«ΣΥΝΔΕΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΕΣ, ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΘΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ, ΜΕ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟ ΔΕΣΜΟ»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΣΥΝΔΕΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΕΣ, ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΘΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ, ΜΕ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟ ΔΕΣΜΟ» Για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώµατος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιοµηχανική Φαρµακευτική και Ανάλυση Φαρµάκων» ΜΙΧΑΗΛ Γ. ΚΑΣΤΕΛΛΟΡΙΖΙΟΣ Φαρµακοποιός ΠΑΤΡΑ 2012

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΣΥΝΔΕΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΣΕ ΕΠΙΦΑΝΕΙΕΣ, ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΘΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΜΕ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ, ΜΕ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΟ ΔΕΣΜΟ» ΜΙΧΑΗΛ Γ. ΚΑΣΤΕΛΛΟΡΙΖΙΟΣ Φαρµακοποιός ΠΑΤΡΑ 2012 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σοφία Αντιµησιάρη Καθηγήτρια Τµήµατος Φαρµακευτικής Παύλος Κλεπετσάνηs Επίκουρος Καθηγητής Τµήµατος Φαρµακευτικής Δηµήτριος Ματαράs Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµατος Χηµικών Μηχανικών

3 στους γονείς μου...

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρµακευτικής Τεχνολογίας του τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράµµατος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιοµηχανική Φαρµακευτική και Ανάλυση Φαρµάκων». Θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Σοφία Αντιµησιάρη, Καθηγήτρια του Τµήµατος Φαρµακευτικής για την ανάθεση του θέµατος και την πολύτιµη βοήθειά της κατά τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Παύλο Κλεπετσάνη και τον κ. Δηµήτριο Ματαρά για τη συνεισφορά τους καθώς και όλα τα µέλη του εργαστηρίου Φαρµακευτικής Τεχνολογίας για την άψογη συνεργασία. Τέλος, οφείλω ένα µεγάλο ευχαριστώ στην οικογένεια και τους φίλους µου για την στήριξη που µου προσφέρουν και την πίστη τους σε µένα. i

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ. Τις τελευταίες δεκαετίες υπάρχει µια αυξανόµενη ζήτηση για βιοσυµβατά υλικά ικανά να χρησιµοποιηθούν σαν πρόσθετα στο ανθρώπινο σώµα, σαν βάσεις για ελεγχόµενη χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων, σαν εµφυτεύµατα κ.α. χωρίς να προκαλούν ανοσοποιητική αντίδραση από τον αργανισµό. Μέχρι και σήµερα δεν έχει βρεθεί το υλικό που θα ξεγελάσει τους αµυντικούς µηχανισµούς του σώµατος, µε άλλα λόγια, να είναι αόρατο από το σώµα. Έχουν γίνει πολλές προσπάθειες και έχουν εφαρµοστεί διάφορες προσεγγίσεις. Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερες ερευνητικές οµάδες επενδύουν σε υλικά τα οποία απελευθερώνουν ελεγχόµενα βιοδραστικές ουσίες που καταστέλουν την αντίδραση του οργανισµού. Μια τέτοια ουσία είναι η ηπαρίνη, ένα φυσικό αντιπηκτικό το οποίο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την αύξηση της αιµοσυµβατότητας αρτηριακών ενδοπροσθέσεων. Αναπτύξαµε µια µέθοδο για την οµοιοπολική, µη αναστρέψιµη πρόσδεση λιποσωµάτων σε µεταλλικές επιφάνειες, οι οποίες έχουν υποστεί επεξεργασία µε τεχνολογία πλάσµατος. Οι επιφάνειες φέρουν ελεύθερες καρβοξυλοµάδες τις οποίες µπορούµε να εκµεταλλευτούµε για να συζεύξουµε πάνω τους λιποσώµατα µε αµινοµάδες στην επιφάνειά τους (functionalized), µέσω δηµιουργίας αµιδικού δεσµού. Οι µεταλλικές επιφάνειες που χρησιµοποιήσαµε ήταν SS-316 µεταλλικοί δίσκοι επεξεργασµένοι µε τεχνολογία πλάσµατος, και τις προµηθευτήκαµε από το Τµήµα Χηµικών Μηχανικών του Πανεπιστηµίου Πατρών και από το τµήµα Χηµείας του Πανεπιστηµίου του Μπάρι. Χρησιµοποιήσαµε µικρά µονοστιβαδιακά λιποσώµατα (SUV) διαµέτρου της τάξης των 100 nm, µε διάφορες λιπιδικές συστάσεις (PC, PC:Chol 4:1, DSPC:Chol 2:1). Χαρακτηρίσαµε τα functionalized λιποσώµατά ως προς την ικανότητά τους να εγκλωβίζουν ηπαρίνη, το µέγεθος, τη διασπορά µεγέθους, το φορτίο της επιφάνειάς τους και τη σταθερότητά τους σε διάφορες συνθήκες. Τα αποτελέσµατά µας δείχνουν ότι γενικά τα functionalized λιποσώµατα συµπεριφέρονται σαν τυπικά λιποσώµατα που φέρουν λιπίδιο µε PEG οµάδα (pegylated λιποσώµατα), ενώ για βέλτιστο εγκλωβισµό ηπαρίνης σηµαντικό είναι το στάδιο λυοφιλοποίησης / επανασύστασης κατά την παρασκευή τους. ii

6 Αποδείξαµε ότι τα functionalized λιποσώµατα µπορούν να προσδεθούν σε µεταλλικές επιφάνειες (κατάλληλα επεξεργασµένες) διατηρώντας τη δοµή τους και φέροντας ηπαρίνη ή άλλη υδρόφιλη ουσία στο εσωτερικό τους. Εφαρµόσαµε ένα απλό πρωτόκολλο δηµιουργίας αµιδικού δεµσού, και το βελτιστοποιήσαµε ώστε να πάρουµε µέγιστη απόδοση στη σύνδεση των λιποσωµάτων στις επιφάνειες (58,4 ± 8.6 µg λιπιδίου ανά cm 2 επιφάνειας). iii

7 ABSTRACT. Over the last couple of decades there has been an increasing need for more biocompatible, more body friendly materials that can be used in cases of subcutaneous, endoarterial or other type of implantations, as artificial body parts, drug releasing bases or biosensor implantations. The main desired quality of these materials is the lack to trigger the body s defensive mechanisms and foreign body response reactions. Up to this date there has not been a material with the ability to camouflage itself and be invisible to the human body. Lately, scientists show an increasing interest in materials that can elute bioactive molecules, which can suppress the body s immune reactions. One substance with this capability is heparin, a natural anticoagulant that can (and is currently being) used in order to improve the haemocombatibility of stents. We developed a method to covalently attach liposomes on metallic surfaces that have been treated with plasma technology so that they demonstrate free carboxylgroups. We can manipulate these groups to attach amino-group containing liposomes (functionalized) on the metallic surfaces via amidic bond formation. The metallic surfaces that were used were SS-316 metallic rods treated with plasma. They were provided by two different research laboratories, one in the University of Patras (department of Chemical Engineering) and one in the University of Bari (department of Chemistry). The two groups employed different plasma treatment procedures. We used Small Unilamellar Vesicles (SUV liposomes) whose diameter was in the range of 100 nm and were consisted of various lipid compositions (PC, PC:Chol 4:1, DSPC:Chol 2:1). The functionalized liposomes were physicochemically characterized (size, size distribution, ζ potential, drug retention) under various conditions. We discovered that the amino-liposomes demonstrate typical pegylated liposome behavior. Moreover, we found that the amount of heparin trapped in the vesicles dramatically increases when a step of freeze-drying / rehydration is included in their preparation protocol. We encapsulated a hydrophilic dye, calcein, in the liposomes. This allowed us to easily detect the presence of intact liposomes on the metallic surfaces, as well as to accurately quantify the amount of lipid attached. We applied a simple and widely used iv

8 protocol to create an amidic bond between the amino group of the liposomes and the carboxyl group of the metallic surfaces and we further optimized it to achieve the optimum reaction efficacy. (58,4 ± 8.6 µg lipid per cm2 surface) v

9 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ CHOL CMC DRV DSE DSPC FTS GDT IgE IgG IL IUV LUV MLV PC PCS PE PEG PG PI PS Χοληστερόλη Κρίσιµη Συγκέντρωση Μικκυλίων Αφυδατωµενα Ενυδατωµένα Σωµατίδια Διαφορική Θερµιδοµετρία Σάρωσης Διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη Ψύξη Απόψηξη Υπερήχηση Εκφόρτιση λόγω Θερµότητας Ανοσοσφαιρίνη Ε Ανοσοσφαιρίνη G Ιντερλευκίνη Μεσαίου Μεγέθους Μονοστοιβαδιακά Σωµατίδια Μεγάλα Μονοστοιβαδιακά Σωµατίδια Μεγάλα Πολυστοιβαδιακά Σωµατίδια Φωσωατιδυλχολίνη Φασµατοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων Φωσφατιδυλαιθανολαµίνη Πολυαιθυλενογλυκόλη Φωσφατιδυλγλυκερόλη Φωσφατιδυλινοσιτόλη Φωσφατιδυλσερίνη vi

10 PLLA RES SUV Tm TNF ΑΕΕ ΕΑ ΕΜ ΕΠ ΕΤ ΕΦ ΠΑΝ ΥΔ Πολυ-l-Λακτικό Οξύ Δικτυοενδοθηλιακό Σύστηµα Μικρά Μονοστοιβαδιακά Σωµατίδια Θερµπκρασία Μετάπτωσης Παράγοντας Νέκρωσης Όγκου Αγγειακό Εγκεφαλικό Επεισόδιο Ενδοαρτηριακή Οδός Ενδοµυική Οδός Ενδοπεριτονιακή Οδός Ενδοτραχειακή Οδός Ενδοφλέβια Οδός Περοφερική Αγγειακή Νόσος Υποδόρια Οδός vii

11 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ. i ΠΕΡΙΛΗΨΗ... ii ABSTRACT iv ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... vi 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ Γενικά Δοµικά Στοιχεία Χαρακτηριστικά Λιποσωµάτων Λιπίδια Θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης (Phase transition -Tm) Χοληστερόλη και o ρόλος της Ταξινόµηση των λιποσωµάτων Ταξινόµηση µε βάση το µέγεθος Ταξινόµηση µε βάση τη σύσταση και τις εφαρµογές Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Μηχανική διασπορά Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator) Εξώθηση µέσω φίλτρων Χρήση Γαλακτωµατοποιητή Εξώθηση σε θάλαµο εφαρµογής µεγάλης πίεσης Ένεση λιπιδίων Δηµιουργία µικτών µικκυλίων µε απορρυπαντικά Άλλες ειδικές µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Αφυδατωµένα Ενυδατωµένα Σωµατίδια (DRV) Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση. 22

12 Τεχνική ενός βήµατος (one step method) Μέθοδοι καθαρισµού λιποσωµάτων Χρωµατογραφία στήλης (Gel filtration - Column Chromatography) Διαπίδυση (Dialysis) Φυγοκέντρηση (Centrifugation) Δυναµικό επιφάνειας λιποσωµάτων (ζ-δυναµικό) Μεταβολική πορεία των λιποσωµάτων στον οργανισµό Οδοί χορήγησης λιποσωµικών µορφών Παρεντερική χορήγηση Τοπική χορήγηση λιποσωµάτων Xορήγηση per os Λιποσώµατα: Εφαρµογές Ως φορείς εµβολίων Ως αντιµικροβιακά Λιποσώµατα στη θεραπεία του καρκίνου Άλλες εφαρµογές των λιποσωµάτων Λιποσώµατα Ηπαρίνη ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ Ορισµός Εφαρµογές ΑΓΓΕΙΟΠΛΑΣΤΙΚΗ Αθηροσκλήρυνση Ενδοπροσθέσεις Μετεγχειρητικές επιπλοκές Αντιµετώπιση ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

13 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όργανα και υλικά Όργανα Υλικά Παρασκευή λιποσωµάτων Παρασκευή διαλύµατος καλσεΐνης 0.1 Μ Μέτρηση Συγκέντρωσης Λιπιδίου Ποσοτικός προσδιορισµός ηπαρίνης Πειράµατα ακινητοποίησης λιποσωµάτων σε µεταλλικές επιφάνειες Μέθοδοι Παρασκευή µικρών µονοστοιβαδιακών λιποσωµάτων (SUV) που εγκλωβίζουν καλσεΐνη ή ηπαρίνη Διαχωρισµός ελεύθερης από την εγκλωβισµένη στα λιποσώµατα καλσεΐνη (SUV) Διαχωρισµός ελεύθερης από την εγκλωβισµένη στα λιποσώµατα ηπαρίνη (SUV) Παρασκευή αφυδατώµενων ενυδατωµένων λιποσωµάτων (DRV) που εγκλωβίζουν ηπαρίνη Διαχωρισµός ελεύθερης από την εγκλωβισµένη στα λιποσώµατα ηπαρίνη (DRV) Παρασκευή δεύτερης γενιάς µικρών µονοστοιβαδιακών λιποσωµάτων (SUV) που εγκλωβίζουν ηπαρίνη Προσδιορισµός λιπιδίου-μέθοδος Stewart (Anal.Biochemica, 1980) Ποσοτικός προσδιορισµός εγλωβισµένης ηπαρίνης στα λιποσώµατα Προσδιορισµός µεγέθους και ζ δυναµικού λιποσωµάτων Μέτρηση σταθερότητας λιποσωµάτων Πειράµατα ακινητοποίησης λιποσωµάτων σε µεταλλικές επιφάνειες... 57

14 Ακινητοποίηση λιποσωµάτων σε µεταλλικούς δίσκους Εκτίµηση της πρόσδεσης των λιπιδίων στις µεταλλικές επιφάνειες Προκαταρτικά πειράµατα βελτίωσης αιµοσυµβατότητας µεταλλικών επιφανειών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παρασκευή και χαρακτηρισµός λιποσωµάτων Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν καλσεΐνη Μέτρηση λιπιδίου Μέτρηση καλσεΐνης Μέτρηση διασποράς µεγέθους και ζ δυναµικού των λιποσωµάτων Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη Καθαρισµός SUV λιποσωµάτων από ελέυθερη ηπαρίνη Προσδιορισµός ηπαρίνης Μέτρηση διασποράς µεγάθους και ζ δυναµικού των λιποσωµάτων Μελέτες σταθερότητας λιποσωµάτων Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν καλσεΐνη Σταθερότητα SUV λιποσωµάτων σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph Σταθερότητα SUV λιποσωµάτων σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4 παρουσία µεταλικών επιφανειών επεξεργασµένες µε τεχνολογία πλάσµατος Μακροχρόνια (3 µήνες) σταθερότητα SUV λιποσωµάτων σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4 στους 4 ο C (shelf life) Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη Φωτοµετρική µέθοδος Μέθοδος µε µέτρηση του χρόνου πήξης του αίµατος Ακινητοποίηση λιποσωµάτων σε µεταλλικές επιφάνειες ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 90

15 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

16 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ Γενικά Τα λιποσώµατα (µικροτεµαχιδιακά λιπιδικά σωµατίδια) είναι υπό εκτεταµένη έρευνα για περισσότερα από 20 χρόνια για χρήση ως φορείς βελτιωµένης µεταφοράς για ένα ευρύ φάσµα παραγόντων. Σε αυτούς περιλαµβάνονται χηµειοθεραπευτικοί παράγοντες, αντιγόνα, ανοσοτροποποιητές, χηλικές ενώσεις, αιµογλοβίνη και συµπαράγοντες, λιπίδια και γενετικό υλικό. Στόχος οποιουδήποτε συστήµατος διάθεσης βιοδραστικής ένωσης είναι να διαµορφώσει τη φαρµακοκινητική και την ιστική κατανοµή της βιοδραστικής ένωσης µε ωφέλιµο τρόπο. Στα ποικίλα συστήµατα µεταφοράς που έχουν προταθεί όλα αυτά τα χρόνια ανήκουν πολλά συστήµατα-φορείς τεµαχιδίων. Για παράδειγµα, µικροσφαίρες, νανοτεµαχίδια, λιποπρωτεΐνες, µικυλλιακά συστήµατα και λιποσώµατα. Tα λιποσώµατα είναι ενυδατωµένες λιπιδικές διασπορές, αποτελούµενες κυρίως από φωσφολιπίδια, τα οποία σχηµατίζουν διπλοστoιβάδες συγκροτώντας µακροµοριακές δοµές γνωστές ως πολυστoιβαδιακά σωµατίδια (MLV) ή µονοστοιβαδιακά σωµατίδια (SUV, Σχήµα 1.1). Τα φωσφολιπίδια, όταν διασπαρούν σε θερµοκρασία πάνω από την θερµοκρασία µετάπτωσής τους (Τm) σε πλούσιο υδατικό περιβάλλον, σχηµατίζουν αυθόρµητα σωµατίδια που εγκλωβίζουν υδατικό πυρήνα. Τα λιποσωµικά συστήµατα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων έχουν γνωρίσει ευρεία ανάπτυξη µε διάφορα λιποσωµικά σκευάσµατα να βρίσκονται σε κλινικές δοκιµές ή να κυκλοφορούν ήδη στην αγορά. Είναι γνωστό από πολυάριθµες προκλινικές και κλινικές µελέτες ότι βιοδραστικές ενώσεις, όπως τα αντικαρκινικές βιοδραστικές ενώσεις, εγκλωβισµένες σε λιποσώµατα επιδεικνύουν µειωµένη τοξικότητα, ενώ διατηρούν ή εµφανίζουν ακόµα κι αυξηµένη αποτελεσµατικότητα. Αυτό συµβαίνει, εν µέρει, λόγω µεταβολής της φαρµακοκινητικής της βιοδραστικής ένωσης, η οποία οδηγεί σε συσσώρευσή του στις πάσχουσες περιοχές όπως όγκοικαι µειωµένη διάθεση σε άλλους ευαίσθητους ιστούς. Υπό ανάπτυξη βρίσκονται και λιποσωµικά συστήµατα προάγοντα τη σύντηξη µε κυτταρικές µεµβράνες (fusogenic), τα οποία έχουν την ικανότητα να µεταφέρουν βιοδραστικές ενώσεις ενδοκυττάρια, γεγονός το οποίο αναµένεται να ενισχύει 1

17 σηµαντικά τη θεραπευτική ικανότητα των εγκλωβισµένων σε αυτά βιοδραστικών ενώσεων. Οι εξελίξεις στο σχεδιασµό των λιποσωµάτων οδηγούν σε νέες πιθανές υποψηφιότητες για µεταφορά βιοτεχνολογικών προϊόντων, όπως είναι ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες, αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια και κλωνοποιηµένα γονίδια. Σχήµα 1.1: Αναπαράσταση ενός λιποσώµατος σε διατοµή (Avanti polar lipids) Δοµικά στοιχεία Χαρακτηριστικά λιποσωµάτων Λιπίδια Τα λιποσώµατα µπορούν να παρασκευαστούν από ποικιλία λιπιδίων και µιγµάτων λιπιδίων. Ένα από τα βασικά είδη µεµβρανικών λιπιδίων περιλαµβάνουν τα φωσφολιπίδια. Αυτά έχουν µια πολική κεφαλή και δύο υδρογονανθρακικές αλυσίδες. Υπάρχουν δύο είδη φωσφολιπιδίων: τα φωσφοδιγλυκερίδια και τα σφιγγολιπίδια, µαζί µε τα αντίστοιχα προϊόντα υδρόλυσής τους. Ένα παράδειγµα φωσφολιπιδίου φαίνεται στο Σχήµα 1.2. Οι υδρόφοβες ουρές έλκονται µεταξύ τους, ενώ οι υδρόφιλες κεφαλές συνδέονται µε το υδατικό µέσο (υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις, υδρόφοβη επίδραση) εξωτερικά και εσωτερικά της λιποσωµικής επιφάνειας. Με τον τρόπο αυτό σχηµατίζονται διπλές λιπιδικές στιβάδες οι οποίες σφραγίζουν και δηµιουργούν µικρά σωµατίδια παρόµοια µε τα σωµατικά κύτταρα και τα οργανίδιά τους. Οι δυνάµεις που αναπτύσσονται σταθεροποιώντας τα λιποσώµατα είναι οι εξής: 2

18 i. Μεταξύ των λιπιδίων αλληλεπιδράσεις, όπως: υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στις πολικές οµάδες και αλληλεπιδράσεις Van der Waals ανάµεσα στις υδρογονανθρακικές αλυσίδες και ii. Τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ λιπιδίων και νερού (υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις, υδρόφοβη επίδραση). Το ακραίο τµήµα των λιπιδίων που ξεκινά µε NH είναι η πολική οµάδα (ή 3 πολική κεφαλή). Συνδέεται µέσω της γλυκερόλης µε δύο λιπαρές αλυσίδες. Μια από τις αλυσίδες είναι ευθεία λιπαρή αλυσίδα (κορεσµένη), ενώ η άλλη παρουσιάζει κυρτότητα λόγω cis διπλού δεσµού (µη κορεσµένη). Αυτό επηρεάζει το πακετάρισµα και την κίνηση στο πλευρικό επίπεδο της µεµβράνης. Τα πιο κοινά φωσφολιπίδια είναι τα µόρια φωσφατιδυλχολίνης (PC), αµφίφιλα µόρια στα οποία µια γέφυρα γλυκερόλης συνδέει ένα ζεύγος υδρόφοβων υδρογονανθρακικών αλυσίδων µε µια υδρόφιλη πολική κεφαλή, τη φωσφοχολίνη (Σχήµα 1.3). Τα µόρια αυτά είναι αδιάλυτα στο νερό και σε υδατικό µέσο διατάσσονται ευθύγραµµα σε διπλοστοιβάδες µε µορφή επίπεδων φύλλων ώστε να µειωθούν οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ της λιπαρής αλυσίδας των υδρογονανθράκων και του υδατικού περιβάλλοντος. Σχήµα 1.2: Αναπαράσταση δοµής φωσφολιπιδίου (Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993, p 155.) Εκτός από τη φωσφατιδυλχολίνη, λιπιδικές διπλοστιβάδες µπορούν να σχηµατιστούν και µε σφιγγοµυελίνη ή µε ανάλογα αλκυλ-αιθέρων της λεκιθίνης. Στη 3

19 σφιγγοµυελίνη, η παρουσία αµιδίου και υδροξυλοµάδων προκαλεί τη δηµιουργία δεσµών υδρογόνου οι οποίοι µπορεί να εξηγούν την καλύτερα διατεταγµένη φάση γέλης σε σχέση µε τη φωσφατιδυλχολίνη. Στη σφιγγοµυελίνη το υδρόφοβο τµήµα αποτελείται από µια µοναδική αλυσίδα λιπαρού οξέος που ενώνεται µε αµιδικό δεσµό µε το άζωτο της σφιγγοσύνης και η υδρόφιλη περιοχή είναι η οµάδα φωσφοχολίνης. Η λιπόφιλη ουρά είναι γνωστό ως κεραµίδιο. Ένα άλλο ουδέτερο φωσφολιπίδιο που απαντάται σε φυσικές µεµβράνες είναι η φωσφατιδυλαιθανολαµίνη (PE). Tο λιπίδιο αυτό διαφέρει από το PC στο ότι η χαρακτηριστική οµάδα είναι µικρότερη και επίσης µπορεί να σχηµατίσει δεσµούς υδρογόνου µε γειτονικά µόρια στη µεµβράνη. Στα αρνητικά φορτισµένα λιπίδια ανήκουν η φωσφατιδυλγλυκερόλη (PG), η φωσφατιδυλινοσιτόλη (PI) και η φωσφατιδυλσερίνη (PS). Σχήµα 1.3: Δοµή φωσφολιπιδίου και χαρακτηριστικές οµάδες Οι αλυσίδες των λιπαρών οξέων στα φωσφολιπίδια και τα γλυκολιπίδια συνήθως περιέχουν έναν άρτιο αριθµό ατόµων άνθρακα, συνήθως µεταξύ 14 και 24. Πιο συχνά βρίσκουµε τα λιπαρά οξέα µε 16 και 18 άτοµα άνθρακα. Τα λιπαρά οξέα µπορεί να είναι ακόρεστα ή κορεσµένα. Το ισόµερες που ανευρίσκεται στα ακόρεστα λιπαρά είναι σχεδόν πάντα στη cis µορφή. Ένα κεκορεσµένο λιπαρό οξύ περιέχει µόνο απλούς δεσµούς ενώ τα ακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν διπλούς δεσµούς στην υδρογονανθρακική αλυσίδα τους. Οι διπλοί δεσµοί των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων χωρίζονται από µια τουλάχιστον µεθυλενική οµάδα. Η διαµόρφωση και ο 4

20 αριθµός αυτών των διπλών δεσµών καθώς και το µήκος της αλυσίδας επιδρά στο σηµείο τήξης και στα χαρακτηριστικά ρευστότητας της µεµβράνης. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης είµαι «µίγµατα» επειδή τα λιπαρά οξέα που συνάπτονται στις θέσεις 1 και 2 του ίδιου µορίου συνήθως είναι διαφορετικά µεταξύ τους. Η αλυσίδα του λιπαρού οξέως στην εσωτερική θέση είναι ακόρεστη ενώ της εξωτερικής θέσης είναι κεκορεσµένη και µεγαλύτερου µήκους όσο αφορά τον αριθµό των ατόµων άνθρακα. Πίνακας 1.1 Κυτταρικά λιπαρά οξέα Χηµική δοµή Κορεσµένο λιπαρό οξύ CH (CH ) COOH CH (CH ) COOH CH (CH ) COOH CH (CH ) COOH CH (CH ) COOH CH (CH ) COOH Ακόρεστο λιπαρό οξύ CH (CH ) CH=CH(CH ) COOH CH (CH ) CH=CH(CH ) COOH CH (CH ) CH=CHCH CH=CH(CH ) COOH CH (CH ) (CH=CHCH ) CH=CH(CH ) COOH CH CH CH=CHCH CH=CHCH CH=CH(CH ) COOH Ονοµασία Λαουρικό Μυριστικό Παλµιτικό Στεαρικό Αραχιδικό Λινοσερικό Παλµιτολεϊκό Ολεϊκό Λινολεϊκό Αραχιδονικό Λινολενικό Θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης (Phase transition -Tm) Oι µεµβράνες από φωσφατιδυλχολίνες υφίστανται σε διαφορετικές φάσεις όταν ευρίσκονται σε διαφορετικές θερµοκρασίες. Η µετάβαση από τη µία φάση στην άλλη µπορεί να διαπιστωθεί µε φυσικές µεθόδους κατά την αύξηση της θερµοκρασίας. Η πλέον διαδεδοµένη τεχνική για τον προσδιορισµό της θερµοκρασίας µετάπτωσης είναι η Διαφορική Θερµιδοµετρία Σάρωσης (DSC) ( Huang C. et al., 1999). 5

21 Οι πιο συχνά παρατηρούµενες αλλαγές φάσης συµβαίνουν στην υψηλότερη θερµοκρασία, στην οποία η µεµβράνη αποδιατάσσεται από την οργανωµένη µορφή της γέλης (gel) ή του στερεού (solid) και µεταβαίνει σε υγρή - κρυσταλλική δοµή κατά την οποία οι βαθµοί ελευθερίας των µορίων είναι περισσότεροι. Γενικά αύξηση του µήκους της λιπαρής αλυσίδας ή αύξηση του κορεσµού της αλυσίδας αυξάνει την Tm. Η θερµοκρασία µετάπτωσης για τα φωσφολιπίδια που προέρχονται από το κρόκο αυγού ποικίλλει µεταξύ -15 C ( υψηλό βαθµό ακορεστότητας) και πάνω από 50 C για πλήρη κεκορεσµένα φωσφολιπίδια όπως είναι η διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC). Σχήµα 1.4: Σχέση ανάµεσα στη φάση της µεµβράνης και τη θερµοκρασία Χοληστερόλη και o ρόλος της Η χοληστερόλη αποτελεί βασικό συστατικό των βιολογικών µεµβρανών επιτελώντας σηµαντικές λειτουργίες (Σχήµα 1.5). Στα λιποσώµατα που χρησιµοποιούνται ως µοντέλα που προσοµοιάζουν κυτταρικές µεµβράνες συνήθως προστίθεται χοληστερόλη για διάφορους λόγους. Αρχικά, είναι γνωστό ότι προσδίδει σταθερότητα στις διπλοστοιβάδες των λιποσωµάτων, ιδίως όταν πρόκειται για 6

22 ασταθή λιποσώµατα (PC). Συγκεκριµένα, η χοληστερόλη ενσωµατώνεται σε φωσφολιπιδικές µεµβράνες επιφέροντας αλλαγές στις ιδιότητές τους π.χ. στη ρευστότητα και διαπερατότητά τους. Αυτό οφείλεται στη µεταβολή της κάµψης της αλυσίδας του φωσφολιπιδίου µε αποτέλεσµα να σχηµατίζονται πιο συµπαγείς µεµβράνες σε σύγκριση µε λιποσώµατα των οποίων οι µεµβράνες δεν περιέχουν χοληστερόλη. Άλλοι λόγοι προσθήκης χοληστερόλης σε λιποσώµατα µπορεί να είναι οι εξής: Η παρουσία χοληστερόλης στη µεµβράνη των λιποσωµάτων οδηγεί σε σηµαντική αύξηση (ή µείωση) της σειράς προσανατολισµού των υδρογονανθρακικών αλυσίδων πάνω (ή κάτω) από τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης και µείωση της γωνίας κλίσης της φωσφολιπιδικής αλυσίδας στη ρευστή φάση. Η χοληστερόλη µεταβάλλει τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης των λιποσωµικών µεµβρανών, ανάλογα µε την κατάσταση του λιπιδίου. Συγκεκριµένα, όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερµοκρασίες υψηλότερες από την θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης, η χοληστερόλη συµβάλλει στη µείωση της ελευθερίας των ανθρακικών αλυσίδων και τη συµπύκνωση τελικά της µεµβράνης και µείωση της ρευστότητάς της. Αντίθετα, χαµηλότερα από την θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης, η απόσταση µεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της µεµβράνης αυξάνει. Σχήµα 1.5: Χηµική δοµή της χοληστερόλης, όπου φαίνεται η πολική και η µη πολική περιοχή 7

23 1.1.3 Ταξινόµηση των λιποσωµάτων Ταξινόµηση µε βάση το µέγεθος MLVs Multilamellar vesicles (µεγάλα πολυστοιβαδιακά σωµατίδια) Τα MLV λιποσώµατα αποτελούνται από έναν µεγάλο αριθµό παράλληλων, οµόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστοιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωµάτων όσον αφορά την παρασκευή τους. Η κυριότερη µέθοδος παρασκευής MLV λιποσωµάτων είναι η µέθοδος του Bangham (solvent evaporation method) (Bangham A.D. et al., 1965). Βιοδραστικές ενώσεις, καθώς και άλλες διαλυτές ενώσεις µπορούν να εγκλωβιστούν στα υδατικά µεσοδιαστήµατα ανάµεσα στις µεµβράνες, ενώ τα υδρόφοβα τµήµατά τους ή υδρόφοβες βιοδραστικές ενώσεις µπορούν να διαλυτοποιηθούν στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας. Τα λιποσώµατα αυτά έχουν µεγάλες και ετερογενείς διαµέτρους (1-10µm), χαµηλή ικανότητα εγκλωβισµού όγκου ανά µόριο λιπιδίου και παρουσιάζουν πολλαπλά εσωτερικά διαµερίσµατα (Σχήµα 1.6). Η απόσταση µεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάµεων van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων δυνάµεων άπωσης. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν τη χρήση τους ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων και µεµβρανικά µοντέλα αρκετά πολύπλοκη. 8

24 Σχήµα 1.6: Σχηµατική απεικόνιση πολυστοιβαδιακού λιποσώµατος σε διατοµή και µεγέθυνση των περιοχών του. LUVs & ΙUVs- Large unilamellar vesicles & Intermediate unilamellar vesicles (Μεγάλα & µεσαίου µεγέθους µονοστοιβαδιακά σωµατίδια) Τα λιποσώµατα αυτά έχουν διάµετρο της τάξης των 1000nm και είναι µονοστοιβαδιακά. Ανάλογα µε το επιθυµητό µέγεθος, τα LUVs και IUVs µπορούν να παρασκευασθούν µε διάφορες µεθόδους, όπως είναι η αποµάκρυνση απορρυπαντικού, η µηχανική διασπορά και τα διφασικά συστήµατα. Τα λιποσώµατα αυτά θεωρούνται κατάλληλα για εγκλωβισµό υδατοδιαλυτών υλικών, αν και η παρουσία µιας µόνο λιπιδικής µεµβράνης έχει ως συνέπεια µικρότερη µηχανική σταθερότητα και συγκράτηση της ουσίας σε σχέση µε τα MLVs. Ωστόσο, αυτός ο τύπος λιποσωµάτων κρίνεται αρκετά κατάλληλος για την ενεργή φόρτωση ιονιζόµενων µορίων. SUVs - Small unilamellar vesicles (Μικρά µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα) Τα SUV λιποσώµατα αποτελούνται µόνο από µια διπλοστοιβάδα και έχουν διάµετρο nm (Σχήµα 1.7). Διαθέτουν το µικρότερο δυνατό µέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο µπορεί να σχηµατίσει λιποσωµική µορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύµατος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των µεµβρανών. Πρόκειται για θερµοδυναµικά ασταθή λιποσώµατα που είναι επιρρεπή σε συσσωµάτωση και σύντηξη, ιδίως κάτω από τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης. Οι µέθοδοι παρασκευής SUV λιποσωµάτων είναι (i) η κατεργασία µε υπέρηχους και (ii) η µέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξης - απόψυξης (freeze - thaw). 9

25 Σχήµα 1.7: Διατοµή ενός µονοστοιβαδιακού λιποσώµατος (SUV). Οι υδατοδιαλυτές ενώσεις µπορούν να εγκλωβιστούν στον υδατικό πυρήνα (περιοχή 1) ή να συνδεθούν στην εξωτερική επιφάνεια (περιοχή 3). Τα υδροφοβικά µόρια µπορούν να εγκλωβιστούν στη διπλοστοιβάδα (περιοχή 2). Στα φθορίζοντα λιποσώµατα, οι φθορίζουσες ενώσεις είναι εγκλωβισµένες στο εσωτερικό και συνδεδεµένες στην επιφάνεια του λιποσώµατος. (σήµανση F) Ταξινόµηση µε βάση τη σύσταση και τις εφαρµογές Το λιποσωµικό σύστηµα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων διαθέτει ένα µεγάλο πλεονέκτηµα έναντι άλλων κολλοειδών συστηµάτων µεταφοράς: Επιτρέπει σχεδόν άπειρες πιθανότητες µεταβολής των δοµικών και φυσικοχηµικών χαρακτηριστικών. Αυτό το χαρακτηριστικό της ευελιξίας επιτρέπει στους επιστήµονες να τροποποιούν την in vivo συµπεριφορά των λιποσωµάτων και να σχεδιάζουν τις διάφορες λιποσωµικές µορφές ανάλογα µε τις θεραπευτικές ανάγκες. Με βάση τη σύνθεση και την επιθυµητή in vivo εφαρµογή, τα λιποσώµατα διακρίνονται σε τέσσερις µεγάλες κατηγορίες (Σχήµα 1.8) 10

26 Σχήµα 1.8: Σχηµατική απεικόνιση διαφορετικών τύπων λιποσωµάτων: Συµβατικά (Conventional) λιποσώµατα, Στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα (Stealth) λιποσώµατα, Στοχευµένα (Targeted), Κατιονικά (Cationic) λιποσώµατα. Συµβατικά λιποσώµατα (Conventional liposomes): Αυτά µπορούν να οριστούν ως λιποσώµατα που αποτελούνται µόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισµένα) ή/και χοληστερόλη. Πρόκειται για την πλέον χρησιµοποιούµενη κατηγορία λιποσωµάτων στη µεταφορά βιοδραστικών ενώσεων. Διαφέρουν ως προς τις φυσικοχηµικές τους ιδιότητες, όπως το µέγεθος, τη λιπιδική σύσταση, το επιφανειακό φορτίο και τον αριθµό και ρευστότητα των λιπιδικών διπλοστoιβάδων. Τα συµβατικά λιποσώµατα χαρακτηρίζονται από σχετικά µικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίµα. Όταν χορηγούνται in vivo (συχνά ενδοφλέβια) έχουν την τάση να συσσωρεύονται γρήγορα στα φαγοκύτταρα του µονοπυρηνικού συστήµατος φαγοκυττάρων, γνωστό επίσης και ως δικτυοενδοθηλιακό σύστηµα (RES). Tα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήνα. Το γεγονός αυτό έχει αποτελέσει στόχο για διάθεση βιοδραστικών ενώσεων µέσω λιποσωµάτων σε µολυσµένα µακροφάγα. Επιπλέον, τα συµβατικά λιποσώµατα έχουν χρησιµοποιηθεί για µεταφορά αντιγόνων. Λιποσωµικά εµβόλια 11

27 έχουν αποδειχθεί αποτελεσµατικά κατά ιικών, βακτηριακών και παρασιτικών µολύνσεων καθώς επίσης και εναντίον όγκων. Λιποσώµατα µακράς κυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, or sterically stabilized): Η ανάπτυξή τους αποτέλεσε ορόσηµο στην έρευνα των λιποσωµικών συστηµάτων µεταφοράς και αναζωπύρωσε το ενδιαφέρον γύρω από την έρευνα περί λιποσωµάτων. Στην πραγµατικότητα, τα λιποσώµατα µακράς κυκλοφορίας άνοιξαν νέους δρόµους σε θεραπευτικές δυνατότητες που µέχρι τότε θεωρούνταν ανέφικτες για τα συµβατικά λιποσώµατα. Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τους είναι ότι έχουν την ικανότητα να βγαίνουν εκτός κυκλοφορίας σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώµατος είναι αυξηµένη. Αυτό συµπίπτει µε το γεγονός ότι οι περιοχές αυξηµένης τριχοειδικής διαπερατότητας περιλαµβάνουν παθολογικές περιοχές, όπως στέρεους όγκους και περιοχές µολύνσεως και φλεγµονής. Προς το παρόν, ο πιο δηµοφιλής τρόπος παραγωγής τέτοιων λιποσωµάτων είναι η οµοιοπολική σύνδεση του πολυµερούς πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) στην εξωτερική επιφάνεια (Σχήµα 1.9). Αυτά τα λιποσώµατα λέγονται επίσης stealth ή στερεοχηµικώς σταθεροποιηµένα. Ο πρώτος όρος αναφέρεται στην ικανότητά τους να διαφεύγουν των µακροφάγων και ο δεύτερος στο µηχανισµό στερεοχηµικής σταθεροποίησής τους, που είναι υπεύθυνος για την αύξηση του χρόνου κυκλοφορίας. Το τελευταίο οφείλεται σε φραγµό που δηµιουργείται και αποτρέπει τις αλληλεπιδράσεις µε µόρια και κυτταρικά συστατικά του βιολογικού περιβάλλοντος, κυρίως πρωτεΐνες. Ανοσολιποσώµατα (Immunoliposomes): Διαθέτουν ειδικά αντισώµατα ή κλάσµατα αντισωµάτων (Fab ή αντισώµατα µονής αλυσίδας) στην επιφάνειά τους προκειµένου να ενισχύσουν τη στοχευµένη πρόσδεση. Αν και έχουν εξεταστεί για πληθώρα θεραπευτικών εφαρµογών, η εστίαση έχει γίνει στη µεταφορά αντικαρκινικών παραγόντων. Όπως και άλλα σωµατίδια στην κυκλοφορία του αίµατος, είναι δύσκολο στα ανοσολιποσώµατα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία σε άλλα διαµερίσµατα πλην του ήπατος και του σπλήνα. Γι αυτό, προκειµένου να εξασφαλιστεί προσιτότητα των υποδοχέων, επιχειρείται τοπική χορήγηση των λιποσωµάτων στις σωµατικές κοιλότητες. 12

28 Σχήµα 1.9:.Σχηµατική απεικόνιση ενός στερεοχηµικά σταθεροποιηµένου λιποσώµατος. Τα stealth λιποσώµατα εγκλωβίζουν το βιοδραστική ένωση (1) σε µια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα (2).Η PEG επικάλυψη (3) επιτρέπει στα λιποσώµατα να αποφεύγουν το ανοσοποιητικό σύστηµα αυξάνοντας το χρόνο ηµιζωής της βιοδραστικής ένωσης στο σώµα. Κατιονικά λιποσώµατα (Cationic liposomes): Αυτά εκπροσωπούν σχετικά νέα µέλη της οικογένειας των λιποσωµάτων. Βρίσκονται στην πρώτη γραµµή ως συστήµατα µεταφοράς γενετικού υλικού. Τα κατιονικά λιπιδικά συστατικά τους αλληλεπιδρούν µε και εξουδετερώνουν- το αρνητικά φορτισµένο DNA, συµπυκνώνοντας έτσι το DNA σε µια πιο συµπαγή δοµή. Τα σύµπλοκα λιπιδίου- DNA παρέχουν προστασία και επάγουν την κυτταρική εσωτερίκευση και έκφραση του συµπυκνωµένου πλασµιδίου. Λιποσώµατα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic liposomes): Τα λιποσώµατα αυτά µπορούν να διευκολύνουν την ενδοκυτταρική µεταφορά εγκλωβισµένων βιοδραστικών ενώσεων µέσω σύντηξης µε τη µεµβράνη των κυττάρων στόχων. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι παρασκευής τους µεταξύ των οποίων είναι η χρήση λιπιδίων (όπως το DOPE) που είναι ικανά να προάγουν την αποσταθεροποίηση της διπλοστοιβάδας και να προκαλούν φαινόµενα σύντηξης. Επίσης, πρωτεΐνες που επάγουν τη σύντηξη µπορούν να ενσωµατωθούν σε 13

29 λιποσώµατα. Διάφορες µελέτες έχουν δείξει ότι η ενίσχυση της ικανότητας σύντηξης των λιποσωµάτων µπορεί να εφαρµοστεί προκειµένου να ενισχυθεί η αποτελεσµατικότητα των λιποσωµικών συστηµάτων µεταφοράς γενετικού υλικού. Πίνακας 1.2 Κύριες εφαρµογές των κύριων τύπων λιποσωµάτων ΤΥΠΟΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΥΜΒΑΤΙΚΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΜΑΚΡΑΣ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΑΝΟΣΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΚΑΤΙΟΝΙΚΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΚΥΡΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΜΑΚΡΟΦΑΓΩΝ ΤΟΠΙΚΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΣΕ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΜΙΚΡΟΔΕΞΑΜΕΝΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΕΙΔΙΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ Γενικά, ο µέγεθος, η ακαµψία των διπλοστοιβάδων, το φορτίο και οι τροποποιήσεις της επιφάνειας της διπλοστοιβάδας αποτελούν παραµέτρους που καθορίζουν την τύχη των λιποσωµάτων κατά την αποθήκευση και in vivo. Στον Πίνακα 1.2 αναφέρονται οι βασικές εφαρµογές των κύριων τύπων λιποσωµάτων Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Γενικά Στην πράξη, οι περισσότερες µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων οδηγούν σε αρκετά ετερογενείς πληθυσµούς σωµατιδίων µε ευρεία κατανοµή µεγέθους. Δεδοµένου ότι ο διαθέσιµος προς εγκλωβισµό, όγκος λιποσωµάτων ποικίλλει ανάλογα µε την κατανοµή µεγέθους, είναι πολύ σηµαντικό οι λιποσωµικές παρασκευές να χαρακτηρίζονται ως προς το µέγεθος, ώστε να προβλέπεται µε σχετική ακρίβεια η in vitro και in vivo συµπεριφορά τους. Ακόµη και λιποσώµατα µε το ίδιο µέγεθος και τον ίδιο αριθµό στοιβάδων είναι δυνατό να διαφέρουν στην εσωτερική κατανοµή της υδατικής φάσης και στην ποσότητα λιπιδίου που συµµετέχει στη δοµή των σωµατιδίων. Η επιλογή του τύπου λιποσωµάτων που θα χρησιµοποιηθεί για συγκεκριµένη εφαρµογή εξαρτάται εν µέρει από το είδος της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί 14

30 αλλά και από την επιθυµητή συµπεριφορά του λιποσώµατος µετά την παρασκευή του. Κάποιες συνήθεις µεθόδοι παρασκευής λιποσωµάτων φαίνονται στο Σχήµα Σχήµα 1.10: Συνήθεις µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων. MLV (πολυστοιβαδιακά), MVV (πολυκυστιαδιακά), REV (αντίστροφης φάσης), SPLV (σταθερά πολυστοιβαδιακά), SUV (µικρά µονοστοιβαδιακά), ULV (µονοστοιβαδιακά) Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηµατισµό λεπτού υµενίου (film) κατά την εξάτµιση διαλυµάτων λιπιδίων σε οργανικό διαλύτη ή µίγµα διαλυτών. Για να αποµακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χηµική αποικοδόµηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηµατίζεται το λεπτό υµένιο, εκτίθεται σε ρεύµα αζώτου. Η ενυδάτωση (hydration) του υµενίου που ακολουθεί πραγµατοποιείται µε νερό ή µε ρυθµιστικό διάλυµα ή µε διάλυµα της προς εγκλωβισµό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτµισης των διαλυτών, πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασίες υψηλότερες της θερµοκρασίας µετάβασης φάσης του χρησιµοποιούµενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυµα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερµανθεί σε αυτή τη θερµοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. 15

31 Με έντονη µηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υµένιο αποκολλάται από τα τοιχώµατά της, οπότε λαµβάνεται µία θολερή διασπορά µε πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα µεγάλου µεγέθους MLV. Η µείωση του µεγέθους των MLV λιποσωµάτων και η δηµιουργία οµογενούς σε αναφορά µε το µέγεθος πληθυσµού, υλοποιείται µε τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση µέσω φίλτρων ή µεµβρανών (extrusion), µικρoγαλακτωµατοποίηση (microemulcification) κ.ά. Στο τελευταίο στάδιο πραγµατοποιείται η διαδικασία του "annealing", κατά την οποία τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερµοκρασία υψηλότερη αυτής της µετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραµένουν για µία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να οµαλοποιηθεί η µορφοποίηση της δοµής τους. Η διάµετρος των λιποσωµάτων που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή είναι µέχρι 5-6 µm Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator) Τα λιποσώµατα (SUV) που λαµβάνονται µε τη χρήση ακίδας υπερήχων έχουν διάµετρο της τάξης µερικών δεκάδων nm. Το σηµείο εκκίνησης είναι συνήθως µία διασπορά πολυστιβαδιακών MLV λιποσωµάτων. Δεδοµένου ότι αυτά τα σωµατίδια θα σπάσουν ολοκληρωτικά στην πορεία, δεν είναι απαραίτητο να ληφθεί προσοχή σχετικά µε το αρχικό µέγεθος των MLV λιποσωµάτων, το ποσοστό εγκλωβισµού και το πάχος του λιπιδικού υµενίου. Η ακίδα υπερήχων προτιµάται για διασπορές που απαιτούν υψηλή ενέργεια σε µικρό όγκο (π.χ. υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίου, ή παχύρρευστη υδατική φάση), ενώ το λουτρό υπερήχων είναι περισσότερο κατάλληλο για µεγάλους όγκους διαλυµένου λιπιδίου και για περιπτώσεις που δεν είναι απαραίτητη η απόδοση οριακού µεγέθους σωµατιδίων. Έπειτα ακολουθεί φυγοκέντρηση στις στροφές για πέντε λεπτά προκειµένου να αποµακρυνθούν αδιάσπαρτα κοµµάτια λιπιδίου και MLV λιποσώµατα ή συσσωµατώµατά τους καθώς και ρινίσµατα τιτανίου που αποδεσµεύονται λόγω της µεγάλης δύναµη τριβής που αναπτύσσεται µεταξύ της διασποράς και της ακίδας. 16

32 Εξώθηση µέσω φίλτρων Στα λιποσώµατα αυτού του τύπου η µείωση µεγέθους επιτυγχάνεται µε τη χρήση φίλτρων των οποίων οι πόροι έχουν συγκεκριµένη διάµετρο. Η µέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτηµα ότι παρέχει επαναλήψιµα αποτελέσµατα, ενώ το λιπίδιο δεν υφίσταται κάποια σηµαντική µεταβολή. Επιπλέον µπορεί να διπλασιαστεί το ποσοστό εγκλωβισµού διαφόρων ουσιών. Η εξώθηση µέσω φίλτρων διαµέτρου 0,2 µm οδηγεί σε εξαιρετικά οµοιογενείς πληθυσµούς λιποσωµάτων διαµέτρου 270 nm (Olson F.et al., 1979) Χρήση Γαλακτωµατοποιητή Για την παρασκευή λιποσωµάτων µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν γαλακτωµατοποιητές (Mayhew E. et al., 1984). Οι µικρογαλακτωµατοποιητές είναι συσκευές που αντλούν το ρευστό, στην προκειµένη περίπτωση τα λιποσώµατα, µε πολύ υψηλές πιέσεις µέχρι και (10000 p.s.i., bar) µέσα από φίλτρα διαµέτρου 5µm. Στη συνέχεια διαπερνούν το µίγµα χωρισµένο σε δύο τµήµατα µε πολύ µεγάλη ταχύτητα, από µικρά κανάλια που αναµιγνύουν τα δύο ρεύµατα υπό ορθή γωνία παρέχοντας µε τον τρόπο αυτό πολύ µεγάλη ενέργεια. Τα λιπίδια εισάγονται στο µικρογαλακτωµατοποιητή µε τη µορφή εναιωρήµατος µεγάλων λιποσωµάτων MLV ή µε τη µορφή µη ενυδατωµένου λιπιδίου εντός υδατικού µέσου. Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται µικρά MLV λιποσώµατα µε καλή κατανοµή µεγέθους nm (micro emulsification liposomes, MEL). Οι γαλακτωµατοποιητές µπορούν να χρησιµοποιηθούν και στη βιοµηχανική παραγωγή για την παρασκευή µεγάλων ποσοτήτων λιποσωµάτων (Vemuri S. et al., 1989) Εξώθηση σε θάλαµο εφαρµογής µεγάλης πίεσης Η τεχνική περιλαµβάνει την εισαγωγή προσχηµατισµένων µεγάλων λιποσωµάτων σε θάλαµο (French Press) υπό µεγάλη πίεση ( p.s.i.), και αποδίδει οµοιογενείς µονο- ή ολιγο- στιβαδιακές λιποσωµικές διασπορές ενδιάµεσων µεγεθών (30 80 nm σε διάµετρο ανάλογα µε την εφαρµοζόµενη πίεση) (Barenholtz Y. et al., 1979). Τα λιποσώµατα που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιούνται για τη µεταφορά ευαίσθητων µακροµορίων και είναι πιο σταθερά από τα κατεργασµένα µε υπέρηχους λιποσώµατα. 17

33 Ένεση λιπιδίων Περιλαµβάνει µεθόδους κατάλληλες για την παρασκευή SUV και LUV λιποσωµάτων. Διάλυµα λιπιδίου σε οργανικό διαλύτη ενίεται ταχέως σε περίσσεια υδατικού µέσου που περιέχει την ουσία που πρόκειται να εγκλωβισθεί στα λιποσώµατα. Στη διεπιφάνεια µεταξύ νερού και οργανικού διαλύτη, τα φωσφολιπίδια αυτοδιατάσσονται σε λιποσώµατα µικρής διαµέτρου. Τα µεγάλα συγκριτικά πλεονεκτήµατα των µεθόδων είναι η εύκολη εφαρµογή της και ο περιορισµένος κίνδυνος αποικοδόµησης των λιπιδίων. Μειονέκτηµα των µεθόδων είναι το χαµηλό ποσοστό εγκλωβισµού για υδατοδιαλυτές ουσίες. Οι πιο συχνά εφαρµοζόµενες µεθοδολογίες παρασκευής τέτοιων λιποσωµικών διασπορών περιγράφονται παρακάτω και αφορούν σε περιπτώσεις κατά τις οποίες: I. ο οργανικός διαλύτης είναι αναµίξιµος µε την υδατική φάση, II. ο οργανικός διαλύτης είναι µη αναµίξιµος µε την υδατική φάση, III. ο οργανικός διαλύτης είναι σε περίσσεια και µη αναµίξιµος µε την υδατική φάση. Έγχυση Αιθανόλης Κατά την τεχνική αυτή το ή τα λιπίδια διαλύονται σε αιθανόλη και στη συνέχεια τοποθετούνται σε περίσσεια υδατικού µέσου ή κάποιου άλατος µε χρήση σύριγγας. Τα µόρια του λιπιδίου έρχονται σε επαφή µε τα µόρια του νερού και µε τον τρόπο αυτό σχηµατίζονται αστραπιαία λιποσώµατα µικρής διαµέτρου (25 nm). Το ποσοστό εγκλωβισµού που επιτυγχάνεται µε τη µέθοδο αυτή είναι εξαιρετικά χαµηλό εάν οι προς εγκλωβισµό ουσίες είναι διαλυτές στην υδατική φάση. Επιπλέον η περιορισµένη διαλυτότητα λιπιδίων στην αιθανόλη (40 mm για PC), ο µικρός όγκος λιπιδίων (διαλυµένων σε αιθανόλη) που µπορεί να εισαχθεί στο υδατικό διάλυµα καθώς και η δυσκολία αποµάκρυνσης της αιθανόλης από τις λιποσωµικές µεµβράνες κυρίως µε διαπίδυση (dialysis), συµπεριλαµβάνονται στα µειονεκτήµατα της µεθόδου. (Batzri et al., 1973). Λιποσώµατα µε αυτή τη µέθοδο παρασκευάσθηκαν για πρώτη φορά από τους Szoka και Papahadjopoulos το Τα λιποσώµατα αυτά ονοµάζονται αντίστροφης φάσης εξατµιζόµενα σωµατίδια (reverse phase evaporation vesicles, REV). Κατά τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιείται γαλάκτωµα νερού σε έλαιο (αναστροφή του τυπικού 18

34 "έλαιο σε νερό" γαλακτώµατος) και η αποµάκρυνση του διαλύτη από το γαλάκτωµα γίνεται µε εξάτµιση. Έγχυση Αιθέρα Η τεχνική αυτή παρουσιάζει αρκετές διαφορές συγκριτικά µε την ένεση αιθανόλης (Deamer D.W. et al., 1976). Περιλαµβάνει την ένεση µη αναµίξιµου µε το νερό οργανικού διαλύµατος µε αργούς ρυθµούς εντός υδατικής φάσης µε χρήση βελόνας µικρής εσωτερικής διαµέτρου. Η θερµοκρασία έγχυσης πρέπει να είναι τέτοια ώστε να επιτρέπει την εξάτµιση του οργανικού διαλύτη κατά τη διαδικασία προσθήκης του. Λόγω άµεσης εξάτµισης του διαλύτη αυξάνει η βαθµίδωση του λόγου νερού / αιθέρα στη διεπιφάνεια της λιπιδικής µονοστοιβάδας και των δύο µέσων. Η αναδίπλωση της σχηµατιζόµενης διπλοστοιβάδας οδηγεί στο σχηµατισµό µεγάλων λιποσωµάτων (LUV). Η µέθοδος χρησιµοποιείται αποτελεσµατικά στην περίπτωση ευπαθών λιπιδίων, καθώς µειώνει σηµαντικά την πιθανότητα οξείδωσής τους, µε την προϋπόθεση ότι ο αιθέρας έχει επαναποσταχθεί προσεκτικά για την αποµάκρυνση τυχόν υπεροξειδίων που προκύπτουν από την αυθόρµητη οξείδωσή του. Επιπλέον ο ρυθµός αποµάκρυνσης του διαλύτη είναι ίσος µε το ρυθµό εισαγωγής, οπότε δεν υπάρχει περιορισµός στην τελική συγκέντρωση λιποσωµάτων και η όλη διαδικασία µπορεί να διαρκεί για µεγάλο χρονικό διάστηµα καταλήγοντας σε λιποσώµατα µε υψηλό ποσοστό ενκαψυλίωσης. Νερό σε οργανική φάση Περιλαµβάνει το σχηµατισµό λιποσωµάτων σε δύο φάσεις. Πρώτα παρασκευάζεται η εσωτερική µονοστοιβάδα και έπειτα η δεύτερη εξωτερική. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της τεχνικής, κατά βάση όµως παράγεται ένα γαλάκτωµα νερού σε έλαιο µε την εισαγωγή µικρής ποσότητας υδατικού µέσου (που περιέχει την προς εγκλωβισµό ουσία) σε µεγάλο όγκο µη αναµίξιµου διαλύµατος λιπιδίων, συνοδευόµενη από µηχανική ανάδευση ώστε η υδατική φάση να διασπαστεί σε µικροσκοπικά σταγονίδια ύδατος. Τα σταγονίδια αυτά σταθεροποιούνται από την παρουσία της λιπιδικής διπλοστοιβάδας στη διεπιφάνεια των δύο φάσεων. Το µέγεθος των σταγονιδίων εξαρτάται από την ένταση της µηχανικής ενέργειας κατά την παρασκευή του γαλακτώµατος και από το ποσό του λιπιδίου σχετικά µε τον όγκο της υδατικής 19

35 φάσης αφού κάθε σταγονίδιο απαιτεί µια ολοκληρωµένη µονοστοιβάδα φωσφολιπιδίου που να καλύπτει πλήρως την επιφάνειά της ώστε να παρεµποδισθεί η συσσωµάτωση µε άλλες σταγόνες. Το υδατικό τµήµα που περιβάλλεται από αυτή τη διπλοστοιβάδα θα αποτελέσει τον τελικό πυρήνα του τελικού λιποσώµατος. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι προετοιµασίας των σταγονιδίων νερού σε έλαιο πριν την προσθήκη της εξωτερικής κάλυψης, οι οποίοι υπό κατάλληλες συνθήκες παράγουν διαφορετικά µεγέθη σταγονιδίων. Με την επίδραση ακίδας υπερήχων λαµβάνονται σταγονίδια διαµέτρου 100 nm Δηµιουργία µικτών µικκυλίων µε απορρυπαντικά Κατά την ανάµιξη λιπιδίων µε απορρυπαντικά ιονικά αµφοτερικά ή µη ιονικά σε ρυθµιστικό διάλυµα, σχηµατίζονται αυθόρµητα µεικτά µικκύλια (micelles). Το είδος και η κατανοµή των πολικών και λιπόφιλων οµάδων του απορρυπαντικού µέσα στο µικκύλιο καθορίζουν το µέγεθος και το σχήµα του. Η συγκέντρωση απορρυπαντικού στο νερό κατά την οποία αρχίζουν να σχηµατίζονται µικκύλια είναι γνωστή ως κρίσιµη συγκέντρωση µικκυλίων (critical micelle concentration, CMC). Σε συγκεντρώσεις µικρότερες της κρίσιµης τα µόρια του απορρυπαντικού βρίσκονται ελεύθερα στο διάλυµα µονοµερή, ενώ σε µεγαλύτερες σχηµατίζουν ολοένα µεγαλύτερες ποσότητες µικκυλίων. Οι επιφανειοδραστικές ενώσεις διακρίνονται σύµφωνα µε την κατανοµή της πολικής και υδρόφοβης περιοχής που διαθέτουν σε πεπλατυσµένα (αλκυλογλυκοσίδια που δίνουν σφαιρικά µικκύλια) και επιµήκη (χολικά άλατα που σχηµατίζουν δισκοειδή µικκύλια). Η αποµάκρυνση του απορρυπαντικού από τα µικκύλια γίνεται µε διαπίδυση ή χρωµατογραφία στήλης και έτσι σχηµατίζονται λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ότι υπάρχει στην υδατική φάση. Στο στάδιο αυτό είναι εύκολο να αποµακρυνθούν και µικρά µόρια, γι` αυτό τα ποσοστά εγκλωβισµού µε αυτή την τεχνική δεν είναι αξιόλογα. Είναι όµως αποτελεσµατική µέθοδος για το σχηµατισµό λιποσωµάτων που φέρουν λιπόφιλα µόρια, αφού αυτά µπορούν να εισαχθούν στα µικκύλια παρουσία ήπιων απορρυπαντικών µε ποσοστό εγκλωβισµού ακόµη και 100%. 20

36 Άλλες ειδικές µέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Αφυδατωµένα Ενυδατωµένα Σωµατίδια (DRV) Η µέθοδος αυτή έχει αναπτυχθεί από τους C. Kirby and G.Gregoriadis, το Κατά την τεχνική αυτή, πραγµατοποιείται λυοφιλοποίηση (freeze - drying) διασποράς άδειων SUV λιποσωµάτων παρουσία διαλύµατος της προς εγκλωβισµό ουσίας. Εδώ, σε αντίθεση µε την κλασσική παρασκευή µέσω εξάτµισης του διαλύτη όπου τα µόρια του λιπιδίου είναι σε τυχαία κατανοµή, το λιπίδιο το οποίο βρίσκεται στα κενά SUV είναι πολύ καλά οργανωµένο στη δοµή της µεµβράνης. Έτσι, κατά την προσθήκη του υδατικού µέσου σχηµατίζονται λιποσώµατα µε υψηλή ικανότητα εγκλωβισµού και διάµετρο από 400 nm µέχρι µερικά µm. Μερικά από τα πλεονεκτήµατα της µεθόδου είναι: η απλότητα στη χρήση, οι ήπιες συνθήκες που χρησιµοποιούνται (σηµαντικές για ευαίσθητα µόρια), και υψηλή ικανότητα εγκλωβισµού για µεγάλη ποικιλία ουσιών. Η απλότητα της µεθόδου καθιστά ιδιαίτερα δυνατή την διαδικασία scale-up προκειµένου για εφαρµογή στη φαρµακευτική βιοµηχανία. Η πιθανότητα διακοπής της διαδικασίας µετά το στάδιο της αφυδάτωσης και η αποθήκευση κάτω από ειδικές συνθήκες αποτελεί ένα επιπλέον πλεονέκτηµα. Σε αντίθεση µε τη διασπορά ενός στεγνού λιπιδικού υµενίου, η ανασύσταση του λυοφιλοποιηµένου προϊόντος είναι εξαιρετικά ταχεία. Η DRV µέθοδος διαφέρει από τις περισσότερες άλλες µεθόδους υψηλής ικανότητας εγκλωβισµού στο ότι παράγεται µεγάλη αναλογία ολιγο- και πολυστοιβαδιακών λιποσωµάτων. Η ύπαρξη λιποσωµάτων µε πολλές στοιβάδες έχει το πλεονέκτηµα ότι µειώνει το ρυθµό απώλειας της εγκλωβισµένης ουσίας παρουσία του πλάσµατος. Ο κύριος περιορισµός της µεθόδου, ο οποίος είναι κοινός και σε άλλες µεθόδους που παράγουν µεγάλα λιποσώµατα είναι το γεγονός ότι τα DRV λιποσώµατα τείνουν να παρουσιάζουν ετερογένεια όσον αφορά το µέγεθος. Η οµοιογένεια στο µέγεθος µπορεί να µη θεωρείται απαραίτητη για φαρµακευτικούς σκοπούς, αλλά είναι σηµαντική για την επαναληψιµότητα πειραµάτων. Tα DRV µπορούν να µετατραπούν σε πιο οµοιογενείς παρασκευές αν χρειαστεί, χρησιµοποιώντας συνδυασµό φίλτρων και διαπίδυσης. 21

37 Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση (Freeze thaw sonication method, FTS) Η προηγούµενη DRV µέθοδος είναι παραλλαγή µίας άλλης παρόµοιας που αναπτύχθηκε νωρίτερα από τους Pick, Kasahara and Hinckle, 1981, κατά την οποία το προς εγκλωβισµό υλικό εισάγεται στα λιποσώµατα επίσης µετά το σχηµατισµό τους. Σε αυτή την περίπτωση ακολουθείται µία πορεία επαναλαµβανόµενης ψύξης απόψυξης για τη διάρρηξη των SUV λιποσωµάτων, κατά τη διάρκεια της οποίας η διαλυµένη ουσία εξισορροπείται µεταξύ εσωτερικού και εσωτερικού, ενώ τα λιποσώµατα συντήκονται και αυξάνουν αξιοσηµείωτα σε µέγεθος. Έτσι επιτυγχάνονται ποσοστά εγκλωβισµού µέχρι και 30%. Τα λιποσώµατα που παράγονται µε τη µέθοδο αυτή παρουσιάζουν σηµαντικά µειονεκτήµατα σε σύγκριση µε τα DRV λιποσώµατα. Το κυριότερο είναι ότι δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν ουδέτερα λιπίδια και ειδικά το PC, γιατί πιθανώς η παρουσία φορτίου απαιτείται για το σχηµατισµό των κρυστάλλων κατά τη διαδικασία της ψύξης, που βοηθούν στη συνέχεια την πορεία θραύση / σύντηξη. Για παρόµοιους λόγους η σακχαρόζη, δισθενή µεταλλικά ιόντα (που µπορούν να εξουδετερώνουν το επιφανειακό φορτίο) και υψηλής ιονικής ισχύος διαλύµατα αλάτων δεν µπορούν να εγκλωβιστούν αποτελεσµατικά. Ωστόσο η µέθοδος είναι πολύ απλή, ταχεία, ήπια και καταλήγει σε µεγάλα µονοστοιβαδιακά σωµατίδια, χρήσιµα για τη µελέτη φαινοµένων µεταφοράς µέσω µεµβρανών Τεχνική ενός βήµατος (one step method) To λιπίδιο ή το µίγµα λιπιδίων τοποθετούνται σε φιαλίδιο µε πώµα. Προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα νερού ή ρυθµιστικού διαλύµατος, το οποίο έχει προθερµανθεί σε θερµοκρασία υψηλότερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου. Ακολουθεί θέρµανση υπό ανάδευση σε θερµοκρασία επίσης µεγαλύτερη της θερµοκρασίας µετάπτωσης για 4 έως 7 ώρες Ο µηχανισµός σχηµατισµού λιποσωµάτων απουσία οργανικών διαλυτών και επιφανειοδραστικών ουσιών, δεν είναι πλήρως γνωστός. Κάτω από ήπιες συνθήκες, η ενυδάτωση των λιπιδίων είναι µία αργή διαδικασία. Η ύπαρξη φορτισµένων λιπιδίων, η παρουσία και η συγκέντρωση της χοληστερόλης και η ιονική ισχύς του υδατικού µέσου, επηρεάζουν το σχηµατισµό λιποσωµάτων. Μία εναλλακτική περίπτωση είναι η µέθοδος που έχει γίνει γνωστή ως µέθοδος φυσαλίδας ("bubble method"). Η µέθοδος αυτή χρησιµοποιεί άζωτο στη 22

38 διεπιφάνεια νερού λιπιδίου, για τη µείωση του µεγέθους των παρασκευασθέντων λιποσωµάτων Μέθοδοι καθαρισµού λιποσωµάτων Τα λιποσώµατα είναι πολύ µεγαλύτερα -σε µέγεθος- από τα υλικά που εγκλωβίζουν. Επιπλέον, είναι απαραίτητο να πραγµατοποιείται διαχωρισµός των λιποσωµάτων από το µη ενσωµατωµένο υλικό προκειµένου να γίνει ο χαρακτηρισµός και η µελέτη τους. Αυτός ο διαχωρισµός είναι δυνατόν να βασίζεται είτε στη διαφορά µεγέθους (χρωµατογραφία στήλης, διαπίδυση) είτε στη διαφορά πυκνότητας µεταξύ λιποσωµάτων και µη εγκλωβισµένης ουσίας Χρωµατογραφία στήλης (Gel filtration - Column Chromatography) Οι πλέον διαδεδοµένες γέλες για αυτόν τον τύπο διαχωρισµού, είναι οι στήλες Sephadex-G50 (Pharmacia LKB) που αποτελούνται από διακλαδούµενα πολυµερή δεξτράνης. Δύο σηµεία αξίζουν ιδιαίτερης προσοχής αναφορικά µε τη χρήση Sephadex για τα λιποσώµατα: Ένας µικρός αριθµός θέσεων επάνω στην επιφάνεια της πολυδεξτράνης είναι δυνατό να συνδέεται και να αλληλεπιδρά µε τη λιποσωµική µεµβράνη. Αν και αυτή η αλληλεπίδραση µπορεί να µην επηρεάζει τα χαρακτηριστικά ροής του λιποσωµικού εναιωρήµατος µέσω της στήλης, ίσως υπάρχει µικρή απώλεια λιπιδίου και κάποιου βαθµού αποσταθεροποίηση της µεµβράνης που να οδηγεί σε µεταβολές της διαπερατότητας και σε διαφυγή της εγκλωβισµένης ουσίας. Αυτό παρατηρείται ιδιαίτερα σε χαµηλές συγκεντρώσεις λιπιδίου. Το πρόβληµα µπορεί να ξεπεραστεί είτε µε τη διαπέραση λιποσωµάτων που δεν είναι πολύ µικρά σε µέγεθος, είτε µε κορεσµό της στήλης µε άδεια λιποσώµατα ίδιας λιπιδικής σύστασης µε τα προς διαχωρισµό δείγµατα. Μεγαλύτερα λιποσώµατα (> 0,4 µm) µπορεί να συγκρατούνται στη στήλη εάν το µέγεθος πόρων της γέλης είναι πολύ µικρό. Στήλες Sephadex µε µέγεθος σωµατιδίων µm θεωρούνται κατάλληλες για το διαχωρισµό MLV λιποσωµάτων, ενώ δεν υπάρχει περιορισµός για τα SUV λιποσώµατα. 23

39 Διαπίδυση (Dialysis) Κατά τη διεργασία της διαπίδυσης η λιποσωµική διασπορά τοποθετείται σε µεµβράνη και µέσα σε δοχείο µε ορισµένο όγκο καθαρού διαλύτη. Η πειραµατική διάταξη αποτελείται από µια περισταλτική αντλία η οποία ανακυκλώνει τα λιποσώµατα µέσω ινών (hollow fibers) που περνούν από τη συσκευή διαπίδυσης, ενώ µια δεύτερη αντλία διακινεί ρυθµιστικό διάλυµα γύρω από το εξωτερικό των ινών. Οι ίνες είναι στενά τριχοειδή, που αποτελούνται είτε από κυπροφάνη ή από µεµβράνες οξικής κυτταρίνης. Κατά τη διαπίδυση τα ιόντα ηλεκτρολυτών και άλλες ουσίες µικρού µοριακού βάρους εξέρχονται µέσω των πόρων της µεµβράνης, ενώ τα λιποσώµατα λόγω µεγέθους δε µπορούν να εξέλθουν. Η µέθοδος αυτή είναι εξαιρετικά κατάλληλη για την προετοιµασία λιποσωµικών παρτίδων µέσου µεγέθους για βιοµηχανική και κλινική χρήση Φυγοκέντρηση (Centrifugation) Η φυγοκέντρηση είναι ακόµη µία τεχνική διαχωρισµού µε ευρεία εφαρµογή, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις κατά τις οποίες πρωτεΐνες ή DNA έχουν εγκλωβιστεί στα λιποσώµατα ή το εγκλωβισµένο υλικό είναι γνωστό ότι σχηµατίζει µεγάλα συσσωµατώµατα. Η πυκνότητα των λιποσωµάτων από PC είναι 1,0135 g/ml (Johnson S.M. et al., 1973). Η τιµή αυτή αυξάνει ελαφρώς µε την προσθήκη χοληστερόλης και είναι ακόµη µεγαλύτερη για κορεσµένα λιπίδια κάτω από τη θερµοκρασία µετάπτωσης. Στην περίπτωση εγκλωβισµού πρωτεϊνών στα λιποσώµατα η πυκνότητα αυξάνεται σηµαντικά. Έχει υπολογιστεί ότι για SUV λιποσώµατα από PC ο συντελεστής καταβύθισης S (sedimentation coefficient) στο νερό διπλασιάζεται όταν στη λιπιδική διπλοστοιβάδα ενσωµατωθούν µεγάλα ποσά χοληστερόλης. Εποµένως, ανάλογα µε τη λιπιδική σύσταση η καταβύθιση των SUV χρειάζεται περίπου έως 20 ώρες στα g σε υπερφυγόκεντρο, ενώ για την καταβύθιση των MLV λιποσωµάτων αρκεί µία ώρα φυγοκέντρηση στα g ή και λιγότερο ανάλογα µε το µέγεθος. Σε περιπτώσεις όπου η εγκλωβισµένη ουσία είναι σε υψηλή συγκέντρωση είτε όταν χρησιµοποιούνται διαλύµατα ενώσεων υψηλού ΜΒ σε συγκεντρώσεις 24

40 ισοοσµωτικές µε φυσιολογικό ορό, η πυκνότητα του µέσου εναιώρησης µπορεί να πλησιάσει ή να υπερβεί αυτή του λιπιδίου και να καταστήσει αδύνατη την καταβύθιση. Το πρόβληµα αυτό µπορεί να αντιµετωπιστεί µε διάλυση των λιποσωµάτων σε ένα µέσο πολύ χαµηλότερης πυκνότητας, ώστε τα λιποσώµατα να καταβυθιστούν Δυναµικό επιφάνειας λιποσωµάτων (ζ-δυναµικό) Οι ιδιότητες των λιποσωµάτων εξαρτώνται ή επηρεάζονται σηµαντικά από την παρουσία φορτίου στην επιφάνειά τους, το οποίο επηρεάζει την κατανοµή ιόντων στο µέσο διασποράς. Οι σηµαντικότεροι µηχανισµοί απόκτησης επιφανειακού ηλεκτρικού φορτίου από το µέσο διασποράς είναι ο ιονισµός, η προσρόφηση ιόντων και η διάλυση ιόντων από το κρυσταλλικό πλέγµα. Ιόντα αντίθετου φορτίου έλκονται από τη φορτισµένη επιφάνεια, ενώ οµώνυµα ιόντα απωθούνται από αυτή. Σχηµατίζεται ηλεκτρική διπλοστοιβάδα λόγω θερµικής κίνησης και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, η οποία επεξηγεί τα ηλεκτροκινητικά φαινόµενα που εµφανίζονται στις λιποσωµικές µορφές. Ονοµάζονται ηλεκτροκινητικά επειδή η επιβολή εξωτερικού δυναµικού σε λιποσωµικές παρασκευές προκαλεί κίνηση. Η ηλεκτροφόρηση προκαλεί την κίνηση φορτισµένων σωµατιδίων µέσα σε στάσιµο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρµοζόµενης διαφοράς δυναµικού. Η κίνηση αυτή µετράται µε Φασµατοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy PCS). Βασίζεται στη µετατόπιση Ντόπλερ (Doppler) η οποία προκαλείται από την πρόσπτωση µονοχρωµατικής ακτινοβολίας (laser He-Ne, 5mV, 633 nm) στα µικρά κινούµενα σωµατίδια. Από τις µετρούµενες κινητικότητες, δύο παράµετροι που χαρακτηρίζουν τις ηλεκτρικές ιδιότητες των λιποσωµάτων, µπορούν να υπολογισθούν: το ηλεκτρικό δυναµικό (ζ-potential) και η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου (surface charge density) σ. Από τη γνώση της κατεύθυνσης θετικό ή αρνητικό ηλεκτρόδιο- και της ταχύτητας µετακίνησης, µπορούν να προσδιορισθούν το πρόσηµο και το µέγεθος του ζ-δυναµικού. Η εξίσωση Helmholtz-Smoluchowski που ακολουθεί, δίνει την τιµή του ζ-δυναµικού όπου u (cm/sec) είναι η ταχύτητα µετακίνησης του λιποσώµατος στο σωλήνα του κελιού ηλεκτροφόρησης, n το ιξώδες του µέσου (dyn.sec/cm 2 ), ε η διηλεκτρική σταθερά του µέσου και Ε η ένταση (βαθµίδωση) του δυναµικού (V/cm). ζ=ε εnu Εξίσωση Helmholtz - Smoluchowski (1) 25

41 To ζ-δυναµικό σχετίζεται µε το δυναµικό επιφάνειας των σωµατιδίων και επηρεάζει µεγάλο φάσµα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστηµάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους µε ηλεκτρολύτες και βιοδραστικές ενώσεις, καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρηµάτων τους. Η τιµή του ζ-δυναµικού αποτελεί ένδειξη για την εκτίµηση σταθερότητας των κολλοειδών διασπορών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι λιποσωµικές διασπορές µε µεγάλο θετικό ή αρνητικό ζ-δυναµικό εµφανίζουν απωστικές δυνάµεις, που εµποδίζουν τη συσσώρευση, πήξη, συσσωµάτωση και κατακρήµνιση των σωµατιδίων Μεταβολική πορεία των λιποσωµάτων στον οργανισµό Οδοί χορήγησης λιποσωµικών µορφών Παρεντερική χορήγηση Τα λιποσώµατα που πρόκειται να χορηγηθούν παρεντερικά πρέπει να είναι αποστειρωµένα, ελεύθερα πυρετογόνων και ελεύθερα σωµατιδίων. Επιπλέον, πρέπει να είναι καλά χαρακτηρισµένα όσον αφορά το µέγεθος, το φορτίο και τη σταθερότητα κατά την αποθήκευση και κατά την in vivo χρήση. Τα λιποσώµατα για παρεντερική χρήση αποστειρώνονται µέσω φίλτρου ή µε εφαρµογή γ ακτινοβολίας. Στόχος της χορήγησης είναι η µεταφορά της βιοδραστικής ένωσης στο κύτταροστόχος (Σχήµα 1.11) α) Ενδοφλέβια Η ενδοφλέβια οδός (iv) θεωρείται ως η πλέον υποσχόµενη οδός χορήγησης λιποσωµικών προϊόντων καθώς και η πλέον χρησιµοποιούµενη. Μετά από iv χορήγηση, τα λιποσώµατα αποµακρύνονται γρήγορα από την κυκλοφορία µε το ΔΕΣ και κυρίως από τα καθηλωµένα µακροφάγα που βρίσκονται στο ήπαρ και το σπλήνα. Αυτή η δράση των µακροφάγων είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθεί προκειµένου για παθητική στόχευση αυτών των κυττάρων, αλλά συνήθως θεωρείται εµπόδιο που πρέπει να ξεπεραστεί. β) Ενδοπεριτοναϊκή H ενδοπεριτοναϊκή οδός (ΕΠ) είναι παρόµοια από πολλές απόψεις µε την iv χορήγηση, αλλά ο πόνος στην περιοχή της χορήγησης την καθιστά λιγότερο επιθυµητή. Διάφορες µελέτες έχουν αποδείξει την αποτελεσµατικότητα της ΕΠ 26

42 χορήγησης λιποσωµάτων. Για παράδειγµα, έχει επιτευχθεί παρατεταµένη δράση της βιοδραστικής ένωσης µεθοτρεξάτη µέσω ΕΠ χορήγησης λιποσωµάτων που περιέχουν το βιοδραστική ένωση. Η µεταβολική πορεία των λιποσωµάτων µετά από αυτή την οδό χορήγησης εξαρτάται κυρίως από το µέγεθός τους. Τα µικρά µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα (SUVs) µετακινούνται ταχύτατα από το λεµφικό σύστηµα και απελευθερώνονται στη γενική κυκλοφορία. Εκεί, υποβάλλονται σε αποµάκρυνση µέσω του ΔΕΣ όπως τα iv χορηγούµενα λιποσώµατα. Τα MLVs είναι πολύ µεγάλα για να εισέλθουν στα λεµφαγγεία και έτσι συγκρατούνται στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Έτσι, µπορούν να λειτουργούν ως αποθήκη απ όπου απελευθερώνεται η βιοδραστική ένωση. Σχήµα Ένα µονοστοιβαδιακό σωµατίδιο που περιέχει ένα βιοδραστική ένωση (*) αναγνωρίζει το κύτταρο-στόχος, µέσω ενός συνδέσµου όπως π.χ. η οψωνίνη (~<). Σε αυτό το απλοποιηµένο σχήµα, η επαφή µε το κύτταρο ακολουθείται από ενδοκύττωση του λιποσώµατος ( ). Το ενδόσωµα που περιέχει το λιπόσωµα µπορεί να συντηχθεί µε ένα λυσόσωµα. Το προκύπτον σωµατίδιο (γνωστό και ως φαγολυσόσωµα), λυσοσωµικές φωσφολιπάσες ( ) αποικοδοµούν το λιπόσωµα και ελευθερώνουν το βιοδραστική ένωση που είτε µπορεί να δράσει εντός του οργανιδίου, η να διαχυθεί σε άλλες περιοχές του κυττάρου. Ν: πυρήνας, GA: σύµπλεγµα Golgi SER:λείο ενδοπλασµατικό δίκτυο, REP: αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο, M: µιτοχόνδριο, L: λυσόσωµα, e: περιβάλλον (Gregoriadis G., 1990) 27

43 γ) Υποδόρια Η υποδόρια (ΥΔ) ένεση λιποσωµικών προϊόντων παρέχει τοπική δράση και/ ή χρησιµεύει ως δεξαµενή της βιοδραστικής ένωσης για παρατεταµένη αποδέσµευση. Τα λεµφαγγεία έχουν κενά µεγαλύτερα από 0.1 µm τα οποία µεγαλώνουν δραµατικά µετά από φλεγµονή. Αυτά τα κενά επιτρέπουν την εισχώρηση των MLVs, LUVs και SUVs στο λεµφικό σύστηµα. Έτσι, είναι δυνατό να µεταφερθούν υψηλές συγκεντρώσεις κυτταροτοξικών βιοδραστικών ενώσεων ή ραδιοεπισηµασµένων παραγόντων στο λέµφωµα ή συµπαγείς όγκους που έχουν υποστεί µετάσταση στα λεµφαγγεία. Η υποδόρια χορήγηση παρέχει παρατεταµένη δράση στη λιποσωµική ινσουλίνη. δ) Ενδοµυϊκή Όπως και στην υποδόρια ένεση, αρνητικά φορτισµένα λιποσώµατα διασπείρονται από την περιοχή της ένεσης πιο αργά σε σχέση µε αρνητικά φορτισµένα ή ουδέτερα λιποσώµατα. Τα λιποσώµατα µπορεί να απελευθερώνουν το βιοδραστική ένωση στην περιοχή της ένεσης, αλλά κάποια στοιχεία δείχνουν ότι οι µυϊκές ίνες µπορεί να «τραβούν» θετικά φορτισµένα SUVs, πιθανότατα λόγω σύντηξης λιποσώµατος-κυττάρου. Αυξάνοντας το περιεχόµενο των λιποσωµάτων σε χοληστερόλη επιβραδύνεται η απελευθέρωση της ινσουλίνης Τοπική χορήγηση λιποσωµάτων α) Δέρµα Αν η περιοχή δράσης της βιοδραστικής ένωσης είναι οι βαθύτερες στιβάδες του δέρµατος, η βιοδραστική ένωση µπορεί να µην φτάσει σε αυτή την περιοχή, ή µπορεί να αποµακρυνθεί γρήγορα µέσω της κυκλοφορίας του αίµατος οδηγώντας σε σύντοµη διάρκεια δράσης. Τα άδεια λιποσώµατα ενυδατώνουν το δέρµα προσθέτοντας απλώς λιπίδια στο stratum corneum και γι αυτό έχουν βρει εφαρµογή στη βιοµηχανία καλλυντικών. Η ενισχυµένη µεταφορά βιοδραστικών ενώσεων µε λιποσώµατα αποδίδεται στο λιπιδικό υµένιο που παράγεται στο δέρµα και αυξάνει την ενυδάτωσή του. Ωστόσο, σύγκριση λιποσωµικών συστηµάτων µεταφοράς µε συµβατικά συστήµατα όπως αλοιφές, κρέµες και πλύµατα οδηγεί στο συµπέρασµα ότι τα λιποσώµατα βελτιώνουν την ικανότητα της βιοδραστικής ένωσης να διαπερνά το stratum corneum. Αυτό µπορεί να οφείλεται στη λιπόφιλη φύση των λιποσωµάτων, η οποία τα καθιστά 28

44 αναµίξιµα µε την επιφάνεια του δέρµατος και οδηγεί σε καλύτερη απορρόφηση της βιοδραστικής ένωσης. Επιπλέον, τα λιποσώµατα µπορούν να συγκρατούν τη βιοδραστική ένωση στο δέρµα µειώνοντας τις συστηµατικές παρενέργειες. Τα MLVs δρουν ως αποθήκες τοπικής παρατεταµένης δράσης, απελευθερώνοντας την εγκλωβισµένη βιοδραστική ένωση. Λιπόφιλες βιοδραστικές ενώσεις, όπως η προγεστερόνη και η υδροκορτιζόνη µπορεί να µεταφέρονται κατ ευθείαν από τα λιποσώµατα στα κύτταρα του δέρµατος. β) Οφθαλµική χορήγηση Τα κύρια προβλήµατα µε τις συµβατικές οφθαλµικές σταγόνες είναι η φτωχή διείσδυση της βιοδραστικής ένωσης στον οφθαλµικό ιστό και η σύντοµη διάρκεια δράσης. Συνήθως υπάρχει µια ταχεία αύξηση και πτώση της συγκέντρωσης της βιοδραστικής ένωσης µετά την εφαρµογή απλών οφθαλµικών σταγόνων. Τα νεότερα οφθαλµικά προϊόντα επιτρέπουν παρατεταµένη απελευθέρωση της βιοδραστικής ένωσης στον οφθαλµό, αλλά έχουν µικρή ή καθόλου επίδραση στη διείσδυση της βιοδραστικής ένωσης. Υπάρχουν πολλά παραδείγµατα αύξησης της δραστικότητας µιας βιοδραστικής ένωσης όταν ενσωµατώνεται σε λιποσωµικές µορφές. Έρευνες έχουν δείξει µεγαλύτερες συγκεντρώσεις βιοδραστικής ένωσης στον οφθαλµό µετά από χορήγηση LUVs και MLVs παρά µε SUVs. Ωστόσο, φαίνεται ότι τα λιποσώµατα είναι αποτελεσµατικό σύστηµα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων κυρίως για λιπόφιλες βιοδραστικές ενώσεις. γ) Πνευµονική χορήγηση Στην πνευµονική χορήγηση, η απόθεση και η κάθαρση MLVs και SUVs τα οποία χορηγούνται ως αερόλυµα εξαρτάται µόνο από το µέγεθος των σταγονιδίων, παρά από το µέγεθος και το φορτίο των λιποσωµάτων. Οι βιοδραστικές ενώσεις που χορηγούνται µε αυτό τον τρόπο εµφανίζουν παρόµοια θεραπευτική δραστικότητα µε το ελεύθερη βιοδραστική ένωση, αλλά δεν εµφανίζουν γαστρική τοξικότητα και άλλες συστηµατικές παρενέργειες. Τα λιποσώµατα δεν απορροφούνται άµεσα από τους πνεύµονες, αλλά παρέχουν παρατεταµένη απελευθέρωση της βιοδραστικής ένωσης Xορήγηση per os Η χρήση των λιποσωµάτων ως per os συστήµατα µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων έχει µεγάλο ενδιαφέρον. Ωστόσο, αυτή η οδός χορήγησης είναι αρκετά 29

45 αντιφατική όσον αφορά την επιτυχία της. Ένας παράγοντας που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι η µεταβολική πορεία των λιποσωµάτων στον γαστροεντερικό σωλήνα. Διάφορα στοιχεία δείχνουν ότι τα λιποσώµατα δεν µεταφέρονται κατά µήκος του εντερικού επιθηλίου, αλλά µικρά ποσά ενδοκυτταρώνονται και αποικοδοµούνται στα λυσοσώµατα. Αυτό οδηγεί πιθανά σε µικρό ποσό βιοδραστικής ένωσης να φτάνει στη γενική κυκλοφορία µέσω παθητικής διάχυσης. Ωστόσο, υπάρχουν αναφορές επιτυχούς µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων µέσω λιποσωµάτων per os, πχ. για την ηπαρίνη Λιποσώµατα: Εφαρµογές Υπάρχουν διάφοροι λόγοι για τους οποίους η χρήση των λιποσωµάτων ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων έχει επεκταθεί τα τελευταία χρόνια. Διαλυτοποίηση : Τα λιποσώµατα µπορούν να διαλυτοποιήσουν λιπόφιλες βιοδραστικές ενώσεις τα οποία αλλιώς θα ήταν πολύ δύσκολο να χορηγηθούν ενδοφλέβια Προστασία : Οι βιοδραστικές ενώσεις που βρίσκονται εγκλωβισµένα σε λιποσώµατα είναι απρόσιτα για τα µεταβολικά ένζυµα. Από την άλλη πλευρά, συστατικά του σώµατος (όπως ερυθροκύτταρα ή ιστοί στην περιοχή της ένεσης) δεν εκτίθενται άµεσα σε όλη τη δόση της βιοδραστικής ένωσης Διάρκεια δράσης : Τα λιποσώµατα µπορούν να επιµηκύνουν τη διάρκεια δράσης απελευθερώνοντας αργά τη βιοδραστική ένωση στο σώµα Δυνατότητα κατεύθυνσης: Οι επιλογές στόχευσης µεταβάλλουν την κατανοµή της βιοδραστικής ένωσης στο σώµα Εσωτερίκευση : Τα λιποσώµατα ενδοκυτταρώνονται ή φαγοκυτταρώνονται από τα κύτταρα, δηµιουργώντας ευκαιρίες για χρήση βιοδραστικών ενώσεων εξαρτώµενων από λιποσώµατα. Δοµές βασισµένες σε λιπίδια (όχι απαραίτητα λιποσώµατα) είναι επίσης ικανές να µεταφέρουν πλασµιδικό υλικό εντός των κυττάρων µέσω του ίδιου µηχανισµού (µη-ιικά συστήµατα επιµόλυνσης) Ενίσχυση : Τα λιποσώµατα µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως βοηθητικά σε εµβόλια 30

46 Στον πίνακα 1.3 απεικονίζονται ορισµένες πιθανές ιατρικές εφαρµογές των λιποσωµάτων: Πίνακας 1.3 Εφαρµογές λιποσωµάτων ΕΦΑΡΜΟΓΉ Γονιδιακή και αντινοηµατική θεραπεία Υποκατάστατο αίµατος Ανοσοδιαµόρφωση ΕΠΙΘΥΜΗΤΕ Σ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑ- ΤΩΝ Υψηλός εγκλωβισµός DNA, σταθερότητα, ελεγχόµενος ρυθµός κάθαρσης, στόχευση, σύντηξη Υψηλός εγκλωβισµός Hb, αποδεκτό ιξώδες, σταθερότητα, µακρά κυκλοφορία Υψηλός εγκλωβισµός, σταθερότητα, ελεγχόµενος ρυθµός κάθαρσης, στόχευση Απευαισθητοποίηση Θεραπεία πνευµόνων (π.χ. καρκίνος, άσθµα, κυστική ίνωση) ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗ ΜΟΡΦΗ ΦΑΡΜΑΚΟΥ πλασµιδιακό DNA, αντινοηµατικά ολιγονουκλεοτίδια Aιµογλοβίνη (Hb), συνθετικοί µεταφορείς οξυγόνου Ενδογενείς κυτοκίνες (π.χ. IL, TNF): εξωγενή προϊόντα (π.χ. διεστέρες τρεαλόζης) Αλλεργιογόνα και εκχυλίσµατα αλλεργιογόνου Αντικαρκινικά και αντιµικροβιακά βιοδραστικές ενώσεις, αντι-ασθµατικοί παράγοντες, πλασµιδιακό DNA ΟΔΟΣ ΧΟΡΗΓΗ- ΣΗΣ ΕΦ, ΕA, ΕM, ΕT ΤΟΠΙΚΗ (PER OS?) ΕΦ ΕΦ, ΕM, ΥΔ, ΕT ΕM, ΥΔ, PER OS(?) ΕΤ Υψηλός εγκλωβισµός αλλεργιογόνο, σταθερότητα, εγκλωβισµός όλων των αλλεργιογόνων Σταθερότητα (συγκράτηση βιοδραστικής ένωσης) σε αερόλυµα ΘΕΜΑΤΑ ΕΡΕΥΝΑΣ IN VIVO Πορεία µετά τη χορήγηση (σταθερότητα, κάθαρση, κατανοµή), µηχ. Δράσης, τοξικότητα, ανοσογονικότητα DNA Σταθερότητα, ρυθµός αποµάκρυνση, χρόνος προθροµβίνης, αέρια αίµατος Στόχευση σε ανοσοκύτταρα (Τ και Β λεµφοκύτταρα, µονοπύρηνα): αλ/δραση µε κυτ/κούς υποδοχείς Μείωση της ΙgE και αύξηση IgG, όριο δόσης για ανοσολογική δράση, ασφάλεια (αποφυγή αναφυλακτικού shock) Επίπεδα C βιοδραστικής ένωσης στην αναπνευστική συσκευή Συντµήσεις: ΕΑ: ενδοαρτηριακά, ΕΜ: ενδοµυϊκά, ΕΤ: ενδοτραχειακά, ΕΦ: ενδοφλέβια, ΥΔ: υποδόρια, ΙL: ιντερλευκίνες, TNF: παράγοντας νέκρωσης όγκου, ΙgE: ανοσοσφαιρίνη Ε, IgG: ανοσοσφαιρίνη G 31

47 Ως φορείς εµβολίων Ως αντιµικροβιακά Οι µικροβιακές µολύνσεις µπορούν να χωριστούν σε βακτηριακές, παρασιτικές, µυκητιακές και ιϊκές. Εφόσον τα λιποσώµατα θεωρούνται ιδανικά για τη µεταφορά βιοδραστικών ενώσεων στα κύτταρα του ΔΕΣ, µια πιθανή χρήση είναι η µεταφορά παραγόντων οι οποίοι είναι δραστικοί ενεργοποιητές του ανοσοποιητικού συστήµατος. Ιοί: Γενικά, οι ιϊκές µολύνσεις είναι εξαιρετικά δύσκολο να αντιµετωπιστούν και υπάρχουν λίγες αποτελεσµατικές θεραπείες. Η χρήση των λιποσωµάτων µπορεί να ενισχύσει την ενδοκυτταρική µεταφορά αντι-ιϊκών παραγόντων, λόγω της ικανότητάς τους να διαπερνούν τοπικά αποφεύγοντας τη συστηµατική απορρόφηση. Ένα επιπλέον πλεονέκτηµα είναι η ικανότητά τους να µεταφέρουν ιδιαίτερα λιπόφιλα βιοδραστικές ενώσεις. Πρωτόζωα: Τα λιποσώµατα έχουν επίσης χρησιµοποιηθεί για την ενσωµάτωση αντιπαρασιτικών βιοδραστικών ενώσεων. Αυτό αυξάνει δραστικά την αποτελεσµατικότητά τους µέσω παθητικής στόχευσης στα µακροφάγα. Επιπρόσθετα, η χρήση των λιποσωµάτων ως φορείς για βιοδραστικές ενώσεις κατά των µονιλιάσεων παρέχει παρατεταµένο θεραπευτικό αποτέλεσµα. Βακτήρια: Η ανθεκτικότητα των βακτηριακών µολύνσεων στην αντιβιοτική θεραπεία οφείλεται σε µειωµένη πρόσληψη των βιοδραστικών ενώσεων. Ο εγκλωβισµός τους σε λιποσώµατα µπορεί να βελτιώσει την πρόσληψη τους από τα βακτήρια. Τα λιποσώµατα αυξάνουν τη διάρκεια δράσης των αντιβιοτικών, µειώνουν την τοξικότητά τους και µπορεί ακόµα και να διευρύνουν τα θεραπευτικά τους όρια. Μύκητες: Μια άλλη πολλά υποσχόµενη χρήση των λιποσωµάτων είναι ως φορείς αντιµυκητιακών βιοδραστικών ενώσεων, ιδιαίτερα για την αµφοτερικίνη Β. Αυτή η βιοδραστική ένωση έχει περιορισµένη εφαρµογή λόγω των σοβαρών παρενεργειών που εµφανίζει. Αντίθετα, η λιποσωµική αµφοτερικίνη παρουσιάζει πολύ µικρότερη τοξικότητα, γεγονός που βελτιώνει αισθητά το θεραπευτικό δείκτη Λιποσώµατα στη θεραπεία του καρκίνου Υπάρχουν τρεις γενικοί τρόποι για την αύξηση της αποτελεσµατικότητας της χηµειοθεραπείας σε κακοήθεις ασθένειες 32

48 Εφαρµογή νέων συνδυασµών θεραπείας µε διαφορετική δοσολογία και αγωγή για τις ήδη υπάρχουσες βιοδραστικές ενώσεις Ανάπτυξη νέων βιοδραστικών ενώσεων µε διαφορετικές φαρµακολογικές ιδιότητες Βελτίωση της αποτελεσµατικότητας των υπαρχόντων βιοδραστικών ενώσεων µεταβάλλοντας τις φαρµακοκινητικές ιδιότητες ώστε να µεγιστοποιηθεί ο θεραπευτικός τους δείκτης Η χρήση των λιποσωµάτων στοχεύει στην τελευταία περίπτωση. Ο εγκλωβισµός χηµειοτοξικών παραγόντων µέσα σε λιποσώµατα µπορεί να προστατεύσει ευαίσθητους ιστούς από την τοξικότητα της βιοδραστικής ένωσης. Μέγιστη αποτελεσµατικότητα επιτυγχάνεται µε χορήγηση συνδυασµού αντικαρκινικών βιοδραστικών ενώσεων σε λιποσωµικές µορφές (Σχήµα 1.12). Μια άλλη χρησιµότητα των λιποσωµάτων στη θεραπεία του καρκίνου είναι η βραδεία αποδέσµευση της βιοδραστικής ένωσης. Τα λιποσώµατα επίσης µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως φορείς για ασταθείς βιοδραστικές ενώσεις (αλκυλιωτικοί παράγοντες) καθώς και για παράγοντες που είναι πολύ υδατοδιαλυτοί και δεν διαπερνούν την κυτταρική µεµβράνη. Σχήµα 1.12: Στόχευση ενζυµικού προβιοδραστικής ένωσης µε αντίσωµα µέσω ανοσοενζυµοσώµατος. Το ανοσο-ενζυµόσωµα συνδέεται στα κύτταρα στόχους. Έτσι, αποδίδεται το προβιοδραστική ένωση το οποίο ενεργοποιείται από τα ανοσο-ενζυµοσώµατα στο κύτταρο στόχο. Κατά συνέπεια, το δραστικό θανατώνει το κύτταρο. 33

49 Άλλες εφαρµογές των λιποσωµάτων Τα λιποσώµατα χρησιµοποιούνται ακόµα στη µεταφορά οξυγόνου, στη θεραπεία ενζυµικής αντικατάστασης, στην αρθρίτιδα, σε δηλητηριάσεις από µέταλλα, ως διαγνωστικοί παράγοντες και ως αναστολείς ανοσολογικών αντιδράσεων Λιποσώµατα Ηπαρίνη Λιποσώµατα µε εγκλωβισµένη ηπαρίνη (Σχήµα 1.13) σχηµατίστηκαν για πρώτη φορά από τους Ueno, et al., το 1982, τα οποία χορήγησαν δια στόµατος σε σκύλους και παρατήρησαν την αντιπηκτική τους δράση. Σχήµα 1.13: Δοµή της ηπαρίνης. Οι Sharma C.P. and Jayasree G. Πραγµατοποίησαν µία σειρά τροποποιήσεων την επιφάνειας πολυµερών µε στόχο την ενίσχυση της αιµοσυµβατότητας ποικίλων καρδιαγγειακών και παρόµοιων εφαρµογών, όπου η προσθετική συσκευή έρχεται σε επαφή µε το αίµα, χωρίς το πρόβληµα υπερβολικής δόσης που συνήθως προκαλείται από την ηπαρίνη. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποίησαν επιφάνειες από 34

50 πολυαιθερουρεθάνη τις οποίες επεξεργάστηκαν µε διάφορους τρόπους, ένας εκ των οποίων περιλαµβάνει την έκθεσή τους σε φωσφορυλοχολίνη, εκφόρτιση λόγω θερµότητας (glow discharge treatment, GDT) για 15 λεπτά και νέα έκθεσή σε λιποσώµατα µε εγκλωβισµένη ηπαρίνη. Οι επιφάνειες που υποβλήθηκαν σε αυτού του είδους την κατεργασία παρουσίασαν τον ελάχιστον αριθµό προσκολληµένων αιµοπεταλίων σε σύγκριση µε επιφάνειες διαφορετικά τροποποιηµένες, ενώ ακόµη ακόµη µικρότερο αριθµό είχαν εκείνες που εκτέθηκαν µε παρόµοιο τρόπο σε λιποσώµατα φωσφορυλοχολίνης µε ηπαρίνη. Την επίδραση αυτή εξήγησαν µε την υπόθεση ότι η πρόσθετη διγλυκεριδική οµάδα στο PC που περιέχει λιπαρά οξέα πιθανόν προάγει την αιµοπεταλιακή συγκόλληση (Sharma CP. and Chandy T., 1983), συγκριτικά µε τη φωσφορυλοχολίνη, ενώ και η παρουσία χοληστερόλης στα λιποσώµατα µπορεί να ευνοεί θροµβωτικά επεισόδια (Chandy T. and Sharma CP., 1985). Επίσης από τα πειράµατα αυτά καταφαίνεται ότι η τεχνική GDT µετατρέπει τις επιφάνειες σε εξαιρετικά υδρόφιλες, ίσως λόγω της δηµιουργίας πολικών οµάδων, ενώ µετά την πρόσδεση λιποσωµάτων ηπαρίνης ή φωσφορυλοχολίνης-ηπαρίνης αυτές καθίστανται σχετικά υδρόφοβες. Πιο πρόσφατα µελετήθηκε η δυνατότητα χρήσης λιποσωµάτων µε ηπαρίνη προκειµένου να βελτιωθεί η σταθερότητα αλλά και η αιµοσυµβατότητα αυτών. Όπως αναµενόταν η προσθήκη της ηπαρίνης σε θετικά φορτισµένα PC/Chol/SA λιποσώµατα συντέλεσε στην ταχεία συσσωµάτωση των λιποσωµάτων. Αντίθετα δεν παρατηρήθηκε συσσωµάτωση µε την ηπαρίνη σε ουδέτερες ή θετικά φορτισµένες λιποσωµικές διπλοστιβάδες, ενώ δε σηµειώθηκε και η απελευθέρωση ηπαρίνης κατά την παρατεταµένη και υπό συγκεκριµένες συνθήκες επώαση των λιποσωµάτων σε ρυθµιστικό διάλυµα και πλάσµα. Η ηπαρίνη, όπως έχει ήδη αναφερθεί, έχει χρησιµοποιηθεί για τη σύνθεση αρκετών βιοσυµβατών µη-θροµβογεννών υλικών. Πολλές µελέτες αναφέρουν ότι επιφάνειες κατεργασµένες µε πολυσακχαρίτες ή πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), παρουσιάζουν µειωµένη λιπιδική ανταλλαγή, διαφυγή υδατικών περιεχωµένων και προσρόφηση πρωτεϊνών του πλάσµατος στη λιπιδική µεµβράνη. Η παρασκευή επιφανειών µε επικάλυψη ηπαρίνης ή λιποσωµάτων-ηπαρίνης που διαµορφώνει ένα υδρόφιλο ή στερεοχηµικό στρώµα προστασίας, έχει πράγµατι συσχετιστεί µε αυξηµένη λιποσωµική σταθερότητα, µειωµένη διαφυγή και εποµένως βελτιωµένη αιµοσυµβατότητα. 35

51 1.2. ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ Ορισµός Το 1929 ο Irving Langmuir χρησιµοποίησε τον όρο «πλάσµα» για να περιγράψει τα ιονισµένα αέρια. Πλάσµα είναι ένα ουδέτερο αέριο που αποτελείται από φορτισµένα και µη σωµατίδια και παρουσιάζει συλλογική συµπεριφορά, δηλαδή τα σωµατίδια αυτά µπορούν να αλληλεπιδρούν σε µεγάλες αποστάσεις συγκριτικά µε το µέγεθός τους. Η κίνηση των σωµατιδίων στο πλάσµα δηµιουργεί κύµατα φορτίων τα οποία δηµιουργούν ηλεκτρικά πεδία µεγάλης εµβέλειας. Αυτά τα ηλεκτρικά πεδία µπορούν να επηρεάσουν την κίνηση φορτισµένων σωµατιδίων σε µεγάλη εµβέλεια. Το πλάσµα αποτελείται από κατιόντα και ηλεκτρόνια µέσα σε µία ουδέτερη µάζα σωµατιδίων. Ζεύγη ηλεκτρονίων-κατιόντων δηµιουργούνται µέσω ιονισµού και χάνονται µε επανασύνδεση µε αποτέλεσµα το πλάσµα να διατηρεί το ουδέτερο φορτίο του. Οι συγκρούσεις ηλεκτρονίων µε ουδέτερα σωµατίδια µπορεί να προκαλέσει και διέγερση των ατόµων ή µορίων, και κατά συνέπεια αποδιέγερση τους µε αυθόρµητη εκποµπή ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας. Αυτό είναι το φαινόµενο αίγλης που συνοδεύει συνήθως το πλάσµα. Παράλληλα υπάρχουν και άλλα είδη συγκρούσεων µε µόρια που οδηγούν σε διάσπαση και έτσι κάνουν το πλάσµα χρήσιµο στις εναποθέσεις, στην παραγωγή ελεύθερων ριζών και γενικά σε αντιδράσεις που θα χρειάζονταν µεγάλη θερµοκρασία για να πραγµατοποιηθούν Εφαρµογές Η τεχνολογία πλάσµατος χρησιµοποιείται σε πολλούς τοµείς όπως σε λαµπτήρες φθορισµού, επεξεργασία επιφανειών, εγχάραξη ή ξηρή λιθογραφία για τη δηµιουργία δοµών στη µικροηλεκτρονική, εναπόθεση υλικών σε επιφάνειες κλπ. Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήσαµε επιφάνειες καλυµµένες µε υλικό που είχε πολυµεριστεί µε τεχνολογία πλάσµατος. Στον πολυµερισµό µε τεχνολογία πλάσµατος παράγεται µία εκκένωση αερίου που παρέχει ενέργεια για ενεργοποίηση ενός µονοµερούς και εκκίνησης του πολυµερισµού. Με την επιλογή κατάλληλου µονοµερούς και την ενεργειακή πυκνότητα του πλάσµατος ανά µονοµερές µπορούµε να ελέγξουµε τη χηµική σύσταση και τη δοµή του πολυµερικού υµενίου. 36

52 1.3. ΑΓΓΕΙΟΠΛΑΣΤΙΚΗ Αθηροσκλήρυνση Αθηρωµατική νόσος ή αθηροσκλήρυνση ονοµάζεται η νόσος που οφείλεται στην προοδευτική στένωση των αρτηριών µέσω σχηµατισµού αθηροµατικών πλακών, λόγω προδιαθεσιακών παραγόντων όπως η υπέρταση, το κάπνισµα, η παχυσαρκία, οι δυσλιπιδαιµίες, ο διαβήτης, η ηλικία, και η κληρονοµικότητα. Η ρήξη της αθηρωµατικής πλάκας και ο σχηµατισµός θρόµβων αίµατος προκαλούν αιφνίδια απόφραξη της αρτηρίας µε συνέπεια την φτωχή αιµάτωση (ισχαιµία) σηµαντικών οργάνων-στόχων όπως το µυοκάρδιο, ο εγκέφαλος και τα περιφερικά αγγεία. Το συµβάν αυτό ονοµάζεται θροµβοεµβολικό επεισόδιο. Τέτοια επεισόδια είναι το αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο (ΑΕΕ) και το οξύ έµφραγµα του µυοκαρδίου (ΟΕΜ). Τέλος, η προοδευτική απόφραξη των περιφερικών αγγείων που ονοµάζεται Περιφερική Αγγειακή Νόσος (ΠΑΝ) οδηγεί στην χρόνια ανεπάρκεια τους µε κύρια σύµπτωµατα τον πόνο των άκρων, την διαλείπουσα χολώτητα αλλά και σειρά άλλων συµπτωµάτων. Η αθηρωµατική νόσος αποτελεί σήµερα την πρώτη αιτία θανάτου στον δυτικό κόσµο Ενδοπροσθέσεις Η διαδερµική διαυλική αγγειοπλαστική µε µπαλόνι (Percutaneous Transluminal Balloon Angioplasty) είναι η διαπλάτυνση ενός στενεµένου αγγείου µε ειδικό καθετήρα που στην άκρη του έχει ένα µικρό µπαλόνι και που εισάγεται µέσα στον αυλό του αγγείου διαµέσου του δέρµατος χωρίς να γίνει χειρουργική τοµή. Η επέµβαση γίνεται συνήθως µε τοπική αναισθησία. Αρχικά παρακεντάται µια αρτηρία µε εύκολη πρόσβαση, όπως η µηριαία αρτηρία στη βουβωνική περιοχή ή η βραχιόνια αρτηρία στο βραχίονα. Προωθείται ένας καθετήρας προς την περιοχή του ενδιαφέροντος, γίνεται έγχυση σκιαγραφικής ουσίας και λαµβάνονται ακτινογραφίες (αγγειογραφία). Κατόπιν γίνεται η αγγειοπλαστική µε µπαλόνι, δηλαδή ο ιατρός φουσκώνει µε αέρα το µπαλόνι µέσα στο στενεµένο αγγείο. Αυτό βοηθά να διευρυνθεί το αγγείο και να αυξηθεί η ροή του αίµατος που περνάει µέσα απ αυτό. 37

53 Σε ορισµένες περιπτώσεις µπορεί να τοποθετηθεί ένα µεταλλικό stent (ενδοπρόσθεση) µέσα στο αγγείο για υποστήριξη του τοιχώµατός του ώστε να το διατηρήσει ανοικτό. Η απόφαση για χρήση stent ή όχι εξαρτάται κυρίως από τη θέση και τη φύση της βλάβης. Οι ενδοπροσθέσεις παραµένουν µέσα στο αγγείο και µπορούν να τοποθετηθούν στις περισσότερες αρτηρίες του ανθρωπίνου σώµατος αλλά τοποθετούνται κυρίως στις νεφρικές, λαγόνιες, µηριαίες, ιγνυακές, κοιλιακή αορτή, στεφανιαίες αρτηρίες, καρωτίδες κλπ. Το µέγεθος των ενδοπροσθέσεων ποικίλει ανάλογα µε το αγγείο που θα τοποθετηθούν από 15 έως 90 mm µήκος ενώ η διάµετρός τους είναι γύρω στα 3 mm. Υπάρχουν κάποιες επιθηµητές ιδιότητες που για τις ενδοπροσθέσεις, αν και δεν έχει παραχθεί ακόµα κάποιο που να τις ικανοποιεί όλες. Η ενδοπρόσθεση πρέπει να κατέχει την κατάλληλη ευκαµψία ώστε να µπορεί να πάρει το σχήµα του αγγείου αλλά και να προσφέρει µια σταθερή επιφάνεια για την ανάπτυξη των ενδοθυλιακών κυττάρων. Το υλικό από το οποίο θα κατασκευαστεί η ενδοπρόσθεση πρέπει να παρουσιάζει την κατάλληλη πλαστικότητα ώστε µετά την εισαγωγή να µπορεί να διατηρεί το σχήµα της παρά την αντίσταση από το αγγείο. Επίσης η έκταση της έκπτυξης πρέπει να είναι προβλέψιµη και ακριβής ώστε να µην υπάρχουν προβλήµατα τραυµατισµού του αγγείου. Τέλος, η πιο σηµαντική ιδιότητα µιας ενδοπρόσθεσης είναι η βιοσυµβατότητά της. Τα µέταλλα είναι γνωστό ότι έχουν φτωχή αιµοσυµβατότητα και προκαλούν θρόµβωση λόγω της έλξης αρνητικά φορτισµένων παραγόντων του αίµατος από τη θετικά φορτισµένη επιφάνειά τους. Μέταλλα µε αρνητικά φορτισµένη επιφάνεια αν και δεν προκαλούν θρόµβωση είναι πολύ επηρεπή σε διάβρωση και προσρόφηση πρωτεϊνών στην επιφάνειά τους (biofouling) Μετεγχειρητικές επιπλοκές Επαναστένωση Κατά το πρώτο εικοσητετράωρο µετά την αγγειοπλαστική η πιθανότητα επαναστένωσης του αγγείου φτάνει το 14% είτε λόγω βραδεία ελαστικής επαναφοράς του αγγείου στην αρχική του θέση, είτε λόγω δηµιουργίας θρόµβου ή σπασµού. Η χρήση των ενδοπροσθέσεων έχει µειώσει σηµαντικά την άµεση ελαστική επαναφορά του αγγείου, ωστόσο υπάρχει ένα ποσοστό στο οποίο ακόµη και µε προσθήκη 38

54 ενδοπρόσθεσης παρατηρείται επαναστένωση. Ο παθοβιολογικός µηχανισµός της είναι αδιευκρίνιστος, αλλά είναι γνωστό πλέον ότι η επαναστένωση δεν αφορά σε υποτροπή της βλάβης του αγγείου αλλά σε αντίδραση επούλωσης του σώµατος κατα την οποία λεία µυικά κύτταρα αναπτύσσονται στο σηµείο της ενδοπρόσθεσης µε επακόλουθο σχηµατισµό νέου έσω χιτώνα στο αγγείο. Θρόµβωση. Κατά το πρώτο δεκαήµερο µετά την αγγειοπλαστική έχει παρατηρηθεί σχηµατισµός θρόµβου στην περιοχή της ενδοπρόσθεσης. Αυτή η επιπλοκή έχει συσχετιστεί µε ανεπαρκή αντιπηκτική αγωγή, επείγουσες καταστάσεις, ασταθής στηθάγχη, µικρή διάµετρος του αγγείου, µη επαρκής διάνοιξης του αγγείου, παρουσία ακαθαρσιών στην ενδοπρόσθεση και πολλαπλές ενδοπροσθέσεις. Μια συστηµατική αντιπηκτική αγωγή ωστόσο αυξάνει την πιθανότητα αιµορραγικών επεισόδιων στον ασθενή, χώρια από τις υπόλοιπες παρενέργειες των αντιπηκτικών βιοδραστικών ενώσεων Αντιµετώπιση Η κύρια οδός για την αντιµετώπιση της επαναστένωσης είναι η επικάλυψη της ενδοπρόσθεσης µε υλικά που προσδίδουν συγκεκριµένες ιδιότητες οι οποίες µε τη σειρά τους οδηγούν σε βελτιωµένη αιµοσυµβατότητα. Αυτές οι ιδιότητες έχουν αν κάνουν είτε µε τη φύση της επιφάνειας (υδροφοβικότητα, φορτίο κλπ) είτε µε ουσίες που απελευθερώνονται από την επιφάνεια (ηπαρίνη, αντιφλεγµονώδη κλπ). Οι κύριες κατηγορίες ενδοπροσθέσεων βάσει του τρόπου αντιµετώπισης της επαναστένωσης είναι οι εξής: α. Ενδοπροσθέσεις επικαλυµµένες µε πολυµερή. Η αλλαγή της φύσης της επιφάνειας της ενδοπρόσθεσης αλλάζει και την αντίδραση από το σώµα. Αυτή η τεχνική έχει προσεγγιστεί µε διάφορα πολυµερή: µη βιοδασπώµενα συθετικά πολυµερή (πολυουρεθάνη), βιοδιασπώµενα συνθετικά πολυµερή (πολυ l-λακτικό οξύ PLLA), φυσικά πολυµερή. β. Ενδοπροσθέσεις επικαλυµµένες µε ηπαρίνη. 39

55 Όπως προαναφέρθηκε, η ηπαρίνη έχει αντιπηκτικές ιδιότητες. Όταν χορηγείται τοπικά αποτρέπει την θρόµβωση του αίµατος στο σηµείο που βρίσκεται η ενδοπρόσθεση και άρα την επαναστένωση. γ. Ενδοπροσθέσεις που απελευθερώνουν βιοδραστικές ενώσεις (drug eluting stents). Οι ενδοπροσθέσεις που απελευθερώνουν βιοδραστικές ενώσεις έχουν προσελκύσει το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών κατά καιρούς. Η τοπική µεταφορά µιας βιοδραστικής ένωσης σε µία ενδοπρόσθεση περιορίζει την πρώιµη θρόµβωση και το σχηµατισµό αργότερα νέου εσωτερικού χοιτώνα που οδηγεί σε επαναστένωση. Σύµφωνα µε τα ερευνητικά αποτελέσµατα οι ενδοπροσθέσεις που απελευθερώνουν βιοδραστικές ενώσεις έχουν εξαιρετικά αποτελέσµατα τόσο στις αυτόχθονες όσο και στις επαναστενωτικές βλάβες των αγγείων. Η αποτελεσµατικότητα των ενδοπροσθέσεων εξαρτάται από τρεις παράγοντες: Τον τύπο της ενδοπρόσθεσης που φέρει τη βιοδραστική ένωση. Τον τύπο της βιοδραστικής ένωσης και τον τρόπο µε τον οποίο αποτρέπει την ενδοπρόσθεση. Τη µέθοδο µε την οποία η βιοδραστική ένωση µεταφέρεται από την επικάλυψη στα αγγειακά τοιχώµατα ασκώντας τη δράση του. Οι βιοδραστικές ενώσεις που χρησιµοποιούνται είναι συνήθως αντιπηκτικά (ηπαρίνη, κουµαρινικά παράγωγα), αντιαιµοπεταλικά (ασπιρίνη, διπυριδαµόλη, τικλοδιπίνη) και άλλα κυτταροστατικά και κυτταροτοξικές βιοδραστικές ενώσεις που συνεργάζονται στην αναστολή της συγκόλλησης αιµοπεταλίων, τον πολλαπλασιασµό κυττάρων στο εσωτερικό του διατείνοντος αγγείου και τελικά στη δηµιουργία θρόµβου και επαναστένωσης στη θέση της ενδοπρόσθεσης. Η διασπορά βιοδραστικής ένωσης σε πολυµερικό υλικό το οποίο στη συνέχεια χρησιµοποιείται για την επικάλυψη της ενδοπρόσδεσης αλλά και ο εγκλωβισµός τους σε µικροσφαίρες ή µικροκάψουλες περιλαµβάνονται σε αρκετές προσπάθειες µεταφοράς βιοδραστικών ενώσεων σε ενδοπροσθέσεις. Ωστόσο ακόµη και τα πολυµερή που επικαλύπτουν τις ενδοπροσθέσεις είναι πιθανό να προκαλούν τα ίδια 40

56 προβλήµατα, όπως για παράδειγµα την πάχυνση του αγγειακού τοιχώµατος που παρατηρήθηκε µετά τη µεταφορά δεξαµεθαζόνης (Lincoff et al., 1997). δ. Ενδοπροσθέσεις επικαλυµένες µε λιποσώµατα. Τα λιποσώµατα εξαιτίας της ιδιότητάς τους να εγκλωβίζουν φαρµακευτικών δραστικές ουσίες έχουν εστιάσει το ενδιαφέρον διαφόρων ερευνητών για τη χρήση τους ως φορείς που εξασφαλίζουν την αργή και ελεγχόµενη απελευθέρωση βιοδραστικών ενώσεων τοπικά σε αγγειακές ενδοπροσθέσεις, µε στόχο την αρατεταµένη αντιθροµβωτική και αντιαιµοπεταλιακή δράση και κατ επέκταση την πρόληψη της επαναστένωσης. Το προτεινόµενο σύστηµα λιποσωµική βιοδραστική ένωση ενδοπρόσθεση αναµένεται να έχει διπλή δράση: Αρχικά ειτουργεί σαν µια αποθήκη απελευθέρωσης βιοδραστικής ένωσης και έπειτα σαν ένα φυσικό κάλυµα που µπορεί να περιορίζει σηµαντικά τα προβλήµατα ποτ προκαλούνται από την αλληλεπίδραση του ενδοθηλίου µε την πολυµερική επικάλυψη ή το µεταλλικό υλικό της ενδοπρόσθεσης. Η φυσιολογία των λιποσωµικών µεµβρανών, σχεδόν όµοια µε αυτή των κυτταρικών µεµβρανών, µπορεί να µειώσει τη φλεγµονώδη αντίδραση που προκαλείται εξαιτίας της αλληλεπίδρασης του ενδοθηλίου των αγγείων µε τα πολυµερικά ή µεταλλικά υλικά. Συνεπώς αυτή η τεχνολογία είναι δυνατόν να βελτιώσει τη βιοσυµβατότητα των ενδοπροσθέσεων. Η ηπαρίνη σαν αντιπηκτική βιοδραστική ένωση µπορεί επίσης να εγκλωβιστεί σε λιποσώµατα, τα οποία ακολούθως επικαλύπτουν ενδοπροσθέσεις, ώστε να ασκήσει παρατεταµένα την αντιθροµβωτκή της δράση για την αποφυγή σχηµατισµού θροµβώσεων και άλλων συναφών επιπλοκών. Οι Kallinteri P. et al. (2002) µελέτησαν τη πιθανότητα επικάλυψης PTFE ενδοπροσθέσεων µε λιποσώµατα (µέσω προσρόφησης στην πολυµερική επιφάνεια) τα οποία εγκλώβιζαν δεξαµεθαζόνη. Η δεξαµεθαζόνη είναι ένα κορτικοστεοϊδές ανοσοκατασταλτική βιοδραστική ένωση το οποίο αναστέλει την αγγειογέννεση. Τα αποτελέσµατά τους ήταν ενθαρρυντικά και απέδειξαν ότι τα λιποσώµατα µπορούν να χρησιµοποιηθούν σαν φορείς βιοδραστικής ένωσης στην επιφάνεια ενδοπροσθέσεων. Η δεξαµεθαζόνη απελευθερώθηκε σε ποστοστό µέχρι και 50% στις πρώτες 48 ώρες από την έκθεση των ενδοπροσθέσεων σε ρυθµιστικό διάλυµα. 41

57 Σε µια επόµενη µελέτη, οι Koromila G. et al. (2006) επικάλυψαν µεταλλικές ενδοπροσθέσεις µε λιποσώµατα (µέσω προσρόφησης στην πολυµερική επιφάνεια) που περιείχαν ηπαρίνη µικρού µοριακού βάρους. Μελέτησαν την επίδραση της παρουσίας των λιποσωµάτων στις ενδοπροσθέσεις στην αιµοσυµβατότητα, µετρώντας το χρόνο πήξης του πλάσµατος. Απέδειξαν ότι τα λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη µπορούν να χρησιµοποιηθούν σαν επικάλλυψη µεταλλικών ενδοπροσθέσεων, και απελευθερώνουν την ηπαρίνη µε τρόπο κατάλληλο ώστε να παρατηρείται βελτίωση της αιµοσυµβατότητας. 42

58 1.4. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη µιας µεθόδου για την οµοιπολική ακινητοποίηση λιποσωµάτων πάνω σε µεταλλικές επιφάνειες που έχουν επεξεργασθεί µε τεχνολογία πλάσµατος. Αυτού του είδους η επικάλυψη των µεταλλικών ενδοπροσθέσεων θα παρακάµψει τα προβλήµατα βιοσυµβατότητας που παρουσιάζουν οι µεταλλικές επιφάνειες καθώς και τα πολυµερή που χρησιµοποιούνται για επικάλυψη. Για τον σκοπό αυτό, παρασκευάσθηκαν λιποσώµατα που φέρουν στην επιφάνειά τους αµινο οµάδες και ακινητοποιήθηκαν σε µεταλλικές επιφάνειες που έφεραν καρβοξυλοµάδες, µεσω δηµιουργίας αµιδικού δεσµού. Διαπιστώθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες της αντίδρασης. Μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις λιποσωµικών εναιωρηµάτων µε τις µεταλλικές επιφάνειες για να καθορισθεί αν η επεξεργασία µε τοχνολογία πλάσµατος επηρεάζει τη σταθερότητα των λιποσωµάτων. Τέλος, µελετήθηκε η ικανότητα αυτών των λιποσωµάτων να εγκλωβίζουν ηπαρίνη και αναπτύχθηκε η βέλτιστη τεχνική για το µέγιστο εγκλωβισµό ηπαρίνης σε µικρά µονοστιβαδιακά λιποσώµατα (SUV). Απώτερος στόχος αυτής της εργασίας είναι να αποτελέσει το θεµέλιο λίθο για την σταθερή ακινητοποίηση λιποσωµάτων πάνω σε µεταλλικές επιφάνειες που θα απελευθερώνουν φαρµακευτικώς δραστικές ουσίες µε ποικίλες εφαρµογές, µία εκ των οποίων η πρόληψη της επαναστένωσης που συνήθως ακολουθεί την αγγειοπλαστική 43

59 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

60 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 Όργανα και υλικά Όργανα ph-µετρο WTW ph 522 Yδατόλουτρο ρυθµιζόµενης θερµοκρασίας JULABO FS 18 Συσκευή Υπερήχων (Probe Sonicator) Sonics Vibra Cell Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας Mettler AE 166, Deltarange Θερµαινόµενη πλάκα Labinco L32 Λουτρό Υπερήχων (Ultrasonic Cleaner), trade Raypa, R. Espinar, S.L. Μαγνητικός αναδευτήρας IKAMAG RH JANKE &KUNKEL Μηχανικός αναδευτήρας (vortex) A-100 Micrel Περιστρεφόµενος Eξατµιστήρας (Rotary Evaporator) BÜCHI RE 111 Συσκευή λυοφιλοποίησης FREEZE DRYER LABCONCO 4.5 Φασµατοφωτόµετρο (Spectrophotometer UV-VIS) Shimadzu UV 1205 Φασµατοφωτόµετρο (Spectrophotometer UV-VIS) Shimadzu UV mini 1240 Φθορισµόµετρο Shimadzu RF-1501 Φυγόκεντρος Biofuge 28 RS (HERAEUS SEPATECH) Nanosizer, Nano-ZS, Nanoseries, (Malvern Instruments) Υλικά Παρασκευή λιποσωµάτων. Λιπίδια σε µορφή κόνεως: Φωσφατιδυλοχολίνη (Egg PC): (Lipoid), 100 mg/ml Φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG): (Lipoid ) 10 mg/ml. 44

61 Διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC): (Avanti Polar Lipids), 20 mg/ml. 1,2 distearoyl sn - glycero 3 - phosphoethanolamine - N - [amino (polyethyleneglycol) ] (Amino-PEG lipid) (Avanti Polar Lipids) 1,2 distearoyl sn - glycero 3 - phosphoethanolamine - N - [amino (polyethyleneglycol) ] (Methoxy-PEG lipid) (Avanti Polar Lipids) Διαλύµατα αυτών των λιπιδίων προετοιµάστηκαν µε διάλυσή τους σε οργανικό διαλύτη χλωροφόρµιο στις ανάλογες τελικές συγκεντρώσεις. Τα διαλύµατα των λιπιδίων φυλάσσονται στην κατάψυξη στους -20 C. Ηπαρίνη νατριούχος βοείου βλεννογόνου (Heparin Sodium salt from bovine intestinal mucosa) Παρασκευάστηκε µητρικό διάλυµα ηπαρίνης ppm σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS. Χοληστερόλη (Cholesterol) 99% σε στερεή µορφή. Προµηθεύεται από την εταιρία SIGMA. Παρασκευάστηκε και χρησιµοποιήθηκε διάλυµα χοληστερόλης σε χλωροφόρµιο συγκέντρωσης 20 mg/ml. To διάλυµα χοληστερόλης φυλάσσεται επίσης στην κατάψυξη (-20 C). Υγρό άζωτο για την ψύξη των λιποσωµάτων πριν τη λυοφιλοποίηση Ισότονο ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4, που παρασκευάζεται µε διάλυση των ακόλουθων συστατικών: 0.24 gr KH 2 PO 4 (Merck) 1.44 gr Na 2 HPO 4 (Merck) 0.2 g KCl (Merck). 8 g NaCl (Merck). 0.02% NaN 3 (Sodium Azide) (Aldrich) σε 1 L απεσταγµένο νερό (D-H2O), και το ph ρυθµίζεται στο 7.4 µε πυκνό διάλυµα HCl (1 Ν) (Merck). 45

62 Παρασκευή διαλύµατος καλσεΐνης 0,1 Μ Για την παρασκευή διαλύµατος καλσεΐνης 0,1 Μ (20 ml) χρειάστηκαν τα εξής: 1,245 g στερεής καλσεΐνης (SIGMA) 0,0052 g EDTA (SERVA) Η διαδικασία παρασκευής του διαλύµατος έχει περιληπτικά ως εξής: Οι παραπάνω ποσότητες ζυγίζονται και µεταφέρονται σε κωνική φιάλη των 25ml. Ακολουθεί προσθήκη 6 ml ρυθµιστικού διαλύµατος TBS (ph=7,4) και 6 ml διαλύµατος ΝαΟΗ 0,5 Ν και η κωνική φιάλη τοποθετείται σε θερµαντική πλάκα υπό ανάδευση. Μετά τη διάλυση των στερεών συστατικών κσι το σχηµατισµό οµοιογενούς µίγµατος ακολουθεί η ρύθµιση του ph µέχρι ph=6,5-7 µε διάλυµα ΝαΟΗ 1 Ν. Επακολουθεί προσθήκη διαλύµατος ΝαΟΗ 0,5 Ν για τη ρύθµιση του ph µέχρι ph=7,4. Το διάλυµα µεταφέρεται σε ογκοµετρική φιάλη των 25 ml και προστίθεται ρυθµιστικό διάλυµα TBS ( ph=7,4) µέχρι τελικού όγκου 20 ml. Έπειτα το διάλυµα επιστρέφεται στην κωνική φιάλη και το ph ρυθµίζεται τελικά µέχρι ph=7,4 µε διάλυµα ΝαΟΗ 0,1 Ν. Το διάλυµα καλσεΐνης διατηρείται στους 5ο C. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η καλσεΐνη είναι µια φθορίζουσα χηµική ουσία (Σχήµα 2.1). Όταν είναι εγκλωβισµένη εντός του λιποσώµατος σε συγκέντρωση που παρουσιάζει απόσβεση (> 50nM), το λιποσωµικό δείγµα δε φθορίζει, οπότε µιλάµε για υψηλό ποσοστό συγκράτησης καλσεΐνης στο λιπόσωµα. Από την άλλη πλευρά οποιαδήποτε διαταραχή της ακεραιότητας της λιποσωµικής µεµβράνης προκαλεί διαφυγή καλσεΐνης στο εξωτερικό περιβάλλον του λιποσώµατος και φθορισµό της λιποσωµικής διασποράς. Σχήµα 2.1. Χηµική δοµή καλσεΐνης 46

63 Μέτρηση Συγκέντρωσης Λιπιδίου Χρησιµοποιήθηκαν: Χλωροφόρµιο (CHCl 3 ) (MERCK). Διάλυµα Stewart, που παρασκευάζεται µε διάλυση: g FeCl3 6 H2O (Iron (III) chloride hexahydrate) της Merck και 30.4 g NH4 SCN (Ammonium thiocyanate) (MERCK) σε 1 L D - H2O Το διάλυµα είναι σταθερό σε θερµοκρασία δωµατίου για αρκετούς µήνες. Πρέπει να φυλάσσεται σε σκιερό µέρος. Επιφανειοδραστικό TRITON X 100 (SIGMA) Ποσοτικός προσδιορισµός ηπαρίνης. 1,9 dimethyl-methylene blue (ALDRICH) Παρασκευάστηκε διάλυµα της χρωστικής διαλύοντας 16mg αυτής σε 1L απεσταγµένο νερό που περιείχε 2.37 gr χλωριούχου νατρίου (NaCl) και 3.04 gr γλυκίνης (MERK). Το ph ρυθµίστηκε στο 3.0 µε προσθήκη µικρής ποσότητας πυκνού διαλύµατος υδροχλωρικού οξέος (HCl) Πειράµατα ακινητοποίησης λιποσωµάτων σε µεταλλικές επιφάνειες. Δίσκοι από ανοξείδωτο ατσάλι SS-316 διαµέτρου 1 cm και πάχους 2 mm (ICEHT/FORTH). Η επιφάνειά τους επεξεργάστηκε µε τεχνολογία πλάσµατος από τα εργαστήρια Χηµικών Μηχανικών του Πανεπιστηµίου Πατρών και του Πανεπιστηµίου του Bari και έφεραν ελέυθερες καρβοξυλοµάδες. N-Hydroxy succinimide (HOSu) (MERCK) Diisopropylcarbodiimide (DIC) (MERCK) 47

64 2.2 Μέθοδοι Παρασκευή µικρών µονοστοιβαδιακών λιποσωµάτων (SUV) που εγκλωβίζουν καλσεΐνη ή ηπαρίνη. Για την παρασκευή των SUV λιποσωµάτων ο αντίστοιχος όγκος διαλύµατος του επιθυµητού κάθε φορά λιπιδίου (PC ή DSPC), καθώς και ο απαιτούµενος όγκος διαλύµατος χοληστερόλης στην περίπτωση παρασκευής λιποσωµάτων που περιέχουν και χοληστερόλη στη µεµβράνη τους µεταφέρονται σε σφαιρική φιάλη των 50ml. Οι όγκοι των διαλυµάτων των λιπιδίων και του διαλύµατος χοληστερόλης που χρησιµοποιούνται κάθε φορά υπολογίζονται, ώστε η τελική συγκέντρωση των λιποσωµάτων που παρασκευάζονται να είναι 5mg/ml. Στον παρακάτω πίνακα περιέχονται οι λιπιδικές συστάσεις των λιποσωµάτων που παρασκευάστηκαν, οι όγκοι του διαλύµατος λιπιδίου και οι όγκοι του διαλύµατος χοληστερόλης που χρησιµοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση. Η σφαιρική φιάλη εφαρµόζεται σε περιστρεφόµενο εξατµιστήρα υπό κενό (Σχήµα 2.2) για την αποµάκρυνση των οργανικών διαλυτών σε θερµοκρασία υψηλότερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου, που χρησιµοποιείται κάθε φορά (Πίνακας 2.1). Η διαδικασία αυτή ολοκληρώνεται µε το σχηµατισµό ενός λεπτού υµενίου στα τοιχώµατα της φιάλης. Έπειτα η φιάλη τοποθετείται σε ρεύµα αζώτου για να αποµακρυνθούν τυχόν ίχνη διαλύτη, αλλά και για την αποφυγή χηµικής αποικοδόµησης του λιπιδίου. Πίνακας 2.1. Θερµοκρασίες µετάπτωσης λιπιδίων PC, ΗPC, DSPC. Λιπίδιο Συντοµογραφία Θερµοκρασία Μετάπτωσης (Τm/ ο C) Φωσφατιδυλοχολίνη PC 40 Διστεαοροϋλοφωσφατιδυλοxολίνη DSPC Το επόµενο στάδιο παρασκευής των MLV λιποσωµάτων περιλαµβάνει την ενυδάτωση του λεπτού υµενίου µε την προσθήκη 2ml διαλύµατος καλσεΐνης ή ηπαρίνης (ph=7,4) προκειµένου να εγκλωβιστούν στα λιποσώµατα. 48

65 Σχήµα 2.2. Εφαρµογή σφαιρικής φιάλης που περιέχει το διάλυµα του λιπιδίου στον περιστρεφόµενο εξατµιστήρα. Μετά την προσθήκη του διαλύµατος η φιάλη αναδεύεται µηχανικά (vortex) µέχρι το υµένιο να αποκολληθεί από τα τοιχώµατα της φιάλης. Τελικά σχηµατίζεται µια θολερή διασπορά πολυστοιβαδιακών λιποσωµάτων µεγάλου µεγέθους (MLV). Θα πρέπει να σωµειώσουµε ότι στην περίπτωση των λιποσωµάτων που περιέχουν PC η αποκόλληση του υµενίου ήταν σχετικά εύκολη, ενώ στην περίπτωση των λιποσωµάτων DSPC η διαδικασία της αποκόλλησης ήταν αρκετά δύσκολη. Έτσι στην περίπτωση αυτή η διαδικασία της αποκόλλησης εκτός από τη µηχανική ανάδευση περιλαµβάνει και την τοποθέτηση της φιάλης σε υδατόλουτρο του οποίου η θερµοκρασία είναι υψηλότερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του αντίστοιχου λιπιδίου. Το επόµενο στάδιο περιλαµβάνει τη µείωση του µεγέθους των λιποσωµάτων µε την τοποθέτησή τους σε λουτρό υπερήχων για 15 λεπτά περίπου. Έπειτα τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο σε θερµοκρασία υψηλότερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου για µια περίπου ώρα για να ηρεµήσουν και να τακτοποιήσουν τη δοµή τους. Πρόκειται για τη διαδικασία της ωρίµανσης (annealing). Τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε συσκευή υπερήχων µε ακίδα Ti για τη µείωση του µεγέθους τους. Η µείωση του µεγέθους και ο σχηµατισµός SUV λιποσωµάτων πρακτικά γίνονται αντιληπτά όταν η διασπορά γίνει διαυγής. 49

66 Συγκεκριµένα η λιποσωµική διασπορά τοποθετείται σε γυάλινο φιαλίδιο µε διάµετρο µεγαλύτερη από αυτήν της ακίδας και η ακίδα βυθίζεται στο φιαλίδιο, ώστε το κατώτερο σηµείο της να είναι λίγο πιο πάνω από το κέντρο καµπυλότητας του πυθµένα του φιαλιδίου. Χρειάζεται µεγάλη προσοχή, ώστε η ακίδα να µην έρχεται σε επαφή µε τα τοιχώµατα του φιαλιδίου γιατί στην αντίθετη περίπτωση υπάρχει µεγάλος κίνδυνος να σπάσει το φιαλίδιο. Τέλος επειδή κατά τη διαδικασία αυτή παράγεται µέγαλο ποσό θερµότητας το φιαλίδιο που περιέχει τη λιποσωµική διασπορά βυθίζεται σε ένα ποτήρι ζέσεως το οποίο περιέχει κρύο νερό. Η διασπορά που περιέχει τα SUV φυγοκεντρείται για 15 λεπτά σε στροφές προκειµένου να αποµακρυνθούν πολυστοιβαδικά λιποσώµατα που έχουν τυχόν αποµείνει στη διασπορά, καθώς και ρινίσµατα τιτανίου που υπάρχουν στο δείγµα µας λόγω επαφής της διασποράς µε τη µεταλλική ακίδα. Σχήµα 2.3. Οµογενοποιηµένος πληθυσµός SUVs που λαµβάνεται µετά από φυγοκέντρηση για την αποµάκρυνση MLVs και ρινισµάτων τιτανίου Διαχωρισµός ελεύθερης από την εγκλωβισµένη στα λιποσώµατα καλσεΐνη (SUV). Η αποµάκρυνση της ελεύθερης καλσεΐνης έγινε µε την κλασική υγρή χρωµατογραφία στήλης. Στην περίπτωσή µας χρησιµοποιήθηκε στήλη Sephadex G- 50. Συγκεκριµένα µεταφέρεται στη στήλη 1ml λιποσωµικού κλάσµατος το οποίο κατόπιν αραιώνεται µε 1ml ρυθµιστικού διαλύµατος PBS (ph=7,4). Τα λιποσώµατα θα πρέπει να σηµειώσουµε επειδή είναι µεγαλύτερα σε µέγεθος από το µόριο της καλσεΐνης διέρχονται από τη στήλη δίχως να επιβραδυνθούν άρα εκλούονται πρώτα. 50

67 Διαχωρισµός ελεύθερης από την εγκλωβισµένη στα λιποσώµατα ηπαρίνη (SUV). Λόγω του µεγάλου µεγέθους της ηπαρίνης (10-15 kda) χρησιµοποιήσαµε στήλη σεφαρόζης 4-Β η οποία έχει µεγαλύτερο αριθµό θεωρητικών πλακών από την Sephadex και µπορεί να διαχωρίζει αργά µόρια παρόµιου µεγέθους Παρασκευή αφυδατώµενων ενυδατωµένων λιποσωµάτων (DRV) που εγκλωβίζουν ηπαρίνη. Για την παρασκευή των λιποσωµάτων αυτών χρειάστηκε να παρασκευαστούν αρχικά άδεια SUV. Η παρασκευή έγινε µε τη µέθοδο του λεπτού υµενίου και µε τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγούµενα για την παρασκευή των SUV µε τη διαφορά ότι η ενυδάτωση του υµενίου στην περίπτωση αυτή έγινε µε PBS (ph=7,4). Μετά την παρασκευή των SUV, 2 ml SUV, 1 ml διαλύµατος ηπαρίνης και 4 ml απεσταγµένου νερού µεταφέρονται σε γυάλινο φιαλίδιο και το µίγµα που προκύπτει ψύχεται σε υγρό άζωτο και τελικά τοποθετείται στο λυοφιλοποιητή για ένα βράδυ. Το λυοφιλοποιηµένο δείγµα επανενυδατώνονται ελεγχόµενα ως εξής : α. Προστίθεται στο δείγµα 50µl απεσταγµένου νερού, ακολουθεί έντονη µηχανική ανάδευση (vortex) και έπειτα το δείγµα αφήνεται σε ηρεµία για µισή ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. β. Ακολουθεί προσθήκη 50µl απεσταγµένου νερού και επαναλαµβάνεται ακριβώς η παραπάνω διαδικασία και γ. Προστίθεται στο δείγµα 0,9ml PBS, το δείγµα αναδεύεται µηχανικά και αφήνεται τελικά σε ηρεµία για µισή ώρα. Τα δύο πρώτα βήµατα της επανενυδάτωσης είναι και τα πλέον καθοριστικά για τον εγκλωβισµό της ηπαρίνης εντός των λιποσωµάτων. 51

68 Σχήµα 2.4. Σχηµατική αναπαράσταση λυοφιλοποίησης Διαχωρισµός ελεύθερης από την εγκλωβισµένη στα λιποσώµατα ηπαρίνη (DRV). Στην περίπτωση αυτή ο καθαρισµός των λιποσωµάτων από τη µη εγκλωβισµένη σ αυτά ηπαρίνη έγινε µε διαδοχικές φυγοκεντρήσεις διάρκειας 20 λεπτών στις στροφές και σε θερµοκρασία 19 ο C. Κατά τις φυγοκεντρήσεις αποµακρύνεται το υπερκείµενο και το ίζηµα επαναιωρείται µε προσθήκη ρυθµιστικού διαλύµατος PBS (ph=7,4) και µηχανική ανάδευση (vortex). Οι φυγοκεντρήσεις επαναλαµβάνονται µέχρι το υπερκείµενο να γίνει άχρωµο οπότε και πλέον είµαστε σίγουροι ότι το λιποσωµικό δείχµα έχει καθαριστεί από τη µη-εγκλωβισµένη ηπαρίνη. Για κάθε λιποσωµικό κλάσµα χρειάστηκαν τουλάχιστον πέντε φυγοκεντρήσεις. Τελικά το ίζηµα που περιέχει τα καθαρά πλέον λιποσώµατα επαναιωρείται µε 1ml PBS (ph=7,4). Είναι αξιωσηµείωτο ότι για τα λιποσώµατα που περιείχαν το λιπίδιο DSPC, ο καθαρισµός τους ήταν εξαιρετικά χρονοβόρος και σε κάποιες περιπτώσεις χρειάστηκαν να γίνουν ακόµα και δέκα επαναλαµβανόµενες φυγοκεντρήσεις Παρασκευή δεύτερης γενιάς µικρών µονοστοιβαδιακών λιποσωµάτων (SUV) που εγκλωβίζουν ηπαρίνη. Παρασκευάστηκαν DRV λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη όπως περιγράφηκε. Εναιώρηµα λιποσωµάτων υψηλής συγκέντρωσης θερµάνθηκε πάνω 52

69 από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου και εφαρµόστηκε η τεχνική εξώθησης µέσω µεµβρανών για να µειωθεί το µέγεθός τους. Χρησιµοποιήθηκαν µεµβράνες πόρων 400 nm αρχικά και 100 nm τελικά. Η διαδικασία αυτή ειδικά στην περίπτωση DSPC λιποσωµάτων µε χοληστερόλη ήταν ιδιαίτερα επίπονη και χρονοβόρος λόγω της φύσης των λιποσωµάτων. Τα λιποσώµατα αυτά καθαρίστηκαν από τη µη εγκλωβισµένη ηπαρίνη µε τον ίδιο τρόπο όπως τα SUV λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη Προσδιορισµός λιπιδίου-μέθοδος Stewart (Anal.Biochemica, 1980) H µέθοδοs Stewart χρησιµοποιείται προκειµένου να προσδιοριστεί η ακριβής συγκέντρωση του λιπιδίου στα λιποσωµικά δείγµατα. Η µέθοδος αυτή βασίζεται στην ικανότητα των φωσφολιπιδίων να σχηµατίζουν σύµπλοκο µε το σιδηροθειοκυανιούχο αµµώνιο σε οργανικό διάλυµα. Το πλεονέκτηµα αυτής της µεθόδου είναι ότι η παρουσία ανόργανου φωσφόρου δεν παρεµποδίζει την ανάλυση. Η συσχέτιση των τιµών απορρόφησης µε την ποσότητα του φωσφολιπιδίου πραγµατοποιείται µε εύκολο τρόπο. Προετοιµασία των πρότυπων διαλυµάτων και των δειγµάτων: Φτιάχνουµε 10 ml διαλύµατος φωσφολιπιδίου PC (από δ/µα αρχικής συγκέντρωσης 20mg/mL) σε χλωροφόρµιο σε συγκέντρωση 0.1 mg/ml. Αναλυτική µέθοδος: i. Ετοιµάζουµε τα πρότυπα διαλύµατα σε δοκιµαστικούς σωλήνες των 10mL όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα (πίνακας 2.2). ii. iii. iv. Στη συνέχεια, ανακινούµε ισχυρά τα δείγµατα µε vortex επί 1min Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 min στις 5000 rpm ή αφήνουµε τα δείγµατα σε ηρεµία ώστε να διαχωριστούν οι φάσεις (περίπου min) Αφαιρούµε προσεκτικά την υπερκείµενη υδατική φάση µε τη βοήθεια αντλίας κενού και µετράµε οπτική απορρόφηση του λιπιδίου στα 485nm. 53

70 Πίνακας 2.2: Συστάσεις διαλυµάτων κατασκευής πρότυπης καµπύλης Stewart Δείγµα Ποσότητα λιπιδίου (µg) Πρότυπο διάλυµα λιπιδίου (ml) Χλωροφόρµιο (ml) Σιδηρο- Θειοκυανιούχο 0.1 Μ (ml) Μέτρηση OD: i. Ανοίγουµε το UV/VIS φασµατοφωτόµετρο ii. iii. iv. Ρυθµίζουµε το µήκος κύµατος στα 485 nm Μηδενίζουµε µε χλωροφόρµιο (τυφλό) Μετράµε τα δείγµατα ξεκινώντας από το αραιότερο στο πυκνότερο v. Βάσει της καµπύλης αναφοράς που προκύπτει, υπολογίζεται η ποσότητα (µg) και τελικώς η συγκέντρωση του λιπιδίου (mg/ml) στο δείγµα εργασίας. Με τη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω υπολογίστηκε η συγκέντρωση του λιπιδίου στα αρχικά δείγµατα. Σε ποσότητα του λιποσωµικού εναιωρήµατος (20µl) προστέθηκαν 2ml CHCl 3 και 2 ml αντιδραστηρίου Stewart. Όπου χρειάστηκε, το δείγµα αραιώθηκε κατάλληλα. 54

71 Διάγραµµα 2.1 : Πρότυπη καµπύλη STEWART λιπιδίου σε CHCl 3 στα 485nm Ποσοτικός προσδιορισµός εγλωβισµένης ηπαρίνης στα λιποσώµατα. Για τον ποσοτικό προσδιορισµό της ηπαρίνης χρησιµοποιήθηκε 1 ml ανά δείγµα από το διάλυµα 1,9 dimethyl-methylene blue. 100 µl προτύπου (5, 10, 15, 20, 40 ppm) και 50 µl TRITON X 10% προστέθηκαν σε 1 ml δαλύµατος χρωστικής και το διάλυµα µετρήθηκε φασµατοµετρικά στα 525 nm µετά από ακριβώς 15 sec. Ο λόγος είναι ότι η ηπαρίνη σαν ανιόν σχηµατίζει έγχρωµο σύµπλοκο µε τη χρωστική κατιόν το οποίο όµως καθιζάνει γρήγορα. Τα πρότυπα διαλύµατα παρασκευάστηκαν µε διάφορους τρόπους, είτε µε άδεια λιποσώµατα, είτε µε λιποσώµατα µε ηπαρίνη, είτε µόνο µε ηπαρίνη. Η τελική µορφή της καµπύλης αναφοράς είχε τα πρότυµα µε άδεια λιποσώµατα Προσδιορισµός µεγέθους και ζ δυναµικού λιποσωµάτων. Για το προσδιορισµό του µεγέθους και του ζ δυναµικού των λιποσωµάτων χρησιµοποιηθηκε µια συσκευή nanosizer (Nano-ZS, Nanoseries, Malvern Instruments, UK). Η κατανοµή του µεγέθους των λιποσωµάτων προσδιορίστηκε µέσω της τεχνικής Dynamic Light Scattering (DLS) ενώ του ζ-δυναµικού µέσω της τεχνικής Laser Doppler Electrophoresis (LDE). Οι µετρήσεις έγιναν στους 25 ο C χρησιµοποιόντας αραιή διασπορά λιποσωµάτων Μέτρηση σταθερότητας λιποσωµάτων. Στο στάδιο αυτό θα προσδιοριστεί η σταθερότητα των λιποσωµάτων, µετρώντας τη συγκράτηση της καλσεΐνης στα λιποσώµατα (latency). Ο 55

72 προσδιορισµός της συγκράτηση έγινε µετρώντας το φθορισµό των αντίστοιχων δειγµάτων πριν και µετά από την προσθήκη διαλύµατος απορρυπαντικού Triton X- 100 περιεκτικότητας 10%. Πιο αναλυτικά η διαδικασία έχει ως εξής: Στο απαλλαγµένο από τη µη εγκλωβισµένη καλσεΐνη λιποσωµικό κλάσµα που λαµβάνεται µε τις δύο µεθόδους που αναφέρθηκαν παραπάνω γίνεται µέτρηση της λιπιδικής συγκέντρωσης. Από το κλάσµα αυτό επαρκής ποσότητα µεταφέρεται σε δοκιµαστικό σωλήνα που περιέχει 1ml PBS (ph=7,4). Η ποσότητα του δείγµατος που επωάζεται είναι τόση όση απαιτείται για ρύθµιση της επωαζόµενης συγκέντρωσης λιπιδίου σε 1 mg/ml. Καθένα από τα δείγµατα αυτά τοποθετούνται για επώαση στους 37 ο C. Πριν από την τοποθέτησή τους για επώαση, λαµβάνονται από κάθε δοκιµαστικό σωλήνα 50 µl δείγµατος τα οποία µεταφέρονται σε δοκιµαστικό σωλήνα που περιέχει 4ml PBS (ph=7,4). Η δειγµατοληψία αυτή αντιστοιχεί στη δειγµατοληψία t=0, και επαναλαµβάνεται για χρονικά διαστήµατα t = 2, 4, 6, 8, 24 και 48 ώρες. Έπειτα µετράται ο φθορισµός των δειγµάτων αυτών. Οι τιµές που λαµβάνονται στην περίπτωση αυτή αντιστοιχούν στην ποσότητα της καλσεΐνης που δεν είναι εγκλωβισµένη στο λιπόσωµα. Σε καθένα από τα δείγµατα αυτά προστίθενται 400 µl διαλύµατος Τriton X- 100, το δείγµα αναδεύεται µηχανικά, βυθίζεται σε υδατόλουτρο θερµοκρασίας περίπου 100 ο C και αφήνεται σε ηρεµία σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 λεπτά. Στη συνέχεια µετράται ο φθορισµός του δείγµατος µετά την προσθήκη του απορρυπαντικού. Το απορρυπαντικό διασπά τη λιποσωµική µεµβράνη, οπότε η καλσεΐνη που είχε εγκλωβιστεί στο λιπόσωµα απελευθερώνεται στο διάλυµα. Το ποσοστό δέσµευσης (% latency) της καλσεΐνης προσδιορίζεται από την ακόλουθη σχέση: % latency = (Ft-Fi)/Ft *100 (5) όπου Fi και Ft οι τιµές φθορισµού κάθε δείγµατος πριν και µετά την προσθήκη του Τriton X-100 αντίστοιχα. Έγινε διέγερση των δειγµάτων στα 495 nm και µέτρηση της εκποµπής (φθορισµός) στα 515 nm. Για τον προσδιορισµό του ποσοστού της καλσεΐνης πο συγκρατείται στα λιποσώµατα (% retention), θεωρούµε ότι το % latency την χρονική στιγµή t=0 αντιστοιχεί σε retention 100%. 56

73 Πειράµατα ακινητοποίησης λιποσωµάτων σε µεταλλικές επιφάνειες Ακινητοποίηση λιποσωµάτων σε µεταλλικούς δίσκους. Για την οµοιπολική σύνδεση των λιποσωµάτων σε µεταλλικές επιφάνειες που φέρουν ελεύθερες καρβοξυλοµάδες, επιλέχθηκαν δύο βασικοί τύποι λιποσωµάτων: Control λιποσώµατα µε MeO οµάδες και Functionalized λιποσώµατα µε NH 2 οµάδες στην επιφάνειά τους. Η λιπιδική τους σύσταση ήταν DPSC:Chol 2:1, 1% DPPE-PEG-(NH 2 /MeO). Αρχικά οι ελεύθερες καρβοξυλοµάδες της µεταλλικής επιφάνειας ενεργοποιήθηκαν σε διάλυµα που περιείχε περίσσεια HOSu και DIC σε DCM/DMF (9:1) για 20 λεπτά. Συγκεκριµένα, gr HOSu διαλύθηκαν σε 800 µl DMF και προτέθηκαν σε ποτήρη ζέσεως των 10 ml. Έπειτα προστέθηκαν 4.2 ml DCM, ο µεταλλικός δίσκος και 130 µl DIC. Έπειτα από µικρή ανάδευση το δείγµα αφήνεται να επωαστεί σε θερµοκρασία δωµατία για 20 λεπτά. Το στάδιο της ενεργοποίησης επαναλήφθηκε 2 φορές, οι επιφάνειες ξεπλύθηκαν σε DCM 3 φορές και αφέθηκαν να στεγνώσουν. Έπειτα τοποθετήθηκαν σε 8 well plates τα οποία έχουν κατάλληλη διάµετρο για να δεχτούν τους µεταλλικούς δίσκους. Προστέθηκε 1 ml εναιωρήµατος λιποσωµάτων. Η επώαση των δειγµάτων έγινε σε διάφορες συνθήκες θερµοκρασίας (25 ο, 37 ο ), διάρκειας (8 h, 24 h, 48 h) µε ή χωρίς µηχανική ανάδευση. H ακινητοποίηση των λιποσωµάτων στις µεταλλικές επιφάνειες φαίνεται σχηµατικά στο Σχήµα 2.5: 57

74 Σχήµα 2.5 : Σχηµατική αναπαράσταση της πορείας δέσµευσης λιποσωµάτων στις µεταλλικές επιφάνειες Εκτίµηση της πρόσδεσης των λιπιδίων στις µεταλλικές επιφάνειες. Αφού η δiαδικασία της ακινητοποίησης των λιποσωµάτων στις µεταλλικές επιφάνειες τελείωσε, αυτές αποµακρύνθηκαν από το 8 well plate και ξεπλύθηκαν ήπια µε βύθιση 5 φορές σε φρέσκα διαλύµατα PBS (ph 7.4). Έπειτα τοποθετήθηκαν σε ποτήρια ζέσεως των 10 ml και στην επιφάνειά τους προστέθηκαν 400 µl διαλύµατος TRITON X 10%. Στη συνέχεια προστέθηκαν 2.1 ml διαλύµατος PBS και στο υπερκείµενο διάλυµα µετρήθηκε ο φθορισµός, ο οποίος προέρχεται από την καλσεΐνη που ήταν εγκλωβισµένη στα άθικτα λιποσώµατα που είχαν ακινητοποιηθεί στις επιφάνειες. Σχήµα 2.6 : Αµιδικός δεσµός ανάµεσα στα λιποσώµατα και τις µεταλλικές επιφάνειες. 58

75 Προκαταρτικά πειράµατα βελτίωσης αιµοσυµβατότητας µεταλλικών επιφανειών. Παρασκευάστηκαν µεταλικές επιφάνειες µε ακινητοποιηµένα λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη στην επιφάνειά τους. Ακολυθήθηκε η ίδια διαδικασία που περιγράφεται στην ενότητα [ ] και χρησιµοποιήθηκαν τέσσερις διαφορετικοί τύποι λιποσωµάτων: PC DSPE-PEG2000-NH2 1% PC DSPE-PEG2000-MeO 1% DSPC:Chol 2:1 DSPE-PEG2000-NH2 1% DSPC:Chol 2:1 DSPE-PEG2000-Meo 1% Η ανάλυση των δειγµάτων ως προς την αιµοσυµβατότητά τους διεξήχθη στο εργαστήριο Εµβιοµηχανικής του Πανεπιστηµίου Πατρών (Καθ. Γ. Μισηρλής, Δρ. Γ. Μηχανετζής). 59

76 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ

77 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 3.1. Παρασκευή και χαρακτηρισµός λιποσωµάτων Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν καλσεΐνη. Παρασκευάστηκαν SUV λιποσώµατα µε διάφορες λιπιδικές συστάσεις, οι οποίες απεικονίζονται στον Πίνακα 3.1. Για την Παρασκευή τους χρησιµοποιήθηκε διάλυµα καλσεΐνης (όπως περιγράφεται στην Ενότητα 2.2.1) το οποίο χρησιµοποιήθηκε για την ενυδάτωση του λιπιδικού υµενίου. Η αρχική συγκέντρωση του λιπιδίου ήταν 20 mg/ml. Κατα την παρασκευή των λιποσωµάτων παρατηρήθηκε διαφορά στην ευκολία ενυδάτωσης του λιπιδικού υµενίου ανάµεσα στα λιποσώµατα µε λιπίδιο PC, DSPC και αυτά που περιείχαν χοληστερόλη. Στην περίπτωση των DSPC:Chol λιποσωµάτων η ενυδάτωση ήταν χρονοβόρος και απαιτούσε έντονη µηχανική αναύδευση και θέρµανση του δείγµατος σε θερµοκρασία άνω των 55 ο C (θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου). Επίσης, στο στάδιο της έκθεσης της λιποσωµικής διασποράς σε ακίδα υπερήχων τα DSPC:Chol λιποσώµατα χρειάστηκαν πολύ περισσότερο χρόνο έκθεσης σε σχέση µε τα PC. Πίνακας 3. 1 Λιποσωµικές συστάσεις SUV Λιποσωµάτων Λιποσωµική Σειρά mol:mol DSPE-PEG2000-NH2 (F) DSPE-PEG2000-MeO (C) PC PC:Chol 2:1 - - DSPC:Chol 2:1 - - DSPC:PG:Chol 9:1:5 - - DSPC:Chol F 2:1 1% - DSPC:PG:Chol F 9:1:5 1% - DSPC:Chol C 2:1-1% DSPC:Chol F 2:1 0.5% - DSPC:Chol C 2:1-0.5% Για το χαρακτηρισµό των λιποσωµάτων, προσδιορίστηκε η τελική συγκέντρωση του λιπιδίου, ο εγκλωβισµός της καλσεϊνης, το µέγεθος, η κατανοµή µεγέθους και το ζ δυναµικό των λιποσωµάτων. 60

78 Μέτρηση λιπιδίου. Για τον ποσοτικό προσδιορισµό του λιπιδίου χρησιµοποιήθηκε η τεχνική Stewart. Έγινε διάλυση των λιποσωµάτων σε χλωροφόρµιο και εκχύλιση του λιπιδίου στο διάλυµα Stewart, στο οποίο συµπλοκοποιήθηκε µε σιδηροκυανυούχα. Μετρήθηκε η απορρόφηση του συµπλόκου στα 485 nm. Στο Γράφηµα 3.1 φαίνεται µια τυπική καµπύλη αναφοράς. Ανά τακτά χρονικά διαστήµατα παρασκευαζόταν νέα καµπύλη για της εξάλλειψη σφαλµάτων που οφείλονται σε διαφορές ανάµεσα στις παρτίδες των διαλυµάτων Stewart και σε νέα αντιδραστήρια. Γράφηµα 3. 1 Πρότυπη Stewart Από της καµπύλη αναφοράς υπολογίζονται µε την κατάλληλη αναγωγή τα µg του λιπιδίου που περιέχονται σε 1 ml λιποσωµικού δείγµατος Μέτρηση καλσεΐνης. Κατασκευάστηκε πρότυπη καµπύλη καλσεΐνης όπως περιγράφεται στο πειραµατικό µέρος. Όπως και στην περίπτωση της πρότυπης καµπύλης Stewart, ανά τακτά χρονικά διαστήµατα κατασκευαζόταν νεά καµπύλη αναφοράς. Στο Γράφηµα 3.2 φαίνεται µια τυπική καµπύλη αναφοράς καλσεΐνης. 61

79 Γράφηµα 3. 2 Πρότυπη καµπύλη καλσεΐνης Για να µελετήσουµε τη καθαρότητα των λιποσωµικών δειγµάτων µετρήθηκε ο φθορισµός του δείγµατος πριν και µετά τη ρήξη των λιποσωµάτων µε 1% TRITON-X όπως περιγράφεται στο πειραµατικό µέρος. Στον Πίνακα 3.2 απεικονίζονται οι τιµές Drug/Lipid (mol/mol) και latency (%) για τις λιποσωµικές σειρές. Πίνακας 3. 2 Εγκλωβισµός καλσεΐνης σε λιποσώµατα µε διαφορετικές συστάσεις Λιποσωµική Σειρά D/L Latency (%) PC 0,029 ± 0,005 98,9 ± 1,9 PC:Chol 0,032 ± 0,002 98,7 ± 2,1 DSPC:Chol 0,069 ± 0,004 95,6 ± 1,1 DSPC:PG:Chol 0,070 ± 0,004 96,6 ± 3,1 DSPC:Chol F 1% 0,129 ± 0,005 99,2 ± 2,9 DSPC:PG:Chol F 1% 0,111 ± 0,007 97,4 ± 3,1 DSPC:Chol C 1% 0,133 ± 0,01 98,3 ± 2,2 DSPC:Chol F 0.5% 0,123 ± 0,02 94,5 ± 2,7 DSPC:Chol C 0.5% 0,149 ± 0,009 93,2 ± 0,8 Από τον Πίνακα 3.2 µπορούµε να βγάλουµε το συµπέρασµα ότι τα λιποσώµατα DSPC:Chol 2:1 1% C προσφέρονται ως καλύτερα control για τα DSPC:Chol 2:1 1% F σε σχέση µε τα DSPC:Chol 2:1 µιας και έχουν παρεµφερή τιµή D/L. Αυτή η παρατήρηση θα επιβεβαιωθεί και παρακάτω. 62

80 Μέτρηση διασποράς µεγάθους και ζ δυναµικού των λιποσωµάτων. Για τη µέτρηση του µεγέθους και του ζ δυναµικού των λιποσωµάτων χρησιµοποιήθηκε ειδικό όργανο (Nanosizer, Nano-ZS, Nanoseries, Malvern Instruments). Τα αποτελέσµατα απεικονίζονται στον Πίνακα 3.3 Πίνακας 3. 3 Μέγεθος, κατανομή μεγέθους (Poly Dispersity Index PDI) και ζ δυναμικό λιποσωμάτων Λιποσωµική Σειρά Μέγεθος (nm) PDI ζ δυναµικό DSPC:Chol 70,982 ± 0,905 0,154 ± 0,013 - DSPC:PG:Chol 91,592 ± 1,888 0,1598 ± 0,023-8,3175 ± 1,42 DSPC:Chol F 1% 80,094 ± 2,379 0,2202 ± 0,012 0,14825 ± 1,98 DSPC:PG:Chol F 1% 91,144 ± 1,474 0,2038 ± 0,025-2,25 ± 0,49 DSPC:Chol C 1% 86,908 ± 0,999 0,112 ± 0,021 0,53725 ± 2,3 Από τους πίνακες 3.2 και 3.3 προκύπτουν συµπεράσµατα σχετικά µε την επίδραση της χοληστερόλης, του φορτίου και το λιπιδίου DSPE-PEG2000-X στον εγκλωβισµό της καλσεΐνης. Η παρουσία της χοληστερόλης είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι αυξάνει το µέγεθος των λιποσωµάτων, και όπως παρατηρούµε στον Πίνακα 3.2, αυξάνει και τον εγκλωβισµό της καλσεΐνης (και κατ επέκταση κάθε υδρόφικου µορίου) στα λιποσώµατα. Το φορτίο (PG) φαίνεται να αυξάνει το µέγεθος των λιποσωµάτων χωρίς όµως να αυξάνει την ικανότητά τους να εγκλωβίζουν καλσεΐνη. Κατά πάσα πιθανότητα οι απωστηκές δυνάµεις στη λιπιδική µεµβράνη που αυξάνουν το µέγεθος δεν επιτρέπουν περαιτέρω εγκλωβισµό καλσεΐνης. Τα λιπίδια DPPE-PEG2000-X αυξάνουν και το µέγεθος και την ικανότητα των λιποσωµάτων να εγκλωβίζουν καλσεΐνη. Όπως προαναφέρθηκε, τα λιποσώµατα DSPC:Chol 2:1 1% C προσφέρονται ως καλύτερα control για τα DSPC:Chol 2:1 1% F σε σχέση µε τα DSPC:Chol 2:1 µιας και όπως βλέπουµε στον Πίνακα 3.3 εκτός από παρεµφερή τιµή D/L έχουν και παρεµφερές µέγεθος και φορτίο στην επιφάνειά τους. Η τιµή PDI (Polydispersity Index) είναι ενδεικτική ως προς τη διασπορά του µεγέθους στον πληθυσµό των λιποσωµάτων. Όπως βλέπουµε στον Πίνακα 3.3 τα λιποσώµατα έχουν µικρό PDI, δηλαδή είναι οµοιογενή ως προς το µέγεθός τους. 63

81 Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη. Η ηπαρίνη είναι µόριο µεγάλου µοριακού βάρους (10-15 kda) και η παρασκευή λιποσωµάτων µε ηπαρίνη παρουσιάζει κάποιες διαφορές σε σχέση µε ένα µόριο µικρού µοριακού βάρους όπως η καλσεΐνη. Παρασκευάστηκαν τρία είδη λιποσωµάτων: SUV, DRV και SUV δεύτερης γενιάς. Για την ενυδάτωση του λιπιδικού υµενίου χρησιµοποιήθηκε διάλυµα ηπαρίνης σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4 σε συγκέντρωση 10,000 ppm. Στους πίνακες 3.4 και 3.5 µπορούµε να δούµε τις λιπιδικές συστάσεις που εξετάστηκαν. Πίνακας 3. 4 Λιποσωμικές συστάσεις SUV Λιποσωμάτων Λιποσωµική Σειρά mol:mol DSPE-PEG2000-NH2 (F) DSPE-PEG2000-MeO (C) PC PC C 1% - - 1% PC F 1% - 1% - DSPC: Chol 2:1 - - DSPC:Chol C 2:1-1% DSPC: Chol F 2:1 1% - Πίνακας 3. 5 Λιποσωμικές συστάσεις DRV και SUV (2 ης γενιας) Λιποσωμάτων Τύπος Λιποσωµική mol:mol DSPE-PEG2000-NH2 (F) DSPE-PEG2000-MeO (C) Λιποσωµάτων Σειρά DRV DSPC:Chol 2:1 - - DSPC:Chol 2:1 - - SUV (2 ης γενιάς) PC:Chol C 1% 4:1-1% PC:Chol F 1% 4:1 1% - Κατά την παρασκευή των λιποσωµάτων προσαρµόστηκε η µέθοδος καθαρισµού τους από την ελεύθερη (µη εγκλωβισµένη ηπαρίνη) όπως περιγράφεται στην Ενότητα Στην περίπτωση των DRV λιποσωµάτων ο διαχωρισµός έγινε µε τρεις διαδοχικές φυγοκεντρήσεις σε 12,000 rpm αφαιρώντας το υπερκείµενο διάλυµα και επαναδιασπείροντας τα λιποσώµατα σε φρέσκο ρυθµιστικό διάλυµα. Για το χαρακτηρισµό των λιποσωµάτων υπολογίστηκε η τελική συγκέντρωση του λιπιδίου, ο εγκλωβισµός της ηπαρίνης (εκφρασµένη σε g(heparin)/mol(lipid), η διασπορά µεγέθους και το ζ δυναµικό των λιποσωµάτων. 64

82 Καθαρισµός SUV λιποσωµάτων από ελέυθερη (µη εγκλωβισµένη) ηπαρίνη. Χρησιµοποιήθηκε σεφαρόζη σαν στατική φάση, και εξετάστηκαν δύο διαφορετικά µήκη της χρωµατογραφικής στήλης ως προς την επάρκειά τους να διαχωρίσουν τα λιποσώµατα από την ελεύθερη ηπαρίνη. Συλλέχθηκαν κλάσµατα 1 ml το καθένα και αναλύθηκαν ως προς το περιεχόµενό τους σε λιπίδιο και ηπαρίνη. Τα γραφήµατα 3.3 και 3.4 δείχνουν το κατάλληλο µήκος για τον καθαρισµό των λιποσωµάτων. Γράφημα 3. 3 Χρωματογραφική στήλη Sepharose 4B- CL μήκος 22,5 cm Γράφημα 3. 4 Χρωματογραφική στήλη Sepharose 4B- CL μήκος 25,5 cm 65

83 Προσδιορισµός ηπαρίνης. Ο ποσοτικός προσδιορισµός της ηπαρίνης προσεγγίστηκε µε δύο διαφορετικούς τρόπους όπως περιγράφεται στην Ενότητα Ένας φωτοµετρικός και ένας που βασίζεται στην επιρροή που έχει η ηπαρίνη στο χρόνο πήξης του αίµατος. Ο δεύτερος τρόπος διεξήχθη από το Eργαστήριο Eµβιοµηχανικής του Πανεπιστηµίου Πατρών. Κατά τον φωτοµετρικό προσδιορισµό της ηπαρίνης προστέθηκε 1 ml διαλύµατος χρωστικής 1,9dimethyl-methylene blue σε 200 µl δείγµατος. Η παρουσία των λιπιδικών µεµβρανών µετά τη διάσπαση των λιποσωµάτων µε διάλυµα TRITON 10-X 1% βρέθηκε ότι επηρεάζει το τελικό αποτέλεσµα κατά τη φωτοµέτρηση. Γι αυτό το λόγο εξετάστηκαν διάφορες συνθήκες για την κατασκευή πρότυπης καµπύλης: Αρχικά κατασκευάστηκε πρότυπη καµπύλη χωρίς την παρουσία λιποσωµάτων, χρησιµοποιόντας διάλυµα µόνο ηπαρίνης σαν πρότυπο. Γράφημα 3. 5 Πρότυπη Ηπαρίνης σε ρυθμισιτκό διάλυμα PBS ph 7.4 Έπειτα προστέθηκε διασπορά άδειων λιποσωµάτων στα πρότυπα δείγµατα. Οι καµπύλες που παρουσιάζονται εδώ παρασκευάστηκαν µε PC άδεια λιποσώµατα φροντίζοντας η τελική συγκέντρωση του λιπιδίου να είναι η ίδια µε τα δείγµατά µας. 66

84 Τα δείγµατα περιείχαν 50 µl πρότυπο διάλυµα, 50 µl PBS και 100 µl λιποσώµατα SUV. Σαν τυφλό χρησιµοποιήθηκαν 100 µl PBS. Γράφημα 3. 6 Πρότυπη Ηπαρίνης με άδεια λιποσώματα #1 Έπειτα επαναλήφθηκε η ίδια διαδικασία αλλά στο τυφλό διάλυµα προστέθηκε και ίση πόσοτητα άδειων λιποσωµάτων µε τα πρότυπα δείγµατα. 67

85 Γράφημα 3. 7 Πρότυπη Ηπαρίνης με άδεια λιποσώματα #2 Παρατηρούµε ότι η παρουσία των λιποσωµάτων εµποδίζει την Παρασκευή πρότυπης καµπύλης µιας και η γραµµικότητα χάνεται σε συγκέντρωση µεγαλύτερη των 15 ppm. Γι αυτό το λόγο προσθέσαµε στα δείγµατά µας TRITON 10-X προκειµένου να διασπαστούν τα λιποσώµατα σε λιπιδικές µεµβράνες. Αρχικά τα δείγµατά µας περιείχαν 50λ πρότυπο διάλυµα, 50λ triton 10% και 100λ λιποσώµατα SUV. Το τυφλό διάλυµα ήταν 50λ PBS και 50λ triton 10%. Γράφημα 3. 8 Πρότυπη Ηπαρίνης με άδεια λιποσώματα και Triton #1 68

86 Εν τέλη, προσθέσαµε στο τυφλό διάλυµα ίση ποσότητα άδειων λιποσωµάτων και πήραµε την εξής πρότυπη καµπύλη: Γράφημα 3. 9 Πρότυπη Ηπαρίνης με άδεια λιποσώματα και Triton #2 Χρησιµοποιήθηκε και η τεχνική µέτρησης της ηπαρίνης βάσει του χρόνου πήξεως του αίµατος. Σε αυτή την περίπτωση δεν χρειάστηκε να χρησιµοποιήσουµε άδεια λιποσώµατα στα πρότυπα δείγµατά µας, µιας και αν και επηρεάζουν την οπτική απορρόφηση ενός διαλύµατος, δεν επηρεάζουν το χρόνο πήξης του αίµατος. Πήραµε την ακόλουθη καµπύλη αναφοράς: 69

87 Γράφημα Πρότυπη Ηπαρίνης με μέθοδο χρόνου πήξης του αίματος Ο εγκλωβισµός της ηπαρίνης στα λιποσώµατα υπολογίστηκε σε γραµµάρια ηπαρίνης ανά mol λιπιδίου (D/L). Στους πίνακες 3.6 και 3.7 παρουσιάζονται οι τιµές D/L για τις διάφορες συστάσεις λιπιδίων και τύπου λιποσωµάτων. Πίνακας 3. 6 Εγκλωβισμός Ηπαρίνης σε SUV λιποσώματα Λιποσωµική Σειρά D/L (g/mol) (n=3) PC 0.89 ± 0.04 PC C 1% 5,51±0,45 PC F 1% 5,82±0,12 DSPC: Chol 2,95 ± 0,06 DSPC:Chol C 1% 5,66 ± 0,34 DSPC: Chol F 1% 5,97 ± 0,1 Παρατηρούµε ότι η παρουσία χοληστερόλης ευνοεί τον εγκλωβισµό της ηπαρίνης. Αυτό το παρατηρήσαµε και στην περίπτωση της καλσεΐνης. Επίσης, το λιπίδιο DSPC είναι καλύτερο από το PC. Πιθανότητα ο λόγος είναι ότι (όπως και η χοληστερόλη) προσφέρει στα λιποσώµατα σταθερότητα και οµοιόµορφο σχήµα, άρα και µεγαλύτερο όγκο ανα µονάδα επιφάνειας. Τέλος, παρατηρούµε ότι η παρουσία ενός pegylated λιπιδίου (όπως τα λιπίδια F και C) ακόµα και σε πολύ µικρή 70

88 συγκέντρωση (1%) είναι ικανή να αυξήσει σηµαντικά την ικανότητα των λιποσωµάτων να εγκλωβίσουν ηπαρίνη. Πίνακας 3. 7 Εγκλωβισμός Ηπαρίνης σε DRV και SUV (2 ης γενιάς) λιποσώματα Τύπος Λιποσωµάτων Λιποσωµική Σειρά D/L (g/mol) (n=3) DRV DSPC:Chol 13,6 ± 0,37 DSPC:Chol 10,6 ± 0,14 SUV (2 ης γενιάς) PC:Chol C 1% ± 0.08 PC:Chol F 1% ± 0.11 Από τα αποτελέσµατα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.7 συµπεραίνουµε ότι η διαδικασία κατά την παρασκευή των DRV λποσωµάτων (λυοφιλοποίηση και επανασύσταση) ενισχύσει δραµατικά την ικανότητά τους να εγκλωβίζουν ηπαρίνη. Αυτή η βελτίωση δεν χάνεται ακόµα και όταν µειώνεται το µέγεθος των λιποσωµάτων σε ~100nm (SUV 2 ης γενιάς). Αυτό είναι ένα πολύ σηµαντικό εύρηµα µιας και έτσι µπορούµε να παρασκευάσουµε λιποσωµικές κολλοειδείς διασπορές µε µεγάλη συγκέντρωση ηπαρίνης. Ωστόσο, στην περίπτωση των SUV λιποσωµάτων 2 ης γενιάς η παρουσία ενός pegylated λιπιδίου δεν φαίνεται να επηρεάζει τον εγκλωβισµό της ηπαρίνης. Αυτό επιβεβαιώνει ότι αυτή η βελτίωση δεν οφείλεται στο µέγεθος ή το σχήµα των λιποσωµάτων, αλλά σε αλληλεπίδραση της ηπαρίνης µε τις λιπιδικές µεµβράνες Μέτρηση διασποράς µεγάθους και ζ δυναµικού των λιποσωµάτων. Για τη µέτρηση του µεγέθους και του ζ δυναµικού των λιποσωµάτων χρησιµοποιήθηκε η ίδια πορεία µε τα λιποσώµατα µε καλσεΐνη. Τα αποτελέσµατα απεικονίζονται στον Πίνακα

89 Πίνακας 3. 8 Μέγεθος, διασπορά μεγέθους και ζ δυναμικό SUV λιποσωμάτων με ηπαρίνη Τύπος Λιποσωµάτων Λιποσωµική Σειρά Μέγεθος (nm) PDI ζ δυναµικό SUV (1 ης γενιάς) PC C 1% 99,15±0,40 0,168±0,004-5,69±0,02 PC F 1% 92,77±1,11 0,18±0,015-1,47±0,77 DSPC:Chol 2:1 C 1% 90,88±0,37 0,158±0,37-3,24±1,03 DSPC:Chol 2:1 F 1% 72,75±0,72 0,205±0,004-1,76±0,44 SUV (2 ης γενιάς) PC:Chol 4:1 C 1% 115,9±0,4 0,19±0,09-5,91±0,9 PC:Chol 4:1 F 1% 109,1±0,5 0,22±0,07-6,11±0,5 PC:Chol 4:1 F 1% (άδεια) 99,7±0,7 0,29±0,11-5,61±0,4 Βλέπουµε την ίδια επίδραση του τύπου του λιπιδίου, της παρουσίας της χοληστερόλης και της παρουσίας pegylated λιπιδίου µε τα λιποσώµατα µε καλσεΐνη. Τα SUV λιποσώµατα 2 ης γενιάς παρουσιάζουν εξίσου καλή διασπορά µεγέθους µε αυτά της 1 ης, παρόµιο φορτίο επιφάνειας και το µέγεθός τους παραµένει στην τάξη των 100 nm. Τέλος, η παρουσία της ηπαρίνης στα λιποσώµατα, αν και µεγάλο µόριο, δεν επηρεάζει σηµαντικά το µέγεθός τους Μελέτες σταθερότητας λιποσωµάτων Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν καλσεΐνη Σταθερότητα SUV λιποσωµάτων σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4 Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι τα λιπίδια DPSC και PC µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την παρασκευή λιποσωµάτων και η σταθερότητά τους τόσο σε ρυθµιστικό διάλυµα όσο και σε πλάσµα αίµατος έχει µελετηθεί. Προκειµένου να εξετάσουµε το ενδοχόµενο η παρουσία του λιπιδίου που φέρει την αµινοµάδα (DSPE- PEG2000-NH 2 ) να επηρεάζει τη σταθερότητά τους, µελετήσαµε την περιεκτικότητα των λιποσωµάτων σε καλσεΐνη (latency) για διάστηµα 48 ώρες σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4 και θερµοκρασία 37 ο C. Μελετήθηκαν οι εξής τύποι SUV λιποσωµάτων: DSPC:Chol 2:1, DSPC:PG:Chol 9:1:5, DSPC:Chol 2:1 1%F και DSPC:PG:Chol 9:1:5 1%F. Όπως φαίνεται στο Γράφηµα 3.11, η παρουσία του F λιπιδίου δεν επηρεάζει τη σταθερότητα των λιποσωµάτων ανεξάρτητα από την ύπαρξη φορτίου ή όχι. 72

90 Γράφημα Σταθερότητα SUV Λιποσωμάτων σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS ph Σταθερότητα SUV λιποσωµάτων σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4 παρουσία µεταλικών επιφανειών επεξεργασµένες µε τεχνολογία πλάσµατος. Μελετήσαµε αν η παρουσία των µεταλλικών επιφανειών επηρεάζει τη σταθερότητα των λιποσωµάτων. Χρησιµοποιήθηκαν οι εξής λιπιδικές συστάσεις: PC, PC:Chol 2:1, DSPC:Chol 2:1 1%C, DSPC:Chol 2:1 1%F. Για τη µελέτη της σταθερότητας χρησιµοποιήσαµε σαν ένδειξη την ποσοστό της εγκλωβισµένης καλσεΐνης σε σχέση µε την ολική (latency). Στα γραφήµατα απεικονίζεται η σταθερότητα SUV λιποσωµάτων (διάφορων λιπιδικών συστάσεων και συγκεντρώσεων) παρουσία µεταλλικών επιφανειών. Οι κόκκινες γραµµές είναι απουσία (control) και οι µαύρες παρουσία µεταλικών επιφανειών. 73

91 Γράφημα Σταθερότητα PC λιποσωμάτων (1mg/ml) παρουσία (τετράγωνα) και απουσία (κύκλοι) μεταλλικών επιφανειών Γράφημα Σταθερότητα PC:Chol 2:1 λιποσωμάτων (1 mg/ml) παρουσία (τετράγωνα) και απουσία (κύκλοι) μεταλλικών επιφανειών 74

92 Γράφημα Σταθερότητα PC:Chol 2:1 λιποσωμάτων (5 mg/ml) παρουσία (τετράγωνα) και απουσία (κύκλοι) μεταλλικών επιφανειών Γράφημα Σταθερότητα DSPC:Chol 2:1 1%F λιποσωμάτων (0.5 mg/ml) παρουσία (τετράγωνα) και απουσία (κύκλοι) μεταλλικών επιφανειών 75

93 Γράφημα Σταθερότητα DSPC:Chol 2:1 1%C λιποσωμάτων (0.5 mg/ml) παρουσία (τετράγωνα) και απουσία (κύκλοι) μεταλλικών επιφανειών Όπως φαίνεται από τα παραπάνω γραφήµατα, η παρουσία των µεταλλικών επιφανειών δεν επηρεάζει τη σταθερότητα των λιποσωµάτων. Αυτό είναι ένα πολύ καλό εύρηµα διότι είναι σηµαντικό τα λιποσώµατά µας να είναι σταθερά παρουσία των επιφανειών Μακροχρόνια (3 µήνες) σταθερότητα SUV λιποσωµάτων σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7.4 στους 4 ο C (shelf life). Γνωρίζουµε από τη βιβλιογραφία ότι τα λιποσώµατα µε κύριo λιπίδιo PC ή DSPC µπορούν να αποθηκευτούν για µεγάλα χρονικά διαστήµατα στους 4 ο C. Προκειµένου να εξετάσουµε το ενδεχόµενο το pegylated λιπίδιο (F και C) να επηρεάζει την ικανότητά τους να αποθηκεύονται για µεγάλο διάστηµα στους 4 ο C παρασκευάσαµε DSPC:Chol 2:1 SUV λιπoσώµατα µε 1% pegylated λιπίδιο (F ή C) µε ή χωρίς φορτίο (PG) και µετρήσαµε το µέγεθός τους και τη διασπορά µεγέθους τους σε χρόνο t = 0 και σε χρόνο t = 3 µήνες. Σε περίπτωση συσσωµάτωσης των λιποσωµάτων θα παρατηρούσαµε αύξηση του µέσου µεγέθους των λιποσωµάτων, όπως και αύξηση του δείκτη PDI. Όπως φαίνεται στους πίνακες 3.9 και 3.10, κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε (οι τιµές µέσου µεγέθους και PDI δεν διαφέρουν σηµαντικά ανάµεσα στα παλιά και φρέσκα δείγµατα), οπότε τα µπορούµε να αποθηκεύουµε τα δείγµατά µας µέχρι και 3 µήνες στους 4 ο C. 76

94 Πίνακας 3. 9 Μέγεθος SUV Λιποσωμάτων σε χρόνο t = 0 Λιποσωµική Σειρά Μέγεθος (nm) PDI DSPC:Chol C 1% 86,908 ± 0,999 0,112 ± 0,021 DSPC:Chol F 1% 91,592 ± 1,888 0,1598 ± 0,023 DSPC:PG:Chol C 1% 80,094 ± 2,379 0,2202 ± 0,012 DSPC:PG:Chol F 1% 91,144 ± 1,474 0,2038 ± 0,025 Πίνακας Μέγεθος SUV Λιποσωμάτων σε χρόνο t = 3 μήνες Λιποσωµική Σειρά Μέγεθος (nm) PDI DSPC:Chol C 1% 77,868 ± 4,467 0,1912± 0,080 DSPC:Chol F 1% 89,208 ± 1,049 0,141± 0,029 DSPC:PG:Chol C 1% 89,168 ± 0,832 0,1804 ± 0,014 DSPC:PG:Chol F 1% 85,45 ± 1,452 0,213 ± 0, Λιποσώµατα που εγκλωβίζουν ηπαρίνη Φωτοµετρική µέθοδος. Εκτιµήσαµε τη σταθερότητα SUV (2 ης γενιάς) λιποσωµάτων τριών λιπιδικών συστάσεων µελετώντας την περιεκτικότητά τους σε ηπαρίνη (D/L) κατά την επώασή τους σε ρυθµιστικό δάλυµα PBS ph 7.4 στους 37 ο C. Οι λιπιδικές συστάσεις που χρησιµοποιήθηκαν είναι: PC, PC 1% C και DSPC:Chol 1% C. Στον Πίνακα 3.11 παρουσιάζονται οι τιµές D/L των λιποσωµάτων σε σχέση µε το χρόνο επώασης και στο Γράφηµα 3.17 βλέπουµε τις τιµές εκφρασµένες σε ποσοστό του αρχικού D/L. Πίνακας Σταθερότητα SUV λιποσωμάτων με ηπαρίνη σε PBS στους 37 ο C Χρόνος (h) Drug/Lipid (g/mol) (n=2) PC PC C 1% DSPC:Chol C 1% ± ± ± ± ± ± ± ± ±

95 Γράφημα Σταθερότητα SUV λιποσωμάτων με ηπαρίνη σε PBS στους 37ο C Παρατηρούµε ότι τα DSPC:Chol 1%C λποσώµατα είνια σταθερά µέχρι και 24 h, ενώ τα PC 1%C παρουσιάζουν µικρή αστάθεια. Τα PC λιποσώµατα, όπως ήταν αναµενόµενο, δείχνουν σηµάδια αστάθεια από τις πρώτες ώρες επώασης. Η παρουσία του pegylated λιπιδίου (C) προσδίδει σταθερότητα στα λιποσώµατα, επιβραδύνοντας την απελευθέρωση της ηπαρίνης Μέθοδος µε µέτρηση του χρόνου πήξης του αίµατος. Μελετήθηκαν ο λιποσωµικές σειρές PC 1% C και DSPC:Chol 2:1 1% C. Η σταθερότητα των λιποσωµάτων εξετάστηκε υπολογίζοντας την ποσότητα της ελεύθερης ηπαρίνης στα δείγµατα σε διάφορες χρονικές στιγµές κατά την επώασή τους σε PBS και στους 37 ο C. Στον Πίνακα 3.12 βλέπουµε την ποσότητα ελεύθερης ηπαρίνης στα δείγµατα σε διάφορες χρονικές στιγµές, και στα γραφήµατα 3.18 και 3.19 βλέπουµε τη σταθερότητά των λιποσωµάτων εκφρασµένη σε ποσοστό της ελεύθερης ως προς την ολική ηπαρίνη. 78