SIR MYCOPLASMA ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ

Transcript

1 SIR MYCOPLASMA ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ ΓΙΑ ΜΥΚΟΠΛΑΣΜΑ ΤΟΥ ΟΥΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 1- ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΡΗΣΗ Το SIR MYCOPLASMA είναι ένα αντιδραστήριο για την ανάλυση αντιβιογράμματος του μυκοπλάσματος του ουρογεννητικού συστήματος. Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum) και Mycoplasma hominis (Mh). Επί του παρόντος, δεν είναι εύκολη η επίτευξη διαφορικής ταυτοποίησης των Ureaplasma urealyticum και U. parvum. Το SIR MYCOPLASMA αποτελείται από μια μικροπλάκα που περιέχει 8 αντιβιοτικά, τα οποία είναι δραστικά έναντι των μικροοργανισμών αυτών και χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία λοιμώξεων στα γεννητικά όργανα. Η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών, ιδιαίτερα σε κυκλίνες και μακρολίδια (αντιβιοτικά για θεραπεία πρώτης γραμμής) (10, 11, 18), καθιστά την ανάλυση αντιβιογράμματος απολύτως απαραίτητη για την αποφυγή θεραπευτικών αποτυχιών. Με τη χρήση τυποποιημένου ενοφθαλμίσματος η τεχνική αυτή συμφωνεί σε μεγάλο βαθμό με τη μέθοδο αναφοράς (9). 2- ΑΡΧΗ Το SIR MYCOPLASMA είναι ένα αντιβιόγραμμα υγρού μέσου, στο οποίο κάθε αντιβιοτικό απαντάται σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (δοξυκυκλίνη, τετρακυκλίνη, αζιθρομυκίνη, ιωσαμυκίνη, ερυθρομυκίνη, οφλοξασίνη) ή σε μία μόνο συγκέντρωση (κλινδαμυκίνη, πριστιναμυκίνη). Η εξέταση βασίζεται στην αναστολή του μεταβολισμού. Η ανάπτυξη μυκοπλασμάτων μετράται αντικειμενικά βάσει της μεταβολικής τους δραστηριότητας: υδρόλυση ουρίας σε ζωμό U9 Ureaplasma spp και υδρόλυση αργινίνης σε ζωμό αργινίνης Mh, με απελευθέρωση αμμωνίας, με την οποία το μέσο μετατρέπεται σε αλκαλικό και το χρώμα του δείκτη ph του ερυθρού της φαινόλης στο μέσο αλλάζει από κίτρινο σε κόκκινο. Αν ο μικροοργανισμός είναι ευαίσθητος στο υπό εξέταση αντιβιοτικό, ο μεταβολισμός του αναστέλλεται και το χρώμα του μέσου παραμένει κίτρινο. Ο μικροοργανισμός μπορεί να αναπτυχθεί όταν είναι ανθεκτικός και το μέσο γίνεται κόκκινο. 3- ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ Το SIR MYCOPLASMA περιλαμβάνει τα εξής: 10 μικροπλάκες SIR (το διάγραμμα των 16 μικροβυθισμάτων φαίνεται στην ετικέτα, επιτρέποντας την ταυτοποίηση του δείγματος). 10 αυτοκόλλητα καλύμματα στεγανοποίησης. 1 ένθετο συσκευασίας. Κάθε μικροπλάκα συσκευάζεται ξεχωριστά σε συσκευασία αλουμινίου με κάλυμμα στεγανοποίησης και φακελάκι με αποξηραντικό. 4- ΦΥΛΑΞΗ Όταν φυλάσσεται στους C, το SIR MYCOPLASMA μπορεί να χρησιμοποιηθεί μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία. 5- ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ (ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ) Zωμός U9: κωδικός (συσκευασία με 10 αμπούλες λυοφιλικού ζωμού U9 Q.S.P. 2 ml) Zωμός αργινίνης: κωδικός (συσκευασία με 10 αμπούλες λυοφιλικού ζωμού αργινίνης Q.S.P. 2 ml) MYCOPLASMA DUO (κουτί 20 εξετάσεων - κωδικός 62740) Αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό Πιπέτες 2 ml, 200 µl, 100 µl, 20 µl Επωαστής στους 37 C Δοχείο για μολυσμένα απορρίμματα. 6- ΤΡΟΠΟΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ A) ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΑ SIR Η μικροπλάκα SIR είναι μια μικρολωρίδα που αποτελείται από δύο σειρές 8 μικροβυθισμάτων, στις οποίες επικαλύπτονται τα διάφορα αντιβιοτικά. Τα αντιβιοτικά επανυδατώνονται όταν το ενοφθάλμισμα κατανέμεται στα μικροβυθίσματα, ώστε οι συγκεντρώσεις που λαμβάνονται να προσεγγίζουν τις κρίσιμες συγκεντρώσεις, επιτρέποντας με τον τρόπο αυτό την ανάλυση του προφίλ ευαισθησίας των υπό εξέταση στελεχών και την κατηγοριοποίησή τους σε ευαίσθητα, ενδιάμεσα ή ανθεκτικά.

2 Ορός ελέγχου ανάπτυξης ελλείψει αντιβιοτικού Doxycycline (4 mg/l and 8 mg/l) Tetracycline (4 mg/l and 8 mg/l) Azithromycin (2 mg/l and 4 mg/l) Josamycin (2 mg/l and 8 mg/l) Erythromycin (1 mg/l and 4 mg/l) Clindamycin (2 mg/l) Pristinamycin (2 mg/l) Ofloxacin (1 mg/l and 4 mg/l) B) ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ Τα προς εξέταση αντιβιοτικά επιλέχθηκαν βάσει των θεραπευτικών συνταγών που συνιστώνται για τις νεογνικές μυκοπλασμικές λοιμώξεις καθώς και τις μυκοπλασμικές λοιμώξεις στα γεννητικά όργανα (17). Μέχρι σήμερα δεν έχει καθοριστεί κρίσιμη συγκέντρωση ειδικά για το μυκόπλασμα. Κατά συνέπεια, οι κρίσιμες συγκεντρώσεις που έχουν επιλεγεί στη μικροδιάταξη του SIR MYCOPLASMA βασίζονται σε εκείνες που έχουν δημοσιευθεί σε μια σειρά επιστημονικών περιοδικών και/ή συνιστώνται από ιατρικές κοινότητες, όπως η CA-SFM (Επιτροπή Αντιβιογραμμάτων - Γαλλική Μικροβιολογική Εταιρεία). Η επιλογή των συγκεντρώσεων αζιθρομυκίνης βασίζεται σε μια αξιολόγηση που πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κλινικών στελεχών (19). Κυκλίνες που εξετάστηκαν: τετρακυκλίνη και δοξυκυκλίνη (σε συγκεντρώσεις 4 και 8 mg/l). Τα στελέχη Mh και Ureaplasma spp. που θεωρούνται ανθεκτικά στις τετρακυκλίνες ανιχνεύονται χωρίς αμφιβολία, καθώς έχει δημοσιευθεί ότι οι Ελάχιστες Ανασταλτικές Συγκεντρώσεις (MIC) ήταν 8 mg/l σε αντίθεση με συγκεντρώσεις 2 mg/l για τα ευαίσθητα στελέχη (15, 18). Για αυτήν την κατηγορία αντιβιοτικών, παρατηρούνται αντιστάσεις χαμηλού επιπέδου που απαιτούν χρόνο επώασης 48 ωρών (19). Η συχνότητα αντίστασης των στελεχών στις κυκλίνες ποικίλλει ανάλογα με τη χώρα και το επίπεδο έκθεσης σε αντιβιοτικά (18). Μακρολίδια που εξετάστηκαν: ερυθρομυκίνη (σε συγκεντρώσεις 1 και 4 mg/l), αζιθρομυκίνη (σε συγκεντρώσεις 2 και 4 mg/l), ιωσαμυκίνη (σε συγκεντρώσεις 2 και 8 mg/l). Τα στελέχη Mh παρουσιάζουν φυσική ανθεκτικότητα στην ερυθρομυκίνη και την αζιθρομυκίνη. Η ιωσαμυκίνη παραμένει δραστική. Συνεπώς, τα αποτελέσματα που προκύπτουν με τα εν λόγω αντιβιοτικά θα πρέπει να επιβεβαιώνουν την προηγούμενη ταυτοποίηση του στελέχους. Η συχνότητα της επίκτητης αντίστασης στα μακρολίδια μεταξύ των στελεχών Mh και Ureaplasma spp που έχουν απομονωθεί σε κλινικές συνθήκες δεν είναι γνώστη, αλλά είναι πιθανώς πολύ μικρή (18). Λινκοζαμίδη που εξετάστηκε: κλινδαμυκίνη (σε συγκέντρωση 2 mg/l). Τα στελέχη Ureaplasma spp παρουσιάζουν φυσική ανθεκτικότητα στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό (18). Στρεπτογραμίνη που εξετάστηκε: πριστιναμυκίνη (σε συγκέντρωση 2 mg/l). Τα στελέχη μυκοπλάσματος είναι εξαιρετικά ευαίσθητα στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Φθοριοκινολόνη που εξετάστηκε: οφλοξασίνη (σε συγκεντρώσεις 1 και 4 mg/l). Το συγκεκριμένο μόριο είναι δραστικό στα στελέχη Mh και Ureaplasma spp. Η συχνότητα αντίστασης δεν είναι γνωστή με ακρίβεια, αλλά έχει εκτιμηθεί σε επίπεδα κάτω από 1% για το στέλεχος Ureaplasma spp. (6, 18). Γ) ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ Το αντιβιόγραμμα μπορεί να επιτευχθεί ξεκινώντας από το περιεχόμενο του μικροβυθίσματος Χ του MYCOPLASMA DUO (κωδικός 62740). Για τη διάρκεια και τη θερμοκρασία αποθήκευσης του βιολογικού δείγματος, ανατρέξτε στις εκάστοτε ισχύουσες συστάσεις (13). 1) Τυποποίηση ενοφθαλμίσματος Για να εισάγετε στο αντιβιόγραμμα ενοφθάλμισμα που περιέχει 10 3 έως 10 5 CCU/ml (CCU = Μονάδες Μεταβαλλόμενου Χρώματος), πρέπει να διεξάγετε μια προκαλλιέργεια του μέσου που θα ενοφθαλμιστεί στο δείγμα. Η προκαλλιέργεια (που διεξάγεται σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που περιγράφονται παρακάτω) οδηγεί σε αύξηση του μυκοπλάσματος σε μια μέγιστη τιμή τίτλου της τάξης των 10 6 έως 10 7 CCU/ml. Με την προκαλλιέργεια αυτή και αραίωση 1/100 σε ζωμό U9 ή αργινίνης παράγεται τυποποιημένο ενοφθάλμισμα, ανάλογα με τα είδη που έχουν απομονωθεί.

3 ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ MYCOPLASMA DUO Όταν το αντιβιόγραμμα δημιουργείται με χρήση του MYCOPLASMA DUO, το περιεχόμενο του μικροβυθίσματος Χ στις 24 ή 48 ώρες επώασης για το Mh και στις 24 ώρες για το Ureaplasma spp, αντιστοιχεί στην προκαλλιέργεια. Στη συνέχεια, το περιεχόμενο του μικροβυθίσματος πρέπει να αραιωθεί σε ζωμό U9 ή ζωμό αργινίνης σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται παρακάτω, ώστε να προκύψει το τυποποιημένο ενοφθάλμισμα. 1. Για το Mycoplasma hominis Ξεκινώντας από το μικροβύθισμα Χ (στις 24 ή 48 ώρες επώασης), πραγματοποιήστε αραίωση 1/100 σε ζωμό αργινίνης (20 µl του περιεχομένου του μικροβυθίσματος Χ σε 2 ml ζωμού αργινίνης). 2. Για το Ureaplasma spp Στις 24 ώρες επώασης: πραγματοποιήστε αραίωση 1/100 του περιεχομένου του μικροβυθίσματος Χ σε ζωμό U9 (20 µl του περιεχομένου του μικροβυθίσματος Χ σε 2ml ζωμού U9). Στις 48 ώρες επώασης: σε αυτήν την περίπτωση, δεν μπορείτε να χρησιμοποιήσετε το περιεχόμενο του μικροβυθίσματος Χ, καθώς υπάρχει κίνδυνος το Ureaplasma να έχει υποστεί αυτόλυση. Πραγματοποιήστε αραίωση 1/10 του μέσου μεταφοράς εναιωρήματος που φυλάσσεται στους + 4 C (200 µl σε 2 ml ζωμού U9). ΕΝΑΡΞΗ ΑΠΟ ΖΩΜΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΟ ΜΕ ΜΥΚΟΠΛΑΣΜΑ Το ουρογεννητικό δείγμα μπορεί να εισαχθεί σε μέσο καλλιέργειας ειδικό για μυκόπλασμα (15). Αν αναμένετε τα αποτελέσματα της ταυτοποίησης και αρίθμησης, μπορείτε να πραγματοποιήσετε αργότερα το αντιβιόγραμμα και να αποθηκεύσετε το μέσο στους +4 C (πρβλ. ένθετο του προϊόντος για το μέσο καλλιέργειας που χρησιμοποιείται). Στη συνέχεια, συνιστάται η επώαση του μέσου καλλιέργειας στους 37 C για 16 ώρες, ώστε να προκύψει ενοφθάλμισμα εμπλουτισμένο με μυκόπλασμα. Η συνήθης τιμή τίτλου που προκύπτει είναι CCU/ml. Σύμφωνα με τις δημοσιευμένες συστάσεις (15), για την πραγματοποίηση αντιβιογράμματος συνιστάται η χρήση τυποποιημένου ενοφθαλμίσματος. Επομένως, 20 μl του εμπλουτισμένου μέσου καλλιέργειας αραιώνονται σε 2 ml ζωμού U9 ή ζωμού αργινίνης (αραίωση 1/100), ανάλογα με την ταυτοποίηση του στελέχους μυκοπλάσματος. 2) Κατανομή του τυποποιημένου ενοφθαλμίσματος 100 μl τυποποιημένου ενοφθαλμίσματος (αραίωση 1/100 της προκαλλιέργειας, σε ζωμό U9 ή ζωμό αργινίνης) κατανέμονται σε κάθε μικροβύθισμα της μικροπλάκας SIR. Καλύψτε τη μικροπλάκα με μεμβράνη στεγανοποίησης και επωάστε στους 37 C για 48 ώρες.

4 Επώαση για 24 ή 48 ώρες Επώαση για μόνο 24 ώρες ή ή MYCOPLASMA DUO Πηγαδάκι Χ Εμπλουτισμένο θρεπτικό υλικό για Μυκόπλασμα Mέσου μεταφοράς εναιωρήματος που φυλάσσεται στους + 4 C Ζωμός αργινίνης Ζωμός Ζωμός αργινίνης Ζωμός Ζωμός αργινίνης Ζωμός Κατανείμετε 100 μl σε κάθε πηγαδάκι Κατανείμετε 100 μl σε κάθε πηγαδάκι Κατανείμετε 100 μl σε κάθε πηγαδάκι Αντιβιογραμμα Αντιβιογραμμα Αντιβιογραμμα Αντιβιογραμμα Αντιβιογραμμα Αντιβιογραμμα

5 Δ) ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ Ureaplasma spp και Mh Σε αυτήν την περίπτωση, ενοφθαλμίστε 2 μικροπλάκες SIR: μία με το τυποποιημένο ενοφθάλμισμα που προκύπτει μετά από αραίωση σε ζωμό U9 (αντιβιόγραμμα στελέχους Ureaplasma spp) και την άλλη με το τυποποιημένο ενοφθάλμισμα που προκύπτει μετά από αραίωση σε ζωμό αργινίνης (αντιβιόγραμμα στελέχους Mh). 7- ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η ανάγνωση του αντιβιογράμματος είναι δυνατή μόλις τα μικροβυθίσματα με ορό ελέγχου ανάπτυξης μετατραπούν από κίτρινα σε κόκκινα. Μία ένδειξη λαμβάνεται στις 24 ώρες και άλλη μία στις 48 ώρες. Η ένδειξη στις 48 ώρες επιτρέπει την ανίχνευση αντιστάσεων χαμηλού επιπέδου στις κυκλίνες (19) και την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων όταν προκύπτει ότι η τιμή του αρχικού ενοφθαλμίσματος ήταν χαμηλή (10 3 CCU/ml) ή όταν η μεταβολή του χρώματος ήταν αμφίβολη μετά τις 24 ώρες. 2 κίτρινα μικροβυθίσματα: Απουσία ανάπτυξης Ευαίσθητο στέλεχος 2 κόκκινα μικροβυθίσματα: Ανάπτυξη παρουσία αντιβιοτικού Ανθεκτικό στέλεχος Μικροβύθισμα με χαμηλή συγκέντρωση αντιβιοτικού: κόκκινο Μικροβύθισμα με υψηλή συγκέντρωση αντιβιοτικού: κίτρινο ενδιάμεσο στέλεχος Για την κλινδαμυκίνη και την πριστιναμυκίνη (μία μόνο συγκέντρωση), μόνο δύο αποτελέσματα είναι πιθανά: Ευαίσθητο ή Ανθεκτικό. Παράδειγμα: κίτρινο / κίτρινο: S Ευαίσθητο στέλεχος κόκκινο / κίτρινο: I Eνδιάμεσο στέλεχος κόκκινο / κόκκινο: R Ανθεκτικό στέλεχος Ειδική περίπτωση: αν παρατηρηθεί πορτοκαλί χρώμα. Σε μοκροβυθίσματα χαμηλής συγκέντρωσης ενδέχεται να παρατηρήσετε την αρχή μιας μεταβολής από κίτρινο σε κόκκινο χρώμα, καταλήγοντας σε πορτοκαλί χρώμα. Το αποτέλεσμα αυτό πρέπει να ερμηνευθεί ως θετικό και μετά από 48 ώρες ενδέχεται να προκύψει σαφής μεταβολή χρώματος. 8- ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα προϊόντα που παρασκευάζονται και διατίθενται από τη Bio-Rad Company παρακολουθούνται από ένα σύστημα διασφάλισης ποιότητας, από την παραλαβή των πρώτων υλών μέχρι τη διάθεση των έτοιμων προϊόντων στην αγορά. Κάθε παρτίδα έτοιμου προϊόντος υποβάλλεται σε ποιοτικό έλεγχο και διατίθεται στην αγορά μόνο εφόσον πληρεί τα κριτήρια αποδοχής. Τα έγγραφα που σχετίζονται με την παραγωγή και τον έλεγχο κάθε παρτίδας φυλάσσονται ως υλικό αναφοράς. 9 ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΣ ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Ο ποιοτικός έλεγχος μπορεί να διεξαχθεί με τη χρήση ενός στελέχους από μια λυοφιλική συλλογή (Ureaplasma parvum ATCC ). Μετατρέψτε σε εναιώρημα το λυοφιλικό στέλεχος σε 1 ml πρόσφατα ανασυσταμένου μέσου U9 (αριθμός καταλόγου 62762). Πραγματοποιήστε αραίωση 1/10 σε πρόσφατα ανασυσταμένο μέσο U9. Επωάστε το ενοφθαλμισμένο μέσο U9 στους 37 C για 18 ώρες υπό αερόβιες συνθήκες. Ξεκινώντας από αυτό το εμπλουτισμένο με Ureaplasma μέσο U9, πραγματοποιήστε αραίωση 1/100 (προσθέστε 20 μl του μέσου 2ml ανασυσταμένου ζωμού U9). Ο ενοφθαλμισμός της μικροδιάταξης SIR MYCOPLASMA διεξάγεται σύμφωνα με το σύνηθες πρωτόκολλο, δηλ. κατανέμοντας 100 μl σε κάθε μικροβύθισμα. Καλύψτε τη μικροδιάταξη με μεμβράνη στεγανοποίησης και επωάστε στους 37 C για 48 ώρες. Η ανάγνωση της μικροδιάταξης είναι δυνατή όταν το χρώμα των μικροβυθισμάτων με ορό ελέγχου ανάπτυξης μετατρέπονται από κίτρινο σε κόκκινο.

6 Τα αναμενόμενα προφίλ είναι τα ακόλουθα: Ορός ελέγχου ανάπτυξης Ορός ελέγχου ανάπτυξης DO 4 8 mg/l TE 4 8 mg/l JM 2 8 mg/l AZM 2 4 mg/l E 1 4 mg/l CM 2 mg/l PT 2 mg/l OFX 1 4 mg/l + + S S S S S/I R S S/I 9-10 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Η επιλογή των αντιβιοτικών που εξετάζονται με το SIR MYCOPLASMA έχει πραγματοποιηθεί σύμφωνα με τις θεραπευτικές αγωγές και το αντιβιόγραμμα SIR MYCOPLASMA έχει αξιολογηθεί εκ νέου λαμβάνοντας υπόψη τις τροποποιημένες θεραπείες. Στην περίπτωση των δύο αξιολογήσεων που περιγράφονται παρακάτω, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Ελάχιστων Ανασταλτικών Συγκεντρώσεων σε υγρό μέσο (MIC) ως μέθοδος αναφοράς (6,15). Η πρώτη αξιολόγηση (χωρίς μικροβυθίσματα αζιθρομυκίνης) πραγματοποιήθηκε σε 80 στελέχη, συμπεριλαμβανομένων 60 στελεχών Ureaplasma spp και 20 στελεχών Mycoplasma hominis (9). Για τα στελέχη Ureaplasma spp: Για τις τετρακυκλίνες, τα ποσοστά συμφωνίας ποικίλλουν από 90 % [79,5 96,2 %] a έως 95 % [86,1 99 %] a ανάλογα με το αντιβιοτικό. Για τα μακρολίδια, τα ποσοστά συμφωνίας ποικίλλουν από 92 % [81,6-97,3 %] a έως 100 % [95,1-100 %] a ανάλογα με το αντιβιοτικό. Για την κλινδαμυκίνη, το ποσοστό συμφωνίας ήταν 85 % [73,4 92,9 %] a Για την πριστιναμυκίνη, το ποσοστό συμφωνίας ήταν 100 % [95,1-100 %] a Για τις φθοριοκινολόνες, το ποσοστό συμφωνίας ήταν 93 % [83,8-98,2 %] a. Για τα στελέχη Mycoplasma hominis: Το ποσοστό συμφωνίας είναι 85 % [62,1-96,8 %] a για την τετρακυκλίνη και 100 % [86,1-100 %] a για όλα τα υπόλοιπα αντιβιοτικά. Το συνολικό ποσοστό συμφωνίας για όλα τα αντιβιοτικά που αναφέρθηκαν προηγουμένως είναι 94,6 % [92,4-96,4 %] a με 2,6 % σημαντικές ασυμφωνίες. Κανένα στέλεχος δεν βρέθηκε ευαίσθητο στη μικροδιάταξη SIR MYCOPLASMA ενώ είχε βρεθεί ανθεκτικό με τη μέθοδο αναφοράς (καμία ιδιαίτερα σημαντική ασυμφωνία). Μια δεύτερη αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε μετά από αντικατάσταση της μινοκυκλίνης με αζιθρομυκίνη σε συγκεντρώσεις 2 και 4 µg/ml. Διεξήχθη συγκριτική έρευνα μεταξύ της μεθόδου για τον καθορισμό των MIC σε υγρό μέσο και της μικροδιάταξης SIR MYCOPLASMA για μικροβυθίσματα αζιθρομυκίνης. Τα στελέχη που εξετάστηκαν είναι στελέχη αναφοράς και κλινικά στελέχη άγριου τύπου. Κάθε ενοφθάλμισμα υποβλήθηκε σε τυποποίηση και επαληθεύτηκε ότι βρίσκεται εντός αποδεκτών και συνιστώμενων ορίων, δηλ και 10 5 CCU/ml (15). Τα αποτελέσματα των δύο μεθόδων ερμηνεύτηκαν ως Ευαίσθητο (S), Ενδιάμεσο (I) ή Ανθεκτικό (R) για τις διάφορες συγκεντρώσεις της μικροδιάταξης. Για 15 στελέχη μυκοπλάσματος αναφοράς (13 στελέχη ATCC Ureaplasma spp και 2 στελέχη ATCC Mycoplasma hominis), το ποσοστό συμφωνίας για την κλινική κατηγοριοποίηση S ή R ήταν 100 % [81,9-100 %] a. Όλα τα στελέχη Ureaplasma spp είχαν ευαίσθητο προφίλ και τα δύο στελέχη Mycoplasma hominis είχαν ανθεκτικό προφίλ, γεγονός που υποδεικνύει τη φυσική ανθεκτικότητα του συγκεκριμένου είδους. Για 15 κλινικά απομονωθέντα στελέχη Ureaplasma spp, η συμφωνία μεταξύ της κλινικής κατηγοριοποίησης που προέκυψε από τη μικροδιάταξη SIR MYCOPLASMA και της αντίστοιχης των MIC αναφοράς ήταν 100 % [81,9-100 %] a. a: [CI 95%] = διάστημα εμπιστοσύνης 95%.

7 11- ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Αν το μέσο γίνει κόκκινο και θολερό, υποδεικνύεται η ανάπτυξη άλλων βακτηρίων εκτός του μυκοπλάσματος (η ανάπτυξη του μυκοπλάσματος δεν επηρεάζει την καθαρότητα του μέσου). Αυτό το φαινόμενο μπορεί να παρατηρηθεί στους ζωμούς καλλιέργειας αργινίνης και U9 αν έχουν επωαστεί στους 37 C. Η παρουσία άλλων βακτηρίων μπορεί να επιβεβαιωθεί σε σοκολατούχο άγαρ. Η τελική ερμηνεία των αποτελεσμάτων, όπως κάθε ερμηνεία βιολογικών αποτελεσμάτων, δεν μπορεί να βασιστεί σε μία μόνο εξέτασης, αλλά πρέπει να βασίζεται σε κλινικά δεδομένα καθώς και βιοχημικά, κυτταρολογικά και ανοσολογικά αποτελέσματα. Αν η τιμή του ενοφθαλμίσματος που χρησιμοποιείται για τον ενοφθαλμισμό της μικροδιάταξης SIR MYCOPLASMA είναι χαμηλή (<10 3 CCU/ml), η μεταβολή του χρώματος στα μικροβυθίσματα μπορεί να είναι αναξιόπιστη. Σε περίπτωση που το αποτέλεσμα δεν φαίνεται φυσιολογικό, συνιστάται η επανάληψη του τυποποιημένου ενοφθαλμίσματος και αντιβιογράμματος με τη χρήση της μικροδιάταξης SIR MYCOPLASMA. Αν, για ένα συγκεκριμένο αντιβιοτικό, το μικροβύθισμα με την υψηλότερη συγκέντρωση έχει κόκκινο χρώμα και το μικροβύθισμα με τη χαμηλότερη συγκέντρωση παραμένει κίτρινο, το αποτέλεσμα δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί. Συνιστάται η δημιουργία ενός ακόμη αντιβιογράμματος ξεκινώντας από ένα νέο τυποποιημένο ενοφθάλμισμα. Είναι γνωστό ότι τα μακρολίδια, ειδικά η ερυθρομυκίνη, είναι ευαίσθητα στις μεταβολές του ph (14). Πράγματι, ενδέχεται να παρατηρηθεί μεταβολή χρώματος σε μικροβύθισμα χαμηλής συγκέντρωσης και επομένως να προκύψει ενδιάμεσο αποτέλεσμα λόγω επίδρασης pη και όχι δραστηριότητας του αντιβιοτικού. Το συγκεκριμένο φαινόμενο μεταβολής του χρώματος ενδέχεται να παρατηρηθεί επίσης και στα μικροβυθίσματα αζιθρομυκίνης. 10- ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. BEBEAR C. Activité comparée de la minocycline et doxycycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme. Pathol. Bio., 1985,33, CANTET P et BEBEAR C. Activité comparée in vitro de sept quinolones sur Ureaplasma urealyticum. Pathol. Bio. 1983, 31, DAVIS J.W. Antimicrobial Susceptiblity of Ureaplasma urealyticum. J. Clin. Microb., 1981, 13, EVANS R.T and TAYLOR ROBINSON D. The Incidence of Tetracycline Resistant Strains of Ureaplasma urealyticum. J. Antimicrob. Chemother, 1978, 4, ROBERT M.C. Dissemination of the Tet M Tetracycline Resistance Determinant to Ureaplasma urealyticum. Antimicrob. Agents Chemother, 1986, 29, ROBERTSON J.A. Standardized Method for Determining Antimicrobial Susceptibility of Strains of Ureaplasma urealyticum and their Response to Tetracycline, Erythromycin and Rosaramincin. Antimicrob. Agents Chemother, 1981, 20, TAYLOR ROBINSON D. Clinical Antibiotic Resistances of Ureaplasma urealyticum. Pediatr. Infec. Dis., 1986, 5, SOBETZKO R., HARTMANN A.A., ELSNER P. Susceptibility of Ureaplasma urealyticum to Ten Chemotherapeutic Agents. Zbl.Bakt. Hyg. 1988, A269, RENAUDIN H., BEBEAR C. Evaluation des systèmes Mycoplasma Plus et SIR Mycoplasma pour la détection quantitative et l'étude de la sensibilité aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux. Path.Biol., 1990, 38, n 5, CUMMINGS M.C., Mc CORMACK W.M. Increase in Resistance of Mycoplasma hominis to Tetracyclines. Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34, BAURIAUD R., SEROR C.,LARENG M.B., LEFEVRE J.C. Sensibilité in vitro aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux isolés à Toulouse. Etude de nouvelles molécules (macrolides et quinolones).path. Biol. 1992, 40, n 5, WAITES K., DUFFY L., HAMRICK W., CROUSE D., CASSEL G. Microbiologic Efficacy of Intravenous erythromycin against Ureaplasma urealyticum in the Lower Respiratory Tract of Preterm Neonates. 10th International IOM congress Bordeaux July 19 26th 1994 Poster n 163.

8 13. BEBEAR C.M., RENAUDIN H., CHARRON A., CLERC M., PEREYRE S., BEBEAR C DNA Gyrase and Topoisomerase IV Mutations in Clinical Isolates of Ureaplasma spp. and Mycoplasma hominis Resistant to Fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 47: KENNY G. E, CARTWRIGHT F.D Effect of ph, Inoculum size, and Incubation time on the susceptibility of Ureaplasma urealyticum to Eryhtromycin in vitro. Clin. Infect. Dis.; 17 (Suppl 1). 15. WAITES K.B., BEBEAR C.M., ROBERTSON J.A., TALKINGTON D. F., KENNY G. E. Laboratory Diagnosis of Mycoplasmal Infections. Cumitech Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. Geneva : World Health Organization (WHO), 1991, 1 st edition. 17. Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR May 10, 2002 / 51 / No-RR BEBEAR C.M L antibiogramme. Chap Paris : Eska Editor, 1 st edition. 19. BEBEAR C.M., RENAUDIN H Evaluation de la galerie SIR Mycoplasma incluant l azithromycine.

9 55

10 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2007 Fax.: +33 (0) code: