Ακινητοποίηση λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες για εφαρμογές σε ουρολογικούς καθετήρες

Transcript

1 Ακινητοποίηση λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες για εφαρμογές σε ουρολογικούς καθετήρες Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» Διαμάντη Γεωργία Βιολόγος Πάτρα

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Ακινητοποίηση λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες για εφαρμογές σε ουρολογικούς καθετήρες Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Αντιμησιάρη Σοφία, Καθηγήτρια τμήματος Φαρμακευτικής Σπηλιοπούλου Ίρις, Καθηγήτρια τμήματος Ιατρικής Κλεπετσάνης Παύλος, Επίκουρος καθηγητής τμήματος Φαρμακευτικής 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης με κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» κατά τα έτη Ευχαριστώ την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου κα. Σ. Αντιμησιάρη, Kαθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την πολύτιμη καθοδήγηση, τη σημαντικότατη βοήθεια και την ιώβεια υπομονή της στην ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω την κα. Ι. Σπηλιοπούλου, Καθηγήτρια της Ιατρικής Σχολής, Πανεπιστημίου Πατρών, καθώς και τον κ. Π. Κλεπετσάνη, Επ. Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για τις πολύτιμες συμβουλές τους, καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Επίσης ευχαριστώ, τα μέλη του εργαστηρίου, και ιδιαιτέρως τον Δρ. Σπύρο Μουρτά, για την βοήθειά τους, τη φιλία τους και τις σημαντικές παρατηρήσεις τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας μου. Ιδιαίτερη και πολύτιμη ήταν η βοήθεια του Δρ. Β. Δρακόπουλου (ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ), της ιατρού κα Σταμούλη Β. από το Βιοχημικό εργαστήριο του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών, καθώς και της Δρ. Αντιγόνης Φωκά από το Μικροβιολογικό εργαστήριο του Πανεπιστημίου Πατρών. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Μαρία Μπίρκου για τη στήριξη και τις συμβουλές της καθ όλη τη διάρκεια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος, καθώς και τον Γιάννη Διαμάντη, Γιάννη Νάκα, Βίκυ Παπαροϊδάμη και Χαρά Παπαγεωργίου για την υπομονή τους τις τελευταίες μέρες ολοκλήρωσης της εργασίας αυτής. 3

4 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 1,2-EDT BSA Chol CL CMC DLS DRV DSC 1,2-ethanedithiol (1,2-αιθανοδιθειόλη) Bovine Serum Albumin (Αλβουμίνη βόειου ορού) Cholesterol (Χοληστερόλη) Conventional Liposomes (συμβατικά λιποσώματα) Critical Micelle Concentration (κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση) Dynamic Laser Scattering (μέθοδος δυναμικής σκέδασης φωτός) Dried reconstituted vesicles (συμπυκνωμένα-αναγεννημένα κυστίδια) Differential scanning calorimetry (διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης) DSPC DSPC-PEG- COOH FBS FI FTS HDL LDL Lipid-PEG Lipid-Maleimide LUV MLV MVV PBS PC PCS distearoylphosphatidylcholine (Διστεραϋλοφωσφατιδυλοχολίνη) Distearoyl-N-(3-carboxypropionoylpoly(ethyleneglycol)succinyl) phosphatidylethanolamine Fetal bovine serum (βόειος ορός) Fluorescence Intensity (ένταση φθορισμού) Freeze-Thaw Sonication method High Density Lipoprotein (υψηλής πυκνότητας λιποπρωτείνη) Low Density Lipoprotein (χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη) DSPE -PEG2000: 1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy(polyethyleneglycol)-2000] DSPE-PEG(2000) Maleimide :1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-n-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] Large unilamellar vesicles (μεγάλα μονοστοιβαδιακά κυστίδια) Multilamellar vesicles (πολυστοιβαδιακά κυστίδια) Multivesicular vesicle (πολυσωματιδιακό λιπόσωμα) Phosphate buffer saline (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών) Phosphatidylcholine (Φωσφατιδυλοχολίνη) Photon Correlation Spectroscopy (Φασματοσκοπία Συσχέτισης φωτονίων) 4

5 PEG REV SEM SL SPLV SUV TC ΤΕΜ ULV Polyethylene glycol (Πολυαιθυλενογλυκόλη) Reverse phase evaporation vesicle (αντίστροφης φάσης εξατμιζόμενο σωματίδιο) Scanning Electron Microscopy (Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης) Sterically stabilized liposomes (σταθερά λιποσώματα) Stable plurilamellar vesicle (σταθερό πολυστοιβαδιακό λιπόσωμα) Small unilamellar vesicles (μικρά μονοστοιβαδιακά κυστίδια) Transmission Temperature (Θερμοκρασία Μετάπτωσης) Transmission Electron Microscopy (ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης) Unilamellar vesicle (μονοστοιβαδιακό λιπόσωμα) 5

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ακινητοποίηση λιποσωμάτων με εγκλωβισμένη Tobramycin σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες, με σκοπό την παρασκευή αντιμικροβιακών ενδοπροθέσεων του ουροποιητικού, που αποδεσμεύουν φάρμακο με ελεγχόμενο ρυθμό. Παρασκευάστηκαν διαφορετικοί τύποι λιποσωμάτων και μετρήθηκε ο εγκλωβισμός της Tobramycin (ΤΟΒ), με μέθοδο άμεσης χημειοφωταύγειας. Λιποσώματα με μέγεθος ~95 nm, παρασκευάστηκαν με την τεχνική της λυοφιλοποίησης/ενυδάτωσης και εξώθησης μέσω μεμβρανών (extruded-drv) ή με υπερήχους (SUV). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων εγκλωβισμού έδειξαν 4 φορές υψηλότερο εγκλωβισμό σε λιποσώματα extruded-drv έναντι των SUV. Δίσκοι ανοξείδωτου χάλυβα 316, επικαλύφθηκαν με χρυσό και ακινητοποιήθηκαν στην επιφάνειά τους ειδικά τροποποιημένα Mal-lipid λιποσώματα (από λιπίδια DSPC, lipid-peg και lipid-maleimide), χρησιμοποιώντας 1,2-αιθανδιθειόλη. Η ειδική προσκόλληση των λιποσωμάτων στην επιφάνεια των δίσκων (μετά από επώαση με τα λιποσώματα) αποδείχτηκε με τη μέτρηση φθορισμού της καλσεΐνης, η οποία ήταν εγκλωβισμένη στα λιποσώματα. Πραγματοποιήθηκαν και μετρήσεις φθορισμού σε επιφάνειες που επωάστηκαν με λιποσώματα χωρίς Mal-lipid (control), ώστε να μετρηθεί η μη-ειδική προσκόλληση. Αύξηση στον χρόνο επώασης (λιποσωμάτων - επιφανειών) από 2 σε 24 ώρες, καθώς και αύξηση του ποσοστού PEGlipid από 4% σε 8% δεν έδειξε να επηρεάζουν σημαντικά τον λόγο ειδική/μη-ειδική προσκόλληση, σε αντίθεση με το ποσοστό του Mal-lipid, όπου παρατηρήθηκε αύξηση του λόγου όταν χρησιμοποιήθηκε 0,1 mol% Mal-lipid (σε σύγκριση με το 1 mol% [επί του συνολικού λιπιδίου]). Για την απόδειξη της αντιμικροβιακής δράσης των επιφανειών πάνω στις οποίες ακινητοποιήθηκαν TOB-λιποσώματα, έναντι τεσσάρων στελεχών Staphylococcus epidermidis, χρησιμοποιήθηκαν extruded-drv λιποσώματα στα οποία είχε εγκλωβιστεί ΤΟΒ, καθώς και λιποσώματα χωρίς ΤΟΒ (ελέγχου). Παρατηρήθηκε αισθητή μείωση του βακτηριακού πληθυσμού στις επιφάνειες με ακινητοποιημένα ΤΟΒ- λιποσώματα. 6

7 ABSTRACT The aim of this study is to covalently link liposomes on metallic surfaces, as a method to prepare antimicrobial controlled (release) drug-eluting stents, using Tobramycin (TOB) as an anti-microbial drug. As a preliminary step for immobilization of TOB, different types of liposomes were constructed and evaluated for TOB loading efficiency, size distribution and ζ-potential. TOB concentrations were measured by a chemiluminescence immunoassay (ADVIA Centaur, Siemens), after modulating the technique as required for the specific samples. Results show that extruded DRV liposomes with similar sizes (mean diameter) with that of SUV liposomes (~95 nm), have 4 times higher drug loading efficiency. DSPC, lipid-peg and lipid-peg-maleimide lipids were used for liposome construction. SS disks were sputtered with gold and the maleimide functionalized liposomes were covalently attached on the disk surface, by using 1,2-ethandithiol (at ph 6.50). The immobilization of the vesicles on the surfaces was determined by fluorometric measurement of the attached (liposome-entrapped) calcein, while the non-specific binding of non-functionalized (control) liposomes was also measured. Results show that when increasing the incubation period (between liposomes and surfaces) from 2 to 24h a slight (non-significant) increase of the ratio between specific/non-specific binding is observed; and modulation of the total PEG-lipid content (from 4 to 8 mol%) of the liposomes does not have any significant effect on this ratio. However when calculating the lipid attachment per cm 2 surface, the values are higher in the case of liposomes functionalized with 0.1 mol% Maleimide-lipid compared to 1 mol% (of total lipid). Finally, the anti-microbial effect of DRV-functionalized liposomes when loaded with TOB and attached to SS-gold disks, against four strains of S. epidermidis, was proven, after successful attachment of the drug-loaded liposomes on the surfaces and measuring the bacterial attachment (compared to the attachment of bacteria on control surfaces [with empty liposomes, or with no liposomes at all]).. 7

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 3 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 ABSTRACT... 7 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΒΙΟΜΟΡΙΑ: ΛΙΠΙΔΙΑ Γενικά περί λιπιδίων Φωσφολιπίδια Οργάνωση λιπιδίων λιπιδικών μεμβρανών Η χοληστερόλη και ο ρόλος της Λιποσώματα Σταθερότητα λιποσωμάτων Τύποι λιποσωμάτων Μέθοδοι παρασκευής και χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Μηχανική διασπορά Εξώθηση μέσω φίλτρων Χρήση Μικρογαλακτωματοποιητή Ένεση λιπιδίων Έγχυση Αιθανόλης Έγχυση Αιθέρα Νερό σε οργανική φάση Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Σωματίδια (DRV) Μέθοδος FreezeThaw Χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Δυναμικό επιφάνειας λιποσωμάτων (ζ-δυναμικό) Κατανομή μεγέθους Φυσικά Χαρακτηριστικά Χαρακτηριστικοί παράμετροι Αναλυτική μέθοδος/όργανα Χημικά Χαρακτηριστικά Βιολογικά Χαρακτηριστικά Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Διαπίδυση (dialysis) Φυγοκέντρηση (centrifugation) Χρωματογραφία γέλης (gel chromatography) Εφαρμογές των λιποσωμάτων Β. ΒΙΟΫΛΙΚΑ Γενικά περί Βιοϋλικών Κατηγορίες βιοϋλικών Βιοϋλικά πρώτης, δεύτερης και τρίτης γενιάς Ουρολογικές Ενδοπροθέσεις Ανατομία Ουρητήρα

9 Γ. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΕΝΔΟΠΡΟΘΕΣΕΩΝ ΟΥΡΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Κατάταξη των Βακτηρίων Κατάταξη Σταφυλοκκόκων Staphylococcus epidermidis Στάδια προσκόλλησης του S. epidermidis στην επιφάνεια ενός Βιοϋλικού Λοιμώξεις ενδοπροθέσεων ουροποιητικού συστήματος Κακώσεις ουρητήρα Αντιβιοτικά Αμινογλυκοσίδες Ποσοτικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό των αμινογλυκοσίδων ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Συσκευές και όργανα Υλικά Λιπίδια σε μορφή σκόνης: Διαλύματα Παρασκευή διαλύματος καλσεΐνης 0,1 Μ Παρασκευή ρυθμιστικου διάλυματος PBS ph Διάλυμα Tobramycin Διάλυμα φυσιολογικού ορού 0,9% NaCl (αποστειρωμένο) Θρεπτικά υλικά και βακτηριακά στελέχη Καθαρισμός λιποσωμάτων Αντιδραστήρια Μέθοδοι Προσδιορισμός λιπιδίου- Μέθοδος Steward Προσδιορισμός Tobramycin - Άμεση Χημειοφωταύγεια (Direct Chemiluminescence Immunoassay- CIA) Πρότυπη καμπύλη αναφοράς για προσδιορισμό συγκέντρωσης Tobramycin στα δείγματα Προσδιορισμός εγκλωβισμένης καλσείνης - Πρότυπη καμπύλη καλσείνης Μελέτη εγκλωβισμού Tobramycin Πολυστιβαδιακά λιποσώματα που εγκλωβίζουν Tobramycin (MLV) Μονοστιβαδιακά λιποσώματα που εγκλωβίζουν Tobramycin (SUV) Αφυδατωμένα ενυδατωμένα λιποσώματα (DRV) που εγκλωβίζουν Tobramycin Ακινητοποίηση λιποσωμάτων με εγκλωβισμένη καλσείνη σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες Επίστρωση επιφανειών με χρυσό Παρασκευή και χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Διαπίστωση ειδικής ή μη-ειδικής προσκόλλησης λιποσωμάτων σε επιχρυσωμένες επιφάνειες Αντιμικροβιακή προστασία τελικών επιφανειών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Απόδειξη προσκόλλησης λιποσωμάτων σε επιχρυσωμένες SS-316 μεταλλικές επιφάνειες

10 4.2 Μελέτη εγκλωβισμού Tobramycin σε διαφορετικού τύπου λιποσώματα με σκοπό την επιλογή άριστου παρασκευάσματος Επιβεβαίωση αντιμικροβιακής προστασίας τελικών επιφανειών ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συμπεράσματα για την δυνατότητα ακινητοποίησης των λιποσωμάτων στις επιφάνειες Συμπεράσματα για την μελέτη εγκλωβισμού της Tobramycin σε διαφορετικού τύπου λιποσώματα με σκοπό την επιλογή άριστου παρασκευάσματος Συμπεράσματα για την επιβεβαίωση της αντιμικροβιακής προστασίας των τελικών τροποποιημένων επιφανειών Συμπεράσματα για πιθανές κλινικές εφαρμογές στην κατασκευή προηγμένων ουρολογικών καθετήρων 126 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 1.ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

12 Α. ΒΙΟΜΟΡΙΑ: ΛΙΠΙΔΙΑ 12

13 1 Γενικά περί λιπιδίων Τα λιπίδια είναι οργανικά μόρια που απαντούν στη φύση και μπορούν να απομονωθούν κατά την εκχύλιση κυττάρων και ιστών με μη-πολικούς οργανικούς διαλύτες. Ο προσδιορισμός τους γίνεται με βάση μια φυσική τους ιδιότητα (διαλυτότητα) και όχι με βάση τη δομή τους, όπως συμβαίνει με τους υδατάνθρακες και τις πρωτεΐνες. Τα λιπίδια ταξινομούνται σε δύο κατηγορίες: σε αυτά που περιέχουν εστερομάδες και μπορούν να υδρολυθούν, όπως λίπη, τριγλυκερίδια και κηροί, και σε αυτά που δεν περιέχουν εστερομάδες και δεν υδρολύονται, όπως η χοληστερόλη και άλλα στεροειδή (Εικόνα 1.1). Α. Β. Εικόνα 1.1: Α. Δομή λιπιδίου με ένα εστέρα, τριγλυκερίδιο (R, R, R = ανθρακικές αλυσίδες με C11-C19). Β. Δομή χοληστερόλης. 1.1 Φωσφολιπίδια Τα φωσφολιπίδια είναι μια μεγάλη ομάδα εξαιρετικά σύνθετων μορίων που συναντώνται εκτεταμένα στις βιολογικές μεμβράνες και έχουν μια φωσφορική εστερομάδα, ως κοινό γνώρισμα. Η πλειοψηφία των φωσφολιπιδίων περιέχουν γλυκερόλη ως μια από τις δομικές μονάδες και προέρχονται από το γλυκερινο-1- φωσφορικό εστέρα (α-γλυκερινοφωσφορικό οξύ) με την R απεικόνιση στο 13

14 χειρομορφικό κέντρο. Στη συνέχεια ο εστέρας αλκυλιώνεται στις άλλες δύο υδροξυλομάδες του υπολείμματος της γλυκερόλης από λιπαρά οξέα μακριάς αλυσίδας για να σχηματιστούν φωσφατιδικά οξέα που μετατρέπονται σε φωσφογλυκερίδια με εστεροποίηση του υπολείμματος του φωσφορικού οξέος από ένα άλλο μόριο (π.χ. χολίνη ή αιθανολαμίνη) που περιέχει μια υδροξυλομάδα. Γνωρίζουμε αρκετά είδη φωσφογλυκεριδίων, που διακρίνονται από τη φύση λόγω αυτού του τελικού τμήματος του μορίου, και που είναι πάντα μια εξαιρετικά πολική ομάδα ή μια ομάδα που συνδέεται με δεσμό υδρογόνου. Σημαντικότερα φωσφογλυκερίδια είναι οι λεκιθίνες (Εικόνα 1.2) και οι κεφαλίνες. Εικόνα 1.2: Φωσφατιδυλοχολίνη, μια λεκιθίνη. Μια δεύτερη κύρια κατηγορία φωσφολιπιδίων, μετά τα φωσφογλυκερίδια, περιλαμβάνει τα σφιγγολιπίδια. Τα σφιγγολιπίδα προέρχονται από τη σφιγγοσίνη ή κάποια συγγενική της διυδροξυαμίνη (σφιγγανίνη). Η σφιγγοσίνη είναι ένα μόριο μακριάς αλυσίδας που τα τελικά της τρία άτομα άνθρακα έχουν λειτουργικότητα που 14

15 μοιάζει με αυτή της γλυκερόλης ενώ το υπόλοιπο του μορίου έχει μια μακριά υδρογονανθρακική αλυσίδα που μοιάζει με αυτή ενός λιπαρού οξέος (Εικόνα 1.3). Εικόνα 1.3: Δομή Σφιγγοσίνης. Τα σφιγγολιπίδια αποτελούν συστατικά όλων των φυτικών και ζωικών μεμβρανών. Υπάρχουν σε αφθονία στον εγκέφαλο και στους νευρικούς ιστούς, όπου ενώσεις που αποκαλούνται σφιγγομυελίνες αποτελούν τα κύρια συστατικά του περιβλήματος των νευρικών ινών. Οι σφιγγομυελίνες (Εικόνα 1.4) έχουν μια ομάδα φωσφορικής χολίνης συνδεδεμένη πάνω στην υδροξυλομάδα. Εικόνα 1.4: Δομή σφιγγομυελίνης, ένα σφιγγολιπίδιο. 15

16 2 Οργάνωση λιπιδίων λιπιδικών μεμβρανών Τα φωσφολιπίδια, τα γλυκολιπίδια και τα σφιγγολιπίδια, όπως αναφέρθηκε και ανωτέρω (Ενότητα 1.1), συμμετέχουν στο σχηματισμό των μεμβρανών των ζωντανών συστημάτων. Για να κατανοήσουμε όμως τον λόγο γι αυτό είναι απαραίτητο να κοιτάξουμε μερικούς από τους παράγοντες που σχετίζονται με το φαινόμενο της διαλυτότητας. Ο βαθμός στον οποίο ένα διαλυόμενο σώμα θα διαλυθεί σε ένα διαλύτη καθορίζεται από τις σχετικές δυνάμεις αλληλεπίδρασης διαλυόμενου σώματος-διαλύτη στην στερεά κατάσταση και της αλληλεπίδρασης διαλύτη-διαλύτη και διαλυόμενου σώματος-διαλύτη στην υγρή φάση. Τα πολικά διαλυόμενα σώματα έχουν συνήθως ισχυρές δυνάμεις που συνδέουν το κρυσταλλικό πλέγμα (π.χ. ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση σε ιοντικά ή τύπου διπολικού ιόντος στερεά, ή πολλαπλή σύνδεση με δεσμούς υδρογόνου όπως στα σάκχαρα) και είναι απίθανο να διαλυθούν εύκολα σε μη πολικούς διαλύτες, όπου οι αλληλεπιδράσεις διαλυόμενου σώματος-διαλύτη θα είναι ασθενείς και θα παραχθεί σχετικά λίγη ενέργεια από αυτή τη πηγή για να αντισταθμίσει την ενέργεια που απαιτείται για να απομακρύνει τα μόρια από το κρυσταλλικό πλέγμα. Αντίθετα, οι εξαιρετικά πολικοί διαλύτες δεν διαλύουν εύκολα μη πολικά σώματα γιατί η εισαγωγή μη πολικών μορίων διαλυόμενου σώματος μεταξύ των μορίων του πολικού διαλύτη θα κατέστρεφε τις σχετικά ισχυρές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων του διαλύτη χωρίς καμία σημαντική αντισταθμιστική αλληλεπίδραση διαλυόμενου σώματοςδιαλύτη. Έτσι γι αυτές τις ουσίες που διαλύονται σαν διασπειρόμενα, μεμονωμένα μόρια υπάρχει μια καλά διαπιστωμένη ποιοτική σχέση μεταξύ της διαλυτότητας και των σχετικών πολικοτήτων του διαλυόμενου σώματος και του διαλύτη. Σε ένα πολικό διαλύτη, όπως το νερό ή η μεθανόλη, ο διαλύτης θα αλληλεπιδράσει με το πολικό άκρο του διαλυόμενου σώματος τείνοντας να προκαλέσει τη διάλυση αυτού του μέρους του μορίου, ενώ η μικρή αλληλεπίδραση διαλυόμενου σώματος-διαλύτη θα τείνει να εξαιρέσει το μη πολικό μέρος του μορίου από το διαλυτικό μέσο. Τέτοια διαλυόμενα σώματα, κάτω από αυτές τις συνθήκες, τείνουν να σχηματίσουν συσσωματώματα γνωστά σαν μικύλλια, στα οποία τα μη πολικά άκρα του μορίου του διαλυόμενου σώματος συγκεντρώνονται μαζί, ενώ τα πολικά άκρα σχηματίζουν μια εξωτερική στιβάδα που αλληλεπιδρά με το πολικό μέσο. Το αποτέλεσμα είναι ο σχηματισμός ενός μη πολικού σφαιριδίου με μια πολική επιφάνεια (Εικόνα 1.5). 16

17 Εικόνα 1.5: Η δομή των φωσφολιπιδίων τους επιτρέπει να δημιουργήσουν σχηματισμούς, όπως τα μικύλλια και τα λιποσώματα. Ο σχηματισμός μικυλλίων δεν απαιτεί την ύπαρξη ηλεκτρικού φορτίου στο διαλυόμενο σώμα. Ενώ τα τριγλυκερίδια (τριαλκυλογλυκερίνες) είναι αδιάλυτα στο νερό, οι μονο- και διαλκυλογλυκερίνες (DAG) διαλύονται σχηματίζοντας μικύλλια. Το υδατοδιαλυτό (υδρόφιλο) τμήμα είναι η ελεύθερη υδροξυλομάδα που μπορεί να συνδεθεί με δεσμό υδρογόνου με το νερό και σε αυτή οφείλεται η ικανότητα αναμείξεως της γλυκερόλης με το νερό. Τα μη υδατοδιαλυτά (υδρόφοβα) τμήματα σε αυτά τα γλυκερίδια είναι οι μακριές υδρογονανθρακικές αλυσίδες των λιπαρών οξέων. Τα σφαιρικά συσσωματώματα (μικύλλια και λιποσώματα) δεν είναι το μόνο είδος δομής που σχηματίζεται από μόρια με υδρόφιλα και υδρόφοβα τμήματα. Τα φωσφολιπίδια και οι σχετικές ενώσεις σχηματίζουν εύκολα και αυθόρμητα μονοστιβάδες πάνω στην επιφάνεια υδατικών μέσων, και διπλοστιβάδες μέσα στα υδατικά μέσα. Η διπλοστιβάδα λιπιδίου είναι μια λεπτή μεμβράνη φτιαγμένη από δύο στρώματα μορίων λιπιδίου. Οι διπλοστιβάδες λιπιδίων είναι το φράγμα που συγκρατεί ιόντα (Na+, K+), πρωτεΐνες και άλλα μόρια, όπου απαιτείται, και τα αποτρέπουν από τη διάχυση στις περιοχές όπου δεν πρέπει να είναι. Οι διπλοστιβάδες λιπιδίων ταιριάζουν ιδανικά με αυτόν τον ρόλο επειδή, ακόμα κι αν είναι μόνο μερικά νανόμετρα (nm) σε πάχος, είναι αδιαπέραστες από τα περισσότερα υδατοδιαλυτά (υδρόφιλα) μόρια. Οι διπλοστιβάδες 17

18 είναι ιδιαίτερα αδιαπέραστες από τα ιόντα, κάτι το οποίο επιτρέπει στα κύτταρα να ρυθμίζουν τη συγκέντρωση και το ph με την άντληση των ιόντων στις μεμβράνες τους, χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες, τις αποκαλούμενες ιοντικές αντλίες. Οι φυσικές διπλοστιβάδες αποτελούνται συνήθως από φωσφολιπίδια, τα οποία έχουν μία υδρόφιλη κεφαλή και δύο υδρόφοβες ουρές (Εικόνα 1.6). Όταν τα φωσφολιπίδια εκτίθενται στο νερό, διευθετούνται σε δυο επίπεδα φύλλα (μία διπλοστιβάδα) με όλες τις ουρές τους να κατευθύνονται προς το κέντρο της στοιβάδας. Το κέντρο αυτής της διπλοστιβάδας δεν περιέχει σχεδόν καθόλου νερό και αποκλείει επίσης μόρια όπως σάκχαρα ή άλατα που διαλύονται στο νερό, αλλά όχι οργανικούς διαλύτες. Εικόνα 1.6: Βασική δομή των βιομεμβράνων, αποτελούμενες από φωσφολιπίδια. Οι βιολογικές μεμβράνες δεν αποτελούνται μόνο από φωσφολιπίδια αλλά περιέχουν κατά μέσο όρο 60% πρωτεΐνες και 40% λιπίδια, και στο περιεχόμενο αυτών περιλαμβάνονται ποικίλες ποσότητες στεροειδών, από τα οποία αξίζει να αναφερθεί η χοληστερόλη, ο ρόλος της οποίας θα αναλυθεί εκτενέστερα πιο κάτω. Οι πρωτεΐνες έχουν και μη πολικές και πολικές περιοχές που μπορούν να αλληλεπιδράσουν αντίστοιχα με τη διπλοστιβάδα και τα υδατικά μέσα. Προφανώς δεν υπάρχουν ομοιοπολικοί δεσμοί μεταξύ της πρωτεΐνης και των λιπιδίων των μεμβρανών και έτσι άλλα μόρια μπορούν να έχουν κάποια ελευθερία κινήσεως μέσα στην μεμβράνη. Κατά την διαμόρφωση αυτή των λιπιδίων στις διπλοστιβάδες αναδύονται καινούργιες μεμβρανικές συμπεριφορές. Η μεμβράνη υφίσταται μεταβολές φάσης, γύρω από μια κρίσιμη θερμοκρασία. Για ομοιογενείς μεμβράνες (όπου όλα τα λιπίδια είναι 18

19 ίδια) αυτή η θερμοκρασία είναι γνωστή ως θερμοκρασία τήξης του λιπιδίου και συμβολίζεται ως Tm. Παρόλο που κατά συνθήκη η Tm αναφέρεται στο λιπίδιο, δεν έχει νόημα να αναφερθούμε σε θερμοκρασίες μετάπτωσης αν δεν μιλάμε για ένα σύστημα οργανωμένων λιπιδίων (μια μεμβράνη). Η θερμοκρασία μετάπτωσης των μεμβρανών εξαρτάται από το μήκος και τον κορεσμό της ανθρακικής αλυσίδας της ουράς και των ηλεκτροστατικών ιδιοτήτων της κεφαλής των λιπιδίων. Επίσης, έκθεση της μεμβράνης σε αυξημένες συγκεντρώσεις άλατος, μπορεί να επηρεάσει την θερμοκρασία μετάπτωσης. Σε θερμοκρασίες πάνω από την Tm η μεμβράνη αποδιατάσσεται από την οργανωμένη μορφή του πηκτώματος (gel) ή του στερεού (solid) και μεταβαίνει σε υγρή-κρυσταλλική δομή κατά την οποία οι βαθμοί ελευθερίας των μορίων είναι περισσότεροι. Τα λιπίδια μπορούν να προσροφηθούν ελευθέρα μέσα στην διπλοστιβάδα. Παρά το γεγονός πως τα λιπίδια είναι ευκίνητα σε αυτή τη φάση, εξακολουθούν να εξέρχονται από την επιφάνεια της μεμβράνης στο διάλυμα, λόγω της υδροφοβικότητας των μορίων της ουράς των λιπιδίων. Αυτό αποδεικνύεται με ανίχνευση μεμονωμένων λιπιδίων, με τη μέθοδο του φθορισμού. Σε θερμοκρασίες κάτω από την Tm η μεμβράνη περνάει σε φάση gel. Στη φάση αυτή τα λιπίδια πακετάρονται πιο δομημένα και παραμένουν σχετικά ακίνητα. Η πιο γνωστή μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας μετάπτωσης είναι η διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC) (Huang et al., 1999). Από την άλλη πλευρά με την μέθοδο της ατομικης μικροσκοπίας (AFM) μπορούμε να δούμε την φάση του gel, καθώς το πάχος της μεμβράνης αλλάζει μέχρι και 1 νανόμετρο (nm), λόγω της αύξησης του βαθμού οργάνωσης των λιπιδίων στην μεμβράνη. Κοντά στην θερμοκρασία μετάπτωσης οι δύο αυτές φάσεις συνυπάρχουν με αποτέλεσμα να προσδίνονται καινούργιες και ενδιαφέρουσες ιδιότητες στην μεμβράνη, όπως ασυνήθεις σχηματισμοί και διαφορετικά πορώδη, οι οποίες μπορούν να φανούν εξαιρετικά χρήσιμες σε εφαρμογές στοχευμένων συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων. Στην Εικόνα 1.7 φαίνεται η συμπεριφορά και η μορφολογία της μεμβράνης του λιπιδίου DMPC (1,2-διμυριστολd54-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη), το οποίο έχει κρίσιμη θερμοκρασία μετάπτωσης στους 23 0 C, όταν αυτό εκτεθεί σε θερμοκρασία δωματίου (25,5 0 C). Παρατηρούμε, στην κατανομή Gauss, δυο κορυφές, μία στα 3,4 nm και άλλη μία στα 4,3 nm, γεγονός που αποτελεί ένδειξη συνύπαρξης και των δύο κρυσταλλικών δομών. Σε μια τέτοια 19

20 ετερογένεια, το αποτέλεσμα είναι οι διασταυρώσεις-αλληλοεπικαλύψεις μεταξύ των πόρων της μεμβράνης, γεγονός που επιτρέπει στους διαλύτες πεπερασμένου μοριακού μεγέθους, να εξέρχονται ή να εισέρχονται διαμέσου της μεμβράνης. Αυτή η μοναδική ιδιότητα της μεμβράνης του DMPC να την διαπερνούν ιόντα και ATP χωρίς να χάνει τα μακρομόρια της (όπως πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα) της προσδίδει σαφές πλεονέκτημα για βιοχημικά πειράματα σε θερμοκρασίες δωματίου (Cisse I., 2006). Εικόνα 1.7: Κατανομή Gauss, που παρουσιάζει την επίδραση της θερμοκρασίας μετάπτωσης και τις αλλαγές στην μορφολογία της μεμβράνης του λιπιδίου DMPC, με τη μέθοδο AFM (Tokumasu et al. J. Electron Micr., 51,1,2002). 3 Η χοληστερόλη και ο ρόλος της Η χοληστερόλη αποτελεί βασικό συστατικό των βιολογικών μεμβρανών επιτελώντας σημαντικές λειτουργίες. Είναι ένα από τα πιο σημαντικά από τα φυσιολογικώς ενεργά στερεοειδή, που συντίθεται στο ήπαρ από αιθανικό οξύ, μέσω μεβαλονικού οξέος και σκουαλενίου. Βρίσκεται σε όλους τους ιστούς, ιδιαίτερα στον εγκέφαλο. Περιέχει τέσσερις συμπυκνωμένους δακτυλίους, τρεις εξαμελείς και έναν πενταμελή. Η υδρόφιλη περιοχή της χοληστερόλης είναι αρκετά μικρή, αποτελούμενη από μία ενιαία ομάδα αλκοόλης. Στο αντίθετο άκρο της δομής των δακτυλίων υπάρχει μια μικρής αλυσίδας ουρά. Η χοληστερόλη, δεν σχηματίζει από μόνη της διπλοστιβάδες, αλλά ενσωματώνεται σε φωσφολιπιδικές μεμβράνες επιφέροντας αλλαγές στις ιδιότητές τους 20

21 π.χ. στη ρευστότητα και διαπερατότητά τους. Αυτό οφείλεται στη μεταβολή της κάμψης της αλυσίδας του φωσφολιπιδίου με αποτέλεσμα να σχηματίζονται πιο συμπαγείς μεμβράνες. Συγκεκριμένα στα λιποσώματα, η χοληστερόλη οδηγεί σε σημαντική αύξηση (ή μείωση) της σειράς προσανατολισμού των υδρογονανθρακικών αλυσίδων πάνω (ή κάτω) από τη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης και μείωση της γωνίας κλίσης της φωσφολιπιδικής αλυσίδας στη ρευστή φάση. Όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερμοκρασίες υψηλότερες από την θερμοκρασία μετάβασης φάσης, η χοληστερόλη συμβάλλει στη μείωση της ελευθερίας των ανθρακικών αλυσίδων και τη συμπύκνωση τελικά της μεμβράνης και μείωση της ρευστότητάς της. Σε περιπτώσεις όμως όπου το λιπίδιο βρίσκεται σε θερμοκρασίες χαμηλότερες από την θερμοκρασία μετάπτωσης η απόσταση μεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της μεμβράνης αυξάνει. Ουσιαστικά λοιπόν η χοληστερόλη αναιρεί τις επιπτώσεις της θερμοκρασίας (μετάπτωση φάσης) στα χαρακτηριστικά της μεμβράνης. Απουσία χοληστερόλης τα λιποσώματα έχουν την τάση να αλληλεπιδρούν με πρωτεϊνες του αίματος όπως η αλβουμίνη, η m- τρανσφερίνη και η μακροσφαιρίνη. Οι πρωτεΐνες αυτές τείνουν να αποσταθεροποιούν τη μεμβράνη των λιποσωμάτων και μειώνουν τη χρησιμότητά τους ως μεταφορείς φαρμάκων. Η χοληστερόλη φαίνεται να μειώνει τέτοιου τύπου αλληλεπιδράσεις με την ενσωμάτωσή της στη διπλοστιβάδα. Α. Β. Εικόνα 1.8: Α. Θέση χοληστερόλης στη λιπιδική διπλοστιβάδα. Β. Θέση χοληστερόλης σε κατιονικό λιπόσωμα. 21

22 4 Λιποσώματα Τα λιποσώματα (Εικόνα 1.9) είναι εξαιρετικά εύχρηστες δομές και χρησιμοποιούνται επιτυχώς εδώ και χρόνια για ερευνητικούς, θεραπευτικούς και αναλυτικούς σκοπούς. Είναι κολλοειδή συστήματα σφαιρικού σχήματος, στα οποία απαντούν μια ή περισσότερες διπλοστιβάδες λιπιδίων που εναλλάσσονται με υδατικά τμήματα και τα οποία σχηματίζονται αυθόρμητα όταν τα λιπίδια διασπείρονται σε υδάτινο μέσο δημιουργώντας ένα πληθυσμό κυστιδίων, των οποίων το μέγεθος παρουσιάζει ομοιόμορφη κατανομή και κυμαίνεται από 20nm-10μm. Τα λιποσώματα έχουν την ικανότητα, λόγω της μορφής και διαφοροποίησής τους, να παγιδεύουν ποσότητες υλικών τόσο στο εσωτερικό υδατικό διαμέρισμα όσο και εντός της λιπιδικής διπλοστιβάδας. Δομικά μοιάζουν στην δομή των βιολογικών κυττάρων, και γι αυτό τον λόγο μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πολύ καλά χαρακτηρισμένα οχήματα, για την μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ λιπιδικών μεμβρανών και βιομορίων, όπως το DNA και οι πρωτεΐνες, διαπερατότητα ιόντων και φαρμάκων, αποσαφήνιση μηχανισμού δράσης των φυτοφαρμάκων καθώς και του μηχανισμού δράσης των αντιβιοτικών στην στόχευση φαρμάκων στον οργανισμό (Edwards et al., 2006). Εναλλακτικά τα λιποσώματα μπορεί να απαρτίζονται εξ ολοκλήρου από συνθετικά συστατικά, που επιλέγονται λόγω βελτιωμένων χημικών ιδιοτήτων. Επίσης, κατά τον σχηματισμό των λιποσωμάτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα αμφίφιλα μόρια, εκτός των φωσφολιπιδίων, όπως λιπαρά οξέα, δευτεροταγείς αμίνες διπλής αλυσίδας ή παράγωγα χοληστερόλης. 22

23 Εικόνα 1.9: Σφαιρική δομή λιποσώματος. 4.1 Σταθερότητα λιποσωμάτων Η σταθερότητα των λιποσωμάτων είναι ένα ιδιαίτερα σημαντικό χαρακτηριστικό τους. Διακρίνουμε τρείς κατηγορίες σταθερότητας: 1. Φυσική σταθερότητα 2. Χημική σταθερότητα 3. Βιολογική σταθερότητα Η φυσική σταθερότητα αναφέρεται στην σταθερότητα του μεγέθους και του λόγου του λιπιδίου προς την ενεργή ουσία ( φάρμακο, μόρια DNA κ.α.). Το μέγεθος των λιποσωμάτων αυξάνεται λόγω συσσωμάτωσης αυτών. Τα λεκιθινικά λιποσώματα έχει βρεθεί πως έχουν την τάση να συσσωματώνονται πιο εύκολα σε σύγκριση με αυτά που αποτελούνται από λεκιθίνη αυγού και όξινα φωσφολιπίδια. Ο Connor et al. παρατήρησε πως SUV (Small Unilamellar Vesicles) λιποσώματα που περιείχαν φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη και παλμιτουλομοκυστείνη συντήκονται εντόνως όταν γίνεται αλλαγή του ph του διαλύματος από 7 σε 5, απελευθερώνοντας ταυτόχρονα το μεγαλύτερο μέρος της καλσεΐνης, η οποία είχε εγκλωβιστεί επιτυχώς στα λιποσώματα. Αύξηση της φυσικής σταθερότητας των λιποσωμάτων επιτεύχθηκε από τους Frokjaer et al. (1982) με την αύξηση του φορτίου των λιποσωμάτων. Η παρουσία φορτισμένων λιπιδίων μεταβάλλει το ποσοστό εγκλωβισμού των βιοδραστικών μορίων στα λιποσώματα. Φορτισμένα λιπίδια παρουσιάζουν αυξημένα ποσοστά εγκλωβισμού λόγω 23

24 παραχώρησης μεγαλύτερων υδατικών τμημάτων μεταξύ των διπλοστιβάδων εξαιτίας της απώθησης ομώνυμα φορτισμένων ομάδων. Η χημική σταθερότητα αναφέρεται στην διαδικασία υδρόλυσης και οξείδωσης των λιπιδικών συστατικών του λιποσώματος. Η χοληστερόλη και τα φωσφολιπίδια τα οποία περιέχουν ακόρεστα λιπαρά οξέα υφίστανται οξειδώσεις για αυτό το λόγο προτιμάται η χρήση φωσφολιπιδίων τα οποία περιέχουν κορεσμένα λιπαρά οξέα. Η συνθετική λεκιθίνη η οποία είναι κορεσμένη αποτελεί μια καλή εναλλακτική της λεκιθίνης του αυγού και της σόγιας. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων μπορεί να ελαχιστοποιηθεί με τη χρήση αντιοξειδωτικών όπως η βιταμίνη Ε και το βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (BHT). Ο σχηματισμός παγοκρυστάλλων στα λιποσώματα (για παράδειγμα όταν τα λιποσώματα είναι εν μέρει παγωμένα και εν μέρει αποψυγμένα) και η ακόλουθη αστάθεια των διπλοσταβάδων οδηγεί στη διαρροή του εγκλωβισμένου υλικού. Όταν τα λιποσώματα υποβάλλονται σε έναν κύκλο ψύξης- απόψυξης και λυοφιλοποιούνται απουσία κρυοπραστατευτικού όπως η λακτόζη, χάνουν τα εγκλωβισμένα συστατικά κατά την ανασύσταση (Crommelin and Bommel, 1984). Σε μια άλλη μελέτη βρέθηκε ότι προσθήκη κρυοπροστατευτικού, όπως το 20 % διμεθυλοσουλφοξείδιο, στα παγωμένα λιποσώματα ίσως βοηθά τα λιποσώματα έναντι της διαρροής εγκλωβισμένων μορίων. Η λυοφιλοποίηση μπορεί σε κάποιες περιπτώσεις να φανεί χρήσιμη στη λύση του προβλήματος της σταθερότητας των λιποσωμάτων για μεγάλο διάστημα. Στην ανασύσταση (ενυδάτωση) τα περισσότερα φάρμακα παραμένουν μέσα στα λιποσώματα. Έχει αποδειχθεί ότι όταν τα λιποσώματα λυοφιλοποιούνται παρουσία τρεχαλόζης (σάκχαρο) διατηρούν το 100 % του περιεχομένου τους (Crowe et al., 1986, 1987, Madden et al., 1985). Ένας ακόμα τρόπος για να σταθεροποιηθούν τα λιποσώματα είναι η χρήση συνθετικών φωσφολιπιδίων τα οποία πολυμερίζονται όταν εκτεθούν σε UV ακτινοβολία. Η βιολογική σταθερότητα των λιποσωμάτων είναι περιορισμένη. Η σταθερότητα των λιποσωμάτων στην κυκλοφορία έχει μεγάλο ενδιαφέρον ιδίως όταν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν ως μεταφορείς φαρμάκων. Είναι αποδεδειγμένο ότι τα λιποσώματα είναι γενικά ανίκανα να διατηρήσουν τα εγκλωβισμένα συστατικά όταν έρχονται σε επαφή με το αίμα ή το πλάσμα. Γενικά, τα MLV είναι πιο σταθερά καθώς μόνο ένα τμήμα του φωσφολιπιδίου είναι εκτεθειμένο και τα SUV είναι τα λιγότερο σταθερά λόγω 24

25 της αυξημένης πίεσης που υφίστανται εξαιτίας της καμπυλότητάς τους. Τα κατιονικά λιποσώματα στο πλάσμα είναι επιρρεπή στο να δημιουργούν συσσωματώματα και να εμφανίζουν διαρροές. Οι υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDLs) είναι υπεύθυνες για την αστάθεια των λιποσωμάτων πριν από την αλληλεπίδραση των λιποσωμάτων με τα φαγοκύτταρα του αίματος όπως τα μονοκύτταρα. Η αστάθεια των λιποσωμάτων οφείλεται στην ανταλλαγή λιπιδίων μεταξύ λιποσωμάτων και υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL). Η ενσωμάτωση χοληστερόλης μερικές φορές αυξάνει την σταθερότητα των λιποσωμάτων παρουσία πλάσματος. Ο Gregoriadis (1982) μελέτησε τη σταθερότητα των SUV σε ορό ποντικού στους 37 o C. Λιποσώματα τα οποία είχαν συντεθεί χρησιμοποιώντας λεκιθίνη αυγού, διολεοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη ή σφιγγομυελίνη έγιναν γρήγορα διαπερατά στην εγκλωβισμένη καρβοξυφλουορεσκεΐνη (CF) αλλά η ενσωμάτωση χοληστερόλης στα λιποσώματα μείωσε τη διαρροή της CF. Η σταθερότητα των λιποσωμάτων στο γαστρεντερικό σωλήνα είναι πολύ σημαντική στην περίπτωση που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν ως μεταφορείς φαρμάκων μέσω της στοματικής οδού. Αρκετή έρευνα έχει γίνει ώστε να μελετηθεί η σταθερότητα των λιποσωμάτων, η ικανότητα τους να διατηρούν την ακεραιότητά τους έναντι των ενζύμων που βρίσκονται στο γαστρεντερικό σωλήνα, των χολικών αλάτων και της γαστρικής οξύτητας. Η παγκρεατική λιπάση ήταν ικανή να αποδομεί τα φυσιολογικά υπάρχοντα φωσφολιπίδια. Βρέθηκε ότι τα λιποσώματα τα οποία έχουν λιπαρά οξέα με μικρού μήκους αλειφατικές αλυσίδες ήταν πιο σταθερά έναντι της αποδόμησης από τη λιπάση (Dapergolas and Gregoriadis, 1977). 4.2 Τύποι λιποσωμάτων Η ταξινόμηση των λιποσωμάτων γίνεται με βάση το μέγεθος (Εικόνα 1.10), την σύσταση και την μέθοδο παρασκευής τους. Με βάση το μέγεθός τους διακρίνονται σε Μεγάλα μονοστιβαδιακά λιποσώματα (Large Unilamellar Vesicles, LUV) Πολυστιβαδιακά λιποσώματα (Multilamellar Vesicles, MLV) Μικρά μονοστιβαδιακά λιποσώματα (Small Unilamellar Vesicles, SUV) Ολιγοστιβαδιακά λιποσώματα (Oligovesicular Vesicles, OVV) 25

26 Γιγάντια λιποσώματα (Giant Unilamellar Vesicles, GUV) Τα LUV λιποσώματα έχουν διάμετρο της τάξης των 1000nm και είναι μονοστοιβαδιακά. Τα λιποσώματα αυτά θεωρούνται κατάλληλα για εγκλωβισμό υδατοδιαλυτών υλικών, αν και η παρουσία μιας μόνο λιπιδικής μεμβράνης έχει ως συνέπεια μικρότερη μηχανική σταθερότητα και συγκράτηση της ουσίας σε σχέση με τα MLVs (βλέπε παρακάτω). Τα MLV λιποσώματα αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό παράλληλων, ομόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωμάτων όσον αφορά την παρασκευή τους. Η κυριότερη μέθοδος παρασκευής MLV λιποσωμάτων είναι η μέθοδος του Bangham (solvent evaporation method) (Bangham A.D. et al., 1965). Η απόσταση μεταξύ των διαδοχικών διπλοστιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάμεων Van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων απωστικών δυνάμεων. Τα SUV λιποσώματα αποτελούνται μόνο από μια διπλοσιβάδα και έχουν διάμετρο nm. Διαθέτουν το μικρότερο δυνατό μέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο μπορεί να σχηματίσει λιποσωμική μορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύματος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των μεμβρανών. Πρόκειται για θερμοδυναμικά ασταθή λιποσώματα που είναι επιρρεπή σε συσσωμάτωση και σύντηξη, ιδίως κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης. Οι μέθοδοι παρασκευής SUV λιποσωμάτων είναι: (i) η κατεργασία με υπέρηχους, (ii) η μέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξης - απόψυξης (freeze - thaw), (iii) η μέθοδος της έγχυσης αιθανόλης (ethanol injection) και (iv) μέθοδος έγχυσης αιθέρα (ether injection). 26

27 Εικόνα 1.10: Ταξινόμηση λιποσωμάτων με βάση το μέγεθος και τον αριθμό των διπλοστιβάδων. Η μπάρα αντιπροσωπεύει 5μm (American Chemical Society, 2005). Με βάση τη σύσταση και την in vivo εφαρμογή τους διακρίνονται σε Συμβατικά λιποσώματα CL (Conventional liposomes) Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, sterically stabilized) Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes) Κατιονικά λιποσώματα (Cationic liposomes) Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic liposomes) Λιποσώματα ευαίσθητα στο ph ( ph sensitive liposomes) Τα συμβατικά λιποσώματα αποτελούνται από φωσφατιδυλοχολίνη και χοληστερόλη και σπανιότερα από ανιονικά φωσφολιπίδια. Διαφέρουν ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, όπως το μέγεθος, τη λιπιδική σύσταση, το επιφανειακό φορτίο, τον αριθμό και ρευστότητα των λιπιδικών διπλοστιβάδων. Το βασικό χαρακτηριστικό τους είναι η μικρής διάρκειας κυκλοφορία τους στο αίμα. Ο χρόνος αυτός χαρακτηρίζεται ως ημιπερίοδος ζωής και μπορεί να κυμαίνεται από λίγα λεπτά έως λίγες ώρες. Όταν χορηγούνται in vivo (συχνά ενδοφλέβια) έχουν την τάση να συσσωρεύονται γρήγορα στα φαγοκύτταρα του μονοπυρηνικού συστήματος φαγοκυττάρων, γνωστό επίσης και ως 27

28 δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (RES). Tα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήνα. Τα μακράς διαρκείας ή στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα (Stealth, Long Circulating, Sterically stabilized liposomes) χρησιμοποιούνται επί πολλά χρόνια ως οι κύριοι φορείς φαρμάκων και στόχευσης ιστών. Έχουν την ικανότητα να βγαίνουν εκτός κυκλοφορίας σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος είναι αυξημένη, λόγω του ότι οι περιοχές αυξημένης τριχοειδικής διαπερατότητας περιλαμβάνουν παθολογικές περιοχές, όπως στέρεους όγκους και περιοχές μολύνσεως και φλεγμονής. Ο πιο δημοφιλής τρόπος παραγωγής τέτοιων λιποσωμάτων είναι η ομοιοπολική σύνδεση του πολυμερούς πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) στην εξωτερική επιφάνεια (Εικόνα 1.11). Εικόνα 1.11: Σχηματική απεικόνιση ενός στερεοχημικά σταθεροποιημένου λιποσώματος, με lipid-peg (DSPE-PEG). Η παρατεταμένη κυκλοφορία των PEG-λιποσωμάτων στον οργανισμό οφείλεται στα παρακάτω: Το επιφανειακό φορτίο των PEG-λιποσωμάτων Την υδροφιλικότητα των PEG-λιποσωμάτων Τις απωστικές δυνάμεις που επικρατούν ανάμεσα στα PEG-λιποσωμάτα και τα άλλα σωματίδια Στην μείωση στον ρυθμό προσρόφησης των πρωτεϊνών του πλάσματος στην επιφάνεια των PEG-λιποσωμάτων. Ένα παράγωγο PEG με ενεργό άκρο μπορεί να συζευχθεί με ορισμένες ενεργές ομάδες στη λιποσωμική επιφάνεια όμως η ομάδα μαλεϊμιδίου. Αυτή η τεχνική συνήθως ονομάζεται post coating PEGylation τεχνική και είναι κατάλληλη για την προσκόλληση 28

29 PEG στη επιφάνεια προπαρασκευασμένων λιποσωμάτων. Σ αυτή την περίπτωση οι αλυσίδες του πολυμερούς βρίσκονται μόνο στην εξωτερική πλευρά των λιποσωμάτων. Ανάλογα με τη συγκέντρωση επικάλυψης και το μοριακό βάρος του PEG, τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα μπορούν να έχουν διαφορετικές διαμορφώσεις. Καθοριστικός παράγοντας για τη διαμόρφωσή τους είναι η απόσταση ανάμεσα στις αλυσίδες του πολυμερούς επάνω στη λιποσωμική διπλοστιβάδα. Έχει αποδειχθεί βιβλιογραφικά πως σε μεγαλύτερα ποσοστά Lipid-PEG, το PEG στην επιφάνεια των λιποσωμάτων φέρει τη μορφή «βούρτσας» (brush διαμόρφωση), ενώ σε μικρότερα ποσοστά Lipid-PEG φέρει τη μορφή «μανιταριού» (mushroom διαμόρφωση) (Εικόνα 1.12). Η διαφορά τους έγκειται στο γεγονός πως στην brush στερεοχημική διαμόρφωση, και καθώς έχουμε διπλάσιο αριθμό μορίων lipid-peg, το καθένα από αυτά τα μόρια καταλαμβάνει περισσότερες θέσεις, μεγαλύτερη επιφάνεια στο λιπόσωμα, αναγκάζεται να «τεντωθεί» και επομένως προστατεύει καλύτερα το λιπόσωμα από τις πρωτεΐνες του αίματος. Στην Εικόνα 1.13 απεικονίζεται η διαφορά στην στερεοχημική διαμόρφωση του lipid-peg με mushroom και brush μορφή σε λιποσώματα. 4% lipid-peg 8% lipid-peg Εικόνα 1.12: Στερεοχημική διαμόρφωση lipid-peg σε ποσοστό 4% (mushroom διαμόρφωση) και ποσοστό 8% (brush διαμόρφωση). 29

30 Εικόνα 1.13: (α) Λιπόσωμα με mushroom διαμόρφωση των αλυσίδων PEG και (β) 8% brush διαμόρφωση τους. Τα ανοσολιποσώματα διαθέτουν ειδικά αντισώματα ή κλάσματα αντισωμάτων (Fab ή αντισώματα μονής αλυσίδας) στην επιφάνειά τους προκειμένου να ενισχύσουν τη στοχευμένη εντόπιση. Όπως και άλλα σωματίδια στην κυκλοφορία του αίματος, είναι δύσκολο στα ανοσολιποσώματα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία σε άλλα διαμερίσματα πλην του ήπατος και του σπλήνα. Γι αυτό, προκειμένου να εξασφαλιστεί προσιτότητα των υποδοχέων, επιχειρείται τοπική χορήγηση των λιποσωμάτων στις σωματικές κοιλότητες. Τα κατιονικά λιποσώματα (Εικόνα 1.14) αποτελούνται από κατιονικά λιπίδια όπως η διολευλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (DOPE). Τα συστατικά των λιποσωμάτων αυτών αντιδρούν με το DNA, παρουσιάζουν μεγάλη συγγένεια σύνδεσης με τις κυτταρικές μεμβράνες και χρησιμοποιούνται ως συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού στον πυρήνα. 30

31 Εικόνα 1.14: Κατιονικά λιποσώματα. Τα ευαίσθητα στο ph λιποσώματα αποτελούνται από φωσφολιπίδια όπως φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (PE), διολευλοφωσφατιδυλοαιθανολαμινη (DOPE). Σε χαμηλό ph συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη του ενδοσώματος και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 1.15). Είναι κατάλληλα για ενδοκυτταρική μεταφορά ασθενών βάσεων και μακρομορίων. Η βιοκατανομή και η φαρμακοκινητική τους είναι ανάλογη με αυτή των συμβατικών λιποσωμάτων. Εικόνα 1.15: Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph. 31

32 Τα λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη διευκολύνουν την ενδοκυτταρική μεταφορά εγκλωβισμένων βιοδραστικών ενώσεων μέσω σύντηξης με την μεμβράνη των κυττάρων/στόχων. Ανάμεσα στους τρόπους παρασκευής τους είναι η χρήση λιπιδίων που είναι ικανά να αποσταθεροποιήσουν την διπλοστιβάδα και να προκαλέσουν φαινόμενα σύντηξης καθώς και κάποιες πρωτεΐνες με δυνατότητα ενσωμάτωσης στα λιποσώματα που επάγουν την σύντηξη. 4.3 Μέθοδοι παρασκευής και χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Για την παρασκευή σταθερών λιπιδικών διπλοστιβάδων έχουν προταθεί πολλές τεχνικές σε εργαστηριακή αλλά και σε βιομηχανική κλίμακα. Στο Εικόνα 1.16 απεικονίζονται διάφορες τεχνικές παρασκευής λιποσωμάτων σε μικρή κλίμακα, όπου χρησιμοποιούνται οργανικοί διαλύτες, κυρίως αλκοόλες. Ανάλογα με την επιλογή της τεχνικής δημιουργούνται πολυστιβαδιακά, μονοστιβαδιακά ή ολιγοστιβαδιακά λιποσώματα. Για να υπάρξει ομοιογένεια ανάμεσα στα λιποσώματα που παρασκευάζονται, αυτά υπόκεινται σε διαδικασίες ρύθμισης του μεγέθους τους. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται τεχνικές όπως εξώθηση λιποσωμάτων μέσω φίλτρων, που φέρουν πόρους συγκεκριμένης διαμέτρου. Ο διαχωρισμός επίσης των μορίων που δεν έχουν εγκλωβιστεί στα λιποσώματα είναι σημαντικός και γίνεται με την χρήση φυγοκέντρου ή υπερ-διηθητικών συσκευών. Μια πιο εκτενής αναφορά σε κάποιες από αυτές τις τεχνικές γίνεται στη συνέχεια. 32

33 Εικόνα 1.16: Παρασκευή λιποσωμάτων μικρής κλίμακας (Torchilin V.P. Weissig V.) Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηματισμό λεπτού λιπιδικού υμενίου (film) κατά την εξάτμιση οργανικού ή οργανικών διαλυτών, στους οποίους έχει προηγουμένως διαλυθεί το λιπίδιο. Για να απομακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χημική αποικοδόμηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηματίζεται το λεπτό υμένιο, εκτίθεται σε ρεύμα αζώτου για πέντε λεπτά. Η ενυδάτωση (hydration) του υμενίου που ακολουθεί πραγματοποιείται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα ή με διάλυμα της προς εγκλωβισμό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτμισης των διαλυτών, πραγματοποιούνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες της θερμοκρασίας μετάβασης φάσης του χρησιμοποιούμενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυμα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερμανθεί σε αυτή τη θερμοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με μηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υμένιο αποκολλάται από τα τοιχώματά της, οπότε λαμβάνεται μία θολερή διασπορά με πολυστιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους MLV. Η μείωση του μεγέθους των MLV λιποσωμάτων και η 33

34 δημιουργία ομογενούς σε αναφορά με το μέγεθος πληθυσμού, υλοποιείται με τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση μέσω φίλτρων ή μεμβρανών (extrusion), μικρoγαλακτωματοποίηση (microemulcification) Στο τελευταίο στάδιο πραγματοποιείται η διαδικασία της ομαλοποίησης (annealing), κατά την οποία τα λιποσώματα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερμοκρασία υψηλότερη αυτής της μετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραμένουν για μία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να ομαλοποιηθεί η μορφοποίηση της δομής τους. Η διάμετρος των λιποσωμάτων που λαμβάνονται με τη μέθοδο αυτή κυμαίνεται από 5 έως 6 μm. MLVs με υψηλή αποδοτικότητα εγκλωβισμού μπορεί να προετοιμαστούν με την ενυδάτωση του λιπιδίου παρουσία ενός μη αναμίξιμου οργανικού διαλύτη (πετρελαϊκός αιθέρας, διαιθυλικός αιθέρας). Το περιεχόμενο γαλακτωματοποιείται με υπέρηχους. Ο οργανικός διαλύτης αφαιρείται με τη διαβίβαση ενός ρεύματος αερίου αζώτου πάνω από το μίγμα. Τα MLVs διαμορφώνονται αμέσως στην υδάτινη φάση μετά από την αφαίρεση του οργανικού διαλύτη. Το κύριο μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι έκθεση των υλικών που τοποθετούνται σε κάψα στον οργανικό διαλύτη και υπέρηχους Εξώθηση μέσω φίλτρων Στα λιποσώματα αυτού του τύπου η μείωση μεγέθους επιτυγχάνεται με τη χρήση φίλτρων των οποίων οι πόροι έχουν συγκεκριμένη διάμετρο. Η μέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι παρέχει επαναλήψιμα αποτελέσματα, ενώ το λιπίδιο δεν υφίσταται κάποια σημαντική μεταβολή. Επιπλέον μπορεί να διπλασιαστεί το ποσοστό εγκλωβισμού διαφόρων ουσιών. Η εξώθηση μέσω φίλτρων διαμέτρου 0.2 μm οδηγεί σε εξαιρετικά ομοιογενείς πληθυσμούς λιποσωμάτων διαμέτρου 270 nm (Olson F.et al., 1979) Χρήση Μικρογαλακτωματοποιητή Για την παρασκευή λιποσωμάτων μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν γαλακτωματοποιητές (Mayhew E. et al., 1984). Οι μικρογαλακτωματοποιητές είναι συσκευές που αντλούν το ρευστό, στην προκειμένη περίπτωση τα λιποσώματα, με πολύ υψηλές πιέσεις μέχρι και (10000 p.s.i., bar) μέσα από φίλτρα διαμέτρου 5μm. Στη συνέχεια διαπερνούν το μίγμα χωρισμένο σε δύο τμήματα με πολύ μεγάλη ταχύτητα, 34

35 από μικρά κανάλια που αναμιγνύουν τα δύο ρεύματα υπό ορθή γωνία παρέχοντας με τον τρόπο αυτό πολύ μεγάλη ενέργεια. Τα λιπίδια εισάγονται στο μικρογαλακτωματοποιητή με τη μορφή εναιωρήματος μεγάλων λιποσωμάτων MLV ή με τη μορφή μη ενυδατωμένου λιπιδίου εντός υδατικού μέσου. Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται μικρά MLV λιποσώματα με καλή κατανομή μεγέθους nm (micro emulsification liposomes, MEL). Οι γαλακτωματοποιητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στη βιομηχανική παραγωγή για την παρασκευή μεγάλων ποσοτήτων λιποσωμάτων (Vemuri S. et al., 1989) Ένεση λιπιδίων Περιλαμβάνει μεθόδους κατάλληλες για την παρασκευή SUV και LUV λιποσωμάτων. Διάλυμα λιπιδίου σε οργανικό διαλύτη ενίεται ταχέως σε περίσσεια υδατικού μέσου που περιέχει την ουσία που πρόκειται να εγκλωβισθεί στα λιποσώματα. Στη διεπιφάνεια μεταξύ νερού και οργανικού διαλύτη, τα φωσφολιπίδια αυτοδιατάσσονται σε λιποσώματα μικρής διαμέτρου. Τα μεγάλα συγκριτικά πλεονεκτήματα των μεθόδων είναι η εύκολη εφαρμογή της και ο περιορισμένος κίνδυνος αποικοδόμησης των λιπιδίων. Μειονέκτημα των μεθόδων είναι το χαμηλό ποσοστό εγκλωβισμού για υδατοδιαλυτές ουσίες. Οι πιο συχνά εφαρμοζόμενες μεθοδολογίες παρασκευής τέτοιων λιποσωμικών διασπορών περιγράφονται παρακάτω και αφορούν σε περιπτώσεις κατά τις οποίες: I. ο οργανικός διαλύτης είναι αναμίξιμος με την υδατική φάση, II. ο οργανικός διαλύτης είναι μη αναμίξιμος με την υδατική φάση, III. ο οργανικός διαλύτης είναι σε περίσσεια και μη αναμίξιμος με την υδατική φάση Έγχυση Αιθανόλης Κατά την τεχνική αυτή το ή τα λιπίδια διαλύονται σε αιθανόλη και στη συνέχεια τοποθετούνται σε περίσσεια υδατικού μέσου ή κάποιου άλατος με χρήση σύριγγας. Τα μόρια του λιπιδίου έρχονται σε επαφή με τα μόρια του νερού και με τον τρόπο αυτό σχηματίζονται αστραπιαία λιποσώματα μικρής διαμέτρου (25 nm). Το ποσοστό εγκλωβισμού που επιτυγχάνεται με τη μέθοδο αυτή είναι εξαιρετικά χαμηλό εάν οι προς 35

36 εγκλωβισμό ενώσεις είναι διαλυτές στην υδατική φάση. Επιπλέον η περιορισμένη διαλυτότητα λιπιδίων στην αιθανόλη (40 mm για PC), ο μικρός όγκος λιπιδίων (διαλυμένων σε αιθανόλη) που μπορεί να εισαχθεί στο υδατικό διάλυμα καθώς και η δυσκολία απομάκρυνσης της αιθανόλης από τις λιποσωμικές μεμβράνες κυρίως με διαπίδυση (dialysis), συμπεριλαμβάνονται στα μειονεκτήματα της μεθόδου. (Batzri et al., 1973). Λιποσώματα με αυτή τη μέθοδο παρασκευάσθηκαν για πρώτη φορά από τους Szoka και Papahadjopoulos το Τα λιποσώματα αυτά ονομάζονται αντίστροφης φάσης εξατμιζόμενα σωματίδια (reverse phase evaporation vesicles, REV). Κατά τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιείται γαλάκτωμα νερού σε έλαιο (αναστροφή του τυπικού "έλαιο σε νερό" γαλακτώματος) και η απομάκρυνση του διαλύτη από το γαλάκτωμα γίνεται με εξάτμιση Έγχυση Αιθέρα Η τεχνική αυτή παρουσιάζει αρκετές διαφορές συγκριτικά με την ένεση αιθανόλης (Deamer D.W. et al., 1976). Περιλαμβάνει την ένεση μη αναμίξιμου με το νερό οργανικού διαλύματος με αργούς ρυθμούς εντός υδατικής φάσης με χρήση βελόνας μικρής εσωτερικής διαμέτρου. Η θερμοκρασία έγχυσης πρέπει να είναι τέτοια ώστε να επιτρέπει την εξάτμιση του οργανικού διαλύτη κατά τη διαδικασία προσθήκης του. Λόγω άμεσης εξάτμισης του διαλύτη αυξάνει η βαθμίδωση του λόγου νερού / αιθέρα στη διεπιφάνεια της λιπιδικής μονοστιβάδας και των δύο μέσων. Η αναδίπλωση της σχηματιζόμενης διπλοστιβάδας οδηγεί στο σχηματισμό μεγάλων λιποσωμάτων (LUV). Η μέθοδος χρησιμοποιείται αποτελεσματικά στην περίπτωση ευπαθών λιπιδίων, καθώς μειώνει σημαντικά την πιθανότητα οξείδωσής τους, με την προϋπόθεση ότι ο αιθέρας έχει επαναποσταχθεί προσεκτικά για την απομάκρυνση τυχόν υπεροξειδίων που προκύπτουν από την αυθόρμητη οξείδωσή του. Επιπλέον ο ρυθμός απομάκρυνσης του διαλύτη είναι ίσος με το ρυθμό εισαγωγής, οπότε δεν υπάρχει περιορισμός στην τελική συγκέντρωση λιποσωμάτων και η όλη διαδικασία μπορεί να διαρκεί για μεγάλο χρονικό διάστημα καταλήγοντας σε λιποσώματα με υψηλό ποσοστό ενκαψυλίωσης. 36

37 Νερό σε οργανική φάση Περιλαμβάνει το σχηματισμό λιποσωμάτων σε δύο φάσεις. Πρώτα παρασκευάζεται η εσωτερική μονοστιβάδα και έπειτα η δεύτερη εξωτερική. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της τεχνικής, κατά βάση όμως παράγεται ένα γαλάκτωμα νερού σε έλαιο με την εισαγωγή μικρής ποσότητας υδατικού μέσου (που περιέχει την προς εγκλωβισμό ουσία) σε μεγάλο όγκο μη αναμίξιμου διαλύματος λιπιδίων, συνοδευόμενη από μηχανική ανάδευση ώστε η υδατική φάση να διασπαστεί σε μικροσκοπικά σταγονίδια ύδατος. Τα σταγονίδια αυτά σταθεροποιούνται από την παρουσία της λιπιδικής διπλοστιβάδας στη διεπιφάνεια των δύο φάσεων. Το μέγεθος των σταγονιδίων εξαρτάται από την ένταση της μηχανικής ενέργειας κατά την παρασκευή του γαλακτώματος και από το ποσό του λιπιδίου σχετικά με τον όγκο της υδατικής φάσης αφού κάθε σταγονίδιο απαιτεί μια ολοκληρωμένη μονοστιβάδα φωσφολιπιδίου που να καλύπτει πλήρως την επιφάνειά της ώστε να παρεμποδισθεί η συσσωμάτωση με άλλες σταγόνες. Το υδατικό τμήμα που περιβάλλεται από αυτή τη διπλοστιβάδα θα αποτελέσει τον τελικό πυρήνα του τελικού λιποσώματος. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι προετοιμασίας των σταγονιδίων νερού σε έλαιο πριν την προσθήκη της εξωτερικής κάλυψης, οι οποίοι υπό κατάλληλες συνθήκες παράγουν διαφορετικά μεγέθη σταγονιδίων. Με την επίδραση ακίδας υπερήχων λαμβάνονται σταγονίδια διαμέτρου 100 nm Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Σωματίδια (DRV) Η μέθοδος αυτή έχει αναπτυχθεί από τους C. Kirby and G.Gregoriadis, το Κατά την τεχνική αυτή, πραγματοποιείται λυοφιλοποίηση (freeze drying) διασποράς άδειων SUV λιποσωμάτων παρουσία διαλύματος της προς εγκλωβισμό ένωσης. Εδώ, σε αντίθεση με την κλασική παρασκευή μέσω εξάτμισης του διαλύτη όπου τα μόρια του λιπιδίου είναι σε τυχαία κατανομή, το λιπίδιο το οποίο βρίσκεται στα κενά SUV είναι πολύ καλά οργανωμένο στη δομή της μεμβράνης. Έτσι, κατά την προσθήκη του υδατικού μέσου σχηματίζονται λιποσώματα με υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού και διάμετρο από 400 nm μέχρι μερικά μm. Μερικά από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι: η απλότητα στη χρήση, οι ήπιες συνθήκες που χρησιμοποιούνται (σημαντικές για ευαίσθητα μόρια), και η υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού για μεγάλη ποικιλία ουσιών. Η 37

38 απλότητα της μεθόδου καθιστά ιδιαίτερα δυνατή την διαδικασία scale-up προκειμένου για εφαρμογή στη φαρμακευτική βιομηχανία. Η πιθανότητα διακοπής της διαδικασίας μετά το στάδιο της αφυδάτωσης και η αποθήκευση κάτω από ειδικές συνθήκες αποτελεί ένα επιπλέον πλεονέκτημα. Σε αντίθεση με τη διασπορά ενός στεγνού λιπιδικού υμενίου, η ανασύσταση του λυοφιλοποιημένου προϊόντος είναι εξαιρετικά ταχεία. Η DRV μέθοδος διαφέρει από τις περισσότερες άλλες μεθόδους υψηλής ικανότητας εγκλωβισμού στο ότι παράγεται μεγάλη αναλογία ολιγο και πολυστιβαδιακών λιποσωμάτων. Η ύπαρξη λιποσωμάτων με πολλές στοιβάδες έχει το πλεονέκτημα ότι μειώνει το ρυθμό απώλειας της εγκλωβισμένης ουσίας παρουσία του πλάσματος. Ο κύριος περιορισμός της μεθόδου, ο οποίος είναι κοινός και σε άλλες μεθόδους που παράγουν μεγάλα λιποσώματα είναι το γεγονός ότι τα DRV λιποσώματα τείνουν να παρουσιάζουν ετερογένεια όσον αφορά το μέγεθος. Η ομοιογένεια στο μέγεθος μπορεί να μη θεωρείται απαραίτητη για φαρμακευτικούς σκοπούς, αλλά είναι σημαντική για την επαναληψιμότητα πειραμάτων. Tα DRV μπορούν να μετατραπούν σε πιο ομοιογενείς παρασκευές αν χρειαστεί, χρησιμοποιώντας συνδυασμό φίλτρων και διαπίδυσης Μέθοδος FreezeThaw Η προηγούμενη DRV μέθοδος είναι παραλλαγή μίας άλλης παρόμοιας που αναπτύχθηκε νωρίτερα από τους Pick, Kasahara and Hinckle, 1981, κατά την οποία το προς εγκλωβισμό υλικό εισάγεται στα λιποσώματα επίσης μετά το σχηματισμό τους. Σε αυτή την περίπτωση ακολουθείται μία πορεία επαναλαμβανόμενης ψύξης απόψυξης για τη διάρρηξη των SUV λιποσωμάτων, κατά τη διάρκεια της οποίας η διαλυμένη ουσία εξισορροπείται μεταξύ εσωτερικού και εσωτερικού, ενώ τα λιποσώματα συντήκονται και αυξάνουν αξιοσημείωτα σε μέγεθος. Έτσι επιτυγχάνονται ποσοστά εγκλωβισμού μέχρι και 30%. Τα λιποσώματα που παράγονται με τη μέθοδο αυτή παρουσιάζουν σημαντικά μειονεκτήματα σε σύγκριση με τα DRV λιποσώματα. Το κυριότερο είναι ότι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ουδέτερα λιπίδια και ειδικά το PC, γιατί πιθανώς η παρουσία φορτίου απαιτείται για το σχηματισμό των κρυστάλλων κατά τη διαδικασία της ψύξης, που βοηθούν στη συνέχεια την πορεία θραύση / σύντηξη. Για παρόμοιους λόγους η σακχαρόζη, δισθενή μεταλλικά ιόντα (που μπορούν να εξουδετερώνουν το 38

39 επιφανειακό φορτίο) και υψηλής ιονικής ισχύος διαλύματα αλάτων δεν μπορούν να εγκλωβιστούν αποτελεσματικά. Ωστόσο, η μέθοδος είναι πολύ απλή, ταχεία, ήπια και καταλήγει σε μεγάλα μονοστιβαδιακά σωματίδια, χρήσιμα για τη μελέτη φαινομένων μεταφοράς μέσω μεμβρανών. 4.4 Χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Ο χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων είναι απαραίτητος προκειμένου να εξασφαλιστεί ο έλεγχος της ποιότητας του προϊόντος. Στον Πίνακα 1.1 φαίνονται αναλυτικά τα φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά των λιποσωμάτων καθώς και οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται συνήθως για τον προσδιορισμό τους. Ορισμένες από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τον σκοπό αυτό είναι οι ακόλουθες (Edwards et al., 2005): 1. Δυναμικό επιφανείας λιποσωμάτων (ζ-δυναμικό) 2. Μέτρηση μεγέθους (μέση διάμετρος) και τιμής πολυδιασποράς λιποσωμάτων 3. Κατανομή προς εγκλωβισμό ουσίας στο λιπόσωμα (encapsulation efficiency) 4. Λόγος συγκέντρωησης λιπιδιού προς τη συγκέντρωση της προς εγκλωβισμού ουσίας (lipid/encapsulant concentration) 5. Αριθμός διπλοστιβάδων που απαρτίζουν το λιπόσωμα Δυναμικό επιφάνειας λιποσωμάτων (ζ-δυναμικό) Οι ηλεκτρικές ιδιότητες της επιφάνειας των λιποσωμάτων μπορούν να μελετηθούν με ηλεκτροφόρηση κατά την οποία προκαλείται κίνηση των λιποσωμάτων μέσα σε στάσιμο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρμοζόμενης διαφοράς δυναμικού. Η κίνηση αυτή μετριέται με Φασματοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) και βασίζεται στη μετατόπιση Doppler που προκαλείται από την πρόσπτωση μονοχρωματικής ακτινοβολίας (laser He Ne, 5 mw, 633 nm) στα κινούμενα σωματίδια. Γενικά δύο παράμετροι που χαρακτηρίζουν την επιφάνεια των λιποσωμάτων μπορούν να υπολογισθούν από τις μετρούμενες κινητικότητες το δυναμικό επιφάνειας, ζ δυναμικό (ζ potential) και η πυκνότητα επιφανειακού φορτίου σ (surface charge density). Η εξίσωση Helmholtz Smoluchowski (Jones M.N., 1995) που ακολουθεί δίνει την τιμή αμικού, 39

40 ζ=ε εnu Εξίσωση Helmholtz - Smoluchowski όπου u (cm/sec) η ταχύτητα μετακίνησης του λιποσώματος στο σωλήνα του κελιού ηλεκτροφόρησης, n (dyne sec/cm 2) το ιξώδες του μέσου, ε η διηλεκτρική σταθερά του μέσου και Ε (V/cm) η ένταση του εφαρμοζόμενου δυναμικού. Το ζ δυναμικό σχετίζεται με το δυναμικό επιφάνειας των σωματιδίων και επηρεάζει μεγάλο φάσμα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστημάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους με ηλεκτρολύτες και φάρμακα καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρημάτων. Η τιμή του ζ δυναμικού αποτελεί ένδειξη για την καλή εκτίμηση σταθερότητας των κολλοειδών διασπορών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι λιποσωμικές διασπορές με μεγάλο θετικό ή αρνητικό ζ δυναμικό εμφανίζουν απωστικές δυνάμεις που εμποδίζουν τη συσσώρευση, πήξη, συσσωμάτωση και κατακρήμνιση των σωματιδίων τους. Η φύση και η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου είναι επίσης πολύ σημαντικοί παράμετροι που επηρεάζουν τη συμπεριφορά των λιποσωμάτων. Και οι δύο παράμετροι μπορούν να μεταβληθούν με την αλλαγή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων. Η έλλειψη φορτίου επιφάνειας μπορεί να μειώσει τη φυσική σταθερότητα των SUV, αυξάνοντας τη συσσωμάτωσή τους. Επιπλέον τα ουδέτερα λιποσώματα δεν αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα, ενώ μεγάλο επιφανειακό φορτίο προάγει σημαντικά αλληλεπιδράσεις τέτοιου είδους Κατανομή μεγέθους Συνήθως είναι δύσκολο να εκτιμάται επειδή συχνά καμία τεχνική δεν μπορεί να καταγράψει όλα τα μεγέθη που είναι παρόντα. Αυτό ισχύει ειδικά για τα πολυστιβαδιακά λιποσώματα τα οποία συνήθως παρουσιάζουν μια ευρεία κατανομή μεγέθους. Πιο στενές κατανομές μεγέθους MLV μπορεί να επιτευχθούν με εξώθηση των διασπορών μέσω φίλτρων με σχετικά μεγάλου μεγέθους πόρους (π.χ.1μm). Πολλές διαφορετικές τεχνικές χρησιμοποιούνται για συστήματα MLV και LUV με μέσους διαμέτρους μικρότερες του 1μm, περιλαμβάνοντας την ηλεκτρονική μικροσκοπία (electron microscopy) και διαδικασίες σκέδασης φωτός (light scattering procedures). Άλλες τεχνικές είναι η dynamic light scattering (DLS), gel permeation, High-performance gel exclusion 40

41 chromatography (HPGEC), Sendimentation field flow fractionation και η Coulter counter (Μετρητής Coulter). Πίνακας 1.1: Διαφορετικές παράμετροι για το χαρακτηρισμό των λιποσωμάτων και οργανολογία (Lasic D. D., Papahadjopoulos D., 1998). Χαρακτηριστικοί παράμετροι Φυσικά Χαρακτηριστικά Αναλυτική μέθοδος/όργανα 1 Σχήμα μορίου μεταφοράς και μορφολογία επιφάνειας Ηλεκτρονική μικροσκοπία, Κρυοσκοπικές μέθοδοι με ηλεκτρονική μικροσκοπία 2 Μέσο μέγεθος μορίου μεταφοράς και μέγεθος διανομής (υπομικρομετρική και μικρομετρική κλίμακα) Δυναμική σκέδαση φωτός, ζ-δυναμικού, Φασματομετρία αυτοσυσχέτησης φωτονίων, σκέδαση φωτός λέιζερ,gel διαπερατότητας και gel αποκλεισμού 3 Φορτίο επιφάνειας Ηλεκτροφόρηση ελεύθερης ροής 4. Ηλεκτρικό δυναμικό επιφάνειας και ph επιφάνειας Μετρήσεις ζ-δυναμικού & ανιχνευτές ευαίσθητοι στο ph 5 Αριθμός διπλοστιβάδων Small angle X-ray scattering, 31 P-NMR, Κρυοσκοπικές μέθοδοι με ηλεκτρονική μικροσκοπία 6 Συμπεριφορά φάσης Κρυοσκοπικές μέθοδοι με ηλεκτρονική μικροσκοπία, Διαφορικής σάρωσης χρωματόμετρο 7 Ποσοστό ελεύθερου φαρμάκου % Φυγόκεντρο με στήλη διαχωρισμού, χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων, ραδιοσήμανση 8 Απελευθέρωση φαρμάκου Διάχυση των κυττάρων/ διαπίδυση Χημικά Χαρακτηριστικά 1 Συγκέντρωση φωσφολιπιδίου Μέθοδος Barlett, Μέθοδος stewart, HPLC 2 Συγκέντρωση χοληστερόλης Μέθοδος με οξειδάση της χοληστερόλης και HPLC 3 Υπεροξείδωση των φωσφολιπιδίων Απορρόφηση UV, Ιωδομετρική και GLC 4 Υδρόλυση φωσφολιπιδίων, Αυτοοξείδωση χοληστερόλης HPLC και TLC 5 Ωσμωτικότητα Οσμόμετρο Βιολογικά Χαρακτηριστικά 1 Στειρότητα Αερόβιες ή Αναέροβιες καλλιέργειες 2 Πυρετογένεση Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test 3 Τοξικότητα στα ζώα Παρακολούθηση ποσοστών επιβίωσης, ιστολογίας και παθολογίας 41

42 4.5 Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Συνήθως είναι απαραίτητος ο διαχωρισμός της ελεύθερης ένωσης από αυτήν που έχει εγκλωβιστεί στα λιποσώματα. Ο διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται με την χρήση μεθόδων που περιγράφονται παρακάτω Διαπίδυση (dialysis) Κατά τη διαδικασία της διαπίδυσης η λιποσωμική διασπορά τοποθετείται σε ένα δοχείο και ο πυθμένας ή τα τοιχώματα του δοχείου αποτελούνται από μεμβράνες διαπίδυσης. Το δοχείο τοποθετείται με τη σειρά του σε ένα μεγαλύτερο δοχείο που περιέχει καθαρό διαλύτη. Κατά τη διαπίδυση, τα ιόντα του ηλεκτρολύτη και άλλες διαλυτές ουσίες μικρού μοριακού βάρους εξέρχονται από τους πόρους της μεμβράνης, ενώ τα λιποσώματα λόγω μεγέθους, δεν μπορούν να εξέλθουν Φυγοκέντρηση (centrifugation) Η πυκνότητα των διπλοστιβάδων από φωσφατιδυλοχολίνη έχει αναφερθεί ότι είναι ίση με 1,0135 g*ml 1 (Johnson et al., 1973). Η τιμή αυτή αυξάνει ελαφρά (1,0142 g*ml 1 ) με την προσθήκη χοληστερόλης σε ποσοστό 50 % και αναμένεται μεγαλύτερη για κορεσμένα λιπίδια, κυρίως κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης. Επίσης η παρουσία πρωτεϊνών στις μεμβράνες οδηγεί σε αισθητή αύξηση της πυκνότητας. Έτσι λιποσωμικές μεμβράνες διεσπαρμένες σε νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα καθιζάνουν υπό την επίδραση της βαρύτητας. Έχει υπολογιστεί ότι μικρά μονοστιβαδιακά λιποσώματα (SUV) από φωσφατιδυλοχολίνη (PC) έχουν συντελεστή καταβύθισης S (sedimentation coefficient) 2.6 S στο νερό, ενώ το μέγεθος αυτό αυξάνει σε 5.2 S με την προσθήκη μεγάλων ποσών χοληστερόλης (Newman et al., 1975). Έτσι ανάλογα με τη σύσταση της διπλοστιβάδας, μικρά μονοστιβαδιακά λιποσώματα μπορούν αν καταβυθιστούν στα g μετά από ώρες σε μια υπερφυγόκεντρο. Τα πολυστιβαδιακά λιποσώματα καταβυθίζονται ευκολότερα (στα g ή λιγότερο ανάλογα με το μέγεθος, για 1 h περίπου). Στην περίπτωση που εγκλωβίζεται μέσα στα λιποσώματα ουσία με υψηλή συγκέντρωση ή με υψηλό μοριακό βάρος σε συγκέντρωση ισοτονική με ρυθμιστικό διάλυμα, η πυκνότητα του μέσου πλησιάζει ή υπερβαίνει αυτή των λιπιδίων, με αποτέλεσμα η καταβύθιση να είναι αδύνατη. Το πρόβλημα αυτό μπορεί να ξεπεραστεί με 42

43 αραίωση των λιποσωμάτων σε ένα μέσο με χαμηλότερη πυκνότητα έτσι ώστε τα λιποσώματα να είναι βαρύτερα από αυτό Χρωματογραφία γέλης (gel chromatography) Στην υγρή χρωματογραφία αποκλεισμού μοριακών μεγεθών τα μόρια των συστατικών ενός μίγματος, μετακινούνται με τη βοήθεια μιας υγρής κινητής φάσης μέσα στο πορώδες δίκτυο στατικής φάσης και διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος τους. Το δικτυωτό πλέγμα της στατικής φάσης λειτουργεί σαν μοριακό κόσκινο, επιτρέποντας την είσοδο στο εσωτερικό του μόνο σε μόρια που είναι μικρότερα από το μέγεθος των πόρων του. Ενώσεις μεγαλύτερου μεγέθους αποκλείονται από το να εισέλθουν στο δίκτυο και εκλούονται πρώτες παρασυρόμενες από την κινητή φάση. Οι υπόλοιπες ουσίες, ανάλογα με το μέγεθος τους κατανέμονται λιγότερο ή περισσότερο στη στατική φάση και εκλούονται κατά σειρά μεγέθους. Ως στατικές φάσεις χρησιμοποιούνται κυρίως υδρόφιλες πηκτές από διακλαδισμένα πολυμερή δεξτράνης (Sephadex G), αγαρόζης (Sepharose B) ή πολυακρυλαμιδίου (Bio Gel P). Ειδικά πολυμερή δεξτράνης σχηματίζουν μετά από αλκυλίωση των υδροξυλομάδων τους υδρόφοβες γέλες με οργανικούς διαλύτες (Sephadex LH). Όσον αφορά στα λιποσώματα, οι πλέον διαδεδομένες γέλες για το διαχωρισμό της ελεύθερης από την εγκλωβισμένη ουσία είναι οι Sephadex G (κυρίως G 50 και G 25). 4.6 Εφαρμογές των λιποσωμάτων Τα λιποσώματα έχουν γίνει το επίκεντρο του ενδιαφέροντος τα τελευταία 30 χρόνια ως φαρμακευτικοί νανοφορείς. Πιο πρόσφατα είδαν το φως μελέτες και νέες τεχνικές που αφορούν λιποσωμικά φάρμακα- από κλινικά εγκεκριμένα προϊόντα έως νέες πειραματικές τεχνικές, όπως γονιδιακή μεταφορά και θεραπεία κατά του καρκίνου. Έτσι, τα λιποσώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τους εξής σκοπούς [παραδείγματα αναφέρονται στις παρενθέσεις] (Torchilin V. et al.,2005) : 1. Θεραπεία ασθενειών (Λιποσώματα που φέρουν φάρμακα έναντι συγκεκριμένων ασθενειών, όπως αντικαρκινικά). 2. Φορείς εμβολίων (Λιποσώματα που φέρουν αντιγόνα και βακτηριακές τοξίνες με στόχο την παραγωγή χυμικής ή κυτταρικής ανοσίας στα πειραματόζωα). 43

44 3. Μελέτη κυτταρικής φυσιολογίας (Χρήση λιποσωμάτων για την κατανόηση της λειτουργίας των πρωτεϊνών στις κυτταρικές μεμβράνες). 4. Διαγνωστικοί παράγοντες (Λιποσώματα που περιέχουν παράγοντες όπως ο 99m Tc χρησιμοποιούνται για την απεικόνιση κακοηθειών σε ιστούς, όπως καρκινικοί ιστοί του μαστού). 5. Μεμβρανικά μοντέλα (Λιποσώματα ειδικά σχεδιασμένα για την μελέτη του μηχανισμού που εμπλέκεται με την ωτοτοξικότητα των αμινογλυκοσιδικών αντιβιοτικών, καθώς και τον τρόπο δράσης των τοπικών αναισθητικών). 6. Κοσμετολογία (Λιποσώματα που μελετούν την αλληλεπίδραση ανάμεσα στο δέρμα και τους νανοφορείς). 7. Κλωστοϋφαντουργία (Ανάπτυξη νέας μεθόδου παρεμπόδισης ή ελέγχου του σχηματισμού κυστικού οξέους (cystic acid) στις μάλλινες ίνες μέσω χλωρίωσης του μαλλιού σε ph<7 χρησιμοποιώντας λιποσώματα ως οχήματα μεταφοράς οξειδωτικών παραγόντων). Τα λιποσώματα, εκτός από τις χρήσεις που προαναφέρθηκαν, έχουν μελετηθεί με ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως συστήματα-μεταφορείς βακτηριοκτόνων σε βακτηριακές βιομεμβράνες (Εικόνα 1.17). Έχουν χρησιμοποιηθεί για την μεταφορά βακτηριοκτόνων σε ένα σχετικά μεγάλο εύρος βακτηριακών ειδών. Παράδειγμα αποτελεί ο Staphylococcus epidermidis, ένα βακτήριο που αναπτύσσεται κυρίως στο δέρμα και είναι φυσιολογικά μη παθογόνο αλλά μπορεί να προκαλέσει μολύνσεις σε ανθρώπινα μοσχεύματα, όπως καρδιακές βαλβίδες, τεχνητές αρθρώσεις και καθετήρες (Sanderson and Jones, 1996). Ο ανθεκτικός στην μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA) είναι το κυριότερο παθογόνο που ευθύνεται για την πλειοψηφία των νοσοκομειακών λοιμώξεων. Για τον σκοπό αυτό έχουν χρησιμοποιηθεί λιποσωματικοί φορείς που περιέχουν βανκομυκίνη (Vancomycin), ένα από τα λίγα αντιβιοτικά που είναι αποτελεσματικό έναντι του S. aureus (Kim et al., 1999; Onyeji et al., 1994). Τα αντιβιοτικά σιπροφλοξασίνη (ciprofloxacin) και γενταμυκίνη (gentamicin) όταν εγκλωβιστούν σε λιποσώματα που φέρουν πολυαιθυλενογλυκόλες στην επιφάνειά τους (PEGylated liposomes) φέρουν ενισχυμένη θεραπευτική δράση έναντι μολύνσεων των πνευμόνων αρουραίων από το βακτήριο Klebsiella pneumoniae. Τα λιποσώματα με εγκλωβισμένη σιπροφλοξασίνη είναι εξίσου αποτελεσματικά έναντι του βακτηρίου 44

45 Pseudomonas aeruginosa. Τέλος κατιονικά λιποσώματα που παρασκευάζονται από αμφίφιλα λιπίδια dioctadecyldimethylammonium bromide (DDAB) έδειξαν αντιβακτηριακές ιδιότητες έναντι των βακτηρίων Escherichia coli, Salmonella thyphimurium, P. aeruginosa και S. aureus. Εικόνα 1.17:Απεικόνιση λιποσώματος με εγκλωβισμένο αντιβιοτικό. Τα πλεονεκτήματα των λιποσωμάτων που χρησιμοποιούνται στην μεταφορά φαρμάκων σε βακτηριακές μεμβράνες συνοψίζονται στα ακόλουθα (Duzgunes Ν. et al., 2005): Τα λιποσώματα είναι βιοσυμβατά και η λιπιδική τους σύσταση μπορεί έχει μεγάλο εύρος. Η λιποσωμική επιφάνεια μπορεί να επεξεργαστεί χημικά με διάφορα μόρια (λεκιθίνες, αντισώματα κ.α.) με σκοπό την αποτελεσματική και ειδική στόχευση των τροποποιημένων λιποσωμάτων. Η επεξεργασία των λιποσωμάτων με PEG επίσης αναστέλλει την πρόσληψη από τις βακτηριακές βιομεμβράνες. Υδατοδιαλυτά και υδρόφοβα φάρμακα μπορούν να μεταφέρονται στις βακτηριακές βιομεμβράνες με την χρήση λιποσωμάτων και να παρεμποδίζουν την περαιτέρω ανάπτυξη των βιομεμβρανών. (Robinson et al., 2000). Η αποτελεσματικότητα των λιποσωμάτων αυξάνεται όταν χρησιμοποιούνται χαμηλές συγκεντρώσεις εγκλωβισμένων φαρμάκων, καθώς οι συγκεντρώσεις του ελεύθερου φαρμάκου δεν παρεμποδίζουν την κυτταρική αύξηση. 45

46 Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται κατά την μεταφορά αντιβιοτικών στις βακτηριακές βιομεμβράνες είναι εφαρμόσιμες στην στόχευση φαρμάκων και στην παρεμπόδιση της κυτταρικής αύξησης όλων των τύπων των βακτηριακών κυττάρων που σχηματίζουν μονοστιβάδες σε στερεά υποστρώματα. Οι μέθοδοι αυτές είναι σχετικά περιορισμένες όσον αφορά την μελέτη της δημιουργίας βακτηριακών βιομεμβρανών που ακινητοποιούνται σε στερεά υποστρώματα. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων υπό αυτές τις συνθήκες δεν αντικατοπτρίζουν επακριβώς την συμπεριφορά της βακτηριακής αύξησης in vivo, αλλά αποτελούν μια χρήσιμη ένδειξη του λιποσωμικού ποσοστού που μπορεί να προσκολληθεί στις ακινητοποιημένες επιφάνειες, υπό αυτές τις συνθήκες. 46

47 Β. ΒΙΟΫΛΙΚΑ 47

48 1 Γενικά περί Βιοϋλικών Με τον όρο «βιοϋλικά» αναφερόμαστε σε κάθε υλικό, φυσικό ή τεχνητό, σταθερό ή αποδομημένο κατά ελεγχόμενο τρόπο, που τοποθετείται, σε επαφή με το πολύπλοκο περιβάλλον των ιστών του ανθρώπινου σώματος με σκοπό την αποκατάσταση της δομικής ακεραιότητας και λειτουργίας των ιστών, χωρίς να προκαλεί αρνητικές αντιδράσεις από τον οργανισμό. Η μελέτη των βιοϋλικών ασχολείται με στην φυσική και βιολογική μελέτη των υλικών και στην αλληλεπίδραση τους με το βιολογικό περιβάλλον. Μέρος της έρευνας αποτελεί η σύνθεση, ο χαρακτηρισμός, η εξέταση, η βελτιστοποίηση καθώς και η βιοσυμβατότητα τους. Ο όρος βιοσυμβατότητα είναι άρρηκτα συνδεδεμένος με τον όρο βιοϋλικό και προϋποθέτει την ικανότητα της επιφάνειας του υλικού να γίνει αποδεκτή και να ενσωματωθεί στον οργανισμό, με τέτοιο τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται η αρμονική συμβίωση βιοϋλικού και ζώντος οργανισμού (Ratner et al., 2004). Πιο ειδικά ένα βιοϋλικό θεωρείται συμβατό όταν: 1. Δεν εμφανίζει συστηματική, τοπική τοξική δράση στους παρακείμενους ιστούς 2. Δεν έχει καρκινογόνο και μεταλλαξιογόνο δράση 3. Δεν έχει αλλεργιογόνο δράση, δηλαδή δεν προκαλεί αντιδράσεις υπερευαισθησίας 4. Δεν αποβάλλεται από τον οργανισμό και προσπαθεί να μιμηθεί την βιοχημεία του περιβάλλοντος όπου τοποθετείται. 1.1 Κατηγορίες βιοϋλικών Τα βιοϋλικά ταξινομούνται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με: 1) την αλληλεπίδρασή τους με το όργανο, ιστό-ξενιστή και 2) το υλικό από το οποίο είναι φτιαγμένα. Στην πρώτη κατηγορία τα βιοϋλικά χωρίζονται σε τέσσερις ομάδες: 1. Τοξικά: το υλικό απελευθερώνει τοξικές ουσίες που οδηγούν στην νέκρωση του ιστού που το περιβάλλει (Ratner et al.,2004). 48

49 2. Βιοαποικοδομήσιμα: το υλικό δεν είναι τοξικό αλλά απορροφάται σταδιακά και αντικαθίσταται από τον ιστό που το περιβάλλει (Kohn et al., 2004). 3. Βιοσταθερά: το υλικό δεν είναι τοξικό και είναι βιολογικά ανενεργό αλλά δεν μπορεί να αποσυντεθεί από τον οργανισμό (Ratner et al.,2004). 4. Βιοσύνθετο-βιοενεργό: το υλικό δεν είναι τοξικό και αλληλεπιδρά έντονα με τον ιστό που το περιβάλλει, σχηματίζοντας χημικούς δεσμούς που το σταθεροποιούν (πυκνά κεραμικά, υδροξυπατίτη, βιοενεργά γυαλιά κ.α.) (Hench&Best, 2004). Στην δεύτερη κατηγορία η ομαδοποίηση γίνεται ως ακολούθως: 1. Μέταλλα και τα κράματά τους: Τα μέταλλα χρησιμοποιούνται ως βιοϋλικά χάρη στην άριστη θερμική και ηλεκτρική αγωγιμότητά τους, αλλά και στις μηχανικές τους ιδιότητες. Συνήθως χρησιμοποιείται ο χρυσός και ο ανοξείδωτος χάλυβας. Εφαρμογή βρίσκουν ευρέως στην οδοντιατρική, την ορθοπεδική, την καρδιοχειρουργική (βηματοδότες, προσθετικές βαλβίδες) και στην ουρολογία (καθετήρες, διάνοικτες στενώσεων) (Brunski, 2004). Καθώς το βιοϋλικό με το οποίο ασχοληθήκαμε στην παρούσα έρευνα ήταν ο ανοξείδωτος χάλυβας, ιδιαίτερη σημασία θα δοθεί στην συγκεκριμένη κατηγορία βιοϋλικών. 2. Πολυμερή: χαρακτηρίζονται τα υλικά που αποτελούνται από πολύ μεγάλα μόριααλυσίδες ατόμων άνθρακα, στα οποία συνδέονται διάφορα άτομα ή ρίζες (Callister, 1999). Οι κυριότερες ιδιότητες που απαιτείται να φέρουν τα πολυμερή είναι η βιοσυμβατότητα, καλές φυσικές ιδιότητες (αντοχή, ελαστικότητα, σταθερότητα υλικού), ικανότητα μορφοποίησης (με εξώθηση, σε καλούπι ή σχηματισμός ινών) και δυνατότητα αποστείρωσης (αυτόκαυστο, θερμή ξήρανση, ακτινοβολία). Τα πολυμερή που χρησιμοποιούνται ως βιοϋλικά είναι είτε φυσικά είτε τεχνητά. Τα φυσικά πολυμερή, που ανήκουν στην κατηγορία των βιομοριακών υλικών, παράγονται μέσα από βιολογικές διεργασίες και απαντώνται στο εξωκυττάριο υλικό των συνδετικών ιστών, όπως επί παραδείγματι στους τένοντες, στο δέρμα, στα οστά, στα δόντια και στα αιμοφόρα αγγεία. Αντιπροσωπευτικά δείγματα είναι το κολλαγόνο, (Πίνακας 1.2) η ελαστίνη, το μετάξι, η κερατίνη, η ακτίνη και η μυοσίνη (Μπουρόπουλος, 2002). 49

50 Πίνακας 1.2: Μοριακή δομή και ενδεικτικές θέσεις διαφόρων τύπων κολλαγόνου [Μπουρόπουλος, 2002], [Καφαντάρη, 2000] Τύπος κολλαγόνου Πολυπεπτιδικές Αλυσίδες Κατανομή (α1(i)) Ι 2 α2(i), Δέρμα, τένοντες, οστά τριμερές (α1(i)) 3 οδοντίνη, έντερο, επιδερμίδα ΙΙ (α(ιι)) 3 Υαλώδης χόνδρος ΙΙΙ (α(ιιι)) 3 Αγγεία, επιδερμίδα, καρδιακές βαλβίδες ΙV (α1(iv))2α2(ιv) Βασική μεμβράνη V α1(v)α2(v)α3(v), (α1(v)) 3 Κερατοειδής χιτώνας, οστά VI α1(vi)α2(vi)α3(vi) Δέρμα, καρδιακός μύς, αγγεία VII (α1(vii)) 3 Δέρμα, πλακούντας, οστά VIII IX α1(viii)α2(viii) άγνωστη η οργάνωση των αλυσίδων α1(ιx)α2(ιx)α3(ιχ) Descemet s μεμβράνη Χόνδρος, υαλοειδές υγρό Οφθαλμού X (α1(x)) 3 Οδοντοστοιχία, χόνδρος XI α1(xi)α2(xi)α3(xi) Χόνδρος, οστά, δίσκοι XII (α1(xii)) 3 Δέρμα, εμβρυϊκός τένοντας XIII α1(xiii) Διάφοροι ιστοί XIV α1(xιv) Εμβρυϊκό δέρμα, τένοντες XV α1(xv) Ινοβλάστες XVI α1(xvi) Ινοβλάστες XVII α1(xvii) Επιθηλιακά Ημιδεσμοσωμάτια XVIII α1(xviii) Ήπαρ, πνεύμονες Ευρεία όμως χρήση ως βιοϋλικά παρουσιάζουν και τα τεχνητά πολυμερή, εξαιτίας της ικανότητάς τους να μορφοποιούνται εύκολα σε νημάτια, ράβδους, ιξώδη υγρά και υμένια. Οι κυριότερες κατηγορίες τεχνητών πολυμερών είναι τα πολυαιθυλένιο, τα πολυαμίδια, ο πολυμεθακρυλικός μεθυλεστέρας, το πολυτετραφθοροαιθυλένιο και οι πολυουρεθάνες. Οι κυριότερες εφαρμογές τους: φαίνονται στον Πίνακα 1.3 (Cooper et al., 2004) 50

51 Πίνακας 1.3: Κυριότερες βιοϊατρικές εφαρμογές των τεχνητών πολυμερών Τεχνητά Πολυμερή Πολυβινυλοχλωρίδιο (PVC) Πολυαιθυλένιο (PE) Πολυπροπυλένιο (PP) Πολυμεθακρυλικός Μεθυλεστέρας (PMMA) Polyethylene terephthalate Πολυτετραφθοροαιθυλένιο ( PTFE ) Πολυουρεθάνη ( PU ) PCGA Εφαρμογές Συσκευασίες μεταφοράς αίματος και διαλυμάτων, καθετήρες Ορθοπεδικά εμφυτεύματα, καθετήρες Ράμματα, τεχνητά αγγειακά μοσχεύματα, σύριγγες Αντλίες αίματος, οφθαλμολογία, ορθοπεδικές εφαρμογές, οδοντιατρικές εφαρμογές, νευροχειρουργική Καρδιακές βαλβίδες, stents Εξωτερικούς καθετήρες, ορθοπεδικές εφαρμογές, νευροχειρουργική Εμφυτεύματα σκελετικών αρθρώσεων, ενίσχυση συνδετικών ιστών Stents επικαλυμμένα με συστήματα μεταφοράς φαρμάκων 3. Κεραμικά: Πρόκειται για θερμικά κατεργασμένα υλικά (με έψηση) τα οποία προέρχονται από αργιλικές πρώτες ύλες και που καλύπτουν μεγάλο εύρος εφαρμογών στην ιατρική. Ενδεικτικά αναφέρεται η χρήση της πορσελάνης στην οδοντιατρική και της αλουμίνας, της ζιρκονίας και του φωσφορικού ασβεστίου (υδροξυαπατίτη, Εικόνα 1.18) στην ορθοπεδική (Hench&Best, 2004). Εικόνα 1.18: Η δομή του υδροξυαπατίτη κατά τον άξονα c. [Boanini et al., 2007] 51

52 Τα βασικά πλεονεκτήματα των κεραμικών έναντι των μετάλλων εστιάζονται στην αυξημένη αντίσταση στη διάβρωση, τη σχετικά χαμηλή πυκνότητα, στο υψηλό μέτρο ελαστικότητας και στην καλή αντοχή στη θλίψη. Τα μειονεκτήματα που εμφανίζουν σχετίζονται με την ευθραυστότητα, την εύκολη διάδοση των ρωγμών και τη μικρή αντοχή σε κόπωση. 4. Σύνθετα: Τα σύνθετα βιοϋλικά βρίσκουν εφαρμογή στην Ορθοπεδική και την Οδοντιατρική, με κύριο αντιπρόσωπο τον υδροξυαπατίτη (Russias J. Et al., 2006). Πρόκειται για υλικά που αποτελούνται από δύο ή περισσότερα συστατικά, με κύρια την μήτρα και την ενισχυτική φάση (ανόργανοι κόκκοι, όπως πυριτικό βάριο, πυριτικό ζιρκόνιο). Σκοπός είναι ο επιτυχής συνδυασμός των συστατικών αυτών, ούτως ώστε να επιτευχθούν ειδικές ιδιότητες και χαρακτηριστικά που το καθένα από τα συμμετέχοντα συστατικά δεν μπορεί να επιτύχει από μόνο του. Ανάλογα με το συστατικό της ενισχυτικής φάσης, τα σύνθετα υλικά χωρίζονται σε σύνθετα υλικά με ενίσχυση ινών, με ενίσχυση σωματιδίων και σε στρωματικά σύνθετα υλικά (Mano J. et al., 2004). 1.2 Βιοϋλικά πρώτης, δεύτερης και τρίτης γενιάς Μελετώντας την εξελικτική πορεία των βιοϋλικών θα μπορούσαμε να τα διαχωρίσουμε σε τρεις κατηγορίες. Τα βιοϋλικά πρώτης, δεύτερης και τρίτης γενιάς. Πιο συγκεκριμένα όταν τα συνθετικά υλικά ξεκίνησαν να χρησιμοποιούνται πριν τον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο για βιοιατρικές εφαρμογές, η μόνη απαίτηση ήταν η επίτευξη ενός κατάλληλου συνδυασμού φυσικών ιδιοτήτων ούτως ώστε να ταυτίζονται με αυτές των ιστών που θα αντικαθιστούσαν με την ελάχιστη τοξική επίδραση στον φορέα (Hench L., Biomaterials, 1980). Τα συγκεκριμένα βιοϋλικά ονομάστηκαν βιοϋλικά πρώτης γενιάς από τον Hench, διότι οι μόνες απαιτήσεις που έφεραν ήταν η μηχανική αντοχή και η βιοανοχή, δηλαδή να είναι ανεκτά από τον οργανισμό, χωρίς δυσμενείς επιπτώσεις, σε συνδυασμό με την ικανοποιητική μηχανική συμπεριφορά τους σε φυσιολογικές συνθήκες. Τα πρώτα μεταλλικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς σε ορθοπεδικές εφαρμογές ήταν ο ανοξείδωτος χάλυβας και τα κράματα κοβαλτίου. Η πρώτη επιτυχής προσθετική ήταν ολικού ισχίου από τον Charnley το 1959 και το προσθετικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν ανοξείδωτος χάλυβας. Τα υλικά από 52

53 ανοξείδωτο χάλυβα είναι ανθεκτικά σε ένα μεγάλο εύρος διαβρωτικών στοιχείων, εξαιτίας των υψηλών ποσοστών (πάνω από 12 wt%) χρωμίου (Cr) που περιέχουν, το οποίο επιτρέπει την δημιουργία οξειδωμένου στρώματος Cr2O3 στην επιφάνεια του υλικού. Η οξειδωμένη αυτή μορφή του χρωμίου έχει ισχυρή ικανότητα πρόσδεσης, αυτοδιατήρησης και αντοχής στην διάβρωση. Στα κεραμικά, τα πρώτα βιοϋλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η αλουμίνα, η ζιρκόνια και διάφορα πορώδη κεραμικά. Αυτά τα μη-μεταλλικά, μη-οργανικά υλικά είχαν περιορισμένο εύρος εφαρμογών. Η μικροδομή τους είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τις κατασκευαστικές διαδικασίες που εφαρμόζονται (ανώτατη θερμοκρασία, μέγεθος και κατανομή των κόκκων και του πορώδες, καθαρότητα της σκόνης) και έχουν ξεκάθαρη και άμεση επίδραση και στις μηχανικές αλλά και στις βιολογικές ιδιότητες του υλικού. Η αλουμίνα χρησιμοποιείται πάνω από 20 χρόνια σε ορθοπεδικές εφαρμογές, λόγω του χαμηλού συντελεστή τριβής που παρουσιάζει. Τέλος, μερικά παραδείγματα πολυμερικών βιοϋλικών πρώτης γενιάς είναι η σιλικόνη, το PE (πολυαιθυλένιο), οι ακρυλικές ρητίνες, το PP (πολυπροπυλένιο) και το PMMA (πολυμεθυλομεθακρυλικό). Τα βιοϋλικά δεύτερης γενιάς εμφανίστηκαν ανάμεσα στο 1980 και 2000, και χαρακτηρίζονται από την ανάπτυξη βιοενεργών υλικών, με ειδική ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το βιολογικό περιβάλλον στο οποίο βρίσκονται, με σκοπό την ενίσχυση της βιολογικής απόκρισης με τον παρακείμενο ιστό/επιφάνεια. Τα βιοενεργά βιοϋλικά που σχεδιάστηκαν για την αποκατάσταση σκελετικών ανωμαλιών, οδήγησαν σε in vivo εναπόθεση υδροξυαπατίτη στην επιφάνεια των υλικών. Ακόμα τα σύγχρονα οδοντικά εμφυτεύματα είναι βιοενεργά, αφού με την επιφανειακή τους επεξεργασία με επικάλυψη υδροξυαπατίτη, επιδιώκεται η προαγωγή της διαδικασίας της οστεοενσωμάτωσης. Επίσης, τα βιοϋλικά δεύτερης γενιάς χαρακτηρίζονται από την ανάπτυξη βιοαπορροφήσιμων υλικών, τα οποία έχουν την ικανότητα να υπόκεινται σε σταδιακή βιοδιάσπαση/βιοαποδόμηση, ενώ καινούργιος ιστός αναγεννάται και επιδιορθώνεται. Η ιδιότητα της βιοαποδόμησης αποτελεί σημαντική πρόοδο, γιατί επιτρέπει τη σταδιακή και ελεγχόμενη αντικατάσταση του υλικού από νεοσχηματιζόμενο ιστό, έτσι ώστε όταν ολοκληρωθεί να μην είναι δυνατή η διάκριση των ορίων μεταξύ περιοχής εμφύτευσης και περιβαλλόντων ιστών. Τα πιο διαδεδομένα βιοϋλικά δεύτερης γενιάς είναι τα πολυμερή και πιο συγκεκριμένα τα συνπολυμερή πολυγαλακτικού και 53

54 πολυγλυκολικού οξέος (PLGA) (απορροφήσιμα ράμματα, Εικόνα 1.19). Τα βιοδιασπώμενα πολυμερικά εμφυτεύματα έχουν περισσότερα πλεονεκτήματα από τα αντίστοιχα μεταλλικά, διότι μειώνουν τις επιπτώσεις της οστεοπενίας στον σκελετό, αποκλείουν περαιτέρω χειρουργικές επεμβάσεις για την πιθανή αφαίρεση των μεταλλικών εμφυτευμάτων και προωθούν την μεταχειρουργική διαγνωστική απεικόνιση. Εικόνα 1.19 : Απορροφήσιμο συνθετικό ράμμα, που απορροφάται με υδρόλυση από τον οργανισμό Η τρίτη γενιά βιοϋλικών, που περιλαμβάνει τα απορροφήσιμα από τον οργανισμό πολυμερή σχεδιασμένα σε μοριακό επίπεδο για να άγουν συγκεκριμένες κυτταρικές αποκρίσεις, αποτελούν ιδιαίτερα ελκυστικά υλικά για να χρησιμοποιηθούν ως ικριώματα ή μήτρες στην αναγέννηση ιστών. Τα έξυπνα αυτά βιοϋλικά έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε να αντιδρούν σε αλλαγές στο άμεσο περιβάλλον τους (π.χ. ph, θερμοκρασία, ηλεκτρικά ή φυσικά ερεθίσματα, ενεργειακή κατάσταση) και να διεγείρουν συγκεκριμένες κυτταρικές αποκρίσεις σε μοριακό επίπεδο. Η νανοτεχνολογία επιτρέπει επίσης τη βελτίωση των μη-απορροφήσιμων από τον οργανισμό υλικών (π.χ. κεραμικών υλικών) και τον αποτελεσματικό έλεγχο των βιολογικών αντιδράσεων με στόχο τη δραματική αύξηση της λειτουργικότητας και της μακροβιότητας των εμφυτευμάτων. Οι βασικές ιδιότητες ενός βιοϋλικού τρίτης γενιάς είναι: 1. Βιοσυμβατότητα 2. Πορώδες 3. Μέγεθος πόρου 54

55 4. Επιφανειακές ιδιότητες 5. Μηχανικές ιδιότητες 6. Βιοαποδόμηση Οι ιδιότητες αυτές των βιοϋλικών τρίτης γενιάς, προσδίδουν στα υλικά αυτά την ικανότητα να σηματοδοτούν και να διεγείρουν συγκεκριμένες κυτταρικές αποκρίσεις. Εμπορικά, έχουν χρησιμοποιηθεί πορώδεις τρισδιάστατες δομές που σηματοδοτούν την κυτταρική μετανάστευση, πρόσδεση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, καθώς και ειδικά επεξεργασμένες επιφάνειες με πεπτιδικές αλληλουχίες, οι οποίες μιμούνται τη σύσταση της εξωκυττάριας ύλης, ούτως ώστε να ενεργοποιηθούν συγκεκριμένες κυτταρικές αποκρίσεις (Hutmacher et al., 2000; Temenoff et al., 2000). Για τους σκοπούς αυτούς επιστρατεύτηκαν οι επιστήμες της ιστικής μηχανικής και της αναγεννητικής ιατρικής, οι οποίες ερευνούν τους τρόπους με τους οποίους αποκαθίστανται και αναγεννιούνται τα όργανα και οι ιστοί, χρησιμοποιώντας φυσιολογικά σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως αυξητικούς παράγοντες, αρχέγονα κύτταρα και πεπτιδικές αλληλουχίες, σε συνδυασμό πάντα με συνθετικά ικριώματα. Τα τρισδιάστατα πορώδη ικριώματα (Εικόνα 1.20) θα πρέπει να πληρούν ορισμένα κριτήρια, ούτως ώστε να χρησιμοποιηθούν στην ιστική μηχανική. Αυτά τα κριτήρια είναι: 1. Το υλικό πρέπει να είναι βιοσυμβατό και τα παράγωγα της αποδόμησής του, μητοξικά. 2. Το ικρίωμα πρέπει να είναι βιοδιασπώμενο και να επαναπορροφάται με τους ίδιους ρυθμούς με τους οποίους γίνεται η αποκατάσταση του ιστού. 3. Το ικρίωμα πρέπει να αποτελείται από ένα εσωτερικά δομημένο πορώδες δίκτυο, το οποίο σχηματίζεται από το συνδυασμό μακρο- και μικροπόρων, οι οποίοι εξασφαλίζουν την ικανοποιητική αύξηση του ιστού, την αγγειοποίηση και την μεταφορά θρεπτικών στον ιστό. 4. Οι μηχανικές ιδιότητες του ικριώματος πρέπει να είναι οι κατάλληλες για την αναγέννηση των σκελετικών ιστών. Επιπλέον, το υλικό θα πρέπει να διατηρεί την δομική του συνοχή κατά την διάρκεια των πρώτων σταδίων του νεοσύστατου σκελετού (Navarro M. Et al., 2008). 55

56 Εικόνα 1.20: Τρισδιάστατες πορώδεις μήτρες βιοενεργών υάλων 2 Ουρολογικές Ενδοπροθέσεις 2.1 Ανατομία Ουρητήρα Οι ουρητήρες (Εικόνα 1.21) είναι δυο, ένας από κάθε νεφρό, και μεταφέρουν τα ούρα από τους νεφρούς στην κύστη. Ο κάθε ουρητήρας έχει μήκος cm και κατεβαίνει κατά μήκος του οπίσθιου κοιλιακού τοιχώματος, επάνω στον μυ, περνά στη συνέχεια στη λεκάνη, στρέφεται προς τα μέσα και εμπρός, διασταυρώνεται με τα λαγόνια αγγεία και καταλήγει στην ουροδόχο κύστη. O ουρητήρας μπαίνει στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης λοξά και η πορεία του μέσα στο τοίχωμά της σχηματίζει ένα ειδικό βαλβιδικό μηχανισμό που δεν επιτρέπει στα ούρα που έχουν περάσει μέσα στην ουροδόχο κύστη να επιστρέψουν στον ουρητήρα. Τούτο συμβαίνει μόνο σε παθολογικές καταστάσεις, λέγεται κυστεοουρητηρική παλλινδρόμηση και είναι αιτία μικροβιακών λοιμώξεων του ουροποιητικού συστήματος (ουρολοιμώξεων). Το τοίχωμα του ουρητήρα αποτελείται από έναν εξωτερικό ινώδη χιτώνα, ένα μυϊκό χιτώνα αμέσως κάτω απ' τον ινώδη και προς το εσωτερικό του από το βλεννογόνο χιτώνα που έχει μεταβατικό επιθήλιο. Τα ούρα παράγονται από τους νεφρούς διαρκώς και κατεβαίνουν από τη νεφρική πύελο και τους ουρητήρες κατά κύματα η μεταφορά τους γίνεται με τη βαρύτητα αλλά και με περισταλτικά κύματα που κάνουν τα μυϊκά τοιχώματα αυτών των οργάνων. Συλλέγονται στην ουροδόχο κύστη, η οποία είναι κατά κάποιο τρόπο η αποθήκη των ούρων, και αποβάλλονται με την ούρηση από την ουρήθρα. 56

57 Εικόνα 1.21 :Σχηματική απεικόνιση του ουρητήρα Στην ιατρική όταν χρησιμοποιούμε τον όρο ενδοπρόθεση, αναφερόμαστε σ ένα μηχανισμό ο οποίος εμφυτεύεται στο σώμα προκειμένου να διατηρεί ένα βιολογικό αυλό ανοιχτό. Τα είδη των καθετήρων που χρησιμοποιούνται στην Ιατρική είναι: Α) Kυστικοί καθετήρες Η χρήση των πρώτων κυστικών καθετήρων χάνεται στα βάθη των ιστορικών χρόνων. Η εξέλιξη των σύγχρονων καθετήρων αρχίζει από το 1860 με την εμφάνιση από τον Austo Nelaton ενός τύπου καθετήρα κατασκευασμένο από θειωμένο ελαστικό (vulcanize) [Δαβίλλας 2004]. Υπάρχουν δύο βασικά είδη κυστικών καθετήρων : 1) Οι ευθείς καθετήρες που συνήθως χρησιμοποιούνται εφ άπαξ (εκκενωτικοί καθετηριασμοί κύστης) ή για απομάκρυνση αιμοπηγμάτων από την κύστη όπως οι καθετήρες Robinson, Coudè, Tiemman, Νelaton. 2) Οι αυτοσυγκρατούμενοι καθετήρες, με διάφορους μηχανισμούς συγκράτησης τους όπως οι καθετήρες Malecot, Pezzer ή οι πιο γνωστοί τύπου Foley (Bard 1933),οι οποίοι χρησιμοποιούνται για μεγάλα χρονικά διαστήματα παροχέτευσης [ Carter 2002]. 57

58 Β) Συνθετικοί αυτοσυγκρατούμενοι καθετήρες Ο ιδανικός συνθετικός καθετήρας είναι κατασκευασμένος κυρίως από πολυμερή, έτσι ώστε να μην μετακινείται από την θέση του μετά την τοποθέτησή του και να είναι αρκετά ακτινοσκιερός ώστε να γίνεται εύκολα ορατός κατά την τοποθέτηση του. Τα υλικά από τα οποία κατασκευάζονταν, μέχρι πρότινος, οι καθετήρες ήταν το πολυαιθυλένιο (Εικόνα 1.22) και η πιο άκαμπτη πολυουρεθάνη. Η χρήση όμως των συγκεκριμένων υλικών έχει εγκαταλειφθεί και αντικατασταθεί από την πιο βιοσυμβατή σιλικόνη, εξαιτίας της ακαμψίας, ευθραυστότητας και εμφάνισης ουρητηρικής εξέλκωσης στον ασθενή από τα υλικά αυτά. Εικόνα 1.22: Συνθετικός καθετήρας από πολυαιθυλένιο Η σιλικόνη ως πιο εύκαμπτο υλικό έχει το πλεονέκτημα της πιο εύκολης τοποθέτησης είτε με ενδοουρολογικές ή κυστεοσκοπικές μεθόδους και επιπλέον αντιστέκεται καλύτερα στην δημιουργία βιομεμβράνης από παθογόνα βακτήρια και στην εναπόθεση κρυστάλλων των ούρων (urinary crystalloids). Οι πολυμερικοί συνθετικοί καθετήρες χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: 1. Εσωτερικά stents (double-j ή double pigtail) 2. Έσω-έξω stents (νεφροουρητηρικά stents) 58

59 Ο πιο διαδεδομένος συνθετικός καθετήρας ανήκει στην κατηγορία των αυτοσυγκρατούμενων ουρητηρικών καθετήρων (pigtail ή double J stents) (Εικόνα 1.23).H μορφολογία αυτή του καθετήρα (double pigtail) εξασφαλίζει μεγαλύτερη σταθερότητα τόσο στην νεφρική πύελο όσο και στην ουροδόχο κύστη. Επιπρόσθετα η περιέλιξη του άκρου του καθετήρα προς τα έσω μειώνει τον βαθμό ερεθισμού της ουροδόχου κύστεως. Εικόνα 1.23: Συνθετικός καθετήρας τύπου pigtail ή double J. Ο χρόνος βατότητας των συνθετικών καθετήρων double-j κυμαίνεται από 3 έως 24 μήνες. Έρευνες (Reid et al., 1992) έδειξαν πως το 90 % των καθετήρων αυτών από σιλικόνη παρουσίασαν αποικισμό από προσκόλληση βακτηρίων, ενώ η συχνότητα ουρολοιμώξεων που παρατηρήθηκε κλινικά ήταν μόνο 27 % ( Κωνσταντινίδης Χ., Φέσκου Ε., 2010). Οι συνθετικοί ουροκαθετήρες αποφράσσονται συνήθως από εναπόθεση κρυστάλλων και αλάτων, λίθων της ουροδόχου κύστεως (στρουβίτης) ή από πήγματα αίματος, σε αγγειακά stents (Εικόνα 1.24). Η επαφή αυτή του αίματος με την επιφάνεια του πολυμερούς οδηγεί σε εναπόθεση πρωτεϊνών με αποτέλεσμα τον σχηματισμό θρόμβων (θρόμβωση). Στην περίπτωση αυτή και όταν είναι εφικτό γίνεται αντικατάσταση του καθετήρα. Ένας άλλος περιορισμός των συνθετικών καθετήρων είναι η μετανάστευση τους (Mardis et al., 1993). 59

60 Εικόνα 1.24: Εναποθέσεις αλάτων που σχηματίστηκαν στην εξωτερική επιφάνεια stents πολυουρεθάνης (κρύσταλλοι μονοένυδρου οξαλικού ασβεστίου). Εάν μεταναστεύσει προς την ουροδόχο κύστη αντικαθίσταται με κυστοσκοπική μέθοδο ενώ εάν μεταναστεύσει προς την πύελο αντικαθίσταται μέσω νεφροστομίας (Εικόνα 1.25). Οι συνθετικοί καθετήρες νεφροστομίας τοποθετούνται στην νεφρική πύελο διαδερμικά. Έτσι παρακάμπτεται η φυσιολογική οδός αποχέτευσης των ούρων από τον ουρητήρα, σε περιπτώσεις περιφερειακής απόφραξης. Εικόνα 1.25: Καθετήρας νεφροστομίας. γ) Ενδοαυλικές αυτοδιατεινόμενες ενδοπροθέσεις ή νάρθηκες (stents). Η ενδοπρόθεση αυτή είναι ένα αυτοδιατεινόμενο πλέγμα το οποίο όταν ανοίγει έχει σχήμα κυλινδρικό. Τοποθετείται σε απoφραγμένους ή στενωμένους ουρητήρες ή και στην ουρήθρα. Οι σύγχρονες ενδοπροθέσεις διατίθενται σε δύο μορφές: 60

61 αυτοεκπυσσόμενες και εκπτυσσόμενες με μπαλόνι (Εικόνα 1.26). Τα stents τα οποία εκπτύσσονται με την βοήθεια μπαλονιού τοποθετούνται πάνω σε τύπου Gruntzig καθετήρα με μπαλόνι και εκπτύσσονται παθητικά καθώς φουσκώνει το μπαλόνι του καθετήρα. Στην συνέχεια το μπαλόνι ξεφουσκώνει και η ενδοπρόθεση φτάνει στο τελικό της εύρος και αποδεσμεύεται. Α) B) Εικόνα 1.26: Εκπτυσσόμενη ενδοπρόθεση με μπαλόνι τύπου Gruntzig (Α) και τύπου Palmaz (Β). Οι εκπτυσσόμενες ενδοπροθέσεις κατασκευάζονται από μια ποικιλία υλικών. Μεταξύ των υλικών που χρησιμοποιούνται είναι ο ανοξείδωτος χάλυβας (stainless steel), το ταντάλιο και η νιτινόλη (ικανότητα θερμικής μνήμης). Ειδικότερα στις αυτοεκπτυσσόμενες μεταλλικές ενδοπροθέσεις χρησιμοποιείται ο ανοξείδωτος χάλυβας και η νιτινόλη. Τα αυτοεκπτυσσόμενα stent διαθέτουν ενδογενή δύναμη έκπτυξης η οποία συμβάλλει στην χαμηλή συμπιεστικότητα μετά την τοποθέτηση τους στον αυλό του οργάνου. Το Strecker stent αποτελείται από ελαστικό δίκτυο πλέγματος τανταλίου που τοποθετείται στον καθετήρα με το μπαλόνι σε συμπιεσμένη μορφή. Σταθεροποιείται στην θέση του με στηρίγματα σιλικόνης. Το γεγονός αυτό περιορίζει σημαντικά τον κίνδυνο μετανάστευσης και βοηθά στην διατήρηση της διαμέτρου τους και συνεπώς της διαβατότητας του αυλού. Ευρέως χρησιμοποιούμενο αυτοδιατεινόμενο stent είναι το Wallstent. Αρχικά όταν τα stent τοποθετούνται στον ουρητήρα παρατηρούνται θηλωματώδεις (papillary) υπερπλασίες του ενδοθηλίου 61

62 ανάμεσα στα ανοίγματα του πλέγματος του stent. Η υπερπλαστική αντίδραση είναι ορατή και ενδοσκοπικά. Εχει υποστηριχθεί ότι η υπερπλαστική αντίδραση είναι πιο σημαντική όταν το stent υπερδιατείνεται. Με την πάροδο του χρόνου, τα stents υπαλείφονται (και μερικές φορές αποφράσσονται) από στρώμα ιστού με σκληρότερη σύσταση και πιο ομαλή μορφολογία. Τα ιστολογικά ευρήματα ποικίλουν ανάλογα και με την υποκείμενη νόσο. Μείγμα υπερπλαστικού ουρητηρικού ενδοθηλίου και κοκκιώδης ιστός ή και καρκινικά κύτταρα ανευρίσκονται σε περιπτώσεις υποκείμενης κακοήθειας. Ακόμη και μετά την ενσωμάτωση του stent στο τοίχωμα του ουρητήρα, το stent εξακολουθεί να αποτελεί ερεθιστικό παράγοντα και να προκαλεί υπερπλαστική φλεγμονώδη αντίδραση. 62

63 Γ. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΕΝΔΟΠΡΟΘΕΣΕΩΝ ΟΥΡΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 63

64 1 Κατάταξη των Βακτηρίων Τα βακτήρια χωρίζονται σε δυο μεγάλες κατηγορίες, τα Gram-θετικά και Gramαρνητικά βακτήρια, ανάλογα με το πως χρωματίζονται με την μέθοδο Gram. Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε στην διάρκεια μιας προσπάθειας για την εκλεκτική χρώση των βακτηρίων που βρίσκονται σε μολυσματικούς ιστούς. Το κυτταρικό τοίχωμα των Gramθετικών βακτηρίων αποτελείται από μια στιβάδα πεπτιδογλυκάνης (μουκοπεπτίδιο), τεϊχοικά οξέα ενώ απουσιάζει ο λιποπολυσακχαρίτης όπως έχει χαρακτηρισθεί στα Gram αρνητικά βακτήρια. Αυτά τα χαρακτηριστικά της δομής του κυτταρικού τοιχώματος είναι υπεύθυνα για την χρώση τους κατά Gram, η οποία ακολουθεί την παρακάτω πειραματική πορεία (Δημητρακόπουλος, 1987): όλα τα κύτταρα χρωματίζονται πρώτα με κρυσταλλικό ιώδες και ιώδιο και στη συνέχεια πλένονται με ακετόνη ή αλκοόλη. Βρέθηκε ότι το πλύσιμο αυτό αποχρωματίζει, εκτός των ιστών και πολλές κατηγορίες βακτηρίων που ονομάστηκαν αρνητικά κατά Gram (εμφανίζονται ως ροζ ή κόκκινα μετά την χρώση και το πλύσιμο), σε αντίθεση με αυτά που δεν αποχρωματίζονται (εμφανίζονται ως μπλε βιολετί), καθώς εγκλωβίζουν το σύμπλοκο κρυσταλλικού ιώδουςιωδιούχου καλίου στο κυτταρικό τους τοίχωμα που έχει δομή πλούσια σε υδατάνθρακες οι οποίοι δεν αποδομούνται από την αλκοόλη που χρησιμοποιείται για τον αποχρωματισμό στην Gram χρώση, και που ονομάστηκαν θετικά κατά Gram βακτήρια. Εικόνα 1.27: Κυτταρικό τοίχωμα A:Gram-θετικών και B:Gram-αρνητικών βακτηρίων (Costerton et al.,2004). 64

65 2 Κατάταξη Σταφυλοκκόκων Στην παρούσα εργασία θα περιοριστούμε στο είδος Staphylococcus epidermidis. Οι σταφυλόκοκκοι είναι Gram θετικοί κόκκοι, διαμέτρου 0.5 έως 1.5 μm περίπου, ακίνητοι που ανήκουν στην οικογένεια Micrococcaceae. Η οικογένεια Micrococcaceae περιλαμβάνει τα γένη Staphylococcus, Rothia, Planococcus και Micrococcus. Ο διαχωρισμός των δυο γενών Staphylococcus και Micrococcus βασίζεται στην αναερόβια διάσπαση της γλυκόζης και τον έλεγχο ευαισθησίας στη bacitracin. Οι σταφυλόκοκκοι διασπούν τη γλυκόζη αεροβίως και αναεροβίως, ενώ οι μικρόκοκκοι τη διασπούν μόνο αεροβίως (Δημητρακόπουλος, 1987) και είναι ανθεκτικοί στην bacitracin ενώ οι μικρόκοκκοι είναι ευαίσθητοι. Η κατάταξη των σταφυλόκοκκων βασίζεται σήμερα στην ταξινόμηση των Kloos και Schleifer (1975) και περιλαμβάνει 38 είδη, που διαχωρίζονται μεταξύ τους από τις βιοχημικές τους ιδιότητες. Ο S. aureus αποτελεί το κύριο παθογόνο μικροοργανισμό με δεύτερο κατά σειρά συχνότητας τον S. epidermidis, που μαζί με όλα τα υπόλοιπα είδη σταφυλόκοκκων είναι γνωστοί ως πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι (Coagulase Negative Staphylococcus-CNS). Οι σταφυλόκοκκοι βρίσκονται στον αέρα και το έδαφος, απομονώνονται από τα θηλαστικά και αποικίζουν το δέρμα και τους βλεννογόνους του ανθρώπου σε συγκεντρώσεις πάνω από cfu/cm 2 (Noble και Pitcher, 1978). Μερικά είδη βρίσκονται μόνο σε ζώα ενώ κάποια άλλα είδη αποικίζουν συγκεκριμένες ανατομικές περιοχές του ανθρώπου. Ο S. aureus αποικίζει κυρίως τις ρινικές κοιλότητες και το δέρμα (Weinstein, 1959). Ο S. epidermidis απομονώνεται συνήθως από μεγάλο εύρος ανατομικών θέσεων, όπως οι βλεννογόνοι, η βουβωνική και η μασχαλιαία περιοχή, το δέρμα και αποτελεί το 65-90% όλων των σταφυλόκοκκων της μικροβιακής χλωρίδας (Δημητρακόπουλος, 1987). Όλα τα είδη αναπτύσσονται εύκολα στα κοινά θρεπτικά υλικά, σε αερόβιες συνθήκες και στους 37 0 C, αν και η ανάπτυξή τους είναι δυνατή σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από C. Έχουν επίσης την ικανότητα να αναπτύσσονται σε υλικά που περιέχουν % NaCl. 65

66 2.1 Staphylococcus epidermidis O S. epidermidis αποτελεί το 50-80% των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων που απομονώνονται από τα κλινικά δείγματα των ασθενών και αποτελεί μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων. Οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τον S. epidermidis είναι κυρίως ενδονοσοκομειακές και φαίνεται πως τα στελέχη που απομονώνονται πριν από το χειρουργείο εμφανίζουν αντοχή στα αντιβιοτικά σε ποσοστό μόνο 10%, ενώ τα στελέχη που απομονώνονται 7-10 μέρες μετά είναι πολυανθεκτικά, γεγονός που αποδεικνύει την εκλεκτική πίεση που ασκείται από την ευρεία και αλόγιστη χορήγηση των αντιβιοτικών στα νοσοκομεία (Κατσικογιάννη Μ.Γ., 2008). Οι λοιμώξεις που οφείλονται στον S. epidermidis περιλαμβάνουν την ενδοκαρδίτιδα σε προσθετικές βαλβίδες, ενδοκαρδίτιδες φυσικών βαλβίδων, λοιμώξεις που σχετίζονται με ενδοφλέβιους καθετήρες, περιτονίτιδα σε ασθενείς με συνεχή περιτοναϊκή διάλυση, βακτηριαιμία σε ενδονοσοκομειακούς ασθενείς που φέρουν καθετήρες ή άλλα εμφυτεύματα (Huebner and Goldman, 1999), οστεομυελίτιδα, λοιμώξεις προσθετικών αρθρώσεων καθώς και λοιμώξεις του ουροποιητικού. Η παθογένεια του αποδίδεται κυρίως στην ικανότητά του να προσκολλάται στην επιφάνεια του βιοϋλικού, να παραμένει εκεί και να πολλαπλασιάζεται κάτω από ένα προστατευτικό κάλλυμα εξωκυττάριας βλεννώδους ουσίας που το ίδιο παράγει και ονομάζεται γλυκοκάλυκας ή slime (Vuong and Otto, 2002) Στάδια προσκόλλησης του S. epidermidis στην επιφάνεια ενός Βιοϋλικού Ο σχηματισμός της βιομεμβράνης (Εικόνα 1.28) θεωρείται ότι αποτελεί τον κύριο λοιμογόνο παράγοντα στις λοιμώξεις από S. epidermidis. Η εξωκυττάρια ουσία, που περιβάλλει τα βακτηριακά κύτταρα, γνωστή και ως slime απαρτίζεται από συστατικά του ίδιου του βακτηρίου και του ξενιστή. Το slime που παράγεται από τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους είναι μια υδροπηκτή από πολυσακχαρίτες που συγκρατούνται μεταξύ τους μέσω ιοντικών δεσμών. Οι πολυσακχαρίτες αποτελούνται από ουδέτερους μονοσακχαρίτες όπως γλυκόζη, μανόζη, γαλακτόζη, φρουκτόζη, φουκόζη και ραμνόζη, υδατάνθρακες και ουρονικό οξύ. 66

67 Η παραγωγή του slime από τα βακτήρια είναι ιδιαίτερης σημασίας και ενισχύει την δημιουργία και την διατήρηση της βακτηριακής προσκόλλησης, καθώς βακτηριακά στελέχη που δεν παράγουν slime θεωρούνται λιγότερο παθογόνα και μειωμένης προσκολλητικής ικανότητας και καταστρέφονται γρήγορα από το ανοσοποιητικό σύστημα. Επίσης βακτήρια που έχουν προσκολληθεί στην επιφάνεια ενός υλικού και παράγουν slime παρουσιάζουν λιγότερη ευαισθησία στα αντιβιοτικά και τα απορρυπαντικά απ ότι τα βακτήρια που βρίσκονται σε κάποια καλλιέργεια, καθώς η εξωκυττάρια αυτή ουσία και η εξωτερική στιβάδα των κυττάρων προστατεύει το εσωτερικό αυτής της κοινότητας (Κατσικογιάννη Μ.Γ., 2008). Η ανθεκτικότητα αυτή στα αντιβιοτικά σχετίζεται με (Κωνσταντινίδης & Φέσκου, 2010): 1. Μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης που παρουσιάζουν τα βακτήρια μέσα στην βιομεμβράνη, λόγω ελαττωμένης διάχυσης των θρεπτικών συστατικών και της διαθεσιμότητας οξυγόνου μέσα στο περίβλημα του γλυκοκάλυκα. 2. Εξωγενή αντοχή, κατά την οποία η βιομεβράνη αναστέλλει ή καταργεί την διάχυση του αντιβιοτικού στα βαθύτερα στρώματα της. 3. Ενδογενή αντοχή, κατά την οποία οι μικροοργανισμοί της βιομεμβράνης ενεργοποιούν γονίδια, τα οποία προκαλούν αλλαγή της επιφάνειας τους αλλά και των θέσεων στόχου του αντιβιοτικού με αποτέλεσμα την μείωση της ευαισθησίας. Παράδειγμα αποτελούν τα «εμμένοντα κύτταρα» (persister cells) τα οποία φαινομενικά αποτελούν έναν υποπληθυσμό βακτηριών που παραμένουν σε ύπνωση, παρομοιάζονται σαν σπόροι και έτσι διατηρούνται ανέπαφα ακόμα και μετά από παρατεταμένη έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις αντιβιοτικού. 4. Επαγόμενη αντοχή, που σχετίζεται με την ενεργοποίηση μηχανισμών άμυνας έναντι αντιμικροβιακών φαρμάκων, λόγω της ελαττωμένης διείσδυσης του αντιβιοτικού στα βαθύτερα στρώματα της μεμβράνης. 67

68 Εικόνα 1.28: Στάδια προσκόλλησης βακτηρίων σε επιφάνεια, δημιουργία βιομεμβράνης και παράγοντες που επηρεάζουν τον σχηματισμό της (Κατσικογιάννη, 2008). Στάδιο μη ειδικής προσκόλλησης (Ια). Το πρώτο βήμα είναι η προσκόλληση του βακτηρίου επάνω στην επιφάνεια του ξένου υλικού. Στο πρώτο στάδιο της προσκόλλησης παρεμβαίνουν μη ειδικοί μηχανισμοί, όπως το επιφανειακό φορτίο, η πολικότητα, δυνάμεις Van der Walls και η υδροφοβικότητα (Fleer et al., 1989). Οι περισσότεροι ερευνητές πιστεύουν ότι στη φάση προσέγγισης του βακτηρίου σ οποιοδήποτε αδρανές υλικό, βασικό ρόλο παίζει η υδροφοβικότητα του μικροβιακού κυττάρου και του βιοϋλικού. Ο S. epidermidis φέρει αρνητικό επιφανειακό φορτίο και εκφράζει σχετικά υψηλή επιφανειακή υδροφοβικότητα, η οποία εξαρτάται από την περιεκτικότητα της κυτταρικής επιφάνειας σε πρωτεΐνες (τα πρωτεολυτικά ένζυμα μειώνουν τον υδρόφοβο χαρακτήρα της επιφάνειας) (Vacheethasanee et al., 1998). Στάδιο ειδικής προσκόλλησης (Ιb). Η ειδική προσκόλληση του S. epidermidis σε επιφάνειες βιοϋλικών επιτυγχάνεται με μία πολυσακχαριδική προσκολλητίνη (PS/A: Polysaccharide-adhesin), η οποία επιταχύνει την προσκόλληση (επιτυχής προσκόλληση 68

69 μετά από 15 λεπτά επαφής υλικού και μικροοργανισμού) και με πρωτεΐνες επιφανείας (Tojo et al., 1988). H PS/A είναι μεγάλου μοριακού μεγέθους (> daltons) πολυμερές γαλακτόζης και αραβινόζης, σε αναλογία 1:1 (Mϋller et al., 1993). Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι ο S. epidermidis παράγει PS/A και έχει την ικανότητα παραγωγής λιπασών που δεσμεύονται με το κολλαγόνο, πρωτεασών και αυτολυσινών. Στάδιο παραγωγής βιομεμβράνης (ΙΙ). Αφού προσκολληθεί το βακτήριο στην επιφάνεια ακολουθεί το στάδιο της ωρίμανσης της βιομεμβράνης, της συσσώρευσης των βακτηρίων και η παραγωγή του slime (ESS:extracellular slime substance) που είναι υπεύθυνο για την εμφάνιση της λοίμωξης (Fleer et al., 1989; Jansen et al., 1989). Η λοιμογόνος δύναμη των σταφυλοκόκκων έχει συνδεθεί άμεσα με τη βλεννώδη εξωκυττάρια ουσία (slime), που επάγει την προσκόλληση των βακτηρίων στις προσθετικές επιφάνειες και είναι εμφανής στα τελικά στάδια της προσκόλλησης, και όχι στην αρχική φάση (Peters et al., 1982). Επίσης το slime προστατεύει τα βακτήρια από τους αντιμικροβιακούς παράγοντες που χρησιμοποιούνται στην θεραπεία αυτών των λοιμώξεων και προστατεύει τον μικροοργανισμό από την φαγοκυττάρωση (Kristinsson et al., 1988). Η χημική ανάλυση του εξωκυττάριου προϊόντος (crude slime) έδειξε ότι αποτελείται από μόρια πρωτεϊνών, πεπτιδογλυκανών, υδατανθράκων, νουκλεϊνικών και τειχοϊκών οξέων. Ο επικρατέστερος ουδέτερος μονοσακχαρίτης είναι η γλυκόζη, ενώ σε ένα στέλεχος ανιχνεύθηκε και γαλακτόζη. Ο S. epidermidis παράγει έναν εξωκυττάριο πολυσακχαρίτη PIA (Polysaccharide Intercellular Adhersin) ο οποίος είναι ένα θετικά φορτισμένο πολυμερές της β-1,6-νακετυλογλυκοζαμίνης (NAG) και ο οποίος παράγεται από το οπερόνιο icaadbc, το οποίο αποτελείται από τα γονίδια icaa, icad, icab, icac, icar. Το οπερόνιο icaadbc φαίνεται να είναι υπεύθυνο και να παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των λοιμώξεων που σχετίζονται με καθετήρες. Μετά την έκθεση των βιοϊατρικών υλικών στα υγρά του σώματος, όπως αίμα, σίελος ή ούρα, προσροφώνται μακρομοριακά στοιχεία και σχηματίζουν μια συμβατική μεμβράνη (Reid et al., 1998). Η συμβατική μεμβράνη αποτελεί τη βάση για το σχηματισμό της ώριμης βιομεμβράνης. Τα περισσότερα μακρομόρια που προσροφώνται έχουν πρωτεϊνική σύσταση, όπως αλβουμίνη, ινωδογόνο, κολλαγόνο και φιμπρονεκτίνη. Στην Εικόνα 1.29 απεικονίζεται η χαρακτηριστική τρισδιάστατη δομή της ώριμης 69

70 βιομεμβράνης καθώς και οι δίοδοι που σχηματίζονται σε αυτή και επιτρέπουν την ελέυθερη κίνηση των υγρών. Εικόνα 1.29: Τρισδιάστατη δομή της ώριμης βιομεμβράνης. (Costeron and Steward, Sci. American, 2001.) 3 Λοιμώξεις ενδοπροθέσεων ουροποιητικού συστήματος Τα ούρα μέσα στην ουροδόχο κύστη είναι στείρα, δηλαδή δεν έχουν μικρόβια αφού η παραγωγή και η συλλογή τους γίνεται μέσα σε ένα κλειστό σύστημα ιστών και οργάνων. Μικρόβια υπάρχουν μόνο στο στόμιο της ουρήθρας (μικρόκοκκοι, γαλακτοβάκιλλοι, διφθεροειδή και άλλα σαπροφυτικά), από όπου κατά την ούρηση παρασύρονται και μολύνουν τα ούρα. Η ίδια πιθανότητα υπάρχει και από τα μικρόβια της περινεϊκής χώρας. Τα μικρόβια που απομονώνονται στις ουρολοιμώξεις φαίνονται στον Πίνακα

71 Πίνακας 1.4: Μικροοργανισμοί που απομονώνονται στις ουρολοιμώξεις Escherichia coli Staphylococcus saprophyticus Proteus spp Providencia spp Klebsiella spp Pseudomonas spp Citrobacter spp Serratia spp Enterococcus faecalis S. epidermidis Αναερόβια Στρεπτόκοκκοι ομάδας Β Candida spp Gardnerella vaginalis Mycoplasma spp Ureaplasma urealyticum Μυκοβακτηρίδια Η πλειονότητα των ουροπαθογόνων μικροβίων είναι Gram-αρνητικά δυνητικά αναερόβια (Πίνακας 1.5), τα οποία γενικά υπάρχουν στη χλωρίδα του εντέρου. Gramθετικά μικρόβια, όπως ο Staphylococcus saprophyticus και o Enterococcus faecalis μπορούν επίσης να προκαλέσουν ουρολοιμώξεις. Τα αναερόβια (Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp, Clostridium perfingens) αποτελούν πολύ σπάνια αίτια και πρέπει να αναζητούνται σε συμπτωματικούς ασθενείς στους οποίους η ποσοτική καλλιέργεια αποτυγχάνει να αναδείξει μικρόβιο, ενώ στη μικροσκοπική εξέταση των ούρων ανευρίσκονται κόκκοι ή Gram-αρνητικά βακτηρίδια. Επίσης, το Mycobacterium tuberculosis και άλλα άτυπα μυκοβακτηρίδια μπορεί να βρεθούν σε καλλιέργειες για οξεάντοχα βακτήρια. Ο S. saprophyticus αποτελεί ένα από τα πιο κοινά αίτια λοιμώξεων 71

72 της ουροποιητικής οδού, με πιο συχνά συμπτώματα την αιματουρία, την πυουρία και τον πόνο στο λαγόνιο οστό (Hedman et al., 1991). Πίνακας 1.5: Αρνητικά κατά Gram βακτήρια Escherichia coli Proteus spp Providencia spp Klebsiella spp Pseudomonas spp Citrobacter spp Serratia spp Οι ουρολοιμώξεις αποτελούν την πιο συνηθισμένη αιτία νοσοκομειακών λοιμώξεων. Παραμονή του ουρητήρα για λιγότερο από μια βδομάδα επιφέρει ουρολοίμωξη σε ποσοστό που δεν ξεπερνά το 50 % των ασθενών. Αντίθετα, οι ασθενείς που καθετηριάζονται για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα θα εμφανίσουν ουρολοίμωξη σε ποσοστό που μπορεί να φτάσει το 100 % (Κωνσταντινίδης, Φέσκου, 2010). Παρατεταμένα επεισόδια ουρολοιμώξεων μπορούν να προκαλέσουν τη δημιουργία βιομεμβράνης. Η εξάπλωση της λοίμωξης των ουροφόρων οδών γίνεται με δύο τρόπους: μέσω της ανιούσας εισαγωγής των προσκολλημένων βακτηριακών βιομεμβρανών κατά μήκος του ουροκαθετήρα, καθώς και μέσω του γρήγορου και τυρβώδους ρυθμού ροής των πλαγκτονικών βακτηρίων από την προσκολλημένη βιομεμβράνη προς τα εμπρός. Επιπλέον, η παρουσία μικροβίων στον ουροσυλλέκτη επιτρέπει στα βακτήρια να φτάσουν τη κύστη μέσω της οδού παροχέτευσης και του αυλού του καθετήρα. Οι ασθενείς που φέρουν καθετήρα κύστεως για μικρό χρονικό διάστημα, αν και εμφανίζουν βακτηριουρία και αποικισμό του ουροκαθετήρα δεν έχουν τον κίνδυνο της συστηματικής λοίμωξης. Συνήθως σε αυτές τις περιπτώσεις οι βιομεμβράνες αποτελούνται από ένα είδος μικροοργανισμών, όπως Escherichia coli, Proteus mirabilis ή Klebsiella pneumoniae. Αντίθετα οι ασθενείς που φέρουν καθετήρα κύστεως για μεγάλο χρονικό διάστημα εμφανίζουν βιομεμβράνες που αποτελούνται από τα 72

73 περισσότερα είδη μικροβίων, συνηθέστερα από τα οποία είναι: S. epidermidis, E. coli, P. mirabilis και E. faecalis. Ο σχηματισμός βιομεμβρανών γύρω από την εξωτερική επιφάνεια του καθετήρα, καθώς και γύρω από το μπαλόνι συγκράτησης, μπορεί να προκαλέσει τραυματισμό του βλεννογόνου της κύστης ή της ουρήθρας. Η σημαντικότερη όμως παρενέργεια είναι η δημιουργία κρυστάλλων από είδη μικροοργανισμών που παράγουν ουρεάση και διασπούν την ουρία. Κατά τη διάσπαση της ουρίας παράγονται αμμωνία και ανθρακικά ιόντα. Με τον τρόπο αυτό αυξάνεται το ph των ούρων. Καθώς το περιβάλλον των ούρων γίνεται αλκαλικό ευνοείται η κατακρήμνιση αλάτων φωσφορικού μαγνησίου και φωσφορικού ασβεστίου. Η συνεχής συσσώρευση αυτών των κρυστάλλων στα ούρα και η δημιουργία αλάτων στην επιφάνεια της βιομεμβράνης του ουροκαθετήρα προκαλεί απόφραξη του αυλού. Κλινικά ο ασθενής θα εμφανίσει πόνο, πιθανή αιμοτουρία και διαρροή των ούρων γύρω από τον καθετήρα. Επιπλέον η παρουσία βακτηριουρίας που συνυπάρχει σε αυτούς τους ασθενείς, μαζί με την κατακράτηση των ούρων και την ενδεχόμενη κυστεοουρητηρική παλινδρόμηση λόγω των αυξημένων πλέον ενδοκυστικών πιέσεων, είναι παράγοντες που διευκολύνουν την ανιούσα λοίμωξη προκαλώντας πυελονεφρίτιδα και σηψαιμία. Ο Nomura και η ομάδα του αναφέρουν ότι το 25 % των ασθενών με μακράς διάρκειας χρήση υπερηβικού καθετήρα εμφάνισε λιθίαση της κύστης, η οποία συνοδεύτηκε με ph ούρων> 7.24 (Κωνσταντινίδης, Φέσκου, 2010). Επίσης όλα τα είδη καθετήρων Foley, συμπεριλαμβανομένων των καθετήρων με επικάλυψη αργύρου και εμποτισμένων με νιτροφουραζόνη, αποικίζονται από κρυσταλλικές βιομεμβράνες. Υπεύθυνοι μικροοργανισμοί που παράγουν ουρεάση είναι: K. pneumoniae, P. aeruginosa, M. morganii είδη Proteus συμπεριλαμβανομένου του P. mirabilis,μερικά είδη Providencia, στελέχη του S. aureus, καθώς και πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι. Από τους παραπάνω μικροοργανισμούς ο P. mirabilis απομονώνεται πιο συχνά στις καλλιέργειες ούρων ασθενών που παρουσιάζουν ίζημα και επαναλαμβανόμενη απόφραξη του καθετήρα. 3.1 Κακώσεις ουρητήρα Οι κακοήθεις στενώσεις του ουρητήρα μπορεί να οφείλονται σε εξωγενή ή ενδογενή αίτια που οδηγούν σε μηχανική απόφραξη της ουροφόρου οδού. Οι εξωγενείς 73

74 στενώσεις συνήθως οφείλονται σε επέκταση της πρωτοπαθούς κακοήθειας κατά συνέχεια ιστού με επακόλουθη συμπίεση ή διήθηση του τοιχώματος του ουρητήρα. Οι πιο συνηθισμένες κακοήθειες που οδηγούν σε εξωγενή ουρητηρική στένωση είναι οι κακοήθειες της πυέλου π.χ. γυναικολογικοί όγκοι (καρκίνος μήτρας, καρκίνος τραχήλου της μήτρας, καρκίνος ωοθηκών), όγκοι του γαστρεντερικού συστήματος (π.χ. καρκίνος ορθοσιγμοειδούς) και του ουροποιογεννητικού συστήματος (π.χ. καρκίνος προστάτη). Εξωγενής στένωση μπορεί επίσης να προκληθεί από λεμφαδενικές μεταστάσεις στην πύελο και σπανίως από μεταστάσεις περιουρητηρικές (van Beers et al., 2006). Ενδογενή στένωση προκαλούν οι πρωτοπαθείς όγκοι του ουρητήρα Ο πιο συχνός πρωτοπαθής όγκος είναι το καρκίνωμα εκ μεταβατικού επιθηλίου. Στην περίπτωση κακοήθων στενώσεων στις περισσότερες περιπτώσεις λόγω της σταδιακής απόφραξης τα συμπτώματα είναι λίγα ή απουσιάζουν. Ο πόνος δεν είναι συχνό σύμπτωμα αφού συνήθως προκαλείται από οξεία απόφραξη. Σε μερικές περιπτώσεις μπορεί να παρατηρηθεί πολυουρία ή νυκτουρία λόγω της μειωμένης ικανότητας συμπύκνωσης των ούρων, υπέρταση ή και ηλεκτρολυτικές διαταραχές. Το αποτέλεσμα της χρόνιας απόφραξης είναι η υδρονέφρωση και η σταδιακή έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας. Η αμφοτερόπλευρη πλήρης απόφραξη οδηγεί σε ανουρία και νεφρική ανεπάρκεια. Σε απόφραξη του ενός ουρητήρα στην περίπτωση που ο ετερόπλευρος ουρητήρας έχει καλή λειτουργικότητα η κρεατινίνη μπορεί να βρίσκεται σε σχεδόν φυσιολογικά επίπεδα και τα εργαστηριακά ευρήματα να είναι λίγα (Kirkali&Tuzel, 2003, Genega&Porter, 2002). Ποικίλες χειρουργικές επεμβάσεις έχουν περιγραφεί για την αποσυμφόρηση του ουρητήρα και της ουροποιητικής οδού. Η χρήση και η τοποθέτηση συνθετικών καθετήρων για την αποσυμφόρηση της ουροποιητικής οδού είναι η πιο κοινή λύση. Είναι δυνατή επίσης η τοποθέτηση συνθετικού καθετήρα δια μέσου διαδερμικής νεφροστομίας από τους επεμβατικούς ακτινολόγους. Έχουν περιγραφεί στην βιβλιογραφία και άλλες τεχνικές όπως για παράδειγμα η σύγχρονη ουρητηρική τοποθέτηση περισσότερων του ενός συνθετικών καθετήρων μεγάλης διαμέτρου σε περιπτώσεις όπου η τοποθέτηση ενός καθετήρα έχει αποτύχει. Η πιο πολλά υποσχόμενη τεχνική για την αντιμετώπιση των ουρητηρικών στενώσεων είναι η τοποθέτηση διάμεσου διαδερμικής νεφροστομίας μεταλλικών ουρητηρικών ενδοπροθέσεων (metallic ureteric stents). Τα μεταλλικά stent 74

75 φαίνεται ότι εμφανίζουν μεγαλύτερη αντίσταση στην συμπίεση από τον υποκείμενο όγκο, καλή αγκίστρωση στο τοίχωμα και μεγαλύτερη εσωτερική διάμετρο από τους συνθετικούς καθετήρες. Επιπλέον αποφεύγεται η ανάγκη αλλαγής των καθετήρων όπως συμβαίνει μετά από τοποθέτηση συνθετικών καθετήρων (Holmes et al., 1992). 4 Αντιβιοτικά Αμινογλυκοσίδες Οι αμινογλυκοσίδες είναι μια μεγάλη και διακριτή ομάδα αντιβιοτικών η οποία χαρακτηριστικά περιέχει δύο ή περισσότερα αμινοσάκχαρα συνδεδεμένα με γλυκοζιτικούς δεσμούς σε μια αμινοκυκλιτόλη. Η κυκλιτόλη είναι μια 2-δεοξυστρεπταμίνη στις περισσότερες περιπτώσεις, εξαίρεση αποτελεί η στρεπτομυκίνη, η οποία έχει ως κεντρική δομή τη στρεπτιδίνη. Οι αμινογλυκοσίδες μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σύμφωνα με πρότυπο αντικατάστασης της κυκλιτόλης. Οι πιο σημαντικές υποτάξεις είναι η 4,5- διϋποκατεστημένη δεοξυστρεπταμίνη, η οποία περιλαμβάνει τις νεομυκίνες και η 4,6- διϋποκατεστημένη δεοξυστρεπταμίνη, η οποία περιλαμβάνει τις gentamicin, kanamycin και Tobramycin (Εικόνα 1.30). Οι αμινογλυκοσίδες είναι ευρέως φάσματος αντιβιοτικά τα οποία έχουν βακτηριοκτόνο δράση έναντι μερικών Gram θετικών και αρκετών Gram αρνητικών βακτηρίων. Δεν είναι δραστικά έναντι αναερόβιων βακτηρίων. Η κλινική τους εφαρμογή είναι περιορισμένη λόγω των παρενεργειών της νεφροτοξικότητας και ωτοτοξικότητας και λόγω της αντοχής την οποία αποκτούν τα στελέχη και η οποία προκύπτει από τη δράσης τροποποιητικών ενζύμων των αμινογλυκοσίδων (Stead et al., 2000). 75

76 Εικόνα 1.30: Δομές διϋποκατεστημένης δεοξυστρεπταμίνης αμινογλυκοσιδών. 4.1 Ποσοτικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό των αμινογλυκοσιδών Έχουν προταθεί και χρησιμοποιηθεί πολλές τεχνικές για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αμινογλυκοσιδών. Μερικές από αυτές παρατίθενται παρακάτω (Πίνακας 1.6) και ιδιαίτερη σημασία θα δοθεί στην μέθοδο της άμεσης χημειοφωταύγειας, η οποία είναι και η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία για την ποσοτική μέτρηση του αντιβιοτικού. 76

77 Πίνακας 1.6: Ποσοτικές μέθοδοι προσδιορισμού αμινογλυκοσίδων. Μικροβιολογικές μέθοδοι Ραδιοχημικές μέθοδοι Ραδιοανοσολογικές μέθοδοι Ενζυμικές ανοσολογικές μέθοδοι Φθοροανοσολογικές μέθοδοι Άμεση μέθοδος χημειοφωταύγειας Νεφελομετρικές ανοσολογικές μέθοδοι Ανοσοιστοχημικές τεχνικές Φασματοφωτομετρικές τεχνικές Αέριας Χρωματογραφία (GC) Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) Ηλεκτροφόρηση Αυτή η μέθοδος είναι ανάλογη της ράδιο-ανοσολογικής τεχνικής RIA (RadioImmunoAssay), με εξαίρεση ότι εδώ η σήμανση γίνεται με εστέρες ακριδίνης. Το σήμα παράγεται μετά από διάσπαση του εστερικού δεσμού, απελευθερώνοντας Ν- μεθυλ-ακριδόνη η οποία αποσυντίθεται με την εκπομπή μιας έντονης λάμψης φωτός. Το ACS:180 το οποίο ξεκίνησε το 1991 από τα διαγνωστικά Chiron (ανατολική Walpole, MA, USA πρόσφατα τα απέκτησε η Bayer) ήταν το πρώτο ανοσολογικό σύστημα που χρησιμοποίησε αυτή τη μεθοδολογία. Ετερογενείς ανταγωνιστικές μέθοδοι είναι διαθέσιμες για την αμικασίνη, γενταμυκίνη και Tobramycin και χρησιμοποιούνται σήμερα από μερικά κλινικά χημικά εργαστήρια για την απεικόνιση των θεραπευτικών φαρμάκων. Το δείγμα (φάρμακο), το φάρμακο- εστέρας ακριδίνης (ιχνηθέτης) και το στερεάς φάσης αντιδραστήριο αντισωμάτων επωάζονται μαζί για 7 λεπτά. Στη συνέχεια ακολουθεί η φάση διαχωρισμού, κατά την οποία τα καλυμμένα με αντισώματα μικροσωματίδια οξειδίων σιδήρου κατακάθονται σε μαγνητικό πεδίο, η ποσότητα των ιχνηθετών στα οποία έχει προσδεθεί αντίσωμα υπολογίζεται με την προσθήκη ενός οξειδωτικού παράγοντα με φωτοπολλαπλασιαστική ανίχνευση της εκπομπής λάμψης μέσα σε 5 δευτερόλεπτα. Η ευαισθησία είναι τουλάχιστον όσο υψηλή όσο στη RIA και 77

78 καλύτερα από ότι στις περισσότερες μη- ισοτοπικές ανοσολογικές μεθόδους. Για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό αντιβιοτικών χρησιμοποιήθηκε ο ανοσολογικός αναλυτής ADVIA Centaur XP, ο οποίος βρίσκεται στο Βιοχημικό εργαστήριο του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Με στόχο να μελετηθεί η κατανομή των φαρμάκων στους ιστούς, απαιτούνται μέθοδοι οι οποίες μπορούν να ανιχνεύσουν την αναλυόμενη ουσία επί τόπου. Τέτοιες μελέτες είναι ιδιαίτερης σημασίας για φάρμακα τα οποία είναι γνωστό πως συγκεντρώνονται σε συγκεκριμένα όργανα προκαλώντας ζημιά σε συγκεκριμένα κύτταρα, παραδείγματος χάριν οι νεφροτοξικές και ωτοτοξικές επιδράσεις των αμινογλυκοσιδών (Stead et al., 2000). Η Tobramycin έχει μετρηθεί με εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία σε επιθηλιακά κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων του νεφρού ακολουθώντας μια ανοσολογική τεχνική. Τμήματα ιστών επωάστηκαν με αντι-τομπραμυκινικό αντιορό και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε δεύτερη σήμανση με αντίσωμα σημασμένο με κολλοειδή χρυσό. Η ανίχνευση της ετικέτας χρυσού με φωτο-θερμική μικροσκοπία επέτρεψε την ποσοτικοποίηση της Tobramycin σε ξεχωριστά κύτταρα κάτω από 10 zmol (10-21 mol). 78

79 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 79

80 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 80

81 1 Συσκευές και όργανα ADVIA Centaur Immunoassay System Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator, Sonics Vibra Cell) Αυτόκαυστο Επωαστικός κλίβανος (Thermo Forma, Series II, Water Jacketed, CO2 Incubator, Hepa Filter, model 3121) Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας (Mettler AE 166, Deltarange) Λουτρό Υπερήχων (Branson, Bransonic ultrasonic 2510) Λυχνία Bunsen Μαγνητικός αναδευτήρας (IKAMAG RH JANKE &KUNKEL) Μηχανικός αναδευτήρας - vortex (A-100 Micrel) Περιστρεφόμενος Eξατμιστήρας - Rotary Evaporator (BÜCHI RE 111) ph-μετρο (WTW, ph 522) Sputter Coater (Balzers SCD 004) Συσκευή λυοφιλοποίησης (FREEZE DRYER LABCONCO 4.5) Συσκευή εξώθησης μέσω φίλτρων (Extruder) Yδατόλουτρο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας (JULABO, FS 18) Φασματοφωτόμετρο - Spectrophotometer UV-VIS (Shimadzu UV 1205) Φθορισμόμετρο (Shimadzu, RF-5301 PC) Φυγόκεντρος (Biofuge 28 RS, HERAEUS SEPATECH) Ωσμόμετρο (Roembling auto cal type 13 DR automatic) Zeta-sizer Συσκευή μέτρησης μεγέθους και ζ-δυναμικο θ διασπορών MALVERN NANO-ZS (Malvern Nano-Zs, Malvern Instrument, UK) 2 Υλικά 2.1 Λιπίδια σε μορφή κόνεως: Φωσφατιδυλοχολίνη (Egg PC): (Lipoid), (Σε κόνη ή διάλυμα 100 mg/ml) DSPC (Διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη) (1,2-distearoyl-sn-glycerol-3- phosphatidylcholine) (Avanti Polar Lipids), (Σε κόνη ή διάλυμα 20 mg/ml) 81

82 DSPE -PEG2000: 1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy(polyethyleneglycol)-2000] (Avanti Polar Lipids), (Σε κόνη ή διάλυμα 10 mg/ml) DSPE-PEG(2000) Maleimide:1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 10 mg/ml Χοληστερόλη Cholesterol Sigma, (Σε κόνη ή διάλυμα 20 mg/ml) Διαλύματα αυτών των λιπιδίων προετοιμάστηκαν με διάλυσή τους σε οργανικό διαλύτη χλωροφόρμιο στις ανάλογες τελικές συγκεντρώσεις. Τα διαλύματα των λιπιδίων φυλάχθηκαν στην κατάψυξη στους -20 ο C. 2.2 Διαλύματα Παρασκευή διαλύματος καλσεΐνης 0,1 Μ Για την παρασκευή διαλύματος καλσεΐνης 0,1 Μ (25 ml) χρησιμοποιήθηκαν g στερεής καλσεΐνης (SIGMA) και g EDTA (SERVA). Οι ποσότητες αυτές ζυγίστηκαν και μεταφέρθηκαν σε κωνική φιάλη των 25 ml. Ακολούθησε προσθήκη 6 ml ρυθμιστικού διαλύματος PBS (ph=6.5) και 6 ml διαλύματος ΝαΟΗ 0.5 Ν και τοποθέτηση της κωνικής φιάλης σε μαγνητική πλάκα υπό ανάδευση. Μετά τη διάλυση των στερεών συστατικών και το σχηματισμό ομοιογενούς μίγματος ακολούθησε ρύθμιση του ph στο 6.5 με διάλυμα ΝαΟΗ 1 Ν. Το διάλυμα μεταφέρθηκε σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα PBS (ph=6.5) μέχρι τελικού όγκου 25 ml. Έπειτα το διάλυμα επιστράφηκε στην κωνική φιάλη και το ph έφτασε τελικά στο 6.5 με προσθήκη διαλύματος ΝαΟΗ 0.1 Ν. Το διάλυμα καλσεΐνης διατηρήθηκε στους 5 ο C Παρασκευή ρυθμιστικου διάλυματος PBS ph 6.5 Ζυγίστηκαν 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4, 0.48 g KH2PO4 και 0.4 g NaN3 και μεταφέρθηκαν σε κωνική φιάλη των 2 L. Στην συνέχεια ρυθμίστηκε το ph στο 6.5 και προστέθηκε dh2o μέχρι ο όγκος να φτάσει τα 2 L. Τέλος ρυθμίστηκε η ωσμωτικότητα. Το PBS που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή και τον καθαρισμό 82

83 των λιποσωμάτων, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην επώαση με τα βακτηριακά στελέχη δεν περιείχε νατραζίδιο (NaN3) Διάλυμα Tobramycin Παρασκευάστηκε πυκνό διάλυμα Tobramycin συγκέντρωσης ppm, διαλύοντας 100 mg φαρμάκου σε 10 ml PBS χωρίς NaCl ph 6.5. Αποθήκευση στους 4 0 C Διάλυμα φυσιολογικού ορού 0,9% NaCl (αποστειρωμένο) 2.3 Θρεπτικά υλικά και βακτηριακά στελέχη FBS (Fetal Bovine Serum) Θρυψίνη (Trypsin) 0,25% (σε PBS) Στερεό θρεπτικό υλικό: αιματούχο άγαρ (Blood Agar Base) Tryptic Soy Agar (TSA:BBL) Brain Heart Infusion Broth (BHIB, BBL) Πρότυπο στέλεχος S. epidermidis ATCC (slime-θετικό) το οποίο φέρει το οπερόνιο ica, είναι slime-θετικό και έχει αποδεδειγμένη ικανότητα παραγωγής βιομεμβράνης (biofilm). Πρότυπο στέλεχος S. epidermidis ATCC (slime-αρνητικό) το οποίο δεν φέρει το οπερόνιο ica, είναι slime-αρνητικό και δεν συνθέτει βιομεμβράνη (biofilm). Κλινικό στέλεχος S. epidermidis 4388 (slime-θετικό) το οποίο φέρει το οπερόνιο ica, είναι slime-θετικό και έχει αποδεδειγμένη ικανότητα παραγωγής βιομεμβράνης (biofilm). Κλινικό στέλεχος S. epidermidis 2264 (slime-αρνητικό) το οποίο φέρει το οπερόνιο ica, είναι slime-αρνητικό και δεν έχει ικανότητα παραγωγής βιομεμβράνης (biofilm). Τα στελέχη που αναφέρθηκαν φυλάσσονται στους -70 ο C σε υγρό θρεπτικό υλικό που περιέχει 70% TSB και 15% γλυκερόλη. 83

84 2.4 Καθαρισμός λιποσωμάτων Sephadex G-50, Sigma Chemical Co. Dialysis membranes (μεμβράνες διαπίδυσης), Sigma-Aldrich. 2.5 Αντιδραστήρια 1,2-αιθανοδιθειόλη (1,2-ethanedithiol, 1,2-EDT) Μέτρηση λιπιδίο- Αντιδραστήριο Steward: Διάλυμα Stewart, που παρασκευάζεται με διάλυση: g FeCl3 6 H2O (Iron (III) chloride hexahydrate) της Merck και g NH4 SCN (Ammonium thiocyanate) (Merck) σε 1 L D H2O Το διάλυμα είναι σταθερό σε θερμοκρασία δωματίου για 1-2 μήνες. Φυλάσσεται σε σκιερό μέρος. 3 Μέθοδοι 3.1 Προσδιορισμός λιπιδίου- Μέθοδος Steward H μέθοδοs Stewart χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να προσδιοριστεί η ακριβής συγκέντρωση των λιπιδίων στα λιποσωμικά δείγματα. Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα των φωσφολιπιδίων να σχηματίζουν σύμπλοκο με το σιδηροθειοκυανιούχο αμμώνιο σε οργανικό διάλυμα. Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι η παρουσία ανόργανου φωσφόρου δεν παρεμποδίζει την ανάλυση. Η συσχέτιση των τιμών απορρόφησης με τα μg του φωσφολιπιδίου πραγματοποιείται με κατασκευή αντίστοιχης καμπύλης αναφοράς. Προετοιμασία των πρότυπων διαλυμάτων και των δειγμάτων: Παρασκευάστηκαν 10 ml διαλύματος φωσφολιπιδίου PC (από δ/μα αρχικής συγκέντρωσης 20 mg/ml) σε χλωροφόρμιο σε συγκέντρωση 0.1 mg/ml. Αναλυτική μέθοδος: i. Ετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 10 ml όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.1. ii. Στη συνέχεια, ανακινήθηκαν ισχυρά τα δείγματα με vortex επί 1 min. 84

85 iii. Ακολούθησε είτε φυγοκέντρηση για 5 min στις 5000 rpm είτε παραμονή των δειγμάτων για min σε κατάσταση ηρεμίας, ώστε να διαχωριστούν οι φάσεις. iv. Αφαιρέθηκε προσεκτικά η υπερκείμενη υδατική φάση με τη βοήθεια αντλίας κενού και μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση του λιπιδίου στα 485 nm (Διάγραμμα 2.1). Πίνακας 2.1: Διαλύματα για πρότυπη καμπύλη Stewart Δείγμα Ποσότητα λιπιδίου (μg) Πρότυπο διάλυμα λιπιδίου (ml) Χλωροφόρμιο (ml) Σιδηροθειοκυανιούχο 0.1 Μ (ml) Διάγραμμα 2.1: Πρότυπη καμπύλη Steward (για μέτρηση της συγκέντρωσης φωσφολιπιδίων). 85

86 Μέτρηση OD: i. Ανοίγουμε το UV/VIS φασματοφωτόμετρο ii. Ρυθμίζουμε το μήκος κύματος στα 485 nm iii. Μηδενίζουμε με χλωροφόρμιο (τυφλό) iv. Μετράμε τα δείγματα ξεκινώντας από το αραιότερο στο πυκνότερο Η μέτρηση της οπτικής απορρόφησης πραγματοποιήθηκε στα 485 nm. Ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε χλωροφόρμιο και η μέτρηση της απορρόφησης στα δείγματα ξεκίνησε από τα αραιότερα προς τα πυκνότερα. Βάσει της καμπύλης αναφοράς που πρόεκυψε, υπολογίστηκε η ποσότητα (μg) και τελικώς η συγκέντρωση του λιπιδίου (mg/ml) στο κάθε δείγμα εργασίας. Με τη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω υπολογίστηκε η συγκέντρωση του λιπιδίου στα αρχικά δείγματα. Σε ποσότητα του λιποσωμικού εναιωρήματος (20 μl) προστέθηκαν 2 ml CHl3 και 2 ml αντιδραστηρίου Stewart. Όπου χρειάστηκε, το δείγμα αραιώθηκε κατάλληλα. 3.2 Προσδιορισμός Tobramycin - Άμεση Χημειοφωταύγεια (Direct Chemiluminescence Immunoassay- CIA) Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε για την μέτρηση της Tobramycin είναι αυτή της άμεσης χημειοφωταύγειας (Direct Chemiluminescence Immunoassay- CIA) και πραγματοποιήθηκε στο Βιοχημικό Εργαστήριο του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ο ανοσολογικός αναλυτής ADVIA Centaur Tobramycin System Πρότυπη καμπύλη αναφοράς για προσδιορισμό συγκέντρωσης Tobramycin στα δείγματα. Παρασκευάστηκε πρότυπο διάλυμα Tobramycin 1000 ppm και από αυτό προέκυψε με κατάλληλη αραίωση ένα καινούργιο διάλυμα Tobramycin (1) συγκέντρωσης 20 ppm και τελικού όγκου 5 ml σε PBS ph 6.5. Τα υπόλοιπα διαλύματα παρασκευάστηκαν όπως φαίνονται στον Πίνακα

87 Δείγμα Πίνακας 2.2: Πρότυπα διαλύματα για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης προσδιορισμού συγκέντρωσης Tobramycin. Συγκέντρωση πρότυπου δ/τος Tobramycin (ppm) Πρότυπο δ/μα Tobramycin (μl) PBS (ml) Μέτρηση Tobramycin με CIA (ppm) Διάγραμμα 2.2: Πρότυπη καμπύλη Tobramycin. 3.3 Προσδιορισμός εγκλωβισμένης καλσεΐνης - Πρότυπη καμπύλη καλσεΐνης Η πρότυπη καμπύλη της καλσεΐνης κατασκευάστηκε ώστε να είναι δυνατή η μέτρηση της εγκλωβισμένης Καλσεΐνης στα λιποσώματα που παρασκευάστηκαν. Η καλσεΐνη αποτελεί μια χρωστική ουσία, η οποία ι εκπέμπει φθορισμό σε μήκος κύματος 520 nm όταν διεγερθεί σε μήκος κύματος 470 nm. Παρασκευάστηκε καλσεΐνη με ph Μ. Από αυτό το διάλυμα με διαδοχικές αραιώσεις με PBS ph 6.5 προέκυψαν οι συγκεντρώσεις που παρουσιάζονται στον Πίνακα

88 Πίνακας 2.3: Τιμές συγκέντρωσης και έντασης φθορισμού (FI) καλσείνης για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης της καλσείνης. Δείγμα Συγκέντρωση Φθορισμός (FI) καλσείνης (μμ) 1 0, ,5 2 0, ,0 3 0, ,9 4 0, ,3 5 0,0031 4,9 6 0,0007 1,7 Διάγραμμα 2.3: Πρότυπη καμπύλη καλσεΐνης. Σε αυτό το σημείο και αφού περιγράφησαν οι γενικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι σκόπιμο να αναφερθεί πως η εργασία αυτή χωρίστηκε σε τρεις επιμέρους ενότητες. 1. Αρχικά έγινε μελέτη εγκλωβισμού Tobramycin σε διαφορετικά λιποσωμικά παρασκευάσματα, με σκοπό την επιλογή του τύπου λιποσώματος με τις βέλτιστες 88

89 ιδιότητες (καλός φυσικοχημικός χαρακτηρισμός/υψηλή δυνατότητα εγκλωβισμού ΤΟΒ). 2. Στην συνέχεια έγινε προσπάθεια να αποδειχθεί η ικανότητα ακινητοποίησης των λιποσωμάτων σε μεταλλικές επιφάνειες, και να εντοπιστούν οι άριστες πειραματικές συνθήκες. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα SS-316, οι οποίες επικαλύφθηκαν με χρυσό με τη μέθοδο sputtering και χρησιμοποιήθηκαν λιποσώματα με εγκλωβισμένη καλσεΐνη για ακινητοποίηση τους στις επιφάνειες, επειδή φθορίζει και είναι εύκολο να ανιχνευθεί. 3. Τέλος επιβεβαιώθηκε πειραματικά η αντιμικροβιακή προστασία των τελικών επιφανειών, αφού ακινητοποιήθηκαν πάνω στις επιφάνειες αυτές, λιποσώματα που εγκλωβίζουν TOB. 3.4 Μελέτη εγκλωβισμού Tobramycin Παρασκευάστηκαν διαφορετικοί τύποι λιποσωμάτων, διαφορετικών συστάσεων (Πίνακας 2.4), τα οποία εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να εγκλωβίζουν Tobramycin, ώστε να επιλεγεί η βέλτιστη τεχνική και λιπιδική σύσταση. Πίνακας2. 4: Λιποσωμικές συστάσεις που παρασκευάστηκαν. Τύπος Λιποσώματος Σύσταση Λιποσώματος MLV, DRV, SUV, EXT-DRV PC/Chol 2:1 MLV, DRV, SUV, EXT-DRV DSPC/Chol 2:1 MLV, DRV PC/Chol 1:1 MLV, DRV DSPC Πολυστιβαδιακά λιποσώματα που εγκλωβίζουν Tobramycin (MLV) Τα πολυστιβαδιακά λιποσώματα (MLV) παρασκευάστηκαν με την μέθοδο του λεπτού υμενίου (thin film method). Τα διαλυμένα σε οργανικούς διαλύτες λιπίδια μεταφέρθηκαν σε σφαιρική φιάλη και τοποθετήθηκαν σε περιστρεφόμενο εξατμιστήρα (rotary evaporator), ούτως ώστε να απομακρυθούν οι οργανικοί διαλύτες. Η διαδικασία 89

90 πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία πάνω από την θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων. Μετά τον σχηματισμό του λεπτού υμενίου στα τοιχώματα της σφαιρικής φιάλης, η περίσσεια οργανικού διαλύτη απομακρύνθηκε με την εφαρμογή ρεύματος αζώτου. Ακολούθησε ενυδάτωση του υμενίου με 1 ml διάλυμα Tobramycin και η φιάλη αναδεύτηκε μηχανικά (vortex) μέχρι την αποκόλληση του υμενίου από τα τοιχώματα της φιάλης, με την παράλληλη χρήση λουτρού υπερήχου (για την εξομάλυνση της επιφάνειας των λιποσωμάτων), το οποίο βρίσκεται σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από αυτή της θερμοκρασίας μετάπτωσης του λιπιδίου. Τελικά, προέκυψε ένα θολερό διάλυμα πολυστιβαδιακών λιποσωμάτων μεγάλου μεγέθους και τα λιποσώματα τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο με θερμοκρασία μεγαλύτερη από αυτή της θερμοκρασίας μετάπτωσης του λιπιδίου για περίπου μια ώρα, ούτως ώστε να γίνει η κατάλληλη οργάνωση των λιποσωμικών στιβάδων (annealing). Σε τελικό στάδιο πραγματοποιήθηκε ο καθαρισμός των MLVs από την ελεύθερη Tobramycin που δεν εγκλωβίστηκε στα λιποσώματα με την μέθοδο των διαδοχικών φυγοκεντρήσεων (14000 rpm/min). Πιο συγκεκριμένα φυγοκεντρήθηκε η λιποσωμική διασπορά για 30 λεπτά. Γίνεται απόρριψη του υπερκειμένου, πραγματοποιήθηκε επαναδιασπορά του ιζήματος με 1 ml PBS και επανάληψη της φυγοκέντρησης. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε μέχρι το υπερκείμενο να είναι διαυγές Μονοστιβαδιακά λιποσώματα που εγκλωβίζουν Tobramycin (SUV) Για την παρασκευή των μονοστιβαδιακών λιποσωμάτων ακολουθήθηκε η ίδια πορεία όπως για την παρασκευή των MLV με την διαφορά ότι μετά την διαδικασία της ενυδάτωσης, τα λιποσώματα τοποθετήθηκαν σε ακίδα υπερήχων για μεγαλύτερη μείωση του μεγέθους τους. Πιο συγκεκριμένα η λιποσωμική διασπορά τοποθετήθηκε σε γυάλινο φιαλίδιο με διάμετρο μεγαλύτερη από αυτήν της ακίδας και η ακίδα βυθίστηκε στο φιαλίδιο, ώστε το κατώτερο σημείο της να είναι λίγο πιο πάνω από το κέντρο καμπυλότητας του πυθμένα του φιαλιδίου. Λόγω της υψηλής θερμοκρασίας που δημιουργήθηκε κατά την διαδικασία, το γυάλινο φιαλίδιο βυθίστηκε σε ποτήρι ζέσεως με κρύο νερό. Η μείωση μεγέθους των λιποσωμάτων και ο σχηματισμός των SUV έγινε αντιληπτός όταν η θολερή λιποσωμική διασπορά διαύγασε. Ακολούθησε φυγοκέντρηση 90

91 των λιποσωμάτων για 15 λεπτά σε στροφές/λεπτό και καθαρισμός τους από τυχόν ρινίσματα τιτανίου, που προέρχονταν από την μεταλλική ακίδα των υπερήχων και που θα μπορούσαν να έχουν μολύνει το δείγμα. Τέλος πραγματοποιήθηκε καθαρισμός των λιποσωμάτων από την μη εγκλωβισμένη Tobramycin. Για τον σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος της χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού, κατά την οποία χρησιμοποιήθηκε στήλη Sephadex G50 (1x35 cm), η οποία περιέχει τη γέλη. Ως εκλούτης χρησιμοποιείται ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα PBS, έτσι ώστε τα λιποσώματα να μην υφίστανται λύση λόγω οσμωτικής διαφοράς περιεχομένου και εκλούτη Αφυδατωμένα ενυδατωμένα λιποσώματα (DRV) που εγκλωβίζουν Tobramycin Τα DRV λιποσώματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία όπως για την παρασκευή των SUV λιποσωμάτων, μόνο που το μέσο ενυδάτωσης που χρησιμοποιήθηκε μετά την δημιουργία του λεπτού υμενίου ήταν 1 ml από 10 % PBS (Antimisiaris, S. 2010). Στην συνέχεια, αφού γίνει η ελάττωση του μεγέθους τους με την χρήση της ακίδας υπερήχων και η φυγοκέντρηση της λιποσωμικής διασποράς για την απομάκρυνση των ρινισμάτων τιτανίου, προστίθεται το διάλυμα της Tobramycin (1 ml) και το δείγμα ψύχεται με την χρήση υγρού αζώτου και ξηραίνεται κατά τη διάρκεια της νύχτας (18 ώρες). Ακολουθελι ανασύσταση και επαναενυδάτωση των λιποσωμάτων με την εξής διαδικασία: 1. Προσθήκη 100 μl dh20 (10% του τελικού επιθυμητού όγκου) στη στερεή μάζα που προέκυψε μετά την λυοφιλιοποίηση, έντονη μηχανική ανάδευση (vortex) και παραμονή του δείγματος για 30 λεπτά σε κατάσταση ηρεμίας σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου. 2. Προσθήκη 100 μl dh20 (10% του τελικού επιθυμητού όγκου), όπως ακριβώς και στο βήμα 1 και παραμονή του δείγματος για 30 λεπτά σε κατάσταση ηρεμίας σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου. 3. Προσθήκη 800 μl (80% του τελικού επιθυμητού όγκου) PBS ph 6.5, μηχανική ανάδευση και παραμονή του δείγματος για 30 λεπτά σε κατάσταση ηρεμίας σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από τη θερμοκρασία μετάπτωσης του λιπιδίου. 91

92 Κατόπιν, πραγματοποιήθηκε μείωση του μεγέθους της λιποσωμικής διασποράς με την τεχνική της εξώθησης μέσω φίλτρων, αρχικά από φίλτρα που έχουν πόρους μεγέθους 400 nm και στη συνέχεια από φίλτρα που φέρουν πόρους των 100 nm. Στη συνέχεια τα λιποσώματα καθαρίστηκαν από την ελεύθερη Tobramycin με χρήση στήλης Sephadex G-50 και το δείγμα συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στο ψυγείο μέχρι την περαιτέρω χρήση του. Έτσι παρασκευάστηκαν λιποσώματα extruded-drv (ext-drv). 3.5 Ακινητοποίηση λιποσωμάτων με εγκλωβισμένη καλσεΐνη σε επιχρυσωμένες μεταλλικές επιφάνειες Επίστρωση επιφανειών με χρυσό Για την πραγματοποίηση του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν μεταλλικές επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα SS-316, διαμέτρου 1 cm. Οι επιφάνειες επιστρώθηκαν με χρυσό, πάχους 100 nm, με την μέθοδο sputtering. Κατά τη διαδικασία αυτή μια ηλεκτρική εκκένωση (αέριο φορτισμένων σωματιδίων) διατηρείται πάνω από τον στόχο. Αυτός διατηρείται σε μια αρνητική τάση μερικών εκατοντάδων Volts, δηλαδή αποτελεί μια κάθοδο, οπότε και βομβαρδίζεται από τα θετικά ιόντα αργού που αποτελούν το πλάσμα Έτσι, άτομα του στόχου αποκτούν μεγάλη ενέργεια και αποσπώνται από το στόχο είτε αυτούσια είτε υπό μορφή ενώσεως με το αέριο του πλάσματος. Μερικά από αυτά ξαναγυρνάνε στο στόχο, άλλα αποτίθενται στις εσωτερικές επιφάνειες του θαλάμου κενού και άλλα στη πορεία τους συναντούν το υπόστρωμα (μεταλλικές πλάκες) όπου συμπυκνώνονται και σχηματίζουν ένα λεπτό υμένιο. Η όλη διαδικασία (καθοδική sputtering) μπορεί να συγκριθεί με μια λεπτόκοκκη αμμοθύελα όπου η ορμή των σωματιδίων άμμου είναι καθοριστικότερη ποσότητα από την ίδια τους την ενέργεια. Όταν τα ιόντα Αργού προσκρούουν στην επιφάνεια του στόχου, ουδετεροποιούνται προσλαμβάνοντας ηλεκτρόνια και μερικά 'θάβονται' στην επιφάνεια του στόχου, ενώ τα περισσότερα εξοστρακίζονται προς τα πίσω, όπoυ και επαναϊονίζονται με αποτέλεσμα η όλη διαδικασία να είναι αυτοσυντηρούμενη (Σχήμα 2.1). 92

93 Σχήμα 2.1: Απεικόνιση της διαδικασίας sputtering. Τα ηλεκτρόνια συσσωρεύονται στον τόρο που δημιουργεί το μαγνητικό πεδίο ( Παππάς Σπυρίδων, 2008) Παρασκευή και χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Παρασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν, ως προς το μέγεθος και το δυναμικό τους, extruded-drv λιποσώματα που εγκλωβίζουν διάλυμα καλσεΐνης 0,1 Μ, των οποίων η σύσταση φαίνεται στον Πίνακα 2.5. Πίνακας 2.5: Λιποσωμικές συστάσεις DRV Λιποσώματα Σύσταση Λιποσώματος 1 DSPC/Chol (2:1)/ PEG 4 mole%/ maleimide 0,1 mole% 2 DSPC/Chol (2:1)/ PEG 4 mole%/ maleimide 1 mole% 3 DSPC/Chol (2:1)/ PEG 8 mole%/ maleimide 0,1 mole% 4 DSPC/Chol (2:1)/ PEG 8 mole%/ maleimide 1 mole% Καθεμία από τις παραπάνω λιποσωμικές συστάσεις αφέθηκε για 3 ώρες, στους 25 0 C σε ph 6.5 ούτως ώστε να αντιδράσει το μαλεϊμίδιο (Lipid-maleimide), το οποίο βρισκόταν ενσωματωμένο στα λιποσώματα, με περίσσεια 1,2-αιθανοδιθειόλη (1,2-EDT). Τα δείγματα καθαρίστηκαν από το 1,2-EDT που δεν είχε αντιδράσει με το lipid- 93