Δρ. Δέσποινα Σ. Λυμπεροπούλου ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 Τεχνικές Μελέτης της Βιοποικιλότητας Ανεξάρτητες της Καλλιέργειας ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ: ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Δρ. Δέσποινα Σ. Λυμπεροπούλου ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΟΤΑΝΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΘΗΝΑ 2010

2 Τι είναι βιοποικιλότητα ;

3 Τι είναι βιοποικιλότητα ; Ως «Βιολογική ποικιλότητα» ορίζεται / εννοείται η ποικιλομορφία που εμφανίζεται ανάμεσα στους ζωντανούς οργανισμούς όλων των ειδών, των χερσαίων, θαλάσσιων και άλλων υδάτινων οικοσυστημάτων και οικολογικών συμπλεγμάτων στα οποία οι οργανισμοί αυτοί ανήκουν. ΕΠΙΠΕΔΑ ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ : (Turner et al. 1999) Γενετικό επίπεδο Επίπεδο των ειδών Επίπεδο οικοσυστήματος Λειτουργική βιολογική ποικιλότητα ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ : Αριθμός των ειδών ενός οικοσυστήματος Σχετική αφθονία των μικροβιακών ειδών Λειτουργικός ρόλος των μικροοργανισμών στο οικοσύστημα

4 ΤΟΜΕΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ α) Παραγωγή Ενέργειας β) Εξυγίανση και Διαχείριση του Περιβάλλοντος γ) Γεωργία-Τρόφιμα δ) Ανθρώπινη Υγεία ε) Βιοτεχνολογία στ) Εξέλιξη Οργανισμών και Οικοσυστημάτων Η έννοια του είδους στους Προκαρυωτικούς Οργανισμούς 1) Το ταξινομικό είδος (taxonomic) 2) Το γενοτυπικό είδος (genotypic) 3) Το ονοματολογικό είδος (terminological) 4) Το πρότυπο του «οικότυπου» (ecotype - ecovar) 5) Η Λειτουργική Ταξινομική Μονάδα (Operational Taxinomic Unit-OTU) ή Φυλότυπος Ο βέβαιος ββ και οριστικός καθορισμός των ειδών των βακτηρίων απαιτεί τόσο πολύ χρόνο, τόση παρατηρητικότητα και κρίση, τόση επιμονή και υπομονή, που δύσκολα μπορεί να βρει κανείς κάτι πιο δύσκολο από αυτό» Otto F. Müller International Journal of Systematic Bacteriology (Cover)

5 Επίπεδα διάκρισης της μικροβιακής ποικιλότητας 1) α-ποικιλότητα / β-ποικιλότητα 2) Ποιοτικές (PD-Phylogenetic Diversity) - ποσοτικές μετρήσεις (δείκτες ς Shannon, Evenness) 3) Μετρήσεις βασιζόμενες στα είδη - μετρήσεις βασιζόμενες στην απόκλιση (φυλογενετική, τοπολογική και ταξινομική απόσταση) Σύγκριση μικροβιακής ποικιλότητας (παραμετρικές, μη παραμετρικές και φυλογενετικές προσεγγίσεις). Δείκτης Shannon-Wienner ή Shannon Weaver ; «το να χάσεις πολύτιμη πληροφορία βασιζόμενος σε έναν αινιγματικό και πιθανόν ακατάλληλο δείκτη μπορεί να θεωρηθεί κακοτυχία, το να χάσεις όμως και το όνομά του φαίνεται να είναι καθαρή απροσεξία» (Hill και συνεργάτες 1999)

6 ΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΥΠΑΡΧΟΥΝ ΠΑΝΤΟΥ Ανάγκη κατανόησης ρόλου μικροοργανισμών για προσδιορισμό λειτουργικής βιοποικιλότητας οικοσυστημάτων ΓΝΩΡΙΖΟΥΜΕ ΜΟΝΟ ΤΟ 5 % ΤΟΥ ΣΥΝΟΛΟΥ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΚΑΙ ΕΧΟΥΜΕ ΜΕΛΕΤΗΣΕΙ ΜΟΝΟ ΤΟ 1 %... ;;; Currently no methods available, or likely available in the foreseeable future, that can determine the identity, richness, and evenness of all microbial species present Griffiths et al., 1997

7 Γιατί χρησιμοποιούμε μεθόδους ανεξάρτητες της καλλιέργειας ; For many bacteria and fungi we do not know the conditions required for their cultivation: The great plate count anomaly (Staley and Konopka, 1985) Ενδιαίτημα καλλιεργούμενοι μικροοργανισμοί ργ μ Θαλασσινό νερό % Τρεχούμενο νερό 025% 0.25 Μεσοτροφικές λίμνες % Στάσιμα νερά % Activated sludge 1-15 % Ίζημα 0.25 % Έδαφος 03% 0.3 Εξαιτίας περιβαλλοντικού stress (UV, θερμοκρασία, αλατότητα) καλλιεργούμενα βακτήρια εισέρχονται σε φάση όπου δεν μπορούν να σχηματίσουν αποικίες σε τρυβλία viable but nonculturable

8 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΠΟΥ ΣΤΗΡΙΖΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΥ DNA ΚΑΙ ΤΟ PCR 1. διαφορική λύση των κυττάρων (Picard και συνεργάτες 1992) 2. απομόνωση και καθαρισμός του DNA (Liesack και συνεργάτες 1991, Tebbe και Vahjen 1993, Ogram και συνεργάτες 1988) 3. επιλογή των μορίων εκκινητών (Rainey και συνεργάτες 1994) 4. συνθήκες του PCR (Meyerhans και συνεργάτες 1990, Cariello και συνεργάτες 1991, Weller και συνεργάτες 1991, Reysenbach και συνεργάτες 1992) DGGE, T-RFLP, dot blot, FISH, SSCP, Cloning

9 DGGE (Ηλεκτροφόρηση ακρυλαμίδης παρουσία παράγοντα σε πήκτωμα αποδιατακτικού Ηλεκτροφόρηση μίγματος μορίων DNA (PCR προϊόντα ίδιου μεγέθους) Πήκτωμα ακρυλαμίδης με κατακόρυφα αυξανόμενη κλίση αποδιατακτικού παράγοντα (φορμαμίδιο ουρία) Τμήματα DNA ίδιου μεγέθους αλλά διαφορετικής νουκλεοτιδικής σύστασης - διακριτή ζώνη (ριβότυπος) Κάθε ριβότυπος αντιστοιχεί σε ένα είδος Ανάλυση DGGE σε δείγματα ριζόσφαιρας (Hueuer και συνεργάτες 1997) πρότυπο ζωνών (ριβοτύπων) για κάθε περιβαλλοντικό δείγμα, όπου ο αριθμός των ζωνώνκαταγράφει το μέγεθος της μικροβιακής ποικιλότητας

10 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ DGGE 1. Είναι δυνατός ο διαχωρισμός μόνο μικρών τμημάτων ενισχυμένων περιοχών του DNA (περίπου ως 500 βάσεις) 2. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις στη βιβλιογραφία, όπου δε διαχωρίζονται αλληλουχίες που διαφέρουν σε δυο ή τρεις βάσεις, σε συγκεκριμένες συνθήκες ηλεκτροφόρησης (Buchholz-Cleven και συνεργάτες 1997, Vll Vallaeys και συνεργάτες 1997) 3. Εκκινητικά μόρια που περιέχουν σε μια θέση περισσότερες της μιας βάσης είναι πιθανόν να δίνουν περισσότερους ριβότυπους (ζώνες) με αποτέλεσμα να υπερεκτιμάται η μικροβιακή ποικιλότητα 4. Ένα μικροβιακό είδος μπορεί να δίνει 1-12 διαφορετικούς ριβότυπους, λόγω της παρουσίας σε περισσότερα του ενός αντίγραφα του γονιδίου που ενισχύεται (κυρίως του 16S rrna γονιδίου) (Nubel και συνεργάτες 1996) 5. Η μέθοδος DGGE αποκαλύπτει κυρίως τις επικρατείς μικροβιακές ομάδες που είναι παρούσες σε ένα φυσικό περιβάλλον. Προκαρυωτικοί πληθυσμοί που βρίσκονται σε ποσοστό μικρότερο του 1% σε σχέση με το σύνολο της μικροβιακής κοινωνίας δεν ανιχνεύονται με τη χρήση ηλεκτροφορητικών τεχνικών (Muyzer & Smalla 1998)

11 SSCP (Πολυμορφισμός διαμόρφωσης μονόκλωνης αλυσίδας) ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ: μια αλλαγή σε μια βάση ενός μονόκλωνου μορίου DNA μπορεί να αλλάξει τη διαμόρφωση του μορίου σε ένα πήκτωμα ακρυλαμίδης Χρησιμοποιούνται μόρια 16S rdna, που ενισχύονται με τη διαδικασία του PCR Ακολουθεί αποδιάταξη των δίκλωνων μορίων και ηλεκτροφόρηση σε μη αποδιατακτικό πήκτωμα PAGE Μόρια DNA ίδιου μεγέθους και διαφορετικής σύστασης σε βάσεις δίνουν διαφορετικά πρότυπα κατά την ανάλυση SSCP Η μέθοδος χρησιμοποιείται για διαχωρισμό στελεχών, αλλά και για ανάλυση περιβαλλοντικού DNA

12 Τ-RFLP Μέθοδος εκτίμησης της μικροβιακής ποικιλότητας που στηρίζεται σε ανάλυση προτύπου Τα εκκινητικά μόρια που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση του περιβαλλοντικού DNA είναι σημασμένα με φθορίζοντα μόρια Γράφημα T-RFLP από δυο διαφορετικά δείγματα (Lukow και συνεργάτες 2000) Ακολουθεί πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες που αναγνωρίζουν περιοριστικές θέσεις 4 βάσεων Τα προϊόντα της πέψης ηλεκτροφορούνται ρ σε πήκτωμα ακρυλαμίδης και ακολουθεί ανάλυση των αποτελεσμάτων σε αυτόματη συσκευή ανάλυση αλληλουχίας Γράφημα T-RFLP από 4 διαφορετικά οικοσυστήματα (Liu και συνεργάτες 1997)

13 FISH (Eπιτόπια υβριδοποίηση με φθορίζοντα μόρια ανιχνευτές) ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ : ολιγονουκλεοτίδια - ανιχνευτές που στοχεύουν στο 16S rrna. Διαφορική χρώση μικροβιακών ομάδων (διάκριση από επίπεδο γένους έως και επίπεδο είδους) η οποία στηρίζεται στον υβριδισμό ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών, σημασμένων με φθορίζον μόριο Τα κύτταρα ανιχνεύονται απευθείας στα φυσικά τους μικροπεριβάλλοντα Είναι δυνατόν να καθορισθεί η μορφολογία του κυττάρου, η αφθονία του αλλά και η κατανομή του στο χώρο in situ - (φυλογενετική ταυτότητα, αριθμός και χωροταξική κατανομή των μικροοργανισμών στο περιβαλλοντικό δείγμα). Με ποσοτικοποίηση του σήματος μπορεί να πραγματοποιηθεί εκτίμηση των ρυθμών αύξησης των βακτηριακών κυττάρων in situ. FISH σε κύτταρα Αρχαίων Προκαρυωτικών Οργανισμών και θειοαναγωγικών βακτηριών. Με κόκκινο χρώμα φαίνονται οι Αρχαίοι Προκαρυωτικοί Οργανισμοί και με πράσινο χρώμα φαίνονται τα θειοαναγωγικά βακτήρια (Boetius και συνεργάτες 2000) Kυτταρομετρία ροής

14 Κλωνοποίηση περιβαλλοντικού DNA «μεταγονιδιωματική μεταγονιδιωματική» (metagenomics metagenomics) ή «περιβαλλοντική γονιδιωματική» ή «οικογονιδιωματική» (ecogenomics) ή «γονιδιωματική κοινοτήτων» (community genomics) θεωρείται ηπιο αξιόπιστη μέθοδος για τη μελέτη ενός οικοσυστήματος ο αριθμός των κλώνων που εξετάζονται εξαρτάται από τη μικροβιακή ποικιλότητα του υπό μελέτη περιβάλλοντος (Στατιστικές ς μέθοδοι που χρησιμοποιούν ένα αλγόριθμο συσχετισμού των κλώνων που εξετάζονται και των διαφορετικών αλληλουχιών (φυλοτύπων) που αναλύονται είναι απαραίτητες, ώστε τα αποτελέσματα να είναι στατιστικά σημαντικά) η εφαρμογή της θεωρείται σταθμός στη Μικροβιακή Οικολογία

15 Ανάλυση μικροβιακών κοινοτήτων με κλωνοποίηση και αλληλούχηση των PCR προϊόντων απευθείας από περιβαλλοντικό DNA Απομόνωση DNA Ενίσχυση 16S rdna Κλωνοποίηση προϊόντων PCR (pcr -XL-TOPO ) Bacteria: 8F, R1378 Cyanobacteria: CYA-359F, CYA-781R Archaea: ARC-344F, ARC- 915R Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από τις κατάλληλες αποικίες Αλληλούχιση αντιπροσωπευτικών κλώνων Έλεγχος του μεγέθους της βιβλιοθήκης με κατάλληλους αλγόριθμους Ανάλυση των DNA αλληλουχιών με BLAST

16 2007 B07-Coverage (Good's C) 0, ,70 0,60 A07-Coverage (Good's C) 0,50 0,40 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 45/88 K07-Coverage (Good's C) 0,30 0,20 0,10 0,00 42/83 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 Library size 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 Library size 0,60 0, ,40 0,30 0,20 0,10 47/79 VE07-Coverage (Good's C) 0,00 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 Library size 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 48/92 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 Library size

17 α Proteobacteria β Proteobacteria γ Proteobacteria Verrucomicrobia ε Proteobacteria Acidobacteria Chloroflexi Actinobacteria Bacteroidetes Cyanobacteria Planctomycetes Firmicutes Unaffiliated

18 α-πρωτεοβακτήρια

19 α-πρωτεοβακτήρια

20 Γενικά Συμπεράσματα... Κυριότερη βακτηριακή ομάδα αυτή των Ακτινοβακτηρίων - ομοιόμορφη κατανομή στα α- και β-πρωτεοβακτηρία - Εξίσου σημαντική η ομάδα των Bacteroidetes Παρουσία κλώνων Κυανοβακτηρίων χρονικά και τοπικά σταθερών, σε όλο το εύρος της λίμνης, μεταξύ των οποίων και δυνητικά τοξικοί κλώνοι του γένους Microcystis. Παρατηρήθηκε σχετική κυριαρχία των Crenarchaeota έναντι των Euryarchaeota. Οι βιβλιοθήκες των αρχαίων σπάνια είναι τόσο μεγάλες όσο οι αντίστοιχες των βακτηρίων της ίδιας οικοθέσης, εύρημα το οποίο φαίνεται να σχετίζεται με τον οικολογικό ρόλο αυτών των ομάδων.

21

22 Περιορισμοί και προβλήματα της Μοριακής Μικροβιακής Οικολογίας 1. Απομόνωση DNA από περιβαλλοντικά ρβ δείγματα 2. Επιλογή εκκινητικών μορίων 3. Ερμηνεία των πειραματικών δεδομένων που αφορούν στη μικροβιακή ποικιλότητας

23 Απομόνωση DNA από περιβαλλοντικά ρβ δείγματα Το DNA που θα χρησιμοποιηθεί στη μελέτη πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό των μικροβιακών ομάδων που υπάρχουν στο δείγμα Η λύση των μικροβιακών κυττάρων να είναι εξίσου αποτελεσματική για όλες τις ταξινομικές μονάδες που υπάρχουν στο δείγμα, ώστε να υπάρχει μια αντιπροσωπευτική κατανομή των μικροβιακών κοινωνιών στο απομονωμένο DNA Επειδή το DNA που απομονώνεται από περιβαλλοντικά δείγματα περιέχει Επειδή το DNA που απομονώνεται από περιβαλλοντικά δείγματα περιέχει συνήθως παρεμποδιστές του PCR (π.χ. χουμικά οξέα), το βάρος πέφτει κυρίως στην αριστοποίηση της απόδοσης των πρωτοκόλλων απομόνωσης DNA

24 Απομόνωση DNA από περιβαλλοντικά δείγματα Traditional protocol Crude 2-step Ultra clean Gene clean MOBIO BIO101

25 Επιλογή εκκινητικών μορίων Σε μια ιδανική περίπτωση τα εκκινητικά μόρια θα έπρεπε να ήταν απολύτως συμπληρωματικά με όλα τα γονίδια 16S rrna των Βακτηρίων και των Αρχαίων Προκαρυωτικών Οργανισμών. Baker και συνεργάτες (2003): Έλεγχος εξειδίκευσης καθολικών εκκινητικών μορίων σε σχέση με τις βακτηριακές αλληλουχίες που είναι κατατεθειμένες στη Βάση Δεδομένων Ριβοσωμικών Αλληλουχιών (RDP) Τα αποτελέσματα της παραπάνω μελέτης έδειξαν ότι τα εκκινητικά μόρια δεν παρουσιάζουν συμπληρωματικότητα με αρκετές βακτηριακές αλληλουχίες Παρόμοια αποτελέσματα κατεγράφησαν και για καθολικά εκκινητικά μόρια που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση Αρχαίων Προκαρυωτικών Οργανισμών

26 Γιατί τα καθολικά εκκινητικά μόρια δεν είναι τελικά καθολικά ; 1. 16S rrna είναι πολύ συντηρημένο μόριο εντούτοις εμφανίζει ετερογένεια. 2. Μεγάλο ποσοστό των αλληλουχιών 16S rrna είναι μερικώς χαρακτηρισμένο, οπότε η γνώση μας για την ετερογένεια του γονιδίου περιορίζεται σημαντικά, κυρίως όσον αφορά τις περιοχές στα άκρα

27 Ερμηνεία των πειραματικών δεδομένων που αφορούν στη μικροβιακή ποικιλότητας Οι μοριακές τεχνικές δεν μπορούν να μας αποκαλύψουν ούτε τον ακριβή αριθμό των ειδών που υπάρχουν σε ένα οικοσύστημα ούτε μπορούν να δώσουν βέβαια αποτελέσματα σχετικά με τη σχετική αφθονία των μικροοργανισμών σε μια περιοχή. Δίνουν όμως μια εικόνα της μικροβιακής κοινωνίας και του ρόλου κάθε ομάδας. Πρέπει να είναι απολύτως κατανοητοί οι περιορισμοί των μεθόδων που χρησιμοποιούνται,κυρίως για τις μεθόδους προτύπων Οι μελέτες περιβαλλοντικών δειγμάτων που έχουν ως βάση την αντίδραση Οι μελέτες περιβαλλοντικών δειγμάτων που έχουν ως βάση την αντίδραση PCR εμφανίζουν ορισμένους περιορισμούς, καθώς μόνο τα κυρίαρχα είδη μιας περιοχής ενισχύονται.

28 Ερμηνεία των πειραματικών δεδομένων που αφορούν στη μικροβιακή ποικιλότητας Πληθυσμοί οι οποίοι βρίσκονται σε ποσοστό μικρότερο του 1 % σε σχέση με το σύνολο του μικροβιακού πληθυσμού ενός δείγματος, συνήθως δεν εμφανίζονται σε αναλύσεις DGGE, ή T- RFLP ακόμα και σε περιπτώσεις ύπαρξης μεγάλου αριθμού κύτταρων π.χ κύτταρα / γραμμάριο δείγματος. Οι μοριακές μέθοδοι δεν μας δίνουν ένα αξιόπιστο αποτέλεσμα του αριθμού των ειδών που υπάρχουν σε ένα δείγμα

29 Ερμηνεία των πειραματικών δεδομένων που αφορούν στη μικροβιακή ποικιλότητας Σε τεχνικές όπως το DGGE το μέγεθος της μικροβιακής ποικιλότητας προκύπτει από τον αριθμό και την ποικιλία των ριβοτύπων που εμφανίζονται σε ένα ηλεκτροφόρημα. Οι διαφορές στα πρότυπα των ηλεκτροφορημάτων ερμηνεύονται σε διαφορές της μικροβιακής ποικιλότητας, ενώ μπορεί να αντικατοπτρίζουν διαφοροποιήσεις σε επίπεδο μόνο αφθονίας ταξινομικών ομάδων Οι αριθμοί των ταξινομικών ομάδων που βρίσκονται σε αφθονία να μειώνονται, γεγονός που σηματοδοτεί την παράλληλη αύξηση του ποσοστού ταξινομικών ομάδων χαμηλής πυκνότητας, ώστε να ξεπεράσουν το όριο ανίχνευσης της μεθόδου.

30 Η ανάλυση της δομής των μικροβιακών κοινωνιών, με συνδυασμό μεθόδων που περιλαμβάνουν καλλιέργεια και μοριακών μεθόδων, είναι απαραίτητη για την καταγραφή της μικροβιακής ποικιλότητας. Εν τούτοις μια τέτοια μελέτη είναι στατική και χωρίς ιδιαίτερη οικολογική σημασία, αν δε συνδυάζεται από γεωχημικές αναλύσεις, και αν δεν υπάρχουν συγκριτικά στοιχεία από διάφορες χρονικές περιόδους, ώστε να φαίνεται η απόκριση των μικροβιακών κοινωνιών στις μεταβαλλόμενες κλιματολογικές συνθήκες. Συνδυασμός μόνο τέτοιων μελετών μπορεί να αποκαλύψει τον οικολογικό και λειτουργικό ρόλο κάθε μικροβιακής ομάδας στο οικοσύστημα καθώς και τις αλληλεπιδράσεις τόσο μεταξύ τους, όσο και με τους αβιοτικούς παράγοντες του οικοσυστήματος.