοληστερόλη και προσθέσαµε 25 µl από το αντίστοιχο υπερκείµενο. Έπειτα τα αναµείξαµε σε κυκλοµείκτη και τα επωάσαµε για 20 min στους 25 0 C. Χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε στο φασµατοφωτόµετρο µήκος κύµατος 500 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση των προτύπων ως προς το τυφλό και, αφού µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 200 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος, µετρήσαµε τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων. Για κάθε δείγµα υπολογίσαµε τη µέση τιµή των δύο µετρήσεων. Η διαδικασία της φωτοµέτρησης έπρεπε να ολοκληρωθεί µέσα σε 60 min. Υπολογισµός των LDLC Υπολογίσαµε την LDLC µε βάση τον τύπο (Friedewald et al. 1972): LDLC = ΤC - HDLC - TG/5 Προσδιορισµός ουρίας Ο προσδιορισµός της ουρίας είναι ενζυµικός φασµατοφωτοµετρικός. Η ουρία υδρολύεται παρουσία νερού και ουριάσης παράγοντας διοξείδιο του άνθρακα και αµµωνία. Η αµµωνία αντιδρά µε υποχλωριώδη και σαλυκυλικά ιόντα σχηµατίζοντας έγχρωµο σύµπλοκο πράσινου χρώµατος του οποίου η ένταση είναι ανάλογη µε τη συγκέντρωση της ουρίας του δείγµατος. Για τον προσδιορισµό της ουρίας χρησιµοποιήσαµε ένα σύνολο αντιδραστηρίων της εταιρείας Zafiropoulos (Θεσσαλονίκη, Ελλάδα). Ετοιµάσαµε ένα πλαστικό 18
δοκιµαστικό σωλήνα για το τυφλό, δύο για το πρότυπο, δύο για κάθε δείγµα και δύο για τον ορό ελέγχου. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετήσαµε 1 ml από το αντιδραστήριο 1, 10 µl ουρεάση και µε πολλαπλές αναρροφήσεις 10 µl προτύπου ή δείγµατος, τα αναδεύσαµε καλά και τα επωάσαµε για 5 min στους 20-25 C. Στη συνέχεια προσθέσαµε σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα 1mL από το αντιδραστήριο 2, το αναδεύσαµε και το επωάσαµε για 10 min στους 20-25 C. Τέλος, χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε ως µήκος κύµατος στο φασµατοφωτόµετρο τα 580 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση του προτύπου ως προς το τυφλό, µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 80 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος µετρήσαµε τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων. Για την τελική τιµή υπολογίσαµε τη µέση τιµή των δύο τιµών κάθε δείγµατος, ενώ η διαδικασία της φωτοµέτρησης έπρεπε να ολοκληρωθεί σε 60 min. Προσδιορισµός κρεατινίνης Η κρεατινίνη αντιδρά µε πικρικό οξύ σε αλκαλικό περιβάλλον σχηµατίζοντας κόκκινο σύµπλοκο. Μετά την αρχική φάση επωάσεως (1 min) η πορεία της αντίδρασης είναι σταθερή για 2 min. Η αύξηση της απορρόφησης που οφείλεται στο σχηµατισµό του συµπλόκου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στο δείγµα. Χρησιµοποιήσαµε ένα σύνολο αντιδραστηρίων της εταιρείας Best, το Creatinine. Ετοιµάσαµε έναν πλαστικό δοκιµαστικό σωλήνα για το πρότυπο, για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου. Χρησιµοποιήσαµε το φιαλίδιο εργασίας αναµιγνύοντας 4 όγκους αντιδραστηρίου 1, που ήταν διάλυµα υδροξειδίου του νατρίου συγκέντρωσης 0,16 mol/l, µε 1 όγκο αντιδραστηρίου 2, που ήταν διάλυµα πικρικού οξέος συγκέντρωσης 4,0 mol/l. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετήσαµε 2 ml από το διάλυµα εργασίας και προσθέσαµε 100 µl προτύπου, δείγµατος ή ορού ελέγχου, αντίστοιχα. Αναδεύσαµε και επωάσαµε για 1 min. Έπειτα χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε ως µήκος κύµατος στο φασµατοφωτόµετρο τα 494 nm. ιαβάσαµε την απορρόφηση κάθε δείγµατος ανά 15 sec για 2 min. Στη συνέχεια συγκρίναµε τη µεταβολή της απορρόφησης των δειγµάτων µας µε τη µεταβολή του προτύπου και τέλος υπολογίσαµε τη µεταβολή της απορρόφησης ανά min ( Α) για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου. Η συγκέντρωση του δείγµατος σε mg/dl είναι: 19
2 ( Α δείγµατος) / ( Α προτύπου) Προσδιορισµός CK Ο προσδιορισµός της CK γίνεται φωτοµετρικά µε την παρακολούθηση της ταχύτητας της αντίδρασης που καταλύει το συγκεκριµένο ένζυµο. Προσθέτοντας στο δείγµα µας φωσφοκρεατίνη και ADP, έχουµε την παραγωγή ΑΤΡ και κρεατίνης σύµφωνα µε την αντίδραση: Φωσφοκρεατίνη + ΑDP + H + ATP + Κρεατίνη Επειδή, όµως κανένα από τα δύο προϊόντα δεν απορροφά στο ορατό φάσµα, χρησιµοποιούµε δύο ακόµα ενζυµικές αντιδράσεις. Η πρώτη αξιοποιεί το ΑΤΡ που σχηµατίζεται και γλυκόζη που προσθέτουµε, για να παράγει 6-φωσφορική γλυκόζη παρουσία του ενζύµου εξοκινάση. Γλυκόζη + ΑΤΡ 6-Φωσφορική γλυκόζη + ADP + Η + Η δεύτερη αντίδραση χρησιµοποιεί τη σχηµατιζόµενη 6-φωσφορική γλυκόζη και NADP + που προσθέτουµε, για να παράγει NADPΗ. Η αντίδραση καταλύεται από την αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης. ιευκρινίζουµε ότι τα ένζυµα των δύο τελευταίων αντιδράσεων δεν υπάρχουν στο δείγµα, αλλά τα προσθέτουµε. Το NADPΗ απορροφά στα 340 nm. Aν τα ένζυµα και τα υποστρώµατα που προσθέτουµε είναι σε περίσσεια σε σχέση µε την κρεατινική κινάση, τότε η ταχύτητα σχηµατισµού NADPΗ καθορίζεται µόνο από την ταχύτητα σχηµατισµού ATP από την κρεατινική κινάση. Έτσι, µετρώντας την αύξηση της απορρόφησης στη µονάδα του χρόνου µπορούµε να προσδιορίσουµε τη δραστικότητα του ενζύµου. Για τον προσδιορισµό της CK χρησιµοποιήσαµε το σύνολο αντιδραστηρίων CK- NAC της Dialab (Βιέννη, Αυστρία). Αναµείξαµε κατάλληλες ποσότητες αντιδραστηρίων 1 και 2 σε αναλογία 4:1. Ετοιµάσαµε µία πλαστική µικροκυψελίδα µιας χρήσης για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου και σε κάθε µία προσθέσαµε 600 µl αντιδραστηρίου και τοποθετήσαµε 24 µl ορού δείγµατος ή ορού ελέγχου. Τα αναδεύσαµε καλά στο vortex σε χαµηλή ταχύτητα και επωάσαµε για 1 min. Πληκτρολογήσαµε ως µήκος κύµατος στο φασµατοφωτόµετρο τα 340 nm, τoποθετήσαµε τις κύψελίδες στη θήκη και καταγράψαµε τη µεταβολή της απορρόφησης κάθε δείγµατος ανά 15 sec για 2 min. Στη συνέχεια για τον υπολογισµό 20
της δραστικότητας συγκρίναµε τη µεταβολή της απορρόφησης των δειγµάτων µας µε τη µεταβολή του ορού ελέγχου και τέλος υπολογίσαµε τη µεταβολή της απορρόφησης ανά min ( Α) για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου. Η δραστικότητα του δείγµατος είναι: ( ραστικότητα ορού ελέγχου) ( Α δείγµατος) / ( Α ορού ελέγχου). Προσδιορισµός γ-gt Ο προσδιορισµός της γ-gt γίνεται φωτοµετρικά µε την παρακολούθηση της ταχύτητας της αντίδρασης που καταλύει το συγκεκριµένο ένζυµο. Συγκεκριµένα, η γ-gt καταλύει την αντίδραση: L-γ-γλουταµυλο-3-καρβοξυ-4-νιτροανυλίδιο + Γλυκυλογλυκίνη L-γ-γλουταµυλο-γλυκυλογλυκίνη + 5-αµινο-2-νιτροβενζοϊκό οξύ Χρησιµοποιήσαµε το σύνολο αντιδραστηρίων GGT-3-Carboxy (5+1) Fluid της Centronic GmbH (Notzing, Γερµανία). Ετοιµάσαµε µία πλαστική µικροκυψελίδα µιας χρήσης για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου, σε κάθε µία από τις οποίες προσθέσαµε 500 µl αντιδραστηρίου R1, 100 µl αντιδραστηρίου R2 και 50 µl δείγµατος ή ορού ελέγχου. Τα αναδεύσαµε στον κυκλοµείκτη και επωάσαµε για 1 min. Πληκτρολογήσαµε ως µήκος κύµατος στο φασµατοφωτόµετρο τα 405 nm και καταγράψαµε τη µεταβολή της απορρόφησης κάθε δείγµατος για 3 min. Για τον υπολογισµό της δραστικότητας συγκρίναµε τη µεταβολή της απορρόφησης των δειγµάτων µας µε τη µεταβολή του ορού ελέγχου και τέλος υπολογίσαµε τη µεταβολή της απορρόφησης ανά min ( Α) για κάθε δείγµα και για τον ορό ελέγχου. Η δραστικότητα του δείγµατος είναι: ( ραστικότητα ορού ελέγχου) ( Α δείγµατος) / ( Α ορού ελέγχου) Προσδιορισµός ασβεστίου Τα ιόντα ασβεστίου αντιδρούν µε µεθυλοθυµόλη παράγοντας ένα έγχρωµο προϊόν. Η απορρόφηση του διαλύµατος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ασβεστίου στο δείγµα. Χρησιµοποιήσαµε ένα σύνολο αντιδραστηρίων της biomerieux (Marcy l Etoiles, Γαλλία). Ετοιµάσαµε ένα πλαστικό δοκιµαστικό σωλήνα για το τυφλό, δύο για το πρότυπο, δύο για κάθε δείγµα και δύο για τον ορό ελέγχου. Σε κάθε δοκιµαστικό 21
σωλήνα τοποθετήσαµε 0,7 ml αντιδραστηρίου R2, 0,7 ml αντιδραστηρίου R3 και σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα πλην τυφλού του, 28 µl προτύπου, δείγµατος ή ορού ελέγχου. Αναδεύσαµε και επωάσαµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 1 min. Έπειτα, χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε στο φασµατοφωτόµετρο µήκος κύµατος 612 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση των προτύπων ως προς το τυφλό και, αφού µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 10 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος, µετρήσαµε τις συκγεντρώσεις των δειγµάτων. Για κάθε δείγµα υπολογίσαµε τη µέση τιµή των δύο προσδιορισµών. Η διαδικασία της φωτοµέτρησης ολοκληρώθηκε µέσα σε 60 min. Προσδιορισµός µαγνησίου Τα ιόντα µαγνησίου σε ένα αλκαλικό διάλυµα σχηµατίζουν, µε την επίδραση κυανού του ξυλιδίου, ένα έγχρωµο διάλυµα. Η αύξηση της απορρόφησης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του µαγνησίου στο δείγµα. Τα ιόντα ασβεστίου που υπάρχουν στο δείγµα δεσµεύονται από την ένωση GEDTA. Χρησιµοποιήσαµε ένα σύνολο αντιδραστηρίων της biomerieux. Ετοιµάσαµε ένα πλαστικό δοκιµαστικό σωλήνα για το τυφλό, δύο για το πρότυπο, δύο για κάθε δείγµα και δύο για τον ορό ελέγχου. Σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα τοποθετήσαµε 0,7 ml αντιδραστηρίου R2, 0,7 ml αντιδραστηρίου R3 και, σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα πλην του τυφλού, 28 µl προτύπου, δείγµατος ή ορού ελέγχου. Αναδεύσαµε και επωάσαµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 1 min. Έπειτα, χρησιµοποιήσαµε γυάλινες κυψελίδες και πληκτρολογήσαµε στο φασµατοφωτόµετρο µήκος κύµατος 520 nm. Μετρήσαµε την απορρόφηση των προτύπων ως προς το αντιδραστήριο και, αφού µεταβήκαµε σε MODE CONC, πληκτρολογήσαµε συντελεστή το 2,5 (mg/dl) δια τη µέση τιµή της απορρόφησης των προτύπων. Τέλος, µετρήσαµε τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων. Για κάθε δείγµα υπολογίσαµε τη µέση τιµή των δύο προσδιορισµών. Η διαδικασία της φωτοµέτρησης ολοκληρώθηκε σε 60 min. Στατιστική επεξεργασία Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται ως µέση τιµή ± τυπική απόκλιση. Η κατανοµή όλων των εξαρτηµένων µεταβλητών εξετάστηκε µε τη δοκιµασία Shapiro-Wilk και βρέθηκε 22
να µη διαφέρει σηµαντικά από την κανονική. Χρησιµοποιήσαµε τη δοκιµασία t του Student για ανεξάρτητες παρατηρήσεις για τη σύγκριση των µέσων τιµών δύο παρατηρήσεων και την ανάλυση συσχέτισης για τον έλεγχο της συσχέτισης ανάµεσα σε δύο παραµέτρους. Το επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας για όλες τις δοκιµασίες ορίστηκε στο α = 0,05. Η στατιστική επεξεργασία έγινε µε το προγράµµατα SPSS (έκδοση 12). 23
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι κωπηλάτες και οι µη αθλητές δεν διέφεραν ως προς την ηλικία. Συγκεκριµένα, οι κωπηλάτες είχαν ηλικία 20,2 ± 1,9 έτη, ενώ οι µη αθλητές 22,6 ± 2,9 έτη. Μετά την ολοκλήρωση των µετρήσεων και τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων, φάνηκε ότι οι κωπηλάτες δεν διέφεραν σηµαντικά από τους µη αθλητές ως προς το βάρος, το ύψος, το δείκτη σωµατικής µάζας και το ποσοστό σωµατικού λίπους, το τελευταίο µετρούµενο τόσο µε τη µέθοδο της βιοηλεκτρικής αντίστασης, όσο και µε αυτή της υδροστατικής ζύγισης (πίνακας 1). Σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δυο οµάδων βρέθηκαν στην άλιπη σωµατική µάζα τόσο µε τη µέθοδο ΒΙΑ (P = 0,016) όσο και µε τη µέθοδο της υδροστατικής ζύγισης (P = 0,021), τον όγκο του σωµατικού νερού (P = 0,020), τον βασικό µεταβολικό ρυθµό (P = 0,017) καθώς και την ηµερήσια ενεργειακή ανάγκη (P < 0,001). Η τελευταία υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας το βασικό µεταβολικό ρυθµό µε τους συντελεστές 1,5 για τους µη αθλητές και 1,8 για τους κωπηλάτες. 24
Πίνακας 1. εδοµένα των εθελοντών Παράµετρος Μη αθλητές (ν = 10) Κωπηλάτες (ν = 10) Σωµατική µάζα (kg) 73,7 ± 5,2 79,0 ± 8,0 Ύψος (m) 1,79 ± 0,03 1,80 ± 0,05 ΒΜΙ (kg/m 2 ) 23,1 ± 2,0 23,7 ± 2,5 Λίπος (%) 1 11,2 ± 3,2 10,4 ± 4,6 Λίπος (kg) 1 8,3 ± 2,8 8,4 ± 4,7 Άλιπη µάζα (%) 1 88,8 ± 3,2 89,6 ± 4,6 Άλιπη µάζα (kg) 1 65,0 ± 4,0 70,5 ± 4,9* Λίπος (%) 2 11,3 ± 4,8 12,5 ± 5,0 Λίπος (kg) 2 8,3 ± 4,0 10,3 ± 5,2 Άλιπη µάζα (%) 2 88,7 ± 4,8 87,5 ± 5,0 Άλιπη µάζα (kg) 2 64,2 ± 4,0 70,3 ± 5,5* Νερό (%) 61,9 ± 3,0 62,0 ± 4,1 Νερό (L) 45,5 ± 2,5 48,7 ± 3,1* Βασικός µεταβολικός ρυθµός (kcal/ηµέρα) Ηµερήσια ενεργειακή ανάγκη (kcal/ηµέρα) 1997 ± 110 2142 ± 135* 2951 ± 134 3856 ± 244* *Σηµαντικά διαφορετική από τους µη αθλητές (P < 0,05) 1 Με τη µέθοδο της βιοηλεκτρικής αντίστασης. 2 Με τη µέθοδο της υδροστατικής ζύγισης. 25
Σε ό,τι αφορά τις δυο µεθόδους λιποµέτρησης βρέθηκε υψηλή συσχέτιση (r=0,88) µεταξύ τους ως προς το ποσοστό σωµατικού λίπους και ότι δεν διέφεραν σηµαντικά. Αιµατολογικές παράµετροι Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα των αιµατολογικών παραµέτρων (πίνακας 2). εν παρουσιάστηκαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δυο οµάδων και όλες οι τιµές των εθελοντών ήταν εντός των φυσιολογικών τιµών. Πίνακας 2. Αιµατολογικά αποτελέσµατα Παράµετρος Μη αθλητές Κωπηλάτες ιάστηµα αναφοράς Αιµατοκρίτης 46,3 ± 2,8 44,3 ± 2,3 40-52 Αιµοσφαιρίνη (g/dl) 15,1 ± 0,8 14,1 ± 3,4 14-18 Ερυθροκύτταρα (Μ/µL) 5,1 ± 0,3 5,0 ± 0,4 4,5-6,5 Λευκοκύτταρα (k/µl) 6,2 ± 1,0 5,8 ± 1,3 4,0-11,0 Αιµοπετάλια (k/µl) 209 ± 40 200 ± 31 150-400 Βιοχηµικές παράµετροι Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα των βιοχηµικών παραµέτρων των εθελοντών. Από τις τιµές αυτές σηµαντικές διαφορές παρουσιάστηκαν στην HDLC (P = 0,002) και το ασβέστιο (P = 0,032), όπου και στις δυο περιπτώσεις οι αθλητές είχαν υψηλότερες τιµές από τους µη αθλητές. Από τις βιοχηµικές παραµέτρους οι περισσότερες τιµές, τόσο των µη αθλητών, όσο και των κωπηλατών, ήταν εντός των διαστηµάτων αναφοράς. Ωστόσο, τρεις κωπηλάτες εµφάνισαν τιµές φεριτίνης χαµηλότερες από τις φυσιολογικές. Επίσης, στην TC δύο µη αθλητές βρέθηκαν πάνω από τα φυσιολογικά όρια, ενώ στην LDLC αυξηµένες τιµές παρουσίασαν δύο µη αθλητές και ένας κωπηλάτης. Σε ό,τι αφορά την 26