των ανοσοσφαιρινών σε νεοπλασίες των Β λεμφοκυττάρων»

Transcript

1 Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Διδακτορική Διατριβή «Ανάλυση των αναδιατάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών σε νεοπλασίες των Β λεμφοκυττάρων» Ανδρέας Αγαθαγγελίδης Βιολόγος

2 Aristotle University of Thessaloniki Faculty of Sciences School of Biology Doctoral Dissertation «Analysis of the rearrangements of immunoglobulin genes in B cell neoplasms» Andreas Agathangelidis Biologist 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 8 ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ... 8 Γενικές έννοιες... 8 Επίκτητη ανοσία Προσαρμοστική ανοσία Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Γενικά ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΕΣ Δομή των ανοσοσφαιρινών Λειτουργικός διαχωρισμός του μορίου της ανοσοσφαιρίνης Figure 5: Structural and functional division of the immunoglobulin molecule. In the left diagram the distinction of the immunoglobulin variable region between regions of high varability (CDRs) and low variability (FRs) is depicted Γενετική οργάνωση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας (IGH genetic locus) Γενετικός τόπος της κ ελαφριάς αλυσίδας (IGK genetic locus) Γενετικός τόπος της λ ελαφριάς αλυσίδας (IGL genetic locus) ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Γενικά Αντιγονοανεξάρτητη φάση διαφοροποίησης Μηχανισμοί ελέγχου αυτο-ανοχής στο μυελό των οστών Αντιγονοεξαρτώμενη φάση διαφοροποίησης Το βλαστικό κέντρο ΑΝΤΙΓΟΝΑ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑΣ ΣΤΟΥΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΥΣ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΤΩΝ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ 25 Κατηγορίες και ιδιότητες των αντιγόνων Μοριακή φύση των αντιγόνων Διάκριση αντιγόνων με κριτήρια προέλευσης Διάκριση αντιγόνων ανάλογα με την επαγωγή ανοσοαπόκρισης Υπεραντιγόνα ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΠΟΙΚΙΛΟΜΟΡΦΙΑΣ ΣΤΟΥΣ BCR Γενικά Ανασυνδυασμός V(D)J Ετερογένεια στο συνδυασμό των γονιδίων κάθε αλυσίδας Ετερογένεια στο συνδυασμό βαριάς-ελαφριάς αλυσίδας Ετερογένεια στη σύνδεση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Μηχανισμός της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης (ΣΥΜ) ΠΛΗΘΥΣΜΟΙ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΛΕΜΦΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Πληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια Γενικά Θυλακοειδή Β- λεμφοκύτταρα (FO) Πληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων με ιδιαίτερες λειτουργικές ιδιότητες Β1 Β λεμφοκύτταρα Β λεμφοκύτταρα της οριακής ζώνης (MZ Β cells) ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΑ ΛΕΜΦΙΚΑ ΟΡΓΑΝΑ Γενικά στοιχεία Λεμφαδένες και λεμφικοί ιστοί των βλεννογόνων Σπλήνας ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ (ΧΛΛ) Γενικά Ενεργοποίηση των λευχαιμικών κυττάρων στη ΧΛΛ Μεταβίβαση σήματος μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία «Στερεότυποι» υποδοχείς στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία

4 ΛΕΜΦΩΜΑ ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΟΥ ΜΑΝΔΥΑ Γενικά Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στο λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα Ένα υποσύνολο ασθενών με ΛΜ φέρουν υποδοχείς IG με σωματικές μεταλλάξεις Κλινικές προεκτάσεις από τη μοριακή ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στο ΛΜ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΛΕΜΦΩΜΑ ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΟΥ ΜΑΝΔΥΑ ΟΜΑΔΕΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ, ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΕΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων Απομόνωση γενετικού υλικού Απομόνωση γενωμικού DNA (gdna) Απομόνωση RNA Σύνθεση cdna Ενίσχυση των κλωνικών αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών Καθαρισμός των προϊόντων PCR Καθορισμός της αλληλουχίας των προϊόντων PCR Βιοπληροφορική ανάλυση ανοσογενετικών χαρακτηριστικών Ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών των αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ «ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΙΑΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ VH CDR3 ΣΕ 7596 ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΛΛ: ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ» Ρεπερτόριο γονιδίων της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών IGH Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV Ρεπερτόριο γονιδίων IGHD Ρεπερτόριο γονιδίων IGHJ Επιλεκτικότητα στο επίπεδο συνδυασμού γονιδίων IGHV, IGHD και IGHJ Ανάλυση του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης Συχνότητα «στερεοτυπίας» της περιοχής VH CDR Τύποι «στερεότυπων» αμινοξικών μοτίβων Στερεοτυπία στην περιοχή VH CDR3 παρατηρείται περίπου στο 1/3 των ασθενών με ΧΛΛ Διακριτά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά και ενδείξεις για την προέλευση της ΧΛΛ «Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟ ΛΕΜΦΩΜΑ ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΟΥ ΜΑΝΔΥΑ (ΛΜ): ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ 807 ΑΣΘΕΝΩΝ» Ρεπερτόριο γονιδίων της βαριάς αλυσίδας IGH Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV Ρεπερτόριο γονιδίων IGHD Ρεπερτόριο γονιδίων IGHJ Επιλεκτικότητα στο επίπεδο συνδυασμού γονιδίων IGHV, IGHD και IGHJ Ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης Ανάλυση των σωματικών μεταλλάξεων των αναδιατάξεων Ανάλυση των χαρακτηριστικών και της τοπολογίας των σωματικών μεταλλάξεων Αναζήτηση προτύπων σωματικών μεταλλάξεων Χαρακτηριστικά της περιοχής VH CDR «Στερεοτυπία» της περιοχής VH CDR ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΤΑΞΥ ΧΡΟΝΙΑΣ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ, ΛΕΜΦΩΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΟΥ ΜΑΝΔΥΑ ΚΑΙ ΣΠΛΗΝΙΚΟΥ ΛΕΜΦΩΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΟΡΙΑΚΗΣ ΖΩΝΗΣ Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV Μηχανισμός ΣΥΜ «Στερεοτυπία» της περιοχής VH CDR

5 ΣΥΖΗΤΗΣΗ «ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΙΑΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ VH CDR3 ΣΕ 7596 ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΛΛ: ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ Εισαγωγή Αναθεώρηση των κριτηρίων ταξινόμησης σε «στερεότυπα» υποσύνολα Συχνότητα της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ Τα «στερεότυπα» υποσύνολα στη ΧΛΛ διαθέτουν μοναδικά χαρακτηριστικά Η ανάλυση της «στερεοτυπίας» παρέχει ενδείξεις για την προέλευση της ΧΛΛ Μοριακή κατάταξη των ασθενών με ΧΛΛ με βάση τη «στερεοτυπία» της περιοχής VH CDR3: κλινικές προεκτάσεις «Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟ ΛΕΜΦΩΜΑ ΑΠΟ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΟΥ ΜΑΝΔΥΑ (ΛΜ): ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ 807 ΑΣΘΕΝΩΝ» Εισαγωγή Επιλογή έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων IGHV Η ύπαρξη ενός υποσυνόλου ΛΜ με «μεταλλαγμένα» γονίδια IGHV έρχεται σε αντίθεση με την πιθανή προέλευση της νόσου από παρθένα Β λεμφοκύτταρα Η μελέτη του μηχανισμού ΣΥΜ στο ΛΜ ανέδειξε την ύπαρξη ιδιαίτερων χαρακτηριστικών Η ανάλυση των χαρακτηριστικών της περιοχής VH CDR3 υποδεικνύει την επιλογή των νεοπλασματικών κυττάρων του ΛΜ από αντιγόνο Προεκτάσεις για την προέλευση του ΛΜ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΣΤΕΡΕΟΤΥΠΙΑΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ VH CDR3 ΣΕ 7596 ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ (ΧΛΛ): ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟ ΛΕΜΦΩΜΑ ΤΟΥ ΜΑΝΔΥΑ (ΛΜ): ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ 807 ΑΣΘΕΝΩΝ ABSTRACT STEREOTYPED B CELL RECEPTORS IN ONE-THIRD OF CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (CLL): TOWARDS A MOLECULAR CLASSIFICATION WITH IMPLICATIONS FOR TARGETED THERAPEUTIC INTERVENTIONS A ROLE FOR ANTIGEN SELECTION IN MANTLE CELL LYMPHOMA (MCL): TRACING THE IMMUNOGENETIC EVIDENCE IN A SERIES OF 807 CASES ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

6 Πρόλογος Η μελέτη πραγματοποιήθηκε υπό την επίβλεψη των κ.κ. Πηνελόπης Μαυραγάνη-Τσιπίδου, Αναπληρώτριας Καθηγήτριας του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, Αναστασίας Κουβάτση, Αναπληρώτριας Καθηγήτριας του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, και Μηνά Γιάγκου, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, μελών της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής της διδακτορικής διατριβής. Θα ήθελα να τους ευχαριστήσω θερμά για την καθοδήγηση που μου παρείχαν. Το εργαστηριακό μέρος της διδακτορικής διατριβής εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας της Αιματολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταμόσχευσης Αιμοποιητικών Κυττάρων του ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου» κατά το χρονικό διάστημα Επιθυμώ να ευχαριστήσω θερμά τον Διευθυντή της Κλινικής κ. Αχιλλέα Αναγνωστόπουλο για το ενδιαφέρον του και τη στήριξή του. Η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής θα ήταν αδύνατη χωρίς τη βοήθεια του κ. Κώστα Σταματόπουλου, Αιματολόγου, Επιμελητή και Υπεύθυνου του Εργαστηρίου Κυτταρικής και Μοριακής Βιολογίας. Κυρίως επιθυμώ να τον ευχαριστήσω για τη συμβολή του στην απόκτηση γνώσεων και εμπειρίας καθώς και για την υπομονή του, μέσα από την καθημερινή μας συνεργασία από το 2005, οπότε και έγινα μέλος της επιστημονικής ομάδας στην οποία προΐσταται. Παράλληλα, αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω θερμά την κα. Χρυσούλα Μπέλεση, Βιοπαθολόγο, Διευθύντρια στο Αιματολογικό Τμήμα του ΓΝ Νίκαιας, η οποία με τη μεγάλη εργαστηριακή εμπειρία της συνέβαλε στο σχεδιασμό της μελέτης. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους συνεργάτες της επιστημονικής ομάδας και φίλους μου Δρ. Βασίλη Μπίκο και Αναστασία Χατζηδημητρίου, Βιολόγους, και τους Βιολόγους και υποψήφιους Διδάκτορες Νίκο Παπακωνσταντίνου, Σταυρούλα Ντούφα και Μαρία Γούναρη για τη στήριξή τους, τις συζητήσεις και τα επιστημονικά όνειρα που μοιραστήκαμε. Η βιοπληροφορική επεξεργασία και ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε στο τμήμα Βιοπληροφορικής Επεξεργασίας, του Ινστιτούτου Αγροβιοτεχνολογίας, του Εθνικού Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ,CERTH). Αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω τον κ. Αθανάσιο 6

7 Τσαυτάρη, Διευθυντή του Ινστιτούτου Αγροβιοτεχνολογίας και Καθηγητή του Τομέα Φυτών Μεγάλης Καλλιέργειας και Οικολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, για τη στήριξη που μου παρείχε κατά την παραμονή μου στο Ινστιτούτο. Η βιοπληροφορική ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο της συμμετοχής μου στην Ομάδα Βιοπληροφορικής Ανάλυσης (Bioinformatics Analysis Team, BAT). Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες στον Δρ. Νίκο Δαρζέντα, Επικεφαλής της Ομάδας Βιοπληροφορικής Ανάλυσης, για την πολύτιμη βοήθειά του και την άριστη σχέση μας στη διάρκεια αυτής της συνεργασίας, το Δρ. Αλέξανδρο Μπούσιο και την Εύα Μίγγα για τη βοήθειά τους στην εκπόνηση της διατριβής μου καθώς και στη δημιουργία ενός ευχάριστου κλίματος εργασίας. Τέλος, θέλω να εκφράσω την αγάπη και ευγνωμοσύνη μου στους ανθρώπους του στενού μου περιβάλλοντος. Στην οικογένειά μου και τους φίλους μου που με αγαπούν και με στηρίζουν χωρίς κούραση όλα τα χρόνια της ζωής μου και δε σταματούν να προσπαθούν να με κάνουν καλύτερο άνθρωπο, ακόμα και όταν οι πιθανότητες είναι εναντίον τους. Θεσσαλονίκη, Μαΐος

8 Εισαγωγή Το ανοσοποιητικό σύστημα Γενικές έννοιες Ο οργανισμός του ανθρώπου έχει εξελιχθεί αναπτύσσοντας συστήματα άμυνας που εξασφαλίζουν την έγκαιρη αντιμετώπιση παθογόνων και μη περιβαλλοντικών παραγόντων, επιτυγχάνοντας τη διατήρηση της ομοιόστασής του κι επομένως, την επιβίωσή του. Κάθε δομή που μπορεί να αναγνωριστεί από ένα στοιχείο του ανοσοποιητικού συστήματος αποκαλείται αντιγόνο. Η πρώτη γραμμή άμυνας έγκειται στην παρεμπόδιση της εισόδου περιβαλλοντικών παραγόντων στον οργανισμό, μέσω ανατομικών (δέρμα, βλεννογόνοι, κροσσωτό επιθήλιο της αναπνευστικής οδού) και βιοχημικών φραγμών (γαλακτικό οξύ, γαστρικό υγρό, σίελος). Οι μολυσματικοί παράγοντες που εισέρχονται τελικά στον οργανισμό μπορεί να προκαλέσουν λοιμώξεις ή γενικότερα διαταραχές, η αντιμετώπιση των οποίων επιτυγχάνεται μέσω της δράσης των στοιχείων του ανοσοποιητικού συστήματος. Κύρια λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος είναι η επίτευξη και η διατήρηση της ανοσίας, η οποία περιλαμβάνει την αναγνώριση του παθογόνου και την αντίδραση εναντίον του με σκοπό την εξάλειψή του, ώστε να ελαχιστοποιηθούν οι πιθανές βλάβες. Οι ανοσοαποκρίσεις διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: επίκτητες (innate) και προσαρμοστικές (adaptive). Η διέγερση των μηχανισμών ανοσοαπόκρισης εξαρτάται από τα λευκά αιμοσφαίρια ή λευκοκύτταρα, η συνεργική δράση των οποίων συνιστά ένα αποτελεσματικό σύστημα άμυνας που εξασφαλίζει ότι παρά τη διαρκή επαφή μας με δυνητικά παθογόνους παράγοντες, ο οργανισμός του ανθρώπου νοσεί σχετικά σπάνια και οι λοιμώξεις αντιμετωπίζονται συνήθως με επιτυχία 1,2. Τα λευκοκύτταρα είναι μια ομάδα κυτταρικών πληθυσμών, καθένας από τους οποίους επιτελεί ιδιαίτερη λειτουργία. Η εύρυθμη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος στηρίζεται στη συντονισμένη δράση και αλληλεπίδραση των συγκεκριμένων κυτταρικών πληθυσμών. Τα λευκοκύτταρα προέρχονται από κοινούς κυτταρικούς πρόγονους, τα πολυδύναμα ή αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα που παράγονται στο μυελό των οστών. Από αυτά προέρχονται οι δύο τύποι μητρικών κυττάρων περιορισμένης εξελικτικής εμβέλειας, οι οποίοι είναι οι άμεσοι πρόγονοι όλων των κυτταρικών πληθυσμών του αίματος. Από το προγονικό κύτταρο της μυελικής σειράς προκύπτουν τα κοκκιοκύτταρα και τα μονοκύτταρα/μακροφάγα που αποτελούν τον ένα βασικό 8

9 πληθυσμό λευκοκυττάρων. Ο δεύτερος πληθυσμός είναι τα λεμφοκύτταρα που προκύπτουν από τον κοινό πρόγονο της λεμφικής σειράς και διακρίνονται σε Β, Τ και ΝΚ (natural killer, φυσικοί φονείς) λεμφοκύτταρα (Εικόνα 1). Η επαγωγή του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων προς διακριτούς κυτταρικούς τύπους πραγματοποιείται με τη συμβολή διαφόρων αιμοποιητικών αναπτυξιακών παραγόντων (π.χ. κυτοκίνες). Η διαφοροποίηση προϋποθέτει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων που καθορίζουν την πορεία διαφοροποίησης (lineage-determining genes) και ρυθμίζεται μέσω της δράσης μιας σειράς μεταγραφικών παραγόντων 3. Εικόνα 1: Ανάπτυξη των κυττάρων της λεμφικής και της μυελικής σειράς από πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα (Προέλευση: τροποποιημένη). Figure 1: Development of myeloid and lymphoid cell lines from multipotent hematopoietic stem cells (Origin: modified). Καθένας από τους βασικούς πληθυσμούς των λευκοκυττάρων συμμετέχει σ ένα τύπο ανοσοαπόκρισης. Τα κοκκιοκύτταρα και τα μακροφάγα παίζουν κεντρικό ρόλο στο πλαίσιο της επίκτητης ανοσίας. Το ίδιο ισχύει και για τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα (κατηγορία κοκκιοκυττάρων), τα οποία αποτελούν τους δύο τύπους φαγοκυττάρων του ανθρώπου κι εντοπίζονται σε πολλούς ιστούς του σώματος. Τα τελευταία έχουν εξειδικευμένο ρόλο στην αντιμετώπιση των μικροβιακών λοιμώξεων και είναι τα πλέον πολυάριθμα και ίσως σημαντικότερα κύτταρα της επίκτητης ανοσίας 2. Οι λειτουργίες της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης διεκπεραιώνονται από τα Β και Τ λεμφοκύτταρα. Η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων προϋποθέτει την αναγνώριση κάποιου παθογόνου, οδηγώντας στη συνέχεια στον 9

10 πολλαπλασιασμό και την εκδήλωση των εξειδικευμένων λειτουργιών τους. Η αναγνώριση του παθογόνου υλικού συμβαίνει μέσω της πρόσδεσης μορίων που εκφράζονται στην επιφάνειά του. Τα μόρια αυτά καλούνται αντιγόνα ή αντιγονικοί επίτοποι και αναγνωρίζονται από ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των λεμφοκυττάρων (αντιγονικοί υποδοχείς). Η έννοια του αντιγόνου συμπεριλαμβάνει πλέον όλα τα χημικά μόρια/ενώσεις που αναγνωρίζονται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος 2,3. Επίκτητη ανοσία Τα φαγοκύτταρα συνιστούν την πρώτη γραμμή άμυνας στο πλαίσιο της επίκτητης ανοσοαπόκρισης. Η λειτουργία τους βασίζεται στην έκφραση μη ειδικών μεμβρανικών υποδοχέων που αναγνωρίζουν συντηρημένες δομές στην επιφάνεια διαφορετικών τάξεων παθογόνων. Η πρόσδεση του παθογόνου από τα φαγοκύτταρα πυροδοτεί μια σειρά αντιδράσεων για τον περιορισμό της εισβολής, οι οποίες περιγράφονται στο σύνολό τους με τον όρο φλεγμονή 4,5. Οι συντηρημένες δομές που αναγνωρίζονται από τα φαγοκύτταρα είναι γνωστές ως μοριακά πρότυπα σχετιζόμενα με παθογόνα (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs), με χαρακτηριστικά παραδείγματα τον λιποπολυσακχαρίτη (lipopolysaccharide, LPS) του κυτταρικού τοιχώματος των Gram- βακτηρίων, τις πεπτιδογλυκάνες, τα τεϊχοϊκά οξέα και το βακτηριακό DNA 6. Οι υποδοχείς της επίκτητης ανοσίας ονομάζονται αντίστοιχα υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (Pattern Recognition Receptors, PRRs). Μερικά ενδεικτικά παραδείγματα είναι ο υποδοχέας CD14 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων, ο υποδοχέας της μαννόζης και οι υποδοχείς Toll-like (Toll-like receptors, ΤLRs) 6,7. Εξελικτικά, η επίκτητη ανοσία θεωρείται ότι προϋπήρξε της προσαρμοστικής, ενώ κάποιες δομές της εντοπίζονται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς. Τα κύτταρα της επίκτητης ανοσίας είναι σημαντικά για την έναρξη και τη μετέπειτα κατεύθυνση της ειδικής ανοσοαπόκρισης. Ιδιαίτερη σημασία έχει το γεγονός ότι ο αποτελεσματικός έλεγχος πολλών βακτηριακών λοιμώξεων, κατά το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί από την εμφάνιση της λοίμωξης μέχρι την ενεργοποίηση των μηχανισμών της ειδικής ανοσοαπόκρισης, επιτελείται από το σύστημα της επίκτητης ανοσίας 1,3. Προσαρμοστική ανοσία Οι μηχανισμοί της επίκτητης ανοσίας αδυνατούν να αναγνωρίσουν και να αναχαιτίσουν το σύνολο των παθογόνων μικροοργανισμών. Η προσαρμοστική ανοσία επιτελείται από τα λεμφοκύτταρα, τα οποία έχουν εξελιχθεί ώστε να παρέχουν πιο ειδική και αποτελεσματική δράση, αυξάνοντας την αμυντική ικανότητα του οργανισμού. Η προσαρμοστική ανοσία διακρίνεται σε χυμική, στην 10

11 οποία συμμετέχουν τα Β λεμφοκύτταρα και τα παράγωγά τους (ανοσοσφαιρίνες), και κυτταρική, η οποία στηρίζεται στη δράση των Τ λεμφοκυττάρων. Κάθε ειδική ανοσοαπόκριση διακρίνεται αδρά στη φάση αναγνώρισης, τη φάση ενεργοποίησης και την εκτελεστική φάση. Κατά τη φάση αναγνώρισης, κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζουν οι ειδικοί επιφανειακοί υποδοχείς των λεμφοκυττάρων [Β κυτταρικός υποδοχέας, (B cell receptor, ΒCR) και Τ κυτταρικός υποδοχέας (T cell receptor,tcr)] οι οποίοι αναγνωρίζουν και συνδέονται σε ιδιαίτερες δομές των αντιγόνων (αντιγονικοί επίτοποι) 1. Κατά την εκτελεστική φάση της προσαρμοστικής ανοσίας, τα εκτελεστικά κύτταρα (effector cells), τα οποία προέρχονται από τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων που ήρθαν σε επαφή με το αντιγόνο, συνεργάζονται με λειτουργικά συστήματα και κύτταρα της επίκτητης ανοσίας με σκοπό την εξάλειψη του παθογόνου. Επιπλέον, οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις στα ώριμα στάδια αντιμετώπισης μιας λοίμωξης συμπεριλαμβάνουν μια ειδική ανοσοαπόκριση, μέσω ενεργοποίησης λεμφοκυττάρων από αντιγόνα που προέρχονται από την περιοχή της λοίμωξης. Συνεπώς, γίνεται αντιληπτό ότι οι δύο τύποι ανοσοαπόκρισης, επίκτητη και προσαρμοστική, αλληλεπιδρούν στενά 8. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της προσαρμοστικής ανοσίας διαθέτουν ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά που τους διαχωρίζουν από τους αντίστοιχους της επίκτητης ανοσίας. Συγκεκριμένα, η προσαρμοστική ανοσία χαρακτηρίζεται από: Εξειδίκευση, καθώς εξασφαλίζει ειδική απάντηση απέναντι σε κάθε αντιγόνο, Ποικιλομορφία, η οποία επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστημα ν αναγνωρίζει τεράστια ποικιλία αντιγόνων, Ετερογένεια, αφού διάφοροι κυτταρικοί πληθυσμοί συνεργάζονται για την εξουδετέρωση του αντιγόνου. Μνήμη, μέσω της παραγωγής Β λεμφοκυττάρων μνήμης που παραμένουν μετά την απομάκρυνση κάθε παθογόνου και προσφέρουν ταχύτερη και πιο αποτελεσματική ανοσοαπόκριση σε επακόλουθη μόλυνση από το ίδιο παθογόνο, Αυτορρύθμιση, καθώς το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ικανό να επανέρχεται σε κατάσταση ηρεμίας μετά την αντιμετώπιση κάθε αντιγονικού ερεθίσματος και ν ανταπεξέρχεται αποτελεσματικότερα στα διαδοχικά ερεθίσματα, και τέλος, Ανοχή, ιδιότητα που αφορά στη διάκριση ξένων αντιγόνων και αυτοαντιγόνων και αποτρέπει τη δυνητική αντίδραση εναντίον κυττάρων και ιστών του ίδιου του οργανισμού 3. Ο ρόλος των Β λεμφοκυττάρων στην προσαρμοστική ανοσία Γενικά Από εξελικτική σκοπιά, η προσαρμοστική ανοσία είναι ένας σχετικά νέος μηχανισμός άμυνας, ο οποίος βασίζεται στη γενετική αναπροσαρμογή και την 11

12 αναπαραγωγή κλώνων Β λεμφοκυττάρων που αναγνωρίζουν συγκεκριμένα αντιγόνα 9. Ο τρόπος με τον οποίο τα Β λεμφοκύτταρα συμμετέχουν στη διαδικασία της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης μπορεί να περιγραφεί μέσω της θεωρίας επιλογής κλώνων (Εικόνα 2). Κάθε παρθένο Β Εξωγενές αντιγόνο Τα παρθένα Β λεμφοκύτταρα διαθέτουν υποδοχείς μοναδικής ειδικότητας λεμφοκύτταρο που εισέρχεται στην κυκλοφορία προσδιορίζεται από έναν αντιγονικό υποδοχέα με συγκεκριμένη ειδικότητα. Στον οργανισμό συναντάται μεγάλος αριθμός Β λεμφοκυττάρων, καθένα από τα οποία δυνητικά μπορεί να παράγει ανοσοσφαιρίνες μοναδικής ειδικότητας. Ο αντιγονικός υποδοχέας κάθε Β λεμφοκυττάρου είναι μια παραλλαγή του εκκρινόμενου μορίου ανοσοσφαιρίνης. Όταν το αντιγόνο προσδεθεί στον υποδοχέα, το κύτταρο ενεργοποιείται και πολλαπλασιάζεται, με αποτέλεσμα την παραγωγή πολλών πανομοιότυπων κυττάρων που συνιστούν έναν κλώνο κι εκκρίνουν μόρια ανοσοσφαιρίνης με πανομοιότυπη ειδικότητα 10. Ανοσοσφαιρίνες Η αναγνώριση του αντιγόνου οδηγεί σε κλωνική έκπτυξη Εικόνα 2: Θεωρία επιλογής κλώνων για τον τρόπο λειτουργίας των Β λεμφοκυττάρων στο πλαίσιο της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης. Figure 2: Clonal selection theory for the role of B lymphocytes in the adaptive immune response. Δομή των ανοσοσφαιρινών Οι ανοσοσφαιρίνες ή αντισώματα (immunoglobulins, Igs) είναι μια οικογένεια γλυκοπρωτεϊνών του πλάσματος. Όλα τα μόρια των ανοσοσφαιρινών αποτελούνται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, ανά δύο πανομοιότυπες μεταξύ τους. Ο ένας τύπος πολυπεπτιδικής αλυσίδας έχει μοριακό βάρος 50 kda και ονομάζεται βαριά αλυσίδα (heavy chain, H), ενώ o άλλος τύπος έχει μοριακό βάρος 25 kda και ορίζεται ως ελαφριά αλυσίδα (light chain, L). Οι δύο βαριές αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους με δύο δισουλφιδικούς δεσμούς και κάθε βαριά αλυσίδα συνδέεται με μια ελαφριά αλυσίδα επίσης μ έναν δισουλφιδικό δεσμό. Επειδή οι βαριές και οι ελαφριές αλυσίδες είναι πανομοιότυπες, το μόριο της ανοσοσφαιρίνης διαθέτει δίπτυχο άξονα συμμετρίας 11 (Εικόνα 3). 12

13 Εικόνα 3: Δομή του μορίου της ανοσοσφαιρίνης. Η τριτοταγής δομή του μορίου αποτελείται από δύο πανομοιότυπες βαριές και δύο πανομοιότυπες ελαφριές αλυσίδες. Figure 3: Immunoglobulin structure. The molecule consists of two identical heavy and two identical light chains. Σε κάθε βαριά κι ελαφριά αλυσίδα υπάρχουν ενδοπεπτιδικοί δισουλφιδικοί δεσμοί, που αναγκάζουν τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες να διπλωθούν και να σχηματίσουν σφαιρικές περιοχές, οι οποίες αποτελούνται από 110 αμινοξικά κατάλοιπα. Οι περιοχές αυτές έχουν χαρακτηριστική δομή αντιπαράλληλων β-κλώνων που οργανώνονται σε δύο β-φύλλα και περιγράφονται με τον όρο πτυχή ανοσοσφαιρίνης (immunoglobulin fold). Υπάρχουν δύο τύποι ελαφριών αλυσίδων, που ορίζονται ως κάππα (kappa, κ) και λάμβδα (lambda, λ). Μεταξύ των δύο τύπων δεν έχει ανακαλυφθεί καμία λειτουργική διαφορά. Σε κάθε ανοσοσφαιρίνη εκφράζεται ένας μόνο τύπος ελαφριών αλυσίδων, είτε κ είτε λ. Με βάση το είδος της βαριάς αλυσίδας (μ, γ, δ, ε, α), οι ανοσοσφαιρίνες ταξινομούνται σε πέντε τάξεις ή ισότυπους (isotypes) (IgM, IgG, IgD, IgE, IgA) (Εικόνα 4). Οι ελαφριές αλυσίδες έχουν δύο περιοχές πτυχής ανοσοσφαιρίνης, οι βαριές αλυσίδες α, γ και δ τέσσερις, ενώ οι μ και ε πέντε 3,12. 13

14 Εικόνα 4: Ισότυποι των ανοσοσφαιρινών. Η IgA εκκρίνεται ως διμερές μόριο, ενώ η IgM βρίσκεται στον ορό ως πενταμερές μόριο (Προέλευση: τροποποιημένη). Figure 4: Immunoglobulin isotypes. IgA is secreted as a dimer, whereas IgM is found in the serum mostly as a pentamer (Origin: modified). Λειτουργικός διαχωρισμός του μορίου της ανοσοσφαιρίνης Η σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των πτυχών ανοσοσφαιρίνης αποκάλυψε ότι η περιοχή στο αμινοτελικό άκρο των βαριών κι ελαφριών αλυσίδων χαρακτηρίζεται από ποικιλομορφία, σε αντίθεση με την αντίστοιχη περιοχή στο καρβοξυτελικό άκρο. Οι αμινοτελικές περιοχές των βαριών κι ελαφριών αλυσίδων ονομάζονται μεταβλητές (variable) και συνιστούν τη μεταβλητή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης, ενώ οι σταθερές (constant) καρβοξυτελικές περιοχές συνθέτουν τη σταθερή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης 12. O δομικός αυτός διαχωρισμός έχει λειτουργική βάση, καθώς η μεταβλητή και η σταθερή περιοχή είναι υπεύθυνες για δύο διακριτές διεργασίες. Οι ανοσοσφαιρίνες είναι επιφορτισμένες με την αναγνώριση και πρόσδεση του αντιγόνου και στη συνέχεια με την ενεργοποίηση μιας σειράς εκτελεστικών μηχανισμών για την αντιμετώπισή του. Η εκτελεστική λειτουργία της ανοσοσφαιρίνης διεκπεραιώνεται από τη σταθερή περιοχή του μορίου. Ο ισότυπος της εκκρινόμενης ανοσοσφαιρίνης καθορίζει το είδος των εκτελεστικών μηχανισμών που θα ενεργοποιηθούν. Οι ισότυποι αφορούν σε διαφορές των περιοχών C των βαριών αλυσίδων και παρατηρούνται σε όλα τα άτομα ενός είδους, ενώ δε σχετίζονται με την ειδικότητα της ανοσοσφαιρίνης. Όπως αναφέρθηκε, οι πέντε τάξεις των ανοσοσφαιρινών είναι οι IgA, IgD, IgE, IgG και IgM. Οι ανοσοσφαιρίνες IgG του ανθρώπου διαχωρίζονται σε τέσσερις υποτάξεις (IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4 ), ενώ οι IgA σε δύο (IgA 1, IgA 2 ). Οι ανοσοσφαιρίνες της ίδιας τάξης (π.χ. IgΑ 1 και IgΑ 2 ) εμφανίζουν ομολογία σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας >90%

15 Η αναγνώριση και πρόσδεση των αντιγόνων επιτελείται από τη μεταβλητή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης. Κατά μήκος της μεταβλητής περιοχής των ελαφριών και βαριών αλυσίδων εντοπίζονται υποπεριοχές με διαφορετικό βαθμό μεταβλητότητας. Τρεις περιοχές εμφανίζουν εξαιρετικό βαθμό μεταβλητότητας και χαρακτηρίζονται ως υπερμεταβλητές (hypervariable regions). Οι περιοχές αυτές αντιστοιχούν σε τρεις θηλιές (loops) στο άκρο κάθε β-φύλλου και καθορίζουν την ειδικότητα της ανοσοσφαιρίνης, σχηματίζοντας μια θέση σύνδεσης συμπληρωματική με το αντιγόνο. Για το λόγο αυτό, οι τρεις υπερμεταβλητές περιοχές ονομάζονται και περιοχές καθορισμού της συμπληρωματικότητας (complementarity determining regions, CDRs): CDR1, CDR2 και CDR3. Τα τμήματα μεταξύ των περιοχών CDR είναι πιο συντηρημένα και αναφέρονται ως περιοχές πλαισίου (framework regions, FRs): FR1, FR2, FR3 και FR4. Οι περιοχές πλαισίου σχηματίζουν το δομικό πλαίσιο της περιοχής με τις υπερμεταβλητές αλληλουχίες 1,12 (Εικόνα 5). Εικόνα 5: Δομικός και λειτουργικός διαχωρισμός του μορίου της ανοσοσφαιρίνης. Αριστερά ο διαχωρισμός της μεταβλητής περιοχής κάθε αλυσίδας σε περιοχές υψηλής μεταβλητότητας (CDRs) και περιοχές χαμηλής μεταβλητότητας (FRs). Figure 5: Structural and functional division of the immunoglobulin molecule. In the left diagram the distinction of the immunoglobulin variable region between regions of high varability (CDRs) and low variability (FRs) is depicted. Γενετική οργάνωση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Στον άνθρωπο, οι γενετικοί τόποι των ανοσοσφαιρινών περιλαμβάνουν ομάδες γονιδίων. Οι γενετικοί τόποι των ελαφριών αλυσίδων (IGK και IGL, για την κ και λ ελαφριά αλυσίδα, αντιστοίχως) περιλαμβάνουν τρεις ομάδες γονιδίων: V (Variable: μεταβλητό), J (Junctional: συνδετικό) και C (Constant: σταθερό). Ο γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας (IGH) περιλαμβάνει επιπλέον την ομάδα γονιδίων D (Diversity: ποικιλότητας) μεταξύ των ομάδων V και J. Εκτός από τις 15

16 ομάδες γονιδίων, οι γενετικοί τόποι των ανοσοσφαιρινών περιλαμβάνουν και πλήθος ρυθμιστικών γονιδίων, όπως οι αλληλουχίες-οδηγοί (leader sequences, L) πριν από κάθε γονίδιο V (Εικόνα 6). Εικόνα 6: Η διάταξη των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στους γενετικούς τόπους IGH, IGK, IGL. Figure 6: Gene configuration of the IGH, IGK and IGL genetic loci. Ο σχηματισμός της πλήρους γονιδιακής αλληλουχίας που κωδικοποιεί μια βαριά ή ελαφριά αλυσίδα προϋποθέτει τον ανασυνδυασμό ενός γονιδίου από κάθε ομάδα. Οι γενετικοί τόποι των βαριών αλυσίδων, των κ και των λ ελαφριών αλυσίδων βρίσκονται στα χρωμοσώματα 14, 2 και 22, αντίστοιχα (Εικόνα 7). Η μεταβλητή περιοχή των ελαφριών αλυσίδων σχηματίζεται από την αναδιάταξη των γονιδίων V και J, ενώ η σταθερή περιοχή της αλυσίδας κωδικοποιείται από ένα γονίδιο C. Αντίστοιχα, η μεταβλητή περιοχή των βαριών αλυσίδων σχηματίζεται από την αναδιάταξη γονιδίων V, D και J. Η διαδικασία του ανασυνδυασμού περιλαμβάνει τα εξής στάδια: αρχικά, ένα γονίδιο D αναδιατάσσεται μ ένα γονίδιο J και στη συνέχεια πραγματοποιείται η αναδιάταξη του συμπλόκου D-J με ένα γονίδιο V. Κομβικό ρόλο στην αναδιάταξη των γονιδίων παίζει το ετεροδιμερές σύμπλοκο των πρωτεϊνών RAG1/RAG

17 Εικόνα 7: Οι γενετικοί τόποι IGH, IGK και ΙGL στα χρωμοσώματα 14, 2 και 22, αντίστοιχα (Προέλευση: IMGT Web resources; Figure 7: Genetic loci IGH, IGK and IGL at chromosomes 14, 2 and 22, respectively (Origin: IMGT Web resources; Γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας (IGH genetic locus) Ο γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας εντοπίζεται στη ζώνη 14q32.33 του χρωμοσώματος 14, στο τελομερικό άκρο του μακρού βραχίονα. Ο προσανατολισμός των γονιδίων στο γενετικό τόπο ΙGH είναι: τελομερίδιο, 5 ΙGHV IGHD IGHJ IGHC 3, κεντρομερίδιο (Εικόνα 8). Ο γενετικός τόπος IGH έχει μήκος 1250 kb και περιλαμβάνει γονίδια ανά απλότυπο. H ομάδα των γονιδίων IGHV περιλαμβάνει συνολικά γονίδια, ανάλογα με τον απλότυπο. Από αυτά, γονίδια κατατάσσονται σε 7 υποομάδες γονιδίων (subgroups): IGHV1-IGHV7. Τα λειτουργικά γονίδια είναι 44, από τα οποία μόνο τα 40 δίνουν αναγνωρίσιμα προϊόντα. Υπάρχουν επίσης 41 ψευδογονίδια, τα οποία αποκλίνουν αρκετά ώστε να είναι αδύνατη η κατάταξή τους στις παραπάνω υποομάδες. 17

18 Εικόνα 8: Ο γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας (Προέλευση: IMGT Web resources; Figure 8: Genetic locus of the immunoglobulin heavy chain (Origin: IMGT Web resources; H ομάδα των γονιδίων IGHD περιλαμβάνει 27 γονίδια, τα οποία κατατάσσονται σε 7 υποομάδες (subgroups): IGHD1-IGHD7. Λειτουργικά γονίδια είναι 23, ενώ τα υπόλοιπα είναι ψευδογονίδια. H συστοιχία των γονιδίων IGHJ περιλαμβάνει 9 γονίδια, από τα οποία τα 6 είναι λειτουργικά ενώ τα υπόλοιπα είναι ψευδογονίδια. Τέλος, η ομάδα των γονιδίων IGHC αποτελείται από 11 γονίδια (στον πιο συχνό απλότυπο) 14. Γενετικός τόπος της κ ελαφριάς αλυσίδας (IGK genetic locus) Εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 2, στη ζώνη 2p11.2 του μικρού βραχίονα, κι έχει μήκος kb (Εικόνα 9). Περιλαμβάνει συνολικά 82 γονίδια ανά απλοειδές γονιδίωμα, από τα οποία 76 ανήκουν στη συστοιχία γονιδίων IGKV και κατατάσσονται σε 7 υποομάδες (IGKV1- IGKV7). Στη συστοιχία γονιδίων IGKJ ανήκουν 5 γονίδια. Επίσης, υπάρχει ένα μοναδικό γονίδιο IGKC. Τα γονίδια IGKV οργανώνονται σε δύο συστοιχίες, οι οποίες απέχουν μεταξύ τους 800 kb. Η απομακρυσμένη συστοιχία (distal cluster) βρίσκεται στο 5 άκρο του γενετικού τόπου, έχει μήκος 400 kb κι αποτελείται από 36 γονίδια. Η εγγύς συστοιχία (proximal cluster) βρίσκεται στο 3 άκρο του γενετικού τόπου, έχει μήκος 600 kb κι αποτελείται από 40 γονίδια

19 Εικόνα 9: Ο γενετικός τόπος της κάππα ελαφριάς αλυσίδας (Προέλευση: IMGT Web resources; Figure 9: Genetic locus of the immunoglobulin kappa light chain (Origin: IMGT Web resources; Γενετικός τόπος της λ ελαφριάς αλυσίδας (IGL genetic locus) Εντοπίζεται στη ζώνη 22q11.2 του μεγάλου βραχίονα του χρωμοσώματος 22, έχει μήκος kb και περιέχει γονίδια (Εικόνα 10). Τα είναι γονίδια IGLV, τα 7-11 είναι γονίδια IGLJ και τα 7-11 είναι γονίδια IGLC, ανάλογα με τον απλότυπο. Τα λειτουργικά γονίδια κατατάσσονται σε 11 υποομάδες, ενώ 17 ψευδογονίδια εμφανίζουν μεγάλη απόκλιση και δεν ήταν δυνατή η κατάταξή τους σε κάποια από τις υποομάδες. Τα γονίδια IGLJ είναι ισάριθμα με τα γονίδια IGLC και οργανώνονται σε ζεύγη γονιδίων 16. Εικόνα 10: Ο γενετικός τόπος της λάμβδα ελαφριάς αλυσίδας (Προέλευση: IMGT Web resources; Figure 10: Genetic locus of the immunoglobulin lambda light chain (Origin: IMGT Web resources; 19

20 Ανάπτυξη και διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων Γενικά Η ειδικότητα του αντιγονικού υποδοχέα των Β λεμφοκυττάρων καθορίζεται από το συνδυασμό των γονιδίων που αναδιατάχθηκαν και τη μετέπειτα τροποποίησή τους. Η διαδικασία διεκπεραιώνεται από ένα μοναδικό γενετικό μηχανισμό, ο οποίος συμβαίνει κατά την ανάπτυξη των Β λεμφοκυττάρων στο μυελό των οστών. Συγκεκριμένα, κάθε στάδιο διαφοροποίησης χαρακτηρίζεται από μια διαφορετική φάση της διαδικασίας του ανασυνδυασμού γονιδίων και από την έκφραση προσαρμοστικών μορίων και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των αναπτυσσόμενων Β λεμφοκυττάρων. Παρότι κάθε Β λεμφοκύτταρο φέρει στο γονιδίωμα του δύο αλληλόμορφα για το γενετικό τόπο της βαριάς αλυσίδας (IGH) και τέσσερα αλληλόμορφα για τους γενετικούς τόπους των ελαφριών αλυσίδων (IGK/IGL), στην επιφάνεια του εκφράζεται ένα μοναδικό μόριο ανοσοσφαιρίνης. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στη λειτουργία ενός μηχανισμού γνωστού ως αποκλεισμός αλληλόμορφου (allelic exclusion). Ο συγκεκριμένος μηχανισμός στηρίζεται στη χρονική καθυστέρηση του ανασυνδυασμού στο ένα από τα δύο αλληλόμορφα. Η παραγωγή προϊόντος επιτυχημένου ανασυνδυασμού αναστέλλει πλήρως τον ανασυνδυασμό στο άλλο αλληλόμορφο. Κατά τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων, πρώτα πραγματοποιείται ανασυνδυασμός στο γενετικό τόπο της βαριάς αλυσίδας. Η παραγωγή λειτουργικής αναδιάταξης οδηγεί σε ανασυνδυασμό των γενετικών τόπων των ελαφριών αλυσίδων (πρώτα στο γενετικό τόπο IGK κι έπειτα, αν η αναδιάταξη του IGK αποτύχει και στα δύο αλληλόμορφα, στον IGL). Η αποτυχία πραγωγής λειτουργικού ανασυνδυασμού είτε στο επίπεδο της βαριάς είτε στο επίπεδο της ελαφριάς αλυσίδας οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση 17,19 (Εικόνα 11). Μόλις εκφραστεί ο αντιγονικός υποδοχέας στην επιφάνεια του Β λεμφοκυττάρου, παύουν οι περαιτέρω ανασυνδυασμοί. Η αναπτυξιακή πορεία μέχρι την έξοδο στην κυκλοφορία παρθένων Β λεμφοκυττάρων που εκφράζουν λειτουργικούς αντιγονικούς υποδοχείς στην επιφάνειά τους καλείται αντιγονοανεξάρτητη φάση διαφοροποίησης 2,10,20. 20

21 Εικόνα 11: Διαδικασία παραγωγής λειτουργικού αντιγονικού υποδοχέα. Διαδοχικοί επιτυχημένοι ανασυνδυασμοί στους γενετικούς τόπους των ανοσοσφαιρινών προωθούν το επόμενο στάδιο διαφοροποίησης κι εξασφαλίζουν την επιβίωση του κυττάρου. Figure 11: Genetic process for the formation of a functional B cell receptor. Successive functional rearrangements within the immunoglobulin gene loci lead to the next differentiation step and ensure cell survival. Αντιγονοανεξάρτητη φάση διαφοροποίησης Η διαφοροποίηση των πολυδύναμων ή αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (pluripotent hematopoietic stem cells, PHSC) σε Β λεμφοκύτταρα συμβαίνει στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών, στα διάκενα του δικτύου των στρωματικών κυττάρων. Τα αιμοποιητικά κύτταρα διαφοροποιούνται και πολλαπλασιάζονται σε επαφή και αλληλεπίδραση με τα στρωματικά κύτταρα έτσι ώστε να λαμβάνουν τα σήματα που είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική ανάπτυξη και ωρίμανσή τους. Αρχικά το κύτταρο PHSC διαφοροποιείται προς πολυδύναμο προγονικό κύτταρο (multipotential progenitor, MPP), από το οποίο προέρχονται όλα τα κύτταρα του αίματος. Το MPP διακρίνεται από τα PHSC επειδή έχει χάσει την ικανότητα αυτοανανέωσης. Η διαφοροποίηση των MMP κύτταρων οδηγεί στον κοινό πρόγονο της μυελικής σειράς (common myeloid progenitor, CMP) και τον πρώιμο λεμφοειδή πρόγονο (early lymphoid progenitor, ΕLP). Τα κύτταρα ELP εκφράζουν τα ένζυμα RAG1 και RAG2, τα οποία είναι υπεύθυνα για την έναρξη του ανασυνδυασμού στο γενετικό τόπο της βαριάς αλυσίδας 21. Το κρίσιμο βήμα στην ανάπτυξη του Β λεμφοκυττάρου είναι η δέσμευση του ΜΡΡ κυττάρου για διαφοροποίηση στον κοινό πρόδρομο των λεμφοκυττάρων (common lymphoid progenitor, CLP), που χαρακτηρίζεται από την ικανότητα διαφοροποίησης σε Β, Τ ή NK κύτταρα (Εικόνα 1). Χαρακτηριστικοί 21

22 δείκτες που εκφράζονται στην επιφάνεια του CLP κυττάρου είναι οι c-kit και IL- 7Rα 22. Στο στάδιο του κοινού προδρόμου των λεμφοκυττάρων τα γονίδια των ανοσοσφαιρινών βρίσκονται σε μη αναδιαταγμένη διαμόρφωση. Το πρώτο στάδιο της αναδιάταξης συμβαίνει κατά το επόμενο στάδιο της διαφοροποίησης προς πρώιμο προ-προ-β λεμφοκύτταρο, μεταξύ των γονιδίων IGHD και IGHJ, και στα δύο αλληλόμορφα της βαριάς αλυσίδας. Στο επόμενο στάδιο διαφοροποίησης προς όψιμο προ-προ-β λεμφοκύτταρο συμβαίνει η αναδιάταξη ενός γονιδίου IGHV της βαριάς αλυσίδας με το σύμπλοκο IGHD-IGHJ. Τα προ-προ-β λεμφοκύτταρα που αποτυγχάνουν στην παραγωγή λειτουργικού ανασυνδυασμού VDJ υφίστανται απόπτωση και φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα του μυελού των οστών. Όταν η αναδιάταξη είναι παραγωγική, το κύτταρο περνά στο στάδιο του μεγάλου προ-β λεμφοκυττάρου (large pre B-cell) κι εκφράζει στην επιφάνεια του τον οικουμενικό Β λεμφοκυτταρικό δείκτη CD Στο μεγάλο προ-β λεμφοκύτταρο οι δείκτες CD34, c-kit και το ένζυμο TdT σταματούν να εκφράζονται και η βαριά αλυσίδα μετατοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Στη συνέχεια, το κύτταρο εκφράζει στην επιφάνεια του τον προ-β υποδοχέα (pre- BCR), ο οποίος αποτελείται από τη βαριά αλυσίδα ισότυπου μ, μια «υποκατάστατη» ελαφριά αλυσίδα (surrogate light chain, SLC) και τους συνυποδοχείς (co-receptors) Igα και Igβ (Εικόνα 12). Εικόνα 12: Δομή του προ-β υποδοχέα, ο οποίος αποτελείται από μια βαριά αλυσίδα και μια υποκατάστατη ελαφριά αλυσίδα. Figure 12: Pre-BCR structure. The molecule consists of two identical heavy chains paired with two identical surrogate light chains. Οι συνυποδοχείς είναι απαραίτητοι για τη σωστή λειτουργία του pre-bcr. Η υποκατάστατη ελαφριά αλυσίδα βοηθά στο σωστό δίπλωμα της βαριάς αλυσίδας μ και κωδικοποιείται από τα γονίδια VpreΒ και λ5. Τα γονίδια αυτά είναι 22

23 ομόλογα με τα γονίδια της μεταβλητής και της σταθερής περιοχής της λ ελαφριάς αλυσίδας, αντίστοιχα. Σε αυτή τη φάση, το κύτταρο καλείται μεγάλο προ-β λεμφοκύτταρο ΙΙ (large pre-b cell II) 22,24,25. Η έκφραση του προ-β υποδοχέα προκαλεί την έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης bcl-xl. Τα κύτταρα που αποτυγχάνουν να εκφράσουν το σύμπλοκο βαριάς αλυσίδας/υποκατάστατης ελαφριάς αλυσίδας δεν εκφράζουν την πρωτεΐνη bcl-xl και υφίστανται απόπτωση, εκτός αν διασωθούν με λειτουργικό δευτερογενή ανασυνδυασμό και διόρθωση υποδοχέα (receptor editing) 26. Τα κύτταρα που εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον προ-βcr υποδοχέα επιβιώνουν και μετατρέπονται σε μικρά προ-β-λεμφοκύτταρα (small pre-b cells). Σε αυτό το στάδιο σταματά η έκφραση των γονιδίων της SLC, ενώ τα γονίδια RAG που είχαν προσωρινά κατασταλεί επανενεργοποιούνται για την αναδιάταξη των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων. Κατά κανόνα, προηγείται ο ανασυνδυασμός στο γενετικό τόπο IGK. Σε περίπτωση μη παραγωγικής αναδιάταξης, ανασυνδυάζονται τα γονίδια της λ ελαφριάς αλυσίδας. Η παραγόμενη ελαφριά αλυσίδα (κ ή λ) συνδέεται με τη βαριά αλυσίδα μ και σχηματίζονται μονομερή μόρια IgM, τα οποία εκφράζονται στην κυτταρική επιφάνεια και αποτελούν τον ειδικό αντιγονικό υποδοχέα. Τα κύτταρα που εκφράζουν υποδοχείς BCR καλούνται παρθένα Β λεμφοκύτταρα (naive B-cells) 22,27. Μηχανισμοί ελέγχου αυτο-ανοχής στο μυελό των οστών Η ειδικότητα του λειτουργικού αντιγονικού υποδοχέα IgM δεν είναι προκαθορισμένη, συνεπώς υπάρχει η πιθανότητα να είναι αυτο-δραστικός, δηλαδή ν αναγνωρίζει συστατικά του ίδιου του οργανισμού (αυτοαντιγόνα, self antigens). Τα ανώριμα Β λεμφοκύτταρα ελέγχονται πριν από την είσοδό τους στην κυκλοφορία του αίματος και όσα είναι αυτο-αντιδραστικά υφίστανται την επίδραση δύο μηχανισμών αυτο-ανοχής (self-tolerance) προκειμένου να αποφύγουν την εξάλειψη 28. Συγκεκριμένα: O μηχανισμός διόρθωσης υποδοχέα (receptor editing) ενεργοποιείται από την πρόσδεση του αυτο-δραστικού υποδοχέα με το αντίστοιχο αυτοαντιγόνο. Το ανώριμο Β λεμφοκύτταρο επανεκφράζει τις πρωτεΐνες ανασυνδυασμού RAG-1 και RAG-2 επιτρέποντας νέο ανασυνδυασμό των γενετικών τόπων IGK ή IGL, ο οποίος θα οδηγήσει σε αντικατάσταση της ελαφριάς αλυσίδας 29. Σπανιότερα, η διόρθωση του υποδοχέα επιτυγχάνεται μέσω της αντικατάστασης του γονιδίου IGHV της βαριάς αλυσίδας 30,31. Στις περιπτώσεις που δεν επιτυγχάνεται αλλαγή της ειδικότητας, τα ανώριμα Β λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνα με μικρή συγγένεια πρόσδεσης (π.χ. διαλυτά αντιγόνα) αδρανοποιούνται. Το φαινόμενο ονομάζεται ανεργία (anergy) και τα αντίστοιχα κύτταρα ανεργικά (anergic). Τα ανεργικά κύτταρα εκφράζουν λίγη ή καθόλου επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη IgM (ωστόσο, τη 23

24 διατηρούν στο κυτταρόπλασμα) ενώ, αντίθετα, εκφράζουν υψηλά επίπεδα επιφανειακής IgD 32. Η αποτυχία αλλαγής της ειδικότητας συνεπάγεται ότι το αυτο-δραστικό Β λεμφοκύτταρο που αναγνωρίζει πολυσθενή αντιγόνα μέσω της επιφανειακής Ig υφίσταται απαλοιφή με απόπτωση (clonal deletion) 33. Αντιγονοεξαρτώμενη φάση διαφοροποίησης Μετά τον έλεγχο αυτο-ανοχής, τα ώριμα Β λεμφοκύτταρα μετακινούνται προς τα δευτερογενή λεμφικά όργανα, μέσω της κυκλοφορίας του αίματος. Η πρόσδεση των κατάλληλων αντιγόνων σε συνδυασμό με τα κατάλληλα σήματα ενεργοποίησης από τα βοηθητικά κύτταρα, οδηγούν στον πολλαπλασιασμό τους στις περιοχές των Τ λεμφοκυττάρων, στις οποίες συμβαίνουν εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Τ, των Β και των δενδριτικών κυττάρων (dendritic cells, DCs). Ορισμένα διεγερμένα κύτταρα μεταναστεύουν στο κέντρο των λεμφοζιδίων. Επτά έως 10 ημέρες μετά την ανοσοποίηση, τα δευτερογενή λεμφοζίδια αποκτούν πολικότητα και το ειδικό μικροπεριβάλλον που προκύπτει καλείται βλαστικό κέντρο (germinal center) 34. Το βλαστικό κέντρο Το βλαστικό κέντρο είναι ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον όπου συμβαίνουν ο πολλαπλασιασμός και συγκεκριμένα στάδια της διαφοροποίησης των Β λεμφοκυττάρων (Εικόνα 13). Εικόνα 13: Το βλαστικό κέντρο είναι εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον όπου τα Β λεμφοκύτταρα που έχουν διεγερθεί από αντιγόνο αποκτούν υψηλή συγγένεια σύνδεσης και μετατρέπονται σε πλασματοκύτταρα ή Β λεμφοκύτταρα μνήμης..figure 13: Germinal center is a highly specific site where antigen-stimulated B cells acquire high affinity against the antigen and become either plasma cells or memory B cells. 24

25 Τα Β λεμφοκύτταρα που έχουν διεγερθεί και πολλαπλασιάζονται ταχύτατα ονομάζονται κεντροβλάστες και συγκεντρώνονται στη σκοτεινή ζώνη που βρίσκεται προς την πλευρά της περιοχής των Τ λεμφοκυττάρων. Οι κεντροβλάστες είναι μεγάλα κύτταρα που διαιρούνται περίπου κάθε έξι ώρες, υπόκεινται στη διεργασία της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης (ΣΥΜ somatic hypermutation, SHM) και δεν εκφράζουν επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη. Όταν οι κεντροβλάστες σταματήσουν να διαιρούνται, επανεκφράζουν ανοσοσφαιρίνη στην επιφάνειά τους και μεταναστεύουν στον αντίθετο πόλο του βλαστικού κέντρου. Το τμήμα αυτό ονομάζεται φωτεινή ζώνη και είναι πλούσιο σε δενδριτικά κύτταρα των λεμφοζιδίων (follicular dendritic cells, FDCs) και CD4 Τ λεμφοκύτταρα. Σε αυτή τη φάση, τα Β λεμφοκύτταρα καλούνται κεντροκύτταρα, δεν εκφράζουν τους δείκτες Ki67 και CD77 και είναι προγραμματισμένα να πεθάνουν, εκτός αν δεχτούν σήματα επιβίωσης από βοηθητικά κύτταρα. Στα βλαστικά κέντρα συμβαίνουν οι διαδικασίες ΣΥΜ, ωρίμανσης συγγένειας (affinity maturation) και εναλλαγής ισότυπου (class switch recombination, CSR). Τα Β λεμφοκύτταρα με υποδοχείς υψηλής συγγένειας για το αντιγόνο εγκαταλείπουν το βλαστικό κέντρο και μετατρέπονται σε πλασματοκύτταρα ή Β λεμφοκύτταρα μνήμης. Αντίθετα, αν ένα Β λεμφοκύτταρο δεν επιλεγεί κατά τον έλεγχο συγγένειας, τότε θα υποστεί απόπτωση στο βλαστικό κέντρο 35. Αντιγόνα και μηχανισμοί δημιουργίας ετερογένειας στους αντιγονικούς υποδοχείς των Β λεμφοκυττάρων Κατηγορίες και ιδιότητες των αντιγόνων Όπως αναφέρθηκε, με τον όρο αντιγόνο χαρακτηρίζονται τα χημικά μόρια που αναγνωρίζονται από τους υποδοχείς BCR και TCR (στην περίπτωση του TCR, σε συνδυασμό μ ένα μόριο MHC). Η ικανότητα ειδικής πρόσδεσής τους από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος καλείται αντιγονικότητα (antigenicity). Η ικανότητα του αντιγόνου να επάγει ανοσοαπόκριση ονομάζεται ανοσογονικότητα (immunogenicity). Ωστόσο, επισημαίνεται ότι ως αντιγόνο περιγράφεται κάθε δομή που μπορεί να αναγνωριστεί από ένα στοιχείο του ανοσοποιητικού συστήματος. Η πρόκληση ανοσοαπόκρισης εξαρτάται τόσο από το ίδιο το αντιγόνο όσο και από τις γενικότερες συνθήκες που επικρατούν στο βιολογικό σύστημα με το οποίο έρχεται σε επαφή. Συνεπώς, η ανοσογονικότητα δεν είναι εγγενές χαρακτηριστικό αλλά λειτουργική ιδιότητα. Οι παράγοντες που καθορίζουν την ανοσογονικότητα ενός μορίου είναι η ομοιότητά της με αυτόλογες πρωτεΐνες, το μοριακό μέγεθος και η χημική δομή του

26 Μοριακή φύση των αντιγόνων Τα μόρια με ανοσογόνες ιδιότητες είναι συνήθως μακρομόρια (πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες, νουκλεϊνικά οξέα). Ένα μακρομόριο αναγνωρίζεται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος μέσω μιας δομής στην επιφάνειά του. Η δομή αυτή είναι γνωστή ως αντιγονικός επίτοπος. Κάθε τμήμα της επιφάνειας ενός μακρομορίου μπορεί να λειτουργήσει ως επίτοπος. Συνεπώς, κάθε μακρομόριο φέρει μεγάλο αριθμό επίτοπων. Μάλιστα, όσο πιο πολύπλοκη είναι η δομή του τόσο αυξάνει η πιθανότητα της αναγνώρισής του από τα στοιχεία του ανοσοποιητικού συστήματος, άρα αυξάνει και η ανοσογονικότητα του. Όλες σχεδόν οι πρωτεΐνες είναι ανοσογόνες και η πολυπλοκότητά τους είναι ανάλογη με την ισχύ της ανοσοαπόκρισης που διεγείρουν. Επιπλέον, είναι η μοναδική κατηγορία μακρομορίων που μπορούν να επάγουν κυτταρική ανοσοαπόκριση. Οι πολυσακχαρίτες είναι ανοσογόνα που επάγουν χυμική απόκριση, αν και λιγότερο ισχυρή από τις πρωτεΐνες. Αντίθετα, τα λιπίδια σπάνια είναι ανοσογόνα. Τόσο τα λιπίδια όσο και τα νουκλεϊκά οξέα λειτουργούν ως ανοσογόνα μόνο αν είναι συνδεδεμένα με πρωτεΐνες-φορείς 13. Διάκριση αντιγόνων με κριτήρια προέλευσης Τα αντιγόνα διακρίνονται σε εξωγενή, ενδογενή και αυτοαντιγόνα. Τα αντιγόνα του περιβάλλοντος συνιστούν την κατηγορία των εξωγενών αντιγόνων. Η κατηγορία των ενδογενών αντιγόνων περιλαμβάνει αντιγόνα που παράγονται από τα κύτταρα του οργανισμού ως συνέπεια του κυτταρικού μεταβολισμού ή λόγω λοιμώξεων από ιούς ή ενδοκυττάρια βακτήρια. Τέλος, ως αυτοαντιγόνα ορίζονται όλα τα μακρομόρια (π.χ πρωτεΐνες, DNA, RNA) που αποτελούν συστατικά του ίδιου του οργανισμού και αναγνωρίζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα 1,13. Διάκριση αντιγόνων ανάλογα με την επαγωγή ανοσοαπόκρισης Ένας βασικός κανόνας της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης είναι ότι τα παρθένα αντιγονοειδικά λεμφοκύτταρα δε μπορούν να ενεργοποιηθούν μόνο μέσω της πρόσδεσης αντιγόνου. Τα παρθένα Β λεμφοκύτταρα απαιτούν συνδιεγερτικά σήματα που μπορεί να προέρχονται είτε από άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα), είτε άμεσα από κάποια μικροβιακά συστατικά. Συνεπώς, μια διαφορετική ταξινόμηση αντιγόνων είναι εφικτή με βάση τον τρόπο επαγωγής της ανοσοαπόκρισης. Τα πρωτεϊνικά αντιγόνα προσδένονται στον BCR, εγκολπώνονται, αποδομούνται και τμήματά τους επιστρέφουν στην επιφάνεια του κυττάρου 26

27 δεσμευμένα σε μόρια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τάξης ΙΙ (MHC- II). Με αυτόν τον τρόπο αναγνωρίζονται από τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, που παρέχουν το συνδιεγερτικό σήμα στο Β λεμφοκύτταρο προκειμένου να ξεκινήσει την παραγωγή ανοσοσφαιρινών. Τα συγκεκριμένα αντιγόνα καλούνται θυμοεξαρτημένα ή TD (Thymus dependent) αντιγόνα, επειδή δε μπορούν να προκαλέσουν ανοσοαπόκριση σε οργανισμούς χωρίς καλά ανεπτυγμένο θύμο αδένα που δεν παράγουν λειτουργικά Τ λεμφοκύτταρα (Εικόνα 14). Εικόνα 14: Αναγνώριση θυμοεξαρτημένων αντιγόνων (TD). Figure 14: Recognition of thymous-dependent (TD) antigens. Η κατηγορία των θυμοανεξάρτητων ή TI (Thymus independent) αντιγόνων περιλαμβάνει τους πολυσακχαρίτες βακτηρίων, λιποπολυσακχαρίτες και τα πρωτεϊνικά πολυμερή. Τα αντιγόνα αυτά έχουν την ικανότητα διέγερσης των Β λεμφοκυττάρων χωρίς τη δράση των βοηθητικών Τ λεμφοκυττάρων. Τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα διακρίνονται περαιτέρω σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με τον τρόπο που επάγουν την ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων. Τα ΤΙ-1 (τύπου 1) θυμοανεξάρτητα αντιγόνα όταν βρίσκονται σε υψηλή συγκέντρωση προκαλούν άμεσα τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση όλων των Β λεμφοκυττάρων, ανεξάρτητα από την αντιγονική ειδικότητά τους. Αυτό το φαινόμενο περιγράφεται ως πολυκλωνική ενεργοποίηση. Σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (κατά φορές) ενεργοποιούν άμεσα μόνο τα αντιγονοειδικά Β λεμφοκύτταρα που είναι ικανά να προσδέσουν τα συγκεκριμένα ΤΙ-1 μόρια και να εκδηλώσουν ειδική αντισωματική απόκριση. Τα ΤΙ-2 (τύπου 2) θυμοανεξάρτητα αντιγόνα, π.χ. οι πολυσακχαρίτες του βακτηριακού τοιχώματος, έχουν επαναληπτικές δομές και ενεργούν διασυνδέοντας σε μεγάλη έκταση τους υποδοχείς των αντιγονοειδικών Β λεμφοκυττάρων. Η συγκέντρωση του αντιγόνου ΤΙ-2 φαίνεται να είναι κομβική για την ενεργοποίηση. Συγκεκριμένα, σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση αυτά τα αντιγόνα είναι ανίκανα να ενεργοποιήσουν τα Β λεμφοκύτταρα της συγκεκριμένης ειδικότητας, ενώ σε πολύ υψηλή συγκέντρωση μπορεί να καταστήσουν το Β λεμφοκύτταρο ανεργικό (Εικόνα 15). 27

28 Εικόνα 15: Αναγνώριση θυμοανεξάρτητων αντιγόνων (TI). Figure 15: Recognition of thymous-independent (TI) antigens. Επειδή η διαδικασία εναλλαγής ισότυπου (CSR) ρυθμίζεται από τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, τα οποία δεν είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση από αντιγόνα ΤΙ, οι ανοσοσφαιρίνες που παράγονται κατά την ανοσοαπόκριση TI είναι ισότυπου IgM. Η ανοσοαπόκριση εναντίον τέτοιων αντιγόνων είναι ιδιαίτερα χαρακτηριστική για ορισμένες περιοχές του λεμφικού ιστού, όπως η οριακή ζώνη του σπλήνα 2,12. Υπεραντιγόνα Τα υπεραντιγόνα (superantigens) είναι μια ειδική κατηγορία αντιγόνων, τα οποία διαφέρουν από τα συμβατικά αντιγόνα επειδή αναγνωρίζονται από τμήματα των υποδοχέων BCR και TCR εκτός των κλασικών θέσεων πρόσδεσης αντιγόνων 36,37 (Εικόνα 16). Η σύνδεση επιτρέπει την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων κατά μη ειδικό τρόπο. Από τα καλύτερα χαρακτηρισμένα υπεραντιγόνα είναι οι τοξίνες των βακτηρίων Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes και Peptostreptococcus magnus 38,39. Εικόνα 16: Πρόσδεση δύο κοινών υπεραντιγόνων, και αντιπαραβολή με τη θέση πρόσδεσης ενός συμβατικού αντιγόνου. Figure 16: Binding of two common superantigens and comparison with the binding site of a common antigen. 28

29 Μηχανισμοί δημιουργίας ποικιλομορφίας στους BCR Γενικά Ο αριθμός και η ποικιλία των αντιγόνων είναι τεράστιος. Με δεδομένο ότι κάθε Β λεμφοκύτταρο φέρει έναν αντιγονικό υποδοχέα συγκεκριμένης ειδικότητας, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ευρύτατης δομικής ετερογένειας στις ανοσοσφαιρίνες ώστε να είναι δυνατή η αναγνώριση του συνόλου των επιτόπων που υπάρχουν στη φύση. Είναι εντυπωσιακό το γεγονός ότι ο οργανισμός του ανθρώπου έχει την ικανότητα αναγνώρισης διαφορετικών επιτόπων, διαθέτει με άλλα λόγια τη δυνατότητα παραγωγής αντίστοιχου αριθμού διακριτών κλώνων Β λεμφοκυττάρων, καθένα από τα οποία διαθέτει έναν αντιγονικό υποδοχέα μοναδικής ειδικότητας. Καθημερινά, στον οργανισμό του ανθρώπου παράγονται 10 7 νέα Β λεμφοκύτταρα. Υπάρχουν τέσσερις μηχανισμοί που εξασφαλίζουν την ύπαρξη της τεράστιας ετερογένειας μεταξύ των αντιγονικών υποδοχέων των Β λεμφοκυττάρων, αλλά και των αντίστοιχων εκκρινόμενων προϊόντων τους, δηλαδή των ανοσοσφαιρινών. Τρεις από αυτούς είναι επακόλουθα της ποικιλομορφίας στα επίπεδα των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών, της διαδικασίας ανασυνδυασμού των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και του συνδυασμού των αλυσίδων (βαριάς και ελαφριάς) ώστε να προκύψει η μεταβλητή περιοχή του μορίου της ανοσοσφαιρίνης. Ο τέταρτος μηχανισμός είναι μια διεργασία εισαγωγής μεταλλάξεων που συμβαίνει στο ανασυνδυασμένο DNA και καλείται σωματική υπερμεταλλαξιγένεση (ΣΥΜ) 2,40. Ανασυνδυασμός V(D)J Η διεργασία αναδιάταξης των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών ονομάζεται ανασυνδυασμός V(D)J και συμβαίνει στο μυελό των οστών κατά την πρώιμη φάση της διαφοροποίησης των Β λεμφοκύτταρων. Το αναπτυσσόμενο Β λεμφοκύτταρο περνά από διακριτά στάδια διαφοροποίησης, τα οποία χαρακτηρίζονται από αντίστοιχα στάδια στη διεργασία παραγωγής του αντιγονικού υποδοχέα. Τελικά, το παρθένο Β λεμφοκύτταρο που απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος εκφράζει ένα μοναδικό, λειτουργικό αντιγονικό υποδοχέα-ανοσοσφαιρίνη, μέσω του οποίου μεταβιβάζει σήματα για την περαιτέρω ανάπτυξη και διαφοροποίησή του 41. Τα γονίδια V, (D) και J περιβάλλονται από cis-ενεργές αλληλουχίες γνωστές ως αλληλουχίες σηματοδότησης του ανασυνδυασμού (recombination signal sequences, RSS). Όλες οι αλληλουχίες RSS έχουν κοινό πρότυπο οργάνωσης (Εικόνα 17Α). Αποτελούνται από δύο συντηρημένες αλληλουχίες: ένα παλίνδρομο επτανουκλεοτίδιο με συναινετική (consensus) αλληλουχία 5 -CACAGTG-3 κι ένα 29

30 εννεανουκλεοτίδιο με συναινετική, πλούσια σε Α/Τ αλληλουχία 5 -ACAAAAACC- 3, τα οποία διαχωρίζονται από διαστηματική περιοχή μήκους 12 ή 23 ζευγών βάσεων 42. Η αλληλουχία της διαστηματικής περιοχής δεν είναι συντηρημένη, καθώς κρίσιμο ρόλο στη λειτουργικότητα των αλληλουχιών RSS έχει μόνο το μήκος της. Δώδεκα ζεύγη βάσεων αντιστοιχούν σε μια στροφή της έλικας του DNA και 23 ζεύγη βάσεων σε δύο στροφές. Συνεπώς, με το συγκεκριμένο μήκος βάσεων εξασφαλίζεται ο προσανατολισμός της επταμερούς και της εννεαμερούς ακολουθίας προς την ίδια πλευρά της έλικας του DNA, όπου αναγνωρίζονται από τα ένζυμα του ανασυνδυασμού. O ανασυνδυασμός δύο γονιδίων είναι εφικτός μόνο εφόσον αυτά διαθέτουν RSS με διαφορετική διαστηματική αλληλουχία (12 bp ή 23 bp). Αυτή η συνθήκη είναι γνωστή ως κανόνας 12/23 ή κανόνας one turn/two turns (Εικόνα 17Β). Εικόνα 17: Α. Οι δύο τύποι αλληλουχιών σηματοδότησης ανασυνδυασμού (RSS) με μήκος 12 ή 23 νουκλεοτίδια B. Κανόνας 12/23, σύμφωνα με τον οποίο ο ανασυνδυασμός συμβαίνει μόνο μεταξύ γονιδίων με διαφορετικές αλληλουχίες RSS. Figure 17: A. Types of recombination signal sequences (RSS) B. Rule 12/2, according to which only genes with different RSS sequences can be recombined. Tα γονίδια κάθε ομάδας φέρουν ένα συγκεκριμένο τύπο RSS και κάθε γονίδιο φέρει την ίδια ακολουθία στα άκρα του. Ο σχηματισμός της μεταβλητής περιοχής μιας βαριάς αλυσίδας, η οποία προκύπτει από τον ανασυνδυασμό ενός γονιδίου IGHD μ ένα γονίδιο IGHJ στο 3 άκρο και στη συνέχεια μ ένα γονίδιο IGHV στο 5 άκρο, θα είναι επιτυχής μόνο αν τα γονίδια IGHV και IGHJ φέρουν RSS με διαστηματική περιοχή ίδιου μήκους (23bp) και το γονίδιο IGHD φέρει ανοδικά και καθοδικά της αλληλουχίας του την εναλλακτική RSS με διαστηματική περιοχή μήκους 12bp. Με αυτή τη διαδικασία διασφαλίζεται ότι ο ανασυνδυασμός θα οδηγήσει σε λειτουργικό προϊόν 2,43. Ο μηχανισμός αναδιάταξης είναι ίδιος για τις βαριές και τις ελαφριές αλυσίδες, με τη διαφορά ότι για την παραγωγή μιας μεταβλητής περιοχής ελαφριάς αλυσίδας χρειάζεται ν ανασυνδυαστούν δύο γονίδια (IGLV και IGLJ) ενώ για τη βαριά αλυσίδα απαιτούνται δύο γεγονότα ανασυνδυασμού, πρώτα ενός γονιδίου IGHD μ ένα γονίδιο IGHJ κι έπειτα του συμπλόκου DJ μ ένα γονίδιο 30

31 IGHV. Ο ανασυνδυασμός V(D)J είναι διεργασία κοπής κι επανένωσης γονιδίων που απέχουν πολύ μεταξύ τους στη βλαστική διάταξη του DNA. Στον επικρατέστερο τύπο ανασυνδυασμού, τα γονίδια που ανασυνδυάζονται έχουν τον ίδιο μεταγραφικό προσανατολισμό, οπότε ο ανασυνδυασμός πραγματοποιείται μέσω κοπής και απαλοιφής του παρεμβαλλόμενου τμήματος DNA. Σε περίπτωση που τα γονίδια έχουν αντίθετο προσανατολισμό, ο ανασυνδυασμός οδηγεί σε αναστροφή του παρεμβαλλόμενου DNA, το οποίο δεν απομακρύνεται από το χρωμόσωμα 2,44 (Εικόνα 18). Πρωτεύοντα ρόλο στον ανασυνδυασμό διαδραματίζουν οι πρωτεΐνες RAG, δύο ένζυμα που σχηματίζουν το ετερο-διμερές σύμπλοκο RAG-1/RAG-2, το οποίο αναγνωρίζει και προσδένεται στις αλληλουχίες RSS. Έπειτα προκαλεί μια μονόκλωνη εντομή στη συμβολή μεταξύ του επταμερούς και της κωδικοποιητικής αλληλουχίας σε καθένα από τα γονίδια που ανασυνδυάζονται [V, (D) ή J]. Από την εντομή προκύπτει ένα ελεύθερο 3 -ΟΗ στην κωδικοποιούσα αλληλουχία, το οποίο «επιτίθεται» στο συμπληρωματικό κλώνο και προκαλεί μια δίκλωνη εντομή (double strand break, DSB) μέσω αντίδρασης trans-εστεροποίησης. Εικόνα 18: Τύποι του ανασυνδυασμού V(D)J, ανάλογα με το μεταγραφικό προσανατολισμό των ανασυνδυαζόμενων γονιδίων. Figure 18: Types of V(D)J recombination depending on the transcriptional orientation of the recombined genes. Έτσι, προκύπτουν τέσσερα ελεύθερα δίκλωνα άκρα DNA. Τα άκρα των γονιδίων καλούνται κωδικοποιητικά, ενώ τα άκρα του τμήματος που φέρει τις αλληλουχίες RSS και το παρεμβαλλόμενο DNA σηματοδοτικά. Οι πρωτεΐνες RAG παραμένουν προσδεδεμένες στις αλληλουχίες RSS, στα σηματοδοτικά άκρα, δημιουργώντας μια δομή γνωστή ως μετασυναπτικό σύμπλοκο (post synaptic complex, PSC). Παράλληλα, στα κωδικοποιητικά άκρα δημιουργείται μια δομή φουρκέτας (hairpin), καθώς το νουκλεοτίδιο με την ελεύθερη ρίζα 3 -ΟΗ σχηματίζει φωσφοδιεστερικό δεσμό με το συμπληρωματικό του νουκλεοτίδιο. O σχηματισμός των δομών αυτών στα δύο είδη άκρων, πυροδοτεί την κινητοποίηση διαφόρων ενζύμων, τα οποία ανήκουν στην κατηγορία ενζύμων ένωσης των μη ομόλογων άκρων (non homologous end-joining, NHEJ). Τα ένζυμα αυτά αναλαμβάνουν την ένωση των κωδικοποιητικών και των σηματοδοτικών άκρων μεταξύ τους 45,46. Το σύμπλοκο των πρωτεϊνών Ku70/Ku80 ενεργοποιεί την πρωτεΐνη DNA-PK και αυτή ενεργοποιεί διαδοχικά την πρωτεΐνη Artemis, η οποία ανοίγει τη δομή φουρκέτας στα κωδικοποιητικά άκρα. Η ακριβής θέση της 31

32 εντομής είναι τυχαία και μπορεί να συμβεί σε οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο της φουρκέτας. Μετά το άνοιγμα της φουρκέτας, το ένζυμο τελική δεοξυνουκλεοτιδική τρανσφεράση (terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) προσθέτει νουκλεοτίδια Ν (χωρίς εκμαγείο - non-templated, N) με τυχαίο τρόπο στα προεξέχοντα άκρα της κωδικοποιητικής αλληλουχίας. Τέλος, η λιγάση IV ενώνει τα μονόκλωνα άκρα ξεκινώντας από μια συμπληρωματική περιοχή και μια εξωνουκλεάση κόβει τα μη συμπληρωματικά νουκλεοτίδια. Η ενεργότητα της λιγάσης IV αυξάνει με τη δράση της πρωτεΐνης XRCC4 10,47,48 (Εικόνα 19). Εικόνα 19: Στάδια του ανασυνδυασμού V(D)J. Figure 19: Steps of V(D)J recombination. Ο σχηματισμός της μεταβλητής περιοχής της αλυσίδας, μέσω του ανασυνδυασμού των γονιδίων V, (D) και J, ακολουθείται από μεταγραφή των ανασυνδυασμένων γονιδίων, συρραφή του πρόδρομου mrna και προσθήκη της poly-a ουράς ώστε να προκύψει το ώριμο μόριο mrna της συγκεκριμένης αλυσίδας (Εικόνα 20). 32

33 Εικόνα 20: Ανασυνδυασμός V(D)J και παραγωγή των βαριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών. Figure 20: V(D)J recombination and immunoglobulin heavy chain production. Ετερογένεια στο συνδυασμό των γονιδίων κάθε αλυσίδας Κάθε ομάδα γονιδίων V, (D) και J περιλαμβάνει έναν αριθμό λειτουργικών γονιδίων ικανών να ανασυνδυαστούν στο πλαίσιο του σχηματισμού της μεταβλητής περιοχής μιας βαριάς ή ελαφριάς αλυσίδας. Για παράδειγμα, στο γενετικό τόπο των βαριών αλυσίδων υπάρχουν 44 λειτουργικά γονίδια IGHV, 23 γονίδια IGHD και 6 γονίδια IGHJ, ανάλογα με τον απλότυπο. Ο τυχαίος ανασυνδυασμός τους μπορεί θεωρητικά να παράγει 9000 διαφορετικές βαριές αλυσίδες με μοναδικό κριτήριο τη γονιδιακή σύνθεση της μεταβλητής περιοχής 2. Ετερογένεια στο συνδυασμό βαριάς-ελαφριάς αλυσίδας Το πρώτο επίπεδο συνδυαστικής ετερογένειας αφορά στο σχηματισμό της μεταβλητής περιοχής της αλυσίδας. Το δεύτερο επίπεδο αναφέρεται στο συνδυασμό βαριάς κι ελαφριάς αλυσίδας ώστε να σχηματιστεί η πλήρης μεταβλητή περιοχή του μορίου της ανοσοσφαιρίνης. Ο τυχαίος συνδυασμός μεταξύ των 9000 διαφορετικών βαριών αλυσίδων και των 340 διαφορετικών ελαφριών αλυσίδων κ ή λ αποδίδει 3x10 6 διαφορετικές ειδικότητες. Ο πραγματικός αριθμός των διαφορετικών συνδυασμών μπορεί να είναι μικρότερος από τον υπολογιζόμενο με βάση τη θεωρητική έκταση της συνδυαστικής ετερογένειας 2. Αυτό πιθανόν εξηγείται από το γεγονός ότι τα γονίδια εμφανίζουν διαφορετικές συχνότητες έκφρασης 49, ενώ παράλληλα συγκεκριμένοι 33

34 συνδυασμοί βαριάς-ελαφριάς αλυσίδας φαίνονται να είναι πιο συχνοί από άλλους, πιθανότατα λόγω αυξημένης σταθερότητας του μορίου 50. Ετερογένεια στη σύνδεση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Ο προηγούμενος υπολογισμός των διαφορετικών ειδικοτήτων των αντιγονικών υποδοχέων έγινε χωρίς την αξιολόγηση της ετερογένειας που προκαλείται στις συμβολές των γονιδίων V, (D) και J κατά τον ανασυνδυασμό (Εικόνα 21). Η συνδετική ετερογένεια αυξάνει σε μεγάλο βαθμό το ρεπερτόριο ειδικοτήτων των αντιγονικών υποδοχέων και οφείλεται κυρίως στη δράση των ενζύμων Artemis και TdT. Η πρωτεΐνη Artemis, η οποία διαθέτει ενεργότητα ενδονουκλεάσης, διασπά τη δομή φουρκέτας στα κωδικοποιητικά άκρα. Όταν η διάσπαση είναι μονόκλωνη σε απόσταση μερικών νουκλεοτιδίων από την κορυφή της δομής, προκύπτει μια μονόκλωνη ουρά στο συμπληρωματικό κλώνο με παλίνδρομη αλληλουχία (νουκλεοτιδία Ρ, palindromic nucleotides). Εικόνα 21: Μηχανισμός συνδετικής ετερογένειας στις περιοχές συμβολής μεταξύ των γονιδίων V, (D) και J κατά τον ανασυνδυασμό. Figure 21: Junctional diversity located at the regions between V, (D) and J genes during the recombination process. Επιπλέον, στη συμβολή των γονιδίων που ανασυνδυάζονται μπορεί να πραγματοποιηθεί de novo προσθήκη νουκλεοτιδίων μέσω της δράσης του ενζύμου TdT. Η TdT είναι ένζυμο του πυρήνα και καταλύει την προσθήκη νουκλεοτιδίων (κατά προτίμηση γουανίνης και κυτοσίνης) σε μονούς κλώνους DNA χωρίς την ύπαρξη εκμαγείου. Η TdT μπορεί να προσθέσει από ένα έως είκοσι τυχαία νουκλεοτίδια, γνωστά ως νουκλεοτίδια Ν. 34

35 H ποικιλότητα αυξάνει ακόμη περισσότερο με τη δράση άλλων ενζύμων με ενεργότητα εξωνουκλεάσης που αφαιρούν νουκλεοτίδια πριν από την οριστική ένωση των γονιδίων 13,51. Μηχανισμός της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης (ΣΥΜ) Οι τρεις προηγούμενοι μηχανισμοί ετερογένειας συμβαίνουν κατά τη διεργασία σχηματισμού ενός πλήρους λειτουργικού μορίου αντιγονικού υποδοχέα. Η ετερογένεια εστιάζεται κυρίως στις συμβολές των γονιδίων, δηλαδή στην περιοχή VH/L CDR3 των αλυσίδων. Η σωματική υπερμεταλλαξιγένεση (ΣΥΜ) προκαλεί ετερογένεια σε όλη την έκταση της μεταβλητής περιοχής κι ενεργοποιείται μετά την επαφή του Β λεμφοκυττάρου με το αντιγόνο. Συνίσταται στην εισαγωγή μεταλλάξεων στις μεταβλητές περιοχές της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας με πολύ υψηλή συχνότητα. Η τυχαία εισαγωγή μεταλλάξεων αποσκοπεί στη βελτίωση της συγγένειας του Β λεμφοκυττάρου με το συγκεκριμένο αντιγόνο. Τα Β λεμφοκύτταρα των οποίων ο υποδοχέας έχει αποκτήσει το ιδανικότερο πρότυπο μεταλλάξεων επιλέγονται για πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση σε μια διεργασία που αναφέρεται ως ωρίμανση συγγένειας (affinity maturation) (Εικόνα 22Α). Η ΣΥΜ συμβάλλει ουσιαστικά στην αύξηση της ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών, με αποτέλεσμα ο οργανισμός να μπορεί να παράγει έως και διαφορετικά μόρια ανοσοσφαιρίνης. Η συχνότητα εισαγωγής μεταλλάξεων μέσω του μηχανισμού της ΣΥΜ κυμαίνεται από 10-5 έως 10-3 /bp/κυτταρική γενιά και είναι σαφώς μεγαλύτερη από τη συχνότητα εισαγωγής αυθόρμητων μεταλλάξεων στο γονιδίωμα ενός φυσιολογικού κυττάρου ( ). Για το συγκεκριμένο λόγο χαρακτηριστικά αναφέρεται ως «υπερμεταλλαξιγένεση» (hypermutation)

36 Εικόνα 22: Α. Συχνότητα εισαγωγής μεταλλάξεων μέσω του μηχανισμού της ΣΥΜ κατά μήκος των γενετικών τόπων ΙGH και IGK: P-υποκινητής, L-χειριστής, ie- ιντρονικός ενισχυτής, SRαλληλουχία για εναλλαγή ισοτύπου, 3 RR 3 -ρυθμιστική περιοχή,matrix attachment regions (MARs), αλληλουχίες ευαίσθητες στη DNAάση Ι (hs). Β. Στόχευση της ΣΥΜ εντός των μεταβλητών περιοχών των λειτουργικών αναδιατάξεων. Figure 22: A. Mutation rate by the somatic hypermutation mechanism (SHM) across the IGH and IGK genetic loci: P-promoter, L-leader, ie-intronic enhancer, SR-switch region, 3 RR 3 -regulatory region, matrix attachment regions (MARs), DNAase sensitive sequences (hs). B. Targeting of the SHM mechanism across the variable domain of functional rearrangements. Η ΣΥΜ εισάγει κυρίως σημειακές αντικαταστάσεις βάσεων και σπάνια προκαλεί ενθέσεις ή απαλοιφές (insertions/deletions) τμημάτων DNA. Εισαγωγή μεταλλάξεων συμβαίνει τόσο σε λειτουργικές όσο και σε μη λειτουργικές αναδιατάξεις, με διαφορετικό ωστόσο τρόπο. Στις μη λειτουργικές αναδιατάξεις, οι μεταλλάξεις παρουσιάζουν τυχαία κατανομή, ενώ, αντίθετα, στις λειτουργικές αναδιατάξεις υπάρχει μια τάση στόχευσης συγκεκριμένων νουκλεοτιδικών θέσεων. Συγκεκριμένα, στις περιοχές VH/L CDR παρατηρείται επιλεκτικότητα στην εισαγωγή μεταλλάξεων αντικατάστασης (replacement mutations, R), ενώ στις περιοχές πλαισίου κυριαρχούν οι «σιωπηρές» μεταλλάξεις 53 (silent mutations, S) (Εικόνα 22Β). Επιπλέον, ο μηχανισμός της ΣΥΜ φαίνεται ότι στοχεύει επιλεκτικά νουκλεοτίδια G και C έναντι των Α και Τ και πουρίνες έναντι των πυριμιδινών, ενώ χαρακτηρίζεται από επικράτηση των μεταβάσεων (transitions) σε σχέση με τις μεταπτώσεις (transversions). Τέλος, η ΣΥΜ στοχεύει επιλεκτικά συγκεκριμένα κωδικόνια των γονιδίων IGHV σε σχέση με άλλα. Οι θέσεις αυτές ονομάζονται «θερμές θέσεις» ή «επίκεντρα» εισαγωγής μεταλλάξεων (mutational hotspots) και συχνά είναι μοτίβα τριών ή τεσσάρων νουκλεοτιδίων, π.χ. RGYW, WYGR (R: πουρίνη, Y: πυριμιδίνη, W: A ήt) και GNW 54,55. Καθοριστικό ρόλο στο μηχανισμό της ΣΥΜ διαδραματίζει το ένζυμο δεαμινάση της κυτιδίνης (activation-induced cytidine deaminase, AID) και οι 36

37 επιρρεπείς σε λάθη πολυμεράσες (error-prone polymerases). Στον άνθρωπο, η AID κωδικοποιείται από το γονίδιο HIGM2 και εκφράζεται μόνο στα ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα, ιδίως στα Β λεμφοκύτταρα του βλαστικού κέντρου. Το μόριο της AID αποτελείται από 198 αμινοξέα και περιέχει ένα μοναδικό μοτίβο δεαμινάσης της κυτιδίνης στις θέσεις Η AID και τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας των δεαμινασών μετατρέπουν την κυτοσίνη (C) σε ουρακίλη (U) 56,57. Παρότι έχουν προταθεί πολλά μοντέλα, ο ακριβής μηχανισμός της ΣΥΜ παραμένει άγνωστος. Πρόσφατα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΣΥΜ δρα σε δύο φάσεις: η πρώτη φάση βασίζεται στη δράση της AID, ενώ η δεύτερη χαρακτηρίζεται από τη δράση επιδιορθωτικών μηχανισμών επιρρεπών σε λάθη. Συγκεκριμένα, στην πρώτη φάση η AID απαμινώνει ορισμένες C του DNA-στόχου με αποτέλεσμα τη δημιουργία αταίριαστων (μη κανονικών) ζευγών βάσεων U-G. Τα μη κανονικά ζεύγη U-G απαλείφονται κι επιδιορθώνονται μέσω της οδού εκτομής βάσεων. Η συγκεκριμένη οδός ΣΥΜ αναφέρεται ως σύντομη επιδιόρθωση (short-patch basepair excision, SP-BER). Εναλλακτικά, η επιδιόρθωση των αντικανονικών ζευγών πραγματοποιείται κατά τη δεύτερη φάση, μέσω του μονοπατιού της εκτεταμένης επιδιόρθωσης (long-patch base-pair excision, LP-BER), όπου κρίσιμο ρόλο παίζουν οι επιρρεπείς σε λάθη πολυμεράσες 58,59. Πληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων και οργάνωση του περιφερικού λεμφικού συστήματος Πληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια Γενικά Τα Β λεμφοκύτταρα συμμετέχουν στις ανοσοαποκρίσεις μέσω της πρόσδεσης και παρουσίασης αντιγονικών επιτόπων στα Τ λεμφοκύτταρα και της παραγωγής ανοσοσφαιρινών. Διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες: τα θυλακοειδή (follicular, FO), τα Β-1 και τα Β λεμφοκύτταρα της οριακής ζώνης (MZ cells). Τα Β-1 κύτταρα υποδιαιρούνται περαιτέρω στους υποπληθυσμούς Β-1a και B-1b. Οι διαφορές μεταξύ των Β λεμφοκυττάρων αφορούν στην ανατομική θέση τους, την ικανότητά τους να μεταναστεύουν μεταξύ των ιστών και τη συμμετοχή τους σε θυμοεξαρτημένες ή θυμοανεξάρτητες ανοσοαποκρίσεις 60. Θυλακοειδή Β- λεμφοκύτταρα (FO) Τα FO Β λεμφοκύτταρα, ή Β2 Β λεμφοκύτταρα, συμμετέχουν στις θυμοεξαρτημένες ανοσοαποκρίσεις (TD). Τα FO Β λεμφοκύτταρα κυκλοφορούν διαμέσου του αίματος και της λέμφου κι εντοπίζονται στα θηλάκια (follicles) των λεμφαδένων, του σπλήνα και του λεμφικού ιστού των βλεννογόνων. Στις 37

38 περιοχές αυτές αναγνωρίζουν αντιγόνα πρωτεϊνικής φύσης και τα παρουσιάζουν στα Τ λεμφοκύτταρα. Στη συνέχεια, τα FO κύτταρα λαμβάνουν σήματα ενεργοποίησης μέσω του BCR, του υποδοχέα CD40 και των υποδοχέων TLR. Στην αρχή της ανοσοαπόκρισης τύπου TD, τα FO Β λεμφοκύτταρα μπορεί να ενεργοποιηθούν για πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση σε πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα. Τα κύτταρα αυτά είναι βραχύβια και δε μεταναστεύουν. Αυτό μπορεί να συμβεί μέσω σηματοδότησης από τους υποδοχείς TLR, αφού έχουν ήδη ενεργοποιηθεί μέσω του BCR και του CD40. Εναλλακτικά, τα FO Β λεμφοκύτταρα μεταναστεύουν στο βλαστικό κέντρο όπου υπόκεινται σε σωματική υπερμεταλλαξιγένεση με σκοπό την αύξηση της ισχύος σύνδεσής τους με το αντιγόνο. Η διεργασία ωρίμανσης συγγένειας έχει χαρακτήρα θετικής επιλογής, καθώς επιλέγονται και διασώζονται μόνο τα Β λεμφοκύτταρα που αποκτούν έντονο σήμα ενεργοποίησης μέσω της ισχυρής πρόσδεσης του αντιγόνου. Τα κύτταρα αυτά πολλαπλασιάζονται και ταυτόχρονα υφίστανται εναλλαγή ισότυπου. Τελικά, τα κύτταρα εγκαταλείπουν το βλαστικό κέντρο και διαφοροποιούνται σε κύτταρα μνήμης ή πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνες και συχνά μεταναστεύουν στο μυελό των οστών, όπου επιβιώνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα 35,60,61 (Εικόνα 23). Πληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων με ιδιαίτερες λειτουργικές ιδιότητες Τα ΜΖ Β λεμφοκύτταρα, όπως και τα Β-1 Β λεμφοκύτταρα, αποτελούν διακριτούς κυτταρικούς πληθυσμούς που φαίνεται ότι έχουν εξελιχθεί για την αντιμετώπιση συγκεκριμένων παθογόνων. Η ύπαρξη πληθυσμών Β λεμφοκυττάρων με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά σε κομβικές θέσεις του περιφερικού λεμφικού συστήματος προσφέρει σημαντικές ενδείξεις για τον τρόπο λειτουργίας και την εξέλιξη του ανοσοποιητικού συστήματος. Συγκεκριμένα, πέρα από τα θεμελιώδη σύνολα δράσεων της επίκτητης και της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης, το ανοσοποιητικό σύστημα διαθέτει ιδιαίτερους πληθυσμούς Β λεμφοκυττάρων γεωγραφικά περιορισμένους σε κρίσιμες θέσεις, ώστε να αντιμετωπίζει με άμεσο τρόπο συγκεκριμένους τύπους μολυσματικών παραγόντων 62,63. Τα ΜΖ και τα Β-1 Β λεμφοκύτταρα χαρακτηρίζονται από περιορισμένο ρεπερτόριο αντιγονικών ειδικοτήτων κι εξασφαλίζουν την ταχύτατη ανάπτυξη βραχύβιων ανοσοαποκρίσεων έναντι ενός περιορισμένου συνόλου μολυσματικών παραγόντων με κοινές, συντηρημένες δομές. H συντηρημένη φύση των αντιγονικών επιτόπων επιτρέπει την ενεργοποίηση των συγκεκριμένων Β λεμφοκυττάρων χωρίς την ανάγκη παρεμβολής του σταδίου ωρίμανσης συγγένειας. Ουσιαστικά, η ανοσία που παρέχεται από τους συγκεκριμένους πληθυσμούς Β λεμφοκυττάρων αποτελεί το συνδετικό κρίκο 38

39 μεταξύ της επίκτητης και της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης. Συνολικά, η ανοσοαπόκριση από τα ΜΖ και Β1 Β λεμφοκύτταρα χαρακτηρίζεται από αμεσότητα (συνήθως δεν εμπλέκεται ενεργοποίηση βοηθητικών Τ λεμφοκυττάρων), χαμηλή συγγένεια αναγνώρισης και πολυ-αντιδραστικότητα (καθώς αναγνωρίζεται πλήθος διαφορετικών παθογόνων μέσω των συντηρημένων δομικών μοτίβων τους). Οι ιδιαίτεροι αυτοί πληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων φαίνεται ότι έχουν αναπτυχθεί μέσω σχετικά ισχυρών σημάτων επιλογής για την αναγνώριση αυτόλογων αντιγόνων, ενδεχομένως στο στάδιο των ανώριμων Β λεμφοκυττάρων. Συνεπώς, οι υποδοχείς τους συχνά χαρακτηρίζονται από αυτοδραστικότητα. Τα Β λεμφοκύτταρα με ειδικότητες εναντίον στοιχείων του ίδιου του οργανισμού μπορεί να διατηρηθούν επειδή: (i) προσφέρουν μια πρώτη γραμμή άμυνας εναντίον επικίνδυνων παθογόνων και (ii) παράγουν αυτοδραστικές ανοσοσφαιρίνες IgM που συμμετέχουν στη διεργασία αποδόμησης αποπτωτικού υλικού. Είναι επομένως πιο ασφαλής για τον οργανισμό ο αποκλεισμός αυτών των κυττάρων από αντιδράσεις του βλαστικού κέντρου, ώστε να ελαττώνεται ο κίνδυνος παρουσίας αυτο-δραστικών Β λεμφοκυττάρων υψηλής συγγένειας στη δεξαμενή των μακρόβιων κυττάρων μνήμης. Συνολικά, τα λειτουργικά χαρακτηριστικά των Β-1 και ΜΖ Β λεμφοκυττάρων αντιστοιχούν σε χαρακτηριστικά Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Καθώς κατά την ανάπτυξή τους φαίνεται να εμπλέκεται, σε κάποιο βαθμό, η αλληλεπίδραση με αντιγόνα του ιδίου ή κάποιου συμβιωτικού οργανισμού, μπορεί να χαρακτηριστούν ως στοιχεία της φυσικής άνοσης μνήμης (Εικόνα 23). Β1 Β λεμφοκύτταρα Εικόνα 23: Ανάπτυξη και ιδιαίτερες λειτουργίες των Β λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών (Προέλευση: LeBien, TW et al.; Blood Sep 1;112(5): ). Figure 23: Development and specific functions of different B cell subpopulations (Origin: LeBien, TW et al.; Blood Sep 1;112(5): ). Ο πληθυσμός των B-1 Β λεμφοκυττάρων έχει ταυτοποιηθεί σε διαγονιδιακά μοντέλα τρωκτικών, από τη μελέτη των οποίων προέρχονται οι περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη φύση τους. Αντίστοιχος πληθυσμός Β λεμφοκυττάρων δεν έχει καθοριστεί ακόμη σαφώς στον άνθρωπο. Ωστόσο, 39

40 πρόσφατα ευρήματα υποδηλώνουν την ύπαρξη B-1 λεμφοκυττάρων και στον άνθρωπο 67. Τα Β-1 Β λεμφοκύτταρα εντοπίζονται στην περιτοναϊκή κοιλότητα και τον υπεζωκότα κι έχουν χαρακτηριστικό φαινότυπο IgD high IgM low/- CD23 - CD43 + CD45 low. Ο συγκεκριμένος κυτταρικός πληθυσμός διαχωρίζεται περαιτέρω με βάση την έκφραση του δείκτη CD5. Τα CD5 + κύτταρα αποτελούν τον πληθυσμό των B-1a κυττάρων, ενώ τα B-1b κύτταρα είναι CD5 -. Τα Β-1 κύτταρα φαίνεται να συμμετέχουν σε άνοσες απαντήσεις τύπου ΤΙ, μέσω έκκρισης ανοσοσφαιρινών IgM εναντίον κοινών βακτηριακών συστατικών, π.χ. της φωσφορυλοχολίνης (phosphorylcholine, PC). Η ενεργοποίησή τους μπορεί να γίνει άμεσα μέσω αναγνώρισης μορίων όπως οι λιποπολυσακχαρίτες (LPS), μέσω των υποδοχέων TLR. Στην περίπτωση αυτή, τα κύτταρα ενεργοποιούνται για πολλαπλασιασμό και διαφοροποιούνται σε βραχύβια πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν ανοσοσφαιρίνες IgM. Η προέλευσή τους παραμένει αμφιλεγόμενη. Πειραματικά δεδομένα ενισχύουν την άποψη ότι ο υποπληθυσμός κυττάρων Β-1a προκύπτει από εμβρυϊκά προγονικά κύτταρα, μέσω ενός ιδιαίτερου μονοπατιού ανάπτυξης. Ωστόσο, η έκφραση του CD5 παρατηρείται και σε ώριμα σπληνικά Β λεμφοκύτταρα, ενώ τα περισσότερα CD5 + λεμφοκύτταρα της περιτοναϊκής κοιλότητας φέρουν νουκλεοτίδια Ν στις συμβολές των γονιδίων IGHV-IGHD-IGHJ, γεγονός ασύμβατο με την προέλευση από κύτταρα του εμβρυϊκού σπλήνα, τα οποία δεν εκφράζουν το ένζυμο TdT 60,68. Β λεμφοκύτταρα της οριακής ζώνης (MZ Β cells) Τα Β λεμφοκύτταρα της οριακής ζώνης έχουν ανοσοφαινότυπο IgΜ high IgD low CD23 - CD21 + CD1c +. Η μορφολογία τους είναι χαρακτηριστική: είναι λίγο μεγαλύτερα από τα υπόλοιπα κύτταρα της οριακής ζώνης, έχουν ομαλό πυρηνικό περίγραμμα και μέτρια αυξημένο, διαυγές κυτταρόπλασμα. Ο φαινότυπός τους αντιστοιχεί σε ώριμα Β λεμφοκύτταρα, ενώ χαρακτηρίζονται από ασθενή έκφραση ανοσοσφαιρίνης IgD στην επιφάνειά τους. Τα κύτταρα αυτά καταλαμβάνουν μεγάλο μέρος της οριακής ζώνης του σπλήνα και συμμετέχουν στη διεκπεραίωση των σημαντικών προστατευτικών λειτουργιών της. Συγκεκριμένα, τα ΜΖ Β λεμφοκύτταρα συμμετέχουν στην προστασία εναντίον των παθογόνων που φτάνουν στο σπλήνα με την κυκλοφορία του αίματος και πυροδοτούν ανοσοαποκρίσεις εναντίον αντιγόνων τύπου ΤΙ-2, όπως οι πολυσακχαρίτες της επιφάνειας των βακτηριακών τοιχωμάτων 66,69. Τα ΜΖ Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν αντιγόνα και διαφοροποιούνται άμεσα (σε 3-4 ημέρες από την ενεργοποίησή τους) σε πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες ανοσοσφαιρινών IgM. Εκφράζουν ένα συνδυασμό σηματοδοτικών μορίων που τους επιτρέπει να αντιδρούν πολύ ταχύτερα από την πλειονότητα των Β λεμφοκυττάρων του σπλήνα (FO Β λεμφοκύτταρα) 65,70. Η 40

41 ανατομική θέση τους υπαγορεύει την ανάγκη αναγνώρισης και απόκρισης σε ευρύ φάσμα αντιγόνων, έστω και με χαμηλή συγγένεια. Η ενεργοποίησή τους μέσω ασθενούς σηματοδότησης πιθανότατα παίζει κρίσιμο ρόλο σε αυτή την ιδιότητά τους, επειδή τους προσδίδει τη δυνατότητα αντίδρασης σε μικρότερη συγκέντρωση αντιγόνων και με χαμηλότερη συγγένεια πρόσδεσης. Τα ΜΖ Β λεμφοκύτταρα του σπλήνα χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση του υποδοχέα του C3d του συμπληρώματος (CD21), το οποίο σχηματίζει σύμπλοκο με τους υποδοχείς CD19, ΤΑPΑ-1 και Leu-13. Το σύμπλοκο αυτό συνδέεται με τον BCR και οδηγεί σε αύξηση του ορίου ενεργοποίησής του 71,72. Ο πληθυσμός των ΜΖ Β λεμφοκυττάρων εντοπίζεται στην οριακή ζώνη του σπλήνα μόλις αυτή καταστεί πλήρως λειτουργική, σε ηλικία άνω των 2 ετών. Ωστόσο, IgM + IgD + Β λεμφοκύτταρα με αντιγονική εμπειρία και φαινότυπο συμβατό με τα ΜΖ Β λεμφοκύτταρα έχουν εντοπιστεί και στο περιφερικό αίμα παιδιών κάτω των δύο ετών. Έρευνες γονιδιακής έκφρασης και φασματογραφίας της περιοχής CDR3 της βαριάς αλυσίδας υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα αυτά είναι πιθανόν αντίστοιχα των ΜΖ Β λεμφοκυττάρων στην κυκλοφορία του αίματος 73. Μάλιστα, εμφανίζουν επιλεκτικότητα στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων ανοσοσφαιρινών και, όπως η πλειονότητα των ΜΖ Β λεμφοκυττάρων, φέρουν μεταλλάξεις στους αντιγονικούς υποδοχείς τους, ένδειξη ότι πρόκειται για κλασσικά Β λεμφοκύτταρα μνήμης. Ωστόσο, το γεγονός ότι ανιχνεύονται σε ασθενείς με σύνδρομο υπερ-igm (hyper-igm syndrome), οι οποίοι παρουσιάζουν αδυναμία ανάπτυξης βλαστικών κέντρων εξαιτίας μεταλλάξεων στον υποδοχέα CD40L 74, υποδεικνύει την προέλευση του πληθυσμού αυτού μέσω ενός εναλλακτικού μονοπατιού, το οποίο δεν είναι ακόμη καθορισμένο. Ωστόσο, σε αντιστοιχία με πειράματα σε διαγονιδιακά ποντίκια με αντικείμενο την προέλευση των ΜΖ λεμφοκυττάρων του σπληνός, στην εναλλακτική αυτή πορεία διαφοροποίησης φαίνεται να παίζει ρόλο η ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Notch-2 στο στάδιο των ανώριμων Β λεμφοκυττάρων 68,75. Περιφερικά λεμφικά όργανα Γενικά στοιχεία Η παραγωγή και ωρίμανση των λεμφοκυττάρων πραγματοποιείται στα πρωτογενή λεμφικά όργανα. Το σύνολο των λεμφοκυττάρων παράγονται στο μυελό των οστών, όμως μόνο τα Β λεμφοκύτταρα ωριμάζουν εκεί, ενώ τα Τ λεμφοκύτταρα μεταναστεύουν στο θύμο αδένα, όπου και ωριμάζουν. Μετά την ωρίμανσή τους, τα λεμφοκύτταρα εγκαταλείπουν τα πρωτογενή λεμφικά όργανα και εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος. Σε αυτό το στάδιο έχουν την ικανότητα αλληλεπίδρασης με αντιγόνο. Η σύνδεση λεμφοκυττάρου-αντιγόνου 41

42 πραγματοποιείται στα δευτερογενή ή περιφερικά λεμφικά όργανα. Τα δευτερογενή λεμφικά όργανα περιλαμβάνουν το σπλήνα, τα λεμφοζίδια, το λεμφικό ιστό που σχετίζεται με τους βλεννογόνους και το διάχυτο λεμφικό ιστό στο σώμα. Τα παρθένα Β λεμφοκύτταρα επανακυκλοφορούν συνεχώς στα δευτερογενή λεμφικά όργανα, όπου μεταφέρονται αντιγόνα από οποιαδήποτε πιθανή εστία λοίμωξης 2 (Εικόνα 24). Λεμφαδένες και λεμφικοί ιστοί των βλεννογόνων Οι λεμφαδένες είναι οι θέσεις σύγκλισης ενός δικτύου αγγείων (λεμφαγγεία) που συλλέγει το εξωκυττάριο υγρό (λέμφος) από τους ιστούς και το επαναφέρει στην κυκλοφορία, ενώ παράλληλα αποτελούν και θέσεις συγκέντρωσης των λεμφοκυττάρων. Τα Β λεμφοκύτταρα συγκεντρώνονται στα θηλάκια του φλοιού των λεμφαδένων, ενώ τα Τ λεμφοκύτταρα στις παραφλοιώδεις περιοχές. Τα προσαγωγά λεμφαγγεία μαζί με το εξωκυττάριο υγρό από τους ιστούς μεταφέρουν και αντιγόνα από εστίες λοίμωξης, τα οποία παγιδεύονται στους λεμφαδένες. Εικόνα 24: Το περιφερικό λεμφικό σύστημα. Figure 24: Peripheral lymphoid system. Τα παρθένα Β λεμφοκύτταρα από την κυκλοφορία του αίματος εισέρχονται επίσης στους λεμφαδένες μέσω εξειδικευμένων αντιδράσεων προσκόλλησης με συγκεκριμένα μόρια στα τριχοειδή αγγεία και συσσωρεύονται μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αν τα Β λεμφοκύτταρα δεν έρθουν σε επαφή με αντιγόνο, τότε περνούν και πάλι στην κυκλοφορία του αίματος μέσω των απαγωγών λεμφαγγείων. Αν όμως αναγνωρίσουν αντιγόνο κι ενεργοποιηθούν από τα κατάλληλα βοηθητικά κύτταρα, πολλαπλασιάζονται αρχικά στις περιοχές των Τ κυττάρων κι έπειτα μερικά από τα διεγερμένα κύτταρα μεταναστεύουν στο κέντρο των θηλακίων. Επτά έως 10 ημέρες μετά την 42

43 ανοσοποίηση, τα δευτερογενή θηλάκια αποκτούν πολικότητα και το μικροπεριβάλλον που δημιουργείται ονομάζεται βλαστικό κέντρο 2,34. Οι λεμφικοί ιστοί των βλεννογόνων περιλαμβάνουν τις αμυγδαλές, τις αδενοειδείς εκβλαστήσεις, τη σκωληκοειδή απόφυση και τις πλάκες του Peyer, οι οποίες είναι εξειδικευμένες περιοχές του λεπτού εντέρου. Η λειτουργία των συγκεκριμένων λεμφικών ιστών είναι η αντιμετώπιση αντιγόνων που εντοπίζονται στο επιθήλιο διαφόρων βλεννογόνων και διαφέρουν μορφολογικά από τους λεμφαδένες καθώς αποτελούνται κυρίως από ένα θολωτό θηλάκιο όπου συγκεντρώνονται τα Β λεμφοκύτταρα, το οποίο περιβάλλεται από μικρό αριθμό Τ λεμφοκυττάρων 2. Σπλήνας Ο σπλήνας είναι επιφορτισμένος με τη συλλογή αντιγόνων από το αίμα, ενώ επιπλέον συλλέγει και καταστρέφει τα γερασμένα ερυθρά αιμοσφαίρια. Το μεγαλύτερο μέρος του σπλήνα αποτελείται από τον ερυθρό πολφό που είναι η περιοχή καταστροφής των ερυθρών αιμοσφαιρίων και των αιμοπεταλίων. Ο Εικόνα 25: Η οριακή ζώνη του σπλήνα. Ανοσοϊστοχημική χρώση με anti-cd20, anti-igd, anti- CD1c και anti-cd27 αντισώματα. ΜΖ: οριακή ζώνη. Co: στεφάνη του μανδύα. GC: βλαστικό κέντρο (Προέλευση: Weller, S. et al.; Blood December; 104(12): ). Figure 25: Marginal zone of the spleen. Immunohistochemical staining with anti-cd20, anti-igd, anti-cd1c and anti-cd27 antibodies. MZ: marginal zone. Co: corona. GC: germinal center. (Origin: Weller, S. et al.; Blood December; 104(12): ). λευκός πολφός του σπλήνα αποτελείται από συναθροίσεις λεμφοκυττάρων και περιβάλλει τα αρτηρίδια του οργάνου. Στον περιφερικό κόλπο, γύρω από τα αρτηρίδιο, βρίσκεται η περιφερική λεμφική θήκη (ΠΑΛΘ), που αποτελείται κυρίως από Τ λεμφοκύτταρα. Τα λεμφικά θυλάκια που περιέχουν τα Β λεμφοκύτταρα βρίσκονται δίπλα στην ΠΑΛΘ, σχηματίζοντας τη Β κυτταρική στεφάνη. Συνεπώς, η οργάνωση της δομής του σπλήνα γενικά μοιάζει με την αντίστοιχη των λεμφαδένων. Η κύρια διαφορά είναι λειτουργική, καθώς ο σπλήνας δεσμεύει αντιγόνα που προέρχονται από το αίμα και όχι από τη λέμφο 2. Η οριακή ζώνη του σπλήνα (splenic marginal zone, SMZ) είναι μια λειτουργικά και ανατομικά διακριτή περιοχή του λευκού πολφού του σπληνικού παρεγχύματος με περιλεμφοζιδιακή 43

44 ανάπτυξη (Εικόνα 25), η οποία αποτελείται κατά κύριο λόγο από έναν υποπληθυσμό Β λεμφοκυττάρων με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Παρά την αδρή μορφολογική ομοιογένεια που χαρακτηρίζει τη φυσιολογική SMZ, είναι αποδεκτό ότι σε αυτή συνυπάρχουν Β λεμφοκυτταρικοί πληθυσμοί που χαρακτηρίζονται από ετερογένεια στο στάδιο διαφοροποίησης και τη λειτουργική πλαστικότητα τους 69. Στη SMZ συνυπάρχουν παρθένα (naive) Β λεμφοκύτταρα, Β λεμφοκύτταρα με «μεταλλαγμένους» BCR και φαινότυπο κυττάρων μνήμης που έχουν περάσει από το βλαστικό κέντρο και, τέλος, Β λεμφοκύτταρα με «μεταλλαγμένους» BCR και φαινότυπο που συνηγορεί υπέρ της προέλευσής τους από Β λεμφοκύτταρα της οριακής ζώνης. Η μεγάλη ετερογένεια των κυτταρικών πληθυσμών της SMZ αντικατοπτρίζει τον κρίσιμο ρόλο της στην ανοσοποίηση του οργανισμού. Συγκεκριμένα, η SMZ έχει διπλό λειτουργικό ρόλο. Εξαιτίας της ανατομικής θέσης του σπλήνα, η SMZ είναι το πρώτο λεμφικό κυτταρικό διαμέρισμα που έρχεται σε επαφή με τα αντιγόνα που κυκλοφορούν στο αίμα. Η ταχύτατη απόκριση εναντίον αυτών των αντιγόνων πραγματοποιείται χάρη στην ύπαρξη ενός λεμφοκυτταρικού πληθυσμού που έχει την ικανότητα να τα αναγνωρίζει ακόμη και με χαμηλή συγγένεια ή σε χαμηλή συγκέντρωση. Επιπλέον, η παρουσία αντιγονο-ειδικών Β λεμφοκυττάρων μνήμης εξασφαλίζει τη δραστική εξειδικευμένη δευτερογενή ανοσοαπόκριση εναντίον τους. Η δεύτερη λειτουργία της SMZ είναι πιο εξειδικευμένη και αφορά στην αναγνώριση αντιγόνων τύπου TI-2. Κύριοι εκπρόσωποι της συγκεκριμένης ομάδας αντιγόνων είναι οι πολυσακχαρίτες του τοιχώματος των βακτηρίων. Τα αντιγόνα τύπου ΤΙ-2 έχουν χαμηλή ανοσογονικότητα και τα κύτταρα στο ανατομικό περιβάλλον της SMZ είναι τα πλέον κατάλληλα για την αναγνώρισή τους και την εκδήλωση ανοσοαπόκρισης εναντίον τους 72. Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) Γενικά Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι χρόνια κακοήθης νεοπλασία των Β λεμφοκυττάρων. Τα νεοπλασματικά λεμφοκύτταρα είναι πιο μακρόβια από τα φυσιολογικά Β λεμφοκύτταρα κι εκφράζουν τους δείκτες CD19 ή CD20, CD5, CD23 καθώς και χαμηλά επίπεδα ανοσοσφαιρίνης και των δεικτών CD79b και CD22 στην επιφάνειά τους Η ανάπτυξη της νόσου συνίσταται σε σταδιακή συσσώρευση μικρών, ώριμων Β λεμφοκυττάρων στο αίμα, το μυελό των οστών και τους δευτερογενείς λεμφικούς ιστούς. Μορφολογικά, τα λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ έχουν μικρό μέγεθος με στρογγυλό πυρήνα, πυκνή χρωματίνη και λιγοστό κυτταρόπλασμα

45 Η ΧΛΛ είναι η πιο κοινή μορφή λευχαιμίας στο δυτικό ημισφαίριο (~30% του συνόλου των περιπτώσεων λευχαιμίας). Προσβάλλει κυρίως άνδρες (αναλογία Α:Γ = 2:1) με ηλικία μεγαλύτερη των 60 ετών 80,81. Η επιδημιολογία της νόσου υποδηλώνει γενετική προδιάθεση. Επιπλέον, το 10% των ασθενών με ΧΛΛ έχουν έναν πρώτου ή δευτέρου βαθμού συγγενή με ΧΛΛ 82. Η κλινική πορεία παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια, η οποία πιθανόν αντανακλά την ετερογένεια που παρατηρείται σε γενετικό και φαινοτυπικό επίπεδο. Η βασική έρευνα οδήγησε στον εντοπισμό σημαντικών προγνωστικών δεικτών με αποτέλεσμα τη διάκριση των ασθενών σε δύο υποομάδες με διαφορετικά μοριακά και κλινικά χαρακτηριστικά: κάποιοι ασθενείς επιβιώνουν για πολλά χρόνια χωρίς θεραπεία και τελικά πεθαίνουν από άλλα αίτια, ενώ άλλοι εκδηλώνουν πιο επιθετική μορφή της νόσου, χρειάζονται άμεση χορήγηση θεραπείας και ο χρόνος επιβίωσής τους είναι σημαντικά μικρότερος. 80. Η συχνότητα ανίχνευσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών στα κλωνογενή κύτταρα της ΧΛΛ κυμαίνεται από 30-50% με μεθόδους κλασσικής κυτταρογενετικής και έως περίπου 80% με τη μέθοδο του φθορίζοντος υβριδισμού in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH) 83. Παρότι δεν υπάρχει κάποια συγκεκριμένη κυτταρογενετική βλάβη που να θεωρείται ειδική για τη ΧΛΛ, κάποιες ανωμαλίες παρατηρούνται συχνότερα. Από τις πιο συχνές κυτταρογενετικές ανωμαλίες είναι η έλλειψη στο χρωμόσωμα 13, που θεωρείται ως δείκτης καλής πρόγνωσης, και η τρισωμία του χρωμοσώματος 12, η οποία έχει συσχετιστεί μ ενδιάμεση ή δυσμενή πρόγνωση 84,85. Επιπλέον, ελλείψεις στις χρωμοσωμικές ζώνες 11q22-q23, όπου εντοπίζονται τα γονίδια RDX (radixin) και ATM (ataxia telangiectasia mutated) και, ιδίως, στο 17p (TP53) καθορίζουν μια ομάδα ασθενών με επιθετική/ταχεία εξέλιξη της νόσου και μικρή επιβίωση. Εξίσου δυσμενής είναι η πρόγνωση για ασθενείς με μεταλλάξεις του γονιδίου TP53 χωρίς δομική ανωμαλία του χρωμοσώματος 17p 85. Ένας νέος παράγοντας για τη διάκριση ασθενών με ΧΛΛ σε υποομάδες με πιθανή προγνωστική αξία είναι το πρότυπο έκφρασης των micrornas 86. Πειράματα έδειξαν ότι η έκφραση συγκεκριμένου πάνελ micrornas (mir186, mir132, mir16-1, mir102, και mir29c) συνδέεται με καλύτερη πρόγνωση 87. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι δύο μόρια micrornas (mirn15a/mirn16-1) εντοπίζονται στην περιοχή 13q14.3, η οποία αποτελεί ιδιαίτερα συχνό στόχο γενετικών ελλείψεων 88. Ωστόσο, η έκφραση των συγκεκριμένων micrornas φαίνεται ότι καταστέλλεται στις περισσότερες περιπτώσεις ΧΛΛ ανεξαρτήτως κυτταρογενετικού πρότυπο, πιθανόν μέσω σημειακών μεταλλάξεων. Η καταστολή της έκφρασης των mirn15a και mirn16-1 φαίνεται ότι σχετίζεται με υπερέκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης BCL-2, η οποία χαρακτηρίζει τα νεοπλασματικά κύτταρα της ΧΛΛ. 45

46 Ενεργοποίηση των λευχαιμικών κυττάρων στη ΧΛΛ Η αξιολόγηση μεγάλου αριθμού ανοσογενετικών δεδομένων οδήγησε στην εξαγωγή ενδείξεων για την προέλευση των νεοπλασματικών κυττάρων στη ΧΛΛ, καθώς και για το ρόλο του αντιγόνου στην πρόκληση και εξέλιξη της νόσου. Συγκεκριμένα, επειδή η εισαγωγή σωματικών μεταλλάξεων στα γονίδια IGHV προϋποθέτει τη διέγερση του Β κυτταρικού υποδοχέα από αντιγόνο, είναι εύλογη η άποψη ότι οι περιπτώσεις ΧΛΛ με «μεταλλαγμένο» αντιγονικό υποδοχέα προέκυψαν από διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα. Όσον αφορά το «αμετάλλακτο» υποσύνολο, μολονότι η απουσία μεταλλάξεων θεωρήθηκε αρχικά ως ένδειξη ότι τα νεοπλασματικά Β κύτταρα προήλθαν από παρθένα Β λεμφοκύτταρα, τα αποτελέσματα νεότερων ερευνών οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι τα νεοπλασματικά λεμφοκύτταρα στο σύνολο των περιπτώσεων ΧΛΛ, ανεξάρτητα από το μεταλλακτικό φορτίο των γονιδίων IGHV, έχουν ανοσοφαινότυπο έμπειρων Β λεμφοκυττάρων 89 και πρότυπο γονιδιακής έκφρασης παρόμοιο με το αντίστοιχο των Β λεμφοκυττάρων μνήμης 90,91. Τα ευρήματα αυτά συνηγορούν στην υπόθεση ότι σε όλες τις περιπτώσεις ΧΛΛ έχει προηγηθεί αλληλεπίδραση του κλωνοτυπικού Β λεμφοκυττάρου με αντιγόνο. Ωστόσο, ερώτηματα σχετικά με: το αν τα κύτταρα των δύο ομάδων προέρχονται από έναν κοινό πρόγονο ή από διαφορετικούς, το στάδιο(α) της διαφοροποίησης όπου έγινε η λευχαιμική εξαλλαγή και τη φύση των παθογόνων που εμπλέκονται σε αυτή, παραμένουν αναπάντητα. Πρόσφατα πειράματα με ανασυνδυασμένα μόρια κλωνοτυπικής ανοσοσφαιρίνης από ασθενείς με ΧΛΛ προσέφεραν τα πρώτα πειραματικά δεδομένα που επιβεβαιώνουν τη θεωρία επιλογής από αντιγόνο στην ανάπτυξη της ΧΛΛ. Τα συγκεκριμένα μόρια ανοσοσφαιρίνης διαθέτουν χαρακτηριστικά παρόμοια με αυτά των «φυσικών αντισωμάτων» (natural antibodies) και αναγνωρίζουν είτε συστατικά κοινών μικροβίων είτε αποπτωτικά θραύσματα του οργανισμού Τα παραπάνω δεδομένα προτείνουν ένα πιθανό μοντέλο ανάπτυξης της ΧΛΛ, σύμφωνα με το οποίο η νόσος προκύπτει από το νεοπλασματικό μετασχηματισμό φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων, κύρια λειτουργία των οποίων είναι η αναγνώριση κοινών μοριακών δομών που υπάρχουν σε εξωγενή παθογόνα αλλά και σε κυτταρικά υπολείμματα που παράγονται καθημερινά κατά την απόπτωση κυττάρων του οργανισμού. Μεταβίβαση σήματος μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των Β λεμφοκυττάρων της ΧΛΛ είναι η χαμηλή έκφραση των ανοσοσφαιρινών στην επιφάνειά τους. Βέβαια, η κατάσταση αυτή δε σημαίνει απαραίτητα ότι η σηματοδότηση μέσω του BCR 46

47 είναι ελαττωματική, εφόσον τουλάχιστον στις μισές περιπτώσεις ΧΛΛ παρατηρείται ικανότητα διέγερσης των νεοπλασματικών κυττάρων μέσω της IgM, τουλάχιστον όσον αφορά σε γεγονότα κοντά στη μεμβράνη, όπως η φωσφορυλίωση της Syk, της PLCγ2 και η απελευθέρωση ενδοκυττάριου Ca Οι περιπτώσεις ΧΛΛ που συνήθως διαθέτουν ενεργό σηματοδοτικό μονοπάτι μέσω του BCR φέρουν «αμετάλλακτα» γονίδια IGHV κι εκφράζουν ZAP70 και/ή CD38. Αντίθετα, οι περιπτώσεις ΧΛΛ που φέρουν «μεταλλαγμένα» γονίδια IGHV και δεν εκφράζουν ZAP70 και/ή CD38 δεν απαντούν στη διέγερση μέσω της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης, κατάσταση που προσομοιάζει με την αντίστοιχη ανεργικών κυττάρων μετά από χρόνια έκθεση σε αντιγόνο 98,99. Η ZAP70 είναι κρίσιμο μόριο για τη σηματοδότηση των Τ λεμφοκυττάρων, αλλά βρέθηκε ότι εκφράζεται και στα λευχαιμικά Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ. Εμφανίζει δομική ομολογία με τη Syk και μετά από ενεργοποίηση του κυττάρου συνδέεται με τον BCR 98. Έρευνες έχουν δείξει ότι στα Β λεμφοκύτταρα η ZAP70 δεν είναι φωσφορυλιωμένη στα κρίσιμα κατάλοιπα που ρυθμίζουν την ενεργότητά της, συνεπώς δεν έχει σηματοδοτική λειτουργία αλλά εκτελεί κυρίως χρέη προσαρμογέα, επιστρατεύοντας σημαντικούς ρυθμιστές του σηματοδοτικού μονοπατιού 100. Ο ρόλος του CD38 στη σηματοδότηση μέσω του BCR δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Ωστόσο, σε περιπτώσεις ΧΛΛ που φέρουν «μεταλλαγμένα» γονίδια IGHV στις οποίες είναι δυνατή η μεταβίβαση σήματος παρατηρείται έκφραση του CD Μια συστηματική έρευνα προσπάθησε να συσχετίσει την ενεργοποίηση των κινασών καθοδικά του BCR με το μεταλλακτικό φορτίο των γονιδίων IGHV. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το σηματοδοτικό μονοπάτι είναι ενεργό στις περισσότερες περιπτώσεις ΧΛΛ. Ωστόσο, φαίνεται ότι τα κύτταρα της ΧΛΛ μπορούν εν μέρει να ενεργοποιηθούν μέσω του BCR 101. Αυτό το μοριακό πρότυπο προσομοιάζει με το αντίστοιχο των ανεργικών Β λεμφοκυττάρων στον ποντικό. Παρόμοιες αποκρίσεις έχουν παρατηρηθεί και στα CD5+ Β λεμφοκύτταρα στον ποντικό 102, οπότε δεν μπορεί να διευκρινιστεί αν το συγκεκριμένο πρότυπο είναι χαρακτηριστικό των λευχαιμικών κυττάρων ή αντικατοπτρίζει το κύτταρο από το οποίο προέρχονται. Επιπλέον, πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι σε μια υποομάδα ασθενών στους οποίους η μεταβίβαση σήματος μέσω της IgM δεν ήταν δυνατή υπάρχει συνεχής ενεργοποίηση της Erk και απουσία ενεργοποίησης της Αkt και του μεταγραφικού παράγοντα NF-AT. Τα συγκεκριμένα δεδομένα οδήγησαν στη διατύπωση του ισχυρισμού ότι τα κύτταρα αυτά έχουν καταστεί ανεργικά μετά από χρόνια in vitro έκθεση σε αντιγόνο. Η ανάλυση όμως δεν κατάφερε να συσχετίσει τη διαφορά της απόκρισης με το μεταλλακτικό φορτίο των γονιδίων IGHV 103. Συνολικά, τα σχετικά δεδομένα δείχνουν το τελικό αποτέλεσμα της σηματοδότησης μέσω του BCR επηρεάζεται από διάφορες παραμέτρους, όπως η φύση της διέγερσης. Επίσης, σημαντική είναι η διάρκεια της διέγερσης 104, τα 47

48 επίπεδα έκφρασης της IgM και τέλος, η ενεργοποίηση διαφορετικών ισοτύπων ανοσοσφαιρίνης. Όπως προαναφέρθηκε, η ενεργοποίηση της IgM οδηγεί είτε σε μερική ενεργοποίηση της σηματοδότησης, είτε δεν έχει κανένα αποτέλεσμα. Αντίθετα, σχεδόν όλες οι περιπτώσεις απαντούν στη διέγερση μέσω IgD αν και η απάντηση είναι παροδική. Στις σχετικά λίγες περιπτώσεις ΧΛΛ που έχει συμβεί εναλλαγή ισοτύπου και εκφράζουν IgG έχουν παρατηρηθεί διαφορετικές απαντήσεις που έχουν συσχετιστεί κυρίως με τα επίπεδα έκφρασης της IgG 105. Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία Η ανοσογενετική ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών αποκάλυψε δυο κατηγορίες ΧΛΛ, με ή χωρίς σωματικές μεταλλάξεις των γονιδίων IGHV. Οι σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια IGHV καταμετρούνται από την αρχή της περιοχής VH FR1 έως το τέλος της περιοχής VH FR3 και όχι σε όλο το μήκος της μεταβλητής περιοχής: η περιοχή VH CDR3 εξαιρείται επειδή ο μεγαλός βαθμός ετερογένειας που εμφανίζει καθιστά αδύνατη την αξιόπιστη αναγνώριση των σωματικών μεταλλάξεων. Η αλλαγή ενός νουκλεοτιδίου χαρακτηρίζεται ως μετάλλαξη και όχι ως πολυμορφισμός όταν εμφανίζεται στην κλωνοτυπική αλληλουχία αλλά όχι στη φυσιολογική, μη αναδιαταγμένη, αλληλουχία του γονιδίου. Τα γονίδια IGHV με διαφορές >2% από το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο θεωρούνται ως «μεταλλαγμένα». Το όριο του 2% επιλέχθηκε ώστε ν αποφευχθεί το ενδεχόμενο κάποιες από τις διαφορές να αντιστοιχούν σε άγνωστους πολυμορφισμούς του γενετικού τόπου IGH. Οι αλληλουχίες των γονιδίων IGHV που έχουν διαφορές <2% σε σχέση με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο θεωρούνται ως «αμετάλλακτες». Οι μισές περίπου περιπτώσεις ΧΛΛ που εκφράζουν BCR με ισότυπο IgM όπως και σχεδόν το 75% των περιπτώσεων που έχουν πραγματοποιήσει εναλλαγή ισοτύπου παρουσιάζουν διαφορές >2% από το πλησιέστερο μη αναδιαταγμένο γονίδιο. Η παρουσία και το φορτίο των μεταλλάξεων ποικίλει στις διαφορετικές περιπτώσεις ΧΛΛ και φαίνεται να σχετίζεται με την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV από τα λευχαιμικά κύτταρα 81, Στο ρεπερτόριο των ώριμων φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων επικρατούν συγκεκριμένα γονίδια IGHV χωρίς ενδείξεις για την επιλογή συνδυασμών συγκεκριμένων γονιδίων ή υποομάδων βαριών και ελαφριών αλυσίδων IG. Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στη ΧΛΛ χαρακτηρίζεται από επιλεκτικότητα κι εμφανίζει σημαντικές διαφορές από το αντίστοιχο των φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων 81. Ορισμένα γονίδια, ιδίως τα γονίδια IGHV1-69, IGHV4-34, IGHV3-7 και IGHV3-23, χρησιμοποιούνται γενικά με αυξημένη συχνότητα, παρά τις αποκλίσεις που παρατηρούνται στις διάφορες αναλύσεις 81, Η 48

49 επιλεκτικότητα ως προς την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV ερμηνεύεται ως ένδειξη ότι περιορισμένος αριθμός αντιγόνων εμπλέκεται στην ανάπτυξη της νόσου. «Στερεότυποι» υποδοχείς στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία Πρόσφατα, διάφορες ερευνητικές ομάδες έχουν αναφερθεί σε υποσύνολα περιπτώσεων ΧΛΛ τα οποία χαρακτηρίζονται από την παρουσία «στερεότυπων» (ομόλογων) BCR ,112,114, Το φαινόμενο της «στερεοτυπίας» του Β κυτταρικού υποδοχέα φαίνεται να αντίκειται στους νόμους των πιθανοτήτων, εφόσον η μαθηματική πιθανότητα να υπάρχουν δύο διαφορετικά Β λεμφοκύτταρα με πανομοιότυπη ανοσοσφαιρίνη είναι απειροελάχιστη (10-12 ), ενώ αντίθετα η συχνότητα έκφρασης στερεότυπων υποδοχέων στη ΧΛΛ ανέρχεται περίπου στο 1/3 των περιπτώσεων (~30%). Τα «στερεότυπα» υποσύνολα αφορούν τόσο τις «αμετάλλακτες» όσο και τις «μεταλλαγμένες» περιπτώσεις, παρότι η έκφραση «στερεότυπων» BCR είναι συχνότερη στους ασθενείς ΧΛΛ με «αμετάλλακτα» γονίδια IGHV ,114,116. Από λειτουργική σκοπιά, η αξιοσημείωτη ομοιότητα του BCR υποδηλώνει την αναγνώριση ιδιαίτερων, ξεχωριστών αντιγόνων ή κατηγοριών δομικά όμοιων επιτόπων, η οποία ακολουθείται από επιλογή των λευχαιμικών κλώνων 108,109,114,116. Επιπλέον, σε ορισμένα υποσύνολα έχουν αναφερθεί επαναλαμβανόμενες μεταλλάξεις αντικατάστασης («στερεότυπες» αμινοξικές αλλαγές) σε συγκεκριμένα κωδικόνια κατά μήκος του γονιδίου IGHV 119. Οι επιλεγμένες αυτές υπερμεταλλάξεις αποτελούν επιπρόσθετες ενδείξεις για την επιλογή των κλωνογενών κυττάρων ΧΛΛ από αντιγόνο. Τέλος, η ανάλυση του φαινομένου της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ οδήγησε στην ανακάλυψη ότι η κατάταξη των ασθενών σε υποσύνολα που χαρακτηρίζονται από την έκφραση ομόλογων BCR έχει σημαντικές προεκτάσεις για την κλινική πορεία της νόσου, καθώς ασθενείς συγκεκριμένων υποσυνόλων εμφανίζουν κοινά βιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά 108,110,117. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ο περιορισμός στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV στη ΧΛΛ είναι ουσιαστικά γνώρισμα του «στερεότυπου» υποσυνόλου. Οι διαφορές που αναγνωρίστηκαν μεταξύ των δύο υποσυνόλων (με «στερεότυπους» κι «ετερογενείς» υποδοχείς) οδήγησαν στη διατύπωση της άποψης ότι η προέλευση των νεοπλασματικών κυττάρων καθώς και οι μηχανισμοί που καθορίζουν τα χαρακτηριστικά των εκφραζόμενων BCR μπορεί να διαφέρουν ανάμεσα στα δύο υποσύνολα. Η δομική «στερεοτυπία» των BCR αποτελεί ισχυρότατη ένδειξη για την αναγνώριση παρόμοιων αντιγονικών επιτόπων, υπαινίσσεται δηλαδή διέγερση των κλωνογενών κυττάρων της νόσου από περιορισμένο αριθμό μοριακών δομών, άρα και πιθανή «στερεοτυπία» όσον αφορά στα αντιγόνα. Επίσης 49

50 υποδηλώνει ότι οι λευχαιμικοί κλώνοι με «στερεότυπους» BCR πιθανόν προέρχονται από έναν πληθυσμό Β λεμφοκυττάρων με ιδιότητες κυττάρων της επίκτητης ανοσίας, τα χαρακτηρίζονται από εγγενή περιορισμένη ετερογένεια 118. Λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα Γενικά Το λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα (ΛΜ) είναι επιθετική νεοπλασία των Β λεμφοκυττάρων, η οποία αντιπροσωπεύει το 5-10% των μη Hodgkin λεμφωμάτων Κατά τη διάγνωση, οι περισσότεροι ασθενείς βρίσκονται σε προχωρημένο κλινικό στάδιο της νόσου με συχνά ευρήματα λεμφαδενοπάθεια, λευχαιμική νόσο και διήθηση του μυελού των οστών, σπληνομεγαλία και προσβολή της γαστρεντερικής οδού 122. Η μέση ολική επιβίωση είναι 3-5 έτη και μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί θεραπεία που να οδηγεί σε ίαση (εκτός ίσως από τη μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων) 120,121. Το ΛΜ χαρακτηρίζεται από κλινική ετερογένεια, με υποομάδες ασθενών να έχουν πιο ήπια κλινική πορεία και μεγαλύτερη χρονική περίοδο χωρίς πρόοδο νόσου μετά από θεραπεία 120,123. Επιπλέον, παρουσιάζει και φαινοτυπική ετερογένεια, με διάφορες μορφές της νόσου να διακρίνονται με βάση τη μορφολογία των νεοπλασματικών κυττάρων 122. Πληθώρα δεδομένων υποστηρίζει την άποψη ότι η ετερογένεια του ΛΜ σε κλινικό και φαινοτυπικό επίπεδο αντικατοπτρίζει την υποκείμενη γενετική ετερογένεια της νόσου. Η χρωμοσωμική μετάθεση t(11;14)(q13;q32), η οποία οδηγεί στην παράθεση του γονιδίου CCDN1 στο χρωμόσωμα 11 και του γενετικού τόπου της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών (IGH) στο χρωμόσωμα 14, αποτελεί ουσιαστικά τη γενετική «ταυτότητα» της νόσου 124. Σε μοριακό επίπεδο, η συγκεκριμένη γενετική βλάβη προκαλεί συνεχή υπερέκφραση της κυκλίνης D1, με τελικό αποτέλεσμα την απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου 121, Μολονότι η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 συμβάλλει στην παθογένεια του ΛΜ, δεν επαρκεί από μόνη της για την ανάπτυξη της νόσου. Το ΛΜ χαρακτηρίζεται και από μεγάλο αριθμό επαναλαμβανόμενων γενετικών ανωμαλιών 121,128, ένδειξη ότι η υπερέκφραση της κυκλίνης D1 πρέπει να συνοδεύεται από δευτερογενείς γενετικές βλάβες προκειμένου να οδηγήσει στο νεοπλασματικό μετασχηματισμό 121,129. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι σε κάποιες από τις χρωμοσωμικές θέσεις που επηρεάζονται από τις γενετικές βλάβες αναγνωρίστηκαν γονίδια που είναι σημαντικά για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την ομοιόσταση του DNA (π.χ. ATM, BCL2, MYC, TP53) 129,130. Τέλος, επισημαίνεται ότι υπάρχει και μια μικρή ομάδα ασθενών με ΛΜ στους οποίους δεν παρατηρείται υπερέκφραση του γονιδίου CCND1 και ο 50

51 γενετικός τόπος 11q13 δε φέρει χρωμοσωμικές βλάβες. Ωστόσο, οι ασθενείς της μικρής αυτής υποομάδας εμφανίζουν παρόμοιο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης και ίδιες δευτερογενείς γενετικές βλάβες με την υποομάδα των t(11;14)-θετικών ασθενών με ΛΜ, υποστηρίζοντας την άποψη ότι όλες οι περιπτώσεις ΛΜ έχουν την ίδια γενετική προέλευση 120,121,123,131,132. Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στο λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα Η ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στο ΛΜ περιορίστηκε στην ανάλυση των γονιδίων της βαριάς αλυσίδας. Κοινό εύρημα όλων των αναλύσεων ήταν η υπερέκφραση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV. Συγκεκριμένα, η αυξημένη συχνότητα των γονιδίων IGHV4-34, IGHV3-21 και IGHV3-23 αναφέρθηκε σε όλες τις αναλύσεις, παρότι οι σχετικές συχνότητες των γονιδίων διέφεραν μεταξύ των αναλύσεων Τα δύο πιο συχνά γονίδια IGHV στο ΛΜ (IGHV3-21 και IGHV4-34) παρουσιάζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον από ανοσολογική σκοπιά καθώς και από τη σκοπιά προέλευσης της νόσου. Το γονίδιο IGHV3-21 μαζί με τα πιο συγγενή του γονίδια IGHV3-48 και IGHV3-11 επιδεικνύουν τη μέγιστη ομολογία (85-89% σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας) με ένα συγκεκριμένο γονίδιο IGHV του ποντικού (IGHV5-17) 118. Μολονότι η φύση των μηχανισμών επιλογής που καθορίζουν την εξέλιξη του γενετικού τόπου IGH παραμένει άγνωστη, έχει διατυπωθεί η άποψη ότι οι παρατηρούμενες διαφορές στον άνθρωπο και τον ποντικό οφείλονται εν μέρει στην επιλογή από αντιγόνα διαφορετικής φύσης, τα οποία παράγονται στο διαφορετικό περιβάλλον όπου ζουν τα δύο είδη κατά τα τελευταία 70 εκατομμύρια έτη Επομένως, η αξιοσημείωτη φυλογενετική συντήρηση του γονιδίου IGHV3-21 και του ομόλογου γονιδίου στον ποντικό μπορεί να θεωρηθεί ως ισχυρή ένδειξη ότι τα συγκεκριμένα γόνιδια έχουν επιλεγεί λόγω κάποιας διαχρονικής λειτουργικής ειδικότητας που προσδίδουν. Το γονίδιο IGHV4-34 κωδικοποιεί ανοσοσφαιρίνες με εγγενή αυτοαντιδραστικότητα εναντίον των μορίων N-ακετυλολακτοζαμίνης (Nacetyllactosamine, NAL), τα οποία εκφράζονται από τα αντιγόνα του αίματος τύπου I/i, και άλλων γλυκοπρωτεϊνών, όπως το μόριο CD45/B ,143. Επιπλέον, οι συγκεκριμένες ανοσοσφαιρίνες αναγνωρίζουν και άλλα αυτο-αντιγόνα, όπως π.χ. μόρια DNA 144. Τα Β λεμφοκύτταρα που εκφράζουν το γονίδιο IGHV4-34 αποτελούν ένα μεγάλο ποσοστό του «παρθένου» ρεπερτορίου και πολλαπλασιάζονται μετά από συγκεκριμένες λοιμώξεις (π.χ. από Mycoplasma pneumoniae) 144. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι μεγάλο ποσοστό των περιτοναϊκών Β-1 λεμφοκυττάρων στον ποντικό που αντιδρούν εναντίον της φωσφατιδυλοχολίνης και των ερυθρών αιμοσφαιρίων εκφράζουν το γονίδιο VH12 145, το οποίο είναι το γονίδιο με τη μεγαλύτερη ομολογία με το γονίδιο 51

52 IGHV4-34 στον άνθρωπο 118. Όπως και στον άνθρωπο, τα αυτοδραστικά Β-1 λεμφοκύτταρα που εκφράζουν το γονίδιο VH12 έχουν επιλεγεί θετικά και φαίνεται να δρουν προστατευτικά ενάντια σε λοιμώξεις 145. Έτσι, διατυπώθηκε η άποψη ότι το γονίδιο IGHV4-34 έχει διατηρηθεί εξελικτικά λόγω της δυνατότητάς του να παρέχει προστασία εναντίον μεγάλου εύρους παθογόνων κι επιπλέον επειδή παρέχει συγκεκριμένες υπηρεσίες στον οργανισμό 66, π.χ. αφαίρεση αποπτωτικών σωματίων. Όμως, πιθανότατα λόγω της εγγενούς αυτόδραστικότητας του γονιδίου IGHV4-34, τα Β λεμφοκύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο μεταπίπτουν σε ανεργική κατάσταση και αποκλείονται από τις αντιδράσεις του βλαστικού κέντρου. Η σχέση των συγκεκριμένων παρατηρήσεων με την ανάπτυξη του ΛΜ παραμένει άγνωστη. Όμως, η αυξημένη έκφραση των εξελικτικά συντηρημένων γονιδίων IGHV3-21 και IGHV4-34 υποδηλώνει την πιθανότητα τα προγονικά κύτταρα τουλάχιστον μιας υποομάδας ασθενών με ΛΜ να εκφράζουν συγκεκριμένα γονίδια IGHV ώστε να έχουν την ικανότητα αναγνώρισης συγκεκριμένων τύπων αντιγόνων. Ένα υποσύνολο ασθενών με ΛΜ φέρουν υποδοχείς IG με σωματικές μεταλλάξεις Οι περισσότεροι ασθενείς με ΛΜ εκφράζουν στα νεοπλασματικά κύτταρα υποδοχείς IG που είτε είναι «αμετάλλακτοι» είτε φέρουν μικρό αριθμό σωματικών μεταλλάξεων. Βέβαια, αυτό σημαίνει εναλλακτικά ότι μια υποομάδα ασθενών έχουν «μεταλλαγμένους» υποδοχείς Ένας παράγοντας που επηρεάζει τη διάκριση των αναδιατάξεων με βάση το μεταλλακτικό φορτίο, είναι το αριθμητικό όριο 2% στην ομολογία με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV. Η εφαρμογή του συγκεκριμένου κριτηρίου οδηγεί στην αναπόφευκτη θεώρηση περιπτώσεων με μικρό αριθμό μεταλλάξεων (ομολογία >98%) ως «αμετάλλακτων». Το κριτήριο του 2% έχει μεγάλη προγνωστική αξία στη ΧΛΛ 146,147, χωρίς όμως να έχει και κάποια βιολογική σημασία, ιδίως στο ΛΜ. Κλινικές προεκτάσεις από τη μοριακή ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στο ΛΜ Ο ρόλος της ανοσογενετικής ανάλυσης στην αντιμετώπιση της ΧΛΛ είναι πλέον αναμφισβήτητος. Σε αυτό το πλαίσιο, ήταν λογική η αναζήτηση παρόμοιων συσχετίσεων σε άλλους τύπους νεοπλασιών των Β λεμφοκυττάρων, μεταξύ των οποίων και το ΛΜ. Η διάκριση των ασθενών με ΛΜ με βάση το μεταλλακτικό φορτίο των γονιδίων IGHV δεν έδειξε διαφορές σε υποομάδες με διαφορετικές γενετικές ανωμαλίες (ελλείψεις στα χρωμοσώματα 13q, 11q, και 17p) 134. Αντίθετα, 52

53 η παρουσία σωματικών μεταλλάξεων ήταν πιο συχνή σε ασθενείς αρχικού σταδίου χωρίς διήθηση του μυελού των οστών 148. Επιπλέον, κάποιες έρευνες ανέδειξαν συσχέτιση μεταξύ του μεταλλακτικού φορτίου και της πιθανότητας υποτροπής 149. Ωστόσο, καμία από τις προηγούμενες συσχετίσεις δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Επιπλέον, δεν αναδείχθηκε κάποια συσχέτιση ακόμα και όταν χρησιμοποιήθηκαν διάφορα αριθμητικά όρια για την κατάταξη των ασθενών σε υποσύνολα με διαφορετικό μεταλλακτικό φορτίο (1%, 1.5%, 2%, 2.5%, και 5%)

54 Αντικείμενο της εργασίας Εισαγωγή Ο ρόλος των Β λεμφοκυττάρων στην άμυνα του οργανισμού του ανθρώπου είναι η αναγνώριση παθογόνων παραγόντων μέσω πρόσδεσης στους αντίστοιχους αντιγονικούς επίτοπους, η παρουσίαση τους στα Τ λεμφοκύτταρα και η παραγωγή ανοσοσφαιρινών. Η σύνδεση του Β κυτταρικού υποδοχέα επάγει τη μεταβίβαση σημάτων στο εσωτερικό του Β λεμφοκυττάρου που καταλήγουν στην ενεργοποίησή του και σε σηματοδότηση προς άλλα συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος, ώστε να προκύψει πλήρης ανοσοαπόκριση εναντίον του παθογόνου 1,2. Συνεπώς, η νεοπλασματική εξαλλαγή των Β λεμφοκυττάρων μπορεί να οφείλεται σε διαταραχές του μηχανισμού ενεργοποίησής τους. Επιπλέον, τα νεοπλασματικά κύτταρα δεν επιζούν ούτε και πολλαπλασιάζονται in vitro χωρίς διέγερση από εξωγενή αντιγόνα, άρα είναι πιθανό να εξαρτώνται από εξωτερικά σήματα ενεργοποίησης προκειμένου να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν 80. Παρότι η ακριβής φύση αυτών των σημάτων παραμένει άγνωστη, σε μερικές περιπτώσεις πιθανόν εμπλέκονται και σήματα που προκύπτουν από την πρόσδεση αντιγόνου στο Β κυτταρικό υποδοχέα. Ο νεοπλασματικός κλωνικός πληθυσμός προκύπτει από τον πολλαπλασιασμό ενός αρχικού/προγονικού κυττάρου κι έτσι το σύνολο των κυττάρων του χαρακτηρίζεται από έκφραση του ίδιου αντιγονικού υποδοχέα. Η τεράστια ποικιλότητα που βρίσκεται στη βάση της δημιουργίας ενός λειτουργικού ρεπερτορίου Β λεμφοκυττάρων, ικανού να ανταποκρίνεται σε κάθε πιθανό αντιγονικό ερεθισμό, αντιστοιχεί σε ποικιλότητα στο επίπεδο της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του Β κυτταρικού υποδοχέα. Αυτό καθιστά την κλωνική αναδιάταξη ως ένα είδος «μοριακής ταυτότητας» του Β λεμφοκυττάρου και, κατά επέκταση, του νεοπλασματικού πληθυσμού. Συνεπώς, η ανοσογενετική ανάλυση μπορεί να συμβάλει αποφασιστικά στην κατανόηση της βιολογίας και, απώτερα, στη βελτίωση της θεραπευτικής αντιμετώπισης των νεοπλασιών των Β λεμφοκυττάρων. Τα τελευταία χρόνια, η ταχύτατη ανάπτυξη του συγκεκριμένου τομέα βοήθησε αποφασιστικά σε αυτή την κατεύθυνση. Η ανάλυση των αναδιατάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών (IG genes) έχει παράσχει σημαντικές πληροφορίες για την προέλευση ποικίλων νεοπλασιών και για το ρόλο των αντιγονικών ερεθισμάτων στην πρόκληση και ανάπτυξή τους. 54

55 Συγκεκριμένα, η επιλεκτικότητα ως προς το ρεπερτόριο των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών θεωρείται ως έμμεση απόδειξη για τη συμμετοχή ενός περιορισμένου αριθμού αντιγόνων και/ή υπεραντιγόνων στην ανάπτυξη της νόσου 150,151. Η συγκεκριμένη άποψη ενισχύεται από την αναγνώριση ιδιαίτερων χαρακτηριστικών των αναδιατάξεων, όπως η «στερεοτυπία» στην περιοχή VH CDR3 της βαριάς αλυσίδας σε αναδιατάξεις ασθενών με ΧΛΛ 118. Επιπλέον, η ανάλυση του μηχανισμού της σωματικής των γονιδίων της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών θεωρείται ενδεικτική για την αναγνώριση αντιγόνου και προσφέρει ενδείξεις για το στάδιο διαφοροποίησης του κυττάρου κατά το οποίο συνέβη η νεοπλασματική εξαλλαγή 119,152. Αρκετοί τύποι νεοπλασιών των Β λεμφοκυττάρων χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα πρότυπα σωματικών μεταλλάξεων στα γονίδια της μεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας 119,153. Επιπλέον, για ορισμένους τύπους υπάρχουν ενδείξεις ότι ο μηχανισμός της ΣΥΜ παραμένει ενεργός ακόμη και μετά τη νεοπλασματική εξαλλαγή 119. Παρότι η φύση των αντιγόνων είναι ακόμη σχεδόν άγνωστη, η διέγερση του υποδοχέα των Β λεμφοκυττάρων από παθογόνους μικροοργανισμούς ίσως παίζει σημαντικό ρόλο στην κλινική εξέλιξη των νεοπλασιών των Β λεμφοκυττάρων. Πιο χαρακτηριστική περίπτωση είναι η συσχέτιση της λοίμωξης από το βακτήριο Helicobacter Pylori με το λέμφωμα MALT του στομάχου 154. Πιο πρόσφατα επίσης αναφέρθηκε συσχέτιση μεταξύ λοίμωξης από το βακτήριο Chlamydia Psittaci με το λέμφωμα MALT του οφθαλμού 155 (ocular adnexa MALT lymphoma, OAML), καθώς και της λοίμωξης από τον ιό της ηπατίτιδας C με το σπληνικό λέμφωμα της οριακής ζώνης 156. Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία Η σημασία του φαινομένου της «στερεοτυπίας» του BCR στη ΧΛΛ μπορεί ν αποδειχθεί κομβική για τη μοριακή κατάταξη των ασθενών σε ιδιαίτερα υποσύνολα με προφανείς προεκτάσεις για τη θεραπευτική αντιμετώπιση της νόσου. Σε αυτό το πλαίσιο, είναι επιβεβλημένη η αποσαφήνιση οριμένων ανοιχτών ζητημάτων που αφορούν στην ανάλυση της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ: (i) η αναθεώρηση των κριτηρίων για τον προσδιορισμό των αναδιατάξεων με «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3 και την ταξινόμησή τους σε υποσύνολα, ώστε να ληφθούν υπόψη πρόσφατες εξελίξεις, (ii) η διευκρίνιση της συχνότητας του φαινομένου της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ και ειδικότερα η σχέση της με το μέγεθος της ομάδας εργασίας, (iii) η ύπαρξη υποσυνόλων με «στερεότυπες» αναδιατάξεις με μεγάλο αριθμό περιπτώσεων, και, (iv) η λεμπτομερής ανάλυση των χαρακτηριστικών των «στερεότυπων» BCR στη ΧΛΛ με πιθανές προεκτάσεις για την ανάλυση της προέλευσης της νόσου. 55

56 Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε συστηματική ανάλυση της «στερεοτυπίας» της περιοχής VH CDR3 σε 7596 αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ από ασθενείς με ΧΛΛ. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή ειδικών αλγορίθμων καθώς και online βιοπληροφορικών εργαλείων. Λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα Οι προηγούμενες αναλύσεις των μοριακών χαρακτηριστικών του Β κυτταρικού υποδοχέα σε ασθενείς με λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα (ΛΜ) εστιάστηκαν στις αναδιατάξεις της βαριάς αλυσίδας. Η ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV ανέδειξε αυξημένη τάση έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων: IGHV4-34, IGHV3-21 και IGHV3-23 παρότι τα ακριβή ποσοστά διέφεραν σημαντικά μεταξύ διαφορετικών εργασιών Όσον αφορά στην ανάλυση του μηχανισμού της ΣΥΜ, ο διαχωρισμός των αναδιατάξεων με βάση το μεταλλακτικό φορτίο βασίστηκε σε όλες τις αναλύσεις στο ποσοστό 2% που χρησιμοποιείται ως καθιερωμένος προγνωστικός δείκτης στη ΧΛΛ 146,147. Η βιολογική σημασία του συγκεκριμένου κριτηρίου παραμένει αδιευκρίνιστη, ενώ η εφαρμογή του στην ταξινόμηση των ασθενών με ΛΜ δεν ανέδειξε σαφή προγνωστική σημασία 134,138,148,149. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι μολονότι οι περισσότερες αναδιατάξεις ήταν «αμετάλλακτες» ή είχαν ελάχιστες σωματικές μεταλλάξεις, ένα υποσύνολο ασθενών έφεραν «μεταλλαγμένα» γονίδια IGHV Η ύπαρξη αυτού του υποσυνόλου ασθενών έρχεται σε πλήρη αντίθεση με την τρέχουσα θεώρηση (World Health Organization, WHO 2008) της νόσου ως νεοπλασία παρθένων Β λεμφοκυττάρων που δεν έχουν διέλθει από το βλαστικό κέντρο 122. Συνολικά, τα αποτελέσματα των προηγούμενων εργασίων ως προς τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της νόσου ήταν αντιφατικά, με πιο πιθανή εξήγηση το μικρό αριθμό ασθενών που συμπεριλήφθηκαν σε κάθε έρευνα Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής μοριακή ανάλυση των αναδιατάξεων της βαριάς αλυσίδας του Β κυτταρικού υποδοχέα σε 807 περιπτώσεις ασθενών με ΛΜ. Η ανοσογενετική ανάλυση έδειξε ότι το ΛΜ χαρακτηρίζεται από επιλεκτικότητα στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV και στη στόχευση συγκεκριμένων περιοχών/θέσεων της μεταβλητής περιοχής του Β κυτταρικού υποδοχέα από το μηχανισμό της ΣΥΜ. Επιπλέον, η ανάλυση της περιοχής VH CDR3 ανέδειξε την ύπαρξη υποσυνόλων περιπτώσεων με «στερεότυπους» Β κυτταρικούς υποδοχείς και «νοσο-ειδικά» μοριακά χαρακτηριστικά. Τέλος, πραγματοποιήθηκε σύγκριση μεταξύ των «στερεότυπων» περιοχών VH CDR3 σε ασθενείς με ΛΜ και ΧΛΛ. 56

57 Ομάδες εργασίας, υλικά και μεθοδολογία Ομάδες εργασίας Τα δύο μέρη της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο διεθνών συνεργασιών μεταξύ επιστημονικών κέντρων στην Ευρώπη και τις Η.Π.Α. με σκοπό την εξαγωγή μιας ολοκληρωμένης εικόνας των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών σε ασθενείς με λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα (ΛΜ) και χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ). Για το σκοπό αυτό συγκεντρώθηκε ένας πολύ μεγάλος αριθμός δειγμάτων, με αποτέλεσμα οι δύο εργασίες να περιέχουν το μεγαλύτερο αριθμό ασθενών από όλες τις προηγούμενες ανοσογενετικές εργασίες με αντικείμενο τις δύο συγκεκριμένες νεοπλασίες. Ομάδα εργασίας: «Μελέτη της στερεοτυπίας της περιοχής VH CDR3 σε 7596 αναδιατάξεις ασθενών με ΧΛΛ: μοριακή κατάταξη των ασθενών με ενδείξεις για την αντιμετώπιση της νόσου». Η εργασία αφορά στη μελέτη των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών των κλωνικών αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ από 7424 ασθενείς με ΧΛΛ, με έμφαση στην ανάλυση των αλληλουχιών της περιοχής VH CDR3. Ο αριθμός των ασθενών που περιλήφθηκαν στην ομάδα εργασίας είναι τριπλάσιος από την αμέσως μεγαλύτερη δημοσιευμένη εργασία 118. Για τη συγκέντρωση των δεδομένων 57

58 συνεργάστηκαν 15 επιστημονικά κέντρα από την Ευρώπη και ένα από τις Η.Π.Α. (Πίνακας 1). Πίνακας 1: Ομάδα εργασίας. Αριθμός ασθενών με ΧΛΛ ανά συνεργαζόμενο Ινστιτούτο. Table 1: Study group. Number of CLL patients from each collaborating Institute. Ινστιτούτο Ερευνητική Μονάδα Χώρα Αριθμός ασθενών Αιματολογική Κλινική και ΜΜΜΟ, ΓΝ «Γ. Παπανικολάου», Θεσσαλονίκη Αιματολογικό Τμήμα, Γενικό Νοσοκομείο Νίκαιας, Αθήνα Department of Immunology Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, Uppsala University, Uppsala Rheumatology Unit, Department of Medicine, KarolinskaInsitutet, Stockholm Department of Medicine, Clinical Epidemiology Unit, KarolinskaInstitutet, Stockholm Lund University and Hospital Department of Hematology, Lund Stem Cell Center, Lund Department of Haematology, Rigshospitalet, Copenhagen Hematology Department and University Pierre et Marie Curie, HôpitalPitié-Salpètrière, Paris Department of Haematology, Royal Bournemouth Hospital, Bournemouth Department of Haematology, Imperial College Academic Health Science Centre, Hammersmith Hospital, London Department of Hematooncology, University Hospital Brno and Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno Ελλάδα Σουηδία 965 Δανία 358 Γαλλία 944 Ηνωμένο Βασίλειο Τσεχία 540 Laboratory of B Cell Neoplasia and Unit of Lymphoid Malignancies, Universita Vita-Salute San Raffaele and IstitutoScientifico San Raffaele, Milan Unit of Molecular Hematology, IstitutoScientifico Ιταλία 349 San Raffaele, Milan CERMS, S. Giovanni Battista Hospital, Turin 591 Department of Immunology, Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Rotterdam The Feinstein Institute for Medical Research, North Shore-Long Island Jewish Health System, Manhasset, NY Ολλανδία 649 ΗΠΑ 886 Ομάδα εργασίας «Ο ρόλος της αντιγονικής επιλογής στο λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα (ΛΜ): ανάλυση των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών 807 ασθενών». 58

59 Η εργασία αφορά στην ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών των κλωνικών αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ από 807 ασθενείς με ΛΜ. Η ομάδα εργασίας περιλαμβάνει ασθενείς από συνεργαζόμενα Αιματολογικά και Ανοσολογικά κέντρα στην Ελλάδα,τις Σκανδιναβικές χώρες (Δανία, Νορβηγία και Σουηδία), τη Γαλλία, την Ισπανία, την Ιταλία, τη Γερμανία και την Ολλανδία (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Ομάδα εργασίας. Αριθμός ασθενών με ΛΜ ανά συνεργαζόμενο Ινστιτούτο. Table 2: Study group. Number of MCL patients from each collaborating Institute. Ινστιτούτο Ερευνητική Μονάδα Χώρα Αριθμός ασθενών Αιματολογική Κλινική και ΜΜΜΟ, ΓΝ «Γ. Παπανικολάου», Θεσσαλονίκη Αιμοπαθολογοανατομικό Εργαστήριο, Νοσοκομείο Ευαγγελισμός, Αθήνα Department of Immunology Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, Uppsala University, Uppsala Department of Laboratory Medicine, Division of Pathology, KarolinskaInstitutet and Karolinska University Hospital, Huddinge Department of Haematology, Rigshospitalet, Copenhagen Department of Oncology, the Norwegian Radium Hospital, Oslo Hopital Henri Mondor, AP-HP, and Universite Paris-XII Val de Marnes, Creteil Service d' HematologieBiologique, AP-HP, HopitalPitie- Salpetriere, Paris Hôpital Necker, AP-HP, Paris Department of Pathology, Hospital Clinic, and University of Barcelona, Institute of Biomedical Research August Pi isunyer (IDIBAPS), Barcelona Ελλάδα 56 Σουδία Δανία Νορβηγία 266 Γαλλία 132 Ισπανία 39 Laboratory of B Cell Neoplasia and Unit of Lymphoid Malignancies, Universita Vita-Salute San Raffaele and IstitutoScientifico San Raffaele, Milan Ιταλία 22 Pathology Unit and Unit of Lymphoid Malignancies, San Raffaele Scientific Institute, Milan Department of Internal Medicine III, University Hospital Munich - Campus Grosshadern, Munich Pathology Department, University of Wuerzburg, Wuerzburg 2nd Department of Medicine, University Medical Center Schleswig-Holstein, Kiel Department of Pathology, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen Γερμανία 270 Ολλανδία 22 59

60 Υλικά και μέθοδοι Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων Στο σύνολο των ασθενών με ΧΛΛ και στην πλειονότητα των ασθενών με ΛΜ, τα δείγματα αφορούσαν σε φρέσκο ιστό (αίμα ή μυελικό αναρρόφημα και σπανιότερα λεμφαδένες). Σε κάποιες περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν δείγματα βιοπτικού υλικού μονιμοποιημένου σε παραφίνη από ποικίλους ιστούς (λεμφαδένες, μυελό των οστών, σπλήνα, κόλον και οφθαλμό). Η απομόνωση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με κατάλληλη μέθοδο, ανάλογα με το είδος του δείγματος: (i) Για τα δείγματα φρέσκου ιστού πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας, με χρήση φικόλης (Ficoll-Hypaque). (ii) Για τα δείγματα βιοπτικού υλικού μονιμοποιημένου σε παραφίνη, πραγματοποιήθηκαν διπλές πλύσεις με ξυλόλη και αιθανόλη διαδοχικά, για την απομάκρυνση της παραφίνης. Απομόνωση γενετικού υλικού Απομόνωση γενωμικού DNA (gdna) Η απομόνωση gdna από μονοπύρηνα κύτταρα δειγμάτων φρέσκου ιστού πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της αντιστρεπτής πρόσδεσης σε στήλες σιλικόνης, με χρήση του QIAamp DNA Μini Kit (QIAGEN). Η στήλη δεσμεύει επιλεκτικά νουκλεϊκά οξέα (σε συνθήκες χαμηλής αλατότητας), ενώ είναι διαπερατή από πρωτεϊνικά μόρια και δισθενή κατιόντα που μπορεί να αναστείλουν τη δράση της DNA πολυμεράσης κατά την αντίδραση PCR. Η αποδέσμευση του γενετικού υλικού επιτυγχάνεται με την αλλαγή των συνθηκών αλατότητας. Για την απομόνωση gdna από κύτταρα ιστών μονιμοποιημένων σε παραφίνη, αρχικά πραγματοποιήθηκε 48ωρη επώαση σε διάλυμα λύσης (Πίνακας 3), ώστε να προκληθεί λύση της κυτταρικής μεμβράνης και να μετουσιωθούν οι πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν πλύσεις με βασική φαινόλη και χλωροφόρμιο και, τέλος, διαδοχικές πλύσεις με διάλυμα αιθανόλης 95% και 70%, αντίστοιχα, για την κατακρήμνιση του gdna. 60

61 Πίνακας 3: Σύσταση διαλύματος λύσης. Table 3: Lysis buffer composition. Αντιδραστήρια Lysis II Buffer (Tris-Base 10mM, NaCl 400 mm, EDTA 2mM) SDS 10% Πρωτεϊνάση Κ Όγκος 300 μl 50 μl 30 μl Απομόνωση RNA Σύνθεση cdna Η απομόνωση ολικού RNA πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του 4Μ θειοκυανικού γουανιδινίου (Chanzynski method) και η επακόλουθη σύνθεση του cdna με αντίστροφη μεταγραφή (reverse transcription, RT). Ως εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν εξανουκλεοτίδια τυχαίας αλληλουχίας (random hexamers). Η αντίδραση είχε τελικό όγκο 40 μl. Το ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση ήταν η αντίστροφη μεταγραφάση SuperScript II RT, με το αντίστοιχο ρυθμιστικό διάλυμα 5x (RT buffer), τριφωσφορικά νουκλεοτίδια (dntps), αναστολέα RNAασών (RNAaseOUT) και διθειοθρεϊτόλη (DTT) (Πίνακας 4). Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε ολικό κυτταρικό RNA, διαλυμένο σε ddη 2 Ο. To διάλυμα RNA αρχικά θερμάνθηκε στους 65 0 C επί 10 min και στη συνέχεια επωάστηκε στους 4 0 C για 5min για την αποδιάταξη των πιθανών δευτεροταγών δομών του RNA. Πίνακας 4: Αντιδραστήρια για την σύνθεση cdna. Table 4: Reagents for cdna synthesis. Αντιδραστήρια RT buffer 5Χ (250 mmtris-hcl, 375 mm KCl, 15 mm MgCl 2 ) RNAaseOUT (40 U/μl) dntps(10mm) Random Hexamers (500 μg/ml) SS II RT(200 U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Όγκος 8 μl 2 μl 4 μl 2 μl 2 μl Μέχρι τελικό όγκο 40 μl 40 μl Συνθήκες αντίδρασης: 37 0 C, 60 λεπτά 65 0 C, 10 λεπτά τελική θερμοκρασία: 18 0 C Το ενδεχόμενο ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων, εξαιτίας της αδυναμίας ενίσχυσης του mrna, αποκλείστηκε μέσω της ενίσχυσης αλληλουχιών που αντιστοιχούν σε μετάγραφα ιδιοσυστατικών γονιδίων (housekeeping genes). Ως τέτοιο μετάγραφο χρησιμοποιήθηκε το mrna του γονιδίου RARα (Retinoic 61

62 Acid Receptor α), το οποίο κωδικοποιεί έναν από τους υποδοχείς του ρετινοϊκού οξέος. Για την αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα 5 μl του διαλύματος cdna και ως εκκινητές τα ολιγονουκλεοτίδια RAR6 (5 - GGTGCCTCCCTACGCCTTCT-3 ) και RAR8 (5 -GGCGCTGACCCCATAGTGGT- 3 )(Πίνακας 5). Πίνακας 5: Αντιδραστήρια για την ενίσχυση των μεταγράφων RARα. Table 5: Reagents for the PCR amplification of RARa gene transcripts. Αντιδραστήρια Υπόστρωμα (cdna) 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mm Tris-HCl (ph 8.4), 500 mmkcl], MgCl 2 (Invitrogen, 50 mm) dntps (10 mm) RAR6 (10 pm/μl) RAR8 (10 pm/μl) Taq polymerase (5 U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Όγκος 5 μl 5 μl 1,5 μl 1 μl 2,5 μl 2,5 μl 0,5 μl 34 μl 50 μl Συνθήκες αντίδρασης: Αρχική αποδιάταξη: 94 0 C, 5 min Κυρίως αντίδραση (40 κύκλοι) o Αποδιάταξη: 94 0 C, 1 min o Υβριδισμός εκκινητών: 53 0 C, 1 min o Σύνθεση μορίων DNA: 72 0 C, 1.5 min Τελική επέκταση συντιθέμενων μορίων DNA: 72 0 C, 10 min Ενίσχυση των κλωνικών αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών Οι κλωνικές αναδιατάξεις της μεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών ενισχύθηκαν με την τεχνική PCR. Με κριτήριο τον ιστό από όπου απομονώθηκε το γενετικό υλικό και την ποιότητα του δείγματος, εφαρμόστηκαν τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις. 1. PCR με ειδικούς εκκινητές για την περιοχή οδηγό (Leader sequence) των γονιδίων IGHV- VHL PCR Στην περίπτωση δειγμάτων γενετικού υλικού που απομονώθηκαν από φρέσκο ιστό, η ενίσχυση των κλωνικών αναδιατάξεων πραγματοποιήθηκε με PCR με τη χρήση συναινετικών εκκινητών (consensus primers), ειδικών για την περιοχή οδηγό (leader sequence) που εντοπίζεται ανοδικά κάθε γονιδίου IGHV, 62

63 και εκκινητών ειδικών για τα γονίδια IGHJ. Οι 5 συναινετικοί εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν είναι αντιπροσωπευτικοί για καθεμιά από τις υποομάδες των γονιδίων IGHV (IGHV1 IGHV6, primers VHL1-VHL6/ ο εκκινητής VHL1 λειτουργεί και για την υποομάδα IGHV7) και, αντίστοιχα, για καθένα από τα έξι γονίδια IGHJ (IGHJ1 IGHJ6, JH1-JH6 primers), στην περιοχή 3 της αναδιάταξης (Πίνακας 6). Πίνακας 6: Αντιδραστήρια για την VHL PCR. Table 6. VHL PCR reagents. Αντιδραστήρια Yπόστρωμα (gdna/cdna) 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mmtris-hcl (ph 8.4), 500 mm KCl] MgCl 2 (Invitrogen, 50 mm) dntps (10 mm) Μίγμα εκκινητών VHL 1-6 (10 pm/μl) Μίγμα εκκινητών JH1-6 (10 pm/μl) Taq πολυμεράση (5 U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Όγκος 5 μl 10 μl 3 μl 2 μl 3 μl 3 μl 0,5 μl 73,5 μl 100 μl 2. PCR σε δύο γύρους με ειδικούς εκκινητές για την περιοχή VH FR1 των γονιδίων IGHV- VH semi-nested PCR Για την ενίσχυση των κλωνικών αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ από γενετικό υλικό δειγμάτων μονιμοποιημένων σε παραφίνη, χρησιμοποιήθηκε η προσέγγιση των δύο διαδοχικών αντιδράσεων PCR (semi-nested PCR). Στη συγκεκριμένη προσέγγιση, το προϊόν της αρχικής αντίδρασης χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα στη δεύτερη αντίδραση. Οι εκκινητές της δεύτερης αντίδρασης πρέπει να είναι ειδικοί για την ενίσχυση ενός κλάσματος του αρχικού προϊόντος. Έτσι, χρησιμοποιήθηκε ένας πιο «εσωτερικός» εκκινητής (internal primer) σε συνδυασμό μ έναν εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε και στην πρώτη αντίδραση. Στην προκειμένη περίπτωση, χρησιμοποιήθηκε και στις δύο αντιδράσεις μίγμα συναινετικών εκκινητών ειδικών για την περιοχή VH FR1 των γονιδίων IGHV καθεμιάς από τις έξι υποομάδες (VH1- VH6 primers, ο εκκινητής VHL1 λειτουργεί και για την υποομάδα IGHV7). Στην πρώτη αντίδραση, χρησιμοποιήθηκε μίγμα των εκκινητών JH1 JH6 ως εκκινητής 3, ενώ στη δεύτερη αντίδραση ένας συναινετικός εκκινητής, ειδικός για μια «εσωτερική» περιοχή και των έξι γονιδίων IGHJ (VLJH primer) (Πίνακας 7). 63

64 Πίνακας 7: Αντιδραστήρια για την VH semi-nested PCR. Table 7: VH semi-nested PCR reagents. Αντιδραστήρια Αρχική αντίδραση Yπόστρωμα (gdna) 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mmtris-hcl (ph 8.4), 500 mm KCl] MgCl 2 (Invitrogen, 50 mm) dntps (10 mm) Μίγμα εκκινητών VH 1-6FR1 (10 pm/μl) Μίγμα εκκινητών JH1-6 (10 pm/μl) Taq πολυμεράση (5 U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Δεύτερη αντίδραση Yπόστρωμα (Προϊόν αρχικής αντίδρασης) 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mm Tris-HCl (ph 8.4), 500 mm KCl] MgCl 2 (Invitrogen, 50 mm) dntps (10 mm) Μίγμα εκκινητών VH 1-6FR1 (10 pm/μl) VLJH (10 pm/μl) Taq πολυμεράση (5 U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Όγκος 5 μl 10 μl 3 μl 2 μl 6 μl 6 μl 0,5 μl 67,5 μl 100 μl 2 μl 10 μl 3 μl 2 μl 6 μl 4 μl 0,5 μl 72,5 μl 100 μl 3. PCR με ειδικούς εκκινητές για την περιοχή VH FR2 VH FR2 family specific PCR Σε μικρό αριθμό περιπτώσεων, εξαιτίας της προβληματικής ποιότητας του γενετικού υλικού, χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιοι εκκινητές 3 (JH1-JH6 και VLJH) ενώ οι εκκινητές 5 ήταν ειδικοί για την περιοχή VH FR2 καθεμιάς από τις υποομάδες των γονιδίων IGHV (VH1-FR2 /VH6-FR2 primers) (Πίνακας 8). 64

65 Πίνακας 8: Αντιδραστήρια για τη VH-FR2 family specific PCR. Table 8: VH-FR2 family specific PCR reagents. Αντιδραστήρια Αρχική αντίδραση Yπόστρωμα (gdna) 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mmtris-hcl (ph 8.4), 500 mm KCl] MgCl 2 (Invitrogen, 50 mm) dntps (10mM) Μίγμα εκκινητών VH 1-6FR2 (10 pm/μl) Μίγμα εκκινητών JH1-6 (10 pm/μl) Taq πολυμεράση(5 U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Δεύτερη αντίδραση Yπόστρωμα (Προϊόν αρχικής αντίδρασης) 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mmtris-hcl (ph 8.4), 500 mm KCl] MgCl 2 (Invitrogen, 50 mm) dntps (10 mm) Μίγμα εκκινητών VH 1-6FR2 (10 pm/μl) VLJH (10 pm/μl) Taq πολυμεράση(5 U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Όγκος 5 μl 10 μl 3 μl 2 μl 4 μl 6 μl 0,5 μl 69,5 μl 100 μl 2 μl 10 μl 3 μl 2 μl 4 μl 4 μl 0,5 μl 74,5 μl 100 μl Καθαρισμός των προϊόντων PCR Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξης, περιεκτικότητας 3%. Η ζώνη που αντιστοιχούσε στη μονοκλωνική αναδιάταξη IGHV-IGHD-IGHJ αφαιρέθηκε από την πηκτή και ο καθαρισμός του προϊόντος PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), σύμφωνα με το ενδεδειγμένο πρωτόκολλο. Καθορισμός της αλληλουχίας των προϊόντων PCR Ο καθορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων PCR πραγματοποιήθηκε με την αυτοματοποιημένη μέθοδο Sanger και στους δύο κλώνους του προϊόντος. Χρησιμοποιήθηκε ειδικός αναλυτής (CEQ 8000 Genetic Analysis System, Beckman-Coulter) καθώς και αντιδραστήρια της ίδιας εταιρίας (Dye Terminator Cycle Sequencing [DTCS] Quick Start Kit της Beckman Coulter). Η μέθοδος Sanger αφορά στην σύνθεση μορίων DNA in vitro παρουσία τριφωσφορικών διδεοξυριβονουκλεοτιδίων, η προσθήκη των οποίων στο ελεύθερο άκρο του νεοσυντιθέμενου κλώνου προκαλεί διακοπή της σύνθεσης. Έτσι, παράγεται ένα σύνολο διαφορετικών αντιγράφων DNA, τα οποία διαφέρουν 65

66 σε μήκος μόνο κατά ένα νουκλεοτίδιο λόγω του τερματισμού της σύνθεσης DNA σε κάθε πιθανή θέση του νεοσυντιθέμενου κλώνου. Στη συνέχεια, τα τμήματα DNA υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή και διαχωρίζονται με βάση το μήκος τους, καθιστώντας δυνατό τον καθορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του αρχικού μορίου με βάση την κινητικότητα των αντιγράφων DNA στην πηκτή. Ως εκκινητής για τον καθορισμό της αλληλουχίας του συμπληρωματικού (3 5, antisense) κλώνου χρησιμοποιήθηκε ο συναινετικός εκκινητής VLJH, ενώ για τον κωδικοποιητικό κλώνο (5 3, sense) χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί εκκινητές για την υποομάδα του γονιδίου IGHV, οι οποίοι προσδένονται στην αλληλουχία οδηγό, την περιοχή VH FR1 ή την περιοχή VH FR2, ανάλογα και με τον εκκινητή που είχε χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση της μονοκλωνικής αναδιάταξης. Βιοπληροφορική ανάλυση ανοσογενετικών χαρακτηριστικών Οι αλληλουχίες των κλωνικών αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ αναλύθηκαν με τη χρήση του αλγόριθμου IMGT/V-QUEST 157 και συγκρίθηκαν με τις πιο συγγενείς, μη αναδιαταγμένες αλληλουχίες των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών που έχουν καταχωρηθεί στη βάση δεδομένων ανοσογενετικής IMGT (Ιnternational ImMunoGeneTics database) 158,159. Ο έλεγχος ποιότητας, η επιμέλεια των αλληλουχιών καθώς και η ανάλυση των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών των αναδιατάξεων έγινε με συστηματικό και αυτοματοποιημένο τρόπο με τη χρήση σύγχρονων εργαλείων βιοπληροφορικής στη γλώσσα προγραμματισμού Perl. Η ανάπτυξη των βιοπληροφορικών εργαλειών έγινε στο πλαίσιο της συνεργασίας με την Ομάδα Βιοπληροφορικής Ανάλυσης του Ινστιτούτου Αγροβιοτεχνολογίας (ΙΝ.Α.) στο Εθνικό Κέντρο Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (Ε.Κ.Ε.Τ.Α.). Ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών των αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ Οι πληροφορίες από την ανάλυση όλων των παραγωγικών αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ μέσω του εργαλείου IMGT/V-QUEST ομαδοποιήθηκαν με την χρήση αλγορίθμων, ειδικών για την επεξεργασία πληροφοριών από την ανάλυση μεγάλων συνόλων δεδομένων. Οι αλγόριθμοι αναπτύχθηκαν στη γλώσσα προγραμματισμού Perl και προσφέρουν τη δυνατότητα ανάδειξης γενικών χαρακτηριστικών των νεοπλασματικών αναδιατάξεων. Η ανάλυση συνεπάγεται τη δυνατότητα σύγκρισης με τα χαρακτηριστικά των ανοσοσφαιρινών των κλωνικών Β λεμφοκυττάρων σε άλλες νεοπλασίες, καθώς και με πληθυσμούς φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων. 66

67 Η ανάλυση παράγει σύνθετα υπολογιστικά φύλλα που περιέχουν πληροφορίες για τις εξής παραμέτρους: συχνότητα αναδιάταξης των γονιδίων αλλά και των συγκεκριμένων αλληλομόρφων των γονιδίων της μεταβλητής περιοχής της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας, ποσοστό ταυτότητας των αναδιαταγμένων γονιδίων με τα αντίστοιχα πιο συγγενή, μη αναδιαταγμένα γονίδια, πιθανότητα επιλογής συγκεκριμένων αναδιατάξεων σε επίπεδο γονιδίων μέσω του υπολογισμού της συχνότητας ανασυνδυασμού κάθε γονιδίου IGHV με όλα τα γονίδια IGHD και IGHJ, πιθανή σχέση μεταξύ της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων IG με άλλα μοριακά χαρακτηριστικά, όπως το μήκος της περιοχής VH CDR3, και, ομαδοποίηση των ασθενών με βάση το μεταλλακτικό φορτίο του αναδιαταγμένου γονιδίου IGHV. H συγκεκριμένη εφαρμογή δίνει τη δυνατότητα επιλογής συγκεκριμένων κριτηρίων, όπως ο αριθμός των υποσυνόλων καθώς και τα αριθμητικά όρια των μεταλλάξεων, με βάση τα οποία θα γίνει ο αυτόματος διαχωρισμός των ασθενών της ομάδας εργασίας σε συγκεκριμένα υποσύνολα. Σε επόμενο επίπεδο αναδεικνύονται πιθανές συσχετίσεις του φορτίου μεταλλάξεων του γονιδίου IGHV με άλλα μοριακά χαρακτηριστικά των αναδιατάξεων. χαρακτηριστικά της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης: κάθε νουκλεοτιδική αλλαγή κατατάσσεται ανάλογα με το αν οδηγεί σε αντικατάσταση αμινοξέος, οπότε θεωρείται μετάλλαξη αντικατάστασης (replacement mutation, R), ή αν έχει ως αποτέλεσμα τη διατήρηση του ίδιου αμινοξέος, οπότε θεωρείται σιωπηρή (silent mutation, S). Επιπλέον, εξετάζεται η στόχευση μεταλλάξεων στα γνωστά δι- (2-NTP) και τετρά- (4-NTP) νουκλεοτιδικά μοτίβα, WA/TW και RGYW/WRCY (όπου R=A/G, Y=C/T και W=A/T) 160. Σε όλες τις περιπτώσεις μετάλλαξης αντικατάστασης, εξετάζεται αν η αμινοξική αλλαγή είναι προς ένα αμινοξύ παρόμοιων φυσικοχημικών ιδιοτήτων, οπότε η αντικατάσταση θεωρείται συντηρητική (conservative), ή όχι, οπότε η μετάλλαξη θεωρείται μη συντηρητική (nonconservative). Η διάκριση βασίζεται στους κανόνες ομαδοποίησης των αμινοξέων με παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες του IMGT ( 161, καθώς και σε καθιερωμένους αλγορίθμους για την ποιοτική αξιολόγηση των αμινοξικών αντικαταστάσεων (BLOSUM) 162. Επιπλέον, αναλύθηκε η κατανομή των μεταλλάξεων ανά επιμέρους υποπεριοχή της μεταβλητής περιοχής της ανοσοσφαιρίνης, με σκοπό την έμμεση ανίχνευση συγκεκριμένων περιοχών ή θέσεων που «στοχεύονται» από το μηχανισμό της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης και πιθανολογείται ότι είναι σημαντικές για την αντιγονική πρόσδεση ή τη δομική σταθερότητα του μορίου της ανοσοσφαιρίνης. 67

68 Με βάση τα συγκεκριμένα δεδομένα, κατασκευάστηκαν πίνακες κατανομής των μεταλλάξεων για το σύνολο των αναδιατάξεων αλλά και για υποσύνολα αναδιατάξεων με συγκεκριμένα μοριακά χαρακτηριστικά, όπως: υποομάδα γονιδίου, γονίδιο ή αλληλόμορφο γονιδίου IGHV, μεταλλακτικό φορτίο του γονιδίου IGHV και μήκος περιοχής VH CDR3. Δημιουργήθηκαν επίσης πίνακες του λόγου των μεταλλάξεων αντικατάστασης προς τις σιωπηρές μεταλλάξεις (R/S ratios) για υποσύνολα αναδιατάξεων με κοινά χαρακτηριστικά (π.χ. υποομάδα γονιδίου, γονίδιο και αλληλόμορφο IGHV, μεταλλακτικό φορτίο του γονιδίου IGHV, μήκος περιοχής VH CDR3). Ο λόγος μεταλλάξεων R/S αποτελεί μια επιπλέον ένδειξη για την «πίεση» που ασκείται μέσω της αντιγονικής επιλογής προς συγκεκριμένες μεταλλάξεις αντικατάστασης σε συγκεκριμένες θέσεις/περιοχές του γονιδίου IGHV. Γι αυτό το λόγο, υπολογίστηκε επίσης και για συγκεκριμένες υποπεριοχές των αναδιατάξεων (π.χ. VH FR1, VH CDR2). Για τον αντικειμενικό υπολογισμό των λόγων R/S, συνυπολογίστηκε η πιθανότητα μια μετάλλαξη να συμβαίνει συχνότερα σε μια περιοχή VH FR παρά σε μια περιοχή VH CDR εξαιτίας του μεγαλύτερου μήκους των περιοχών VH FR. Για το λόγο αυτό, κάθε μετάλλαξη «κανονικοποιήθηκε» διαιρούμενη με τον αριθμό αμινοξικών κατάλοιπων της περιοχής στην οποία εντοπίζεται (π.χ. μια μετάλλαξη στην περιοχή VH CDR2 μήκους οκτώ αμινοξέων έχει «βαρύτητα» ίση με 1/8=0,13 ενώ αντίθετα, στην περιοχή VH FR1 μήκους 26 αμινοξέων η «βαρύτητα» μιας μετάλλαξης είναι 1/26= 0,04). Παράλληλα, κατασκευάστηκαν υπολογιστικά φύλλα πολλαπλής ευθυγράμμισης των νουκλεοτιδικών και των αμινοξικών αλληλουχιών των αναδιατάξεων με σκοπό την ανεύρεση κοινών, «επαναλαμβανόμενων» (recurrent) μεταλλάξεων μεταξύ διαφορετικών αναδιατάξεων, καθώς και μοτίβων εισαγωγής μεταλλάξεων σε υποσύνολα αναδιατάξεων με ιδιαίτερη μοριακή «ταυτότητα». Η ανεύρεση τέτοιων μοτίβων αποτελεί ένδειξη για την επιλογή εισαγωγής συγκεκριμένων μοτίβων μεταλλάξεων με δομικό ή λειτουργικό ρόλο στην αναγνώριση και πρόσδεση του αντιγόνου. ανάλυση και ομαδοποίηση των αναδιατάξεων με βάση κοινά χαρακτηριστικά της περιοχής VH CDR3: μήκος, ισοηλεκτρικό σημείο, έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων IGHD και IGHJ και αναδιάταξη των IGHD γονιδίων στο ίδιο αναγνωστικό πλαίσιο (IGHD reading frame). ανάλυση της «στερεοτυπίας» στην περιοχή VH CDR3 με τον αλγόριθμο TEIRESIAS 163, ένα υπολογιστικό εργαλείο που αναπτύχθηκε από την ομάδα Bioinformatics and Pattern Discovery του ΙΒΜ Computational Biology Center. Ο λειτουργία του αλγορίθμου περιλαμβάνει δύο στάδια: (i) αναγνώριση κοινών αμινοξικών μοτίβων μεταξύ διαφορετικών περιοχών VH CDR3. 68

69 (ii) ομαδοποίηση/κατάταξη των αναδιατάξεων σε υποσύνολα (clusters) σύμφωνα με συγκεκριμένες παραμέτρους. Τα κριτήρια ταξινόμησης που εφαρμόστηκαν σε κάθε περίπτωση εξασφαλίζουν ότι τα υποσύνολα αναδιατάξεων που προκύπτουν αποτελούνται από αλληλουχίες με υψηλό βαθμό συγγένειας. Ως κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν: η έκφραση γονιδίου/υποομάδας IGHV, ο βαθμός ομοιότητας των περιοχών VH CDR3 σε επίπεδο αμινοξέος και ομάδας αμινοξέων (με παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες), το μήκος της περιοχής VH CDR3 και τέλος η θέση του κοινού αμινοξικού μοτίβου εντός της περιοχής VH CDR3. O αλγόριθμος δημιουργεί υποσύνολα σε αρχικό/βασικό επίπεδο (ground level clusters). Σε αυτό το στάδιο πρέπει να ικανοποιούνται όλα τα κριτήρια ταξινόμησης. Η ύπαρξη κοινών αμινοξικών μοτίβων μεταξύ αλληλουχιών σε διαφορετικά υποσύνολα βασικού επιπέδου οδηγεί στη δημιουργία υποσυνόλων σε ανώτερο επίπεδο (high level clusters). Η ομαδοποίηση σε υποσύνολα ανώτερου επιπέδου είναι δυνατή ακόμα και με πιο «ελαστικά» κριτήρια επιλογής, αναδεικνύοντας πιο μακρινές σχέσεις συγγένειας μεταξύ των αλληλουχιών. Εργαλεία απεικόνισης δεδομένων (data visualization tools) Για την απεικόνιση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν online εργαλεία ελεύθερης πρόσβασης με σκοπό την απεικόνιση δεδομένων με απλότητα, ευκολία και υψηλή αισθητική. WebLogo ( εφαρμογή για τη δημιουργία λογοτύπων αμινοξικών αλληλουχιών. Κάθε λογότυπο αποτελείται από «στοίβες» αμινοξέων, με κάθε «στοίβα» να αντιστοιχεί σε μια δεδομένη θέση της αλληλουχίας. Το μέγεθος κάθε χαρακτήρα (μονογραμματικό σύμβολο αμινοξέος) αντιστοιχεί στη συχνότητα του δεδομένου αμινοξέος στη συγκεκριμένη θέση. Το συγκεκριμένο εργαλείο χρησιμοποιήθηκε για την αναπάρασταση στερεότυπων περιοχών VH CDR3 διαφορετικών υποσυνόλων αναδιατάξεων 164. Circos ( λογισμικό απεικόνισης δεδομένων σε κυκλική διάταξη. Χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση πιθανών συσχετίσεων στην έκφραση γονιδίων IGHV και IGHD 165. TeXshade: λογισμικό που χρησιμοποιεί ευθυγραμμισμένες νουκλεοτιδικές ή αμινοξικές αλληλουχίες, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση κοινών, «επαναλαμβανόμενων» μεταλλάξεων κατά μήκος του γονιδίου IGHV σε υποσύνολα αναδιατάξεων με «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3. Οι χαρακτήρες (μονογραμματικά σύμβολα των αμινοξέων) πάνω από τη γραμμή αναπαριστούν αμινοξικές αλλαγές, ενώ οι χαρακτήρες κάτω από τη γραμμή αναπαριστούν τα αντίστοιχα αμινοξέα στις ίδιες θέσεις του συγγενέστερου μη αναδιαταγμένου γονιδίου IGHV. Το μέγεθος κάθε χαρακτήρα αναπαριστά τη σχετική συχνότητα 69

70 κάθε αμινοξέος στη δεδομένη θέση σε σχέση με τα υπόλοιπα αμινοξέα, στο δεδομένο υποσύνολο αναδιατάξεων. Τα κενά αντιπροσωπεύουν θέσεις όπου διατηρείται η αμινοξική αλληλουχία του μη μη αναδιαταγμένου γονιδίου IGHV 166,167. Τα μονογραμματικά σύμβολα των αμινοξέων χρωματίστηκαν με διαφορετικά χρώματα με βάση τους κανόνες του IMGT για την ομαδοποίηση των αμινοξέων με παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες. 70

71 Αποτελέσματα «Ανάλυση της στερεοτυπίας της περιοχής VH CDR3 σε 7596 αναδιατάξεις ασθενών με ΧΛΛ: μοριακή κατάταξη των ασθενών με ενδείξεις για την αντιμετώπιση της νόσου» Ρεπερτόριο γονιδίων της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών IGH Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV Αναλύθηκαν συνολικά 7596 παραγωγικές αναδιατάξεις από 7424 ασθενείς με ΧΛΛ. Σε 172 ασθενείς (2.3%) ενισχύθηκαν δύο παραγωγικές αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ. Σε επίπεδο υποομάδων των γονιδίων IGHV, συχνότερα αναδιατάσσονταν τα γονίδια της υποομάδας IGHV3. Συγκεκριμένα, γονίδια της υποομάδας IGHV3 ανιχνεύθηκαν σε 3658/7596 περιπτώσεις (48.2%), ενώ ακολούθησαν σε συχνότητα οι υποομάδες IGHV1 και IGHV4 με 1807 και 1567 αναδιατάξεις, αντίστοιχα (Πίνακας 9). Πίνακας 9: Ρεπερτόριο υποομάδων γονιδίων IGHV. Table 9: IGHV gene subgroup repertoire. Υποομάδα γονιδίων IGHV Αριθμός αναδιατάξεων (Ν) Ποσοστό (%) IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV Σύνολο Στο σύνολο των παραγωγικών αναδιατάξεων αναγνωρίσθηκαν 46 γονίδια IGHV. Ο απόλυτος αριθμός και η συχνότητα αναδιάταξης για κάθε γονίδιο αναφέρονται στον Πίνακα 1 του Παραρτήματος. Η ανάλυση ρεπερτορίου ανέδειξε ισχυρή επιλεκτικότητα στη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV. Συχνότερο γονίδιο, με σημαντική διαφορά από τα υπόλοιπα, ήταν το IGHV1-69 που εντοπίστηκε σε 973/7596 αναδιατάξεις (12.8%), ακολουθούμενο από το IGHV4-34 σε 673/7596 περιπτώσεις (8.9%) και τρία γονίδια της υποομάδας IGHV3 (IGHV3-23, IGHV3-7 και IGHV3-30 σε 647, 435 και 416 περιπτώσεις, αντίστοιχα). Ακολούθησαν 71

72 τα γονίδια IGHV3-21, IGHV1-2, IGHV3-48, IGHV4-39 και IGHV3-33 με ποσοστά που κυμαίνονταν από %. Συνολικά, τα δέκα συχνότερα γονίδια της ανάλυσης εκφράζονταν στο 61.2% των αναδιατάξεων (Πίνακας 10). Πίνακας 10: Ρεπερτόριο των συχνότερων γονιδίων IGHV. Table 10: Repertoire of the predominant IGHV genes. Γονίδιο IGHV Αριθμός αναδιατάξεων (Ν) Ποσοστό (%) V V V V V V V V V V Λοιπά γονίδια IGHV Σύνολο Ρεπερτόριο γονιδίων IGHD Γονίδια IGHD αναγνωρίστηκαν σε 7498/7596 (98.7%) περιπτώσεις. Τα γονίδια της υποομάδας IGHD3 αναδιατάσσονταν συχνότερα (3022/7498 αναδιατάξεις, 40.3%), ακολουθούμενα από τα γονίδια της υποομάδας IGHD2 (1471/7498 αναδιατάξεις, 19.4%). Η ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHD ανέδειξε έντονη επιλεκτικότητα, με πέντε γονίδια να αναδιατάσσονται στο 48.9% των περιπτώσεων. Συχνότερο γονίδιο ήταν το IGHD3-3 (1089/7498 αναδιατάξεις, 14.5%), με αμέσως επόμενο το IGHD2-2 (672/7498 αναδιατάξεις, 9%). Ακολούθησαν τα γονίδια IGHD3-22, IGHD3-10 και IGHD6-19 με ποσοστά που κυμαίνονταν από %, ενώ συνολικά αναγνωρίστηκαν 25 διαφορετικά γονίδια IGHD (Εικόνα 26). 72

73 IGHD1-1 IGHD1-14 IGHD1-20 IGHD1-26 IGHD1-7 IGHD2-15 IGHD2-2 IGHD2-21 IGHD2-8 IGHD3-10 IGHD3-16 IGHD3-22 IGHD3-3 IGHD3-9 IGHD4-17 IGHD4-23 IGHD4-4 IGHD5-12 IGHD5-24 IGHD5-5 IGHD6-13 IGHD6-19 IGHD6-25 IGHD6-6 IGHD Ρεπερτόριο γονιδίων IGHJ Εικόνα 26: Ρεπερτόριο γονιδίων IGHD (%). Figure 26: IGHD gene repertoire (%). Η ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHJ ανέδειξε ως συχνότερα γονίδια τα IGHJ4 (3289/7596 περιπτώσεις, 43.3%) και IGHJ6 (2450/7596, 32.3%), δεδομένο που συμφωνεί απόλυτα με τις προηγούμενες εργασίες 81,109,110,114, (Εικόνα 27). IGHJ6, 32% IGHJ1, 2% IGHJ2, 2% IGHJ3, 10% IGHJ5, 11% IGHJ4, 43% Εικόνα 27: Ρεπερτόριο γονιδίων IGHJ. Figure 27: IGHJ gene repertoire. 73

74 Επιλεκτικότητα στο επίπεδο συνδυασμού γονιδίων IGHV, IGHD και IGHJ Η λεπτομερής ανάλυση των αναδιατάξεων ανέδειξε επιλεκτικότητα και στο επίπεδο συνδυασμού γονιδίων IGHV-IGHD. Συγκεκριμένα, η ανάλυση των αναδιατάξεων των 10 συχνότερων γονιδίων IGHV οδήγησε στην αναγνώριση συγκεκριμένων συνδυασμών, ιδίως στις αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV1-69 και IGHV1-2. Αντίθετα, τα γονίδια IGHV4-34, IGHV3-7 και IGHV3-23 δεν εμφάνισαν ιδιαίτερη τάση για ανασυνδυασμό με συγκεκριμένα γονίδια IGHD. Συγκεκριμένα, 298/973 (30.6%) αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV1-69 χρησιμοποιούσαν το γονίδιο IGHD3-3, ενώ ο συνδυασμός IGHV1-2/IGHD6-19 εντοπίστηκε σε 80/348 (23%) περιπτώσεις του γονιδίου IGHV1-2. Οι συνδυασμοί των δέκα επικρατέστερων γονιδίων IGHV με τα πέντε συχνότερα γονίδια IGHD απεικονίζονται στην Εικόνα 28. Εικόνα 28: Κυκλική αναπαράσταση των συχνοτήτων ανασυνδυασμού μεταξύ των δέκα συχνότερων γονιδίων IGHV με τα πέντε συχνότερα IGHD. Η εικόνα σχεδιάστηκε με το λογισμικό Circos. Figure 28: Circular layout of the recombination frequencies of the ten predominant IGHV genes with the five most frequent IGHD genes. The image was created using the Circos software. Επιλεκτικότητα παρατηρήθηκε και ως προς την έκφραση συγκεκριμένων συνδυασμών γονιδίων IGHV και IGHJ. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε έντονη τάση του γονιδίου IGHV1-69 να ανασυνδυάζεται με το γονίδιο IGHJ6 (542/973, 55.7%), ενώ τα γονίδια IGHV3-7 και IGHV3-23 ανασυνδυάζονταν κατά προτίμηση με το γονίδιο IGHJ4 (225/435, 51.7% και 421/647, 65%, αντίστοιχα). Οι συγκεκριμένες τάσεις συνδυασμού γονιδίων IGHV και IGHJ, καθώς και οι συνδυασμοί των υπόλοιπων από τα δέκα συχνότερα γονίδια IGHV με τα γονίδια IGHJ4 και IGHJ6 αναπαριστώνται στην Εικόνα

75 Εικόνα 29: Κυκλική αναπαράσταση των συχνοτήτων ανασυνδυασμού μεταξύ των δέκα συχνότερων γονιδίων IGHV με τα δύο συχνότερα IGHJ. Η εικόνα σχεδιάστηκε με το λογισμικό Circos. Figure 29: Circular layout of the recombination frequencies of the ten most frequent IGHV genes with the two most common IGHJ genes. The image was created using the Circos software. Ανάλυση του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης Για τη διάκριση των αναδιατάξεων σε «μεταλλαγμένες-αμετάλλακτες» χρησιμοποιήθηκε ως όριο το ποσοστό ταυτότητας 98% με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV (IGHV germline gene). Στην παρούσα εργασία, 4171/7596 περιπτώσεις (55%) είχαν ταυτότητα <98% και θεωρήθηκαν ως «μεταλλαγμένες», ενώ 3425/7596 περιπτώσεις είχαν «αμετάλλακτα» γονίδια IGHV. Στο «αμετάλλακτο» υποσύνολο, 2516/3425 αναδιατάξεις (73.5%) εξέφραζαν γονίδια IGHV χωρίς καθόλου σωματικές μεταλλάξεις (Εικόνα 30). <98, 55% 100, 33% 98=<x<100, 12% Εικόνα 30: Υποσύνολα αναδιατάξεων με βάση το ποσοστό ταυτότητας με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV. Figure 30: Rearrangement subgroups based on the homology percentage with the closest germline IGHV gene. 75

76 Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV διέφερε σημαντικά μεταξύ των τριών υποσυνόλων με διαφορετικό φορτίο σωματικών μεταλλάξεων. Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγμα του γονιδίου IGHV1-69, το οποίο αποτελούσε το 30.3% των περιπτώσεων με «πραγματικά αμετάλλακτα» γονίδια IGHV (100% ταυτότητα με το μη αναδιαταγμένο γονίδιο) και μόλις το 2.3% των περιπτώσεων του «μεταλλαγμένου» υποσυνόλου. Αντίθετα, το γονίδιο IGHV4-34 εντοπίστηκε κυρίως στο «μεταλλαγμένο» υποσύνολο (13.1%), ενώ η συχνότητά του ήταν πολύ μικρότερη στο υποσύνολο με ταυτότητα 100% (3.5%). Συχνότητα «στερεοτυπίας» της περιοχής VH CDR3 Οι αλληλουχίες των περιοχών VH CDR3 των αναδιατάξεων IGHV-IGHD- IGHJ αναλύθηκαν με τη χρήση ενός αλγορίθμου βιοπληροφορικής που βασίζεται στην αναγνώριση κοινών αμινοξικών μοτίβων μεταξύ διαφορετικών αλληλουχιών. Η εφαρμογή συγκεκριμένων κριτηρίων ταξινόμησης και η ύπαρξη κοινών αμινοξικών μοτίβων μεταξύ των διαφορετικών αλληλουχιών VH CDR3 οδήγησαν στη δημιουργία υποσυνόλων, τα οποία αποτελούνταν από αλληλουχίες με μεγάλη «μοριακή συγγένεια». Στην παρούσα εργασία, τα κριτήρια του αλγορίθμου ήταν ως εξής: έκφραση γονιδίου IGHV της ίδιας φυλογενετικής ομάδας, 50% ταυτότητα (identity) και 70% ομοιότητα (similarity) μεταξύ των αμινοξικών αλληλουχιών VH CDR3 των αναδιατάξεων κάθε υποσυνόλου, ίδιο μήκος περιοχής VH CDR3, και, κοινές «συντεταγμένες» του κοινού αμινοξικού μοτίβου εντός της περιοχής VH CDR3. Η εφαρμογή των συγκεκριμένων κριτηρίων οδήγησε στην ταξινόμηση 2308/7596 (30.4%) αναδιατάξεων σε υποσύνολα που χαρακτηρίζονται από «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3. Το μέγεθος των υποσυνόλων αρχικού/βασικού επιπέδου κυμαινόταν από 2 56 αλληλουχίες. Οι περιοχές VH CDR3 είναι δυνατό να περιέχουν περισσότερα από ένα κοινά αμινοξικά μοτίβα. Μέσω του ειδικού σχεδιασμού του αλγορίθμου, αυτή η ιδιότητα των περιοχών VH CDR3 κατέληξε στην ταξινόμηση των συγκεκριμένων περιοχών σε περισσότερα από ένα «στερεότυπα» υποσύνολα. Η επικάλυψη μεταξύ των υποσυνόλων οδήγησε στο σχηματισμό υποσυνόλων σε τρία ιεραρχικά ανώτερα επίπεδα, τα οποία χαρακτηρίζονται από πιο γενικά μοτίβα και μεγαλύτερο αριθμό αλληλουχιών (7 213 αλληλουχίες) (Πίνακας 11). 76

77 Πίνακας 11: Ταξινόμηση των αναδιατάξεων σε υποσύνολα με στερεότυπες περιοχές VH CDR3. Table 11: Classification of rearrangements to subsets with stereotyped VH CDR3 regions. Επίπεδο υποσυνόλου Αριθμός υποσυνόλων Αλληλουχίες Αριθμός Ποσοστό Μεταξύ των ανώτερων ιεραρχικά υποσυνόλων (high level clusters) εντοπίστηκαν 19 υποσύνολα, τα οποία περιείχαν 20 ή περισσότερες αλληλουχίες και ορίστηκαν ως «κύρια». Τα «κύρια» υποσύνολα περιλάμβαναν συνολικά 943 αναδιατάξεις και αποτελούσαν το 12.4% του συνόλου των αναδιατάξεων και το 40.9% των περιπτώσεων με «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3 (Εικόνα 28). Με άλλα λόγια, ένας στους οκτώ ασθενείς με ΧΛΛ ανήκε σε ένα από τα «κύρια» υποσύνολα. Η λεπτομερής περιγραφή των «κύριων» υποσυνόλων παρατίθεται στον Πίνακα 2 του Παραρτήματος. Εικόνα 28: Συχνότητα των αναδιατάξεων που ανήκουν σε «κύρια» υποσυνόλα. Figure 28: Frequencies of rearrangements assigned to major subsets. Μολονότι η ταξινόμηση των «στερεότυπων» αναδιατάξεων σε υποσύνολα ανώτερων επιπέδων δεν απαιτούσε την πλήρη ικανοποίηση όλων των κριτηρίων, 77

78 τα συγκεκριμένα υποσύνολα χαρακτηρίζονταν συχνά από αυξημένη ομοιογένεια. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το υποσύνολο #6, το οποίο περιλαμβάνει «στερεότυπες», «αμετάλλακτες» αναδιατάξεις IGHV1-69/IGHD3-16/IGHJ3 92,93,116. Στην παρούσα εργασία το συγκεκριμένο υποσύνολο #6 αποτελούνταν από 68 αναδιατάξεις (0.9%). Με εξαίρεση 4 θέσεις της περιοχής VH CDR3, οι οποίες χαρακτηρίζονταν από σχετική ετερογένεια, οι υπόλοιπες δεκαεπτά θέσεις ήταν εξαιρετικά, αν όχι απόλυτα, συντηρημένες. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι όλα τα αμινοξέα στην περιοχή συμβολής Ν1 μεταξύ των γονιδίων IGHV και IGHD ήταν ταυτόσημα σε 67/68 περιπτώσεις (Εικόνα 29). Εικόνα 29: Λογότυπο της αμινοξικής αλληλουχίας των στερεότυπων αναδιατάξεων του υποσυνόλου #6. Figure 29: Sequence logo of the amino acid sequence of stereotyped rearrangements belonging to subset #6. Στον αντίποδα βρίσκεται το υποσύνολο #2 110,112, το οποίο αποτελούνταν από 213 αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-21 (2.8% του συνόλου των περιπτώσεων). Το υποσύνολο #2 χαρακτηρίζεται από αναδιατάξεις με πολύ μικρή περιοχή VH CDR3 (9 αμινοξέα), η οποία κωδικοποιείται κατά κύριο λόγο από το γονίδιο IGHJ6. Εντυπωσιακό μοριακό χαρακτηριστικό της «στερεοτυπίας» του συγκεκριμένου υποσυνόλου είναι ότι όλες σχεδόν οι αναδιατάξεις διέθεταν ένα αμινοξύ-ορόσημο (ασπαρτικό οξύ, D) στο κέντρο της περιοχής VH CDR3 και συγκεκριμένα στη θέση 107, μεταξύ των αμινοξέων που κωδικοποιούνται από τα γονίδια IGHV και IGHJ. Οι δύο αναδιατάξεις χωρίς κατάλοιπο ασπαρτικού οξέος στη θέση 107 έφεραν αντί αυτού ένα κατάλοιπο γλουταμικού οξέος (Ε) στην ίδια θέση, το οποίο έχει παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες με το ασπαρτικό οξύ (και τα δύο είναι όξινα) 161 (Εικόνα 30). Σε αυτό το πλαίσιο, είναι δυνατός ο ισχυρισμός ότι οι αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-21 στη ΧΛΛ ταξινομούνται στο υποσύνολο #2 με βάση δύο μόνο κριτήρια: το μήκος της περιοχής VH CDR3 πρέπει να είναι 9 αμινοξέα να διαθέτουν ένα όξινο αμινοξύ-ορόσημο (ασπαρτικό οξύ, γλουταμικό οξύ) στη θέση 107 της περιοχής VH CDR3. 78

79 Εικόνα 30: Λογότυπο της αμινοξικής αλληλουχίας των στερεότυπων αναδιατάξεων του υποσυνόλου #2. Figure 30: Sequence logo of the amino acid sequence of stereotyped rearrangements belonging to subset #2. Τύποι «στερεότυπων» αμινοξικών μοτίβων Τα κοινά αμινοξικά μοτίβα που καθορίζουν την ταξινόμηση των αναδιατάξεων σε «στερεότυπα» υποσύνολα διακρίνονταν σε δύο κύριους τύπους: «κυρίως συνδυαστικός» (mainly combinatorial): ο τύπος αυτός κωδικοποιείται από τμήμα της αλληλουχίας ενός αμετάλλακτου γονιδίου IGHD και της περιοχής 5 ενός αμετάλλακτου γονιδίου IGHJ συγκεκριμένων συνδυασμών γονιδίων IGHD- IGHJ. «συνδυαστικός+συνδετικός» (combinatorial+junctional): τα συγκεκριμένα μοτίβα εντοπίζονται εν μέρει στις περιοχές συμβολής Ν (Ν1 και Ν2) μεταξύ των γονιδίων IGHV-IGHD και IGHD-IGHJ, οι οποίες προκύπτουν από τους μηχανισμούς της συνδετικής ετερογένειας (προσθήκη νουκλεοτιδίων Ρ και Ν, δράση εξωνουκλεασών στα άκρα των γονιδίων IGH). Το υποσύνολο #8 108,110 είναι η επιτομή του «κυρίως συνδυαστικού» τύπου μοτίβου. Οι στερεότυπες, αμετάλλακτες βαριές αλυσίδες κωδικοποιούνται από το συνδυασμό των γονιδίων IGHV4-39/IGHD6-13/IGHJ5 (το γονίδιο IGHD βρίσκεται στο πλαίσιο ανάγνωσης 1) με περιοχές VH CDR3 μήκους 19 αμινοξέων. Παρότι οι περιοχές Ν1 και Ν2 (μεταξύ των γονιδίων IGHV-IGHD και IGHD-IGHJ, αντίστοιχα) ήταν ετερογενείς σε αμινοξικό επίπεδο, η εκτενής ανάλυση των αναδιατάξεων της βαριάς αλυσίδας σε δημόσιες βάσεις δεδομένων (IMGT/LIGM-DB) 158 οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ο συγκεκριμένος συνδυασμός γονιδίων IGHV-IGHD-IGHJ είναι ειδικός για το υποσύνολο #8. Χαρακτηριστικό παράδειγμα του «συνδυαστικού+συνδετικού» τύπου είναι το μοτίβο στην περιοχή VH CDR3 των αναδιατάξεων του υποσυνόλου #4 109,110, το οποίο περιλάμβανε 74 περιπτώσεις (0.97% του συνόλου των περιπτώσεων). Οι στερεότυπες αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ κωδικοποιούνται από το συνδυασμό των γονιδίων IGHV4-34 και IGHJ6 (η αναγνώριση του γονιδίου IGHD δεν ήταν αξιόπιστη λόγω της αυξημένης ετερογένειας στο μέσο της περιοχής VH CDR3, πιθανότατα λόγω της εισαγωγής σωματικών μεταλλάξεων). Το κοινό μοτίβο στην περιοχή Ν1 περιλάμβανε τα αμινοξέα γλυκίνη στη θέση 107 και τυροσίνη στη 79

80 θέση 108 (ή άλλα αρωματικά αμινοξέα), ενώ η περιοχή Ν2 αποτελούνταν από δύο κατάλοιπα αργινίνης στις θέσεις και (σε 13/74 περιπτώσεις αντί της αργινίνης στη θέση εντοπίστηκε ένα κατάλοιπο λυσίνης, το οποίο είναι επίσης βασικό). Η αναζήτηση των συγκεκριμένων χαρακτηριστικών στις δημόσιες βάσεις δεδομένων ανέδειξε ότι το μοτίβο [RK]RYYYY, το οποίο αντιστοιχεί στην περιοχή συμβολής Ν2 και την αλληλουχία του γονιδίου IGHJ6 συναντάται μόνο στη ΧΛΛ, και πιο συγκεκριμένα στο #4 (Εικόνα 31). Στους Πίνακες 3Α και 3Β του Παραρτήματος παρατίθενται πρόσθετα παραδείγματα «κύριων» υποσυνόλων (major subsets), τα οποία έφεραν μοτίβα των δύο προαναφερθέντων τύπων. Εικόνα 31: Λογότυπο της αμινοξικής αλληλουχίας των στερεότυπων αναδιατάξεων του υποσυνόλου #4. Figure 31: Sequence logo of the amino acid sequence of stereotyped rearrangements belonging to subset #4. Στερεοτυπία στην περιοχή VH CDR3 παρατηρείται περίπου στο 1/3 των ασθενών με ΧΛΛ Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, η οποία περιλαμβάνει περισσότερες από 7000 αναδιατάξεις, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η συχνότητα του φαινομένου της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ δε σχετίζεται άμεσα με το μέγεθος της ομάδας εργασίας. Παρά τη σημαντική αύξηση του αριθμού των υπό ανάλυση αναδιατάξεων σε σχέση με την πιο πρόσφατη δημοσιευμένη εργασία (2662 αναδιατάξεις, 2010), η αντίστοιχη αύξηση που παρατηρήθηκε στη συχνότητα των «στερεότυπων» αναδιατάξεων ήταν οριακή (30.4% και 28%, αντίστοιχα). Με άλλα λόγια, παρότι η συχνότητα της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ έδειξε ότι αυξάνεται όταν αυξάνεται παράλληλα και το μέγεθος της ομάδας εργασίας, ο ρυθμός της αύξησης μειωνόταν συνεχώς μέχρι το μέγεθος της ομάδας εργασίας να φτάσει την κρίσιμη τιμή των 2000 αναδιατάξεων και όπου η συχνότητα της «στερεοτυπίας» ήταν περίπου 30%. Όταν το μέγεθος της ομάδας εργασίας έλαβε τιμές μεγαλύτερες από 2000 αναδιατάξεις, η συχνότητα της «στερεοτυπίας» δεν παρουσίασε σημαντικές μεταβολές και έτεινε να σταθεροποιηθεί στην τιμή 30%. 80

81 Επομένως, όταν το μέγεθος της ομάδας εργασίας είναι μεγαλύτερ0 των 2000 αναδιατάξεων η συχνότητα της «στερεοτυπίας» φαίνεται να είναι πλέον ανεξάρτητη από τον αριθμό των υπό ανάλυση αναδιατάξεων (Εικόνα 32). Εικόνα 32: Συχνότητα της στερεοτυπίας στη ΧΛΛ σε σχέση με το μέγεθος της ομάδας εργασίας. Τα δεδομένα προέρχονται από δημοσιευμένες έρευνες και την παρούσα εργασία. Figure 32: Stereotypy frequency in CLL in comparison to the size of the study group. Data represented here came from published papers and the present study. Η συχνότητα της «στερεοτυπίας» υπολογίστηκε και με τη χρήση μιας τεχνικής προσομοίωσης. Συγκεκριμένα, οι αναδιατάξεις της παρούσας εργασίας διαχωρίστηκαν με τυχαίο τρόπο σε ομάδες αλληλουχιών με αριθμό και στη συνέχεια υπολογίστηκε η συχνότητα της «στερεοτυπίας» σε καθένα από αυτά τα τυχαία υποσύνολα αλληλουχιών. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν το εύρημα ότι όταν το μέγεθος της ομάδας εργασίας είναι μεγαλύτερο από 2000 αναδιατάξεις, η συνεχής προσθήκη 1000 αναδιατάξεων (μέχρι 7000) οδηγεί σε μικρή αύξηση της συχνότητας των «στερεότυπων» αναδιατάξεων με συνεχή φθίνοντα ρυθμό. Στον Πίνακα 12 αναφέρονται οι τιμές της συχνότητας της «στερεοτυπίας» ανάλογα με το μέγεθος της ομάδας εργασίας και το ιεραρχικό επίπεδο των «στερεότυπων» υποσυνόλων, οι οποίες είναι μέσες τιμές των αποτελεσμάτων από το σύνολο των προσομοιώσεων. 81

82 Πίνακας 12: Σύχνοτητα στερεότυπων αναδιατάξεων σε τυχαίες ομάδες αλληλουχιών της παρούσας εργασίας. Οι αριθμοί με * αντιστοιχούν στα ιεραρχικά επίπεδα «στερεότυπων» υποσυνόλων. Table 12: Frequencies of stereotyped rearrangements in random batches of sequences of the present study. Numbers hightlighted by an * correspond to successive levels of stereotyped subgroups. Αριθμός αναδιατάξεων 0* (%) 1* (%) 2* (%) 3* (%) Διακριτά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά και ενδείξεις για την προέλευση της ΧΛΛ Η λεπτομερής μοριακή ανάλυση των «στερεότυπων» υποσυνόλων ανέδειξε την ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με μοναδικά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά, τα οποία προσφέρουν ενδείξεις για την ανάπτυξη της νόσου και την εμπλοκή του αντιγόνου στην εξέλιξή της. Υποσύνολο #10: περιοχών VH CDR3. σχεδόν απόλυτη ταυτότητα μεταξύ διαφορετικών Η αμινοξική σύνθεση των περιοχών VH CDR3 στο υποσύνολο #10 χαρακτηρίστηκε από σχεδόν απόλυτη ταύτιση. Το συγκεκριμένο υποσύνολο περιλάμβανε 18 «στερεότυπες», «αμετάλλακτες» αναδιατάξεις και είναι μοναδικό υπό την έννοια ότι το κοινό αμινοξικό μοτίβο που χαρακτηρίζει τους υποδοχείς του εκτείνεται σε όλο το μήκος της περιοχής VH CDR3 (22 αμινοξέα). Συγκεκριμένα, μόνο δέκα αμινοξικές διαφορές εντοπίστηκαν σε σύνολο 396 αμινοξέων της περιοχής VH CDR3 (2.5%), καθιστώντας το υποσύνολο #10 ως το πιο ομοιογενές που έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα (Εικόνα 33). 82

83 Εικόνα 33: Λογότυπο της αμινοξικής αλληλουχίας των στερεότυπων αναδιατάξεων του υποσυνόλου #10. Figure 33: Sequence logo of the amino acid sequence of stereotyped rearrangements belonging to subset #10. Υποσύνολα με διαφορετικά γονίδια IGHV της ίδιας φυλογενετικής ομάδας. Το υποσύνολο #59 περιλάμβανε 22 αμετάλλακτες αναδιατάξεις με «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3, οι οποίες χρησιμοποιούσαν τα εξής γονίδια της υποομάδας IGHV1: IGHV1-2, IGHV1-58 και IGHV1-69 (2, 8 και 12 περιπτώσεις, αντίστοιχα). Στο ίδιο πλαίσιο, το υποσύνολο #12 αποτελούνταν από 22 «στερεότυπες» αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV1-2, IGHV1-46 και IGHV5-a (11, 10 και 1 περίπτωση, αντίστοιχα), τα οποία παρότι δεν ανήκουν στην ίδια υποομάδα γονιδίων IGHV, είναι ωστόσο μέλη της φυλογενετικής ομάδας I των γονιδίων IGHV (clan I) που περιλαμβάνει τα γονίδια των υποομάδων IGHV1, IGHV5 και IGHV7, και άρα επιδεικνύουν σημαντικές ομοιότητες στην αμινοξική τους σύνθεση. Το φαινόμενο αυτό αποτελεί ένδειξη ότι συγκεκριμένα αμινοξέα των περιοχών VH CDR1 και VH CDR2 και ίσως των περιοχών VH FR, σε συνδυασμό με την περιοχή VH CDR3, μπορεί να παίζουν ρόλο στην αναγνώριση και πρόσδεση του αντιγόνου. Η λεπτομερής ανοσογενετική περιγραφή των αναδιατάξεων του #59 παρατίθεται στο Παράρτημα Πίνακας 4. Υποσύνολα με διαφορετικά γονίδια IGHV εμφανίζουν κοινά χαρακτηριστικά «στερεοτυπίας». Το γονίδιο IGHV3-48 έχει μεγάλο βαθμό ταυτότητας με το γονίδιο IGHV3-21 (αμινοξική ταυτότητα 97%). Δεκατρείς αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-48 ταξινομήθηκαν σε ένα νέο υποσύνολο (#169) με εξαιρετικά μικρή περιοχή VH CDR3 μήκους 9 αμινοξέων, ακριβώς όπως και στην περίπτωση του υποσυνόλου #2. Επιπλέον, μια ακόμη ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα ομοιότητα είναι ότι και στα δύο υποσύνολα οι αναδιατάξεις φέρουν ένα κατάλοιπο ασπαρτικού οξέος στη θέση 107 (Εικόνα 34). Το γεγονός ότι οι αναδιατάξεις των δύο υποσυνόλων δεν ταξινομήθηκαν στο ίδιο υποσύνολο οφείλεται στη μη ικανοποίηση όλων των κριτηρίων του αλγορίθμου. Ωστόσο, η ομοιότητα των γονιδίων IGHV3-48 και IGHV3-21 σε συνδυασμό με τη μικρή περιοχή VH CDR3 μήκους 9 αμινοξέων και 83

84 την παρουσία ασπαρτικού οξέος στη θέση 107 καθιστούν τα δύο συγκεκριμένα υποσύνολα «συγγενή». Εικόνα 34: Κοινά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά μεταξύ διαφορετικών στερεότυπων υποσυνόλων. Figure 34: Common immunogenetic properties between different stereotyped subsets. Σύγκλιση αλληλουχιών μέσω της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης. Η αναγνώριση κοινών αμινοξικών αντικαταστάσεων μέσω του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης μεταξύ αναδιατάξεων του ίδιου «στερεότυπου» υποσυνόλου έχει ήδη περιγραφεί σε διάφορες έρευνες 109,119. Το συγκεκριμένο φαινόμενο είναι σαφής ένδειξη ότι συγκεκριμένες θέσεις κατά μήκος του γονιδίου IGHV διαφορετικών αναδιατάξεων υφίστανται πίεση ώστε να αποκτήσουν νέες αμινοξικές ιδιότητες ή να διατηρήσουν αυτές που ήδη έχουν. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας ενισχύουν τον παραπάνω συλλογισμό, καθώς εντοπίστηκαν αναδιατάξεις που ανήκουν σε «στερεότυπα» υποσύνολα, τα οποία χαρακτηρίζονται από την έκφραση διαφορετικών αλλά συγγενικών γονιδίων IGHV κι επιδεικνύουν σύγκλιση σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας μέσω της εισαγωγής σωματικών μεταλλάξεων. Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγμα του υποσυνόλου #77, το οποίο περιλάμβανε 25 «στερεότυπες», «μεταλλαγμένες» αναδιατάξεις που χρησιμοποιούσαν είτε το γονίδιο IGHV4-4 είτε το γονίδιο IGHV4-59. Η λεπτομερής ανάλυση των αλληλουχιών αποκάλυψε ότι η ΣΥΜ έτεινε να εξαλείψει τις διαφορές σε θέσεις που οι μη αναδιαταγμένες αλληλουχίες των γονιδίων διέφεραν. Συγκεκριμένα, 4/13 αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV4-59 έφεραν αλλαγή τυροσίνης (Υ) σε ιστιδίνη (Η) στο κωδικόνιο 58 της περιοχής VH CDR2 (Y58>H), αποκτώντας την ίδια αμινοξική σύσταση με τις αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV4-4 στη συγκεκριμένη θέση. Επιπλέον, 16/24 (67%) των περιπτώσεων του υποσυνόλου #77 εμφάνισαν αντικατάσταση ισολευκίνης (Ι) σε μεθειονίνη (Μ) στο κωδικόνιο 78 της περιοχής 84

85 VH FR3 (I78>M), ανεξάρτητα από το γονίδιο IGHV, προσομοιάζοντας με αυτόν τον τρόπο στη μοναδική αναδιάταξη του αλληλομόρφου *07 του γονιδίου IGHV4-4 στη θέση αυτή (Εικόνα 35). Παράλληλα, εξετάστηκε η πιθανότητα το φαινόμενο αυτό να οφείλεται σε λανθασμένη αναγνώριση του γονιδίου IGHV. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν είναι όλες πραγματικές, καθώς οι αναδιατάξεις διατηρούσαν χαρακτηριστικά που είναι ειδικά για τα συγκεκριμένα γονίδια. Εικόνα 35: Σύγκλιση αμινοξικής αλληλουχίας στις αναδιατάξεις του στερεότυπου υποσυνόλου #77. Figure 35: Amino acid sequence convergence among rearrangements assigned to the stereotyped subset #77. «Ο ρόλος της αντιγονικής επιλογής στο λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα (ΛΜ): ανάλυση των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών 807 ασθενών» Ρεπερτόριο γονιδίων της βαριάς αλυσίδας IGH Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV Ενισχύθηκαν 807 παραγωγικές αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ από ασθενείς με ΛΜ. Η ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV έδειξε ότι στην 85

86 πλειονότητα των περιπτώσεων ανασυνδυάζονταν τα γονίδια της υποομάδας IGHV3 (416/807, 51.6%), ενώ ακολούθησαν τα γονίδια της υποομάδας IGHV4 (208/807, 25.8%) (Πίνακας 13). Πίνακας 13: Ρεπερτόριο υποομάδων γονιδίων IGHV. Table 13: IGHV gene subgroup repertoire. Υποομάδα γονιδίων IGHV Αριθμός αναδιατάξεων (Ν) Ποσοστό (%) IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV7 0 0 Σύνολο Συνολικά αναγνωρίστηκαν 38 λειτουργικά γονίδια IGHV. Ο απόλυτος αριθμός και η συχνότητα αναδιάταξης κάθε γονιδίου παρατίθενται στον Πίνακα 5 του Παραρτήματος. Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στο ΛΜ χαρακτηρίζεται από έντονη επιλεκτικότητα στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Συγκεκριμένα, οι αναδιατάξεις τεσσάρων γονιδίων: IGHV3-21 (133 αναδιατάξεις), IGHV4-34 (118 αναδιατάξεις), IGHV1-8 (63 αναδιατάξεις) και IGHV3-23 (60 αναδιατάξεις) αντιστοιχούσαν στο 46% του συνόλου των αναδιατάξεων (Εικόνα 36). Εικόνα 36: Ρεπερτόριο των επικρατέστερων γονιδίων IGHV. Figure 36: Repertoire of the predominant IGHV genes. 86

87 Η πρόσφατη δημοσίευση μιας εργασίας όπου πραγματοποιήθηκε συστηματική ανοσογενετική ανάλυση 6706 αναδιατάξεων από τέσσερις πληθυσμούς φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων [μεταβατικά (transitional), παρθένα (naïve), κύτταρα μνήμης που έχουν υποστεί εναλλαγή ισοτύπου (switched memory) και κύτταρα μνήμης IgM (IgM memory)] 168, κατέστησε δυνατή τη σύγκριση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV στο ΛΜ και στους συγκεκριμένους φυσιολογικούς πληθυσμούς. Σκοπός της σύγκρισης ήταν η αναζήτηση ενδείξεων για το στάδιο διαφοροποίησης των Β λεμφοκυττάρων στο οποίο συμβαίνει η λευχαιμική εξαλλαγή στο ΛΜ. Από τη σχετική ανάλυση διαπιστώθηκε ότι τα ρεπερτόρια των γονιδίων IGHV διέφεραν αρκετά μεταξύ ΛΜ και φυσιολογικών πληθυσμών. Όταν η ανάλυση επικεντρώθηκε στις αναδιατάξεις των επικρατέστερων γονιδίων στο ΛΜ, οι διαφορές έγιναν πιο εμφανείς. Συγκεκριμένα, τρία από τα τέσσερα συχνότερα γονίδια στο ΛΜ (IGHV3-21, IGHV4-34 και IGHV1-8) υπερεκφράζονταν στο ΛΜ σε σχέση με το σύνολο των αναδιατάξεων των φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων αλλά και πιο συγκεκριμένα με τον πληθυσμό των ανώριμων (naive) Β λεμφοκυττάρων (p<0.01). Αντίθετα, το γονίδιο IGHV3-23 εκφραζόταν σε υψηλή συχνότητα σε όλες τις οντότητες χωρίς σημαντικές αποκλίσεις (p<0.01) (Πίνακας 14). Πίνακας 14: Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV στο ΛΜ και σε φυσιολογικούς πληθυσμούς Β λεμφοκυττάρων. Table 14: IGHV gene repertoire in MCL vs. normal B cell populations. Οντότητα Γονίδιο IGHV ΛΜ Φυσιολογικοί πληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων Μεταβατικά Παρθένα Μνήμης με εναλλαγή ισοτύπου Μνήμης IgM IGHV IGHV IGHV IGHV Τα αποτελέσματα της λεπτομερούς σύγκρισης του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV στο ΛΜ και του αντίστοιχου ρεπερτορίου στο φυσιολογικό πληθυσμό παρθένων Β λεμφοκυττάρων παρατίθενται στην Εικόνα 1 του Παραρτήματος. 87

88 D1-1 D1-14 D1-20 D1-26 D1-7 D2-15 D2-2 D2-21 D2-8 D3-10 D3-16 D3-22 D3-3 D3-9 D4-17 D4-23 D4-4 D5-12 D5-24 D5-5 D6-13 D6-19 D6-25 D6-6 D7-27 Ρεπερτόριο γονιδίων IGHD Γονίδια IGHD αναγνωρίστηκαν σε 803/807 αναδιατάξεις. Η ανάλυση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHD ανέδειξε ως συχνότερα τα γονίδια της υποομάδας IGHD3 (275 αναδιατάξεις, 43.1%), ενώ ακολούθησαν τα γονίδια της υποομάδας IGHD6 (163 αναδιατάξεις, 20.2%). Επιλεκτικότητα παρατηρήθηκε και σε επίπεδο μεμονωμένων γονιδίων IGHD. Συγκεκριμένα, συχνότερα ήταν τα γονίδια IGHD3-3 (81/807 αναδιατάξεις, 10.1%), IGHD3-10 (74/807 αναδιατάξεις, 9.2%), IGHD6-19 (62/807 αναδιατάξεις, 7.9%) και IGHD2-2 (61/807 αναδιατάξεις, 7.6%), τα οποία αντιπροσώπευαν περίπου το 1/3 του συνόλου των αναδιατάξεων (Εικόνα 37) Εικόνα 37: Ρεπερτόριο γονιδίων IGHD. Figure 37: IGHD gene repertoire. Ρεπερτόριο γονιδίων IGHJ Αναφορικά με το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHJ, συχνότερα γονίδια ήταν τα IGHJ4 (353/807 αναδιατάξεις, 43.7%) και IGHJ6 (239/807 αναδιατάξεις, 29.6%) (Εικόνα 38). 88

89 IGHJ6, 30% IGHJ2, 3% IGHJ1, 1% IGHJ3, 7% IGHJ5, 15% IGHJ4, 44% Εικόνα 38: Ρεπερτόριο γονιδίων IGHJ. Figure 38: IGHJ gene repertoire. Επιλεκτικότητα στο επίπεδο συνδυασμού γονιδίων IGHV, IGHD και IGHJ Η ανάλυση του μηχανισμού V(D)J ανέδειξε μια τάση στο συνδυασμό συγκεκριμένων γονιδίων IGHV, IGHD και IGHJ. Συγκεκριμένα, οι αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-21 χρησιμοποιούσαν συχνά το γονίδιο IGHD3-3 (38/133 αναδιατάξεις, 28.6%). Η τάση για ανασυνδυασμό με συγκεκριμένα γονίδια IGHD ήταν λιγότερο έντονη για τις αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV1-8 και IGHV4-34. Το γονίδιο IGHD3-10 εντοπίστηκε στο 19% των αναδιατάξεων του γονιδίου IGHV1-8, ενώ τα γονίδια IGHD2-2 και IGHD2-15 στο 14.4% και 13.6% των αναδιατάξεων του γονιδίου IGHV4-34, αντίστοιχα. Αντίθετα, η ανάλυση των αναδιατάξεων του γονιδίου IGHV3-23 δεν έδειξε κάποια προτίμηση για αναδιάταξη με συγκεκριμένα γονίδια IGHD (Εικόνα 39). 89

90 Εικόνα 39: Κυκλική αναπαράσταση των συχνοτήτων ανασυνδυασμού μεταξύ των τεσσάρων συχνότερων γονιδίων IGHV με τα δέκα συχνότερα IGHD. Η εικόνα σχεδιάστηκε με το λογισμικό Circos. Figure 39: Circular layout of the recombination frequencies between thefour predominant IGHV gens and the the most frequent IGHD genes. The image was created using the Circos software. Επιλεκτικότητα παρατηρήθηκε και στο συνδυασμό γονιδίων IGHV με γονίδια IGHJ. Ογδόντα έξι αναδιατάξεις του IGHV3-21 (64.7%) χρησιμοποιούσαν το γονίδιο IGHJ6, σε πλήρη αντίθεση με τις αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-23, όπου το αντίστοιχο ποσοστό ήταν μόνο 6.7% (p<0.001). Το αντίστροφο παρατηρήθηκε για το γονίδιο IGHJ4. Οι περισσότερες αναδιατάξεις που χρησιμοποιούσαν το γονίδιο IGHV3-23 χρησιμοποιούσαν ταυτόχρονα το γονίδιο IGHJ4 (75%), ενώ η αντίστοιχη συχνότητα για τις αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-21 ήταν μόνο 16.5%. Οι αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV4-34 χρησιμοποιούσαν τα γονίδια IGHJ4, IGHJ5 και IGHJ6 με παρόμοια συχνότητα (~30%). Η λεπτομερής περιγραφή της επιλεκτικότητας ως την έκφραση συγκεκριμένων συνδυασμών γονιδίων IGHV και IGHJ αναφέρεται στον Πίνακα

91 Πίνακας 15: Συχνότητα ανασυνδυασμού των τεσσάρων επικρατέστερων γονιδίων IGHV με τα γονίδια IGHJ. Table 15: Recombination frequencies of the four predominant IGHV genes with the IGHJ genes. IGHV1-8 IGHV3-21 IGHV3-23 IGHV4-34 Άλλα γονίδια IGHV Σύνολο Γονίδιο N % N % N % N % N % N % IGHJ IGHJ IGHJ IGHJ IGHJ IGHJ IGHJ Σύνολο Ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης Ανάλυση των σωματικών μεταλλάξεων των αναδιατάξεων Αρχικά, ως κριτήριο για την κατάταξη των αναδιατάξεων σε υποσύνολα με βάση το φορτίο των σωματικών μεταλλάξεων χρησιμοποιήθηκε το ποσοστό ταυτότητας 98% με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο, όπως και σε όλες τις προηγούμενες ανοσογενετικές αναλύσεις στο ΛΜ. Σύμφωνα με το συγκεκριμένο κριτήριο, 186/807 αναδιατάξεις (23%) ορίστηκαν ως «μεταλλαγμένες», ενώ οι υπόλοιπες αναδιατάξεις (621/807, 77%) είχαν ποσοστό ταυτότητας >98% και επομένως χαρακτηρίστηκαν ως «αμετάλλακτες». Όμως, όπως προαναφέρθηκε και στην ενότητα της Εισαγωγής, η βιολογική σημασία και αξία της εφαρμογής του κριτηρίου αυτού, εκτός της ΧΛΛ, παραμένει αδιευκρίνιστη 134,138,148,149. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας υιοθετήθηκε μια διαφορετική προσέγγιση, σύμφωνα με την οποία οι αναδιατάξεις που δεν έφεραν σωματικές μεταλλάξεις διακρίθηκαν από εκείνες που έφεραν έστω και μια μετάλλαξη. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, 238/807 αναδιατάξεις (29.5%) επέδειξαν ποσοστό ταυτότητας 100% και ορίστηκαν ως «πραγματικά αμετάλλακτες», ενώ οι υπόλοιπες (569/807, 70.5%) έφεραν ποικίλο αριθμό μεταλλάξεων και ορίστηκαν ως «μεταλλαγμένες». Οι «μεταλλαγμένες» αναδιατάξεις διακρίθηκαν περαιτέρω σε διαδοχικά υποσύνολα που διέφεραν μεταξύ τους κατά 1% ως προς την ταυτότητά τους με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV (Παράρτημα Πίνακας 6). Για στατιστικούς λόγους, οι αναδιατάξεις με ταυτότητα % 91

92 χαρακτηρίστηκαν ως «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένες» (459/807, 56.7%), ενώ εκείνες με ποσοστό ταυτότητας <97% ως «αρκετά/πολύ μεταλλαγμένες» (113, 14%)(Εικόνα 40). 14 % 29.3% 56.7 % «πραγματικά αμετάλλακτες» «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένες» «αρκετά/πολύ μεταλλαγμένες» Εικόνα 40: Υποσύνολα αναδιατάξεων με βάση το μεταλλακτικό φορτίο. Figure 40: Rearrangement subgroups based on IGHV gene mutational status. Η ταξινόμηση πραγματοποιήθηκε με σκοπό την ανάδειξη υποσυνόλων αναδιατάξεων, οι οποίες λόγω του κοινού βαθμού ΣΥΜ είναι πιθανό να εμφανίζουν επιπλέον κοινά ανοσογενετικά χαρακτηριστικά. Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV διέφερε σημαντικά μεταξύ των τριών υποσυνόλων (Παράρτημα Εικόνα 2). Κάθε υποσύνολο χαρακτηριζόταν από υπεραντιπροσώπευση συγκεκριμένων γονιδίων. Έτσι, το γονίδιο IGHV3-21 αντιπροσώπευε το 4.4% των αναδιατάξεων με ταυτότητα <97%, ενώ ήταν πολύ συχνότερο στο υποσύνολο των «πραγματικά αμετάλλακτων» αναδιατάξεων (22.7%). Σε πλήρη αντίθεση, το γονίδιο IGHV3-23 ήταν το επικρατέστερο γονίδιο στις «αρκετά/πολύ μεταλλαγμένες»αναδιατάξεις (20.2%), αλλά εκφραζόταν μόνο στο 4.2% του υποσυνόλου των αναδιατάξεων που δεν έφεραν σωματικές μεταλλάξεις (p<0.01) (Πίνακας 16). 92

93 Πίνακας 16: Ρεπερτόριο των επικρατέστερων γονιδίων IGHV σε υποσύνολα με διαφορετικό μεταλλακτικό φορτίο. GI: germline identity (ταυτότητα με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο). Table 16: Repertoire of the predominant IGHV genes among subgroups of sequences with different mutational status. Γονίδιο IGHV Ποσοστό ταυτότητας 100 (%) 97=<GI<100 (%) <97 (%) IGHV IGHV IGHV IGHV Σημαντικές διαφορές εντοπίστηκαν και ως προς την προδιάθεση των αναδιατάξεων συγκεκριμένων γονιδίων IGHV να αποκτούν σωματικές μεταλλάξεις όταν εκφράζονται σε κλωνικούς κυτταρικούς υποδοχείς στο ΛΜ (Παράρτημα Εικόνα 3). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-23, οι οποίες σε ποσοστό 36.7% κατατάχθηκαν στο υποσύνολο των «αρκετά/πολύ μεταλλαγμένων» αναδιατάξεων. Αντίθετα, οι αναδιατάξεις που χρησιμοποιούσαν τα γονίδια IGHV1-8, IGHV3-21 και IGHV4-34 σπάνια έφεραν μεγάλο αριθμό σωματικών μεταλλάξεων (εύρος 3-6.4%) (Εικόνα 41) IGHV1-8 IGHV3-21 IGHV3-23 IGHV4-34 <97 97=<x< Εικόνα 41: Κατανομή των αναδιατάξεων των επικρατέστερων γονιδίων IGHV στα υποσύνολα με διαφορετικό μεταλλακτικό φορτίο (%). Figure 41: Distribution of rearrangements of the predominant IGHV genes among subgroups of sequences with different IGHV gene mutational status (%). 93

94 Ανάλυση των χαρακτηριστικών και της τοπολογίας των σωματικών μεταλλάξεων Η ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών και της κατανομής των σωματικών μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε στο σύνολο των 569 αναδιατάξεων της ομάδας εργασίας που έφεραν μεταλλάξεις κατά μήκος της αλληλουχίας του γονιδίου IGHV. Συνολικά, οι σημειακές μεταλλάξεις (2662) επικρατούσαν έναντι των νουκλεοτιδικών ενθέσεων/ελλείψεων, καθώς μόλις πέντε αναδιατάξεις έφεραν τέτοιου είδους γενετικές βλάβες. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα νουκλεοτίδια που αφαιρέθηκαν/προστέθηκαν ήταν πολλαπλάσια του 3, οπότε δεν επηρεάστηκε το πλαίσιο ανάγνωσης. Η εισαγωγή των μεταλλάξεων φαίνεται ότι πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του κλασσικού μηχανισμού ΣΥΜ 169, καθώς τα γενικά χαρακτηριστικά που παρατηρήθηκαν συμφωνούν με τις βασικές αρχές του μηχανισμού. Συγκεκριμένα, οι μεταβάσεις (transitions, 1545 σημειακές μεταλλάξεις 58.9%) επικρατούσαν έναντι των μεταπτώσεων (transversions, σημειακές μεταλλάξεις 41.1%). Με δεδομένη την επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου σε επίπεδο γονιδίων IGHV, η ανάλυση επικεντρώθηκε στα υποσύνολα αναδιατάξεων που χρησιμοποιούσαν τα τέσσερα συχνότερα γονίδια. Η ανάλυση ανέδειξε σημαντικές διαφορές στη στόχευση του μηχανισμού ΣΥΜ. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η έντονη τάση στόχευσης νουκλεοτιδίων αδενίνης (Α) στις αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-21 έναντι των αναδιατάξεων που χρησιμοποιούσαν τα υπόλοιπα γονίδια της υποομάδας IGHV3 (p<0.05). Υπολογίστηκαν επίσης οι συχνότητες των μεταλλάξεων αντικατάστασης έναντι των σιωπηρών μεταλλάξεων. Στην περίπτωση αυτή, όπως και στη συνολική ανάλυση, υπολογίστηκαν οι «κανονικοποιημένες» συχνότητες εισαγωγής μεταλλάξεων (ενότητα Μεθοδολογίας). Τα αποτελέσματα, σε συμφωνία με τις αρχές του κλασσικού μηχανισμού σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης, έδειξαν ότι οι περισσότερες νουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις συνέβηκαν στις περιοχές VH CDR, όπου οι μεταλλάξεις κυρίως οδηγούσαν σε αμινοξική αντικατάσταση, με αποτέλεσμα οι λόγοι R/S να είναι υψηλοί (R/S > 3,0) σε αντίθεση με τους χαμηλούςλόγους (<3,0) στις περιοχές VH FR. Η κατανομή των μεταλλάξεων που οδηγούν σε αμινοξική αντικατάσταση καθώς και των σιωπηρών μεταλλάξεων ανά περιοχή για το σύνολο των αναδιατάξεων αλλά και για κάθε υποομάδα γονιδίων IGHV δίνεται στον Πίνακα

95 VH FR VH CDR Πίνακας 17: Κατανομή των μεταλλάξεων R και S στο σύνολο των αναδιατάξεων καθώς και στα υποσύνολα υποομάδων γονιδίων IGHV. Table 17: Distribution of R and S mutations at cohort level as well as at IGHV gene subgroup level. Περιοχή Σύνολο IGHV1 IGHV2 IGHV3 IGHV4 IGHV5 IGHV6 FR1R FR1S Σύνολο FR FR2R FR2S Σύνολο FR FR3R FR3S Σύνολο FR FRR χωρίς FR1R FRS χωρίς FR1S Σύνολο FR χωρίς FR1 CDR1R CDR1S Σύνολο CDR CDR2 R CDR2 S Σύνολο CDR CDR R CDRS Σύνολο CDR Σύνολο Οι διαφορές του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV μεταξύ υποσυνόλων αναδιατάξεων με διαφορετικό μεταλλακτικό φορτίο κατέστησαν αναγκαία την ανάλυση της στόχευσης της ΣΥΜ σε κάθε υποσύνολο ξεχωριστά, με επίκεντρο τις αναδιατάξεις που χρησιμοποιούσαν τα επικρατέστερα γονίδια IGHV. Η προσέγγιση αυτή ανέδειξε σημαντικές διαφορές, ιδιαίτερα στο υποσύνολο των «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένων» αναδιατάξεων: οι αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-21 έφεραν μεγάλο αριθμό μεταλλάξεων R στις περιοχές VH CDR1 και VH CDR2, ενώ οι αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-23 εμφάνισαν παρόμοια κατανομή των μεταλλάξεων R και S κατά μήκος των περιοχών VH FR και VH CDR. Αναζήτηση προτύπων σωματικών μεταλλάξεων Η ανάλυση επεκτάθηκε και στην αναζήτηση προτύπων στην εισαγωγή μεταλλάξεων κατά μήκος του γονιδίου IGHV. Γενικά, παρατηρήθηκε στόχευση σε κατάλοιπα σερίνης, τα οπoία βρίσκονται συχνά σε «επίκεντρα» (hotspots) 95

96 μεταλλαξιγένεσης. Παράλληλα, αναζητήθηκε η ύπαρξη «επαναλαμβανόμενων» μεταλλάξεων ( recurrent mutations) σε συγκεκριμένες θέσεις και η τάση για εισαγωγή αμινοξικών καταλοίπων με συγκεκριμένες ιδιότητες. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά κάθε νουκλεοτιδικής αλλαγής και οι αλλαγές στις φυσικοχημικές ιδιότητες μεταξύ των αμινοξέων που κωδικοποιούνται από τη μη αναδιαταγμένη νουκλεοτιδική αλληλουχία, καθώς και των αμινοξέων που προκύπτουν μέσω της εισαγωγής σωματικών μεταλλάξεων. Η ανάλυση επικεντρώθηκε στα υποσύνολα των αναδιατάξεων που χρησιμοποιούσαν τα επικρατέστερα γονίδια IGHV. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, «επαναλαμβανόμενες» μεταλλάξεις εντοπίστηκαν κυρίως στις αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV3-21 και IGHV3-23. Πιο συγκεκριμένα, στο υποσύνολο των αναδιατάξεων του γονιδίου IGHV3-21 η αντικατάσταση σερίνης (Serine, S) προς ασπαραγίνη (Asparagine, Ν) στο κωδικόνιο 38 της περιοχής VH CDR1 εντοπίστηκε σε 15/78 περιπτώσεις (19.2%). Στις αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-23 αναγνωρίστηκαν τρεις θέσεις που ήταν συχνοί στόχοι του μηχανισμού ΣΥΜ: (i) το κωδικόνιο 36 της περιοχής VH CDR1 όπου η αντικατάσταση σερίνης προς ασπαραγίνη (S προς N) εντοπίστηκε σε 12/48 περιπτώσεις (25%), (ii) το κωδικόνιο 55 της περιοχής VH FR2 όπου η σιωπηρή νουκλεοτιδική αλλαγή αδενίνης (Α) προς γουανίνη (G) συνέβη σε 11/48 περιπτώσεις (22.9%) και (iii) τέλος, το κωδικόνιο 101 στην περιοχή VH FR3 όπου η αλλαγή βαλίνης (Valine, V) προς ισολευκίνη (Isoleucine, Ι) παρατηρήθηκε σε 12/48 περιπτώσεις (25%)(Εικόνα 42). 96

97 Εικόνα 42: Αναπαράσταση της μεταβλητής περιοχής των αναδιατάξεων των γονιδίων IGHV3-21 και IGHV3-23. Στην πάνω πλευρά απεικονίζονται οι αμινοξικές αντικαταστάσεις, με το ύψος κάθε χαρακτήρα να είναι ανάλογο της συχνότητας του συγκεκριμένου αμινοξέος. Στην κάτω πλευρά αντικατοπτρίζονται τα αμινοξέα που κωδικοποιούνται από το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV στις συγκεκριμένες θέσεις. Τα κενά αντιπροσωπεύουν τις θέσεις όπου δε συνέβησαν αμινοξικές αντικαταστάσεις. Figure 42: Amino acid sequence logos of IGHV3-21 and IGHV3-23 rearrangements with less than 100% germline identity. The letters above the line represent the amino acid changes, whereas the letters shown upside-down below the line represent the corresponding germ line amino acids of the IGHV gene. The size of the amino acid symbol represents the relative frequency of that amino acid at that position relative to all other mutations at that position in the certain IGHV group of sequences. Blank spaces represent amino acids that are unchanged in comparison to the germ line sequence Λεπτομερής κατάλογος των «επαναλαμβανόμενων» μεταλλάξεων στις αναδιατάξεις των τεσσάρων επικρατέστερων γονιδίων δίνεται στον Πίνακα 7 του Παραρτήματος. Χαρακτηριστικά της περιοχής VH CDR3 Η διάμεση τιμή του μήκους της περιοχής VH CDR3 ήταν 16 αμινοξέα με εύρος τιμών 5-35 αμινοξέα, ενώ η κατανομή των αναδιατάξεων ανάλογα με το μήκος της περιοχής VH CDR3 παρατίθεται στην Εικόνα

98 25 % Αριθμός αμινοξέων Εικόνα 43: Κατανομή των αναδιατάξεων ανάλογα με το μήκος της περιοχής VH CDR3. Figure 43: Distribution of rearrangements according to VH CDR3 amino acid length. Η ανάλυση του συνόλου των αναδιατάξεων και ιδιαίτερα εκείνων που χρησιμοποιούσαν τα επικρατέστερα γονίδια IGHV ανέδειξε διαφορές τόσο ως προς την κατανομή των αναδιατάξεων, όσο και ως προς το διάμεσο μήκος της περιοχής VH CDR3. Συγκεκριμένα, οι αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV3-21 και IGHV4-34 είχαν σημαντικά μεγαλύτερο διάμεσο μήκος VH CDR3 (20 και 18 αμινοξέα, αντίστοιχα) έναντι των αναδιατάξεων των γονιδίων IGHV3-23 και IGHV1-8 (15 και 14 αμινοξέα, αντιστοίχως). Η διαφορά μεταξύ των συγκεκριμένων υποσυνόλων αναδιατάξεων ήταν στατιστικά σημαντική (p<0.01) (Εικόνα 44). 98

99 IGHV IGHV IGHV IGHV4-34 Εικόνα 44: Κατανομή των αναδιατάξεων των επικρατέστερων γονιδίων IGHV ανάλογα με το μήκος της περιοχής VH CDR3. Figure 44: Distribution of rearrangements utilizing the predominant IGHV genes according to VH CDR3 amino acid length. «Στερεοτυπία» της περιοχής VH CDR3 Οι αλληλουχίες των περιοχών VH CDR3 της ομάδας εργασίας εξετάστηκαν για την ύπαρξη κοινών αμινοξικών μοτίβων και όσες πληρούσαν τα καθιερωμένα κριτήρια κατατάχθηκαν σε «στερεότυπα» υποσύνολα. Η λογική ταξινόμησης και τα κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφονται στη ενότητα της Μεθοδολογίας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, 84/807 αναδιατάξεις (10.8%) συγκρότησαν 38 «στερεότυπα» υποσύνολα σε αρχικό επίπεδο, τα οποία αποτελούνταν από 2-7 περιπτώσεις. Τα συγκεκριμένα υποσύνολα χρακτηρίζονταν από υψηλή αμινοξική ταυτότητα λόγω της έκφρασης των ίδιων γονιδίων IGHD και IGHJ, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις τα κοινά μοτίβα εκτείνονταν και στις συμβολές μεταξύ των γονιδίων IGH (Πίνακες 18Α και 18Β). 99

100 Πίνακες 18Α και 18Β: Στερεότυπα υποσύνολα αρχικού επιπέδου των αναδιατάξεων που χρησιμοποιούσαν τα γονίδια IGHV3-21 (Α) και IGHV4-34 (Β). Tables 18A and 18B: Level 0 stereotyped subsets of rearrangements utilizing either the IGHV3-21 (A), or the IGHV4-34 gene (B). Α. V3-21/D6-6/J6 V D6-6 J6 Μη αναδιαταγμένο V3-21 AR EYSSSS YYYYYGMDV MC MC T WD... G... MCL-DK A... MCL-SE N... V3-21/D3-9/J4 V N1 D3-9 N2 J4 Μη αναδιαταγμένο V3-21 AR YYDILTGYYN YFDY DDT... Y R... PD... FRA-MCL054.. EGQ... T.... FRA-MCL111...SS H... NS.... FRA-MCL139...SR... S.... Β. V4-34/D2-2/J6 V N1 D2-2 N2 J6 Μη αναδιαταγμένο V4-34 AR DIVVVPAAI YYYYYYMDV G... AVF LSGF L... G...L.. MCL-DK DS... KVI... MCL-SE A... MCL-SE E... S... MCL-SE T...V.. NS... V4-34/D1-26/J6 V D1-26 N2 J6 Μη αναδιαταγμένο V4-34 AR GIVGAT YYYYYYMDV S... TA D D... MCL-DK E.A.. QS... MCL-DK E....A..F

101 Ιδιαίτερο ενδιαφέρον είχε το εύρημα ότι οι περιπτώσεις του μεγαλύτερου «στερεότυπου» υποσυνόλου σε βασικό επίπεδο (V4-34/D2-2/J6) χαρακτηρίζονταν από την ταυτόχρονη έκφραση συγκεκριμένων ελαφριών αλυσίδων που κωδικοποιούνταν από τους «στερεότυπους» συνδυασμούς γονιδίων IGLV3-19/IGLJ2. Η παρουσία κοινών περιπτώσεων σε διαφορετικά υποσύνολα οδήγησε στο σχηματισμό «στερεότυπων» υποσυνόλων σε ιεραρχικά ανώτερα επίπεδα. Το μοναδικό υποσύνολο στο επίπεδο 2 αποτελούνταν από επτά αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV4-34 (Πίνακας 19). Πίνακας 19: Ταξινόμηση των αναδιατάξεων σε υποσύνολα με στερεότυπες περιοχές VH CDR3. Table 19: Assignment of rearrangements to subsets with stereotyped VH CDR3 regions. Υποσύνολα Αναδιατάξεις Αριθμός % Επίπεδο Επίπεδο Επίπεδο Η σύγκριση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV μεταξύ των υποσυνόλων που χαρακτηρίζονταν από «στερεότυπες» και «ετερογενείς» («μη στερεότυπες») περιοχές VH CDR3 οδήγησε στην αναγνώριση σημαντικών διαφορών. Τα πιο χαρακτηριστικά παραδείγματα αφορούσαν τις αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV3-21 και IGHV4-34, οι οποίες αντιπροσώπευαν το 67% των «στερεότυπων» αναδιατάξεων έναντι μόλις 27% των «ετερογενών» (p<0.01). Αντίθετα, οι αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV1-8 ήταν συχνότερες στο «ετερογενές» υποσύνολο σε σχέση με το «στερεότυπο» (8.5% και 2.4%, αντίστοιχα) (Εικόνα 45). Το συνολικό ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στα υποσύνολα με «στερεότυπους» και «ετερογενείς» υποδοχείς δίνεται στην Εικόνα 4 του Παραρτήματος. 101

102 "Στερεότυπες" αναδιατάξεις άλλα γονίδια V, 24% V1-8, 2% V4-34, 29% V3-23, 7% V3-21, 38% "Ετερογενείς" αναδιατάξεις άλλα γονίδια V, 57% V1-8,8% V4-34, 13% V3-23, 8% V3-21, 14% Εικόνα 45: Ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στα υποσύνολα με «στερεότυπους» και «ετερογενείς» υποδοχείς. Figure 45: IGHV gene repertoire in the stereotyped subgroup vs. the heterogeneous subgroup. Συγκριτική ανάλυση μεταξύ χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας, λεμφώματος από το κύτταρο του μανδύα και σπληνικού λεμφώματος της οριακής ζώνης Ρεπερτόριο γονιδίων IGHV Οι αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας σε συνδυασμό με την πρόσφατη δημοσίευση της ομάδας μας σε ασθενείς με σπληνικό λέμφωμα της οριακής ζώνης (ΣΛΟΖ) 153 κατέστησαν εφικτή τη σύγκριση των βασικών ανοσογενετικών χαρακτηριστικών των συγκεκριμένων νεοπλασιών. Tα ρεπερτόρια των γονιδίων IGHV διέφεραν αρκετά μεταξύ των τριών νεοπλασιών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το γονίδιο IGHV1-102

103 69, το οποίο ήταν το πιο συχνό στη ΧΛΛ (12.8%), ήταν εξαιρετικά σπάνιο στις άλλες δύο νεοπλασίες (1.5% στο ΛΜ και 2.9% στο ΣΛΟΖ). Επιπλέον, τα γονίδια IGHV3-21 και IGHV1-8 υπερεκφράζονταν στο ΛΜ σε σχέση με τις άλλες νεοπλασίες των Β λεμφοκυττάρων, ενώ το ΣΛΟΖ χαρακτηριζόταν από την υπερέκφραση του γονιδίου IGHV1-2 και πιο συγκεκριμένα του αλληλομόρφου IGHV1-2*04 που ήταν εξαιρετικά σπάνιο στις άλλες δύο νεοπλασίες. Αντίθετα, τα γονίδια IGHV3-23 και IGHV4-34 εκφράζονταν σε υψηλά ποσοστά σε όλες τις οντότητες χωρίς σημαντικές αποκλίσεις. Όλες οι συγκεκριμένες διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές (p<0.01) (Παράρτημα Εικόνα 5). Μηχανισμός ΣΥΜ Η ανάλυση των σωματικών μεταλλάξεων στις τρεις νεοπλασίες ανέδειξε διαφορές που σχετίζονται με τη «συμπεριφορά» του μηχανισμού ΣΥΜ σε κάθε οντότητα. Συγκεκριμένα, για το διαχωρισμό των ασθενών σε υποσύνολα με βάση το μεταλλακτικό φορτίο των αναδιατάξεων χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά αριθμητικά κριτήρια ταυτότητας με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένιο γονίδιο IGHV: 98% και 97%, ενώ οι αναδιατάξεις που δεν έφεραν σωματικές μεταλλάξεις διαχωρίστηκαν από εκείνες που είχαν έστω και μια σωματική μετάλλαξη. Η επιλογή του αριθμητικού κριτηρίου διαχωρισμού δεν επηρέασε τη σύγκριση. Η πλειονότητα των αναδιατάξεων στη ΧΛΛ και το ΣΛΟΖ ήταν «μεταλλαγμένες», ενώ στο ΛΜ το υποσύνολο με το μεγαλύτερο αριθμό περιπτώσεων ήταν αυτό με τις «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένες» αναδιατάξεις. Επιπλέον, το υποσύνολο των «πραγματικά αμετάλλακτων» αναδιατάξεων παρουσίασε παρόμοια συχνότητα στη ΧΛΛ και το ΛΜ (~30%) αλλά αντιπροσώπευε πολύ μικρότερο ποσοστό αναδιατάξεων στο ΣΛΟΖ (13.3%). Τέλος, τα ρεπερτόρια των γονιδίων IGHV κάθε υποσυνόλου με βάση το μεταλλακτικό φορτίο των αναδιατάξεων διέφερε μεταξύ των τριών οντοτήτων, ενισχύοντας τις προηγούμενες παρατηρήσεις. Όλες οι συγκεκριμένες διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές (p<0.01). «Στερεοτυπία» της περιοχής VH CDR3 Μέχρι πολύ πρόσφατα, η στερεοτυπία της περιοχής VH CDR3 θεωρούνταν ως χαρακτηριστική μόνο για τους κλωνικούς κυτταρικούς υποδοχείς στη ΧΛΛ. Σύμφωνα όμως με πρόσφατες εργασίες της ομάδας μας, συμπεριλαμβανομένης και της παρούσας εργασίας, με τις τελευταίες ανοσογενετικές αναλύσεις στο ΛΜ και το ΣΛΟΖ, η «στερεοτυπία» της περιοχής VH CDR3 δεν αποτελεί αποκλειστικό χαρακτηριστικό της ΧΛΛ, καθώς «στερεότυποι» Β κυτταρικοί υποδοχείς βρέθηκαν επίσης στο ΛΜ και το ΣΛΟΖ. Αυτό το εύρημα παρακίνησε τη σύγκριση 103

104 των τριών οντοτήτων με σκοπό να διερευνηθεί αν τα χαρακτηριστικά της «στερεοτυπίας» ήταν κοινά ή ειδικά για κάθε νόσημα. Η πρώτη σημαντική διαφορά μεταξύ της ΧΛΛ και των άλλων δύο νεοπλασιών ήταν η συχνότητα της «στερεοτυπίας», η οποία είναι σημαντικά μεγαλύτερη στη ΧΛΛ (30.4%) έναντι του ΛΜ (10.4%) και του ΣΛΟΖ ( 7.2%). Η ποιοτική σύγκριση των «στερεότυπων» υποσυνόλων μεταξύ των τριών νεοπλασιών περιορίστηκε στη συγκριτική ανάλυση συγκεκριμένων μόνο υποσυνόλων, ώστε τα αποτελέσματα να είναι αξιόπιστα. Το κριτήριο που χρησιμοποιήθηκε ήταν η χρήση του ίδιου γονιδίου IGHV. Το 67% των «στερεότυπων» αναδιατάξεων στο ΛΜ χρησιμοποιούσαν τα γονίδια IGHV4-34 και IGHV3-21, ενώ στο ΣΛΟΖ το γονίδιο IGHV1-2 αντιστοιχούσε στις μισές περίπου «στερεότυπες» αναδιατάξεις (12/25, 48%). Γι αυτό το λόγο, τα «στερεότυπα» υποσύνολα του ΛΜ συγκρίθηκαν με τα υποσύνολα #4, #16 (γονίδιο IGHV4-34) και #2 (γονίδιο IGHV3-21). Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε μια σειρά επίπεδα: χρήση γονιδίων IGHD και IGHJ, μήκος και αμινοξική σύνθεση της περιοχής VH CDR3 (Εικόνα 46). Εικόνα 46: Σύγκριση «στερεότυπων» υποσυνόλων των γονιδίων IGHV3-21 και IGHV4-34 στη ΧΛΛ και το ΛΜ. Figure 46: Comparison between stereotyped subsets of the IGHV3-21 and the IGHV4-34 gene in CLL VS. MCL. Οι διαφορές ήταν ακόμα πιο έντονες όταν συγκρίθηκαν τα «στερεότυπα» υποσύνολα του γονιδίου IGHV1-2 μεταξύ ΧΛΛ και ΣΛΟΖ. Επομένως, οι «στερεότυποι» υποδοχείς που αναγνωρίστηκαν στη ΧΛΛ ήταν εντελώς 104

105 διαφορετικοί από τους αντίστοιχους στο ΛΜ και το ΣΛΟΖ, παρά τη χρήση του ίδιου γονιδίου IGHV (Πίνακες 8Α και 8Β και του Παραρτήματος). 105

106 Συζήτηση «Ανάλυση της στερεοτυπίας της περιοχής VH CDR3 σε 7596 αναδιατάξεις ασθενών με ΧΛΛ: μοριακή κατάταξη των ασθενών με ενδείξεις για την αντιμετώπιση της νόσου Εισαγωγή Η ΧΛΛ είναι νεοπλασία των Β λεμφοκυττάρων και θεωρείται πλέον ως υποδειγματική για το ρόλο του μικροπεριβάλλοντος στην επιλογή και διέγερση Β λεμφοκυττάρων μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα (BCR), με τελικό αποτέλεσμα την κλωνική επαύξηση, εκδήλωση κι εξέλιξη της νόσου. Οι αρχικές ενδείξεις προέκυψαν από τη μοριακή ανάλυση του BCR και, πιο συγκεκριμένα, της ανοσογενετικής «ταυτότητάς» του: (i) το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στις κλωνοτυπικές αναδιατάξεις των ασθενών με ΧΛΛ χαρακτηρίζεται από επιλεκτικότητα ως προς την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων 81, , (ii) οι ασθενείς διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, με ή χωρίς σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια IGHV, οι οποίες συσχετίζονται με διαφορετική πρόγνωση 89,147, (iii) η ανάλυση της περιοχής VH CDR3 ανέδειξε την ύπαρξη παρόμοιων ή ακόμα και ταυτόσημων υποδοχέων («στερότυποι» BCR) ,114, Η αναγνώριση ομόλογων, «στερεότυπων» BCR σε διαφορετικούς ασθενείς με ΧΛΛ, οι οποίοι έφεραν είτε «μεταλλαγμένα» είτε «αμετάλλακτα» γονίδια IGHV ήταν το πιο πρόσφατο τεκμήριο υπέρ της θεωρίας ότι τα προγονικά κύτταρα της ΧΛΛ δέχονται αντιγονικά ερεθίσματα πριν από τη λευχαιμική εξαλλαγή 118. Ωστόσο, παρά τη σημαντική πρόοδο στην κατανόηση του ρόλου του μικροπεριβάλλοντος στην ανάπτυξη της ΧΛΛ, η ακριβής φύση των αντιγόνων που αλληλεπιδρούν με τα νεοπλασματικά κύτταρα παραμένει αδιευκρίνιστη. Επιπλέον, συγκεκριμένες παρατηρήσεις οδήγησαν στην υπόθεση ότι μάλλον η λειτουργικότητα (και αντιδραστικότητα) του BCR, παρά το μεταλλακτικό φορτίο του αναδιαταγμένου γονιδίου IGHV, καθορίζει τελικά την κλινική πορεία της νόσου. Τα παραπάνω δεδομένα παρακίνησαν τη λεπτομερή ανάλυση των πρωτογενών ανοσογενετικών χαρακτηριστικών του BCR, η οποία μπορεί να προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες για τη φύση των αντιγόνων που αλληλεπιδρούν με τα νεοπλασματικά κύταρα της ΧΛΛ. Η προσέγγιση αυτή είχε ως αποτέλεσμα την απόπειρα ανάπτυξης ενός συστήματος μοριακής ταξινόμησης των περιπτώσεων ΧΛΛ με βάση μόνο την ύπαρξη κοινών, «στερεότυπων» 106

107 αμινοξικών μοτίβων στην περιοχή VH CDR3. Παρά τη νέα δυναμική που προσέφερε η νέα αυτή προσέγγιση, τα διαθέσιμα δεδομένα είναι ακόμα περιορισμένα και απαιτείται πιο εκτενής ανάλυση των «στερεότυπων» υποσυνόλων, ώστε να είναι δυνατή η ακριβής αξιολόγηση της βιολογικής και κλινικής σημασίας της «στερεοτυπίας. Τα τελευταία χρόνια, διάφορες ερευνητικές ομάδες ασχολήθηκαν με την ανάλυση της «στερεοτυπίας» του BCR στη ΧΛΛ ,114, Οι συγκεκριμένες έρευνες συμπεριέλαβαν συνεχώς μεγαλύτερες σειρές ασθενών (εύρος: αναδιατάξεις), ενώ κοινή επιδίωξή τους ήταν ο ακριβής υπολογισμός της συχνότητας των «στερεότυπων» αναδιατάξεων. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν (πιθανόν λόγω διαφορών ως προς το μέγεθος των αντίστοιχων ομάδων εργασίας) κατέστησαν αναγκαία τη διευκρίνιση συγκεκριμένων θεμάτων που αφορούν στην ανάλυση της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ: αποσαφήνιση των κριτηρίων για τον προσδιορισμό των αναδιατάξεων με «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3, πραγματική συχνότητα του φαινομένου της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ και αναζήτηση «στερεότυπων» υποσυνόλων με μεγάλο μέγεθος και ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά. Αναθεώρηση των κριτηρίων ταξινόμησης σε «στερεότυπα» υποσύνολα Η παρούσα ανάλυση βασίστηκε στην εφαρμογή μεθόδων βιοπληροφορικής 118, οι οποίες προσαρμόστηκαν και βελτιώθηκαν με κριτήριο τις ιδιαιτερότητες της εργασίας. Η τροποποίηση των αναλυτικών εργαλείων αντανακλά πρόσφατα ανοσογενετικά ευρήματα 170,171 και συμπεράσματα που προέκυψαν από την αυξημένη εμπειρία της ομάδας μας σε σειρά ανάλογων αναλύσεων. Η γενική αρχή αυτών των τροποποιήσεων ήταν να διασφαλιστεί, κατά το δυνατόν, ότι η ομολογία σε επίπεδο αμινοξικής αλληλουχίας των περιοχών VH CDR3 θα αντιστοιχεί σε πραγματική δομική και λειτουργική ομοιότητα των αντίστοιχων μορίων ανοσοσφαιρίνης 172,173. Τα κριτήρια που αναθεωρήθηκαν περιλαμβάνουν: (i) το μήκος της περιοχής VH CDR3, το οποίο αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της δομής της περιοχής πρόσδεσης του αντιγόνου 174, (ii) την ακριβή θέση του κοινού αμινοξικού μοτίβου στην περιοχή VH CDR3, λαμβάνοντας υπόψιν το δεδομένο ότι η ακριβής θέση συγκεκριμένων αμινοξέων μπορεί να επηρεάσει τη δομή και τη λειτουργία του μορίου της ανοσοσφαιρίνης 175,176. Για να εξασφαλιστεί η μέγιστη δυνατή ακρίβεια, υιοθετήθηκε μια συντηρητική προσέγγιση σύμφωνα με την οποία μόνο αναδιατάξεις με ίδιο μήκος περιοχής VH CDR3 και ίδια θέση του κοινού αμινοξικού μοτίβου στην περιοχή VH CDR3 είχαν τη δυνατότητα να καταταγούν στο ίδιο «στερεότυπο» υποσύνολο. Με αυτή την προσέγγιση, αναδιατάξεις που χρησιμοποιούσαν τα ίδια γονίδια IGHV, 107

108 IGHD και IGHJ και διέθεταν παρόμοια αλληλουχία αλλά διαφορετικό μήκος VH CDR3 κατατάχθηκαν σε διαφορετικά, συγγενικά «στερεότυπα» υποσύνολα. Η εφαρμογή αυστηρών κριτηρίων εξασφάλισε τη μέγιστη μοριακή ομοιογένεια των αναδιατάξεων κάθε «στερεότυπου» υποσυνόλου. Η συγκεκριμένη προσέγγιση θεωρείται πιο «ασφαλής», καθώς, προς το παρόν, τα διαθέσιμα δεδομένα δεν επιτρέπουν την αξιόπιστη πρόβλεψη της αντιδραστικότητας του BCR και της κλινικής πορείας της νόσου με βάση την αλληλουχία της περιοχής VH CDR3. Εκτός από την αναθεώρηση ορισμένων κριτηρίων του αλγορίθμου, προστέθηκε μια νέα παράμετρος που αφορούσε στη σημασία του τμήματος της μεταβλητής περιοχής που κωδικοποιείται από το γονίδιο IGHV. Με την εισαγωγή της νέας παραμέτρου λαμβάνεται πλέον υπόψη ο ρόλος των περιοχών: (i) VH CDR1 και VH CDR2 στην πρόσδεση κλασικών αντιγόνων (μέσω των περιοχών VH CDR), (ii) VH FR στην πρόσδεση συγκεκριμένων τύπων αντιγόνου (υπεραντιγόνα, βακτηριακοί πολυσακχαρίτες) 175. Η νέα παράμετρος επηρέασε σε σημαντικό βαθμό τη σύνθεση των «στερεότυπων» υποσυνόλων, καθώς πλέον κάθε υποσύνολο περιλαμβάνει μόνο αναδιατάξεις με γονίδια IGHV της ίδιας φυλογενετικής ομάδας. Η εφαρμογή της παραμέτρου ανέδειξε μια σειρά «στερεότυπων» υποσυνόλων που περιείχαν αναδιατάξεις με διαφορετικά, αλλά φυλογενετικά συγγενή, γονίδια IGHV. Πιο γνωστό παράδειγμα είναι το υποσύνολο #1 109,110,117, το οποίο αποτελείται από αναδιατάξεις των γονιδίων της φυλογενετικής ομάδας Ι (γονίδια IGHV των υποομάδων IGHV1, IGHV5 και IGHV7). Άλλα παραδείγματα ήταν τα υποσύνολα: #12 (IGHV1-2, IGHV1-46), #59 (IGHV1-58, IGHV1-69) και #77 (IGHV4-4, IGHV4-59). Το υποσύνολο #77 είναι ιδιαίτερο και για έναν ακόμη λόγο. Οι αναδιατάξεις του φέρουν σωματικές μεταλλάξεις με ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά. Συγκεκριμένα, κάποιες από τις σωματικές μεταλλάξεις είχαν ως αποτέλεσμα την αύξηση της ομοιότητας σε αμινοξικό επίπεδο των αναδιατάξεων που χρησιμοποιούσαν τα συγγενή γονίδια IGHV4-4 και IGHV4-59, καθώς εξάλειψαν τις διαφορές σε θέσεις όπου τα δύο αυτά γονίδια διαφέρουν στο επίπεδο της βλαστικής σειράς (μη αναδιαταγμένα). Με άλλα λόγια, η αναγνώριση ενός κοινού αντιγονικού επιτόπου μπορεί να οδηγήσει στην εξομοίωση αναδιατάξεων με διαφορετικά γονίδια IGHV στα πλαίσια των διεργασιών για αύξηση της συγγένειας με το αντιγόνο. Το φαινόμενο αυτό αποτελεί ένδειξη ότι η αναγνώριση του αντιγόνου πιθανόν καθορίζεται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες επιλεγμένων θέσεων της μεταβλητής περιοχής. Επομένως, αναδιατάξεις με παρόμοιες περιοχές VH CDR3 αλλά διαφορετικά γονίδια IGHV είναι πιθανό ν αναγνωρίζουν κοινούς αντιγονικούς επιτόπους λόγω κοινής δομής μέσω σύγκλισης των αλληλουχιών των διαφορετικών γονιδίων σε κρίσιμες θέσεις της μεταβλητής περιοχής. 108

109 Συνολικά, τεκμηριώνεται η ύπαρξη «στερεότυπων» υποσυνόλων που αποτελούνται από αναδιατάξεις με διαφορετικά αλλά «συγγενή» γονίδια IGHV. Πιθανόν, τα συγκεκριμένα γονίδια έχουν προεπιλεγεί λόγω της ειδικότητάς τους εναντίον ορισμένων αντιγόνων και της δεκτικότητας τους στη «στερεοτυπία». Ανάλογα ευρήματα πρόσφατα περιγράφηκαν για ανασυνδυασμένα αντισώματα (recombinant mabs) με τεχνικές ανακατέματος των περιοχών CDR 177 (CDR shuffling), καθώς και για αντισώματα εναντίον του ιού HIV 178. Στην τελευταία περίπτωση, παρά την έντονη επίδραση της ΣΥΜ, τα αντισώματα διέθεταν ένα κοινό μοτίβο στην μεταβλητή περιοχή μήκους 68 αμινοξέων παρότι χρησιμοποιούσαν διαφορετικά γονίδια IGHV (IGHV1-2 και IGHV1-46, τα οποία χρησιμοποιούνται και σε «στερεότυπα» υποσύνολα στη ΧΛΛ, π.χ. #1 και #12). Συχνότητα της «στερεοτυπίας» στη ΧΛΛ Η επανεξέταση των αποτελεσμάτων από παλαιότερες ανοσογενετικές αναλύσεις στη ΧΛΛ ανέδειξε τάση για αύξηση της συχνότητας της «στερεοτυπίας» (8.6 28%) όσο αυξανόταν ο αριθμός των υπό ανάλυση αναδιατάξεων ( αναδιατάξεις) ,114, Μολονότι η σχέση μεταξύ των δύο μεγεθών δεν φαινόταν αναλογική, παρέμενε αδιευκρίνιστη η ακριβής μαθηματική αναλογία μεταξύ τους και συγκεκριμένα αν η αυξητική τάση που παρατηρείται στο σχετικό μέγεθος του υποσυνόλου των «στερεότυπων» αναδιατάξεων θα παρέμενε με τη συνεχή αύξηση του μεγέθους της ομάδας εργασίας. Ο αριθμός των αναδιατάξεων που συγκεντρώθηκε για την παρούσα εργασία (σχεδόν τρεις φορές μεγαλύτερος από τον αντίστοιχο της μεγαλύτερης δημοσιευμένης εργασίας) 118 επέτρεψε να μελετηθεί λεπτομερώς η μαθηματική σχέση μεταξύ της συχνότητας της «στερεοτυπίας» και του μεγέθους της ομάδας μελέτης. Διαπιστώθηκε ότι το φαινόμενο της «στερεοτυπίας» αφορά μόνο ένα υποσύνολο ασθενών με ΧΛΛ, ανεξάρτητα από τον αριθμό των αναδιατάξεων που περιλαμβάνονται στην ανάλυση. Η πραγματική συχνότητα των «στερεότυπων» BCR στη ΧΛΛ, η οποία υπολογίζεται σε ~30%, γίνεται εμφανής μόνο όταν το μέγεθος της ομάδας μελέτης ξεπεράσει την κρίσιμη τιμή των 2000 αναδιατάξεων. Τα αποτελέσματα αυτά επαληθεύτηκαν με τη χρήση προσομοιώσεων σε τυχαία υποσύνολα των αναδιατάξεων της παρούσας εργασίας με μέγεθος αναδιατάξεις. Επομένως, επιβεβαιώνεται η άποψη ότι η ΧΛΛ περιλαμβάνει δύο κατηγορίες ασθενών: μια με «στερεότυπους» BCR και μια με ετερογένεια στο επίπεδο των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών του BCR. Τα «στερεότυπα» υποσύνολα στη ΧΛΛ διαθέτουν μοναδικά χαρακτηριστικά Η λεπτομερής ανάλυση των «στερεότυπων» περιοχών VH CDR3 αποκάλυψε την ύπαρξη μοναδικών ανοσογενετικών χαρακτηριστικών. Σε 109

110 κάποιες περιπτώσεις, το κοινό αμινοξικό μοτίβο κάλυπτε όλη την περιοχή VH CDR3 (χαρακτηριστικό παράδειγμα το υποσύνολο #10), ενώ, άλλοτε, ο ορισμός ενός υποσυνόλου βασίστηκε σε ορισμένες μόνο θέσεις που λόγω της αυξημένης σημασίας τους χαρακτηρίζονται ως ορόσημα. Ενδεικτικό παράδειγμα προσέφερε το υποσυνόλο #2. Συγκεκριμένα, η ταξινόμηση μιας αναδιάταξης στο υποσύνολο #2 απαιτεί την ικανοποίηση τριών μόνο κριτηρίων: (i) συνδυασμός γονιδίων IGHV3-21/IGHJ6, (ii) περιοχή VH CDR3 μήκους 9 αμινοξέων, και τέλος (iii) ένα όξινο αμινοξύ στη θέση 107 της περιοχής VH CDR3. Με άλλα λόγια, οι ιδιότητες που χαρακτηρίζουν τις αναδιατάξεις του γονιδίου IGHV3-21 του υποσυνόλου #2 είναι ο περιορισμός στο μήκος της περιοχής VH CDR3 και η συντήρηση μιας μόνο θέσης-ορόσημου. Όπως προαναφέρθηκε σε μελέτες που αφορούσαν σε αντισώματα με καθορισμένες ειδικότητες, οι δύο αυτές ιδιότητες είναι πολύ πιθανό να σχετίζονται μεταξύ τους 179, καθώς ένα ορισμένο μήκος VH CDR3 μπορεί να εξασφαλίζει την ακριβή τοποθέτηση αμινοξέων με τις απαιτούμενες φυσικοχημικές ιδιότητες σε συγκεκριμένες θέσεις της περιοχής VH CDR3. Έτσι, επιτυγχάνεται είτε η ισχυρή πρόσδεση του αντιγόνου, είτε η σταθερή σύνδεση βαριάς κι ελαφριάς αλυσίδας, ανάλογα με τη λειτουργία των συγκεκριμένων αμινοξέων. Η ύπαρξη «στερεότυπων» BCR στη ΧΛΛ δε σημαίνει ότι η υπόλοιπη αλληλουχία της περιοχής VH CDR3 είναι λιγότερο σημαντική για την πρόσδεση του αντιγόνου. Μια άλλη ερμηνεία του φαινομένου είναι ότι οι συγκεκριμένοι υποδοχείς επιλέγονται λόγω μεγάλης πλαστικότητας, η οποία εγγυάται την αναγνώριση ενός εύρους διαφορετικών επιτόπων. Η συγκεκριμένη ερμηνεία υποστηρίζεται από παρατηρήσεις στον ποντικό, ιδίως για ανοσοσφαιρίνες με ειδικότητα για απτίνες (haptens) μικρού μεγέθους ή υδατανθρακικά μόρια, όπου περιοχές VH CDR3 με συγκεκριμένο μήκος σχετίζονται με καθοριμένες ειδικότητες 180. Η ανάλυση της «στερεοτυπίας» παρέχει ενδείξεις για την προέλευση της ΧΛΛ Σε ανοσογενετικό επίπεδο, οι περιπτώσεις ΧΛΛ με «στερεότυπους» υποδοχείς θυμίζουν τον υποπληθυσμό Β λεμφοκυττάρων που αναφέρονται ως Β1 λεμφοκύτταρα. Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στα Β1 λεμφοκύτταρα χαρακτηρίζεται από έντονη επιλεκτικότητα και διαφέρει πολύ από το αντίστοιχο άλλων υποπληθυσμών Β λεμφοκυττάρων. Χαρακτηρίζεται από συχνή έκφραση συγκεκριμένων συνδυασμών βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας 68. Τα Β1 λεμφοκύτταρα είναι κυρίως υπεύθυνα για την παραγωγή των φυσικών αντισωμάτων που κυκλοφορούν στο αίμα φυσιολογικών ανθρώπων απουσία εξωγενών ερεθισμάτων, έχουν συνήθως ισότυπο IgM και επιδεικνύουν πολυαντιδραστικότητα εναντίον εξωτερικών αντιγόνων και αυτοαντιγόνων 68. Το 110

111 ρεπερτόριο και η αντιδραστικότητα των Β1 BCR φαίνεται να είναι σταθερά μεταξύ διαφορετικών οργανισμών του ίδιου είδους καθώς και μεταξύ διαφορετικών ειδών οργανισμών, μολονότι απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για την πλήρη επιβεβαίωση του συγκεκριμένου ισχυρισμού. Μια πιθανή εξήγηση για το συγκεκριμένο φαινόμενο είναι η εξελικτική επιλογή ειδικοτήτων που παρέχουν προστασία εναντίον παθογόνων και ταυτόχρονα βοηθούν στη διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού μέσω της αφαίρεσης αποπτωτικού υλικού 68. Επισημαίνεται ότι παρόμοιο πρότυπο αντιδραστικότητας ταυτοποιήθηκε σε πολυαντιδραστικά αντισώματα ΧΛΛ 181,182 (ιδίως «αμετάλλακτα»), τα οποία επέδειξαν αυξημένη ειδικότητα εναντίον μοριακών δομών σε αποπτωτικά κύτταρα ή βακτήρια 92,94,182,183. Συνολικά, τα δεδομένα αυτά στηρίζουν την άποψη ότι το υποσύνολο ΧΛΛ που χαρακτηρίζεται από την έκφραση «στερεότυπων» BCR πιθανόν προκύπτει μέσω της λευχαιμικής εξαλλαγής κυττάρων με λειτουργικά χαρακτηριστικά Β1 λεμφοκυττάρων. Η πρόσφατη αναγνώριση ενός μικρού πληθυσμού Β λεμφοκυττάρων του ανθρώπου με ανοσοφαινότυπο CD20+CD27+CD43+, ο οποίος εντοπίστηκε στον ομφάλιο λώρο και το αίμα και επιδεικνύει χαρακτηριστικά των Β1 λεμφοκυττάρων 67 καθιστά τον προηγούμενο ισχυρισμό ακόμα πιο πιθανό. Μοριακή κατάταξη των ασθενών με ΧΛΛ με βάση τη «στερεοτυπία» της περιοχής VH CDR3: κλινικές προεκτάσεις Από πρακτική άποψη, το σημαντικό μέγεθος της κατηγορίας ΧΛΛ με «στερεότυπους» υποδοχείς έχει μεγάλη κλινική αξία. Η άποψη αυτή στηρίζεται σε δεδομένα από ανεξάρτητες μελέτες, οι οποίες ανέφεραν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ συγκεκριμένων «στερεότυπων» υποσυνόλων, αντιδραστικότητας του BCR και κλινικών χαρακτηριστικών της νόσου. Συγκεκριμένα παραδείγματα είναι η μικρή ηλικία διάγνωσης για τους ασθενείς του υποσυνόλου #4 110,117,119, η αυξημένη πιθανότητα εκδήλωσης συνδρόμου Richter για το υποσύνολο #8 184 και τέλος, η κακή πρόγνωση για τους ασθενείς που κατατάσσονται στα υποσύνολα #1 110 και #2 110,117. Επομένως, φαίνεται λογικός ο ισχυρισμός ότι η αναγνώριση «στερεοτυπίας» στην περιοχή VH CDR3 μπορεί να αποδειχθεί καθοριστική για την πρόγνωση του ασθενούς, ίσως με μεγαλύτερη αξιοπιστία σε σχέση με το μεταλλακτικό φορτίο του αναδιαταγμένου γονιδίου IGHV, και να συμβάλλει στην ανάπτυξη και εφαρμογή νέων θεραπευτικών μεθόδων, ειδικών για κάθε «στερεότυπο» υποσύνολο. Επιπλεόν, η αναγνώριση «στερεότυπων» υποσυνόλων με μεγάλο αριθμό περιπτώσεων καθιστά εφικτή την εφαρμογή στοχευμένων θεραπειών σε μια μεγάλη ομάδα ασθενών με ΧΛΛ. 111

112 «Ο ρόλος της αντιγονικής επιλογής στο λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα (ΛΜ): ανάλυση των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών 807 ασθενών» Εισαγωγή Το λέμφωμα από το κύτταρο του μανδύα είναι ένας καλά χαρακτηρισμένος υπότυπος non-hodgkin λεμφώματος και αντιστοιχεί στο 6% του συνόλου των λεμφωμάτων. Προσβάλλει κυρίως άτομα με ηλικία μεγαλύτερη των 60 ετών και συχνότερα άνδρες, σε αναλογία 4:1. Η κλινική πορεία της νόσου είναι επιθετική και η μέση επιβίωση υπολογίζεται σε 3-5 έτη 120,121. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (World Health Organization, WHO) το νεοπλασματικό κύτταρο του ΛΜ προέρχεται από το μετασχηματισμό παρθένου (naive) Β λεμφοκυττάρου που δεν έχει περάσει από το βλαστικό κέντρο 122. Νεότερες όμως μελέτες έχουν αναδείξει μια σειρά ανοσογενετικών χαρακτηριστικών των κλωνικών αναδιατάξεων που δε συμβαδίζουν με τη συγκεκριμένη θεώρηση Συγκεκριμένα, η ύπαρξη ενός υποσυνόλου ασθενών με «μεταλλαγμένες» αναδιατάξεις, με χρήση του αριθμητικού ορίου 2%, αποτέλεσε κοινό εύρημα όλων των μελετών. Το μέγεθος του «μεταλλαγμένου» υποσυνόλου διέφερε πολύ μεταξύ των μελετών (16-38%), γεγονός που πιθανότατα οφείλεται στο μικρό αριθμό αναδιατάξεων που αναλύθηκαν σε κάθε μελέτη ( αναδιατάξεις). Στη συνέχεια, η μελέτη της σχέσης μεταξύ μεταλλακτικού φορτίου των αναδιατάγμένων γονιδίων IGHV και της κλινικής πορείας της νόσου ανέδειξε μια τάση των ασθενών του «μεταλλαγμένου» υποσυνόλου ασθενών να έχουν πιο ήπια κλινική πορεία και να απαντούν καλύτερα στη θεραπεία 149. Οι προηγούμενες μελέτες του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV στο ΛΜ ανέδειξαν έντονη επιλεκτικότητα. Επικρατέστερα γονίδια ήταν τα IGHV4-34, IGHV3-21 και IGHV3-23, ενώ τα γονίδια IGHV4-59, IGHV1-8, IGHV4-39 και IGHV5-51 ήταν μεταξύ των συχνότερων γονιδίων IGHV σε κάποιες από τις εργασίες. Στην παρούσα εργασία αναλύθηκαν λεπτομερώς τα μοριακά χαρακτηριστικά των κλωνοτυπικών αναδιατάξεων από 807 ασθενείς με ΛΜ. Το μέγεθος της ομάδας μελέτης σε συνδυασμό με την εφαρμογή νέων, ειδικών εργαλείων βιοπληροφορικής ανάλυσης οδήγησαν στην απόκτηση μιας πιο πλήρους βιολογικής εικόνας της νόσου με σημαντικές ενδείξεις για το στάδιο της νεοπλασματικής εξαλλαγής και το ρόλο του αντιγόνου στην ανάπτυξή της. Επιλογή έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων IGHV Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνουν ότι το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στο ΛΜ χαρακτηρίζεται από έντονη επιλεκτικότητα. Τέσσερα 112

113 μόνο γονίδια (IGHV3-21, IGHV4-34, IGHV1-8, και IGHV3-23) αντιπροσώπευαν περίπου τις μισές περιπτώσεις, εύρημα ενδεικτικό για τη λειτουργία μηχανισμών επιλογής. Επιπλέον, η επιλεκτικότητα στο επίπεδο των γονιδίων IGHV πιθανόν αντανακλά την εμπλοκή ενός περιορισμένου αριθμού αντιγόνων στην ανάπτυξη της νόσου 150,151. Τέλος, η σύγκριση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV με αντίστοιχα ρεπερτόρια φυσιολογικών πληθυσμών διαφόρων σταδίων διαφοροποίησης, ιδίως με τον πληθυσμό των παρθένων Β λεμφοκυττάρων, ανέδειξε σημαντικές διαφορές. Συγκεκριμένα, η υπεραντιπροσώπευση των γονιδίων IGHV3-21 και IGHV1-8 αποτελεί επιπρόσθετη ένδειξη για την επιλογή των συγκεκριμένων κυττάρων από αντιγόνο. Η ύπαρξη ενός υποσυνόλου ΛΜ με «μεταλλαγμένα» γονίδια IGHV έρχεται σε αντίθεση με την πιθανή προέλευση της νόσου από παρθένα Β λεμφοκύτταρα Η παρουσία ενός υποσυνόλου ασθενών με «μεταλλαγμένες» αναδιατάξεις αποτέλεσε κοινό εύρημα όλων των πρόσφατων ανοσογενετικών αναλύσεων στο ΛΜ Η ταξινόμηση των ασθενών στο συγκεκριμένο υποσύνολο βασίστηκε στη χρήση του ορίου ομολογίας 2%, ακολουθώντας το παράδειγμα της ΧΛΛ, όπου το συγκεκριμένο κριτήριο έχει μεγάλη προγνωστική αξία 146,147. Όμως, η συγκεκριμένη επιλογή είναι αμφιλεγόμενη για τους εξής λόγους. Πρώτον, το μεταλλακτικό φορτίο των γονιδίων IGHV δε φαίνεται να έχει ακριβή προγνωστική σημασία στο ΛΜ 134,138,148,149. Παρά το αδιαμφισβήτητο ενδιαφέρον του συγκεκριμένου ζητήματος, αποφεύχθηκε η αξιολόγησή του στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας, κυρίως λόγω της μεγάλης ετερογένειας αναφορικά με τη θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών. Δεύτερον, η μελέτη της ΣΥΜ ανέδειξε ότι οι περισσότερες περιπτώσεις φέρουν σωματικές μεταλλάξεις, των οποίων η τοπολογία δεν ήταν τυχαία. Αντίθετα, τα πρότυπά της ήταν ειδικά για το ΛΜ. Το σημαντικότατο αυτό χαρακτηριστικό είχε υποβαθμιστεί στις προηγούμενες μελέτες λόγω της εφαρμογής του κριτηρίου ταξινόμησης 2%, το οποίο είναι αυθαίρετο από βιολογική άποψη, καθώς οι αναδιατάξεις με νουκλεοτιδική ταυτότητα 98% αλλά <100% θεωρούνται «αμετάλλακτες» ενώ φέρουν σωματικές μεταλλάξεις. Η μελέτη του μηχανισμού ΣΥΜ στο ΛΜ ανέδειξε την ύπαρξη ιδιαίτερων χαρακτηριστικών Ένα από τα σημαντικότερα ευρήματα της παρούσας μελέτης είναι ότι η πλειονότητα των περιπτώσεων ΛΜ φέρουν μικρό φορτίο σωματικών μεταλλάξεων και κατατάσσονται στο υποσύνολο με «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένων» αναδιατάξεις. Η ανάλυση των ανοσογενετικών 113

114 χαρακτηριστικών στα υποσύνολα ασθενών με διαφορετικό μεταλλακτικό φορτίο («πραγματικά αμετάλλακτες», «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένες» και «πραγματικά μεταλλαγμένες») ανέδειξε μοριακές διαφορές, οι οποίες υποδηλώνουν την ύπαρξη διαφορετικών μηχανισμών αντιγονικής επιλογής. Η επικέντρωση στις αναδιατάξεις των τεσσάρων επικρατέστερων γονιδίων (IGHV3-21, IGHV4-34, IGHV1-8, και IGHV3-23) αποκάλυψε διαφορές ως προς τη συχνότητά τους στα υποσύνολα με διαφορετικό μεταλλακτικό φορτίο, φαινόμενο ενδεικτικό για τη στενή σχέση του μηχανισμού ΣΥΜ με την έκφραση ανοσοσφαιρινών συγκεκριμένων ειδικοτήτων. Αξιολογώντας το σύνολο των συγκεκριμένων παρατηρήσεων φαίνεται πλέον εύλογη η άποψη ότι η περιορισμένη επίδραση του μηχανισμού ΣΥΜ στο ΛΜ δε σημαίνει αναγκαστικά απουσία διέγερσης των κλωνογενών κυττάρων από αντιγόνο. Μια εναλλακτική υπόθεση είναι ότι πιθανόν υπήρξε ισχυρή πίεση για συντήρηση της αλληλουχίας των αναδιαταγμένων γονιδίων IGHV, τουλάχιστον για ένα υποσύνολο περιπτώσεων. Η ύπαρξη «επαναλαμβανόμενων» μεταλλάξεων κατά μήκος της μεταβλητής περιοχής στις αναδιατάξεις των συχνότερων γονιδίων, ιδίως των γονιδίων IGHV3-21, IGHV3-23 και IGHV4-34, ενίσχυσε σημαντικά την άποψη ότι η στόχευση του μηχανισμού ΣΥΜ στο ΛΜ δεν είναι τυχαία, αλλά υπόκειται στη δράση μηχανισμών επιλογής. «Επαναλαμβανόμενες» μεταλλάξεις εντοπίστηκαν και στο υποσύνολο των «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένων» αναδιατάξεων, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων παρέχει στα νεοπλασματικά κύτταρα κάποιο πλεονέκτημα επιλογής. Η ανάλυση των χαρακτηριστικών της περιοχής VH CDR3 υποδεικνύει την επιλογή των νεοπλασματικών κυττάρων του ΛΜ από αντιγόνο Το μήκος και η αμινοξική σύσταση της περιοχής VH CDR3 είναι καθοριστικοί παράγοντες για την αναγνώριση του αντιγόνου 174,185. Η λεπτομερής ανάλυση της περιοχής VH CDR3 στο ΛΜ υποδηλώνει ότι τα προγονικά κύτταρα επιλέχθηκαν από αντιγόνο. Παρατηρήθηκε ότι τα υποσύνολα αναδιατάξεων με διαφορετικό μεταλλακτικό φορτίο παρουσίαζαν διαφορετική κατανομή μήκους της περιοχής VH CDR3. Συγκεκριμένα, οι αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV3-21 και IGHV4-34, οι οποίες επικρατούσαν στο υποσύνολο των «ελάχιστα/οριακά μεταλλαγμένων» και των «πραγματικά αμετάλλακτων» αναδιατάξεων, αντίστοιχα, είχαν αρκετά μεγαλύτερες περιοχές VH CDR3 σε σχέση με το «πραγματικά μεταλλαγμένο» υποσύνολο, πιθανόν αντικατοπτρίζοντας την ανάγκη ακριβούς τοποθέτησης συγκεκριμένων αμινοξικών καταλοίπων ώστε να είναι δυνατή η αναγνώριση ορισμένων αντιγονικών επιτόπων 174,186. Επιπρόσθετες ενδείξεις που επιβεβαιώνουν την τελευταία άποψη προέκυψαν από την ανακάλυψη ότι μια σημαντική υποομάδα αναδιατάξεων 114

115 κατατάσσονται σε υποσύνολα, τα οποία χαρακτηρίζονται από την έκφραση των ίδιων γονιδίων IGHV και κοινών αμινοξικών μοτίβων της περιοχής VH CDR3. Πράγματι, η εφαρμογή βιοπληροφορικών εργαλείων οδήγησε στην ανακάλυψη, για πρώτη φορά στο ΛΜ, «στερεότυπων» αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ που αποτελούν το ~10% του συνόλου των περιπτώσεων. Η αναγνώριση «στερεότυπων» BCR στο ΛΜ σε συχνότητα που το μέγεθος της δεν μπορεί να αποδοθεί στην τύχη αντικρούει την άποψη ότι το ΛΜ είναι μια νεοπλασία κυρίως παρθένων Β λεμφοκυττάρων, τουλάχιστον για τα συγκεκριμένα υποσύνολα ασθενών. Προεκτάσεις για την προέλευση του ΛΜ Παρά τις σημαντικές ενδείξεις για την εμπλοκή αντιγόνου στην ανάπτυξη του ΛΜ που προέκυψαν στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης, σημαντικά θέματα παραμένουν αδιευκρίνιστα: (i) η φύση των αντιγόνων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της νόσου, και, (ii) το στάδιο διαφοροποίησης στο οποίο συμβαίνει ο νεοπλασματικός μετασχηματισμός. Η αναζήτηση των αντιγόνων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ΛΜ μπορεί να αποδειχθεί μακρά και δύσκολη, κρίνοντας από το προηγούμενο της ΧΛΛ 92,182,187. Όσον αφορά τα προγονικά κύτταρα του ΛΜ, πρόσφατες μελέτες σε πληθυσμούς φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων ανέδειξαν αρκετούς υποψηφίους για το φυσιολογικό αντίστοιχο του νεοπλασματικού κυττάρου του ΛΜ. Συγκεκριμένα, στην εργασία των Kolar και συνεργατών, αναγνωρίστηκε ένας νέος υποπληθυσμός Β λεμφοκυττάρων των αμυγδαλών που φαίνεται να βρίσκεται σε ενδιάμεσο στάδιο ανάπτυξης μεταξύ παρθένων λεμφοκυττάρων και Β λεμφοκυττάρων του βλαστικού κέντρου, εκφράζει AID, επιδεικνύει χαμηλή δραστικότητα του μηχανισμού ΣΥΜ και έχει τον εξής ανοσοφαινότυπο: IgM+IgD+CD27-CD23-CD5+CD10-. Οι συγγραφείς της μελέτης πρότειναν το συγκεκριμένο πληθυσμό ως προγονικό του ΛΜ 188. Τα ανοσογενετικά δεδομένα της παρούσας μελέτης βρίσκονται σε συμφωνία με τον παραπάνω ισχυρισμό, τουλάχιστον για συγκεκριμένα υποσύνολα ασθενών, χωρίς όμως να αποκλείονται άλλα ενδεχόμενα (π.χ. τα μεταβατικά Β λεμφοκύτταρα είναι επίσης CD5+ 189,190 και έχουν χαμηλό μεταλλακτικό φορτίο 189,191 ). 115

116 Περίληψη Ανάλυση της στερεοτυπίας της περιοχής VH CDR3 σε 7596 αναδιατάξεις ασθενών με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ): μοριακή κατάταξη των ασθενών με ενδείξεις για την αντιμετώπιση της νόσου Σειρά δεδομένων υποστηρίζουν ότι η ταξινόμηση των ασθενών με ΧΛΛ σε υποσύνολα με στερεότυπους BCR έχει λειτουργικές και προγνωστικές προεκτάσεις. Ωστόσο, συγκεκριμένα θέματα χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση, όπως τα κριτήρια ταυτοποίησης της στερεοτυπίας και η πραγματική συχνότητά της. Σε αυτό το πλαίσιο, μελετήθηκαν 7596 αναδιατάξεις από 7424 ασθενείς με ΧΛΛ με τη χρήση ενός ειδικού αλγορίθμου βιοπληροφορικής. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η ΧΛΛ διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: μια με «στερεότυπους» και μια με «ετερογενείς» BCR, με αναλογία 1:2 και πιθανολογούμενη διαφορετική προέλευση. Επιπλέον, τα αμινοξικά μοτίβα που χαρακτηρίζουν τα «στερεότυπα» υποσύνολα στη ΧΛΛ διαφέρουν από τα αντίστοιχα σε άλλες νεοπλασίες των Β λεμφοκυττάρων. Επισημαίνεται ότι 19 κύρια υποσύνολα αντιπροσώπευαν το 1/8 του συνόλου των περιπτώσεων. Επομένως, η ανοσογενετική μελέτη της ΧΛΛ μπορεί να οδηγήσει στη μοριακή κατάταξη των ασθενών, με προεκτάσεις για την αντιμετώπιση της νόσου μέσω της εισαγωγής νέων θεραπευτικών πρωτοκόλλων ειδικών για κάθε στερεότυπο υποσύνολο. Ο ρόλος της αντιγονικής επιλογής στο λέμφωμα του μανδύα (ΛΜ): ανάλυση των ανοσογενετικών χαρακτηριστικών 807 ασθενών Μελετήθηκαν συνολικά 807 παραγωγικές αναδιατάξεις IGH από ασθενείς με ΛΜ. Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV εμφάνιζε ιδιαίτερη επιλεκτικότητα, με τέσσερα γονίδια να αντιστοιχούν στο 46.3% των περιπτώσεων. Ογδόντα τέσσερις περιπτώσεις (10.8%) είχαν «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3 και ταξινομήθηκαν σε 38 υποσύνολα που χρησιμοποιούσαν κυρίως τα γονίδια IGHV3-21 και IGHV4-34. Με βάση το μεταλλακτικό φορτίο, οι 238/807 περιπτώσεις είχαν «αμετάλλακτα» γονίδια, ενώ οι υπόλοιπες (569/807) έφεραν σωματικές μεταλλάξεις (συνήθως λίγες). Επιπλέον, αναγνωρίστηκαν υποσύνολα με «επαναλαμβανόμενες» μεταλλάξεις. Η σύγκριση με άλλες νεοπλασίες, ιδίως τη ΧΛΛ, έδειξε ότι πολλές από τις μεταλλάξεις αυτές ήταν νοσο-ειδικές. Συνοπτικά, το ΛΜ χαρακτηρίζεται από διακριτό ρεπερτόριο γονιδίων IG, «στερεότυπες» περιοχές VH CDR3 και αυστηρή στόχευση του μηχανισμού ΣΥΜ. Τα παραπάνω ευρήματα συνηγορούν για την εμπλοκή αντιγόνου στην ανάπτυξη της νόσου, τουλάχιστον για συγκεκριμένα υποσύνολα ασθενών με ΛΜ. 116

117 Abstract Stereotyped B cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia (CLL): towards a molecular classification with implications for targeted therapeutic interventions Mounting evidence indicates that grouping of CLL into subsets with stereotyped B cell receptors (BCR) is functionally and prognostically relevant. However, several issues need revisiting, including the criteria for identification of stereotypy and its actual frequency. To this end, we examined 7596 IG VH sequences from 7424 CLL patients with an updated version of our clustering algorithm. We document that CLL may be subdivided into two categories: one with stereotyped and the other with non-stereotyped BCRs, at an approximate ratio of 1:2, and provide evidence suggesting a different ontogeny for these two categories. We also show that subset-defining sequence patterns in CLL differ from those underlying BCR stereotypy in other B cell malignancies. Notably, 19 major subsets collectively accounted for one-eighth of the cohort. Hence, this detailed examination of VH sequences may pave the way towards a molecular classification of CLL with implications for targeted therapeutic interventions, applicable to a significant number of patients assigned to the same subset. A role for antigen selection in mantle cell lymphoma (MCL): tracing the immunogenetic evidence in a series of 807 cases We examined 807 productive IGH rearrangements from cases with MCL. The IGHV gene repertoire was remarkably biased, with four genes accounting for 46.3% of cases. Eighty-four of 807 (10.8%) sequences were found with stereotyped VH CDR3 regions and placed in 38 clusters, mainly utilizing IGHV3-21 and IGHV4-34. Based on somatic hypermutation (SHM) status, 238/807 sequences carried IGHV genes with 100% germline identity; the remainder (569/807) exhibited different levels of somatic hypermutation (SHM), from minimal (usually) to pronounced. Shared replacement mutations across the IGHV gene were identified for certain subgroups. Comparison to other entities, in particular CLL, revealed that several stereotyped mutations were MCL-biased. In conclusion, MCL is characterized by a distinctive immunoglobulin gene repertoire with restricted VH CDR3s and very precisely targeted and, probably, functionally driven SHM, strongly implying a role for antigen-driven selection of the clonogenic progenitors. Hence, an antigen-driven origin of MCL could be envisaged, at least for subsets of cases. 117

118 Βιβλιογραφία 1. Kuby J. Immunobiology. 4th ed: W.H. Freeman and Co.; Janeway C TP. Immunobiology. The immune system in health and disease. 2nd ed: Current Biology Ltd./Garland Publising Inc. 3. Janeway C TP, Walport M, Shlomchik M. Immunobiology. The immune system in health and disease. 6th ed: Garland Publishing Inc.; Janeway CA, Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition. Annual review of immunology. 2002;20: Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. Feb ;124(4): Gordon S. Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune response. Cell. Dec ;111(7): Takeda K, Akira S. Toll-like receptors in innate immunity. International immunology. Jan 2005;17(1): Hoebe K, Janssen E, Beutler B. The interface between innate and adaptive immunity. Nature immunology. Oct 2004;5(10): Cooper MD, Alder MN. The evolution of adaptive immune systems. Cell. Feb ;124(4): Schlissel MS. Regulating antigen-receptor gene assembly. Nature reviews. Immunology. Nov 2003;3(11): Lefranc MP LG. The immunoglobulin FactsBook. London: Academic Press; Burmester GR PA, Wandrey SO, Ulrichs T. Color Atlas of immunology. Vol 2nd edition.: Thieme.; Roitt IM DP. Roitt's essential immunology. 10th ed. Oxford: Blackwell Science; Lefranc MP. Nomenclature of the human immunoglobulin heavy (IGH) genes. Experimental and clinical immunogenetics. 2001;18(2): Lefranc MP. Nomenclature of the human immunoglobulin kappa (IGK) genes. Experimental and clinical immunogenetics. 2001;18(3): Lefranc MP. Nomenclature of the human immunoglobulin lambda (IGL) genes. Experimental and clinical immunogenetics. 2001;18(4): Goldmit M, Schlissel M, Cedar H, Bergman Y. Differential accessibility at the kappa chain locus plays a role in allelic exclusion. The EMBO journal. Oct ;21(19): Liang HE, Hsu LY, Cado D, Schlissel MS. Variegated transcriptional activation of the immunoglobulin kappa locus in pre-b cells contributes to the allelic exclusion of light-chain expression. Cell. Jul ;118(1):

119 19. Pillai S, Cariappa A, Moran ST. Positive selection and lineage commitment during peripheral B-lymphocyte development. Immunological reviews. Feb 2004;197: Carsetti R. The development of B cells in the bone marrow is controlled by the balance between cell-autonomous mechanisms and signals from the microenvironment. The Journal of experimental medicine. Jan ;191(1): Matthias P, Rolink AG. Transcriptional networks in developing and mature B cells. Nature reviews. Immunology. Jun 2005;5(6): LeBien TW, Tedder TF. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. Sep ;112(5): Defrance T, Casamayor-Palleja M, Krammer PH. The life and death of a B cell. Advances in cancer research. 2002;86: Fang T, Smith BP, Roman CA. Conventional and surrogate light chains differentially regulate Ig mu and Dmu heavy chain maturation and surface expression. J Immunol. Oct ;167(7): Lassoued K, Illges H, Benlagha K, Cooper MD. Fate of surrogate light chains in B lineage cells. The Journal of experimental medicine. Feb ;183(2): Meffre E, Davis E, Schiff C, et al. Circulating human B cells that express surrogate light chains and edited receptors. Nature immunology. Sep 2000;1(3): Ohmori H, Hikida M. Expression and function of recombination activating genes in mature B cells. Critical reviews in immunology. 1998;18(3): Wardemann H, Yurasov S, Schaefer A, Young JW, Meffre E, Nussenzweig MC. Predominant autoantibody production by early human B cell precursors. Science. Sep ;301(5638): Schlissel MS. The regulation of receptor editing. Advances in experimental medicine and biology. 2007;596: Chen C, Nagy Z, Prak EL, Weigert M. Immunoglobulin heavy chain gene replacement: a mechanism of receptor editing. Immunity. Dec 1995;3(6): Kolar GR, Capra JD. Immunoglobulin heavy-chain receptor editing is observed in the NOD/SCID model of human B-cell development. Scandinavian journal of immunology. Jul-Aug 2004;60(1-2): Melchers F. Anergic B cells caught in the act. Immunity. Dec 2006;25(6): Strasser A, Puthalakath H, O'Reilly LA, Bouillet P. What do we know about the mechanisms of elimination of autoreactive T and B cells and what challenges remain. Immunology and cell biology. Jan 2008;86(1):

120 34. McHeyzer-Williams LJ, Driver DJ, McHeyzer-Williams MG. Germinal center reaction. Current opinion in hematology. Jan 2001;8(1): Klein U, Dalla-Favera R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature reviews. Immunology. Jan 2008;8(1): Goodyear CS, Silverman GJ. B cell superantigens: a microbe's answer to innate-like B cells and natural antibodies. Springer seminars in immunopathology. Mar 2005;26(4): Sundberg EJ, Deng L, Mariuzza RA. TCR recognition of peptide/mhc class II complexes and superantigens. Seminars in immunology. Aug 2007;19(4): Fraser JD, Proft T. The bacterial superantigen and superantigen-like proteins. Immunological reviews. Oct 2008;225: Llewelyn M, Cohen J. Superantigens: microbial agents that corrupt immunity. The Lancet infectious diseases. Mar 2002;2(3): Maizels N. Immunoglobulin gene diversification. Annual review of genetics. 2005;39: Borghesi L, Milcarek C. From B cell to plasma cell: regulation of V(D)J recombination and antibody secretion. Immunologic research. 2006;36(1-3): Hassanin A, Golub R, Lewis SM, Wu GE. Evolution of the recombination signal sequences in the Ig heavy-chain variable region locus of mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Oct ;97(21): Nishihara T, Nagawa F, Imai T, Sakano H. RAG-heptamer interaction in the synaptic complex is a crucial biochemical checkpoint for the 12/23 recombination rule. The Journal of biological chemistry. Feb ;283(8): Schatz DG, Spanopoulou E. Biochemistry of V(D)J recombination. Current topics in microbiology and immunology. 2005;290: Fugmann SD. RAG1 and RAG2 in V(D)J recombination and transposition. Immunologic research. 2001;23(1): Roth DB. Restraining the V(D)J recombinase. Nature reviews. Immunology. Aug 2003;3(8): Le Deist F, Poinsignon C, Moshous D, Fischer A, de Villartay JP. Artemis sheds new light on V(D)J recombination. Immunological reviews. Aug 2004;200: Sawchuk DJ, Mansilla-Soto J, Alarcon C, et al. Ku70/Ku80 and DNAdependent protein kinase catalytic subunit modulate RAG-mediated cleavage: implications for the enforcement of the 12/23 rule. The Journal of biological chemistry. Jul ;279(28):

121 49. Brezinschek HP, Foster SJ, Brezinschek RI, Dorner T, Domiati-Saad R, Lipsky PE. Analysis of the human VH gene repertoire. Differential effects of selection and somatic hypermutation on human peripheral CD5(+)/IgM+ and CD5(-)/IgM+ B cells. The Journal of clinical investigation. May ;99(10): Janeway CA Jr TP, Walport M, et al. Immunobiology. The Immune System in Health and Disease. 5th ed. New York: Garland Science; Benedict CL, Gilfillan S, Thai TH, Kearney JF. Terminal deoxynucleotidyl transferase and repertoire development. Immunological reviews. Jun 2000;175: Papavasiliou FN, Schatz DG. Somatic hypermutation of immunoglobulin genes: merging mechanisms for genetic diversity. Cell. Apr 2002;109 Suppl:S Odegard VH, Schatz DG. Targeting of somatic hypermutation. Nature reviews. Immunology. Aug 2006;6(8): Franklin A, Blanden RV. On the molecular mechanism of somatic hypermutation of rearranged immunoglobulin genes. Immunology and cell biology. Dec 2004;82(6): Shapiro GS, Wysocki LJ. DNA target motifs of somatic mutagenesis in antibody genes. Critical reviews in immunology. 2002;22(3): Dickerson SK, Market E, Besmer E, Papavasiliou FN. AID mediates hypermutation by deaminating single stranded DNA. The Journal of experimental medicine. May ;197(10): Muramatsu M, Nagaoka H, Shinkura R, Begum NA, Honjo T. Discovery of activation-induced cytidine deaminase, the engraver of antibody memory. Advances in immunology. 2007;94: Casali P, Pal Z, Xu Z, Zan H. DNA repair in antibody somatic hypermutation. Trends in immunology. Jul 2006;27(7): Neuberger MS, Di Noia JM, Beale RC, Williams GT, Yang Z, Rada C. Somatic hypermutation at A.T pairs: polymerase error versus dutp incorporation. Nature reviews. Immunology. Feb 2005;5(2): Allman D, Pillai S. Peripheral B cell subsets. Current opinion in immunology. Apr 2008;20(2): Genestier L, Taillardet M, Mondiere P, Gheit H, Bella C, Defrance T. TLR agonists selectively promote terminal plasma cell differentiation of B cell subsets specialized in thymus-independent responses. J Immunol. Jun ;178(12): Martin F, Kearney JF. B-cell subsets and the mature preimmune repertoire. Marginal zone and B1 B cells as part of a "natural immune memory". Immunological reviews. Jun 2000;175:

122 63. Zinkernagel RM, Ehl S, Aichele P, Oehen S, Kundig T, Hengartner H. Antigen localisation regulates immune responses in a dose- and time-dependent fashion: a geographical view of immune reactivity. Immunological reviews. Apr 1997;156: Boes M, Schmidt T, Linkemann K, Beaudette BC, Marshak-Rothstein A, Chen J. Accelerated development of IgG autoantibodies and autoimmune disease in the absence of secreted IgM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Feb ;97(3): Martin F, Oliver AM, Kearney JF. Marginal zone and B1 B cells unite in the early response against T-independent blood-borne particulate antigens. Immunity. May 2001;14(5): Milner EC, Anolik J, Cappione A, Sanz I. Human innate B cells: a link between host defense and autoimmunity? Springer seminars in immunopathology. Mar 2005;26(4): Griffin DO, Holodick NE, Rothstein TL. Human B1 cells in umbilical cord and adult peripheral blood express the novel phenotype CD20+ CD27+ CD43+ CD70. The Journal of experimental medicine. Jan ;208(1): Hardy RR. B-1 B cell development. J Immunol. Sep ;177(5): Spencer J, Perry ME, Dunn-Walters DK. Human marginal-zone B cells. Immunology today. Sep 1998;19(9): Oliver AM, Martin F, Kearney JF. IgMhighCD21high lymphocytes enriched in the splenic marginal zone generate effector cells more rapidly than the bulk of follicular B cells. J Immunol. Jun ;162(12): Timens W, Boes A, Poppema S. Human marginal zone B cells are not an activated B cell subset: strong expression of CD21 as a putative mediator for rapid B cell activation. European journal of immunology. Nov 1989;19(11): Zandvoort A, Timens W. The dual function of the splenic marginal zone: essential for initiation of anti-ti-2 responses but also vital in the general firstline defense against blood-borne antigens. Clinical and experimental immunology. Oct 2002;130(1): Weller S, Braun MC, Tan BK, et al. Human blood IgM "memory" B cells are circulating splenic marginal zone B cells harboring a prediversified immunoglobulin repertoire. Blood. Dec ;104(12): Weller S, Faili A, Garcia C, et al. CD40-CD40L independent Ig gene hypermutation suggests a second B cell diversification pathway in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jan ;98(3): Tanigaki K, Han H, Yamamoto N, et al. Notch-RBP-J signaling is involved in cell fate determination of marginal zone B cells. Nature immunology. May 2002;3(5):

123 76. DiRaimondo F, Albitar M, Huh Y, et al. The clinical and diagnostic relevance of CD23 expression in the chronic lymphoproliferative disease. Cancer. Mar ;94(6): Matutes E, Owusu-Ankomah K, Morilla R, et al. The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K. Oct 1994;8(10): Matutes E, Polliack A. Morphological and immunophenotypic features of chronic lymphocytic leukemia. Reviews in clinical and experimental hematology. Mar 2000;4(1): Moreau EJ, Matutes E, A'Hern RP, et al. Improvement of the chronic lymphocytic leukemia scoring system with the monoclonal antibody SN8 (CD79b). American journal of clinical pathology. Oct 1997;108(4): Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Chronic lymphocytic leukemia. The New England journal of medicine. Feb ;352(8): Fais F, Ghiotto F, Hashimoto S, et al. Chronic lymphocytic leukemia B cells express restricted sets of mutated and unmutated antigen receptors. The Journal of clinical investigation. Oct ;102(8): Linet MS, Schubauer-Berigan MK, Weisenburger DD, et al. Chronic lymphocytic leukaemia: an overview of aetiology in light of recent developments in classification and pathogenesis. British journal of haematology. Dec 2007;139(5): Dicker F, Schnittger S, Haferlach T, Kern W, Schoch C. Immunostimulatory oligonucleotide-induced metaphase cytogenetics detect chromosomal aberrations in 80% of CLL patients: A study of 132 CLL cases with correlation to FISH, IgVH status, and CD38 expression. Blood. Nov ;108(9): AbdelSalam M, El Sissy A, Samra MA, Ibrahim S, El Markaby D, Gadallah F. The impact of trisomy 12, retinoblastoma gene and P53 in prognosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia. Hematology. Jun 2008;13(3): Mehes G. Chromosome abnormalities with prognostic impact in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Pathology oncology research : POR. 2005;11(4): Nicoloso MS, Kipps TJ, Croce CM, Calin GA. MicroRNAs in the pathogeny of chronic lymphocytic leukaemia. British journal of haematology. Dec 2007;139(5): Calin GA, Ferracin M, Cimmino A, et al. A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. The New England journal of medicine. Oct ;353(17): Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and downregulation of micro- RNA genes mir15 and mir16 at 13q14 in chronic 123

124 lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Nov ;99(24): Damle RN, Ghiotto F, Valetto A, et al. B-cell chronic lymphocytic leukemia cells express a surface membrane phenotype of activated, antigenexperienced B lymphocytes. Blood. Jun ;99(11): Klein U, Tu Y, Stolovitzky GA, et al. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. The Journal of experimental medicine. Dec ;194(11): Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, et al. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. The Journal of experimental medicine. Dec ;194(11): Chu CC, Catera R, Hatzi K, et al. Chronic lymphocytic leukemia antibodies with a common stereotypic rearrangement recognize nonmuscle myosin heavy chain IIA. Blood. Dec ;112(13): Chu CC, Catera R, Zhang L, et al. Many chronic lymphocytic leukemia antibodies recognize apoptotic cells with exposed nonmuscle myosin heavy chain IIA: implications for patient outcome and cell of origin. Blood. May ;115(19): Hatzi K CR, Ferrarini M, et al. B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells express antibodies reactive with antigenic epitopes expressed on the surface of common bacteria. Blood. 2006;108.(11.):12a-12a. 95. Hivroz C, Geny B, Brouet JC, Grillot-Courvalin C. Altered signal transduction secondary to surface IgM cross-linking on B-chronic lymphocytic leukemia cells. Differential activation of the phosphatidylinositol-specific phospholipase C. J Immunol. Mar ;144(6): Michel F, Merle-Beral H, Legac E, Michel A, Debre P, Bismuth G. Defective calcium response in B-chronic lymphocytic leukemia cells. Alteration of early protein tyrosine phosphorylation and of the mechanism responsible for cell calcium influx. J Immunol. Apr ;150(8 Pt 1): Semichon M, Merle-Beral H, Lang V, Bismuth G. Normal Syk protein level but abnormal tyrosine phosphorylation in B-CLL cells. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K. Nov 1997;11(11): Chen L, Widhopf G, Huynh L, et al. Expression of ZAP-70 is associated with increased B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Blood. Dec ;100(13): Lanham S, Hamblin T, Oscier D, Ibbotson R, Stevenson F, Packham G. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational 124

125 status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. Feb ;101(3): Gobessi S, Laurenti L, Longo PG, Sica S, Leone G, Efremov DG. ZAP-70 enhances B-cell-receptor signaling despite absent or inefficient tyrosine kinase activation in chronic lymphocytic leukemia and lymphoma B cells. Blood. Mar ;109(5): Petlickovski A, Laurenti L, Li X, et al. Sustained signaling through the B-cell receptor induces Mcl-1 and promotes survival of chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood. Jun ;105(12): Healy JI, Dolmetsch RE, Timmerman LA, et al. Different nuclear signals are activated by the B cell receptor during positive versus negative signaling. Immunity. Apr 1997;6(4): Muzio M, Apollonio B, Scielzo C, et al. Constitutive activation of distinct BCR-signaling pathways in a subset of CLL patients: a molecular signature of anergy. Blood. Jul ;112(1): Mockridge CI, Potter KN, Wheatley I, Neville LA, Packham G, Stevenson FK. Reversible anergy of sigm-mediated signaling in the two subsets of CLL defined by VH-gene mutational status. Blood. May ;109(10): Stevenson FK, Krysov S, Davies AJ, Steele AJ, Packham G. B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Blood. Oct ;118(16): Chiorazzi N, Ferrarini M. B cell chronic lymphocytic leukemia: lessons learned from studies of the B cell antigen receptor. Annual review of immunology. 2003;21: Ghia P, Stamatopoulos K, Belessi C, et al. Geographic patterns and pathogenetic implications of IGHV gene usage in chronic lymphocytic leukemia: the lesson of the IGHV3-21 gene. Blood. Feb ;105(4): Ghiotto F, Fais F, Valetto A, et al. Remarkably similar antigen receptors among a subset of patients with chronic lymphocytic leukemia. The Journal of clinical investigation. Apr 2004;113(7): Messmer BT, Albesiano E, Efremov DG, et al. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia. The Journal of experimental medicine. Aug ;200(4): Stamatopoulos K, Belessi C, Moreno C, et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. Jan ;109(1): Thorselius M, Krober A, Murray F, et al. Strikingly homologous immunoglobulin gene rearrangements and poor outcome in VH3-21-using 125

126 chronic lymphocytic leukemia patients independent of geographic origin and mutational status. Blood. Apr ;107(7): Tobin G, Thunberg U, Johnson A, et al. Chronic lymphocytic leukemias utilizing the VH3-21 gene display highly restricted Vlambda2-14 gene use and homologous CDR3s: implicating recognition of a common antigen epitope. Blood. Jun ;101(12): Tobin G, Thunberg U, Johnson A, et al. Somatically mutated Ig V(H)3-21 genes characterize a new subset of chronic lymphocytic leukemia. Blood. Mar ;99(6): Tobin G, Thunberg U, Karlsson K, et al. Subsets with restricted immunoglobulin gene rearrangement features indicate a role for antigen selection in the development of chronic lymphocytic leukemia. Blood. Nov ;104(9): Widhopf GF, 2nd, Kipps TJ. Normal B cells express 51p1-encoded Ig heavy chains that are distinct from those expressed by chronic lymphocytic leukemia B cells. J Immunol. Jan ;166(1): Widhopf GF, 2nd, Rassenti LZ, Toy TL, Gribben JG, Wierda WG, Kipps TJ. Chronic lymphocytic leukemia B cells of more than 1% of patients express virtually identical immunoglobulins. Blood. Oct ;104(8): Bomben R, Dal Bo M, Capello D, et al. Molecular and clinical features of chronic lymphocytic leukaemia with stereotyped B cell receptors: results from an Italian multicentre study. British journal of haematology. Feb 2009;144(4): Darzentas N, Hadzidimitriou A, Murray F, et al. A different ontogenesis for chronic lymphocytic leukemia cases carrying stereotyped antigen receptors: molecular and computational evidence. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K. Jan 2010;24(1): Murray F, Darzentas N, Hadzidimitriou A, et al. Stereotyped patterns of somatic hypermutation in subsets of patients with chronic lymphocytic leukemia: implications for the role of antigen selection in leukemogenesis. Blood. Feb ;111(3): Dreyling M, Hiddemann W. Current treatment standards and emerging strategies in mantle cell lymphoma. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2009: Perez-Galan P, Dreyling M, Wiestner A. Mantle cell lymphoma: biology, pathogenesis, and the molecular basis of treatment in the genomic era. Blood. Jan ;117(1): Swerdlow S.H. CE H, N.L et al. WHO Classification of Tumors of Haemopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon, France: IARC Press.;

127 123. Smith MR. Mantle cell lymphoma: advances in biology and therapy. Current opinion in hematology. Jul 2008;15(4): Tsujimoto Y, Yunis J, Onorato-Showe L, Erikson J, Nowell PC, Croce CM. Molecular cloning of the chromosomal breakpoint of B-cell lymphomas and leukemias with the t(11;14) chromosome translocation. Science. Jun ;224(4656): Bosch F, Jares P, Campo E, et al. PRAD-1/cyclin D1 gene overexpression in chronic lymphoproliferative disorders: a highly specific marker of mantle cell lymphoma. Blood. Oct ;84(8): de Boer CJ, van Krieken JH, Kluin-Nelemans HC, Kluin PM, Schuuring E. Cyclin D1 messenger RNA overexpression as a marker for mantle cell lymphoma. Oncogene. May ;10(9): Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene. Nature. Apr ;350(6318): Espinet B, Salaverria I, Bea S, et al. Incidence and prognostic impact of secondary cytogenetic aberrations in a series of 145 patients with mantle cell lymphoma. Genes, chromosomes & cancer. May 2010;49(5): Jares P, Colomer D, Campo E. Genetic and molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma: perspectives for new targeted therapeutics. Nature reviews. Cancer. Oct 2007;7(10): Hartmann EM, Campo E, Wright G, et al. Pathway discovery in mantle cell lymphoma by integrated analysis of high-resolution gene expression and copy number profiling. Blood. Aug ;116(6): Fu K, Weisenburger DD, Greiner TC, et al. Cyclin D1-negative mantle cell lymphoma: a clinicopathologic study based on gene expression profiling. Blood. Dec ;106(13): Wlodarska I, Dierickx D, Vanhentenrijk V, et al. Translocations targeting CCND2, CCND3, and MYCN do occur in t(11;14)-negative mantle cell lymphomas. Blood. Jun ;111(12): Camacho FI, Algara P, Rodriguez A, et al. Molecular heterogeneity in MCL defined by the use of specific VH genes and the frequency of somatic mutations. Blood. May ;101(10): Kienle D, Krober A, Katzenberger T, et al. VH mutation status and VDJ rearrangement structure in mantle cell lymphoma: correlation with genomic aberrations, clinical characteristics, and outcome. Blood. Oct ;102(8): Orchard J, Garand R, Davis Z, et al. A subset of t(11;14) lymphoma with mantle cell features displays mutated IgVH genes and includes patients with good prognosis, nonnodal disease. Blood. Jun ;101(12): Schraders M, Oeschger S, Kluin PM, et al. Hypermutation in mantle cell lymphoma does not indicate a clinical or biological subentity. Modern 127

128 pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. Mar 2009;22(3): Thorselius M, Walsh S, Eriksson I, et al. Somatic hypermutation and V(H) gene usage in mantle cell lymphoma. European journal of haematology. Apr 2002;68(4): Walsh SH, Thorselius M, Johnson A, et al. Mutated VH genes and preferential VH3-21 use define new subsets of mantle cell lymphoma. Blood. May ;101(10): Ota T, Nei M. Divergent evolution and evolution by the birth-and-death process in the immunoglobulin VH gene family. Molecular biology and evolution. May 1994;11(3): Sitnikova T, Nei M. Evolution of immunoglobulin kappa chain variable region genes in vertebrates. Molecular biology and evolution. Jan 1998;15(1): Vargas-Madrazo E, Lara-Ochoa F, Ramirez-Benites MC, Almagro JC. Evolution of the structural repertoire of the human V(H) and Vkappa germline genes. International immunology. Dec 1997;9(12): Bhat NM, Bieber MM, Chapman CJ, Stevenson FK, Teng NN. Human antilipid A monoclonal antibodies bind to human B cells and the i antigen on cord red blood cells. J Immunol. Nov ;151(9): Silberstein LE, George A, Durdik JM, Kipps TJ. The V4-34 encoded anti-i autoantibodies recognize a large subset of human and mouse B-cells. Blood cells, molecules & diseases. 1996;22(2): Mockridge CI, Chapman CJ, Spellerberg MB, et al. Sequence analysis of V(4-34)-encoded antibodies from single B cells of two patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical and experimental immunology. Oct 1998;114(1): Clarke SH, McCray SK. VH CDR3-dependent positive selection of murine VH12-expressing B cells in the neonate. European journal of immunology. Dec 1993;23(12): Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. Sep ;94(6): Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood. Sep ;94(6): Thelander EF, Rosenquist R. Molecular genetic characterization reveals new subsets of mantle cell lymphoma. Leukemia & lymphoma. Jun 2008;49(6): Cogliatti SB, Bertoni F, Zimmermann DR, et al. IgV H mutations in blastoid mantle cell lymphoma characterize a subgroup with a tendency to more 128

129 favourable clinical outcome. The Journal of pathology. Jul 2005;206(3): Kuppers R. Mechanisms of B-cell lymphoma pathogenesis. Nature reviews. Cancer. Apr 2005;5(4): Stevenson FK, Sahota SS, Ottensmeier CH, Zhu D, Forconi F, Hamblin TJ. The occurrence and significance of V gene mutations in B cell-derived human malignancy. Advances in cancer research. 2001;83: Dunn-Walters D, Thiede C, Alpen B, Spencer J. Somatic hypermutation and B-cell lymphoma. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. Jan ;356(1405): Bikos V, Darzentas N, Hadzidimitriou A, et al. Over 30% of patients with splenic marginal zone lymphoma express the same immunoglobulin heavy variable gene: ontogenetic implications. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K. Jan Bouzourene H, Haefliger T, Delacretaz F, Saraga E. The role of Helicobacter pylori in primary gastric MALT lymphoma. Histopathology. Feb 1999;34(2): Chanudet E, Zhou Y, Bacon CM, et al. Chlamydia psittaci is variably associated with ocular adnexal MALT lymphoma in different geographical regions. The Journal of pathology. Jul 2006;209(3): Saadoun D, Suarez F, Lefrere F, et al. Splenic lymphoma with villous lymphocytes, associated with type II cryoglobulinemia and HCV infection: a new entity? Blood. Jan ;105(1): Brochet X, Lefranc MP, Giudicelli V. IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis. Nucleic acids research. Jul ;36(Web Server issue):w Giudicelli V, Duroux P, Ginestoux C, et al. IMGT/LIGM-DB, the IMGT comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences. Nucleic acids research. Jan ;34(Database issue):d Lefranc MP, Giudicelli V, Ginestoux C, et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic acids research. Jan 2009;37(Database issue):d Rogozin IB, Kolchanov NA. Somatic hypermutagenesis in immunoglobulin genes. II. Influence of neighbouring base sequences on mutagenesis. Biochimica et biophysica acta. Nov ;1171(1): Pommie C, Levadoux S, Sabatier R, Lefranc G, Lefranc MP. IMGT standardized criteria for statistical analysis of immunoglobulin V-REGION amino acid properties. Journal of molecular recognition : JMR. Jan-Feb 2004;17(1): Henikoff S, Henikoff JG. Performance evaluation of amino acid substitution matrices. Proteins. Sep 1993;17(1):

130 163. Rigoutsos I, Floratos A. Combinatorial pattern discovery in biological sequences: The TEIRESIAS algorithm. Bioinformatics. 1998;14(1): Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: a sequence logo generator. Genome research. Jun 2004;14(6): Krzywinski M, Schein J, Birol I, et al. Circos: an information aesthetic for comparative genomics. Genome research. Sep 2009;19(9): Beitz E. TEXshade: shading and labeling of multiple sequence alignments using LATEX2 epsilon. Bioinformatics. Feb 2000;16(2): Lefranc MP, Pommie C, Ruiz M, et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V- like domains. Developmental and comparative immunology. Jan 2003;27(1): Wu YC, Kipling D, Leong HS, Martin V, Ademokun AA, Dunn-Walters DK. High-throughput immunoglobulin repertoire analysis distinguishes between human IgM memory and switched memory B-cell populations. Blood. Aug ;116(7): Di Noia JM, Neuberger MS. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annual review of biochemistry. 2007;76: Berkowska MA, Driessen GJ, Bikos V, et al. Human memory B cells originate from three distinct germinal center-dependent and -independent maturation pathways. Blood. Aug ;118(8): Forconi F, Potter KN, Wheatley I, et al. The normal IGHV1-69-derived B-cell repertoire contains stereotypic patterns characteristic of unmutated CLL. Blood. Jan ;115(1): Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc MP. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. Nucleic acids research. Jan 2010;38(Database issue):d Kuroda D, Shirai H, Kobori M, Nakamura H. Structural classification of CDR- H3 revisited: a lesson in antibody modeling. Proteins. Nov ;73(3): Barrios Y, Jirholt P, Ohlin M. Length of the antibody heavy chain complementarity determining region 3 as a specificity-determining factor. Journal of molecular recognition : JMR. Jul-Aug 2004;17(4): Silverman GJ, Goodyear CS. Confounding B-cell defences: lessons from a staphylococcal superantigen. Nature reviews. Immunology. Jun 2006;6(6): Zemlin M, Klinger M, Link J, et al. Expressed murine and human CDR-H3 intervals of equal length exhibit distinct repertoires that differ in their amino acid composition and predicted range of structures. Journal of molecular biology. Dec ;334(4):

131 177. Jirholt P, Ohlin M, Borrebaeck CA, Soderlind E. Exploiting sequence space: shuffling in vivo formed complementarity determining regions into a master framework. Gene. Jul ;215(2): Scheid JF, Mouquet H, Ueberheide B, et al. Sequence and structural convergence of broad and potent HIV antibodies that mimic CD4 binding. Science. Sep ;333(6049): Jirholt P, Strandberg L, Jansson B, et al. A central core structure in an antibody variable domain determines antigen specificity. Protein engineering. Jan 2001;14(1): Johnson G, Wu TT. Preferred CDRH3 lengths for antibodies with defined specificities. International immunology. Dec 1998;10(12): Herve M, Xu K, Ng YS, et al. Unmutated and mutated chronic lymphocytic leukemias derive from self-reactive B cell precursors despite expressing different antibody reactivity. The Journal of clinical investigation. Jun 2005;115(6): Lanemo Myhrinder A, Hellqvist E, Sidorova E, et al. A new perspective: molecular motifs on oxidized LDL, apoptotic cells, and bacteria are targets for chronic lymphocytic leukemia antibodies. Blood. Apr ;111(7): Catera R, Silverman GJ, Hatzi K, et al. Chronic lymphocytic leukemia cells recognize conserved epitopes associated with apoptosis and oxidation. Mol Med. Nov-Dec 2008;14(11-12): Rossi D, Spina V, Cerri M, et al. Stereotyped B-cell receptor is an independent risk factor of chronic lymphocytic leukemia transformation to Richter syndrome. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. Jul ;15(13): Xu JL, Davis MM. Diversity in the CDR3 region of V(H) is sufficient for most antibody specificities. Immunity. Jul 2000;13(1): Mageed RA, Harmer IJ, Wynn SL, et al. Rearrangement of the human heavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generates antibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 and residues intrinsic to the heavy chain variable region. Clinical and experimental immunology. Jan 2001;123(1): Chiorazzi N, Ferrarini M. Cellular origin(s) of chronic lymphocytic leukemia: cautionary notes and additional considerations and possibilities. Blood. Feb ;117(6): Kolar GR, Mehta D, Pelayo R, Capra JD. A novel human B cell subpopulation representing the initial germinal center population to express AID. Blood. Mar ;109(6):

132 189. Lee J, Kuchen S, Fischer R, Chang S, Lipsky PE. Identification and characterization of a human CD5+ pre-naive B cell population. J Immunol. Apr ;182(7): Sims GP, Ettinger R, Shirota Y, Yarboro CH, Illei GG, Lipsky PE. Identification and characterization of circulating human transitional B cells. Blood. Jun ;105(11): Capolunghi F, Cascioli S, Giorda E, et al. CpG drives human transitional B cells to terminal differentiation and production of natural antibodies. J Immunol. Jan ;180(2):

133 Παράρτημα Πίνακας 1: Ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στη ΧΛΛ. Table 1: IGHV gene repertoire in CLL. Γονίδιο IGHV Αριθμός % IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV Γονίδιο IGHV Αριθμός % IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV4-b IGHV IGHV IGHV IGHV5-a IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV Σύνολο

134 Πίνακας 2: Λεπτομερής περιγραφή των μοριακών χαρακτηριστικών των «κύριων» υποσυνόλων στη ΧΛΛ. Table 2: Detailed outline of the molecular properties of major subsets in CLL. Αριθμός Μέγεθος Μήκος Τύπος Υποσύνολο Γονίδιο V Γονίδιο D Γονίδιο J Μοτίβο VH CDR3 περιπτώσεων (%) VH CDR3 μοτίβου # ,80 V J6 9 [AVLI]x[DE]xxxM[DE]x - # ,42 Clan I - J4 13 ARx[NQ]W[AVLI]xxxxFDx - #4 74 0,97 V4-34 διάφορα J6 20 [AVLI]RGxxxxxxx[KRH]RYYYYGx[DE]x συνδυαστικός+συνδετικός #6 68 0,90 V1-69 D3-16 J3 21 ARGGxYDY[AVLI]WGSYRxx[DE][AVLI]FDx συνδυαστικός+συνδετικός #5 53 0,70 V1-69 D3-10, D3-3 J6 20 ARxxxxxx[AVLI]xxxYYYYxMDx κυρίως συνδυαστικός #3 42 0,55 V1-69 D2-2 J6 22 Axxxxx[AVLI][AVLI]VxxAxxxxYYGMDx κυρίως συνδυαστικός #8 35 0,46 V4-39 D6-13 J5 19 AxxxxYSSSWxxxxNWFDP κυρίως συνδυαστικός # ,38 Clan III D3-3 J6 21 ARxxxxxxxxxxxxYYYxMDx κυρίως συνδυαστικός # ,34 V4-34 D2-2, D2-15 J6 24 AxRFYCxGxxCxxxxxxYYxGxDx συνδυαστικός+συνδετικός # ,33 V4-4, V4-59 διάφορα διάφορα 14 [AVLI]RGxxx[ST]GWxxxxx συνδυαστικός+συνδετικός #7C 23 0,30 V1-69 D3-3 J6 24 AxxxxxxDFW[ST]GYxxxxYYYxxDx συνδυαστικός+συνδετικός #28A 23 0,30 V1-2 διάφορα J6 17 ARxxxGxxYYYYYGMDx κυρίως συνδυαστικός # ,30 V4-34 διάφορα J3 17 ARRxxxWxxxxxDxxDx συνδυαστικός+συνδετικός # ,29 Clan I D3-3 διάφορα 12 AxxxDFWSGxxx κυρίως συνδυαστικός # ,29 V1-2, V1-46 D3-22 J4 19 ARDxxYYDSSGYY[ST]xxxDx κυρίως συνδυαστικός # ,28 V4 (V4-4) διάφορα J4 10 x[krh]ggxwxfdx συνδυαστικός+συνδετικός #64B 20 0,26 V3-48 D2 J6 21 A[KRH][DE]xx[AVLI]VVxxx[AVLI]xYYYYGMDx κυρίως συνδυαστικός # ,26 Clan I διάφορα J4 14 ARxQWLxxxxxFDx - # ,26 Clan III D4-17 J3, J4 14 A[KRH]xxxGxx[AVLI]xxxDx κυρίως συνδυαστικός 134

135 «Κυρίως συνδυαστικός» τύπος Υποσύνολο #5 Γονίδιο V V1-69 Γονίδιο D D3-10/D3-3 Γονίδιο J J6 Μεταλλακτικό φορτίο αμετάλλακτες Μήκος VH CDR3 20 αμινοξέα V1-69 N1 D3-10/D3-3 N2 J6 Υποσύνολο #3 Γονίδιο V V1-69 Γονίδιο D D2-2 Γονίδιο J J6 Μεταλλακτικό φορτίο αμετάλλακτες Μήκος VH CDR3 22 αμινοξέα V1-69 N1 D2-2 N2 J6 Υποσύνολο #8 Γονίδιο V V4-39 Γονίδιο D D6-13 Γονίδιο J J5 Μεταλλακτικό φορτίο αμετάλλακτες Μήκος VH CDR3 19 αμινοξέα V4-39 N1 D6-13 N2 J5 Πίνακας 3Α: «Στερεότυπα» υποσύνολα με αμινοξικά μοτίβα του «κυρίως συνδυαστικού» τύπου. Table 3A: Stereotyped subsets of the mostly combinatorial type. 135

136 «Συνδυαστικός+συνδετικός» τύπος Υποσύνολο #16 Γονίδιο V V4-34 Γονίδιο D D2-2/D2-15 Γονίδιο J J6 Μεταλλακτικό φορτίο μεταλλαγμένες Μήκος VH CDR3 24 αμινοξέα V4-34 N1 D2-2/D2-15 N2 J6 Υποσύνολο #77 Γονίδιο V V4-4/V4-59 Γονίδιο D διάφορα Γονίδιο J διάφορα Μεταλλακτικό φορτίο μεταλλαγμένες Μήκος VH CDR3 14 αμινοξέα V4-34/ V4-59 N1 διάφορα D N2 J6 Υποσύνολο #201 Γονίδιο V V4-34 Γονίδιο D διάφορα Γονίδιο J J3 Μεταλλακτικό φορτίο μεταλλαγμένες Μήκος VH CDR3 17 αμινοξέα V4-34 N1 διάφορα D N2 J6 Πίνακας 3Β: «Στερεότυπα» υποσύνολα με αμινοξικά μοτίβα του «συνδυαστικού+συνδετικού» τύπου. Table 3B: Stereotyped subsets of the combinatorial+junctional type. 136

137 Πίνακας 4: Ανοσογενετική περιγραφή των αναδιατάξεων του υποσυνόλου #59. Table 4: Immunogenetic outline of subset #59 rearrangements. Υποσύνολο #59 Κωδικός Μεταλλακτικό Γονίδιο V Γονίδιο D IGHD RF Γονίδιο J αναδιάταξης φορτίο CZ H IGHV1-58*01 IGHJ4*02 Μήκος VH CDR3 Αλληλουχία VH CDR3 AAGDDFWSGYys CZ H IGHV1-69*09 IGHJ4*02 ARGYDFWSGYSs FR H IGHV1-58*01 IGHJ4*02 AAGDDFWSGYsv FR H IGHV1-69*02 IGHJ5*02 ARGYDFWSGYqn GR H IGHV1-69*09 IGHJ4*02 ARaYDFWSGYYn GR H IGHV1-58*01 IGHJ4*02 AAgYDFWSGyiY GR H IGHV1-69*09 IGHJ4*02 argydfwsgysy GR H IGHV1-58*01 IGHJ4*02 AAtYDFWSGshY IT H IGHV1-58*01 IGHJ4*02 AAGpDFWSGYpY NL H IGHV1-69*02 IGHJ4*02 ARGvDFWSGYTS NY H IGHV1-69*02 IGHJ4*02 atnydfwsgypy NY H IGHV1-69*02 IGHD3-3*01 2 IGHJ4*02 12 ARAnDFWSGYgG NY H IGHV1-2*02 IGHJ4*02 ASSyDFWSGpDY NY H IGHV1-69*02 IGHJ5*02 ARGYDFWSGYSr SE H IGHV1-69*06 IGHJ4*02 asgvdfwsgygy SE H IGHV1-58*01 IGHJ5*02 AvtYDFWSGYSa UK H IGHV1-69*02 IGHJ4*03 AKnYDFWSGYSn UK H IGHV1-58*01 IGHJ4*02 AAshDFWSGYDY UK H IGHV1-58*02 IGHJ5*01 AAGYDFWSGYdY UK H IGHV1-69*04 IGHJ4*01 ASTlDFWSGhDY UK H IGHV1-69*02 IGHJ6*02 ARAYDFWSGfpv UK H IGHV1-2*02 IGHJ4*02 ARAiDFWSGYtG 137

138 Γονίδιο IGHV Αριθμός % V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V4-b V V5-a V Σύνολο Πίνακας 5: Ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στο ΛΜ. Table 5: IGHV gene repertoire in MCL. 138

139 V1-18 V1-2 V1-24 V1-3 V1- V1- V1-8 V2- V2-5 V2-70 V3-7 V3-9 V3-11 V3-13 V3-15 V3-20 V3-21 V3-23 V3-30 V3- V3-33 V3-43 V3- V3- V3-53 V3- V3- V3-72 V3-73 V3-74 V4- V4- V4-31 V4- V4- V4-4 V4- V4- V4-b V5-51 V5-a V6-1 V MCL Normal Naive Εικόνα 1: Σύγκριση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV μεταξύ ΛΜ και πληθυσμού φυσιολογικών παρθένων Β λεμφοκυττάρων (%). Figure 1: IGHV gene repertoire comparison in MCL vs. normal naïve B cells (%). 139

140 Νουκλεοτιδική Ομολογία Γονίδιο GHV 99=<GI<100 98=<GI<99 97=<GI<98 GI<97 96=<GI<97 GI<96 IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV IGHV4-b IGHV IGHV5-a IGHV Πίνακας 6: Ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV των «μεταλλαγμένων» αναδιατάξεων σε διαδοχικά υποσύνολα που διέφεραν μεταξύ τους κατά 1% στην ομολογία τους με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV. Table 6: IGHV gene repertoires of subgroups of cases differing from each other by 1% deviation from the closest germline gene. 140

141 GI=100 97=<GI<100 GI< Εικόνα 2: Σύγκριση του ρεπερτορίου των γονιδίων IGHV μεταξύ των τριών υποσυνόλων διαφορετικού μεταλλακτικού φορτίου στο ΛΜ (%). Figure 2: Comparison of the IGHV genes repertoires between the three mutational subgroups in MCL (%). 141

142 <97 97=<x< Εικόνα 3: Κατανομή των αναδιατάξεων των γονιδίων IGHV στο ΛΜ ανάλογα με το μεταλλακτικό φορτίο (%). Figure 3: Distribution of rearrangements in MCL based on IGHV gene mutational status (%). 142

143 Γονίδιο V Αριθμός αναδιατάξεων Περιοχή IGHV FR3 IGHV IGHV CDR1 Κωδικόνιο AA από 81 N 85 S 95 R AA προς Αριθμός αναδιατάξεων % αναδιατάξεων D S N T T K S T S N CDR2 57 S T FR3 72 K R T I N CDR1 36 S FR2 CDR2 40 S 55 A 57 S S H N T N T T S G V T I G D G D S T L V IGHV FR3 CDR1 FR2 FR3 101 V I L G E G D A S T N P S I M V K R S T N Πίνακας 7: «Επαναλαμβανόμενες» μεταλλάξεις στις αναδιατάξεις των τεσσάρων επικρατέστερων γονιδίων στο ΛΜ (τα κελιά των αμινοξέων χρωματίστηκαν με βάση τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες). Table 7: Recurrent mutations among rearrangements of the four predominant genes in MCL (cells representing amino acid were colored according to their physicochemical properties). 143

144 V1-18 V1-2 V1-3 V1-46 V1-69 V1-8 V2-26 V2-5 V2-70 V3-11 V3-13 V3-15 V3-20 V3-21 V3-23 V3-30 V V3-33 V3-43 V3-48 V3-49 V3-53 V3-64 V3-66 V3-7 V3-72 V3-74 V3-9 V4-31 V4-34 V4-39 V4-4 V4-59 V4-61 V4-b V5-51 V5-a V6-1 Σύνολο Ετερογενείς Επίπεδο 0 Επίπεδο 1 Επίπεδο Εικόνα 4: Ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στα υποσύνολα με «στερεότυπους» και «ετερογενείς» υποδοχείς, καθώς και στο σύνολο των αναδιατάξεων (%). Figure 4: IGHV gene repertoires in subgroups of cases with stereotyped and heterogeneous receptors, as well as at cohort level (%). 144