ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ NF κβ ΑΠΟ ΙΟΥΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ TRAF6

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ NF κβ ΑΠΟ ΙΟΥΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ TRAF6 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΓΑΣ ΧΑΡΙΛΑΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΟΣΙΑΛΟΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 ~ ii ~ ΠΡΟΛΟΓΟΣ Δεκέμβριος Επιστρέφοντας από την Αγγλία όπου βρισκόμουν για την παρακολούθηση μεταπτυχιακού προγράμματος, αισθάνομαι γεμάτος αισιοδοξία, καθώς ξεκινάω τη διδακτορική μου διατριβή στο τμήμα από το οποίο είχα πάρει το πτυχίο μου λίγους μήνες νωρίτερα. Δεκέμβριος Η ώρα του τέλους έφτασε. Μετά από πέντε χρόνια προσπάθειας και μόχθου (σωματικού και κυρίως ψυχικού), το κεφάλαιο αυτό είναι έτοιμο να κλείσει. Οι λέξεις αυτή τη στιγμή γράφονται δυσκολότερα απ ό,τι περίμενα και μου προκαλεί εντύπωση... Η αλήθεια είναι ότι φαινόταν πολύ ευκολότερο. Δεν ξέρω τι μπορεί να σημαίνει αυτό, το σίγουρο είναι πάντως ότι δεν οφείλεται στην απουσία συναισθημάτων. Το αντίθετο μάλιστα. Ίσως τα έντονα συναισθήματα που έχω αυτή τη στιγμή να προκαλούν τη δυσκολία στη σύνταξη του προλόγου αυτού. Όταν τελειώνει κάτι τόσο μεγάλο γύρω από το οποίο έχεις ζήσει και επενδύσει για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα, πρέπει να θεωρήσεις τον εαυτό σου πολύ τυχερό όταν κοιτώντας προς τα πίσω, σου μένει μία γλυκιά αίσθηση. Όπως και να χει πάντως, αρκεί να πάρεις μία βαθιά ανάσα και να κάνεις το επόμενο βήμα, όποιο κι αν είναι αυτό, όπου κι αν οδηγήσει. Μέσα σε αυτά τα χρόνια, έμαθα πολλά, ίσως και περισσότερα από όσα ήθελα και περίμενα ότι θα αποκτήσω από μία διατριβή. Το σημαντικό είναι να ξέρεις να διαχειρίζεσαι τη γνώση αυτή και να τη μετατρέπεις σε εφόδιο για τη συνέχεια. Ο κύριος υπεύθυνος για όλες τις γνώσεις που απέκτησα αυτά τα χρόνια είναι ο αναπληρωτής καθηγητής Γεώργιος Μόσιαλος. Θέλω να εκφράσω τις ευχαριστίες μου για την καθοδήγηση που μου προσέφερε, για τις συμβουλές του, αλλά και για τα «σπρωξίματα» που μου έδωσε κατά καιρούς προς την εκάστοτε κατεύθυνση. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την αναπληρώτρια καθηγήτρια Πηνελόπη Μαυραγάνη Τσιπίδου, η οποία με βοήθησε πάρα πολλές φορές, τόσο παρέχοντάς μου συμβουλές και προτάσεις σε ό,τι αφορά τα πειράματά μου, όσο και όντας ένα πολύ σημαντικό ψυχολογικό στήριγμα όποτε το χρειαζόμουν. Είναι πολύ πιθανό ότι αν δεν ήταν η κυρία Μαυραγάνη, τα πράγματα να ήταν διαφορετικά.

3 ~ iii ~ Θέλω να ευχαριστήσω το τρίτο μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής, τον καθηγητή Μηνά Αρσενάκη, για τις συμβουλές και τη βοήθειά του, καθώς επίσης και τα μέλη της Εξεταστικής Επιτροπής, καθηγήτρια Μαργαρίτα Χατζοπούλου Κλαδαρά, καθηγήτρια Αντιγόνη Λάζου, αναπληρωτή καθηγητή Μηνά Γιάγκου και αναπληρωτή καθηγητή Χρήστο Παναγιωτίδη, για τις πολύτιμες συμβουλές τους κατά τη διόρθωση της παρούσας διατριβής. Ένα ευχαριστώ θέλω να πω και στην Εύη Χατζηβασιλείου για τη βοήθειά της και τις συμβουλές της, όποτε κι αν τη χρειάστηκα, κατά τη διάρκεια των πειραμάτων μου. Η επικοινωνία μεταξύ των ανθρώπων που βρίσκονται σε ένα εργαστήριο είναι πολύ σημαντική για την ομαλή και ευχάριστη διεξαγωγή των πειραμάτων. Έτσι, θέλω να ευχαριστήσω τον Κώστα Δημητριάδη, το Βασίλη Μαυροματίδη, τη Σοφία Καραναστάση, τον Παύλο Χάντουε και το Δημήτρη Καρατζά, που ο καθένας τους προσέφερε το δικό του λιθαράκι ώστε να δημιουργηθεί το ιδιαίτερο κλίμα που επικρατούσε στο εργαστήριο τα χρόνια αυτά. Το μεγαλύτερο ευχαριστώ και ταυτόχρονα τη μεγαλύτερη συγνώμη οφείλω στην οικογένειά μου τόσο με τη στενή έννοια του όρου όσο και με μία πιο ευρεία έννοια, τους φίλους μου, για τη στήριξή τους και κυρίως για την ανοχή τους και την υπομονή τους όλα αυτά τα χρόνια. στις καλές στιγμές, μοιράστηκαν μαζί μου τη χαρά και τον ενθουσιασμό. στις κακές στιγμές, αποτέλεσαν πολλές φορές τους δέκτες αδικαιολόγητων νεύρων και φωνών. Για το γεγονός ότι παραμένουν ακόμη δίπλα μου, τους ευχαριστώ. Μέγας Χαρίλαος

4 ~ iv ~ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων NF κβ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της ανοσοαπόκρισης. Ο NF κβ ενεργοποιείται από μία πληθώρα εξωκυτταρικών σημάτων, ανάμεσα στα οποία είναι διάφορες κυτοκίνες και άλλες ουσίες, βακτήρια και συστατικά τους, καθώς επίσης και ιοί, όπως είναι ο ιός της ηπατίτιδας C και ο ιός Epstein Barr. Η πρωτεΐνη TRAF6 είναι μία Ε3 λιγάση ουβικουιτίνης, που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ από διάφορα ερεθίσματα στα οποία συμπεριλαμβάνονται ιικοί παράγοντες όπως η πρωτεΐνη core του ιου της ηπατίτιδας C και η πρωτείνη LMP1 του ιού Epstein-Barr. Η TRAF6 αποτελείται από μία ιδιαίτερα συντηρημένη καρβοξυτελική περιοχή, στην οποία υπάρχει η επικράτεια TRAF C και μία δομή εσπειραμένης έλικας, καθώς και από μία αμινοτελική περιοχή, που περιέχει μία επικράτεια RING και μία σειρά από δακτύλους ψευδαργύρου. Η επικράτεια TRAF C συνεισφέρει στον ολιγομερισμό της πρωτεΐνης TRAF6 και αλληλεπιδρά με σηματοδοτικά μόρια που βρίσκονται ανοδικά στο μονοπάτι ενεργοποίησης του NF κβ, ενώ η επικράτεια RING είναι το κύριο στοιχείο που προσδίδει στην πρωτεΐνη τη λειτουργία της Ε3 λιγάση ουβικουιτίνης. Για να εξακριβωθούν δομικά στοιχεία που συμμετέχουν ενεργά στην επαγόμενη από TRAF6 ενεργοποίηση του NF κβ, πραγματοποιήθηκε μία σειρά μεταλλάξεων τόσο στην επικράτεια TRAF C όσο και στην επικράτεια RING. Μεταλλάξεις που έγιναν σε συντηρημένα αμινοξέα της επικράτειας TRAF C δεν προκάλεσαν σημαντικές μεταβολές στην ικανότητα της πρωτεΐνης να ενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα NF κβ. Αντίθετα, οι μεταλλάξεις που έγιναν στην επικράτεια RING της πρωτεΐνης TRAF6 αποκάλυψαν μία σειρά αμινοξέων που έχουν λειτουργικά σημαντικό ρόλο ο οποίος είναι συντηρημένος καθώς δείχθηκε ότι ομόλογα αμινοξέα της επικράτειας RING της πρωτεΐνης TRAF2 είναι επίσης σημαντικά για την ενεργοποίηση του NF-κΒ. Τα περισσότερα από τα λειτουργικά σημαντικά αμινοξέα των επικρατειών RING της TRAF6 και της TRAF2 βρίσκονται στην επιφάνεια διμερισμού των αντίστοιχων επικρατειών υπογραμμίζοντας τη λειτουργική σημασία της συγκεκριμένης περιοχής.

5 ~ v ~ Ωστόσο η ικανότητα διμερισμού των επικρατειών RING δεν αποτελεί από μόνη της ικανή συνθήκη για την ενεργοποίηση του NF-κΒ από τις πρωτεΐνες TRAF6 και TRAF2, αναδεικνύοντας έτσι την ύπαρξη άλλων ιδιοτήτων των επιφανειών διμερισμού των επικρατειών αυτών που είναι σημαντικές για το συγκεκριμένο σηματοδοτικό μονοπάτι. Αναλυση της εξαρτώμενης από την επικράτεια RING ικανότητας πολυουβικουιτίνωσης της TRAF6 έδειξε ότι η δράση αυτή μπορεί να είναι αναγκαία αλλα όχι ικανή συνθήκη για την ενεργοποίηση του NF-κΒ από την TRAF6. Παρατηρήθηκε ωστόσο μία συσχέτιση της ικανότητας διμερισμού της επικρατείας RING και της πολυουβικουιτίνωσης της TRAF6, γεγονός που επισημαίνει την πιθανή αναγκαιότητα διμερισμού της επικράτειας RING για την πολυουβικουιτίνωση της TRAF6. Η παρούσα διατριβή κατέδειξε την ύπαρξη νέων δομικών και μηχανιστικών στοιχείων μεταγωγής σήματος από την πρωτεΐνη TRAF6 που θα συμβάλλουν στην ανάπτυξη μεθόδων ελέγχου της δράσης της πρωτεΐνης αυτής και των παθολογικών καταστάσεων στις οποίες συμμετέχει.

6 ~ vi ~ ABSTRACT The transcriptional factors NF κβ play an important role in the immunity response. NF κβ is activated by a plethora of signaling molecules, such as various cytokines and other substances, bacteria and bacterial parts, as well as viruses, such as the hepatitis C virus (HCV) and the Epstein Barr virus (EBV). The protein TRAF6 is an E3 ubiquitin ligase that has an important role in the activation of the transcriptional factor NF κβ by various stimuli which include the HCV core protein and the EBV oncoprotein LMP1. TRAF6 consists of a highly conserved carboxyl terminal TRAF C domain, preceded by a coiled coil domain, and of an amino terminal region, which contains a RING domain and a series of zinc fingers. The TRAF C domain contributes to the oligomerization of the protein and interacts with upstream signaling molecules, while the RING domain is the main element that grants the function of E3 ubiquitin ligase to TRAF6. To determine structural features that are important for TRAF6 dependent NF κβ activation, a series of mutational changes in residues of the TRAF C and RING domains was undertaken. Mutations of conserved residues residing in the TRAF C domain did not cause significant changes in the ability of TRAF6 to activate NF κβ. On the other hand, mutations of residues located in the RING domain of TRAF6 revealed a number of residues that have a functionally important role which was conserved since homologous amino acids in the corresponding RING domain of TRAF2 were shown to have an important role in TRAF2-induced NF-κB activation. Most of the functionally important residues of the RING domains of TRAF6 and TRAF2 lie on the dimerization interface of these domains, underscoring their functional significance. However, the dimerization capability of the TRAF6 and TRAF2 RING domains was not sufficient for NF-κB activation, indicating the existence of other properties of the dimerization interfaces of these domains that are necessary for the activation of NF-kB. Evaluation of the RING-domain dependent polyubiquitination of TRAF6 showed that this function may be necessary but insufficient for TRAF6-induced activation of NF-κB. Interestingly, a relative correlation between the dimerization capability of the RING domain of TRAF6

7 ~ vii ~ and its polyubiquitination was noted, underlying the functional importance of RING domain dimerization for the polyubiquitination of TRAF6. The present study revealed the existence of novel structural and mechanistic elements of TRAF6-mediated signal transduction which will contribute to the development of methods for controlling the activity of TRAF6 and its associated pathologies.

8 ~ viii ~ Η διατριβή αυτή συγχρηματοδοτήθηκε κατά 75% από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης), 25% από το Ελληνικό Δημόσιο (Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας) και από τον ιδιωτικό τομέα στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης (έργο ΠΕΝΕΔ2003 με κωδικό 03ΕΔ297)

9 ~ ix ~ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η λειτουργική σημασία διαφόρων δομικών στοιχείων της πρωτεΐνης TRAF6. Η TRAF6 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ από ογκογόνους ιούς (HCV, EBV) καθώς επίσης και κυτταρικούς υποδοχείς που συμμετέχουν στην έμφυτη και τη προσαρμοστική ανοσία (IL-1R/TLR, CD40),ή την ομοιόσταση των οστών (TRANCE-R/RANK). Κατά συνέπεια η ανάλυση του μηχανισμού δράσης της TRAF6 έχει ιδιαίτερη σημασία για την κατανόηση της ρύθμισης πολλαπλών φυσιολογικών διεργασιών αλλά και παθολογικών καταστάσεων που σχετίζονται με την απορρύθμιση τους. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής μπορούν να αξιοποιηθούν μακροπρόθεσμα για την ανάπτυξη μεθόδων αντιμετώπισης παθολογικών καταστάσεων που σχετίζονται με τη δράση της πρωτεΐνης TRAF6.

10 ~ x ~ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Εισαγωγή Οικογένεια πρωτεϊνών Rel IκΒs καταστολείς (και όχι μόνο) του NF κβ Η πρόσδεση του NF κβ στο DNA Τα μονοπάτια ενεργοποίησης του NF κβ Εξωκυτταρικά σήματα του NF κβ Κυτταρικοί υποδοχείς των εξωκυτταρικών σημάτων του NF κβ Υπεροικογένεια υποδοχέων TNFR Οικογένεια υποδοχέων IL 1R/TLR Οικογένεια πρωτεϊνών ΙΚΚ Γονίδια στόχοι του NF κβ Οικογένεια πρωτεϊνών TRAF Πρωτεΐνη TRAF Πρωτεΐνη TRAF Πρωτεΐνη TRAF Πρωτεΐνη TRAF Πρωτεΐνη TRAF Πρωτεΐνη TRAF Ουβικουιτίνωση πρωτεϊνών Ουβικουιτίνωση και NF κβ NF κβ και ιοί Υλικά Μέθοδοι Πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης Δημιουργία μεταλλαγμάτων των γονιδίων των πρωτεϊνών TRAF6 και TRAF Εύρεση συντηρημένων αμινοξέων στο γονίδιο της TRAF Μεταλλαξιγόνος PCR Απομόνωση DNA από πηκτή (gel) αγαρόζης Ένθεση του τμήματος DNA με την

11 ~ xi ~ τροποποιημένη τριπλέτα στον πλασμιδιακό φορέα Μετασχηματισμός βακτηρίων Απομόνωση πλασμιδίων με τη μέθοδο της αλκαλικής λύσης Έλεγχος απομονωμένων πλασμιδίων Ανακαλλιέργεια σε βακτήρια και απομόνωση πλασμιδίων με το kit NucleoSpin Plasmid QuickPure της Macherey Nagel Αλληλούχιση δειγμάτων Απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα με το kit NucleoBond Xtra Midi της Macherey Nagel Φωτομέτρηση δειγμάτων Καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων Προσδιορισμός ικανότητας ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ από τα μεταλλάγματα TRAF6 και TRAF Καλλιέργεια κυττάρων που θα διαμολυνθούν Διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με HBS Συλλογή ευκαρυωτικών κυττάρων μετά από διαμόλυνση Ποσοτικός προσδιορισμός δραστικότητας λουσιφεράσης Μέτρηση δραστικότητας λουσιφεράσης Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS PAGE) Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών (Transfer) Ανοσοανίχνευση κατά Western (western blotting) Εμφάνιση σε φιλμ ECL Αυτοουβικουιτίνωση των πρωτεϊνών TRAF6 και TRAF Διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων με το αντιδραστήριο Ex Gen Συλλογή κυττάρων... 71

12 ~ xii ~ Ανοσοκατακρήμνιση Αποτελέσματα Μελέτη της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ από τα μεταλλάγματα της καρβοξυτελικής περιοχής TRAF C της πρωτεΐνης TRAF Μελέτη της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ από τα μεταλλάγματα της επικράτειας RING της πρωτεΐνης TRAF Μελέτη της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ από τα μεταλλάγματα της επικράτειας RING της πρωτεΐνης TRAF Έλεγχος έκφρασης των μεταλλαγμάτων της πρωτεΐνης TRAF6 και της πρωτεΐνης TRAF Έλεγχος της επίδρασης των μεταλλαγμάτων της επικράτειας RING της πρωτεΐνης TRAF6 στην αυτοουβικουιτίνωσή της Συζήτηση Βιβλιογραφία Παράρτημα

13 ~ 1 ~ ΕΙΣΑΓΩΓΗ

14 ~ 2 ~ 1.1 ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Rel Ο NF κβ αντιπροσωπεύει ένα σύνολο ευκαρυωτικών μεταγραφικών παραγόντων που απαντώνται σχεδόν σε όλους τους κυτταρικούς τύπους. Εντοπίστηκε το 1986 ως μεταγραφικός παράγοντας που ήταν απαραίτητος για τη μεταγραφή της ελαφριάς αλυσίδας κ της αιμοσφαιρίνης (Ig κ) στα Β λεμφοκύτταρα, απ όπου πήρε και το όνομά του (Sen and Baltimore, 1986a). Από τη στιγμή της ανακάλυψής του μέχρι και σήμερα, βρέθηκαν πάρα πολλά γονίδια στόχοι του NF κβ, των οποίων η έκφραση επηρεάζεται από τον παράγοντα αυτόν. Τα γονίδια αυτά αφορούν, κυρίως, μόρια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα. Ο NF κβ είναι ένας συλλογικός όρος που αναφέρεται σε μία κατηγορία διμερών μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι αποτελούν μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Rel. Στην οικογένεια αυτή ανήκουν πέντε μέλη που απαντώνται στα κύτταρα θηλαστικών (Ghosh S. et al, 1998). Τα μέλη αυτά είναι (εικόνα 1): NF κb1 (p105/p50). NF κb2 (p100/p52). RelA (p65). RelB. c Rel. Κοινό χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών αυτών είναι μία συντηρημένη περιοχή 300 αμινοξέων, η οποία βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο τους και ονομάζεται Rel Homology Domain (RHD). Η περιοχή RHD ευθύνεται για τη σύνδεση με το DNA, το διμερισμό, καθώς και την αλληλεπίδραση με μέλη της οικογένειας ΙκΒ. Περιέχει, επίσης, ένα πυρηνικό σήμα εντοπισμού (Nuclear Localization Sequence, NLS) (Ghosh S. et al, 1998). Τρία από τα μέλη της οικογένειας Rel (p65, RelB, c Rel) συντίθενται ως ώριμα προϊόντα. Χαρακτηριστικό τους γνώρισμα είναι ότι περιέχουν περιοχές ενεργοποίησης της μεταγραφής (Transactivation Domains, TADs) στο καρβοξυτελικό τους άκρο που κατά κύριο λόγο ευθύνονται για την ιδιότητα των μορίων να δρουν ως ρυθμιστές της μεταγραφής διαφόρων γονιδίων στόχων (Santoro et al, 2003).

15 ~ 3 ~ Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση των σημαντικότερων περιοχών που εντοπίζονται στα διάφορα μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Rel. Οι πρωτεΐνες Rel σχηματίζουν διμερή μεταξύ τους που είναι γνωστά με τον όρο NF κβ. RHD: Rel Homology Domain, ομόλογη περιοχή μεταξύ των πρωτεϊνών Rel. TAD: Transactivation Domain, περιοχή που επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων. ANK: Ankyrin repeats, επαναλήψεις αγκυρίνης. DD: Death Domain, περιοχή θανάτου. Figure 1. Schematic representation of the domains found in members of the Rel family. Rel proteins form dimers with each other, collectively known as NF κβ. RHD: Rel Homology Domain, TAD: Transactivation Domain, which induces the transcription of the target genes. ANK: Ankyrin repeats. DD: Death Domain. Τα άλλα δύο μέλη της οικογένειας, το p50 και το p52, προκύπτουν από τη μετα-μεταφραστική τροποποίηση πρόδρομων μορίων, του p105 (Fan and Maniatis, 1991; Mercurio et al, 1993) και p100 (Mercurio et al, 1993) αντίστοιχα. Η τροποποίηση αυτή γίνεται μέσω πολυουβικουιτίνωσης και πραγματοποιείται στο πρωτεάσωμα (Fan and Maniatis, 1991; Palombella et al, 1994). Τα p105 και p100 δε φέρουν TADs στο καρβοξυτελικό τους άκρο, αλλά μία περιοχή επαναλήψεων αγκυρίνης (Ghosh S. et al, 1998). Οι επαναλήψεις αγκυρίνης έχουν σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση πρωτεϊνών πρωτεϊνών. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, συνδέονται με το RHD, καλύπτοντας έτσι το NLS, γεγονός που προκαλεί την παρεμπόδιση της μεταφοράς των πρωτεϊνών στον πυρήνα. Ως αποτέλεσμα, τα πρόδρομα μόρια p105 και p100 εντοπίζονται αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα (Henkel et al, 1992). Τα ώριμα μόρια p50 και p52 περιέχουν τις περιοχές RHDs και επομένως, έχουν την ικανότητα σύνδεσης με το DNA. Όπως, όμως, τα πρόδρομα μόριά τους, έτσι και αυτά δε φέρουν TADs, κάτι που υποδεικνύει

16 ~ 4 ~ ότι δεν έχουν ικανότητα ενεργοποίησης της μεταγραφής. Εξαιτίας του γεγονότος αυτού, τα p50 και p52 έχουν τρεις πιθανούς τρόπους λειτουργίας (Ghosh and Hayden, 2008): Συνδέονται με κάποιο μέλος της οικογένειας που φέρει TAD, μεταβάλλοντας έτσι την εξειδίκευση των ετεροδιμερών ως προς τη θέση σύνδεσής τους. Σχηματίζουν ομοδιμερή, προκαλώντας έτσι την καταστολή της μεταγραφής των γονιδίων όπου συνδέονται. Επιστρατεύουν άλλες πρωτεΐνες που φέρουν TAD στα γονίδια όπου συνδέονται, επάγοντας έτσι τη μεταγραφή τους. 1.2 IκΒs ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΙΣ (ΚΑΙ ΟΧΙ ΜΟΝΟ) ΤΟΥ NF κβ Τα διμερή του NF κβ βρίσκονται ανενεργά στο κυτταρόπλασμα, συνδεδεμένα με τις πρωτεΐνες ΙκΒ (Inhibitors of κβ). Κοινό χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών αυτών είναι ότι έχουν επαναλήψεις αγκυρίνης, που κυμαίνονται από τρεις έως επτά. Οι επαναλήψεις αγκυρίνης είναι αυτές που αλληλεπιδρούν με το RHD και καλύπτουν το NLS του NF κβ. Πρέπει να σημειωθεί, παρολαυτά, ότι όλες οι πρωτεΐνες που περιέχουν επαναλήψεις αγκυρίνης δε δρουν απαραίτητα ως καταστολείς του NF κβ. Με βάση έρευνες των τελευταίων χρόνων, δημιουργήθηκε η άποψη ότι οι πρωτεΐνες ΙκΒ δεν είναι απλοί καταστολείς του μεταγραφικού παράγοντα, αλλά έχουν έναν πιο σύνθετο ρόλο κατά τη γονιδιακή ρύθμιση. Για παράδειγμα, έχουν την ικανότητα σταθεροποίησης ασταθών διμερών NF κβ, όπως είναι αυτά που περιέχουν RelB, με αποτέλεσμα να παίζουν ρόλο στο φάσμα των διμερών που εμφανίζονται σε ένα κύτταρο (Hoffmann et al, 2006). Επίσης, ορισμένες από τις πρωτεΐνες ΙκΒ έχουν την ικανότητα θετικής ρύθμισης της μεταγραφής, δρώντας ως μεταγραφικοί συνενεργοποιητές. Για τους παραπάνω λόγους, ίσως θα ήταν καλύτερο οι πρωτεΐνες αυτές να θεωρούνται πλειοτροπικοί NF κβ συμπαράγοντες (Ghosh and Hayden, 2008). Οι πρωτεΐνες ΙκΒ μπορούν να τοποθετηθούν σε τρεις κατηγορίες (Ghosh and Hayden, 2008):

17 ~ 5 ~ Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι πρωτεΐνες ΙκΒα, ΙκΒβ και ΙκΒε. Όταν κάποιο κατάλληλο σήμα φθάσει στο κύτταρο, οι παράγοντες αυτοί υφίστανται αποικοδόμηση στο πρωτεάσωμα που εξαρτάται από ουβικουιτίνη, με αποτέλεσμα τα διμερή NF κβ να απελευθερώνονται και να οδηγούνται στο εσωτερικό του πυρήνα. Μεταξύ των γονιδίων που επάγει ο NF κβ, βρίσκεται και αυτό που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ΙκΒα, κάτι που διευκολύνει τον τερματισμό της απόκρισης, καθώς προσδένεται και πάλι στα κυτταροπλασματικά διμερή NF κβ, εμποδίζοντας τη μετατόπισή τους στον πυρήνα (Hayden and Ghosh, 2008). Ο ρόλος της ΙκΒα είναι να ρυθμίζει την άμεση αλλά παροδική επαγωγή της δράσης του NF κβ μέσω ενός αυτορυθμιζόμενου βρόγχου. Στην περίπτωση, όμως, που ένα σήμα βρίσκεται συνεχώς (π.χ. LPS), ο μεταγραφικός παράγοντας παραμένει στον πυρήνα παρά το γεγονός ότι αυξήθηκε η παραγωγή ΙκΒα. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην ΙκΒβ, η οποία αποικοδομείται μόλις εμφανιστεί το σήμα, αλλά δεν επαναδημιουργείται μέχρι αυτό να σταματήσει να υπάρχει (Thompson et al, 1995). Τόσο η ΙκΒα όσο και η ΙκΒβ συνδέονται με τις ίδιες υπομονάδες rel, κάτι που δεν ισχύει στην περίπτωση της ΙκΒε. Η πρωτεΐνη αυτή φαίνεται να συνδέεται κατά προτίμηση με τα σύμπλοκα p65:p65 και p65:c Rel, κάτι που υποδηλώνει ότι βοηθά στη ρύθμιση γονιδίων των οποίων οι προαγωγείς συνδέονται κυρίως με τα διμερή αυτά (π.χ. IL 8) (Kunsch and Rosen, 1993). Η ΙκΒε αποικοδομείται μαζί με τις προαναφερθείσες πρωτεΐνες μετά από κατάλληλο σήμα και η έκφρασή της επάγεται από τον NF κβ, όπως ακριβώς συμβαίνει και με την ΙκΒα. Καθώς όμως η ΙκΒε έχει πιο αργή κινητική σε σχέση με την ΙκΒα, κατά τις φάσεις αποικοδόμησης/επανασύνθεσης εμφανίζονται και διαφορετικά αποτελέσματα (Kearns et al, 2006). Η δεύτερη κατηγορία πρωτεϊνών ΙκΒ αποτελείται από τις πρόδρομες πρωτεΐνες p100 και p105. Όπως αναφέρθηκε, οι πρωτεΐνες αυτές υφίστανται μετα μεταφραστική τροποποίηση, σχηματίζοντας τις Rel πρωτεΐνες p50 και p52. Με τη μορφή πρόδρομων μορίων, όμως,

18 ~ 6 ~ εμφανίζουν ιδιότητες καταστολέων έχοντας τρόπο δράσης παρόμοιο με αυτόν της πρώτης κατηγορίας. Η τρίτη κατηγορία περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες ΙκΒζ, BCL 3 και ΙκΒNS. Ενώ οι πρωτεΐνες των δύο προηγούμενων κατηγοριών εμφανίζονται στο κυτταρόπλασμα κυττάρων που δεν έχουν δεχθεί σήμα, δε συμβαίνει το ίδιο με την κατηγορία αυτή. Η μεταγραφή τους επάγεται μετά από την ενεργοποίηση του NF κβ και δρουν εντός του πυρήνα. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΙκΒζ επάγεται μετά από σήμα IL 1 και LPS. Η πρωτεΐνη αυτή συνδέεται με διμερή NF κβ που δεν περιέχουν TAD και κυρίως διμερή p50:p50. Φαίνεται πως έχει αρνητική δράση όταν συνδέεται με σύμπλοκα που περιέχουν p65 και θετική δράση όταν συνδέεται με ομοδιμερή p50. Η πρωτεΐνη BCL 3 αναγνωρίστηκε αρχικά ως πρωτο ογκογονίδιο που υπερεκφράζεται σε Β κυτταρικές χρόνιες λευχαιμίες και ο ρόλος της στη σηματοδότηση του NF κβ δεν έχει εξακριβωθεί. Μοναδικό χαρακτηριστικό της που δεν έχουν οι άλλες πρωτεΐνες ΙκΒ είναι η TAD που διαθέτει. Εντοπίζεται στον πυρήνα και συνδέεται με ομοδιμερή p50 και p52, τα οποία, όπως έχει αναφερθεί, δεν περιέχουν TAD και δεν έχουν ικανότητα ενεργοποίησης της μεταγραφής. Η σύνδεσή τους με την BCL 3 πιθανόν να τους προσδίδει την ικανότητα ενεργοποίησης άλλων γονιδίων. Μία άλλη άποψη που υπάρχει για τη δράση της BCL 3 είναι ότι ευνοεί τη μεταγραφή εκτοπίζοντας τα ομοδιμερή από τις θέσεις σύνδεσης κβ στο DNA, επιτρέποντας κατ αυτόν τον τρόπο τη σύνδεση μεταγραφικά ενεργών διμερών. Τέλος, υποστηρίζεται ότι μπορεί να παρεμποδίσει τη μεταγραφή σταθεροποιώντας ομοδιμερή p50 και p52 στις θέσεις κβ. Ο τρόπος με τον οποίο δρα η BCL 3 εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως είναι οι μετα μεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίσταται (φωσφορυλίωση, ουβικουιτίνωση), η έκφρασή της μαζί με άλλες πρωτεΐνες κλπ. Δεν έχει διευκρινιστεί ο μηχανισμός δράσης της πρωτεΐνης ΙκΒNS. Φαίνεται πως η πρωτεΐνη αυτή έχει κατασταλτικό χαρακτήρα για ορισμένα γονίδια που αφορούν τη φλεγμονώδη απόκριση.

19 ~ 7 ~ 1.3 Η ΠΡΟΣΔΕΣΗ ΤΟΥ NF - κβ ΣΤΟ DNA Όπως αναφέρθηκε, ο όρος NF κβ καλύπτει ένα φάσμα διμερών μεταγραφικών παραγόντων που αποτελούνται από μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Rel. Συνήθως, όμως, ο όρος αυτός χρησιμοποιείται για να περιγράψει το ετεροδιμερές p50/p65, που απαντάται συχνότερα και που αποτελεί τον πρώτο μεταγραφικό παράγοντα NF κβ που μελετήθηκε (Kopp and Ghosh, 1995; Verma et al, 1995). Όταν ένας μεταγραφικός παράγοντας NF κβ συνδέεται στο DNA, αναγνωρίζει μία νουκλεοτιδική αλληλουχία μήκους 10bp, που έχει τη μορφή 5 GGGGYNNCCY 3. Η αλληλουχία αυτή είναι γνωστή ως θέση σύνδεσης κβ (κβ binding site ή consensus site). Όπως φαίνεται, η αλληλουχία αυτή δεν είναι αυστηρά καθορισμένη, αλλά αντιπροσωπεύει μία ομάδα αλληλουχιών, καθώς οι θέσεις Υ αντιστοιχούν σε οποιαδήποτε πυριμιδίνη (T ή C) και οι θέσεις N σε οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο. Ανάλογα με τη συγκεκριμένη αλληλουχία που υπάρχει σε κάποιο γονίδιο, εμφανίζονται προτιμήσεις ως προς το συνδυασμό των δύο πρωτεϊνών που σχηματίζουν τον ετεροδιμερή μεταγραφικό παράγοντα (όπως αναφέρεται παρακάτω, και οι δύο πρωτεΐνες συμμετέχουν στη σύνδεση με τη θέση σύνδεσης κβ). Για παράδειγμα, το p50 συνδέεται με αλληλουχίες της γενικής μορφής 5 GGGGATYCCC 3, ενώ το p65 συνδέεται με αλληλουχίες της μορφής 5 GGGRNTTTCC 3 (Kunsch et al, 1992). Εκτός από τη διαφορική αυτή προτίμηση των διμερών NF κβ για αλληλουχίες συγκεκριμένης μορφής, υπάρχει διαφορά και στον τρόπο ρύθμισης της μεταγραφής, με ορισμένα διμερή να ενεργοποιούν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων και ορισμένα να την καταστέλλουν. Έτσι, τα διμερή p50/p65, p50/c Rel, p65/p65 και p65/c Rel είναι ενεργοποιητές της μεταγραφής, ενώ τα ομοδιμερή p50/p50 και p52/p52 είναι καταστολείς (Hansen et al, 1994; Kang et al, 1992; Plaksin et al, 1993). Ο τρόπος με τον οποίο τα διμερή NF κβ συνδέονται στο DNA βρέθηκε ερευνώντας την κρυσταλλική δομή των ομοδιμερών p50/p50 και p65/p65 (Ghosh G. et al, 1995; Muller et al, 1995; Chen et al, 1998). Ένα μόριο p50 αποτελείται από δύο περιοχές που συνδέονται μεταξύ τους με

20 ~ 8 ~ έναν ευλύγιστο σύνδεσμο. Στο κέντρο των περιοχών αυτών, υπάρχουν β φύλλα που συνδέονται μεταξύ τους, σχηματίζοντας έτσι μία ασυνήθιστη θέση σύνδεσης με το DNA. Όταν γίνεται ομοδιμερισμός των μορίων p50, σχηματίζεται μία συνεχόμενη επιφάνεια, η οποία «κλειδώνει» το μεταγραφικό παράγοντα στο DNA. Η δομή ενός διμερούς p50:p50 θυμίζει το σχήμα μιας πεταλούδας, με τη θέση σύνδεσης στο DNA να βρίσκεται στο κέντρο και τα β φύλλα να σχηματίζουν τα «φτερά». Το ομοδιμερές p65:p65 εμφανίζει ομοιότητες στον τρόπο σύνδεσής του με το DNA σε σχέση με το p50:p50, αλλά υπάρχει η εξής διαφορά: οι υπομονάδες p65 δεν έχουν συμμετρία ως προς το DNA, καθώς η μία υπομονάδα συνδέεται στη μισή θέση σύνδεσης κβ με εξειδίκευση, ενώ η άλλη υπομονάδα εμφανίζει περιορισμένη εξειδίκευση στην άλλη μισή θέση σύνδεσης κβ. 1.4 ΤΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ NF κβ Όταν δεν υπάρχει κάποιος λόγος που να απαιτεί την ενεργοποίηση της μεταγραφής γονιδίων από τον NF κβ, ο μεταγραφικός παράγοντας εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Όταν εμφανιστεί κάποιο κατάλληλο σήμα στην εξωκυτταρική περιοχή, μία σειρά αντιδράσεων οδηγεί στη μετατόπιση του μεταγραφικού παράγοντα από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, με επακόλουθο την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων. Για τη μετατόπιση του NF κβ στον πυρήνα απαιτούνται πολυάριθμες πρωτεΐνες του κυττάρου. Υπάρχουν δύο σηματοδοτικά μονοπάτια που έχουν ως αποτέλεσμα τη μετακίνηση των διμερών NF κβ από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Τα μονοπάτια αυτά εξαρτώνται από τις κινάσες ΙΚΚ και χαρακτηρίζονται ως «κλασικό» και «εναλλακτικό». Το κλασικό μονοπάτι επάγεται συνήθως από μικροβιακές και ιικές μολύνσεις ή από έκθεση σε κυτοκίνες που επάγουν τη φλεγμονώδη απόκριση (εικόνα 2). Το μονοπάτι αυτό χρησιμοποιεί κυρίως διμερή p50/p65 και p50/c Rel, και εξαρτάται από τη δράση της κινάσης ΙΚΚβ (Li et al, 1999). Επάγεται από τους περισσότερους κυτταρικούς υποδοχείς που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του NF κβ. Μεταξύ αυτών, βρίσκονται

21 ~ 9 ~ διάφοροι υποδοχείς της υπεροικογένειας TNFR (TNFR1, TNFR2), οι υποδοχείς IL 1R/TLR κλπ. Φλεγμονώδης απόκριση Εικόνα 2. Τα κύρια χαρακτηριστικά και τα σημαντικότερα μόρια που συμμετέχουν στο κλασικό μονοπάτι ενεργοποίησης του NF - κβ. Figure 2. Main features and most important molecules participating in the classic pathway of NF κβ activation. Το εναλλακτικό μονοπάτι χρησιμοποιεί αποκλειστικά τα διμερή p52:relb, επάγοντας την τροποποίηση της πρόδρομης πρωτεΐνης p100 στην ώριμη πρωτεΐνη p52 (εικόνα 3). Η πρωτεΐνη p100 βρίσκεται συνήθως ως ετεροδιμερές με την RelB στο κυτταρόπλασμα (Luo et al, 2005). Το μονοπάτι αυτό ενεργοποιείται από συγκεκριμένα μέλη της οικογένειας κυτοκινών TNF και στηρίζεται στη δράση της κινάσης ΝΙΚ, η οποία ενεργοποιεί επιλεκτικά τα ομοδιμερή ΙΚΚα. Οι υποδοχείς που ενεργοποιούν το εναλλακτικό μονοπάτι ανήκουν στην υπεροικογένεια των TNFR και συγκεκριμένα, είναι οι CD40, LT βr και BAFFR.

22 ~ 10 ~ Εικόνα 3. Τα κύρια χαρακτηριστικά και τα σημαντικότερα μόρια που συμμετέχουν στο εναλλακτικό μονοπάτι ενεργοποίησης του NF κβ. Figure 3. Main features and most important molecules participating in the alternative pathway of NF - κβ activation. Τόσο το κλασικό όσο και το εναλλακτικό μονοπάτι ρυθμίζουν την κυτταρική επιβίωση και το θάνατο (Senftleben and Karin, 2002). Το κλασικό μονοπάτι αποτρέπει τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο στις περισσότερες συνθήκες, ενώ το εναλλακτικό μονοπάτι ευθύνεται για την επιβίωση των ανώριμων Β λεμφοκυττάρων και την ανάπτυξη των δευτερευόντων λεμφικών οργάνων (Karin and Lin, 2002; Bonizzi and Karin, 2004). Τα βασικά στάδια των σηματοδοτικών μονοπατιών του NF κβ, καθώς και οι πρωτεΐνες που παίζουν σημαντικό ρόλο σε αυτά έχουν ως εξής (εικόνα 4): Σύνδεση προσδέτη και υποδοχέα. Ο εξωκυτταρικός προσδέτης (ligand) συνδέεται με τους κατάλληλους διαμεμβρανικούς υποδοχείς του κυττάρου, προκαλώντας είτε τον ολιγομερισμό τους είτε κάποια μεταβολή στον προσανατολισμό του κυτταροπλασματικού τμήματός

23 ~ 11 ~ τους (βλέπε σελίδα 13). Αυτό το γεγονός είναι υπεύθυνο για τη μεταφορά του μηνύματος από τον εξωκυτταρικό χώρο στο εσωτερικό του κυττάρου. Ενεργοποίηση του συμπλόκου κινασών ΙΚΚ. Μετά την εσωτερίκευση του σήματος, διάφορες πρωτεΐνες επιστρατεύονται προκειμένου να ενεργοποιηθεί, μέσω φωσφορυλίωσης, το σύμπλοκο ΙΚΚ. Η κύρια λειτουργία του συμπλόκου αυτού, που αποτελείται από τρεις υπομονάδες, είναι η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών ΙκΒ. Αποικοδόμηση των πρωτεϊνών ΙκΒ. Οι πρωτεΐνες ΙκΒ είναι καταστολείς του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ που συνδέονται με αυτόν και τον συγκρατούν στο κυτταρόπλασμα. Οι κινάσες ΙΚΚ, μετά την ενεργοποίησή τους, φωσφορυλιώνουν τις πρωτεΐνες ΙκΒ, γεγονός που προκαλεί την αποικοδόμησή τους και την απελευθέρωση του NF κβ. Μετατόπιση του NF κβ στον πυρήνα. Μετά την απελευθέρωσή του από τις πρωτεΐνες καταστολείς, ο NF κβ μπορεί πλέον να εισέλθει στον πυρήνα του κυττάρου και να συνδεθεί με τα κατάλληλα γονίδια στόχους, επάγοντας τη μεταγραφή τους. Ακολουθεί λεπτομερής ανάλυση καθενός από τα στάδια αυτά.

24 ~ 12 ~ Εικόνα 4. Τα κύρια στάδια των μονοπατιών ενεργοποίησης του NF κβ. (1) Σύνδεση του προσδέτη με τον κυτταρικό υποδοχέα και εισαγωγή του σήματος στο εσωτερικό του κυττάρου. (2) Ενεργοποίηση του ετεροτριμερούς συμπλόκου ΙΚΚ (ΙΚΚα/ΙΚΚβ/ΝΕΜΟ) ή του ομοδιμερούς συμπλόκου ΙΚΚα. (3) Αποικοδόμηση των καταστολέων του NF κβ στο πρωτεάσωμα. (4) Απελευθέρωση του NF κβ και μετατόπισή του στον πυρήνα. Figure 4. Main steps of the activation pathways of NF κβ. (1) Binding of ligand to the cellular receptor and internalization of the signal in the cell. (2) Activation of the heterotrimeric complex IKK (IKKα/ΙΚΚβ/ΝΕΜΟ) or the homodimeric complex IKKα. (3) Degradation of the inhibitors of NF κβ by the proteasome. (4) Release of NF κβ and translocation to the nucleus.

25 ~ 13 ~ 1.5 ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ ΤΟΥ NF - κβ Μία πληθώρα από ουσίες, μικροοργανισμούς, περιβαλλοντικές επιδράσεις και άλλες καταστάσεις ευθύνεται για την ενεργοποίηση των διμερών NF κβ (Pahl, 1999). Ενδεικτικά, αναφέρονται διάφορα βακτήρια και τμήματά τους [π.χ. Helicobacter pylori (Münzenmaier et al, 1997), Rickettsia rickettsii (Sporn et al, 1997), λιποπολυσακχαρίτες LPS (Sen and Baltimore, 1986b)], ιοί [π.χ. Epstein Barr Virus (Hammarskjöld et al, 1992), Hepatitis C Virus (Chen et al, 1997; You et al, 1999)], κυτοκίνες [π.χ. IL 1 (Osborn et al, 1989), TNFα (Osborn et al, 1989), TNFβ (Messer et al, 1990)] κλπ. 1.6 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΩΝ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΗΜΑΤΩΝ ΤΟΥ NF κβ Καθώς τα εξωκυτταρικά σήματα που ενεργοποιούν τον NF κβ είναι ποικίλα, υπάρχουν πολλοί και διαφορετικοί κυτταρικοί υποδοχείς στους οποίους αυτά προσδένονται. Σε αυτούς, ανήκουν η υπεροικογένεια υποδοχέων TNFR (Tumor Necrosis Factor Receptors) και η οικογένεια IL 1R/TLR (Interleukin 1 Receptors/Toll Like Receptors) Υπεροικογένεια υποδοχέων TNFR Οι TNFRs απαντώνται σχεδόν σε όλους τους εμπύρηνους κυτταρικούς τύπους. Δύο υποδοχείς που ανήκουν στην οικογένεια αυτή είναι ο TNFR1 και ο TNFR2. Οι υποδοχείς αυτοί εμφανίζουν 28% ομολογία στην εξωκυτταρική περιοχή τους όπου συνδέεται ο προσδέτης. Υπάρχουν δύο απόψεις για τον τρόπο με τον οποίο το σήμα εισέρχεται εντός του κυττάρου. Η μία άποψη υποστηρίζει ότι ο προσδέτης βρίσκεται ως τριμερές, προκαλώντας ολιγομερισμό (τριμερισμό) των υποδοχέων, οι οποίοι στη συνέχεια πυροδοτούν το σηματοδοτικό καταρράκτη εντός του κυττάρου (Vandenabeele et al, 1995) (εικόνα 5). Αργότερα, διατυπώθηκε η άποψη ότι οι TNFRs προϋπάρχουν ως ολιγομερή (τριμερή) στην κυτταρική μεμβράνη,

26 ~ 14 ~ συνδεόμενα στην εξωκυτταρική πλευρά τους μέσω της περιοχής PLAD (Pre- Ligand binding Assembly Domain) (εικόνα 6). Η σύνδεση του ligand, σύμφωνα με την άποψη αυτή, προκαλεί την αλλαγή προσανατολισμού του τριμερούς υποδοχέα, η οποία είναι και η υπεύθυνη για την έναρξη της σηματοδότησης εντός του κυττάρου (Papoff et al, 1999; Chan et al, 2000a; Siegel et al, 2000). Εικόνα 5. Μία υπόθεση για τον τρόπο μεταγωγής σήματος από τους TNFR υποδοχείς προς το εσωτερικό του κυττάρου. Σύμφωνα με αυτήν, οι υποδοχείς προϋπάρχουν ως μονομερή στην κυτταρική μεμβράνη. Η σύνδεση του προσδέτη προκαλεί τον ολιγομερισμό (τριμερισμό) τους, γεγονός που επιτρέπει τη μετάδοση του σήματος προς την κυτταροπλασματική πλευρά. Figure 5. A hypothesis for the signal transduction through the TNF receptors to the cytoplasm. According to it, the receptors are found as monomers on the cell membrane prior to the appearance of the signal. Association of the ligand causes the receptors to form trimers, which allows the transduction of the signal towards the intracellular area.

27 ~ 15 ~ Εικόνα 6. Σύμφωνα με την εναλλακτική υπόθεση μεταγωγής σήματος στο εσωτερικό του κυττάρου, οι υποδοχείς TNFR είναι συνδεδεμένοι σε ολιγομερή στην κυτταρική επιφάνεια προτού ακόμη εμφανιστεί το σήμα. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της περιοχή PLAD (Pre-Ligand Assembly Domain). Η σύνδεση του προσδέτη στο τριμερές των υποδοχέων προκαλεί τη μεταβολή του προσανατολισμού των κυτταροπλασματικών τμημάτων των υποδοχέων, γεγονός που προκαλεί και την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών καθοδικά των υποδοχέων. Figure 6. An alternative hypothesis for signal transduction by TNFR supports that TNFR form oligomers on the cell surface prior to the appearance of the ligand. This is accomplished thanks to the PLAD domain (Pre Ligand Assembly Domain). Association of the ligand to the receptor trimer causes an alteration of the orientation of the intracellular receptor parts, eventually leading to the activation of downstream proteins. Ο TNFR1 έχει μία περιοχή στο κυτταροπλασματικό του άκρο που ονομάζεται death domain (DD). Χάρη στην περιοχή αυτή, επιτυγχάνεται η συναρμογή ενός σηματοδοτικού συμπλόκου στρατολογώντας άλλες

28 ~ 16 ~ πρωτεΐνες που περιέχουν DD, όπως είναι η TRADD (εικόνα 7). Στο σηματοδοτικό αυτό σύμπλοκο, συνδέονται στη συνέχεια οι πρωτεΐνες TRAF2, TRAF5 και RIP. Το σύμπλοκο αυτό αποσπάται από τον υποδοχέα και συνδέεται με την πρωτεΐνη FADD και με πρωτεΐνες που λέγονται κασπάσες (Micheau and Tschopp, 2003). Τελικό αποτέλεσμα της στρατολόγησης αυτής είναι η ενεργοποίηση των κασπασών (όπως οι caspase 8 και caspase 10), γεγονός που αποτελεί το έναυσμα για τον ενζυμικό καταρράκτη της απόπτωσης (Chan et al, 2000b). Κάποιες φορές, όμως, μπορεί να στρατολογηθούν συγκεκριμένες πρωτεΐνες στο σύμπλοκο του υποδοχέα, που ονομάζονται c IAPs (cellular inhibitors of apoptosis, κυτταρικοί αναστολείς της απόπτωσης). Το γεγονός αυτό μπορεί να αποτρέψει τον κυτταρικό θάνατο, οδηγώντας τελικά σε ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων όπως είναι ο NF κβ και ο AP 1 (Wang et al, 1998) (εικόνα 8).

29 ~ 17 ~ Εικόνα 7. Σηματοδότηση μέσω της περιοχής Death Domain (DD) του υποδοχέα TNFR1. Η εμφάνιση του σήματος TNF προκαλεί τη στρατολόγηση στο κυτταροπλασματικό άκρο του υποδοχέα της πρωτεΐνης TRADD, μία αλληλεπίδραση που πραγματοποιείται χάρη στις περιοχές DD των δύο πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες TRAF2 και RIP συνδέονται με την TRADD, με αποτέλεσμα το σύμπλοκο αυτό να αποδεσμευτεί από τον υποδοχέα. Τέλος, οι πρωτεΐνες FADD και caspase 8 συνδέονται με το σύμπλοκο TRADD/TRAF2/RIP, γεγονός που σηματοδοτεί την έναρξη της αποπτωτικής απόκρισης. Figure 7. Signaling through the Death Domain (DD) of the TNFR1 receptor. Binding of TNF to the receptor causes the recruitment of the TRADD protein to the cytoplasmic tail of the receptor, an interaction accomplished through the DD of both proteins. The TRAF2 and RIP proteins are then connected to TRADD, causing the complex to detach from the receptor. FADD and caspase 8 associate with the TRADD/TRAF2/RIP complex, causing the initiation of the apoptotic response.

30 ~ 18 ~ Εικόνα 8. Αναστολή της απόπτωσης μέσω του υποδοχέα TNFR1. Αντί να συνδεθεί η πρωτεΐνη TRADD στον υποδοχέα μέσω της περιοχής DD που διαθέτει, στρατολογούνται σε αυτόν οι πρωτεΐνες TRAF1, TRAF2, c-iap1 και c-iap2. Το σύμπλοκο αυτό εμποδίζει τη δράση της caspase 8, με αποτέλεσμα να μην πραγματοποιείται σηματοδότηση προς το αποπτωτικό μονοπάτι. Figure 8. Inhibition of apoptosis by the TNFR1 receptor. Instead of TRADD interacting with the receptor through the DD, the proteins TRAF1, TRAF2, c IAP1 and c IAP2 are recruited. This complex inhibits caspase 8, thus preventing the activation of the apoptotic pathway. Ο υποδοχέας TNFR2 δεν περιέχει DD, γεγονός που δεν του επιτρέπει να συνδεθεί με άλλες πρωτεΐνες DD, όπως η TRADD. Η σύνδεση του υποδοχέα αυτού με το προσδέτη του έχει ως αποτέλεσμα την επιστράτευση των πρωτεϊνών TRAF2 και RIP. Μέσω διαφόρων μορίων, η RIP προκαλεί τη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της υπομονάδας ΙΚΚβ του συμπλόκου κινασών ΙΚΚ, με τελικό αποτέλεσμα την αποικοδόμηση των πρωτεϊνών ΙκΒ και την είσοδο του NF κβ στον πυρήνα του κυττάρου (εικόνα 9).

31 ~ 19 ~ Εικόνα 9. Σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα TNFR2. Η σύνδεση του ligand με τον υποδοχέα προκαλεί τη στρατολόγηση στο κυτταροπλασματικό άκρο αυτού των πρωτεϊνών TRAF2 και RIP. Ως αποτέλεσμα, η RIP προκαλεί με τη μεσολάβηση διαφόρων άλλων μορίων τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας ΙΚΚβ του συμπλόκου ΙΚΚ (ΙΚΚα/ΙΚΚβ/ΝΕΜΟ), το οποίο ενεργοποιείται προκαλώντας την αποικοδόμηση των καταστολέων ΙκΒ. Εναλλακτικά, η πρωτεΐνη ΜΕΚΚ1 μπορεί να στρατολογηθεί στο σύμπλοκο υποδοχέα/traf2, οδηγώντας τόσο σε ενεργοποίηση του ΙΚΚ συμπλόκου, όσο και σε ενεργοποίηση της πρωτεΐνης JNK και κατ επέκταση του μεταγραφικού παράγοντα AP 1. Figure 9. Signaling through the TNFR2 receptor. Binding of the ligand to the receptor causes the recruitment of TRAF2 and RIP to its cytoplasmic tail. RIP eventually causes the phosphorylation of the IKKβ subunit of the IKK complex (IKKα/ΙΚΚβ/ΝΕΜΟ), which is then activated, leading to the degradation of the ΙκΒ inhibitors. Alternatively, MEKK1 is recruited to the TRAF2/receptor complex, leading to the activation of both the IKK complex and the JNK protein and AP 1 transcription factor.

32 ~ 20 ~ Ο TNFR2 φέρει επίσης μία αλληλουχία στην οποία μπορούν να προσδεθούν οι πρωτεΐνες TRAF1 και TRAF2, σε συνδυασμό με τις πρωτεΐνες c IAP1 και c IAP2 (Ye et al, 1999). Το σύμπλοκο των πρωτεϊνών αυτών, όπως αναφέρθηκε, μπορεί να συνδεθεί και με τον υποδοχέα TNFR1, εμποδίζοντας την αποπτωτική δράση που προκαλείται από την ενεργοποίηση των κασπασών (Wang et al, 1998). Στην υπεροικογένεια των υποδοχέων TNFR ανήκουν και πολλοί άλλοι, όπως είναι ο CD40, ο LT βr (που ενεργοποιούν το εναλλακτικό μονοπάτι του NF κβ), καθώς και ο TRANCE-R/RANK που εκφράζεται στα κύτταρα των οστεοκλαστών. Ο τρόπος με τον οποίο γίνεται η σηματοδότηση μέσω των υποδοχέων αυτών παρουσιάζεται αργότερα Οικογένεια υποδοχέων IL 1R/TLR Ο NF κβ ενεργοποιείται και από υποδοχείς που ανήκουν στην οικογένεια IL 1R/TLR. Το κοινό χαρακτηριστικό των υποδοχέων IL 1R και TLR είναι μία ενδοκυτταρική περιοχή, η οποία ονομάζεται TIR domain (Toll/IL 1R). Η περιοχή TIR ευθύνεται για τη σύνδεση του υποδοχέα ενδοκυτταρικά με την πρωτεΐνη MyD88 (η οποία επίσης περιέχει μία TIR domain), προκειμένου να συνεχιστεί η σηματοδότηση εντός του κυττάρου. Οι υποδοχείς IL 1R είναι υποδοχείς που συνδέονται εξωκυτταρικά με τα μόρια IL 1 και IL 18 που παράγονται από άλλα κύτταρα. Από την άλλη, οι TLRs αναγνωρίζουν παθογόνα ή τμήματά τους, όπως είναι οι βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες (LPS), λιποπρωτεΐνες, πεπτιδογλυκάνες κλπ. (Barton and Medzhitov, 2002). Οι προσδέτες αυτοί περιλαμβάνουν μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με παθογόνα (Pathogen-Associated Molecular Patterns PAMPs). Οι TLRs εντοπίζονται σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως είναι τα Β λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα. Αφού γίνει η σύνδεση του προσδέτη με τον υποδοχέα, στρατολογείται η πρωτεΐνη MyD88 στην κυτταροπλασματική ουρά του υποδοχέα, μέσω αλληλεπίδρασης των περιοχών TIR που έχουν και οι δύο (Wesche et al, 1997) (εικόνα 10). Μετά την αλληλεπίδραση αυτή, συνδέονται στο σύμπλοκο

33 ~ 21 ~ οι κινάσες σερίνης/θρεονίνης IRAKs (Cao et al, 1996b). Οι κινάσες αυτές αποδεσμεύονται από το σύμπλοκο και συνδέονται στην πρωτεΐνη TRAF6. Η πρωτεΐνη αυτή έχει βρεθεί πως είναι απαραίτητη για τη σηματοδότηση που γίνεται μέσω των υποδοχέων αυτών, καθώς μία επικρατής αρνητική μορφή της πρωτεΐνης TRAF6 παρεμποδίζει την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ μετά από σηματοδότηση από TLR2 (Kirschning et al, 1998). Τελικό αποτέλεσμα της δράσης της TRAF6 είναι η ενεργοποίηση όχι μόνο του NF κβ, αλλά και της JNK, μετά από σηματοδότηση από IL 1 (Lomaga et al, 1999). Εικόνα 10. Σηματοδότηση μέσω των υποδοχέων IL 1R/TLR. Η πρωτεΐνη MyD88, συνδεόμενη στον υποδοχέα, στρατολογεί και ενεργοποιεί τις κινάσες IRAK, οι οποίες στη συνέχεια αποδεσμεύονται και ενεργοποιούν την TRAF6. Figure 10. Signaling through the IL 1R/TLR receptors. When MyD88 interacts with the receptor, the IRAK kinases are recruited, activated, and then dissociate from the complex to activate TRAF6.

34 ~ 22 ~ 1.7 ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΙΚΚ Οι πρωτεΐνες της οικογένειας ΙΚΚ σχηματίζουν ένα σύμπλοκο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την ενεργοποίηση του NF κβ μέσω φωσφορυλίωσης των καταστολέων ΙκΒ. Το σύμπλοκο αυτό αποτελείται από δύο υπομονάδες με λειτουργία κινάσης, τις ΙΚΚα και ΙΚΚβ, καθώς και από μία ρυθμιστική υπομονάδα, την ΙΚΚγ/ΝΕΜΟ (Scheidereit, 2006; Hacker and Karin, 2006). Η υπομονάδα ΙΚΚβ είναι απαραίτητη κατά τη σηματοδότηση από τους περισσότερους υποδοχείς, όπως οι TNFR, που, όπως αναφέρθηκε, ενεργοποιούν το κλασικό μονοπάτι του NF κβ. Στην περίπτωση αυτή, η ΙΚΚβ είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των καταστολέων ΙκΒα και ΙκΒβ (Hayden and Ghosh, 2008). Από την άλλη, η υπομονάδα ΙΚΚα είναι απαραίτητη για το εναλλακτικό μονοπάτι ενεργοποίησης, κατά το οποίο φωσφορυλιώνεται η πρωτεΐνη p100, με αποτέλεσμα να επάγεται η τροποποίησή της στην ώριμη p52 (Hayden and Ghosh, 2008). Στην περίπτωση του εναλλακτικού μονοπατιού, η ΙΚΚα δεν ενεργοποιείται όντας τμήμα του ετεροτριμερούς ΙΚΚ συμπλόκου, αλλά ως ομοδιμερές. Τέλος, η ΙΚΚγ/ΝΕΜΟ απαιτείται από το κλασικό μονοπάτι του NF κβ, αλλά όχι από το εναλλακτικό (Ghosh and Hayden, 2008). Οι κινάσες του συμπλόκου ΙΚΚ ενεργοποιούνται με φωσφορυλίωση από διάφορες κινάσες, όπως είναι η ΝΙΚ (NF κβ Inducing Kinase), η ΜΕΚΚ1 (Mitogen activated protein kinase/erk kinase 1), μία MAP3K, αλλά και η ΤΑΚ1, μία άλλη MAP3K, ανάλογα με την προέλευση του σήματος. Η ΝΙΚ είναι η κινάση που φωσφορυλιώνει τα ομοδιμερή ΙΚΚα, προκαλώντας την ενεργοποίηση του εναλλακτικού μονοπατιού του NF κβ. 1.8 ΓΟΝΙΔΙΑ ΣΤΟΧΟΙ ΤΟΥ NF κβ Μεταξύ των στόχων των διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων NF κβ περιλαμβάνονται γονίδια που αφορούν την ενδοκυτταρική και διακυτταρική σηματοδότηση, την κυτταρική απόκριση σε καταστάσεις στρες, καθώς και την ανάπτυξη, επιβίωση και απόπτωση του κυττάρου (Pahl, 1999; Gerondakis et al, 1999). Πιο συγκεκριμένα, επάγεται η μεταγραφή γονιδίων

35 ~ 23 ~ που κωδικοποιούν 27 κυτοκίνες και χημοκίνες (π.χ. IL 1α, IL 1β, IL 8, TNFα, TNFβ), μόρια κυτταρικής προσκόλλησης, ρυθμιστές της απόπτωσης, αναπτυξιακούς παράγοντες κλπ. (Pahl, 1999). Η επαγωγή γονιδίων που κωδικοποιούν ουσίες όπως TNFα και IL 1 υποδηλώνει την ύπαρξη ενός μηχανισμού θετικής ρύθμισης του μονοπατιού του NF κβ (εικόνα 11). Χάρη στο μηχανισμό αυτό, η απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος προσαρμόζεται για την άμεση αντιμετώπιση του εξωγενούς κινδύνου. Εικόνα 11. Ο NF κβ επάγει τη μεταγραφή γονιδίων, τα προϊόντα των οποίων έχουν ως αποτέλεσμα την περαιτέρω ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα. Διαπιστώνεται έτσι ένας μηχανισμός θετικής ρύθμισης της δράσης του NF κβ. Figure 11. NF κβ induces the transcription of genes, the products of which may augment its activation thus establishing a mechanism of positive autoregulation of NF κβ. Όπως αναφέρθηκε, μεταξύ των γονιδίων που φέρουν θέσεις σύνδεσης κβ βρίσκονται και αυτά που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες ΙκΒα, ΙκΒβ και p105 (Senftleben et al, 2002). Με τον τρόπο αυτό, παρέχεται ένας μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης του μεταγραφικού παράγοντα NF κβ, καταστέλλοντας τη δράση του μετά την κάλυψη των αναγκών του κυττάρου (εικόνα 12).

36 ~ 24 ~ Εικόνα 12. Ανάμεσα στα προϊόντα που παράγονται από την επαγωγή των γονιδίων εξαιτίας του NF κβ, υπάρχουν και ορισμένα των οποίων η λειτουργία αφορά την καταστολή του μεταγραφικού παράγοντα, όπως είναι οι πρωτεΐνες της οικογένειας ΙκΒ. Με τον τρόπο αυτό, το κύτταρο μπορεί να ελέγχει τη δράση του NF κβ, εμποδίζοντας την ανεξέλεγκτη δράση του. Figure 12. Some genes which are activated by NF κβ encode proteins necessary for the inhibition of the transcription factor, such as proteins of the ΙκΒ family. In this way, the cell is able to regulate NF κβ, preventing its out-ofcontrol activation. Καθώς υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που φέρουν θέσεις σύνδεσης κβ, δε θα ήταν λογικό να μεταβάλλεται η έκφραση του συνόλου των γονιδίων αυτών κάθε φορά που ο NF κβ εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου. Αυτό εξασφαλίζεται με την ύπαρξη ενός διπλού μηχανισμού, που επιτρέπει την επιλεκτική ενεργοποίηση γονιδίων ανάλογα με τις επικρατούσες συνθήκες και τις ανάγκες του κυττάρου (Pahl, 1999). Ο μηχανισμός αυτός αποτελείται από τα εξής στοιχεία: Ο προαγωγέας και ο ενισχυτής ενός γονιδίου έχουν συνήθως πάνω από ένα σημεία πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Επομένως, προκειμένου να επαχθεί η μεταγραφή ενός δεδομένου γονιδίου, χρειάζονται περισσότεροι από ένας μεταγραφικοί παράγοντες. Ο NF

37 ~ 25 ~ κβ μπορεί να είναι απαραίτητος αλλά όχι επαρκής για την πλήρη ενεργοποίηση ενός γονίδιου. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι διάφορες πρωτεΐνες της οικογένειας Rel δείχνουν μία προτίμηση ως προς την αλληλουχία των θέσεων σύνδεσης κβ στις οποίες προσδένονται. Επομένως, η διαθεσιμότητα των διαφόρων μελών της οικογένειας Rel, καθώς και ο σχηματισμός των ομοδιμερών και ετεροδιμερών, είναι παράγοντες που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο ποια γονίδια θα επαχθούν μεταγραφικά. Διαφορετικά εξωκυτταρικά σήματα και διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια καθορίζουν τα παραπάνω. 1.9 ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ TRAF Οι διαμεμβρανικοί κυτταρικοί υποδοχείς που δεν εμφανίζουν κάποια εγγενή ενζυμική δράση, προκειμένου να μεταγάγουν το εξωκυτταρικό σήμα στο εσωτερικό του κυττάρου, στρατολογούν άλλες πρωτεΐνες που προσδένονται σε αυτούς. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν και οι υποδοχείς της υπεροικογένειας TNFR, καθώς δεν περιέχουν κάποια αλληλουχία που να τους προσδίδει δράση κινάσης. Με βάση το σκεπτικό αυτό, και χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους, όπως είναι το σύστημα δύο υβριδίων της ζύμης, ανακαλύφθηκαν οι πρωτεΐνες της οικογένειας TRAF [Tumor necrosis factor (TNF) Receptor Associated Factors] (Inoue et al, 2000). Οι πρωτεΐνες αυτές βρέθηκε ότι συνδέονται με την κυτταροπλασματική ουρά των υποδοχέων TNFR, βοηθώντας στη μεταγωγή του σήματος προς το σύμπλοκο των ΙΚΚ κινασών. Τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών TRAF έχουν μία συντηρημένη αλληλουχία αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο τους, που ονομάζεται επικράτεια TRAF (Rothe et al, 1994) (εικόνα 13). Η επικράτεια TRAF αποτελείται από δύο υποπεριοχές, την καρβοξυτελική περιοχή TRAF C, η οποία είναι συντηρημένη σε υψηλο ποσοστό μέσα στην οικογένεια TRAF, και τη λιγότερο συντηρημένη αμινοτελική περιοχή TRAF N ή περιοχή εσπειραμένης έλικας (coiled coil domain) (Cheng et al, 1995). Κρυσταλλογραφικές μελέτες έδειξαν ότι η επικράτεια TRAF της πρωτεΐνης

38 ~ 26 ~ TRAF2 δημιουργεί ένα τριμερές σε μορφή μανιταριού, όπου οι εσπειραμένες έλικες αποτελούν το μίσχο και οι TRAF C περιοχές σχηματίζουν το «καπέλο» του (Park et al, 1999; McWhirter et al, 1999). Εικόνα 13. Η γενική δομή των πρωτεϊνών της οικογένειας TRAF. Στο καρβοξυτελικό άκρο εντοπίζεται η περιοχή TRAF domain, που είναι χαρακτηριστική και συντηρημένη στις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Η περιοχή αυτή διακρίνεται περαιτέρω στην υποπεριοχή TRAF C και στην υποπεριοχή εσπειραμένης έλικας. Figure 13. The basic structural organization of the TRAF family of proteins. The TRAF domain is located in the carboxyl terminal region and is conserved in all of them. This domain is further divided in two subdomains: the TRAF C subdomain and the coiled-coil subdomain. Όλα τα μέλη της οικογένειας TRAF εκτός από την TRAF1 έχουν δύο επιπλέον κοινά χαρακτηριστικά στην αμινοτελική περιοχή τους (εικόνα 14). Το πρώτο είναι ότι φέρουν μία επικράτεια RING στο αμινοτελικό τους άκρο. Το δεύτερο κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι φέρουν δακτύλους ψευδαργύρου (zinc fingers) μεταξύ της επικράτειας RING και της περιοχής εσπειραμένης έλικας. Οι TRAF2, 3, 5 και 6 φέρουν πέντε επαναλήψεις δακτύλων ψευδαργύρου, ενώ η TRAF4 φέρει επτά επαναλήψεις. Αξίζει να σημειωθεί ότι η TRAF4 έχει επιπλέον δύο σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) και εντοπίζεται στον πυρήνα (Regnier et al, 1995), σε αντίθεση με τις υπόλοιπες TRAF που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα. Η TRAF4 αποτελεί επίσης τη μόνη πρωτεΐνη της οικογένειας που δε φαίνεται να συνδέεται με κάποιον κυτταρικό υποδοχέα.

39 ~ 27 ~ Εικόνα 14. Η δομή των μελών της οικογένειας TRAF. Όλες οι πρωτεΐνες TRAF, με εξαίρεση την TRAF1, εμφανίζουν στο αμινοτελικό άκρο τους μία περιοχή που φέρει μία επικράτεια RING και επαναλήψεις δακτύλων ψευδαργύρου. Τα χαρακτηριστικά αυτά είναι υπεύθυνα για τη δράση των πρωτεϊνών TRAF2 και 6 ως Ε3 λιγάσες ουβικουιτίνης. Figure 14. The structure of the members of the TRAF family. All TRAF proteins, except TRAF1, contain a RING domain domain and a variable number of zinc fingers in their amino terminal region. These domains are responsible for the function of TRAF2 and TRAF6 as E3 ubiquitin ligases Πρωτεΐνη TRAF1 Η πρωτεΐνη TRAF1 βρέθηκε μέσω ανοσοκατακρήμνισής της με τον υποδοχέα TNFR2 του ανθρώπου (Rothe et al, 1994). Όπως έχει αναφερθεί, η TRAF1 είναι η μόνη πρωτεΐνη της οικογένειας που δε φέρει αμινοτελική επικράτεια RING και επαναλήψεις δακτύλων ψευδαργύρου. Η TRAF1 αλληλεπιδρά έμμεσα με τον υποδοχέα TNFR2 και άμεσα με άλλα μέλη της υπεροικογένειας TNFR, όπως είναι ο RANK (Receptor Activator of NF κβ) (Wong et al, 1998; Galibert et al, 1998), ο CD40 (Pullen et al, 1999) και η πρωτεΐνη LMP 1 του ιού Epstein Barr (Kaye et al, 1996). Απουσία σήματος, η υπερέκφραση της TRAF1 δε φαίνεται να προκαλεί ενεργοποίηση του NF κβ ή της JNK (Schwenzer et al, 1999; Leo