15 o Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων ΠΡΑΚΤΙΚΑ

Transcript

1 15 o Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων ΠΡΑΚΤΙΚΑ Θεσσαλονίκη Οκτωβρίου 2013

2 15 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων Θεσσαλονίκη 2013 Πρώτη έκδοση 2013 Τυπώθηκε στη Θεσσαλονίκη από τις Εκδόσεις Γιαχούδη ISBN (έντυπη μορφή) ISBN (ηλεκτρονική μορφή) Οι εργασίες να αναφέρονται ως: Αδαμίδου Α, Καλλιανιώτης Α, Κάρλου- Ρήγα Κ (2013) Γεωγραφική κατανομή των αλιευτικών εργαλείων και καθορισμός εξειδικευμένων αλιευτικών δραστηριοτήτων της παράκτιας αλιείας στις ελληνικές θάλασσες. Πρακτικά Πανελλήνιου Συνεδρίου Ιχθυολόγων 15: 9-12 Articles should be cited as: Adamidou A, Kallianiotis A, Karlou- Riga K (2013) Geographical distribution of fishing gears and identification of métiers in small- scale fisheries throughout the Hellenic seas. Proceedings of the Hellenic Conference of Ichthyologists 15: 9-12 ii

3 15 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων Θαλάσσια οικοσυστήματα και Αλιεία Γενετική ταυτοποίηση ενός ατόµου του είδους Terapon theraps (Pisces: Terapontidae) µε τη χρήση µιτοχονδριακών δεικτών Αναστασία Ιµσιρίδου, Γεώργιος Μίνος Αλεξάνδρειο Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυµα Θεσσαλονίκης, Τµήµα Τεχνολογίας Αλιείας και Υδατοκαλλιεργειών, T.Θ. 157, 63200, Νέα Μουδανιά, Χαλκιδική ABSTRACT Anastasia Imsiridou, George Minos: Genetic identification of a Terapon theraps individual (Pisces: Terapontidae) with mitochondrial markers The Indo-Pacific largescaled terapon, Terapon theraps Cuvier, 1829 (Terapontidae), is reported on the basis of an alive specimen, in the inshore area of Thermaikos Gulf (Ν. Aegean Sea). A DNA methodology was developed in order to identify this Terapon individual, based on the Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification and sequencing analysis of two mitochondrial genes: COI and 16S rrna. The analyzed nucleotide sequence of the COI gene was 670 bp in size and the analyzed nucleotide sequence of the 16S rrna gene was 578 bp. The mitochondrial COI gene could not identify precisely the Terapon individual, as the COI sequence revealed a 100% percentage of maximum identity with both T. theraps and T. jarbua. On the contrary, the 16S rrna gene could identify our specimen as the nucleotide sequence revealed a 99% percentage of maximum identity with T. theraps and a 91% percentage of maximum identity with T. jarbua. Keywords: Terapon, COI, 16S rrna, genetic identification ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η οικογένεια Terapontidae περιλαµβάνει 16 γένη και περίπου 48 είδη ψαριών (Nelson 2006), τα οποία ζουν σε αλµυρά, υφάλµυρα και γλυκά νερά. Η εξάπλωση τους περιλαµβάνει τον Ινδικό Ωκεανό, τον Ειρηνικό Ωκεανό και την Ερυθρά Θάλασσα. Το είδος Terapon jarbua Forsskål, 1775 πρόσφατα βρέθηκε στη Μεσογειακή ακτή του Ισραήλ (Golani & Appelbaum- Golani 2010), αυξάνοντας έτσι τον αριθµό των Λεσεψιανών µεταναστών που ανήκουν στην οικογένεια Terapontidae στα εξής τέσσερα: Pelates quadrilineatus Bloch, 1790, Terapon puta Cuvier, 1829, Terapon jarbua και Terapon theraps, Cuvier, Η πρώτη αναφορά του είδους T. theraps στη Μεσόγειο έγινε στην Αδριατική Θάλασσα (Lipej et al. 2008), πολύ µακριά από την τυπική του εξάπλωση. Αν και η οικογένεια Terapontidae περιλαµβάνει είδη που ζουν στις ακτές, το είδος T. theraps παραµένει πολύ σπάνιο στην ανατολική Μεσόγειο. Η πρώτη αναφορά για ένα ζωντανό άτοµο του είδους T. theraps στον Ελλαδικό χώρο έγινε στη περιοχή της Χαλκιδικής, Θερµαϊκός κόλπος (Minos et al. 2012). Ο στόχος της παρούσας εργασίας είναι η γενετική ταυτοποίηση του ανωτέρω ατόµου µε τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) και της ανάλυσης πρωτοδιάταξης δύο γονιδίων του µιτοχονδριακού DNA: α) του γονιδίου που κωδικοποιεί για την υποµονάδα Ι της κυτοχρωµικής οξειδάσης (COI) β) του γονιδίου που κωδικοποιεί για το 16S ριβοσωµικό RNA (16S rrna). ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στις 10 Σεπτεµβρίου 2008, ένα άτοµο του είδους T. theraps (Εικ. 1) αλιεύτηκε ζωντανό σε δίχτυα (απλάδια), σε βάθος 20 µέτρων, στη παράκτια θαλάσσια περιοχή κοντά στη Νέα Ποτίδαια Χαλκιδικής (Θερµαϊκός κόλπος). Το ολικό µήκος του δείγµατος ήταν 153 mm και το βάρος του 68 γρ. Η θερµοκρασία του νερού µετρήθηκε στους 20 o C και η αλατότητα βρέθηκε 36,5. Το δείγµα αποθηκεύτηκε στην Ιχθυολογική συλλογή του Αλεξάνδρειου Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύµατος Θεσσαλονίκης, η οποία βρίσκεται στο Τµήµα Τεχνολογίας Αλιείας και Υδατοκαλλιεργειών (Νέα Μουδανιά, Χαλκιδική). 73

4 ο 15 Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων Θαλάσσια οικοσυστήματα και Αλιεία Ελήφθη µυϊκός ιστός από το δείγµα και ακολούθησε αποµόνωση ολικού DNA, σύµφωνα µε τους Hillis et al. (1996). Στη συνέχεια έγινε ενίσχυση του µιτοχονδριακού γονιδίου COI µε την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR), σύµφωνα µε τους Ward et al. (2005). Ακολούθησε ενίσχυση του 16S rrna γονιδίου σύµφωνα µε τους Imsiridou et al. (2011). Εικόνα 1. Άτοµο Terapon theraps µήκους 15,3 cm που αλιεύτηκε στη Νέα Ποτίδαια Χαλκιδικής (Θερµαϊκός κόλπος). Figure 1. A Terapon theraps individual of total length 15.3 cm that was fished in Nea Potidea (Chalkidiki, Thermaikos Gulf). Τα προϊόντα της ενίσχυσης ελέγχθηκαν µε τη τεχνική της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης, χρώση µε βρωµιούχο εθίδιο και στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία. Έγινε ανάλυση της πρωτοταγούς δοµής στο σύστηµα 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems). Οι νουκλεοτιδικές ακολουθίες αναλύθηκαν µε τη χρήση των πακέτων Clustal X (Thompson et al. 1997) και BioEdit (Hall 1999). Τέλος, οι ακολουθίες κατατέθηκαν στη διεθνή βάση δεδοµένων GenBank (accession numbers: JF340158, KC690138). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης ελέγχθηκαν µε τη βοήθεια του µοριακού µάρτυρα 100 bp DNA ladder, και ήταν περίπου 700 ζεύγη βάσεων για το γονίδιο COI και 600 ζεύγη βάσεων για το γονίδιο 16S rrna. Οι ακολουθίες των µιτοχονδριακών γονιδίων που αναλύθηκαν ήταν 670 ζεύγη βάσεων για το γονίδιο COI και 578 ζεύγη βάσεων για το γονίδιο 16S rrna. Για να γίνει µια αξιόπιστη ταυτοποίηση του δείγµατος, έγινε αρχικά εισαγωγή της ακολουθίας του γονιδίου COI που αναλύθηκε, στη παγκόσµια βάση ταυτοποίησης Barcode of Life Data Systems (BOLD, (Ward et al. 2005, Ratnasingham & Hebert 2007). Πρόκειται για ένα σύστηµα γενετικής ταυτοποίησης των ειδών, µε τη χρήση της ακολουθίας του µιτοχονδριακού γονιδίου που κωδικοποιεί για τη κυτοχρωµική οξειδάση (COI). Με βάση τα αποτελέσµατα, η αλληλουχία που αναλύθηκε αντιστοιχεί σε δύο είδη, τα T. theraps και T. jarbua µε ποσοστό οµολογίας 100% στο καθένα (Εικ. 2). Συνεπώς δεν ήταν δυνατή µια πρώτη ταυτοποίηση του δείγµατος µας µε το συγκεκριµένο σύστηµα αναγνώρισης. Στη συνέχεια εισήγαµε την ακολουθία του γονιδίου COI στη µηχανή αναζήτησης Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, και τα αποτελέσµατα ήταν παρόµοια, καθώς η ακολουθία µας έδωσε ένα ποσοστό µέγιστης οµοιότητας 100% µε το είδος T. jarbua (GenBank: EF , EF ) και ένα ποσοστό µέγιστης οµοιότητας 99% µε το είδος T. theraps (GenBank: JF494667, JF494668, EU871699, EU871698). Συνεπώς και µε τη συγκεκριµένη µηχανή αναζήτησης, δεν ήταν δυνατή η ακριβής ταυτοποίηση του δείγµατός µας µε το γονίδιο COI. 74

5 20 15 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων Θαλάσσια οικοσυστήματα και Αλιεία Εικόνα 2. Αποτελέσµατα αναζήτησης στη γενετική βάση ταυτοποίησης Barcode of Life Data Systems. Figure 2. Search results in the genetic identification database Barcode of Life Data Systems. Identification Summary: Taxonomic Level Taxon Assignment Phylum Chordata 100 Class Actinopterygii 100 Order Perciformes 100 Family Terapontidae 100 Genus Terapon 100 Probability of Placement (%) Similarity Scores of Top 100 Matches: TOP 20 Matches : Display option: Top Phylum Class Order Family Genus Species Similarity (%) Status Chordata Actinopterygii Perciformes Terapontidae Terapon theraps 100 Published Chordata Actinopterygii Perciformes Terapontidae Terapon jarbua 100 Published Chordata Actinopterygii Perciformes Terapontidae Terapon jarbua 100 To γεγονός της ανεπαρκούς ταυτοποίησης µε το γονίδιο COI µπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι: i) η ακολουθία µας παρουσιάζει µεγάλη οµοιότητα µε τις καταχωρηµένες ακολουθίες COI και των δύο ειδών ii) το τµήµα του γονιδίου COI που αναλύθηκε δε παρουσιάζει επαρκή πολυµορφισµό για τη διάκριση των δύο ειδών iii) έχει γίνει κάποιο σφάλµα στην αρχική συστηµατική ταξινόµηση των ατόµων Terapon και στη παραπέρα καταχώρηση των ακολουθιών του γονιδίου COI, στη βάση δεδοµένων Εφόσον τα αποτελέσµατα µε τη χρήση του γονιδίου COI δεν ήταν διαφωτιστικά, έγινε χρήση των αποτελεσµάτων της γενετικής ανάλυσης του γονιδίου 16S rrna. Έγινε εισαγωγή της ακολουθίας του γονιδίου 16S rrna στη µηχανή αναζήτησης BLAST όπου η ακολουθία µας έδωσε ένα ποσοστό µέγιστης οµοιότητας 99% µε το είδος T. theraps (GeneBank: JN ), ενώ το είδος T. jarbua είναι αρκετά αποµακρυσµένο µε ποσοστό µέγιστης οµοιότητας 91% (GeneBank: JQ ). Συνεπώς το γονίδιο που κωδικοποιεί για το 16S ριβοσωµικό RNA µπόρεσε να ταυτοποιήσει επιτυχώς το δείγµα του είδους T. theraps, σε αντίθεση µε το γονίδιο που κωδικοποιεί για τη κυτοχρωµική οξειδάση (COI). Τα αποτελέσµατα από τη γενετική ανάλυση, επιβεβαιώνονται και από τη µορφολογική ανάλυση των ειδών του γένους Terapon. Το δείγµα µας δε µπορεί να ανήκει στο είδος T. jarbua λαµβάνοντας υπόψη τα µορφολογικά του γνωρίσµατα, καθώς το είδος T. jarbua έχει πλευρικά κατά µήκος του σώµατος επιµήκεις σκουρόχρωµες ζώνες που καµπυλώνονται προς την κεφαλή, 75 έως 100 λέπια στη πλευρική γραµµή και 14 έως 16 σειρές λεπιών πάνω από τη πλευρική γραµµή (Fischer & Whitehead 1974, Vari 1984, Golani & Appelbaum-Golani 2010). Το δείγµα µας έχει ευθύγραµµες επιµήκεις ζώνες, 8 σειρές µε λέπια πάνω από τη πλευρική γραµµή, 55 λέπια στη πλευρική γραµµή και είναι 15,3 cm σε µήκος. Συµπερασµατικά λοιπόν, το δείγµα που αλιεύτηκε στη Χαλκιδική σύµφωνα µε τα εξωτερικά µορφολογικά και µεριστικά του γνωρίσµατα καθώς και σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της γενετικής ανάλυσης, ανήκει στο είδος T. theraps. Προτείνεται η χρήση της αλληλουχίας του γονιδίου 16S rrna για επιτυχηµένη αναγνώριση των συγγενικών ειδών. 75

6 15 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιχθυολόγων Θαλάσσια οικοσυστήματα και Αλιεία ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Fischer W, Whitehead PJP (1974) FAO species identification sheets for fishery purposes. Eastern Indian Ocean (fishing area 57) and Western Central Pacific (fishing area 71). Vol. 4, FAO, Rome Golani D, Appelbaum-Golani B (2010) First record of the Indo-Pacific fish the Jarbua terapon (Terapon jarbua) (Osteichthyes: Terapontidae) in the Mediterranean with remarks on the wide geographical distribution of this species. Scientia Marina 74: Hall TA (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: Hillis DM, Moritz C, Mable BK (1996) Molecular Systematics. Sinauer Associates, Sunderland, MA Imsiridou A, Minos G, Gakopoulou A, Katsares V, Karidas T, Katselis G (2011) Discrimination of two picarel species Spicara flexuosa and Spicara maena (Pisces: Centracanthidae) based on mitochondrial DNA sequences. Journal of Fish Biology 78: Lipej L, Mavrič B, Žiža V, Dulčić J (2008) The largescaled terapon Terapon theraps: a new Indo-Pacific fish in the Mediterranean Sea. Journal of Fish Biology 73: Minos G, Imsiridou A, Economidis PS (2012) First record of Terapon theraps (Terapontidae) in the Aegean Sea (Greece). Cybium 36: Nelson JS (2006) Fishes of the world (4 th ed.). John Wiley & Sons, New York Ratnasingham S, Hebert PDN (2007) BOLD: The Barcode of Life Data System ( Molecular Ecology Notes 7: Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997) The CLUSTAL X windows interface: Flexible strategies for multiple alignment aided by quality analysis tool. Nucleic Acids Research 25: Vari RP (1984) Teraponidae. In: Fisher W, Bianchi G (eds) FAO species identification sheets for fishery purposes. Western Indian Ocean; (Fishing Area 51) vols 1-6. FAO, Rome Ward RD, Zemlac TC, Innes BH, Last PR, Hebert PDN (2005) DNA barcoding Australia s fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society B 360: