Παραδοτέα Π.Ε Ιδρυματικό Υπεύθυνος Καθηγητής κ. Χρυσάφη Χαρτώνα. Επιστημονικός Υπεύθυνος Καθηγητής κ. Ηλίας Αναστασόπουλος

Transcript

1 «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΑΠΟΣΤΑΓΜΑΤΩΝ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ ΡΙΓΑΝΗΣ ΣΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗ ΜΕΙΩΣΗ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥΣ (ΖΩΟΠΛΑΓΚΤΟΝ)» Παραδοτέα Π.Ε Ιδρυματικό Υπεύθυνος Καθηγητής κ. Χρυσάφη Χαρτώνα Επιστημονικός Υπεύθυνος Καθηγητής κ. Ηλίας Αναστασόπουλος

2 ΠΕ4 «ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΚΛΩΝΩΝ ΦΥΤΩΝ ΡΙΓΑΝΗΣ» ΠΑΡΑΔΟΤΕΑ 3. Ανάπτυξη κατάλληλου πρωτοκόλλου RAPD-PCR, και SSRs στη ρίγανη Διάρκεια Υπολοποίησης πακετου εργασιας: 1/7/ /10/2015. Παραδοτεο Ανάπτυξη κατάλληλου πρωτοκόλλου RAPD-PCR, και SSRs στη ρίγανη Εισαγωγή: Μετά την απομόνωση DNA 23 φυτά ρίγανης έγινε μοριακή ανάλυση RAPD-PCR, και SSRs. κατά Πρωτοκόλλο RAPD-PCR Αντιδράσεις PCR Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε ένα μείγμα 20 μl που περιείχε: 0,5 μl γονιδιωματικό DNA, 1x ρυθμιστικό διάλυμα PCR (KapaTaq), 10,20, 100 pm από κάθε εκκινητή (20 pm για τον αρνητικό μάρτυρα,η2ο), 200 μμ dntps και 1 U θερμοσταθερή DNA πολυμέραση (KapaTaq). Οι εκκινητές (Eurofins Genomics, France) που τελικά χρησιμοποιήθηκαν ήταν: OPA-02 OPA-03 OPA-04 OPA-20 TGCCGAGCTG AGTCAGCCAC AATCGGGCTG GTTGCGATCC

3 Συνθήκες PCR Οι αντιδράσεις έγιναν σε θερμικό κυκλοποιητή MJ Research PTC-100 υπό τις ακόλουθες συνθήκες (πρόγραμμα ORE28092): ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 94 C για 4 λεπτά ακολουθούμενο από 35 κύκλους: i) αποδιάταξης του DNA στους 94 C για 45, ii) υβριδισμού των εκκινητών στη μήτρα DNA στους 35 C για 45 και iii) επέκτασης των νουκλεοτιδικών αλυσίδων στους 72 C για 1. Το πρόγραμμα ολοκληρώθηκε με ένα τελευταίο βήμα επέκτασης των αλυσίδων DNA στους 72 C για 5. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση στα 110V σε πήκτωμα αγαρόζης 1% (Sigma). Οι ζώνες που προέκυψαν απεικονίστηκαν με το σύστημα απεικόνισης Gel Imaging:Doc-Print II (Vilber Lourmat). Τα μοριακά βάρη των ζωνών υπολογίστηκαν συγκρίνοντας δείκτες DNA γνωστού μήκους 100-bp (New England Biolabs). Εικ.1: Α) Τέσσερις διαφορετικοί εκκινητές σε τρίς διαφορετικές ποσότητες 10, 20 και 100 pm ο καθένας. Καταλήξαμε στη επιλογή 20 pm εκκινητή. Στα τρία πρώτα δείγματα συμπεριλαμβάνεται και αρνητικός μάρτυρας (H2O). Στη μέση διακρίνεται ο μάρτυρας μεγέθους. Β) RAPD ανάλυση στην πάνω σειρά των δειγμάτων 1 εώς 15 με τον OPA-04 εκκινητή και μάρτυρα μεγέθους (αριστερά) και στην κάτω σειρά των δειγμάτων 1 έως 16 με τον OPA-20 εκκινητή.

4 Πρωτοκολλο SSR Αντιδράσεις PCR Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για να μελετηθούν οι επιλεχθέντες μικροδορυφορικοί δείκτες (SSR's) αναπτύχθηκαν από τους Novak et al. (2008). Πρόκειται περί μικροδορυφορικών επαναλήψεων που ανιχνεύονται σε εκφραζόμενες DNA αλληλουχίες (ESTs), οι οποίες ενισχύονται από τους παρακάτω εκκινητές όπως φαίνονται μαζί με τα μοτίβα επαναλήψεων στην Εικόνα 2. Εικ.2: Εκκινητές για την ενίσχυση με PCR καθώς και μοτίβα επανάληψης των μικροδορυφορικών δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη.

5 Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε ένα μείγμα 15 μl που περιείχε: γονιδιωματικό DNA, 1x ρυθμιστικό διάλυμα PCR (KapaTaq), 1.5 mm MgCl2, 0.6 μm από κάθε εκκινητή, 100 μμ από κάθε dntp και 0.6 U θερμοσταθερή DNA πολυμέραση (KapaTaq). Οι αντιδράσεις έγιναν σε θερμικό κυκλοποιητή MJ Research PTC-100 υπό τις ακόλουθες συνθήκες: ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 C για 5 λεπτά ακολουθούμενο από 35 κύκλους: i) αποδιάταξης του DNA στους 95 C για 1 λεπτό, ii) υβριδισμού των εκκινητών στη μήτρα DNA στους 59 C για 1 λεπτό και iii) επέκτασης των νουκλεοτιδικών αλυσίδων στους 72 C για 2 λεπτά. Το πρόγραμμα ολοκληρώθηκε με ένα τελευταίο βήμα επέκτασης των αλυσίδων DNA στους 72 C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση στα 110V σε πήκτωμα αγαρόζης 2% (Sigma). Οι ζώνες που προέκυψαν απεικονίστηκαν με το σύστημα απεικόνισης GelDocEZ (BioRad). Τα μοριακά βάρη των ζωνών υπολογίστηκαν συγκρίνοντας δείκτες DNA γνωστού μήκους 100-bp και 1-kb (New England Biolabs). Στη συνέχεια προκειμένου να μην υπάρξουν αναστολείς στα επόμενα στάδια της αλληλούχησης και γενοτύπησης των δειγμάτων απομακρύνθηκαν τα υπολείμματα των αντιδράσεων PCR (περίσσεια εκκινητών, άλατα MgCl2, dntps κλπ με την βοήθεια της εμπορικής συσκευασίας PCR clean up kit (Macherey-Nagel). Αλληλούχηση και γενοτύπηση των δειγμάτων Αρχικά αλληλουχήσαμε ορισμένα από τα δείγματα, ώστε να εξετάσουμε κατά πόσον οι εκκινητές ενισχύουν πράγματι μικροδορυφορικές αλληλουχίες και ποιο είναι το ακριβές μοτίβο επανάληψης στο νουκλεοτιδικό επίπεδο. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε 3 δείγματα κλώνων ρίγανης τα οποία μετά την ενίσχυση με PCR αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας το ζεύγος εκκινητών OR09. Η αλληλούχιση έγινε από την εταιρεία VBC Biotech (Austria) χρησιμοποιώντας τη συσκευή αλληλούχησης ABI 3730XL (Applied Biosystems). Οι αλληλουχήσεις έγιναν και προς τις δύο κατευθύνσεις χρησιμοποιώντας δηλαδή τόσο τον πρόσθιο (forward) όσο και τον οπίσθιο (reverse) εκκινητή, ώστε να μην έχουμε απώλεια διαβάσματος βάσεων. Η ενοποίηση και η ευθυγράμμιση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών έγινε χρησιμοποιώντας το υπολογιστικό πακέτο προγραμμάτων BioEdit. H γενοτύπηση των δειγμάτων έγινε χρησιμοποιώντας εκκινητές σημασμένους με ειδικές χρωστικές φθορισμού (FAM, HEX, ROX, TAMRA). Η ηλεκτροφόρηση των θραυσμάτων μετά από τις αντιδράσεις PCR έγινε στη συσκευή

6 αλληλούχησης ΑΒΙ 3500 (Applied Biosystems) και ο καθορισμός του μεγέθους τους δηλαδή η διάκριση των διαφορετικών αλληλομόρφων κάθε μικροδορυφορικού γενετικού τόπου πραγματοποιήθηκε με το υπολογιστικό πρόγραμμα STRand Στατιστική Ανάλυση Για τον υπολογισμό του αριθμού των αλληλομόρφων ανά γενετικό τόπο, του δείκτη ποικιλότητας του Shannon (Ι), ο οποίος μάλιστα δεν προϋποθέτει ισορροπία του πληθυσμού κατά Hardy-Weinberg (Lewontin 1972) και των συντελεστών γενετικής απόστασης (Nei 1972) χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα POPGENE Η ανάλυση κύριων συντεταγμένων (PCoA) πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα Genalex Οι τιμές των συντελεστών γενετικής απόστασης κατά Nei (1972) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή δενδρογράμματος UPGMA με το πρόγραμμα TFPGA ver Οι δειγματοληπτικές αντιδράσεις PCR χρησιμοποιώντας ορισμένα δείγματα ρίγανης και ζεύγη εκκινητών έδωσαν τα αναμενόμενα αποτελέσματα ως προς το μέγεθος και τον αριθμό των ζωνών όπως φαίνεται στην επόμενη εικόνα. Εικ. 3: PCR αντιδράσεις συγκεριμένων δειγματων φυτών ρίγανης μετά από αντίδρασεις PCR με τους εκκινητές OR09, OR10, OR12. Μετά την αλληλούχηση επιλεγμένων δειγμάτων πήραμε ενδεικτικά τα εξής αποτελέσματα (Εικόνα 4).

7 Εικόνα 4: Νουκλεοτιδική αλληλουχία του μικροδορυφορικού δείκτη OR09 σε άτομο ρίγανης. Στη συνέχεια αφού έγινε η ενοποίηση και ευθυγραμμίση (alignment) των αλληλουχιών DNA που προέκυψαν τόσο με τον πρόσθιο όσο και με τον οπίσθιο εκκινητή χρησιμοποιώντας το υπολογιστικό πακέτο προγραμμάτων BioEdit, προέκυψαν οι πλήρεις αλληλουχίες που εμφανίζονται στην επόμενη εικόνα. Εικ. 5: Σύγκριση της πλήρους αλληλουχίας του μικροδορυφορικού δείκτη OR09 σε τρία δείγματα φυτών ρίγανης.

8 Όπως παρατηρούμε στην εικόνα 5 δεν υπάρχουν διαφορές σε νουκλεοτιδικό επίπεδο μεταξύ των τριών ατόμων για το μικροδορυφορικό δείκτη OR09. Επίσης το μοτίβο επανάληψης προσομοιάζει με την εργασία των Novak et al. (2008). Η γενοτύπηση των δειγμάτων με βάση τα δώδεκα ζεύγη μικροδορυφορικών εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα αποκάλυψε την ύπαρξη διαφορετικών αλληλομόρφων σε κάθε γενετικό τόπο. Στις επόμενες εικόνες παρατίθενται οι γενότυποι που προέκυψαν για ορισμένους μικροδορυφορικούς δείκτες σε συγκεκριμένα άτομα: Εικ. 6: Ομοζυγωτικό άτομο του δείγματος 1 ως προς το αλληλόμορφο 144 του εκκινητή OR09.

9 Εικ. 7: Ετεροζυγωτικό άτομο του δείγματος 17 ως προς τα αλληλόμορφα 115 και 117 του εκκινητή OR12. Οι γενότυποι με βάση το μέγεθος των θραυσμάτων DNA που ανιχνέυθηκαν όλων των ατόμων σε όλους τους γενετικούς τόπους εμφανίζονται στον επόμενο πίνακα:

10 Είναι εμφανές ότι εκτός από τα άτομα 12 και 16 τα οποία εμφανίζουν τον ίδιο γενότυπο και δεν μπορούν να διακριθούν στα υπόλοιπα υπάρχουν αρκετοί διαγνωστικοί δείκτες που επιτρέπουν το πλήρη διαχωρισμό τους και την απόλυτη ταυτοποίησή τους. Ο αριθμός των αλληλομόρφων ανά γενετικό τόπο και ο δείκτης ποικιλότητας του Shannon (Ι) παρουσιάζονται στον επόμενο πίνακα.

11 Οι συντελεστές γενετικής απόστασης κυμαίνονται από 0 (μεταξύ 12 και 16) έως 1,79 (μεταξύ των δειγμάτων 11 και 15 με το δείγμα 24).

12 Πίνακας: Συντελεστές γενετικής απόστασης D κατά Nei (1972). Η ανάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) έδειξε ότι τα δείγματα που αναλύθηκαν ομαδοποιούνται κυρίως σε τρεις μεγάλες ομάδες. Η μία περιλαμβάνει τρία δείγματα O. onites, στα δεξιά της Εικόνας 8, ενώ η μεγάλη ομάδα αριστερά της ίδιας εικόνας περιλαμβάνει δείγματα O. vulgare. Τέλος η μικρότερη ομάδα, περιλαμβάνει δείγματα O. vulgare και O. marjoram. Εικ. 8 Ανάλυση κυρίων συντεταγμένων PCoA με βάση τους μοριακούς δείκτες Παρόμοια ομαδοποίηση εμφανίζεται και στο δενδρογράμμα UPGMA με βάση το συντελεστή γενετικής απόστασης του Nei (1972).

13 Εικ 9: Δενδρόγραμμα UPGMA με βάση το συντελεστή γενετικής απόστασης κατά Nei (1972). Στη συνέχεια έγινε ανάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) τόσο με βάση τη σύσταση του ριγανελαίου όσο και με βάση τα αποτελέσματα της μοριακής ανάλυσης με δείκτες SSR σε συγκεκριμένους γενοτύπους που παρουσίαζαν μεγάλο ενδιαφέρον από πλευράς χημικής σύστασης και αντιμικροβιακών ιδιοτήτων του ριγανέλαιου. Η ανάλυση PCoA με βαση τα χημειοτυπικά χαρακτηριστικά επίσης έδειξε ότι οι γενότυποι ομαδοποιούνται κυρίως σε τρεις ομάδες.

14 Εικ. 10: Aνάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) με βάση τη σύσταση του ριγανελαίου (προσαρμογή απο Stefanakis et al 2013, όπου αναφέρονται οι κωδικοί 3,4,5,6,7 και 8, οι οποίοι αντιστοιχούν στους 15,22,12,19,25 και 20 της παρούσας εργασίας). Αντίστοιχη ομαδοποίηση προκύπτει για τους γενότυπους αυτούς και με βάση τους μοριακούς δείκτες SSR Εικ. 11:. Aνάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) με βάση τη χρήση δεικτών SSR.

15 Με βάση τη γενοτυπική σύσταση είναι εύκολο να διακριθούν οι γενότυποι αυτοί μεταξύ τους καθώς έχουν προκύψει αρκετοί διαγνωστικοί δείκτες με διακριτά διαγνωστικά πρότυπα που τους διαχωρίζουν. Για να πραγματοποιηθεί όμως απόλυτη διάκριση με το σύνολο των δειγμάτων που αναλύθηκαν θα χρειαστεί να αναλυθούν περισσότεροι ή και διαφορετικού τύπου μοριακοί δείκτες οι οποίοι ενισχύουν αλληλουχίες με μεγαλύτερη ποικιλότητα σε πιο εκτεταμένες περιοχές του γονιδιώματος. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δεδομένα που παρουσιάστηκαν σε προηγούμενες αναφορές της ερευνητικής μας ομάδας, αποδεικνύουν ότι ριγανέλαιο απο τα δείγματα 1, 15 και 20 μπορεί να μειώσει τη δράση βακτηριακών στελεχών της ομάδας Vibrio και επομένως να χρησιμοποιηθεί στην απολύμανση τροχοζώων Brachionus plicatilis που χρησιμοποιούνται ως ζωντανή τροφή σε ψάρια [8], [9]. Στη παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε μοριακή αναλυση 25 γενοτύπων ρίγανης με χρήση μικροδορυφορικών DNA δεικτών (SSRs). Με βάση αυτοί οι γενότυποι ομαδοποιήθηκαν σε τρεις κύριες ομάδες και προέκυψαν αρκετοί διαγνωστικοί δείκτες οι οποίοι διαχωρίζουν τα δέιγματα αυτά μεταξύ τους. Για ορισμένους από τους γενοτύπους αυτούς συσχετίσθηκαν οι χημειοτυπικές αναλύσεις με την ανάλυση μοριακών δεικτών και προέκυψαν παρόμοιες ομαδοποιήσεις. Χρειάζονται περισσότερες αναλύσεις προκειμένου να βρεθούν μοναδικά DNA προφίλ για τη ταυτοποίηση των συγκεκριμένων δειγμάτων που παρουσιάζουν μεγαλύτερο ενδιαφέρον. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ [1] Vokou D. et. al. (1993). Geographic Variation of Greek Oregano (Origanum vulgare ssp. hirtum) Essential Oils. Biochemical Systematics and Ecology, 21: [2] Kokkini, S. et. al. (1993). The Hybrid Origanum intercedens from the Island of Nisyros (SE Greece) and its Parental Taxa; Comparative Study of Essential Oils and Distribution. Biochemica/Systematics and Ecology, 21: [3] Sivropoulou A. et. al. (1996) Antimicrobial and Cytotoxic Activities of Origanum Essential Oils. J. Agric. Food Chem. 44:

16 [4] Kokkini, S. et. al. (2004). Essential Oil Composition of Greek (Origanumvulgare ssp. hirtum) and Turkish (0. onites) Oregano :a Tool for Their Distinction. J. Essent. Oil Res., 16: [5] Burt SA and Reinders RD. (2003). Antibacterial activity of selected plant essential oils against Escherichia coli O157:H7. Lett Appl Microbiol. 36: [6] Dorman HJ and Deans SG (2000).Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol.88: [7] Claire Yew, Y.C. (2008). Improving aquaculture production through better health and disease prevention the natural way. Feed technology update. Vo.3. Iss.1 [8] Stefanakis M.K, Touloupakis E., Anastassopoulos E., Ghanotakis D., Katerinopoulos H.E., Makridis P. (2013). Antibacterial activity of essential oils from plants of the genus Origanum. Food Control 34: [9] Stefanakis, M. K., Anastasopoulos, E., Katerinopoulos, H. E., & Makridis, P. (2014). Use of essential oils extracted from three Origanum species for disinfection of cultured rotifers (Brachionus plicatilis). Aquaculture Research, 45(11), [10] Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: [11] Novak, J., Lukas, B., Bolzer, K., Grausgruber-Gröger, S., & Degenhardt, J. (2008). Identification and characterization of simple sequence repeat markers from a glandular origanum vulgare expressed sequence tag. Molecular Ecology Resources, 8(3), [12] Nei M. Interspecific gene differences and evolutionary time estimated from electrophoretic data on protein identity. Amer. Naturalist 105:385-98, 1971.