ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ

Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ Εργαστήριο Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Λάμπρου Μαρία, M.Sc., Ph.D. Βιοχημικός & Βιοτεχνολόγος

2 ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΣΤΟΧΟΙ: 1. Τεχνικές αντιβιογράμματος 2. Μακροσκοπική εικόνα

3 Αντιβιοτικά Αντιβιοτικά: χημικές ουσίες με αντιμικροβιακή δράση φυσικής προέλευσης ή συνθετικής και ημισυνθετικής παραγωγής Δράση: αναστέλλουν τον μεταβολισμό ή την ανάπτυξη του μικροοργανισμού (βακτηριοστατικά) και ή θανατώνουν τον μικροοργανισμό (βακτηριοκτόνα) 1. Παρεμποδίζουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος 2. Αναστέλλουν κάποια μεταβολική διαδικασία 3. Παρεμβαίνουν στις λειτουργίες αντιγραφής, μεταγραφής, μετάφρασης 4. Προκαλούν διαταραχές στη λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης Πενικιλίνη: πρώτο αντιβιοτικό (A. Fleming, 1929)

4 Ομάδες Αντιβιοτικών Ανάλογα με το τρόπο δράσης τους

5 Ελεγχος της ευαισθησίας των μικροβίων στα αντιβιοτικα Σημαντική εξέταση για τον καθορισμό της αντιμικροβιακής αγωγής των ασθενών με λοιμώξεις με στόχο: Σωστή θεραπευτική των λοιμώξεων χρησιμοποιώντας το καλύτερο διαθέσιμο για την κάθε περίπτωση αντιβιοτικό, στη σωστή δόση και διάρκεια θεραπείας, με μειωμένη επίπτωση ανεπιθύμητων ενεργειών και τοξικότητας Αποφυγή της επικράτησης ανθεκτικών στελεχών μικροβίων ή την μείωση των ήδη επικρατούντων τόσο στην κοινότητα όσο και στο νοσοκομειακό περιβάλλον Την «ιδανική» προσφορά υπηρεσιών υγείας με λογικό κόστος

6 Μέθοδοι ελέγχου ευαισθησίας στα αντιβιοτικά 1. Μέθοδος διαχύσεως στο άγαρ από δισκία χαρτιού εμποτισμένα με αντιβιοτικά (Μέθοδος Kirby- Bauer) 2. Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) 3. MIC με αυτοματοποιημένα συστήματα (Vitek2/ Phoenix/Microscan)

7 1. Μέθοδος διαχύσεως στο άγαρ από δισκία χαρτιού εμποτισμένα με αντιβιοτικά (Μέθοδος Kirby- Bauer) Mέθοδος εκλογής: δοκιμή ευαισθησίας των αερόβιων και ταχείας αναπτύξεως, μη απαιτητικών μικροβίων Διαχωρίζονται τα μικρόβια σε: ευαίσθητα μέτρια ευαίσθητα ανθεκτικά Δεν εφαρμόζεται: σε μικρόβια διατροφικά απαιτητικά, όπως οι αιμόφιλοι και οι ναϊσσέριες, σε αναερόβια, σε ειδικές ομάδες μικροβίων με διαφορετική χημική δομή των επιφανειακών τους στοιχείων, όπως στα μυκοβακτηρίδιαμ βραδείας αναπτύξεως και άλλα παρεμφερή

8 1. Μέθοδος διαχύσεως στο άγαρ από δισκία χαρτιού εμποτισμένα με αντιβιοτικά (Μέθοδος Kirby- Bauer) Αρχή μεθόδου Μέθοδος διαχύσεως του αντιβιοτικού σε στερεό υλικό από δισκία διηθητικού χαρτιού εμποτισμένα με αντιβιοτικά η συγκέντρωση του αντιβιοτικού μειώνεται όσο η απόσταση από το δισκίο αυξάνεται Η μέθοδος είναι προτυποποιημένη Το μέγεθος της διαμέτρου αναστολής αναπτύξεως του μικροβίου που σχηματίζεται γύρω από το δισκίο είναι ανάλογο με την MIC του αντιβιοτικού

9

10 Εμποτισμένος δίσκος με αντιβιοτικό. Α: άγαρ, Β: δίσκος, C: Το αντιβιοτικό διαχέεται στο άγαρ με βαθμίδωση, D: βακτηριακή ανάπτυξη στην επιφάνεια του άγαρ μετά από 18 ώρες, E: ζώνη αναστολής

11 2. Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Πιο ειδική μέθοδος από το αντιβιόγραμμα κατά Kirby- Bauer, διότι δείχνει: όχι μόνο σε ποια αντιβιοτικά είναι ευαίσθητο το μικρόβιο που απομονώθηκε, αλλά και την ελάχιστη ποσότητα του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροβίου αυτού Πολύ σημαντικές πληροφορίες στον κλινικό γιατρό, σχετικά με τη δόση του αντιβιοτικού που θα χορηγηθεί στον ασθενή για τη θεραπεία της νόσου

12 2. Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Αρχή μεθόδου Σε σειρά διαδοχικών αραιώσεων του αντιβιοτικού προστίθεται προτυπωμένο (γνωστής περιεκτικότητας σε cfu/ ml) εναιώρημα του υπό εξέταση μικροβίου Η τελευταία αραίωση του αντιβιοτικού που ακόμη αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροβίου δείχνει την MIC Υπάρχει η μακρομέθοδος (παλαιότερη) που εκτελείται σε σωληνάρια με παρασκευή διαδοχικών αραιώσεων του αντιβιοτικού και η νεότερη μικρομέθοδος που εκτελείται σε ειδικές πλάκες μικροτιτλοποίησης

13 Διαδικασία της MIC. H βακτηριακή ανάπτυξη καθορίζεται από την ορατή θολότητα μετά από ώρες επώασης. Σε αυτό το παράδειγμα, η ελάχιστη συγκέντρωση αναστολής του αντιβιοτικού είναι 0,5mg/l (Σωλήνας Α)

14 Μέθοδος διαχύσεως στο άγαρ από δισκία χαρτιού εμποτισμένα με αντιβιοτικά (Μέθοδος Kirby- Bauer) Διαδικασία: Η μέθοδος ακολουθεί τα παρακάτω βήματα Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum) Eνοφθαλμισμός θρεπτικού υλικού Τοποθέτηση αντιβιοτικών Επώαση Ανάγνωση αποτελεσμάτων

15 Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum) Καθαρό καλλιέργημα μικροβίου σε μη εκλεκτικό υλικό (άγαρ) 4-5 αποικίες παρόμοιας μορφολογίας με αποστειρωμένο κρίκο Εναιωρούνται σε 4-5ml θρεπτικού ζωμού. Επώαση στους 37 ο C λίγες ώρες πολλαπλασιασμός θολώνει ο ζωμός Θολερότητα εναιωρήματος των μικροβίων πρέπει να ισοδυναμεί με 0,5 της θολομετρικής κλίμακας McFarland Ρύθμιση με αραίωση με αποστειρωμένο ισότονο διάλυμα NaCl ή με νέο εναιώρημα του ίδιου μικροβίου ή με ζωμό Εναιώρημα: 24h καλλιέργημα των μικροβίων (μη ζωντανά μικροβιακά κύτταρα)

16 Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος (inoculum)

17 Eνοφθαλμισμός θρεπτικού υλικού Καθοριστικός παράγοντας για την επιτυχία της μεθόδου το ομοιόμορφο πάχος θρεπτικού υλικού (περίπου 4 mm) Σε περίπτωση που το πάχος δεν ακολουθεί αυτόν τον κανόνα έχουμε ψευδή αποτελέσματα στις ζώνες αναστολής Επίσης, τα τρυβλία πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία 2-8 ο C, να χρησιμοποιούνται μέσα σε 1-4 εβδομάδες και πρέπει να είναι στεγνά (επιτυγχάνεται σε επωαστικό κλίβανο για min) Τέλος τα τρυβλία ελέγχονται για στειρότητα

18 Eνοφθαλμισμός θρεπτικού υλικού Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιείται είναι: Για τα μη απαιτητικά: MUELLER HINTON AGAR Aπαιτητικά: Mueller Hinton Agar + 5% αίμα προβάτου (στρεπτόκοκκοι, μηνιγγιτιδόκοκκος) Haemophilus test medium (αιμόφιλος) GC Agar + 1% supplement (γονόκοκκος)

19 Eνοφθαλμισμός θρεπτικού υλικού Ενοφθαλμισμός: 1. Χρήση βαμβακοφόρου στειλεού που βυθίζεται στο μικροβιακό εναιώρημα μας, στραγγίζεται και κατόπιν επιστρώνεται σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου 2. Επίστρωση ποσότητας του μικροβιακού εναιωρήματος που περιχύνεται στην επιφάνεια του υλικού, αμέσως μετά την παρασκευή του μικροβιακού εναιωρήματος γιατί η θολερότητα αυξάνεται με το χρόνο λόγω του γρήγορου πολλαπλασιασμού των μικροβίων Προσοχή: όχι με κρίκο

20 Eνοφθαλμισμός θρεπτικού υλικού

21 Τοποθέτηση αντιβιοτικών Τα δισκία αντιβιοτικών τοποθετούνται είτε ένα ένα με λαβίδα ή με την μικροσυσκευή πολλαπλών δισκίων πάνω στην επιφάνεια του άγαρ Διατηρούνται σε θερμοκρασία - 14 έως 8 ο C (καταψύχονται μόνο τα β- λακταμικά) και 1-2 ώρες πριν χρησιμοποιηθούν φέρονται απαραίτητα σε θερμοκρασία δωματίου. Προσοχή πάντα στην ημερομηνία λήξης Επιλογή των αντιβιοτικών πραγματοποιείται ανάλογα του είδους των μικροβίων και την θέση της λοίμωξης Δεν μετακινούνται δισκία που έχουν τοποθετηθεί ήδη πάνω στο τρύβλιο Επώαση και ανάγνωση αποτελεσμάτων

22 Τοποθέτηση αντιβιοτικών

23 Τοποθέτηση αντιβιοτικών

24 Οι συνθήκες επώασης: Επώαση για τα μη απαιτητικά μικρόβια: παρουσία O 2 στους 37 ο C για τα απαιτητικά μικρόβια: παρουσία 5% CO 2 στους 37 o C (Haemophilus influenzae, H. parainfluenzae, S. pneumoniae, Streptococcus spp. Neisseria meningipdis, Neisseria gonorrhoeae) Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως ώρες ώρες στα μικρόβια: Streptococcus spp., N. gonorrhoeae / N. meningipdis, Acinetobacter spp, B. cepacia, S. maltophilia 24 ώρες: σταφυλόκοκκος (οξακιλλίνη), εντερόκοκκος/σταφυλόκοκκος (βανκομυκίνη), στελέχη P. aeruginosa κυστικής ίνωσης

25

26 Ανάγνωση αποτελεσμάτων Διάμετροι των ζωνών αναστολής ανάπτυξης γύρω από κάθε δισκίο με διαβήτη, κανόνα ή ειδικό όργανο μετρησης της διαμέτρου, με γυμνό μάτι από την πίσω πλευρά του κλειστού τρυβλίου τοποθετημένου σε σκούρα επιφάνεια Διάμετρο της ζώνης γίνεται ο χαρακτηρισμός του μικροβίου ως ευαίσθητο, μέτρια ευαίσθητο ή ανθεκτικό βάσει προκατασκευασμένων πινάκων Σε πίνακα αναγράφεται η έκταση των ζωνών αναστολής που αναμένεται να έχουν τα ταχείας αναπτύξεως μη απαιτητικά μικρόβια. Ταυτόχρονα αναγράφονται και οι τιμές των MIC που αντιστοιχούν στις διάφορες ζώνες αναστολής

27 Ανάγνωση αποτελεσμάτων

28 Ανάγνωση αποτελεσμάτων

29

30 Ανάγνωση αποτελεσμάτων Προσοχή: Η διπλή ζώνη αναστολής, παρότι εμφανίζεται σπάνια, μπορεί να οφείλεται: Σε επιμόλυνση από ένα δεύτερο μικρόβιο (επανάληψη) Σε παρουσία διπλού πληθυσμού μικροβίων (η εσωτερική ζώνη αντιστοιχεί στα πιο ανθεκτικά μικρόβια) Λαμβάνεται υπόψη η εσωτερική ζώνη αναστολής Πρέπει να αγνοείται μόνο σε περίπτωση παρουσίας ερπυσμού ορισμένων μικροβίων (π.χ. Proteus spp) Επίσης η ύπαρξη αποικιών στο εσωτερικό της ζώνη αναστολής δεν λαμβάνεται υπόψιν, θεωρείται επιμόλυνση

31 h p:// kirby%20bauer.html ή h p:// associated- figure- resource/2237- animaxon

32 Μέθοδοι ελέγχου ποιότητας πρέπει να εφαρμόζονται σε όλα τα στάδια της διαδικασίας του αντιβιογράμματος Τακτικός έλεγχος ευαισθησίας προτύπων στελεχών μικροβίων (τουλάχιστον ανά εβδομάδα και σε κάθε αλλαγή παρτίδας αντιβιοτικών) για εξακρίβωση της δράσης των αντιβιοτικών. Αυτό γίνεται γιατί τα αντιβιοτικά μπορεί να εμφανίζουν μειωμένη δράση, παρά την τήρηση των κανόνων συντήρησης (συνήθως τεχνικοί λόγοι)

33 Μέθοδοι ελέγχου ποιότητας πρέπει να εφαρμόζονται σε όλα τα στάδια της διαδικασίας του αντιβιογράμματος Οταν υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι αιμοκαλλιέργειες ή καλλιέργειες ΕΝΥ είναι θετικές, π.χ. όταν η χρώση κατά Gram είναι θετική, τότε η απάντηση του αντιβιογράμματος μπορεί να επιταχυνθεί με την εκτέλεση άμεσης ευαισθησίας Το μικροβιακό εναιώρημα γίνεται άμεσα αραιώνοντας το κλινικό υλικό (ΕΝΥ - θολό υπερκείμενο ζωμών αιμοκαλλιέργειας μετά την φυγοκέντρηση) σε ζωμό με ρύθμιση της θολερότητας σύμφωνα με τη κλίμακα Mac Farland Ομως ο έλεγχος της ευαισθησίας του μικροβίου πρέπει να επαναλαμβάνεται κατόπιν με την κλασική μέθοδο, μετά την ανάπτυξη και απομόνωση του μικροβίου

34 Είδη ποιοτικού ελέγχου Εσωτερικός Ποιοτικός Ελεγχος Αξιολογεί / διασφαλίζει δουλειά ρουτίνας Εξωτερικός Ποιοτικός Ελεγχος Επικυρώνει την αναλυτική διαδικασία του εργαστηρίου Παρέχει διαπίστευση ποιότητας

35 Σκοπός ποιοτικού ελέγχου Καταγραφή, έλεγχος, διασφάλιση: Ακρίβεια και επαναληψιμότητα τεχνικών Ορθή παρασκευή υλικών Πρακτική τεχνολόγων και ιατρών

36 Είδη ποιοτικού ελέγχου Πρότυπα βακτηριακά στελέχη πρέπει να βρίσκονται στο εργαστήριο, να προμηθεύονται από αξιόπιστη εταιρεία, να συντηρούνται σύμφωνα με τις οδηγίες Enterococcus faecalis ATCC Escherichia coli ATCC E.Coli ATCC H.Influenzae ATCC H.Influenzae ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Neisseria gonorrheae ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

37 Είδη ποιοτικού ελέγχου Στον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας του αντιβιογράμματος χρησιμοποιείται η ίδια μέθοδος με τα ίδια υλικά όπως των κλινικών στελεχών Για κάθε αντιβιοτικό (πχ E. coli ΑΤCC 25922): Καταγραφή διαμέτρων ζωνών ευαισθησίας ή MIC Κατασκευή καμπύλης Levey- Jennings Σύγκριση με πίνακες Επιτρεπόμενων Ορίων Διακύμανσης Τιμών

38 Είδη ποιοτικού ελέγχου Ο εξωτερικός έλεγχος γίνεται από πιστοποιημένους Οργανισμούς με προγράμματα όπως: EQAS- AS External Quality Assurance System for AST (WHO + CDC) NEQAS AST External Quality Assurance System for AST (HPA- UK)

39 Διαδικασία εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου Εγγραφή του εργαστηρίου στο πρόγραμμα Παραλαβή οδηγιών και λοιπών πληροφοριών Παραλαβή άγνωστων στελεχών ελέγχου Εκτέλεση ταυτοποίησης και ευαισθησίας με την τρέχουσα μεθοδολογία Καταγραφή αποτελεσμάτων σε ανάλογες φόρμες, παράλληλα με πιθανά σχόλια Αποστολή των αποτελεσμάτων Παραλαβή των σωστών απαντήσεων Διασφαλίζει την ποιότητα και πιστότητα των αποτελεσμάτων του εργαστηρίου

40 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι: η μακρομέθοδος που είναι παλαιότερη, εκτελείται σε σωληνάρια με παρασκευή διαδοχικών αραιώσεων του αντιβιοτικού η νεότερη μικρομέθοδος, που έχει αντικαταστήσει πλέον την μακρομέθοδο, που εκτελείται σε ειδικές πλάκες μικροτιτλοποίησης

41 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Μακρομέθοδος

42 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Διαδικασία μικρομεθόδου: Ετοιμες αραιώσεις των αντιβιοτικών σε πλαστικές πλάκες μικροτιτλοποιήσης για Gram θετικά και Gram αρνητικά μικρόβια Σε κάθε σειρά κελιών υπάρχουν φθίνουσες αραιώσεις ενός αντιβιοτικού, έτσι σε μια πλάκα υπάρχουν 4,5,6 ή 8 διαφορετικά αντιβιοτικά ανάλογα του μεγέθους τους Το εναιώρημα με το λοιμογόνο παράγοντα παρασκευάζεται λαμβάνοντας 4-5 αποικίες από 18-24h καθαρό καλλιεργήμα και τοποθετούνται σε ζωμό Muller- Hinton και ρυθμίζεται η θολερότητα του ζωμού έτσι ώστε να αντιστοιχεί στην 0,5 McFarland

43 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Διαδικασία μικρομεθόδου (συνέχεια): Σπορά του ενοφθαλμίσματος στα κελιά: αυτόματη πιπέτα με όγκο 0,05-0,1ml ή με ειδικό αυτόματο κατανεμητή Επώαση των πλακών στους 36 ο C για 18-20h και λόγω ύπαρξης πολύ μικρών όγκων, φροντίζουμε να μην εξατμισθούν τα εναιωρήματα κλείνοντας με διάφανη ταινία κάθε πλάκα Μάρτυρας αναπτύξεως: ένα βύθισμα με μικροβιακό ενοφθάλμισμα χωρίς αντιβιοτικό Μάρτυρας στειρότητας: ένα βύθισμα μόνο με τον ζωμό

44 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Μικρομέθοδος

45 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Ανάγνωση: Διαβάζονται με καθρέπτη (βλέπουμε τους πυθμένες των κελιών) ή με φακό Ανάπτυξη μικροβίου υπάρχει στα βοθρία που είναι θολά ή έχουν «κομβίο» από μικρόβια στον πυθμένα Μετράται η ελάχιστη συγκέντρωση αντιβιοτικού που δεν παρατηρείται ανάπτυξη (MIC) Απαιτείται συνήθως η μέθοδος αυτή σε περίπτωση Μηνιγγίτιδας, Ενδοκαρδίτιδας, Οστεομυελίτιδας και σε όσα χαρακτηρίζονται ως «μη ευαίσθητα»

46 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentraxon) Δεν μας πληροφορούν για: Την δραστικότητα του αντιβιοτικού στον χρόνο Τον ρυθμό θανάτωσης των μικροβίων και εάν αυξάνεται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού Συνεχιζόμενη δράση που παραμένει μετά την έκθεση στο αντιβιοτικό

47 Προσδιορισμός ελάχιστης βακτηριοκτόνου πυκνότητας ή MΒC (Minimal Bactericidal Concentraxon) Κύρια επιδίωξη αυτής της μεθόδου είναι η θεραπευτική επιτυχία σε πολύ βαριές λοιμώξεις όπως Ενδοκαρδίτιδα, Οστεομυελίτιδα, και σε λοιμώξεις σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς Σήμερα για πολλές σύγχρονες ουσίες είναι κοντά στην μέθοδο MIC Δεν είναι προτυποποιημένη και είναι περισσότερο κατάλληλη για ερευνητικούς σκοπούς και για την αξιολόγηση νέων αντιβιοτικών

48 Προσδιορισμός ελάχιστης βακτηριοκτόνου πυκνότητας ή MΒC (Minimal Bactericidal Concentraxon) Διαδικασία: Η μέθοδος ακολουθεί τα παρακάτω βήματα: Προσδιορισμός της MIC με μια από τις δύο μεθόδους Αραιώσεις αντιβιοτικού Ανακαλλιέργεια σε στερεό θρεπτικό υλικό από τους δοκιμαστικούς σωλήνες ή τα κελιά χωρίς ορατή μικροβιακή ανάπτυξη Επώαση στους 36 ο C για 24h Καθορισμός του κρίσιμου αριθμού αποικιών για τον προσδιορισμό της MBC Υπολογισμός (CFU/ml )

49

50 E- test Αρχή: To Etest, αποτελεί τη νεότερη από τις μεθόδους αντοχής των μικροβίων στα αντιβιοτικά Συνδυάζει ουσιαστικά την κλασική μέθοδο του αντιβιογράμματος κατά Kirby - Bauer και την MIC To Etest αποτελείται από ένα λεπτό, πλαστικά strip, το οποίο περιέχει ένα αντιβιοτικό, σε πάρα πολλές υποδιπλάσιες αραιώσεις Μέθοδος κλιμακωτής (gradient) διάχυσης

51 E- test Διαδικασία: Η μέθοδος ακολουθεί τα παρακάτω βήματα Υλικό: ΜΗΑ Εναιώρημα - ενοφθαλμισμός: όπως στο αντιβιογραμμα (Κ- Β) Τοποθέτηση ταινιών Εtest Επώαση (όπως Κ- Β) Ανάγνωση αποτελεσμάτων

52 E- test Εναιώρημα ενοφθαλμισμός & Τοποθέτηση ταινιών Εtest Λαμβάνεται η ύποπτη αποικία με τη βοήθεια αποστειρωμένου βαμβακοφόρου στυλεού και εισάγεται σε σωληνάριο που περιέχει εμπλουτιστικό ζωμό MH μικροβιακό εναιώρημα Μια ποσότητα του μικροβιακού εναιωρήματος ενοφθαλμίζεται, στο MH άγαρ, με τη βοήθεια του στυλεού αυτού, και στρώνεται σε όλο το τρυβλίο, (όπως κλασικό αντιβιόγραμμα) Στο ενοφθαλμισμένο πλέον MH άγαρ, προστίθεται ένα ή περισσότερα strips, στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού με ιδιαίτερη προσοχή, με τη βοήθεια λαβίδας ανάλογα με τα αντιβιοτικά στα οποία ελέγχεται η ευαισθησία του μικροβίου

53

54 E- test Επώαση - Ανάγνωση αποτελεσμάτων Τελικά, το τρυβλίο επωάζεται στον επωαστικό κλίβανο για 24 ώρες ανεστραμμένο Την επόμενη ημέρα αξιολογείται η διαυγής ζώνη που δημιουργείται γύρω από το strip To σημείο όπου τελειώνει η διαυγής ζώνη δείχνει την ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού (MIC), η οποία αναστέλλει τη δράση του μικροβίου Πάνω στο strip αναγράφονται όλες οι υποδιπλάσιες αραιώσεις του αντιβιοτικού και έτσι είναι εύκολο να βρεθεί η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του

55 Καθορισμός της MIC με E- test. Α: Ζώνη αναστολής, B: Βακτηριακή ανάπτυξη, C: Ταινία E- test, D: Η MIC είναι το σημείο στο οποίο η άκρη της ζώνης αναστολής διασταυρώνει τo Ε- test. Στο συγκεκριμένο παράδειγμα η MIC είναι 3mg/l.

56 E- test Προσοχή: περιπτώσεις που εμφανίζονται αποικίες στην ζώνη αναστολής το μικρόβιο θεωρείται ανθεκτικό Προσοχή: φαινόμενο "dip effect", κατά το οποίο ορατά μεν η αναστολή ανάπτυξης του μικροβίου επεκτείνεται παράλληλα και πολύ κοντά στην ταινία ευαισθησίας και προς τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις (σημείο Ζ της εικόνα), μετά το προφανές σημείο του πραγματικού κύκλου αναστολής με την ταινία (σημείο Χ), όπου αντιστοιχεί η MIC Η ανάπτυξη αυτή πρέπει να αγνοείται Το φαινόμενο εμφανίζεται συχνότερα κατά τον έλεγχο πνευμονιοκόκκων, εντεροκόκκων και σταφυλόκοκκων

57

58 E- test Στα βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά: πλήρης αναστολή ανάπτυξης (όχι μικροαποικίες και θόλωση (haze)) Στα βακτηριοστατικά αντιβιοτικά: 80% αναστολή ανάπτυξης Τα τελευταία χρόνια το Etest, χρησιμοποιείται συχνά για τον έλεγχο της MIC σε πολλά αντιβιοτικά, με πολύ καλά αποτελέσματα

59

60 h p:// shoeb/e- test.mov

61 β- Λακταμάσες Ενζυμα που αδρανοποιούν τα β- λακταμικά αντιβιοτικά Τα χρωμοσωμιακά ένζυμα προϋπήρχαν της εποχής των αντιβιοτικών και βρίσκονται σχεδόν σε όλα τα βακτήρια Εκκρίνονται ιδιοσυστασιακά Θεωρείται οτι αναπτύχθηκαν για να προστατεύσουν τα βακτήρια από τα φυσικά β- λακταμικά παράγωγα μυκήτων και άλλων βακτηρίων Θεωρείται ότι τα γονίδιά τους "αποσπάστηκαν" από το χρωμόσωμα και ενσωματώθηκαν σε "μετακινούμενα στοιχεία" (πλασμίδια, μεταθετά στοιχεία) Πρώτη αναφορά πλασμιδιακής β- λακταμάσης: TEM- 1

62 Μηχανισμός δράσης β- λακταμασών Οι β- λακταμάσες χαρακτηρίζονται από σχετική ειδικότητα υποστρώματος, δηλ. το κάθε ένζυμο υδρολύει συνήθως μόνο ένα ή μια μικρή ομάδα αντιβιοτικών Μηχανισμός δράσης: υδρόλυση του β- λακταμικού δακτυλίου με την δράση εστέρα της σερίνης (ένζυμα ομάδας σερίνης, serine β- lactamases) και με την δράση ιόντων ψευδαργύρου (ένζυμα ομάδας ψευδαργύρου, zinc β- lactamases)

63 Ελεγχος παραγωγής β- λακταμασών Μέθοδος χρωμογόνου κεφαλοσπορίνης (νιτροσεφίνης) Είναι μέθοδος απλή, γρήγορη και ακριβής για ορισμένα μικρόβια (πχ για αιμοφίλους ναϊσσέριες και εντεροκόκκους) και πρέπει να υπάρχει δυνατότητα πραγματοποίησης σε όλα τα εργαστήρια. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε σοβαρές λοιμώξεις Φέρεται στο εμπόριο σε μικρά κίτρινα δισκία χαρτιού Μια κρικιά του καλλιεργήματος επιστρώνεται στο δισκίο χαρτιού. Αυτό τοποθετείται μέσα σε τρυβλίο κλειστό (για να εμποδιστεί η ταχεία εξάτμιση). Μέσα σε 30sec έως 15min αλλάζει το χρώμα. Το δισκίο από κίτρινο γίνεται κόκκινο αν το μικρόβιο παράγει β- λακταμάση

64

65 Η είσοδος των β- λακταμικών αντιβιοτικών προκάλεσε επανάσταση στην θεραπευτική όμως σύντομα αναδείχθηκε το σημαντικό πρόβλημα της ανάπτυξης αντοχής Ετσι πρέπει να προσπαθούμε και να μελετούμε την ελάττωση αυτών και όχι την βιοαντοχή τους

66

67

68

69