ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ "Μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων των χρωμοσωματικών φυλών του υπόγειου σκαπτοποντικού Microtus thomasi με κυτταρογενετικές και μοριακές μεθόδους" ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μιχαήλ Ροβάτσος Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Οκτώβριος 2012

2

3 Μέλη Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής: Γιαγιά-Αθανασοπούλου Ευαγγελία (Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Στεφάνου Γεωργία (Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Δημόπουλος Νικόλαος (Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Σκούρας Ζαχαρίας (Καθηγητής Α.Π.Θ) Κίλιας Γεώργιος (Αναπλ. Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Κίλια-Κλώσσα Έλενα (Επίκ. Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Τριανταφυλλίδης Αλέξανδρος (Επίκ. Καθηγητής Α.Π.Θ.) Μέλη Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής: Γιαγιά-Αθανασοπούλου Ευαγγελία (Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Στεφάνου Γεωργία (Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Κίλιας Γεώργιος (Αναπλ. Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Επιβλέπων Καθηγητής: Γιαγιά-Αθανασοπούλου Ευαγγελία (Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο 202.

4

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ζωολογίας του Τομέα Βιολογίας Ζώων του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Πρώτα από όλους, χρωστάω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Καθηγήτρια κ. Ευαγγελία Γιαγιά-Αθανασοπούλου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με την ανάθεση της διδακτορικής διατριβής. Κατά τη διάρκεια της πολυετής εκπόνησης της διατριβής, υπήρξε πάντα δίπλα μου σαν φίλη και σαν συνεργάτης. Χωρίς την ηθική της συμπαράσταση και την επιστημονική της καθοδήγηση, όσα πετύχαμε μαζί όλα αυτά τα χρόνια δεν θα είχαν πραγματοποιηθεί. Στα πλαίσια της διατριβής, είχα τη χαρά και την τύχη να συνεργαστώ με τον Λέκτορα κ. Κώστα Σταματόπουλου και τον Καθηγητή κ. Antonio Sanchez Baca (Πανεπιστήμιο της Jaen, Ισπανία), στους οποίους οφείλω τα μέγιστα όχι μόνο για την υποστήριξη που προσέφεραν στην παροχή εργαστηριακών υποδομών, αλλά κυρίως για τις πολύτιμες συμβουλές και τη διαμόρφωση της αντίληψης που έχω για την έρευνα και τη Βιολογία. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Gligor Paspali και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Selfo Oruci (Πανεπιστήμιο Eqrem Cabej, Αλβανία) για τη φιλοξενία και την πολύτιμη υποστήριξη στις δειγματοληψίες σκαπτοποντικών στην Αλβανία και το Μαυροβούνιο. Ευχαριστώ πολύ τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής: την Καθηγήτρια κ. Γεωργία Στεφάνου, τον Καθηγητή κ. Νικόλαο Δημόπουλο, τον Καθηγητή κ. Ζαχαρία Σκούρα (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης), τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Κίλια, την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Έλενα Κίλια-Κλώσσα και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Αλέξανδρο Τριανταφυλλίδη (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) για την άψογη συνεργασία μας και τη γρήγορη διαδικασία της αξιολόγησης της διδακτορικής διατριβής. Θέλω να ευχαριστήσω όλους τους φίλους και συνεργάτες που αφιέρωσαν χρόνο και κόπο για να μου μάθουν όλες τις τεχνικές που χρησιμοποίησα στη διδακτορική διατριβή! Αρχικά, τον Δρ. Γεώργιο Μήτσαινα, για την εκμάθηση των κλασικών κυτταρογενετικών τεχνικών, τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Alberto Marchal Ortega και τον Dr. Manu Acosta Lopez (Πανεπιστήμιο της Jaen, Ισπανία) για την εκμάθηση των μοριακών κυτταρογενετικών τεχνικών, τον κ. Στέφανο Μαρτιμιανάκη

6 και τον Δρ. Γιώργο Τρυφωνόπουλο για την εκμάθηση των μεθόδων της μοριακής φυλογένεσης και την κ. Ειρήνη Νικολοπούλου για τη βοήθειά της στις στατιστικές αναλύσεις. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω την κ. Μαρία Καμηλάρη, για τη βοήθεια και τις ατέλειωτες συζητήσεις για όλα τα θέματα, από τις αδυναμίες των τεχνικών μέχρι τα μελλοντικά σχέδια μετά τη διατριβή. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω τους συνεργάτες μου, που κατά τη διάρκεια της εκπόνησης των διπλωματικών τους εργασιών, με βοήθησαν στις δειγματοληψίες και στη διαχείριση των σκαπτοποντικών στο εργαστήριο: την Δρ. Ειρήνη Καραμαρίτη, την κ. Λήδα Αγγέλου, την κ. Ελένη Αρακλιώτη, την κ. Μαρίνα Δημογέροντα και την κ. Άλκηστις Μανουσοπούλου. Ιδιαίτερη αναφορά πρέπει να γίνει στους χρηματοδότες της διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ το Πανεπιστήμιο Πατρών που χρηματοδότησε μεγάλο μέρος του πειραματικού μέρους της διατριβής μέσα από το πρόγραμμα βασικής έρευνας "Καραθεοδωρή 2008", καθώς και την Γ.Γ.Ε.Τ για τη χρηματοδότηση μέσα από το πρόγραμμα "Συνεργασία Έρευνας και Τεχνολογίας μεταξύ Ελλάδας και Αλβανίας ". Ολοκληρώνοντας τον πρόλογο, θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς μου, που με υποστήριξαν με κάθε δυνατό τρόπο όλα αυτά τα χρόνια και κυρίως τη Θεώνη Χριστοπούλου, που βρίσκεται πάντα δίπλα μου από τα φοιτητικά μας χρόνια και με στηρίζει σε ευχάριστες και δυσάρεστες στιγμές. Με σεβασμό και εκτίμηση, Μιχάλης Ροβάτσος

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 1 Β. ABSTRACT... 5 Γ. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 9 Γ.1. Βασικές έννοιες της ταξινόμησης και της συστηματικής... 9 Γ.1.1. Ταξινόμηση και Συστηματική... 9 Γ.1.2. Η έννοια του είδους Γ.2. Ειδογένεση και εξέλιξη των οργανισμών Γ.2.1. Η ειδογένεση και οι απομονωτικοί μηχανισμοί Γ.2.2. Ο χρωμοσωματικός πολυμορφισμός και η σημασία του στην ειδογένεση Γ.2.3. Η έννοια της χρωμοσωματικής φυλής (chromosome race) Γ.3. Ιστορικά στοιχεία για το γένος Microtus Γ.3.1. Η εξελικτική ιστορία του γένους Microtus Γ.3.2. Η ονοματολογία των αντιπροσώπων του γένους Microtus Γ.4. Το είδος Microtus thomasi Γ.4.1. Η ονοματολογία του είδους Microtus thomasi Γ.4.2. Η γεωγραφική κατανομή Γ.4.3. Στοιχεία μορφολογίας και οικολογίας Γ.4.4. Οι χρωμοσωματικές φυλές Γ.5. Χρωμοσωματικές μεταλλάξεις και γονιμότητα Γ.5.1. Η σπερματογένεση Γ.5.2. Οι επιπτώσεις των χρωμοσωματικών μεταλλάξεων στη γονιμότητα των τρωκτικών Γ.6. Μοριακοί δείκτες και φυλογένεση Γ.6.1. Το μιτοχονδριακό DNA Γ.6.2. Τα πυρηνικά γονίδια Γ.6.3. Οι πολυεπαναλαμβανόμενες αλληλουχίες Γ.7. Στοιχεία παλαιογεωγραφίας, παλαιοκλιματολογίας και βιογεωγραφίας Γ.7.1. Η παλαιογεωγραφία και η παλαιοκλιματολογία του Ελληνικού χώρου κατά το Τεταρτογενές Γ.7.2. Στοιχεία μετανάστευσης και βιογεωγραφίας των ευρωπαϊκών ειδών μετά την τελευταία παγετώδη περίοδο Γ.8. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής... 52

8 Δ. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Δ.1. Δειγματοληψία - Συλλογή υλικού Δ.2. Μεθοδολογία για τη χρωμοσωματική ανάλυση Δ.2.1. Χρωμοσωματικά παρασκευάσματα από κύτταρα του μυελού των οστών Δ.2.2. Χρωμοσωματικά παρασκευάσματα από σπερματοκύτταρα Δ.2.3. Τεχνική χρώσης G-banding Δ.2.4. Τεχνική χρώσης C-banding Δ.2.5. Έγκλιση Δ.3. Μεθοδολογία για in situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH) Δ.3.1. Παρασκευή και σήμανση ανιχνευτή Δ Παρασκευή ανιχνευτή για τις τελομερικές αλληλουχίες Δ Παρασκευή ανιχνευτή για τη δορυφορική αλληλουχία Mth-Alu Δ Παρασκευή ανιχνευτή για τη δορυφορική αλληλουχία Msat Δ.3.2. Επεξεργασία ανιχνευτή Δ.3.3. Προετοιμασία χρωμοσωματικών παρασκευασμάτων Δ.3.4. Επεξεργασία χρωμοσωματικών παρασκευασμάτων (1η μέρα) Δ.3.5. In situ υβριδοποίηση Δ.3.6. Επεξεργασία χρωμοσωματικών παρασκευασμάτων (2η μέρα) και ανίχνευση σήματος Δ.4. Μεθοδολογία για τη φυλογενετική ανάλυση με δείκτες μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους Δ.4.1. Απομόνωση ολικού γενωμικού DNA Δ Πρωτόκολλο απομόνωσης ολικού DNA (σύστημα αντιδράσεων Macherey-Nagel) Δ Πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης ολικού DNA Δ.4.2. Πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) Δ.4.3. Ηλεκτροφόρηση και καθαρισμός των προϊόντων της PCR Δ Πρωτόκολλο καθαρισμού των προϊόντων της PCR (σύστημα αντιδράσεων Macherey-Nagel) Δ.4.4. Αλληλούχιση και έλεγχος των χρωματογραφημάτων Δ.4.5. Στοίχιση και επεξεργασία των αλληλουχιών Δ.4.6. Έλεγχος δεδομένων για ομοπλασία και κορεσμό Δ.4.7. Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων... 78

9 Δ.4.8. Επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης Δ.4.9. Μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης Δ Μέθοδος Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining) Δ Μέθοδος της μέγιστης φειδωλότητας (Maximum Parsimony) Δ Μπεϊεσιανή συμπερασματολογία (Bayesian Inference) Δ Μέγιστη Πιθανοφάνεια (Maximum Likelihood) Δ Μεθοδολογία φυλογενετικών δικτύων Δ.5. Μεθοδολογία για τον έλεγχο της αναπαραγωγικής συμβατότητας των χρωμοσωματικών φυλών μέσω πειραματικών διασταυρώσεων Δ.6. Μεθοδολογία ιστολογικών παρασκευασμάτων Δ.6.1. Μονιμοποίηση των όρχεων Δ.6.2. Έγκλιση των όρχεων σε παραφίνη Δ.6.3. Τομή των όρχεων στο μικροτόμο Δ.6.4. Προσαρμογή των τομών στις αντικειμενοφόρους πλάκες Δ.6.5. Χρώση με Αιματοξυλίνη-Εοσίνη Δ.6.7. Έγκλιση Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ε.1. Χρωμοσωματική μελέτη Ε.1.1. Χρωμοσωματική μελέτη με τις μεθόδους της G- και της C- ζώνωσης Ε.1.2. Ανάλυση της τοπολογίας της αλληλουχίας των τελομερών Ε.1.3. Ανάλυση της τοπολογίας της δορυφορικής αλληλουχίας Mth-Alu Ε.1.4. Ανάλυση της τοπολογίας της δορυφορικής αλληλουχίας Msat Ε.2. Φυλογενετική ανάλυση με δείκτες μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους Ε.2.1. Ανάλυση του γενετικού τόπου cytb Ε Εκτίμηση των γενετικών αποστάσεων Ε Οι φυλογενετικές σχέσεις με βάση τις μεθόδους κατασκευής δένδρων Ε Οι φυλογενετικές σχέσεις με βάση τις μεθόδους κατασκευής δικτύων Ε.2.2. Ανάλυση του γενετικού τόπου D-loop Ε Εκτίμηση των γενετικών αποστάσεων Ε Οι φυλογενετικές σχέσεις με βάση τις μεθόδους κατασκευής δένδρων

10 Ε Οι φυλογενετικές σχέσεις με βάση τις μεθόδους κατασκευής δικτύων Ε.2.3. Συνδυασμένη ανάλυση των γενετικών τόπων cytb και D-loop Ε Εκτίμηση των γενετικών αποστάσεων Ε Οι φυλογενετικές σχέσεις με βάση τις μεθόδους κατασκευής δένδρων Ε Οι φυλογενετικές σχέσεις με βάση τις μεθόδους κατασκευής δικτύων Ε.2.4. Ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων με βάση τις μεθόδους κατασκευής δένδρων Ε.2.5. Ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων με βάση τις μεθόδους κατασκευής δικτύων Ε.3. Διασταυρώσεις στο εργαστήριο ανάμεσα στις χρωμοσωματικές φυλές Ε.3.1. Διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα τις χρωμοσωματικής φυλής thomasi με την ελάχιστη (TH1) και τη μέγιστη (TH2) ετεροχρωματίνη στα φυλετικά χρωμοσώματα Ε.3.2. Διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα των χρωμοσωματικών φυλών thomasi και peloponnesiacus Ε.3.3. Διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα της χρωμοσωματικής φυλής atticus, με άτομα των φυλών thomasi και peloponnesiacus Ε.3.4. Διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα των χρωμοσωματικών φυλών thomasi και subalpine Ε.3.5. Διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα των χρωμοσωματικών φυλών thomasi και Kali Ε.3.6. Διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα των χρωμοσωματικών φυλών thomasi και Edessa ΣΤ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΤ.1. Επικαιροποίηση της ταξινόμησης και της ονοματολογίας των σκαπτοποντικών που ανήκαν ως σήμερα στο είδος M. thomasi ΣΤ.1.1. Διάκριση των αδελφών ειδών M. thomasi και M. atticus με μεθόδους μοριακής φυλογένεσης ΣΤ.1.2. Διάκριση των αδελφών ειδών M. thomasi και M. atticus με μεθόδους συγκριτικής μοριακής κυτταρογενετικής ανάλυσης ΣΤ.1.3. Διάκριση των αδελφών ειδών M. thomasi και M. atticus με την μέθοδο των πειραματικών διασταυρώσεων σε εργαστηριακές συνθήκες ΣΤ.2. Η χρωμοσωματική ποικιλότητα των ειδών M. thomasi και M. atticus ΣΤ.3. Η εξελικτική πορεία των ειδών M. thomasi και M. atticus

11 Ζ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Η. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Η.1. Διαλύματα

12

13 Α. Περίληψη Α. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν οι φυλογενετικές σχέσεις των χρωμοσωματικών φυλών του είδους M. thomasi με κυτταρογενετικές και μοριακές προσεγγίσεις. Συλλέχθηκαν συνολικά 408 άτομα από 65 τοποθεσίες της Ελλάδας, της Αλβανίας και του Μαυροβουνίου, που μελετήθηκαν με κλασικές κυτταρογενετικές μεθόδους (πρότυπο G & C ζώνωσης), συγκριτική μοριακή κυτταρογενετική ανάλυση με δείκτες τελομερικές και δορυφορικές αλληλουχίες, μοριακή φυλογένεση με δείκτες μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους (cytb, D-loop) και εργαστηριακές διασταυρώσεις ανάμεσα σε άτομα από διαφορετικές χρωμοσωματικές φυλές. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι οι σκαπτοποντικοί από την Αττική και την Εύβοια παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τους υπόλοιπους πληθυσμούς, σε όλες τις προσεγγίσεις που χρησιμοποιήθηκαν και προτείνεται να θεωρηθούν ως διακριτό είδος με το όνομα Microtus atticus, όπως είχε αρχικά περιγραφεί από τον Miller το Τα δύο αδελφά είδη M. thomasi και M. atticus έχουν παρόμοιο πρότυπο C και G ζώνωσης στα αυτοσωματικά χρωμοσώματα, αλλά διαφέρουν ως προς την σύσταση της ετεροχρωματίνης των Χ χρωμοσωμάτων (στο Μ. atticus αποτελείται κυρίως από τη δορυφορική αλληλουχία Mth-Alu900, ενώ στο M. thomasi από τελομερικές αλληλουχίες), παρουσιάζουν αναπαραγωγική απομόνωση (σε εργαστηριακές συνθήκες δίνουν στείρα F 1 υβρίδια) και παρουσιάζουν γενετικές αποστάσεις, παραπλήσιες με άλλα στενά συγγενικά είδη Microtus ως προς τους μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους (cytb: 2,7% και D-loop: 2,6%). Τα δύο παραπάνω είδη παρουσιάζουν εκτεταμένους χρωμοσωματικούς πολυμορφισμούς που ομαδοποιούνται σε εννέα χρωμοσωματικές φυλές στο είδος M. thomasi: thomasi (2n=44, FN=44), peloponnesiacus" (2n=44, FN=46), Tichio (2n=42, FN=44), Rb-subalpine (2n=40, FN=42), subalpine (2n=42, FN=42), Preveza (2n=40, FN=42), Kali (2n=40, FN=42), Aridea (2n=38, FN=42), Edessa (2n=38, FN=40) και δύο φυλές στο είδος M. atticus: "atticus" (2n=44, FN=46), "Evia" (2n=44, FN=44). 1

14 Α. Περίληψη Με βάση τα αποτελέσματα των εργαστηριακών διασταυρώσεων, τη φυλογενετική και την κυτταρογενετική μελέτη, πραγματοποιήθηκε μία εκτεταμένη αναθεώρηση της προέλευσης των ήδη γνωστών χρωμοσωματικών φυλών, ενώ βρέθηκαν και περιγράφηκαν νέες χρωμοσωματικές φυλές. Οι πληθυσμοί σκαπτοποντικών από την Αττική και την Πελοπόννησο, που σύμφωνα με παλαιότερες εργασίες, είχαν περιγραφεί ως "atticus" και άνηκαν στο είδος M. thomasi, στην παρούσα διδακτορική διατριβή διαχωρίζονται σε δύο χρωμοσωματικές φυλές, που κατατάσσονται στα δύο διαφορετικά είδη. Οι πληθυσμοί από την Αττική ανήκουν στη φυλή "atticus" και κατατάσσονται στο είδος M. atticus, ενώ οι πληθυσμοί σκαπτοποντικών από την Πελοπόννησο θεωρούνται ως μία διακριτή φυλή, την "peloponnesiacus" και κατατάσσονται στο είδος M. thomasi. Οι χρωμοσωματικές φυλές του είδους M. thomasi: Tichio, Preveza, Kali και "Edessa" που είχαν αναφερθεί ως πολυμορφισμοί σε παλαιότερες εργασίες, περιγράφονται πια ως διακριτές χρωμοσωματικές φυλές. Επίσης, περιγράφονται για πρώτη φορά η χρωμοσωματική φυλή Aridea (2n=38, FN=42) του είδους M. thomasi και η χρωμοσωματική φυλή "Evia" (2n=44, FN=44) του είδους M. atticus. Οι χρωμοσωματικές φυλές "atticus" του είδους M. atticus και "peloponnesiacus", "subalpine", "Kali" και "Edessa" του είδους M. thomasi διασταυρώθηκαν στο εργαστήριο με την θεωρούμενη ως πιο πρωτόγονη φυλή "thomasi" του είδους M. thomasi. Η χρωμοσωματική φυλή "atticus", που ανήκει στο είδος M. atticus, έδωσε στείρους απογόνους με τις φυλές "peloponnesiacus" και "thomasi", που ανήκουν στο είδος M. thomasi. Οι σκαπτοποντικοί της φυλής "subalpine" έδωσαν γόνιμους απογόνους στην F 1 γενεά, στην F 2 γενεά και στις ανάδρομες διασταυρώσεις, όταν διασταυρώνονται με σκαπτοποντικούς της φυλής "thomasi". Αντίθετα, οι σκαπτοποντικοί της φυλής "Kali" έδωσαν στείρους απογόνους στην F 2 γενεά, ενώ οι σκαπτοποντικοί της φυλής "Edessa" έδωσαν στείρους απογόνους στην F 1 γενεά, όταν διασταυρώνονται με σκαπτοποντικούς της φυλής "thomasi", αν και ανήκουν στο ίδιο είδος. Η αναπαραγωγική απομόνωση των φυλών "Kali" και "Edessa", από τη φυλή "thomasi" οφείλεται σε χρωμοσωματικές ασυμβατότητες και αποτελεί ένδειξη ότι η γενετική διαφοροποίηση των χρωμοσωματικών φυλών μπορεί να οδηγήσει υπό προϋποθέσεις σε ειδογένεση. 2

15 Α. Περίληψη Με βάση την παλαιογεωγραφία του ελληνικού χώρου και την συγκριτική ερμηνεία των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από όλες τις προσεγγίσεις, παρουσιάζεται ένα πιθανό σενάριο της εξελικτικής ιστορίας των χρωμοσωματικών φυλών των ειδών M. thomasi και M. atticus. Υποθέτουμε ότι η προγονική μορφή των δύο ειδών βρισκόταν σε παγετώδες καταφύγιο της Νότιας Ελλάδας κατά την τελευταία παγετώδη περίοδο (πριν από χρόνια). Εξαιτίας οικολογικών ή/και παλαιοκλιματολογικών παραγόντων, ο αρχικός πληθυσμός διασπάστηκε σε δύο υποπληθυσμούς, που σταδιακά διαφοροποιήθηκαν σε διακριτά είδη. Με το τέλος της πρόσφατης παγετώδους περιόδου, η σταδιακή βελτίωση των κλιματολογικών συνθηκών, επέτρεψε στο είδος M. thomasi να αποικίσει την Κεντρική και Βόρεια Ελλάδα, την Αλβανία και το Μαυροβούνιο, όπου διαμορφώθηκαν σταδιακά όλες οι γνωστές χρωμοσωματικές φυλές. Αντίθετα, οι αλλαγές στο ηπειρωτικό ανάγλυφο, όπως η άνοδος της στάθμης της θάλασσας και ο αποχωρισμός της Εύβοιας από την Στερεά Ελλάδα, απομόνωσαν το είδος M. atticus στην περιοχή της Αττικής και της Εύβοιας αποτρέποντας την περαιτέρω εξάπλωσή του. 3

16 Α. Περίληψη 4

17 Β. Abstract Β. ABSTRACT During the current PhD project, the phylogenetic relationships of the chromosomal races of the underground vole Microtus thomasi were examined through cytogenetic and molecular approaches. In total, 408 voles were collected from 65 localities of Greece, Albania and Montenegro, in order to clarify their phylogenetic relationships with classical cytogenetic techniques (G and C banding), comparative cytogenetic analysis with telomeric and satellite markers, molecular phylogeny with markers mtdna markers (cytb, D-loop) and hybridization experiments between voles from distinct chromosomal races. Our results indicate that the voles from Attiki and Evia seem to be differentiated from other populations, based in all applied approaches. In this context, we propose that the populations from Attiki and Evia should be considered as a distinct species, validating the species name Microtus atticus, as it has been originally described by Miller at The two sibling species, Microtus thomasi and Microtus atticus have karyotypes with similar G and C banding pattern, but differ in the content of the X chromosome heterochromatin (mainly Mth-Alu900 satellite sequence in M. atticus, telomeric repeats in M. thomasi), appear reproductively isolated (produce sterile F 1 hybrids when crossed in laboratory conditions) and the between species genetic distances were calculated similar to other closely related Microtus species (2,7% for cytb and 2,6% for D-loop). The two species demonstrate an extensive chromosomal polymorphism, resulting in the description of nine chromosomal races in M. thomasi: thomasi (2n=44, FN=44), peloponnesiacus" (2n=44, FN=46), Tichio (2n=42, FN=44), Rbsubalpine (2n=40, FN=42), subalpine (2n=42, FN=42), Preveza (2n=40, FN=42), Kali (2n=40, FN=42), Aridea (2n=38, FN=42), Edessa (2n=38, FN=40) and two chromosomal races in M. atticus: "atticus" (2n=44, FN=46), "Evia" (2n=44, FN=44). Based on the results from the hybridization experiments, the molecular phylogenetic and the cytogenetic analysis, we proceed to the re-evaluation of the known chromosomal races and the description of new chromosomal races. The voles from Attiki and Peloponnesus, which were described to the "atticus" chromosomal 5

18 Β. Abstract race of the species M. thomasi according to previous publications, are distinguished in two races, which are attributed to distinct species. In fact, the voles from Attiki are attributed to "atticus" race and classified in M. atticus, while the voles from Peloponnesus are attributed to a new race, named "peloponnesiacus" and classified to M. thomasi. The race "atticus", consisting of the populations from Attiki and Peloponnesus according to previous studies, was distinguished in two distinct, reproductively isolated races: "atticus" (2n=44, FN=46) (populations from Attiki) attributed to M. atticus, and "peloponnesiacus" (2n=44, FN=46) (populations from Peloponnesus), attributed to M. thomasi. Furthermore, we described four chromosomal races ( Tichio, Preveza, Kali και "Edessa") in the species M. thomasi, which were referred in previous works as chromosomal polymorphisms. In the same context, we described for first time the chromosomal race "Aridea" (2n=38, FN=42) in the species M. thomasi and the chromosomal race "Evia" (2n=44, FN=44) in the species M. atticus. The chromosome races "atticus" of the species M. atticus and "peloponnesiacus", "subalpine", "Kali" and "Edessa" of the species M. thomasi, were crossed in laboratory conditions with the most primitive form "thomasi" of the species M. thomasi. The voles from the chromosomal race "atticus" (M. atticus) produced sterile F 1 hybrids, when crossed with voles from the chromosomal races "thomasi" and "peloponnesiacus" (M. thomasi). The voles from the chromosomal race "subalpine" produced fully fertile hybrids in F 1, F 2 and backcrosses generations, when crossed with the voles from the chromosomal race "thomasi". On the contrary, the voles from the chromosomal races "Kali" and "Edessa" produced sterile hybrids in F 2 and F 1 generations, when crossed with the voles from the chromosomal race "thomasi", despite the fact that all three races belong to the same species. The reproductive isolation of the chromosomal races "Kali" and "Edessa" could be attributed to chromosomal incompatibilities and indicates that the genetic differentiation of the chromosomal races could eventually lead to speciation. Based on the geographical traits of the Southern Balkans and the comparative interpretation of our results, we are able to present a possible scenario of the evolutionary history of the chromosomal races of the species M. thomasi and M. atticus. We assume that the primitive form was distributed in a glacial refugium of 6

19 Β. Abstract Southern Greece, during the last Glacial period ( BP). Due to ecological or/and climatological factors, the ancestral population was separated in two subpopulations, which evolved to distinct species. At the end of the last glacial period, the global warming allowed the voles of M. thomasi to expand northwards to the Balkans, colonizing unoccupied areas of Greece, Albania and Montenegro and establishing all known chromosomal races. On the contrary, the changes of the landscape, due to the rise of the sea level and the separation of Evia Island from the Greek mainland, further isolated the M. atticus populations in Attiki and Evia, prohibiting the northwards colonization. 7

20 Β. Abstract 8

21 Γ. Εισαγωγή Γ. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γ.1. Βασικές έννοιες της ταξινόμησης και της συστηματικής Γ.1.1. Ταξινόμηση και Συστηματική Η πρώτη προσπάθεια ομαδοποίησης των οργανισμών ανάγεται στην κλασική αρχαιότητα, όπου ο Αριστοτέλης με βάση τη μορφολογική ομοιότητά τους διαμόρφωσε το «φυσικό σύστημα κατάταξης». Τον 18 ο αιώνα ο Linnaeus ανέπτυξε το πρώτο ολοκληρωμένο ταξινομικό σύστημα με την καινοτομία της διπλής ονοματολογίας, που δημοσίευσε το 1758 στην δεύτερη έκδοση του έργου του «Systema Naturae» και αποτέλεσε το θεμέλιο λίθο της σύγχρονης ταξινόμησης. Έτσι, ως ταξινόμηση (taxonomy) ορίζεται το σύνολο των θεωριών και των πρακτικών μεθόδων που χρησιμοποιούνται για να διαχωριστούν οι οργανισμοί σε ταξινομικές κατηγορίες. Η ταξινόμηση περιλαμβάνει την κατάταξη και την ονοματολογία. Ως κατάταξη (classification) ονομάζεται η κατηγοριοποίηση των οργανισμών σε ομάδες μέσα σε ένα οργανωμένο ταξινομικό σύστημα, ενώ ως ονοματολογία (nomenclature) ονομάζεται η χρήση συγκεκριμένων χαρακτηριστικών ονομάτων για κάθε ομάδα που διακρίνει η ταξινόμηση (Simpson 1961). Η ταξινομική ιεράρχηση βασίζεται στην εξελικτική θεωρία και έχει συγκεκριμένη δομή. Είδη που μοιάζουν μεταξύ τους κατατάσσονται στο ίδιο γένος, γένη που μοιάζουν ταξινομούνται στην ίδια οικογένεια, οικογένειες που παρουσιάζουν κοινά χαρακτηριστικά αποτελούν την ίδια τάξη. Ομοίως, οι τάξεις που παρουσιάζουν ομοιότητες ανάγονται σε κλάσεις, οι κλάσεις σε φύλα και τα φύλα σε βασίλεια. Η ταξινομική ιεράρχηση έχει τέτοια δομή, ώστε να απεικονίζει την αλυσίδα των σύγχρονων και των προγονικών ειδών. Η εξελικτική αλληλουχία των οργανισμών λέγεται φυλογένεση (phylogeny). Παράλληλα, κάθε είδος, οικογένεια ή άλλη διακριτή ταξινομική ομάδα ονομάζεται taxon. Tα taxa των οποίων τα μέλη είναι απόγονοι ενός κοινού προγόνου λέγονται μονοφυλετικά (monophyletic), ενώ εκείνα που τα μέλη τους έχουν προέλθει από διαφορετικές προγονικές εξελικτικές γραμμές λέγονται πολυφυλετικά (polyphyletic). Η ταξινόμηση είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τη συστηματική (systematic), δηλαδή την επιστημονική μελέτη των 9

22 Γ. Εισαγωγή διαφορετικών μορφών της ποικιλότητας των οργανισμών, καθώς και των μεταξύ τους σχέσεων (Simpson 1961). Η ταξινόμηση βασίστηκε σε διάφορες μεθοδολογικές προσεγγίσεις. Αρχικά, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν την εξελικτική ταξινόμηση (evolutionary taxonomy), όπου έγινε προσπάθεια να απεικονιστούν ιεραρχικά τα taxa (βασίλειο, φύλο, τάξη, οικογένεια, γένος και είδος) με διακλαδιζόμενα φυλογενετικά δένδρα ή δενδρογράμματα προγόνων και απογόνων (phylogenetic tree), ώστε να αντικατοπτρίζουν το πρότυπο της καταγωγής από κοινό πρόγονο και το βαθμό της διαφοροποίησης (απόκλισης). Όμως η μέθοδος αυτή δεν ήταν ικανοποιητική, καθώς τα παραπάνω δύο γνωρίσματα δεν ακολουθούν ούτε τα ίδια πρότυπα, ούτε τους ίδιους ρυθμούς. Έπειτα, χρησιμοποιήθηκε η αριθμητική ή φαινετική ταξινόμηση (numerical or phenetic taxonomy), όπου η ομαδοποίηση των ταξινομικών μονάδων βασίστηκε στη μορφολογική ομοιότητα. Ωστόσο, η παραπάνω μέθοδος δεν λαμβάνει υπόψη το γενετικό υπόβαθρο των οργανισμών, με συνέπεια να προκύπτουν σφάλματα εξαιτίας της εξελικτικής σύγκλισης ή απόκλισης (Γκιώκας & Σφενδουράκης 2003, Αλαχιώτης 1992). Η φυλογενετική ή κλαδιστική ταξινόμηση (phylogenetic or cladistic taxonomy) αποτελεί τον πιο αξιόπιστο τρόπο ανάλυσης και απεικόνισης των φυλογενετικών σχέσεων των οργανισμών. Ο όρος διατυπώθηκε τη δεκαετία του 1950 από το Γερμανό εντομολόγο Willi Hennig και βασίζεται στην κλαδογενετική εξέλιξη, σύμφωνα με την οποία μία εξελικτική γραμμή διασπάται σε δύο ομάδες απογόνων, δηλαδή σε δύο κλάδους (Hennig 1950). Η κλαδιστική ανάλυση διακρίνει τους χαρακτήρες σε προγονικούς (πλησιόμορφους) και παράγωγους (απώμορφους). Μόνον οι απώμορφοι χαρακτήρες που μοιράζονται μεταξύ τους κάποια taxa (συναπωμορφίες) χρησιμεύουν στην κατασκευή κλαδογραμμάτων (cladograms) ή φυλογενετικών δέντρων. Ένα κλαδόγραμμα αποτελεί μία υπόθεση, που αφορά τις φυλογενετικές σχέσεις, άρα είναι αξιόπιστο μόνο, όταν είναι αξιόπιστες οι υποθέσεις, τα δεδομένα και οι αναλυτικές μέθοδοι κατασκευής του. Επίσης, η κλαδιστική μέθοδος προϋποθέτει διακλαδισμένο και όχι «δικτυωτό» πρότυπο εξελικτικής διαφοροποίησης, αν και σε κάποιους οργανισμούς, όπως τα φυτά, ο υβριδισμός είναι κοινό φαινόμενο. Τέλος, το κλαδόγραμμα συνήθως περιλαμβάνει αρτίγονους οργανισμούς και παρουσιάζει γεγονότα ειδογένεσης, αλλά όχι εξαφανίσεις, με συνέπεια να αποτελεί μια υπεραπλουστευμένη απεικόνιση του προτύπου της εξέλιξης 10

23 Γ. Εισαγωγή και να μη επαληθεύεται πάντα από το αρχείο των απολιθωμάτων (Γκιώκας & Σφενδουράκης 2003, Αλαχιώτης 1992). Γ.1.2. Η έννοια του είδους Η δομική μονάδα της ταξινόμησης και της συστηματικής κατάταξης είναι το είδος (ετυμολογικά προκύπτει από το ρήμα είδω = γνωρίζω, διακρίνω). Στο είδος, ως έννοια των βιολογικών επιστημών, έχουν αποδοθεί διαχρονικά αρκετοί ορισμοί, ανάλογα με τα κριτήρια που χρησιμοποιούσαν οι εκάστοτε ερευνητές, για να προσεγγίσουν την ποικιλότητα των οργανισμών. Ο πιο αποδεκτός ορισμός είναι ο βιολογικός ορισμός του είδους (biological species concept) (Mayr 1942), όπου τα είδη είναι ομάδες ενδοδιασταυρούμενων φυσικών πληθυσμών, οι οποίες είναι αναπαραγωγικά απομονωμένες από παρόμοιες ομάδες και καταλαμβάνουν ένα συγκεκριμένο οικολογικό θώκο στη φύση. Ο ορισμός αυτός βασίζεται σε ένα καθαρά βιολογικό κριτήριο, δηλαδή την αναπαραγωγική απομόνωση. Όμως, το κριτήριο αυτό δεν μπορεί να εφαρμοστεί για οργανισμούς που αναπαράγονται μονογονικά ή παρθενογενετικά. Ο ορισμός δεν ισχύει, όταν αναφερόμαστε σε αλλοπατρικούς πληθυσμούς που δε διασταυρώνονται στη φύση επειδή δεν έρχονται σε επαφή, αν και δυνητικά μπορούν (π.χ. όταν βρεθούν στο εργαστήριο). Επίσης, δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε απολιθωμένα είδη. Αργότερα, προτάθηκε η έννοια του εξελικτικού είδους (evolutionary species concept) (Simpson 1961, Meglitsch 1954), που ορίζεται ως μία ομάδα ατόμων που ανήκουν σε μία ανεξάρτητη εξελικτική γραμμή. Όμως, απαιτεί αρκετές υποκειμενικές υποθέσεις για την εκτίμηση του ορίου διαχωρισμού διαδοχικών ειδών της ίδιας εξελικτικής γραμμής. H παραπάνω αδυναμία της έννοιας του εξελικτικού είδους ξεπεράστηκε με την εξής θεώρηση: Όταν οι μορφολογικές διαφορές μεταξύ απολιθωμένων οργανισμών του παρελθόντος είναι εξίσου μεγάλες, όσο και μεταξύ αρτίγονων ειδών, τότε κατατάσσονται σε διαφορετικά είδη. Έτσι, τα είδη που ανήκουν στην ίδια εξελικτική γραμμή, έχουν ζήσει σε διαφορετικές χρονικές περιόδους και δεν υπάρχουν αρκετές ενδείξεις για το χρόνο ειδογένεσης, ονομάζονται χρονοείδη (chronospecies) (Stanley 1978). Συχνά χρησιμοποιείται και η έννοια του φυλογενετικού είδους (phylogenetic species concept) (Cracraft 1989), που ορίζεται ως η μικρότερη διακριτή ομάδα 11

24 Γ. Εισαγωγή οργανισμών ή ατόμων μέσα στην οποία υπάρχει ένα κληρονομούμενο πρότυπο προγόνου-απογόνου. Η έννοια αυτή εφαρμόζεται τόσο σε αμφιγονικά, όσο και σε μονογονικά αναπαραγόμενους οργανισμούς. Επίσης, ισχύει και για τα εξαφανισμένα ή απολιθωμένα είδη και επαληθεύεται με όλες τις μεθόδους διάκρισης των ειδών (μορφολογικές, κυτταρολογικές, βιοχημικές, γενετικές). Όμως, η έννοια του φυλογενετικού είδους μειονεκτεί έναντι του βιολογικού, καθώς αρκετά είδη είναι πολυτυπικά (προέρχονται από πολλές εξελικτικές γραμμές) και δεν εφαρμόζεται σε αδελφά είδη (είδη της ίδιας εξελικτικής γραμμής, χωρίς διακριτά χαρακτηριστικά, αλλά αναπαραγωγικά απομονωμένα). Τέλος, υπάρχει και η έννοια του μορφολογικού είδους που ορίζεται ως μία ομάδα ατόμων που διακρίνεται μορφολογικά από τις άλλες. Τα κριτήρια για την αναγνώριση μορφολογικών ειδών διαφέρουν από ομάδα σε ομάδα. Η έννοια αυτή έχει περιορισμένη εφαρμογή, καθώς παρεμβάλλεται η υποκειμενικότητα του ερευνητή και συχνά γίνονται λάθη εξαιτίας συγκλίνουσας ή αποκλίνουσας εξέλιξης. Επίσης, υπάρχουν αρκετά είδη, συνήθως συμπατρικά, με παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά, αλλά αναπαραγωγικά απομονωμένα, σε βαθμό που είναι δύσκολος ο διαχωρισμός τους και ονομάζονται αδελφά είδη (Γκιώκας & Σφενδουράκης 2003). Τα είδη, που είναι ευρέως εξαπλωμένα, αποτελούνται από πολλούς τοπικούς πληθυσμούς. Όταν οι τοπικοί πληθυσμοί διακρίνονται μεταξύ τους με σαφή χαρακτηριστικά, τότε χαρακτηρίζονται ως υποείδη (στην βιβλιογραφία αναφέρονται ως συνώνυμοι όροι η φυλή και η ποικιλία). Ως υποείδος ορίζεται κάθε γεωγραφικά καθορισμένο άθροισμα τοπικών πληθυσμών, το οποίο διαφέρει σε ταξινομικά χαρακτηριστικά από παρόμοιες υποδιαιρέσεις του είδους. Τα είδη, όταν διακρίνονται σε δύο ή περισσότερα υποείδη ονομάζονται πολυτυπικά, ενώ όταν δεν εμφανίζουν υποείδη ονομάζονται μονοτυπικά. Τα διάφορα υποείδη ενός είδους μπορούν να διασταυρωθούν, όταν βρίσκονται στο εργαστήριο ή σε γειτονικές περιοχές, οπότε στις περιοχές επαφής σχηματίζονται ενδιάμεσοι πληθυσμοί ή ζώνες υβριδισμού, όπου υπάρχουν άτομα (υβρίδια) με χαρακτήρες και γενετική σύσταση ενδιάμεση των πληθυσμών. Επίσης, ένα υποείδος είναι γεωγραφικά οριοθετημένο και αποτελεί μία γεωγραφική φυλή (ο όρος φυλή αρχικά χρησιμοποιήθηκε από τους ανθρωπολόγους). Οι όροι γεωγραφική και οικολογική φυλή θεωρούνται συνώνυμοι στην Συστηματική Ζωολογία, καθώς δύο περιοχές ή τοποθεσίες δεν μπορεί να έχουν παρόμοιο περιβάλλον. Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει ο «τύπος», δηλαδή ένα 12

25 Γ. Εισαγωγή άτομο-πρότυπο που φέρει όλα τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των μελών του είδους, του γένους ή της οικογένειας που ανήκει (Όντριας 1976). Γ.2. Ειδογένεση και εξέλιξη των οργανισμών Γ.2.1. Η ειδογένεση και οι απομονωτικοί μηχανισμοί Η ειδογένεση είναι η διαδικασία δημιουργίας νέων ειδών. Η ειδογενετική πορεία, ως προς την αλληλουχία των ενδιάμεσων ειδών, διακρίνεται στην αναγένεση (anagenesis) ή φυλετική ειδογένεση (phyletic evolution) και στην κλαδογένεση (cladogenesis) ή διχοτομική ειδογένεση. Η αναγένεση συνίσταται σε μεταβολές που πραγματοποιoύνται μέσα σε μία φυλογενετική εξελικτική γραμμή με την πάροδο του χρόνου. Η κλαδογένεση συνίσταται στη διάσπαση μίας φυλογενετικής γραμμής σε δύο ή περισσότερες, που εξελίσσονται ανεξάρτητα. Ωστόσο, υπάρχει και η στασιγένεση (stasigenesis), όπου ένα είδος παραμένει εξελικτικά σταθερό για μεγάλο χρονικό διάστημα και μεταπίπτει σε νέο είδος, χωρίς να υπάρχει προοδευτική αλλαγή (Avise 2000, Αλαχιώτης 1992). Η ειδογένεση στηρίζεται κυρίως σε παράγοντες που προκαλούν γενετική διαφοροποίηση (Αλαχιώτης 1992), όπως: Οι μεταλλάξεις (mutations), δηλαδή κάθε κληρονομήσιμη μορφολογική ή φυσιολογική αλλαγή του γενετικού υλικού. Η ειδογένεση φαίνεται να προάγεται με αλλαγές κυρίως σε ρυθμιστικά γονίδια (regulatory genes) τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση άλλων γονιδίων και όχι σε δομικά γονίδια, τα προϊόντα των οποίων είναι κυρίως πρωτεΐνες. Ο γενετικός ανασυνδιασμός, όπου τα μεταλλαγμένα γονίδια ανασυνδιάζονται στα χρωμοσώματα και αυξάνει η ποικιλομορφία. Η φυσική επιλογή (natural selection), δηλαδή η διαφορική ικανότητα αναπαραγωγής εναλλακτικών γενοτύπων που καθορίζεται από το γεγονός ότι κάποιοι γενότυποι αυξάνουν τις πιθανότητες επιβίωσης και αναπαραγωγής σε σχέση με άλλους, σε συγκεκριμένο χώρο και χρόνο. 13

26 Γ. Εισαγωγή Η τυχαία γενετική εκτροπή (genetic drift), δηλαδή η τυχαία μεταβολή των γονιδιακών συχνοτήτων. Η έναρξη των ειδογενετικών διεργασιών προϋποθέτει ότι οι δύο πληθυσμοί, που θα διαφοροποιηθούν γενετικά, πρέπει να βρίσκονται μεταξύ τους απομονωμένοι. Η απομόνωση μπορεί να είναι είτε αναπαραγωγική, είτε γεωγραφική. Η αναπαραγωγική απομόνωση περιλαμβάνει τους μηχανισμούς που εμποδίζουν την αναπαραγωγή ανάμεσα σε συμπατρικούς πληθυσμούς. Αυτοί οι μηχανισμοί διακρίνονται σε προσυζευτικούς ή προζυγωτικούς μηχανισμούς απομόνωσης, που εμποδίζουν το σχηματισμό ζυγωτικών υβριδίων και σε μετασυζευτικούς ή ζυγωτικούς μηχανισμούς απομόνωσης, που μειώνουν τη βιωσιμότητα ή τη γονιμότητα των υβριδίων (Dobzhansky 1977). H γεωγραφική απομόνωση βασίζεται στο διαχωρισμό ενός αρχικού πληθυσμού εξαιτίας γεωλογικού φράγματος και την ανεξάρτητη εξέλιξη των δύο νέων υποπληθυσμών που προκύπτουν. Η ειδογένεση, ανάλογα τον τρόπο απομόνωσης των πληθυσμών, διακρίνεται σε τρεις κύριες κατηγορίες. 1. Η γεωγραφική ή αλλοπατρική ειδογένεση (geographical or allopatric speciation), που εξελίσσεται, όταν οι πληθυσμοί είναι γεωγραφικά απομονωμένοι, με συνέπεια η μεταξύ τους γονιδιακή ροή να περιορίζεται ή να διακόπτεται. Οφείλεται είτε σε βικαριανιστικά γεγονότα, όπου κάποια περιβαλλοντική αλλαγή (π.χ. η άνοδος της στάθμης της θάλασσας) μπορεί να δημιουργήσει ένα φράγμα στη διασπορά του αρχικού πληθυσμού, είτε σε φαινόμενα ιδρυτικής αρχής και πληθυσμιακής έκρηξης (founder flush speciation), όπου συνήθως λίγα άτομα διασπείρονται, ξεπερνώντας ένα προϋπάρχον φράγμα και εποικίζουν μία ακατοίκητη από το είδος περιοχή (παρατηρείται κυρίως σε ωκεάνια νησιά) (Carson, 1971). Παραλλαγή της αλλοπατρικής ειδογένεσης είναι η παραπατρική ειδογένεση, όπου ένα μικρός υποπληθυσμός στα όρια εξάπλωσης του πληθυσμού εισέρχεται σε ένα νέο θώκο (πχ. γειτονική γεωγραφική περιοχή) και σταδιακά η μεταξύ τους γονιδιακή ροή περιορίζεται ή διακόπτεται. 2. Η συμπατρική ειδογένεση (sympatric speciation), που διαδραματίζεται στην ίδια γεωγραφική περιοχή, οδηγώντας σταδιακά δύο υποπληθυσμούς να εξελιχτούν σε διαφορετικά είδη. Οφείλεται είτε στη διασπαστική επιλογή, όπου ισχυρές εξελικτικές πιέσεις αναγκάζουν έναν πληθυσμό να «προσαρμοστεί» σε δύο ή 14

27 Γ. Εισαγωγή περισσότερες περιβαλλοντικές καταστάσεις ή οικοθέσεις, είτε στις χρωμοσωματικές αναδιατάξεις, δηλαδή αλλαγές στον αριθμό ή στη δομή των χρωμοσωμάτων. 3. Η φυλετική ειδογένεση, όπου ένα είδος δεν διασπάται, για να δώσει δύο ή περισσότερα είδη, αλλά το προγονικό είδος δίνει ένα μόνο νέο είδος (χρονοείδος) μέσα από εξελικτικές αλλαγές στο χρόνο. Τα φαινόμενα φυλετικής ειδογένεσης συμπεραίνονται από το αρχείο των απολιθωμάτων και συχνά υπάρχουν αμφιβολίες αν το χρονοείδος αντιπροσωπεύει μία συνεχή σειρά ή αποτελεί προϊόν διαδοχικών γεγονότων ειδογένεσης που ακολουθήθηκαν από γρήγορες εξαφανίσεις όλων των ενδιάμεσων ειδών, που δεν άφησαν απολιθώματα (Avise 2000, Αλαχιώτης 1992). Γ.2.2. Ο χρωμοσωματικός πολυμορφισμός και η σημασία του στην ειδογένεση Τα χρωμοσώματα είναι συσπειρωμένα μόρια γενετικού υλικού (DNA) συνδεδεμένα με πρωτεΐνες, ιστόνες και μη ιστόνες, και χαρακτηρίζονται από τις αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων που αντιγράφονται, από το κεντρομερίδιο και από τα τελομέρη. Ως δομή εμφανίζονται στις κυτταρικές φάσεις της μείωσης και της μίτωσης. Αντίθετα, στην κυτταρική φάση της μεσόφασης το γενετικό υλικό βρίσκεται με την μορφή ινιδίων χρωματίνης (συσπειρωμένα μόρια γενετικού υλικού), που διακρίνεται σε ευχρωματίνη και σε ετεροχρωματίνη. Η ευχρωματίνη παρουσιάζει μικρό βαθμό συμπύκνωσης, που μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και περιλαμβάνει τις περιοχές του DNA που μπορούν να μεταγραφούν. Η ετεροχρωματίνη παρουσιάζει μεγάλο βαθμό συμπύκνωσης, που δεν μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Διακρίνεται σε δύο κυρίως τύπους: τη συστατική ή δομική (constitutive), που είναι μόνιμα συμπυκνωμένη σε όλα τα κύτταρα του οργανισμού και περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA, όπως το δορυφορικό DNA και τη λειτουργική (facultative) ετεροχρωματίνη, που είναι επίσης ανενεργή, αλλά ποικίλει ανάλογα με τον ιστό (Μαρμάρας & Λαμπροπούλου 2000). Τα σωματικά κύτταρα των θηλαστικών έχουν διπλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων (2n), δηλαδή κάθε χρωμόσωμα υπάρχει σε δύο αντίτυπα, ενώ τα γενετικά κύτταρα φέρουν απλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων (n), δηλαδή κάθε χρωμόσωμα υπάρχει σε ένα αντίτυπο. Τα χρωμοσώματα διαχωρίζονται από το κεντρομέρος σε δύο βραχίονες. Ο θεμελιώδης αριθμός των βραχιόνων (FN), 15

28 Γ. Εισαγωγή δηλαδή ο συνολικός αριθμός των χρωμοσωματικών βραχιόνων σε ένα καρυότυπο, αποτελεί βασικό ταξινομικό γνώρισμα, ειδικά σε είδη με τον ίδιο αριθμό χρωμοσωμάτων. Η αναλογία των βραχιόνων (r-index), που είναι ο λόγος του μακρύτερου (l=long) προς τον βραχύτερο (s=short) βραχίονα l/s, καθορίζει την μορφή του χρωμοσώματος ως: μετακεντρικό (metacentric), όταν το κεντρομέρος βρίσκεται στο μέσο περίπου του χρωμοσώματος και οι δύο βραχίονες είναι ισομεγέθεις (r-index μεταξύ 1,0 και 1,7). υπομετακεντρικό (submetacentric), όταν το κεντρομέρος βρίσκεται κοντά στο ένα άκρο του χρωμοσώματος και σχηματίζει δύο ανισομεγέθεις βραχίονες (rindex μεταξύ 1,7 και 3,0). υποτελοκεντρικό (subtelocetric), όταν το κεντρομέρος βρίσκεται πολύ κοντά στο τελομέρος του χρωμοσώματος. Τα χρωμοσώματα αυτά έχουν συχνά δορυφόρους, μορφολογικά στοιχεία με σφαιρικό συνήθως σχήμα που διαχωρίζονται από το υπόλοιπο χρωματόσωμα με δευτερογενή περίσφιξη (r-index μεταξύ 3,0 και 7,0). ακροκεντρικό (acrocentric), όταν το κεντρομέρος βρίσκεται στο άκρο του χρωμοσώματος και ο βραχίονας s είναι πολύ μικρός (r-index μεταξύ 7,0 και ). τελοκεντρικό (telocetric), όταν το κεντρομέρος βρίσκεται στο τελομέρος του χρωμοσώματος (r-index= ) (Stebbins 1971). Oι χρωμοσωματικές μεταλλάξεις μεταβάλουν τον καρυότυπο, επιδρώντας στη δομή (έλλειμμα, θραύση, διπλασιασμός, ανασυνδιασμός, μετατόπιση, προσθήκη ετεροχρωματίνης) και στον αριθμό (ανευπλοειδία, πολυπλοειδία) των χρωμοσωμάτων. Η επικράτηση ή η αύξηση της συχνότητας ενός τύπου χρωμοσωματικής μετάλλαξης σε ένα πληθυσμό ονομάζεται χρωμοσωματικός πολυμορφισμός. Η εμφάνιση χρωμοσωματικών πολυμορφισμών, θεωρείται, με βάση το στασιπατρικό μοντέλο ειδογένεσης, ότι δημιουργεί αναπαραγωγική απομόνωση, καθώς μειώνεται η γονιμότητα του ετεροζυγώτη. Έτσι, μέσα στην περιοχή εξάπλωσης του αρχικού είδους μπορεί να δημιουργηθεί ένας πληθυσμός ετεροζυγωτών, που αναπαράγεται με φυσιολογική γονιμότητα με τα όμοια χρωμοσωματικά άτομα, αλλά εμφανίζει μειωμένη γονιμότητα όταν αναπαράγεται με άτομα με διαφορετική χρωμοσωματική σύνθεση. 16

29 Γ. Εισαγωγή Η συσσώρευση επιπλέον μεταλλάξεων στον παραπάνω πληθυσμό μπορεί να οδηγήσει σε μεγαλύτερη μείωση της γονιμότητας και τελικά σε ειδογένεση (White 1978, 1973, 1968). Η συσσώρευση και διατήρηση μεγάλου αριθμού χρωμοσωματικών μεταλλάξεων στους φυσικούς πληθυσμούς, δείχνει a posteriori ότι ίσως να προσδίδει στα άτομα-φορείς κάποιο εξελικτικό πλεονέκτημα (Corti et al. 1986, Capanna et al. 1985, Gropp et al. 1972). Ωστόσο, η υπόθεση αυτή δέχεται κριτική, καθώς αρκετοί ερευνητές θεωρούν ότι οι χρωμοσωματικές αναδιατάξεις δεν σχετίζονται άμεσα με την ειδογενετική διαδικασία, αλλά είτε απλώς ενισχύουν την απομόνωση των ήδη διαφοροποιημένων ειδών (Mayr 1982, Futuyma & Μayer 1980, Mayr 1963), είτε προκύπτουν από καθαρά τυχαία φαινόμενα μειωτικής παρέκκλισης (molecular drive) (Dover et al. 1982). Οι χρωμοσωματικοί πολυμορφισμοί παρατηρούνται σε πολλές ομάδες οργανισμών, όπως οι άπτερες ακρίδες (White 1978) και τα υπόγεια τρωκτικά. Στα τρωκτικά έχουν διατυπωθεί πολλές θεωρίες φυλογενετικής εξέλιξης και γεωγραφικής εξάπλωσης βασισμένες σε καρυοτυπικές μελέτες (Mazurok et al. 2001, Galleni 1995, Spotorno et al. 1994, Brunet-Lecomte & Volobouev 1994, Baker & Bickham 1986). Οι συχνότερες χρωμοσωματικές αναδιατάξεις, που εμφανίζονται στα τρωκτικά είναι: Kεντρικές συντήξεις (Robertsonian fusions) ή διασπάσεις (Robertsonian fissions): Οι κεντρικές συντήξεις δημιουργούνται από την σύντηξη δύο ακροκεντρικών ή τελοκεντρικών χρωμοσωμάτων στην περιοχή του κεντρομέρους, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός μετακεντρικού χρωμοσώματος. Η κεντρική σύντηξη μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε με απώλεια του ενός κεντρομέρους ή με σύντηξη των παρακεντρομερικών περιοχών δημιουργώντας ένα δίκεντρο μετακεντρικό χρωμόσωμα, όπου το ένα από τα δύο κεντρομέρη είναι ανενεργό. Η κεντρική διάσπαση δημιουργείται από την διάσπαση ενός μετακεντρικού χρωμοσώματος στην περιοχή του κεντρομέρους, με αποτέλεσμα τη δημιουργία δύο ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων. Ο τύπος αυτός χρωμοσωματικής μετάλλαξης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην καρυοτυπική εξέλιξη των θηλαστικών (Robertson 1916). Περικεντρικές και παρακεντρικές αναστροφές: Δημιουργούνται, όταν ένα χρωμόσωμα σπάει σε δύο διαφορετικά σημεία και το ενδιάμεσο τμήμα αναστρέφεται κατά 180 ο και επανασυνδέεται στο χρωμόσωμα. Αν το ανεστραμμένο τμήμα περιέχει 17

30 Γ. Εισαγωγή και το κεντρομέρος, η αναστροφή ονομάζεται περικεντρική, ενώ αν δεν το περιέχει ονομάζεται παρακεντρική. Και τα δύο είδη αναστροφών έχουν την τάση να παράγουν μη λειτουργικούς γαμέτες, γεγονός που ενισχύεται στη περίπτωση που πραγματοποιείται συγχρόνως και γενετικός ανασυνδιασμός (King 1993, Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση 1992, Futuyma 1991, Richardson 1991, Stansfield 1987, White 1973). Μετατοπίσεις: Δημιουργούνται από θραύση ενός τμήματος του χρωμοσώματος, το οποίο στην συνέχεια συνδέεται με ένα άλλο μη ομόλογο χρωμόσωμα. Οι μεταλλάξεις αυτές σε ετερόζυγη κατάσταση οδηγούν σε σταυρωτή διάταξη των χρωμοσωμάτων κατά τη μείωση, με αποτέλεσμα ο διαχωρισμός τους κατά την ανάφαση να δίνει κυρίως μη βιώσιμους γαμέτες με διπλασιασμένα ή ελλιπή χρωμοσωματικά τμήματα (King 1993, Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση 1992, Futuyma 1991, Richardson 1991). Προσθήκη ή Απώλεια ετεροχρωματίνης: Αποτελεί μία δομική χρωμοσωματική αναδιάταξη, που παρατηρείται συνήθως στα φυλετικά χρωμοσώματα (King 1993). Παρατηρήθηκε ότι υβρίδια μεταξύ ατόμων με μεγάλη ποικιλότητα ως προς την ποσότητα και τη θέση συσσώρευσης της ετεροχρωματίνης, δεν εμφανίζουν μειωμένη γονιμότητα. Αρχικά θεωρήθηκε ότι αυτή η μορφή μετάλλαξης δεν επηρεάζει την γονιμότητα των ατόμων και δεν προωθεί ειδογενετικές διαδικασίες. Ωστόσο, αργότερα διαπιστώθηκε ότι το δορυφορικό DΝΑ, που βρίσκεται στη συστατική ετεροχρωματίνη, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία του ζευγαρώματος κατά τη μείωση, με συνέπεια η διαφορετική κατανομή της ετεροχρωματίνης στον καρυότυπο να επηρεάζει τη γονιμότητα, είτε μεταξύ χρωμοσωματικών φυλών είτε μεταξύ ειδών (Fry & Salser 1977, Corneo 1976, Hatch et al. 1976). Επίσης, η προσθήκη μεγάλων ποσοτήτων ετεροχρωματίνης ή δορυφορικού DΝΑ στο γονιδίωμα ευνοεί τη δημιουργία χρωμοσωματικών αναδιατάξεων ή/και διευκολύνει τη σταθεροποίησή τους (Κing 1993, Miklos et al. 1980). Συντήξεις σε σειρά (tandem fusions): Δημιουργούνται από την σύντηξη μεταξύ τελομέρους-κεντρομέρους ή τελομέρους-τελομέρους δύο ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων, χωρίς απώλεια χρωμοσωματικού υλικού, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός μεγάλου ακροκεντρικού χρωμοσώματος. Οι συντήξεις σε σειρά 18

31 Γ. Εισαγωγή συμβαίνουν συνήθως μεταξύ ευχρωματινικών περιοχών και συνήθως δεν εμφανίζονται σε ετεροχρωματινικούς βραχίονες (Elder & Hsu 1988). Γ.2.3. Η έννοια της χρωμοσωματικής φυλής (chromosome race) Κυτταρογενετικές μελέτες των τελευταίων δεκαετιών έδειξαν ότι ένα μεγάλο ποσοστό ειδών παρουσιάζουν εκτεταμένους χρωμοσωματικούς πολυμορφισμούς, με έντονες διαφορές στον καρυότυπο ακόμα και ανάμεσα σε γειτονικούς πληθυσμούς, όπως ο οικιακός ποντικός Μus domesticus (2n=22 έως 2n=40) (Nachman et al. 1994) και η μυγαλή Sorex araneus (2n=20 έως 2n=33) (Wolcik et al. 2002). Η έννοια της «χρωμοσωματικής φυλής» (chromosome race) χρησιμοποιείται από πολλούς ερευνητές, για να περιγράψουν, να ομαδοποιήσουν και να συγκρίνουν φυσικούς πληθυσμούς ειδών με χρωμοσωματικούς πολυμορφισμούς. Ο όρος «χρωμοσωματική φυλή» χρησιμοποιείται συχνά από τους ζωολόγους σαν «αδύναμο» συνώνυμο του υποείδους, μέχρι να συγκεντρώσουν αρκετά στοιχεία, για να προχωρήσουν σε επίσημη συστηματική κατάταξη, ειδικά όταν αναφέρονται σε αλλοπατρικούς ή παραπατρικούς πληθυσμούς. Χαρακτηριστική περίπτωση αποτελεί ο ενδημικός σκαπτοποντικός της Ιταλίας Microtus savii, όπου μελέτες υβριδισμού, μοριακές και μορφομετρικές αναλύσεις, οδήγησαν τους ερευνητές να ονομάσουν τέσσερις χρωμοσωματικές φυλές ως υποείδη, ενώ μία χρωμοσωματική φυλή θεωρείται πλέον διακριτό είδος (Microtus brachycercus) (Castiglia et al. 2008, Galleni et al. 1998, 1994). Επειδή η χρωμοσωματική φυλή δεν αποτελεί επίσημη συστηματική κατάταξη, υπήρχε μία σύγχυση στη βιβλιογραφία στο παρελθόν, σχετικά με τα κριτήρια που χρησιμοποιούσαν οι ερευνητές, για να ομαδοποιήσουν τους χρωμοσωματικούς πολυμορφισμούς. Με αφορμή τη μελέτη της μυγαλής Sorex araneus, που παρουσιάζει 72 χρωμοσωματικές φυλές με εκτεταμένη εξάπλωση στην Παλαιαρκτική περιοχή, δημιουργήθηκε ένα κοινό σύστημα περιγραφής των χρωμοσωματικών φυλών (Searle et al. 2010, Hausser et al. 1994). Συγκεκριμένα, σύμφωνα με τους Searle et al. (2010) και Hausser et al. (1994): Η χρωμοσωματική φυλή είναι μία ομάδα πληθυσμών γεωγραφικά συνδεδεμένων ή πρόσφατα διαχωρισμένων, που παρουσιάζουν ίδιο καρυότυπο, από κοινή καταγωγή. 19

32 Γ. Εισαγωγή Δύο ομάδες πληθυσμών που διαφέρουν στον καρυότυπο ακόμα και σε μία χρωμοσωματική αναδιάταξη (πχ. ένα ζεύγος μετακεντρικών χρωμοσωμάτων), αποτελούν διαφορετικές χρωμοσωματικές φυλές. Οι χρωμοσωματικές φυλές που έρχονται σε επαφή παρουσιάζουν συνήθως ζώνες υβριδισμού, όπου τα υβρίδια έχουν καρυότυπους με ανάμεικτους χρωμοσωματικούς πολυμορφισμούς. Οι πληθυσμοί στις ζώνες υβριδισμού δεν θεωρούνται νέες χρωμοσωματικές φυλές, εκτός και αν βρεθεί ένας μεγάλος αριθμός ατόμων με σταθερή υβριδική χρωμοσωματική σύνθεση, που διακρίνεται από τις δύο προγονικές φυλές. Απομονωμένοι γεωγραφικά πληθυσμοί που παρουσιάζουν τον ίδιο καρυότυπο, ανήκουν στην ίδια χρωμοσωματική φυλή μόνο όταν η απομόνωσή τους είναι πρόσφατη και έχουν όλες τις χρωμοσωματικές αναδιατάξεις από κοινή προέλευση. Το όνομα της χρωμοσωματικής φυλής συνιστάται να προέρχεται από ένα τοπωνύμιο, που να σχετίζεται με την γεωγραφική κατανομή της φυλής, όπως η περιοχή περιγραφής, το όνομα της πλησιέστερης πόλης, το όνομα της επαρχίας ή κάποιο ιδιαίτερο γεωγραφικό χαρακτηριστικό. Για παράδειγμα, η χρωμοσωματική φυλή "Valais" του είδους Sorex araneus, πήρε το όνομά της από την περιοχή Valais της Ελβετίας (46' 16' N, 7' 29' E), όπου συλλέχθηκαν και μελετήθηκαν τα πρώτα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή της φυλής (Hausser et al. 1994). Σύμφωνα με τους Hausser et al. (1994), όταν περιγράφεται μία νέα χρωμοσωματική φυλή, ο συγγραφέας οφείλει να παρουσιάσει στη δημοσίευσή του: 1. Το όνομα της φυλής και περιγραφή του καρυοτύπου. 2. Τον τόπο συλλογής του δείγματος που βασίστηκε η περιγραφή της φυλής. 3. Συνώνυμα ονόματα, που μπορεί να έχουν δοθεί σε αυτό τον πληθυσμό/φυλή από παλαιότερες μελέτες. 4. Περιγραφή της γεωγραφικής κατανομής της φυλής. 5. Όσο περισσότερες πληροφορίες διαθέτει, όπως αποτελέσματα εργαστηριακών διασταυρώσεων, μελέτη ζωνών υβριδισμού, μορφομετρική ανάλυση και μοριακή φυλογένεση. 20

33 Γ. Εισαγωγή Γ.3. Ιστορικά στοιχεία για το γένος Microtus Γ.3.1. Η εξελικτική ιστορία του γένους Microtus Τα τρωκτικά (Rodentia) αποτελούν την πολυπληθέστερη τάξη των Ευθήριων θηλαστικών, με έντονη διαφοροποίηση στη μορφολογία, στο μέγεθος, στην ηθολογία, στην οικολογία και στη γεωγραφική εξάπλωση. Οι αρχαιότερες γνωστές απολιθωμένες μορφές ανήκουν στο γένος Paramys και έζησαν στη Β. Αμερική πριν 55 εκ. χρόνια. Παρουσιάζουν το χαρακτηριστικό πρότυπο της οδόντωσης των τρωκτικών, χωρίς κυνόδοντες, με μεγάλους τομείς, που διαχωρίζονται από τους γoμφίους με ένα μεγάλο κενό, το διάστημα. Mε βάση τα αποτελέσματα αναλύσεων απολιθωμένων κρανίων και δοντιών, ο πρόγονος των σημερινών τρωκτικών έμοιαζε με τα αρτίγονα εντομοφάγα και έζησε κατά το Παλαιόκαινο πριν 60 εκ. χρόνια. Από τον παραπάνω πρόγονο προήλθαν αρχικά πέντε ομάδες τρωκτικών, που εξελίχθηκαν και διαφοροποιήθηκαν στις αρτίγονες οικογένειες (MacDonald & Barrett 1993). Η οικογένεια Arvicolidae εμφανίστηκε στο Πρώιμο Πλειόκαινο, πριν 5 εκ. χρόνια. O πρώτος αντιπρόσωπος άνηκε στο γένος Promimomys, που εξαπλώθηκε στην Ευρασία με το είδος Promimomys insuliferus και στη Β. Αμερική με το είδος Promimomys mimus. Από το είδος Promimomys insuliferus προέκυψαν τα γένη Dolomys, Pliomys και Mimomys, ενώ από το είδος Promimomys mimus προέκυψε τo γένος Pliopotamus, που είναι πρόγονος των σύγχρονων αρουραίων του γένους Ondatra (Chaline & Graf 1988, Graf 1982). Kατά το Ύστερο Πλειόκαινο, οι παραπάνω ομάδες απομονώθηκαν, καθώς διακόπηκε η επικοινωνία Αμερικής-Ασίας με την δημιουργία του Βερίγγειου Πορθμού και ακολούθησαν διαφορετικά εξελικτικά μονοπάτια (Chaline & Graf 1988, Graf 1982). Η εμφάνιση των παγετώνων, κατά το Ύστερο Πλειστόκαινο, αποκατέστησε διόδους επικοινωνίας, με συνέπεια άτομα Pliomys να μεταναστεύσουν στην Αμερική, όπου διαφοροποιήθηκαν στα γένη Pliophenacomys και Pliolemmus. Παράλληλα, στην Ευρασία, από την εξελικτική γραμμή του γένους Mimomys προέκυψε πριν 2-2,4 εκ. χρόνια το γένος Allophaiomys (Zheng & Zhang 2000, Chaline & Graf 1988). Από το γένος Allophaiomys προέκυψαν οι κλάδοι του γένους Chionomys πριν από 0,6-1 εκ. χρόνια και οι κλάδοι των γενών Microtus και Arvicola πριν 0,6-0,7 εκ. χρόνια (Brunet-Lecomte 1989, Chaline & Graf 1988, Graf 1982). Οι σύγχρονοι 21