ΜΕΛΕΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ SPONGIA OFFICINALIS L (PORIFERA, DEMOSPOGIAE) STUDY OF THE BACTERIAL DIVERSITY OF SPONGIA

Transcript

1 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΜΕΛΕΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ SPONGIA OFFICINALIS L (PORIFERA, DEMOSPOGIAE) Σκαράκη Κ. 1,2, Νταϊλιάνης Θ. 2,3, Κωτούλας Γ. 2, Νικολαΐδου Α. 4, Μαγουλάς Α. 2, Πανταζίδου Α. 1 1 Τομέας Οικολογίας και Ταξινομικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, skaraki@her.hcmr.gr, apantazi@biol.uoa.gr 2 Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, Ελληνικό Κέντρο Θαλασσίων Ερευνών, thanosd@her.hcmr.gr, kotoulas@her.hcmr.gr, magoulas@her.hcmr.gr 3 Τομέας Ζωολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 4 Τομέας Ζωολογίας - Θαλάσσιας Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, anikol@biol.uoa.gr Περίληψη Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της βακτηριακής ποικιλότητας σε άτομα του είδους Spongia officinalis. Το είδος αυτό είναι ευρέως διαδεδομένο στη Μεσόγειο Θάλασσα και αποτελεί ένα από τα κύρια εμπορικά είδη Σπόγγων. Η μελέτη της βακτηριακής του ποικιλότητας παρουσιάζει μεγάλο οικολογικό και βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον. Η μέθοδος ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία είναι η κατασκευή βιβλιοθήκης κλώνων του γονιδίου 16S rrna και η περαιτέρω φυλογενετική ανάλυση αυτών. Βρέθηκαν κυρίως βακτηριακές ομάδες όπως Chloroflexi, γ- και δ-proteobacteria. Επίσης οι αλληλουχίες που απομονώθηκαν βρέθηκαν να είναι συγγενικές με βακτηριακές αλληλουχίες που είχαν απομονωθεί από άλλα θαλάσσια ασπόνδυλα.. Λέξεις κλειδιά: θαλάσσια ασπόνδυλα, Bacteria, 16S rdna βιβλιοθήκη κλώνων, φυλογενετικό δέντρο. STUDY OF THE BACTERIAL DIVERSITY OF SPONGIA OFFICINALIS L (PORIFERA, DEMOSPOGIAE) Skaraki K. 1,2, Dailianis T. 2,3, Kotoulas G. 2, Nicolaidou A. 4, Magoulas A. 2, Pantazidou A. 1 1 Department of Ecology and Taxonomy, School of Biology,National and Kapodistrian University of Athens, skaraki@her. hcmr.gr, apantazi@biol.uoa.gr 2 Institute of Marine Biology and Genetics, Hellenic Centre for Marine Research, thanosd@her.hcmr.gr, kotoulas@her. hcmr.gr, magoulas@her.hcmr.gr 3 Department of Zoology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki 4 Department of Zoology and Marine Biology, School of Biology,National and Kapodistrian University of Athens, anikol@ biol.uoa.gr Abstract The aim of this study is the description of the bacterial diversity of Spongia officinalis. This species is widely distributed in the Mediterranean Sea and is one of the most important commercial sponge species. The description of the bacterial diversity associated with this presents a high ecological and biotechnological interest. We have used the method of sequencing clone libraries and phylogenetic analysis to assess the patterns of biodiversity and the subsequent phylogenetic analysis. The sequences analyzed were affiliated to different bacterial groups as Chloroflexi, γ- and δ-proteobacteria. Sequences in this study were found to be related to bacterial sequences that had been isolated from other marine invertebrates. Keywords: marine invertebrates, Bacteria, 16S rdna clone library, phylogenetic tree. 1. Εισαγωγή Το Φύλο των Σπόγγων περιλαμβάνει τρεις Κλάσεις: τους Υαλόσπογγους (Hexactinellida), τους Ασβεστόσπογγους (Calcarea) και τους Δημόσπογγους (Demospongiae). Οι τελευταίοι περιλαμβάνουν τη μεγαλύτερη ποικιλία ειδών καθώς και τη μεγαλύτερη γεωγραφική εξάπλωση και ποικιλία ενδιαιτημάτων (Sará & Vacelet, 1973). Ένα από τα πολύ σημαντικά εμπορικά είδη Σπόγγων είναι ο Δημόσπογγος (Demospongiae) Spongia officinalis. Το είδος αυτό απαντά στη μεγαλύτερη έκταση

2 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ της λεκάνης της Μεσογείου, σε σκληρά υποστρώματα κυρίως και σε βάθη μέχρι 100 μέτρα. Αλιευτικά πεδία Σπόγγων στον ελλαδικό χώρο βρίσκονται στην Κρήτη, τα Δωδεκάνησα, τη Σάμο και την Εύβοια. Παρατηρούνται όλων των ειδών οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ Σπόγγων και μικροοργανισμών. Τα βακτήρια αποτελούν μία σημαντική πηγή τροφής για τους Σπόγγους, λόγω του μικρού τους μεγέθους (Stabili et al., 2006). Συγκεκριμένα είδη βακτηρίων όμως μπορούν να συνυπάρξουν με Σπόγγους ως παράσιτα - παθογόνα (Cervino et al., 2006; Olson et al., 2006; Rützler, 1988; Webster et al., 2002) ή να συμβιώνουν με αμοιβαία συνεισφορά (Wilkinson, 1983). Τα μικρόβια που σχετίζονται με τους Σπόγγους μπορούν να αποτελέσουν μέχρι και το 40% του όγκου των ιστών τους (Webster & Hill, 2001). Η συνύπαρξη βακτηρίων-σπόγγων σε συνδυασμό και με το ότι αποτελούν πολύ πλούσιες πηγές δευτερογενών μεταβολιτών με βιολογική δραστικότητα (Kefalas et al., 2003; Taylor et al., 2007) έχει αυξήσει τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον της έρευνας για τη μελέτη και κατανόηση των σχέσεων αυτών. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της βακτηριακής ποικιλότητας του Spongia officinalis, μέσω κατασκευής βιβλιοθηκών κλώνων του γονιδίου 16S rrna και κατ επέκταση φυλογενετικής ανάλυσης των αλληλουχιών του γονιδίου 16S rrna. Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη μέχρι τώρα προσπάθεια εύρεσης της βακτηριακής ποικιλότητας στη Spongia officinalis με τη μέθοδο των βιβλιοθηκών κλώνων του γονιδίου 16S rrna. Η μελέτη εντάσσεται στην προοπτική βιογεωγραφικής έρευνας της ποικιλότητας των βακτηριακών ειδών που συναντώνται στο Spongia officinalis παράλληλα με φυλογεωγραφική έρευνα του Σπόγγου αυτού. Η σύγκριση της ποικιλότητας μεταξύ ατόμων από διαφορετικά ενδιαιτήματα θα επιτρέψει την κατανόηση της δυναμικής της εποίκισης των οργανισμών αυτών από μικροοργανισμούς, τόσο σε σχέση με το ενδιαίτημα και τη βιογεωγραφία, όσο και σε σχέση με τη γενετική δομή του ξενιστή. 2. Υλικά και Μέθοδοι Δείγματα Σπόγγων από άτομα του είδους Spongia officinalis Linnaeus, 1759 var. adriatica Schmidt 1862 συλλέχθηκαν με αυτόνομη κατάδυση από τη Μεσόγειο Θάλασσα από τη θαλάσσια περιοχή της Μασσαλίας (Γαλλία) και βάθος 20μ, το Φεβρουάριο του Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένα πλαστικά δοχεία και διατηρήθηκαν σε 97% αλκοόλη σε θερμοκρασία -20 ο C για περαιτέρω μορφολογικές και μοριακές αναλύσεις. Πραγματοποιήθηκε εξαγωγή ολικού DNA, από εσωτερικό τμήμα του Σπόγγου, με χρήση του κιτ DNEasy Blood & Tissue της εταιρίας Qiagen και ακολούθησε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με ειδικούς βακτηριακούς εκκινητές (primers). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι: 27f 5 -AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3 και 1492r 5 - TACGG(C/T)TACCTTGTTAC- GACTT-3 οι οποίοι ενισχύουν το γονίδιο 16S rrna και δίνουν προϊόν ~1500bp. H αντίδραση PCR είχε συνολικό όγκο 30μl και περιείχε περίπου 60ng ολικού DNA, 1x PCR buffer (GenAxon), 2mM MgCl 2, 0.25μΜ από τον κάθε εκκινητή, 300μΜ dntps και 0,25U πολυμεράσης (Taq, GenAxon). Η πειραματική διαδικασία της PCR συμπεριελάμβανε ένα κύκλο αποδιάταξης στους 94 C για 3 λεπτά, 25 κύκλους που περιλάμβαναν 1 λεπτό στους 94 C, 1 λεπτό στους 55 C και 3 λεπτά στους 72 C, ακολουθούμενους από ένα τελικό βήμα επέκτασης στους 72 C για 7 λεπτά. Οι αντιδράσεις PCR έγιναν σε μηχάνημα PCR PTC-220 Peltier Thermal Cycler (MJ Research Inc., Watertown, Mass). Το προϊόν της αντίδρασης PCR διαχωρίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% (w/v) που περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο ενώ η παρατήρησή του έγινε κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Το προϊόν PCR, αρχικά, από ένα άτομο σπόγγου, καθαρίστηκέ με το Nucleospin Extract II Kit (Macherey-Nagel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το καθαρισμένο προϊόν PCR

3 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ κλωνοποιήθηκε με πακέτο TOPO TA Cloning Kit (Version R) και εφαρμόστηκαν οι οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen Ltd, Carsbad, CA). Συνολικά απομονώθηκαν 33 θετικές αποικίες οι οποίες ελέγχθηκαν για το αν περιέχουν το σωστό προϊόν (1500bp) με αντίδραση PCR με την χρήση εκκινητών του πλασμιδίου, T7 και Sp6. Οι θετικοί κλώνοι μεταφέρθηκαν σε υγρό LB (με αντιβιοτικό Καναμυκίνη 50μg/ml), επωάστηκαν στους 37 C για ώρες και ακολούθησε εξαγωγή πλασμιδίου σύμφωνα με τη μέθοδο Maniatis et al., Η αλληλούχιση των κλώνων έγινε με τη χρήση των εκκινητών Τ7, Sp6 και 514f και του πακέτου BigDye terminator 3.1, ενώ αναλύθηκαν σε αυτόματο αλληλουχητή ABI 3700 (Applied Biosystems). Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες διορθώθηκαν με το χέρι, με το πρόγραμμα BioEdit, version (Hall, 1997). Η ευθυγράμμιση των αλληλουχιών (alignment) έγινε με το πρόγραμμα Clustal X, version 1.83 (Thompson et al., 1997). Οι αλληλουχίες που προέκυψαν ελέγχθηκαν για τυχόν χιμαιρικής προέλευσης στο πρόγραμμα Chimera Check ( της βάσης δεδομένων Ribosomal Database Project. Οι αλληλουχίες στη συγκρίθηκαν με ήδη γνωστές αλληλουχίες της βάσης δεδομένων NCBI (GenBank, με το πρόγραμμα BLAST (Basic Local Alignment Tool), (Altschul et al. 1997) και την επιλογή megablast. Η φυλογενετική ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα MEGA, version 4 (Kumar et al., 2008). Το φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε εφαρμόζοντας τη μέθοδο Neighbor-Joining σε αποστάσεις Kimura 2-parameter. Η στατιστική υποστήριξη της τοπολογίας του φυλογενετικού δέντρου προσεγγίστηκε με τη μέθοδο bootstraps με 1000 επαναλήψεις. Οι αλληλουχίες με 99% ομοιότητα θεωρήθηκαν ως ένας φυλότυπος (OUT-operational taxonomic unit) και για να βρεθεί η αναλογία της ποικιλότητας την οποία αντιπροσωπεύσουν αναλύθηκαν με τη rarefaction analysis ( edu/strata/software.html). 3. Αποτελέσματα Συνολικά από τους 33 κλώνους που απομονώθηκαν, για τους 17 έγινε προσδιορισμός μέρους της αλληλουχίας τους. Οι περισσότερες αλληλουχίες βρέθηκε να εμπίπτουν στις βακτηριακές ομάδες Chloroflexi, γ- και δ-proteobacteria. Μετά τη σύγκριση των αλληλουχιών στη βάση δεδομένων NCBI οι περισσότεροι κλώνοι βρέθηκε να είναι φυλογενετικά συγγενικοί με κλώνους που έχουν απομονωθεί από θαλάσσια ασπόνδυλα, κυρίως από άλλα είδη Σπόγγων και οκτωκοράλλια από διάφορες γεωγραφικές περιοχές (Πίν. 1, Εικ. 1). Για παράδειγμα, ο κλώνος 18Τ7 παρουσιάζει 95% ομοιότητα με τον βακτηριακό κλώνο CN71 (AM259922) που ανήκει στην ομάδα των γ-proteobacteria και έχει απομονωθεί από τον Σπόγγο Chondrilla nucula στη θάλασσα της Αδριατικής (Thiel et al. 2007). Οι περισσότερες αλληλουχίες της παρούσας εργασίας βρέθηκαν να έχουν μεγάλη ομοιότητα, 93%-99%, με αλληλουχίες που έχουν απομονωθεί από άλλα είδη Σπόγγων, όπως τα είδη Chondrilla nucula, Agelas dilatata, Rhopaloeides odorabile, Discodermia dissoluta, Theonella swinhoei, Aplysina aerophoba, Acanthostrongylophora sp., Aplysina fulva, και Plakortis sp. (Garren et al., 2008; Hentschel et al., 2002; Schirmer et al., 2005; Taylor et al., 2007; Webster et al., 2008). Επίσης, ομοιότητες βρέθηκαν και με αλληλουχίες που έχουν απομονωθεί από άλλα θαλάσσια ασπόνδυλα κυρίως οκτωκοράλλια και συγκεκριμένα από το είδος Erythropodium caribaeorum, ενώ βρέθηκε μία αλληλουχία, η 30Τ7 να έχει 96% ομοιότητα με βακτήρια που σχετίζονται με είδη μυκήτων που αναπτύσσονται πάνω σε κοράλλι (Garren, et al., 2008). Τέλος, η αλληλουχία, 29Τ7, βρέθηκε να έχει 83% ομοιότητα με αλληλουχία που απομονώθηκε από το χλωροφύκος Ulva australis (Πίν. 1). Η ανάλυση (rarefaction) για την εύρεση του ποσοστού της ποικιλότητας την οποία αντιπροσωπεύουν οι κλώνοι που αλληλουχήθηκαν έδειξε ότι δεν έχει περιγραφεί ακόμα το μεγαλύτερο ποσο

4 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ Πίνακας 1: Σύνολο αλληλουχιών του γονιδίου 16S rrna που απομονώθηκαν από άτομο του είδους Spongia officinalis και οι κοντινότερες συγγενικές αλληλουχίες από τη βάση δεδομένων NCBI. UC= άγνωστη κατάταξη. Αλ/ια bp Κοντινότερος συγγενής Πηγή απομόνωσης NCBI κωδικός Ομ/τα φυλογενετική ομάδα 18T7 404 clone CN71 sponge mesohyl, Chondrilla nucula AM % γ- Proteobacteria 5Sp6 496 clone LC3-5 self sediment South Atlantic AY % γ-proteobacteria clone AD026 sponge Agelas dilatata EF % γ- Proteobacteria 31T7 614 clone 27aC3 sponge Rhopaloeides odorabile EU % UC 2T7 464 Dd-spT-A14 sponge Discodermia dissoluta. AY % UC 424 clone 232 marine sponge AY % UC 4T7(3) 757 clone 27aH2 sponge Rhopaloeides odorabile EU % UC 29T7 560 clone OP200 sponge Acanthostrongylophora sp. EF % UC 625 clone i103 sponge Aplysina fulva FM % UC 655 clone UA24 surface macroalgae Ulva australis DQ % UC 6T7 766 clone PK024 marine sponge Plakortis sp. EF % Chloroflexi 13T7 582 clone TK13 sponge Aplysina aerophoba AJ % UC 542 clone 27aF4 sponge Rhopaloeides odorabile EU % UC 23T7(4) 772 clone PK025 marine sponge Plakortis sp. EF % δ- Proteobacteria 21T7(2) 424 clone OP209 sponge Acanthostrongylophora sp. EF % UC 424 clone EC214 octocoral Erythropodium caribaeorum DQ % δ- Proteobacteria Εικ. 1: Φυλογενετικό δέντρο των αλληλουχιών (850bp) που απομονώθηκαν από άτομο του είδους Spongia officinalis και των συγγενικών τους αλληλουχιών από τη βάση δεδομένων NCBI. Το δέντρο κατασκευάστηκε με τη μέθοδο Neighbor-Joining και φυλογενετικό bootstraps test με 1000 επαναλήψεις. Για outgroup χρησιμοποιήθηκε το Αρχαίο Halobacterium jilantaiense

5 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Πρακτικά, Τόμος ΙΙ στό της (Εικ. 2) Παρ όλα αυτά οι αλληλουχίες που αναλύθηκαν έως τώρα ανήκουν σε διάφορες βακτηριακές ομάδες. Εικ. 2: Γραφική παράσταση των κλώνων που αναλύθηκαν σε συνάρτηση με τα αναμενόμενα OTU. 4. Συμπεράσματα - Συζήτηση Η εργασία αυτή αφορά στη μελέτη-περιγραφή της βακτηριακής ποικιλότητας του S. officinalis και παρουσιάζει τα προκαταρκτικά αποτελέσματα μιας βιβλιοθήκης κλώνων του γονιδίου 16S rrna. Από τις 17 αλληλουχίες που αναλύθηκαν οι περισσότερες παρουσίαζαν ομοιότητα με βακτηριακές αλληλουχίες που είχαν απομονωθεί από θαλάσσια ασπόνδυλα και ιδιαίτερα άλλα είδη Σπόγγων. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν πως η βακτηριακή ποικιλότητα των Σπόγγων είναι υψηλή, συγχρόνως όμως παρουσιάζει και σημαντική εξειδίκευση. Κατά συνέπεια η μικροβιακή ποικιλότητα των Σπόγγων δεν αντικατοπτρίζει τυχαία δειγματοληψία βακτηρίων του περιβάλλοντός τους χώρου. Επιπλέον, αναφορές συμβιωτικών βακτηρίων αλλά και βιοδραστικών ουσιών στους Σπόγγους οι οποίες αποδείχτηκαν προϊόντα συμβιωτικών τους βακτηρίων, ενισχύει το ενδιαφέρον περαιτέρω μελέτης του συστήματος «Σπόγγοι βακτήρια». Με την εργασία αυτή είναι η πρώτη φορά που δημοσιεύονται βακτηριακές αλληλουχίες με τη μέθοδο της κατασκευής 16S rrna βιβλιοθηκών κλώνων από το S. officinalis. 5. Ευχαριστίες Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το έργο Αριστεία του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε (Επιχειρησιακό σχέδιο ), από το οποίο χορηγήθηκε υποτροφία στην πρώτη συγγραφέα για την εκπόνηση Διδακτορικής Διατριβής. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25 (17): Cervino, J.M., Winiarski-Cervino, K., Polson, S.W., Goreau, T., & Smith, G.W., Identification of bacteria associated with a disease affecting the marine sponge Ianthella basta. New Britain, Papua New Guinea. Mar Ecol Prog Ser, 324: Garren, M., Smriga, S. & Azam, F., Gradients of coastal fish farm effluents and their effect on coral reef microbes. Environmental Microbiology, 10 (9): Hentschel, U., Hopke, J., Horn, M., Friedrich, A.B., Wagner, M., Hacker, J. & Moore, B.S., Molecular Evidence for a Uniform Microbial Community in Sponges from Different Oceans. Appl. Environ. Microbiol, 68 (9): Hall, B.G., BioEdit: A Biological Sequence Alignment Editor for Windows 95/98/NT. Hooper, & Van Soest, Systema Porifera: a guide to the classification of sponges.(eds) Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY. Kefalas, E., Castritsi-Catharios, J., & Miliou, H., Bacteria associated with the sponge Spongia officinalis as indicators of contamination. Εcological Indicators, 2 (4): Kumar, S., Dudley, J., Nei, M & Tamura, K., MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Brief. Bioinform., 9 (4):

6 9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, Proceedings, Volume ΙΙ Maniatis, Fritsch & Sambrook, /Molecular Cloning: A Laboratory Manual/. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. Olson, J.B., Gochfeld, D.J. & Slattery, M., Aplysina red band syndrome: a new threat to Caribbean sponges. Dis Aquat Organ, 71(2): Rützler, K., Mangrove sponge disease induced by cyanobacterial symbionts: failure of a primitive immune system? Dis Aquat Organ, 5: Sara, M., & Vacelet, J., Ecologie des Demosponges. vol. 3. Spongiaires p In:/ Traitē de Zoologie/, P.P Grassē (Ed), Paris, Masson. Schirmer, A., Gadkari, R., Reeves, C.D., Ibrahim, F., DeLong, E.F. & Hutchinson, C.R., Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissolute. Appl. Environ. Microbiol. 71 (8), Stabili, L. Licciano, M. Giangrande, A. Longo, C. Mercurio, M. Marzano, C. N.& Corriero, G., Filtering activity of Spongia officinalis var. adriatica (Schmidt) (Porifera, Demospongiae) on bacterioplankton: implications for bioremediation of polluted seawater. Water Res, 40 (16): Taylor, M.W., Radax, R., Steger, D. &. Wagner, M., Sponge-Associated Microorganisms: Evolution, Ecology, and Biotechnological Potential. Microbiol Mol. Biol. Rev., 71 (2): Thiel, V., Leininger, S., Schmaljohann, R., Brummer, F. & Imhoff, J.F., Sponge-specific bacterial associations of the Mediterranean sponge Chondrilla nucula (Demospongiae, Tetractinomorpha). Microb Ecol,.54 (1): Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, D.G., The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic. Acids Res, 25: Webster, N.S., & Hill, R.T., The culturable microbial community of the Great Barrier Reef sponge Rhopaloeides odorabile is dominated by an α-proteobacterium. Mar. Biol. 138 (4): Wilkinson, C. R Net primary productivity in coral reef sponges. Science 219 (4583): Webster, N.S., Cobb, R.E. & Negri, A.P., Temperature thresholds for bacterial symbiosis with a sponge. ISME J, 2 (8): Webster, N.S., Negri, A.P., Webb, R.I. & Hill, R.T., A spongin-boring alpha proteobacterium is the etiological agent of disease in the Great Barrier Reef sponge, Rhopaloeides odorabile. Mar. Ecol. Prog. Ser., 232: