Παραγωγή και μελέτη μονοκλωνικών αντισωμάτων από ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία

Transcript

1 Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας Διδακτορική Διατριβή Παραγωγή και μελέτη μονοκλωνικών αντισωμάτων από ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία Μαρία Γούναρη Βιολόγος Θεσσαλονίκη 2013

2 Aristotle University of Thessaloniki Faculty of Sciences School of Biology Department of Genetics, Development and Molecular Biology Doctoral Dissertation Production and study of monoclonal antibodies from patients with Chronic Lymphocytic Leukemia Maria Gounari Biologist Thessaloniki

3 Περιεχόμενα Περιεχόμενα... 3 Πρόλογος... 7 Περίληψη... 9 Abstract Εισαγωγή Το ανοσοποιητικό σύστημα: Δομή και λειτουργία Η έμφυτη ανοσία Toll-Like υποδοχείς Επίκτητη ανοσία Αντιγόνα- Ανοσογόνα Γενικές έννοιες - Ιδιότητες των αντιγόνων Ιδιότητες των αντιγόνων Χημική φύση των ανοσογόνων Αντιγονικοί καθοριστές Αναγνώριση των αντιγονικών επιτόπων από τα λεμφοκύτταρα- Τύποι αντιγόνων Αντισώματα: δομή και λειτουργία Γενετικοι τόποι των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Μηχανισμοί δημιουργίας ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών Συνδυαστική ποικιλότητα και Ανασυνδυασμός V(D)J Συνδετική ποικιλότητα Σωματική υπερμεταλλαξιγένεση και εναλλαγή ισοτύπου Β λεμφοκύτταρα Ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων στο μυελό των οστών Αναδιατάξεις των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια Λεμφοζιδιακά Β λεμφοκύτταρα Follicular B cells B κύτταρα της οριακής ζώνης του σπληνός (Splenic Marginal Zone B cells MZ B cells) B1 κύτταρα Σηματοδότηση μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα (ΒΚΥ) Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) Γενικά... 44\ 5.2 Διάγνωση Σταδιοποίηση και πρόγνωση Κυτταρογενετικές ανωμαλίες

4 Μεταλλάξεις σε γονίδια Πρότυπο έκφρασης των microrna CD ZAP Το φορτίο των μεταλλάξεων στα γονίδια IGHV Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και στερεότυπες ανοσοσφαιρίνες στη Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία Ο ρόλος του αντιγόνου στη ΧΛΛ- Ενεργοποίηση των λευχαιμικών κυττάρων στην ΧΛΛ Αντιγόνα στη ΧΛΛ Αναγνώριση μικροβιακών αντιγόνων Αντικείμενο μελέτης Υλικά και μέθοδοι Παραγωγή υβριδωμάτων Αρχή της μεθόδου Διαδικασία παραγωγής ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων Απομόνωση μακροφάγων της περιτοναϊκής κοιλότητας ποντικού Σύντηξη ΧΛΛ Β λεμφοκυττάρων με μυελωματικά κύτταρα ποντικού Υποκλωνοποίηση των ΧΛΛ-ετεροϋβριδωμάτων για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών Όψιμο στάδιο καλλιέργειας ΧΛΛ- ετεροϋβριδωμάτων Συλλογή υπερκειμένου και επεξεργασία Κρυοδιατήρηση κυττάρων Έλεγχος παραγωγής και έκκρισης της ανοσοσφαιρίνης του λευχαιμικού κλώνου RT-PCR και ανάλυση Sequencing Δοκιμασίες ELISA Western Blot Παραγωγή ανασυνδυασμένων ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Περιγραφή των πλασμιδιακών φορέων Κλωνοποίηση με τη βοήθεια της PCR Αποφωσφορυλίωση του πλασμιδιακού DNA Σύνδεση του DNA με λιγκάση Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων με ανασυνδυασμένα πλασμίδια Παραγωγή ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων Καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων Κρυοδιατήρηση ευκαρυωτικών κυττάρων Διαμόλυνση κυττάρων ΗΕΚ Καθαρισμός των ΧΛΛ ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων

5 Ποσοτικοποίηση των ανασυνδυασμένων ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Ηλεκτροφόρηση των μονοκλωνικών αντισωμάτων σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμίδης (SDS-PAGE) Έλεγχος της ειδικότητας των μονοκλωνικών αντισωμάτων Δοκιμασίες ELISA με την χρήση εμπορικά διαθέσιμων συσκευασιών Δοκιμασίες ELISA Δοκιμασία ELISA παρεμπόδισης Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμασιών ELISA Ομάδα μελέτης Παραγωγή ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Συλλογή αλληλουχιών των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Αποτελέσματα Παραγωγή ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη μέθοδο των υβριδωμάτων Συντήξεις λευχαιμικών λεμφοκυττάρων με μυελωματικά κύτταρα ποντικού OURI Επιβεβαίωση ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων RT-PCR και Sequencing ELISA Western-blot «Επιβεβαιωμένα» ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα Συλλογή και επεξεργασία των μονοκλωνικών αντισωμάτων από τα υπερκείμενα της καλλιέργειας των ετεροϋβριδωμάτων Παραγωγή ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη μέθοδο του ανασυνδυασμένου DNA Επιβεβαίωση της παραγωγής ΧΛΛ πλασμιδίων Έλεγχος της έκφρασης ανασυνδυασμένων ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Έλεγχος αντιγονικής ειδικότητας των αντισωμάτων που προήλθαν από τα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα Υποσύνολο #13: Στερεότυποι IGHV4-59/IGKV3-20 υποδοχείς με δράση ρευματοειδούς παράγοντα Εντοπισμός και συχνότητα του υποσυνόλου #13 στην ΧΛΛ Εντοπισμός του στερεότυπου Β κυτταρικού υποδοχέα του υποσυνόλου #13 και σε άλλες Β λεμφοϋπερπλασίες Σύγκριση των αλληλουχιών του υποσυνόλου #13 με αλληλουχίες διαθέσιμες στα συνεργαζόμενα ινστιτούτα Σύγκριση των αλληλουχιών του υποσυνόλου #13 με αλληλουχίες από δημόσιες τράπεζες αλληλουχιών Χαρακτηριστικά των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών του υποσυνόλου # Ανάλυση της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης

6 4.4 Λειτουργικές δοκιμές του διαλυτού Β κυτταρικού υποδοχέα από έναν ασθενή του υποσυνόλου #13: Απόδειξη δράσης ρευματοειδούς παράγοντα Έλεγχος αντιγονικής ειδικότητας των ανασυνδυασμένων αντισωμάτων Σύγκριση αντισωμάτων που προήλθαν από τις δυο τεχνικές Στερεότυπο υποσύνολο # Στερεότυπο υποσύνολο # Στερεότυπο υποσύνολο # Στερεότυπο υποσύνολο # Στερεότυπα υποσύνολα #8 και # Στερεότυπο υποσύνολο # Στερεότυπα υποσύνολα #37, #59 και ετερογενείς περιπτώσεις Στερεότυπο υποσύνολο # Συζήτηση Εφαρμογή της τεχνολογίας των υβριδωμάτων και του ανασυνδυασμένου DNA στη μελέτη του Β κυτταρικού υποδοχέα στη ΧΛΛ Αντιπαραβολή των τεχνικών παραγωγής ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Αντιγονική διέγερση Γενικές παρατηρήσεις Πολυαντιδραστικότητα Στερεότυπη αντιγονική διέγερση Ο ρόλος της ελαφριάς αλυσίδας Στερεότυπο υποσύνολο #1 και αντιγονική διέγερση Στερεότυπο υποσύνολο #2 και αντιγονική διέγερση Στερεότυπο υποσύνολο #4 και αντιγονική διέγερση Στερεότυποι υποδοχείς IGHV4-59/IGKV3-20 στην ΧΛΛ και άλλες λεμφοϋπερπλασίες: ανοσοπαθογενετικές συσχετίσεις Στερεότυπο υποσύνολο #8: η εξαιρετική πολυαντιδραστικότητα οδηγεί στην κλινική επιθετικότητα; Βιβλιογραφία Παράρτημα

7 Πρόλογος Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) χαρακτηρίζεται από την παρουσία υποσυνόλων ασθενών που εκφράζουν στερεότυπους Β κυτταρικούς υποδοχείς (ΒCRs). Η στερεοτυπία των Β υποδοχέων αποτελεί ισχυρή ένδειξη επιλογής από κάποιο(α) άγνωστο(α) αντιγόνο(α). Έτσι, ανακύπτουν ερωτήματα σχετικά με το ρόλο της διέγερσης από αντιγόνο στην παθογένεια της ΧΛΛ τα οποία αναμένεται να διαλευκανθούν μέσω της μελέτης και του προσδιορισμού της αντιγονικής ειδικότητας των BCRs. Τα λευχαιμικά λεμφοκύτταρα χαρακτηρίζονται από περιορισμένη ικανότητα ανάπτυξης in vitro και χαμηλά επίπεδα επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης. Προκειμένου να ξεπεραστούν τα παραπάνω προβλήματα, στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνολογίες των υβριδωμάτων και του ανασυνδυασμένου DNA με σκοπό την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων από τα ΧΛΛ κύτταρα ασθενών. Κατόπιν, διενεργήθηκε λεπτομερής έλεγχος για το χαρακτηρισμό της αντιγονικής ειδικότητά τους. Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε υπό την επίβλεψη της κας. Αναστασίας Κουβάτση, Αναπληρώτριας Καθηγήτριας του Τομέα Γενετικής, Ανάπτυξης και μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ), την οποία ευχαριστώ θερμά για τη δυνατότητα που μου έδωσε να εκπονήσω τη διδακτορική διατριβή μου, καθώς και για την πολύπλευρη συμπαράσταση που μου παρείχε σε όλες τις φάσεις εκπόνησης της διατριβής. Επίσης ευχαριστώ θερμά τους κ.κ Μηνά Γιάγκου και Μηνά Αρσενάκη, Καθηγητές του Τομέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ για την καθοδήγηση και την υποστήριξή τους ως μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής της διδακτορική διατριβής. Το εργαστηριακό μέρος της διδακτορικής διατριβής εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας της Αιματολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταμόσχευσης Αιμοποιητικών Κυττάρων του ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου» κατά το χρονικό διάστημα καθώς και στο Εργαστήριο Αιματολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Vita Salute San Raffaele του Μιλάνο κατά το χρονικό διάστημα Επιθυμώ να ευχαριστήσω θερμά τους διευθυντές των δυο κλινικών κ.κ. Αχιλλέα Αναγνωστόπουλο και Federico Caligaris Cappio για το ενδιαφέρον και την στήριξή τους. Η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής θα ήταν αδύνατη χωρίς τη βοήθεια του κ. Κώστα Σταματόπουλου, Αιματολόγου, Επιμελητή και Υπεύθυνου του Εργαστηρίου Κυτταρικής και Μοριακής Βιολογίας. Κυρίως επιθυμώ να τον ευχαριστήσω για τη συμβολή του στην απόκτηση γνώσεων και εμπειρίας καθώς και για την υπομονή του, μέσα από την 7

8 καθημερινή μας συνεργασία από το 2005, οπότε και έγινα μέλος της επιστημονικής ομάδας στην οποία προΐσταται. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Paolo Ghia, Αιματολόγο- Καθηγητή του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Vita Salute San Raffaele του Μιλάνο για την άριστη συνεργασία μας, τις υποδείξεις του σε όλες τις φάσεις της παρούσας διδακτορικής εργασίας και τη στήριξη που μου παρείχε καθόλη τη διάρκεια παραμονής μου στο εργαστήριο του. Παράλληλα, αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω θερμά την κα. Χρυσούλα Μπέλεση, Βιοπαθολόγο, Διευθύντρια στο Αιματολογικό Τμήμα του ΓΝ Νίκαιας, η οποία με τη μεγάλη εργαστηριακή εμπειρία της συνέβαλε στο σχεδιασμό της μελέτης. Η βιοπληροφορική επεξεργασία και ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε στο τμήμα Βιοπληροφορικής Επεξεργασίας, του Ινστιτούτου Αγροβιοτεχνολογίας, του Εθνικού Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ,CERTH). Αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω τον κ. Αθανάσιο Τσαυτάρη, Διευθυντή του Ινστιτούτο Αγροβιοτεχνολογίας και Καθηγητή του Τομέα Φυτών Μεγάλης Καλλιέργειας και Οικολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, για τη στήριξη που μου παρείχε κατά τη διάρκεια της συνεργασίας μας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους συνεργάτες της επιστημονικής ομάδας και φίλους μου Δρ. Έφη Κωσταρέλη, Ανδρεά Αγαθαγγελίδη, Σταυρούλα Ντούφα, Νίκο Παπακωνσταντίονου, Βασίλη Μπίκο, Αναστασία Χατζηδημητρίου, Benedetta Apollonio και Eleonora Fonte για τη στήριξή τους, τις συζητήσεις και τα επιστημονικά όνειρα που φτιάξαμε μαζί. Τέλος, θέλω να εκφράσω την αγάπη και ευγνωμοσύνη μου στους ανθρώπους του στενού μου περιβάλλοντος. Στην οικογένειά μου και τους φίλους μου που με αγαπούν και με στηρίζουν χωρίς κούραση και μου παρέχουν ανιδιοτελή αγάπη, κατανόηση και ουσιαστική συμπαράσταση σε οτιδήποτε επιχειρώ. Θεσσαλονίκη Σεπτέμβριος

9 Περίληψη Στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ), η ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με ομόλογους («στερεότυπους») Β κυτταρικούς υποδοχείς (ΒΚΥ) υποστηρίζει το ρόλο της αντιγονικής διέγερσης στην ανάπτυξη της νόσου. Το εμπλεκόμενο(α) αντιγόνο(α) αλλά και οι λειτουργικές συνέπειες της επιλογής παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστα. Συνεπώς, γίνεται κρίσιμη η ανάλυση των ΒΚΥ από άποψη ειδικότητας και συγγένειας. Στην παρούσα μελέτη, ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα παράχθηκαν με την τεχνολογία των υβριδωμάτων και του ανασυνδυασμένου DNA και εξετάστηκαν εναντίον κοινών (αυτό)αντιγόνων. Ο χαρακτηρισμός των αντιγόνων που αναγνωρίστηκαν από τον κακοήθη κλώνο υποστηρίζει την ιδέα ότι κάθε στερεότυπο υποσύνολο στη ΧΛΛ μπορεί να συνδέεται με συγκεκριμένους τύπους αντιγονικού ερεθίσματος. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασαν τα ευρήματα που αφορούσαν τους ΒΚΥ των στερεότυπων υποσυνόλων #13 και #8. Στερεότυπο υποσύνολο #13 Μέσω ανοσογενετικών αναλύσεων εντοπίσαμε 12 ΧΛΛ περιπτώσεις που έφεραν μεταλλαγμένες, στερεότυπες αναδιατάξεις IGHV4-59/IGHD2-15/IGHJ2 των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών, οι οποίες είχαν αρχικά περιγραφεί ως στερεότυπο υποσύνολο #13. Οι αναδιατάξεις του υποσυνόλου #13 έφεραν στερεότυπες σωματικές μεταλλάξεις, ισχυρή ένδειξη επιλογής από αντιγόνο. Επιπλέον δυο ασθενείς με άτυπη ΧΛΛ, ένας ασθενής με Σπληνικό Λέμφωμα της Οριακής Ζώνης και μια περίπτωση μονοκλωνικής Β λεμφοκυττάρωσης βρέθηκαν να εκφράζουν τον στερεότυπο ΒΚΥ του υποσυνόλου #13. Η σύγκριση των αλληλουχιών με αντίστοιχες αλληλουχίες από δημόσιες τράπεζες αποκάλυψε περαιτέρω ομοιότητες με (i) ένα ρευματοειδή παράγοντα από υγιή δότη, (ii) έναν κλωνοτυπικό υποδοχέα από ασθενή με ΧΛΛ, με ιστορικό μικτής κρυοσφαιριναιμίας τύπου ΙΙ (ΜΚΤΙΙ) και θετικότητα για anti-hcv (Hepatitis C Virus - HCV) αντισώματα και (iii) τις κλωνοτυπικές αλληλουχίες δύο ασθενών με μυοεπιθηλιακή σιελαδενίτιδα που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο συνδρόμου Sjögren (Sjögren's syndrome-associated myoepithelial sialadenitis, SS-MESA). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι για το πρωτοπαθές σύνδρομο Sjögren έχουν δημοσιευτεί σημαντικές ανοσογενετικές ομοιότητες με την ΜΚΤΙΙ η οποία αποδίδεται αιτιολογικά στον HCV. Επιπλέον, 3 από τους 8 ασθενείς του υποσυνόλου #13 για τις οποίες υπήρχαν διαθέσιμες πληροφορίες ήταν θετικοί για αντι-hcv αντισώματα στον ορό. 9

10 Με βάση τα παραπάνω ευρήματα, αποφασίσαμε να ελέγξουμε την αντιγονική ειδικότητα της μονοκλωνικής ανοσοσσφαιρίνης του υποσυνόλου #13. Προχωρήσαμε στην παραγωγή ετεροϋβριδωμάτων από Β λευχαιμικά κύτταρα ενός ασθενούς του υποσυνόλου #13 και αποκαλύφθηκε ότι η εκκρινόμενη νοσοειδική ανοσοσφαιρίνη IgM έχει ισχυρή δράση ρευματοειδούς παράγοντα, ενώ δεν αντιδρούσε με αντιγόνα του ιού HCV, όπως συμβαίνει και με την μονοκλωνικη ανοσοσφαιρίνη IgM με δράση ρευματοειδούς παράγοντα (ΡΠ) στην ΜΚΤ ΙΙ, όπου η αντι-hcv αντιδραστικότητα μεσολαβείται από πολυκλωνικές IgG ανοσοσφαιρίνες που σχηματίζουν ανοσοσυμπλέγματα με τον μονοκλωνικό ΡΠ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία αποδεικνύουμε δράση ΡΠ για ένα υποσύνολο διακριτών υποδοχέων που εντοπίστηκαν σε ευρύ φάσμα Β λεμφοϋπερπλαστικών διαταραχών, συμπεριλαμβανομένης της ΧΛΛ και υποδεικνύουν την ύπαρξη μηχανισμών διασταυρούμενης αντιδραστικότητας ή μοριακού μιμητισμού των αντιγονικών στοιχείων που επιλέγουν τα πρόδρομα κακοήθη κύτταρα και οδηγούν σε ετερογενείς αλλά συναφείς κλινικές οντότητες. Στερεότυπο υποσύνολο #8 Το στερεότυπο υποσύνολο #8 χαρακτηρίζεται από την έκφραση αμετάλλακτων στερεότυπων υποδοχέων IGHV4-39/IGKV1(D)-39, ισοτύπου IgG. Οι ασθενείς του υποσυνόλου #8 παρουσιάζουν επιθετική κλινική πορεία και την υψηλότερη καταγεγραμμένη πιθανότητα μετατροπής της ΧΛΛ σε επιθετικό λέμφωμα (σύνδρομο Richter). Με σκοπό να διαλευκάνουμε τη βιολογική βάση της επιθετικής συμπεριφοράς του υποσυνόλου #8, μελέτησαμε το πρότυπο της αντιγονικής αναγνώρισης των mabs του υποσυνόλου σε σύγκριση με το αντίστοιχο πρότυπο των mabs άλλων στερεότυπων υποσυνόλων είτε καλής πρόγνωσης (στερεότυπο υποσύνολο #4) είτε κακής πρόγνωσης (στερεότυπα υποσύνολα #1 και #2). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοανίχνευσης τύπου ELISA όπου τα ΧΛΛ αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενή αντισώματα. Ως αντιγόνα επικάλυψης επιλέχθηκαν αντιπρόσωποι των κυριότερων τάξεων των ήδη καθιερωμένων αντιγόνωνστόχων για την ΧΛΛ. Ειδικότερα ελέγχθηκε η αντιδραστικότητα έναντι βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών, δίκλωνου DNA, BSA και νέο-αντιγόνων που παράγονται σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες. 10

11 Τα μονοκλωνικά αντισώματα του υποσυνόλου #8 παρουσίασαν έντονη πολυαντιδραστικότητα καθώς αναγνώρισαν όλα τα αντιγόνα του πάνελ. Το προφίλ της αντιγονικής αναγνώρισης των αντισωμάτων του υποσυνόλου #8 συνδέει την έντονη πολυαντιδραστικότητα των αντισωμάτων του υποσυνόλου με την κλινική επιθετικότητα. Πιθανόν, η απεριόριστη ικανότητα απόκρισης στα πολλαπλά ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος μπορεί να διεγείρει συνεχώς τα λευχαιμικά κύτταρα καθ όλη τη διάρκεια της φυσικής ιστορίας της νόσου οδηγώντας στην προοδευτική επιλογή των πιο επιθετικών κλώνων. 11

12 Abstract In chronic lymphocytic leukemia (CLL), the existence of subsets of cases with closely homologous ( stereotyped ) B-cell receptors (BCRs) supports a role for antigen in driving the cell of origin, at least for subsets of cases. The implicated antigen(s) as well as the functional consequences of antigen recognition remain largely unknown. Therefore, it becomes crucial to analyze the BCRs in terms of specificity and affinity. In the present study, CLL monoclonal antibodies produced using hybridomas technology and recombinant DNA technology were tested against common (auto)antigens. Characterization of the antigens recognized by the malignant clone supports the notion that each stereotyped subset in CLL may be associated with certain types of antigenic stimuli. Particularly interesting were the findings regarding the BcRs of stereotyped subsets #13 and #8. Stereotyped subset #13 Through an immunogenetic approach we identified 12 cases mutated, stereotyped IGHV4-59/IGKV3-20 rearrangements of the immunoglobulin genes, initially described as subset #13. All rearrangements carried stereotyped somatic mutation within their immunoglobulin genes, strong evidence for antigen selection. In addition, two cases each with atypical CLL, one case with splenic marginal-zone lymphoma and one case with monoclonal B lymphocytosis from our groups were found to carry BcR homologous to subset #13. Public-database searches revealed sequence homology with a rheumatoid factor (RF) from a healthy individual, a CLL case with prior HCV-associated type-ii mixed cryoglobulinemia (HCV/MC-II) and two cases with Sjögren's syndromeassociated myoepithelial sialadenitis (SS-MESA). Interestingly, remarkable immunogenetic similarities to HCV-associated MC-II have been reported for primary Sjögren's syndrome. In addition, 3/8 of our cases with available data had positive hepatitis C virus (HCV) serology. In this context, we proceeded in testing the antigen specificity of subset #13 monoclonal immunoglobulin. By establishing heterohybridomas from a subset #13 CLL case, it was shown that the secreted, subset #13 - specific IgM has strong rheumatoid factor (RF) activity yet is not HCVreactive, similar to the monoclonal IgM RF in HCV/MC-II, where anti-hcv reactivity is mediated by polyclonal IgG forming immune complexes with the non-hcv-reactive monoclonal RF. 12

13 In conclusion, in the present study, we demonstrate the existence of RF with restricted immunoglobulin gene sequences in various conditions including CLL, alluding to crossreactivity or molecular mimicry of the antigenic elements selecting the clonogenic progenitors yet resulting in distinct pathological conditions. Stereotyped subset #8 Stereotyped subset #8 is defined by the expression of unmutated, IgG-switched IGHV4-39/IGKV1(D)-39 BcRs. Subset #8 patients experience aggressive clinical courses and exhibit the highest risk for Richter s transformation (RT) among all CLL. In order to obtain biological insight into the underlying reasons for this behavior, we profiled the antigen reactivity of subset #8 vs. other stereotyped subsets, both good (stereotyped subset #4) and bad prognosis (stereotyped subsets #1 and #2). The CLL monoclonal antibodies were used as primary antibodies in ELISA assays against antigens which are representatives of the major classes of established antigenic targets for CLL, namely molecular structures on microbial pathogens, autoantigens and neo-epitopes created by chemical modifications during apoptosis. Subset #8 CLL monoclonal antibodies exhibited broad polyreactivity as they bound to all antigens tested, in clear contrast with the mabs from all other stereotyped subsets and links promiscuous antigen reactivity of this distinct subset with clinical aggressiveness. An unlimited capacity to respond to multiple immune/inflammatory stimuli present in the microenvironment may elicit unabated stimulation thoughout the natural history of these patients, leading to progressive selection of the more aggressive clonal variants. 13

14 Εισαγωγή 14

15 1. Το ανοσοποιητικό σύστημα: Δομή και λειτουργία Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ένα σύστημα οργάνων και ιστών υπεύθυνο για την άμυνα του οργανισμού. Είναι ένα εξαιρετικά σύνθετο δίκτυο που εκτείνεται σε όλο το σώμα και είναι σε θέση να αναγνωρίσει και να υπερασπίσει τον οργανισμό ενάντια σε θεωρητικά άπειρες προκλήσεις, τόσο εξωγενείς (παθογόνοι μικροοργανισμοί, τοξίνες εντόμων και βακτηρίων) όσο και ενδογενείς (αποπτωτικά κύτταρα, καρκινικά κύτταρα). Η συνδυασμένη αντίδραση των στοιχείων του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι των παθογόνων παραγόντων με σκοπό την εξάλειψή τους αποτελεί την ανοσοαπόκριση. Οι ανοσοαποκρίσεις εμπίπτουν σε δύο κατηγορίες: έμφυτες ή φυσικές και επίκτητες ή ειδικές. Σε μια ειδική ανοσοαπόκριση, ένα ξένο αντιγόνο επάγει την κλωνική επέκταση ενός υποσυνόλου κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος που αναγνωρίζουν και εξαλείφουν τον «εισβολέα», ενώ παράλληλα δημιουργούν άνοση μνήμη που προστατεύει τον οργανισμό από μελλοντική λοίμωξη από το ίδιο παθογόνο. Η έμφυτη ανοσία προστατεύει τον οργανισμό από τους εισβολείς μέσω ενός πιο γενικευμένου συστήματος αναγνώρισης, χωρίς να παράγει άνοση μνήμη 1. Η έμφυτη και η ειδική ανοσία χρησιμοποιούν διαφορετικούς μηχανισμούς και υποδοχείς για την αναγνώριση και την εξάλειψη των παθογόνων αλλά και οι δύο εξαρτώνται από τις ιδιότητες και τις λειτουργίες των λευκοκυττάρων. Στην έμφυτη ή φυσική ανοσία κεντρικό ρόλο διαδραματίζουν τα φαγοκύτταρα (μονοκύτταρα, μακροφάγα, ουδετερόφιλα), ενώ η επίκτητη ή ειδική ανοσία διεκπεραιώνεται από τα Τ και Β λεμφοκύτταρα 2,3. Μετά τη γέννηση, τα λευκοκύτταρα παράγονται στο μυελό των οστών από πολυδύναμα στελεχιαία κύτταρα και περιλαμβάνουν τα κύτταρα της μυελικής σειράς (μονοκύτταρα/μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και βασεόφιλα) και τα κύτταρα της λεμφικής σειράς (Β-λεμφοκύτταρα, Τ-λεμφοκύτταρα και κυτταροκτόνα κύτταρα - natural killer cells, ΝΚ) (Εικόνα 1). Η ανάπτυξη κάθε τύπου λευκοκυττάρου από τα πολυδύναμα στελεχιαία κύτταρα ελέγχεται με μεγάλη ακρίβεια με τη συμμετοχή ειδικών αυξητικών παραγόντων όπως οι κυτοκίνες 3. Τα Τ και τα Β λεμφοκύτταρα που είναι υπεύθυνα για την ειδική ανοσία καθώς και τα ΝΚ κύτταρα τα οποία είναι εγγενώς κυτταροτοξικά ενάντια σε καρκινικά κύτταρα και κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιούς φιλοξενούνται στα όργανα του λεμφικού συστήματος 4. Πρωτογενή λεμφικά όργανα είναι ο μυελός των οστών και ο θύμος αδένας και δευτερογενή οι λεμφαδένες, ο σπλήνας, ο διάχυτος λεμφικός ιστός στο αίμα, οι λεμφικοί ιστοί των 15

16 βλεννογόνων (mucosa associated lymphoid tissue, MALT), οι αμυγδαλές, τα λεμφογάγγλια και οι πλάκες Payer 3. Εικόνα 1. Ανάπτυξη κυττάρων της λεμφικής και της μυελικής σειράς από πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα. Figure 1. Development of myeloid and lymphoid cell lines from multipotent hematopoietic stem cells Η έμφυτη ανοσία Η έμφυτη ή φυσική ανοσία είναι η πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού έναντι κάθε είδους λοιμώξεων. Συνίσταται από ποικιλία αμυντικών μηχανισμών που περιλαμβάνουν ανατομικούς φραγμούς (δέρμα, βλεννογόνοι, κροσσωτό επιθήλιο της αναπνευστικής οδού), φυσιολογικούς φραγμούς (θερμοκρασία, ph,) και βιοχημικούς φραγμούς (λυσοζύμη στο σίελο, τον ιδρώτα και τα δάκρυα, ιντερφερόνη, συμπλήρωμα, λιπαρά οξέα κ.ά.). Επιπλέον στην έμφυτη ανοσία περιλαμβάνονται οι μηχανισμοί φαγοκυττάρωσης που μεσολαβούνται από τα πολυμορφοπύρηνα και τα μακροφάγα κύτταρα, η δράση των NΚ κυττάρων και η φλεγμονώδης αντίδραση 2. Οι δραστικοί μηχανισμοί της έμφυτης ανοσίας ρυθμίζονται από ένα περιορισμένο ρεπερτόριο υποδοχέων των οποίων η έκφραση και η ειδικότητα καθορίζονται γενετικά. Οι υποδοχείς αυτοί ονομάζονται υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (pattern recognition receptors - PRRs), εκφράζονται σε ποικιλία διαφορετικών κυττάρων και αναγνωρίζουν οντογενετικά συντηρημένες μοριακές δομές των μικροοργανισμών, παθογόνων και μη 16

17 παθογόνων, γνωστές ως μοριακά πρότυπα συνδεόμενα με την παθογένεια (pathogenassociated molecular patterns, PAMPs) ή μοριακά πρότυπα συνδεόμενα με μικρόβια (microbe-associated molecular patterns - MAMPs) 5,6. Οι PAMPs είναι εξελικτικά πολύ σταθερά μόρια και σαφώς διακριτά από τα μόρια του ξενιστή. Στους PAMPs ανήκουν ποικίλα συστατικά όπως λιποπολυσσακχαρίτες (LPS) Gramαρνητικών βακτηρίων, η πεπτιδογλυκάνη, η βακτηριακη φλαγγελίνη, βακτηριακό DNA, το μονόκλωνο RNA των ιών, διάφορα σάκχαρα, μη μεθυλιωμένα CpG ολιγονουκλεοτίδια κ.ά. Η αναγνώριση των PAMPs από τους PRRs του ξενιστή θέτει τον οργανισμό σε συναγερμό ως προς την παρουσία ενός επικίνδυνου παθογόνου παράγοντα 5, Toll-Like υποδοχείς Από τους πιο σημαντικούς PRRs είναι οι Toll-like υποδοχείς και οι NOD-like υποδοχείς οι οποίοι συγκαταλέγονται στους σηματοδοτικούς PRRs και ενεργοποιούν διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια κινητοποίησης των χυμικών και κυτταρικών μηχανισμών της μη ειδικής ανοσίας, επάγοντας την φλεγμονώδη αντίδραση 5,6. Στην οικογένεια των TLRs των θηλαστικών ανήκουν 15 μέχρι τώρα γνωστά μέλη (TLR1 έως TLR15) και καθένα αναγνωρίζει ένα διαφορετικό PAMP προσδέτη 6. Οι TLRs εκφράζονται σε λεμφικούς και μη ιστούς, κυριαρχούν ωστόσο στους πρώτους ακολουθώντας διαφορετικό πρότυπο έκφρασης σε κάθε ιστό. Εκφράζονται στη μεμβράνη κυρίως κυττάρων της έμφυτης ανοσίας όπως μακροφάγα/μονοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, σιτευτικά, δενδριτικά και επιθηλιακά κύτταρα 5. Ενεργοποιούνται από μικροβιακά συστατικά και από άλλους παράγοντες, όπως τραυματισμοί που προκαλούνται από θερμότητα, χημικά, ιονίζουσα ακτινοβολία και άλλα ενδογενή ερεθίσματα όπως πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος, νεκρωτικοί ιστοί, ινωδογόνο κ.ά. που ονομάζονται μοριακά πρότυπα συνδεδεμένα με βλάβη (damage-associated molecular patterns, DAMPs) Επίκτητη ανοσία Η ειδική ή επίκτητη ανοσία αναπτύσσεται στα ανώτερα σπονδυλωτά σε μετέπειτα φάση της λοίμωξης με σκοπό να εξαλείψει τα παθογόνα που διέφυγαν από την έμφυτη ανοσία, προσφέροντας στον οργανισμό αποτελεσματική προστασία 8. Η ειδική ανοσία βασίζεται στην κλωνική επιλογή των Τ και Β λεμφοκυττάρων που παράγουν μεγάλη ποικιλία αντιγονοειδικών υποδοχέων οι οποίοι επιτρέπουν στο ανοσοποιητικό σύστημα να αναγνωρίζει κάθε ξένο αντιγόνο. Με τον όρο αντιγόνο αναφέρονται οι ουσίες των μολυσματικών παραγόντων που μπορούν να προκαλέσουν μια 17

18 ανοσοαπόκριση (Κεφάλαιο 2). Οι υποδοχείς αυτοί ονομάζονται Τ κυτταρικός υποδοχέας (ΤΚΥ, T cell Receptor - TcR) και Β κυτταρικός υποδοχέας (BKY, B cell Receptor - BcR), αντίστοιχα, και δημιουργούνται κατά την ανάπτυξη των Τ και Β λεμφοκυττάρων μέσω σωματικού ανασυνδυασμού κατά τέτοιο τρόπο ώστε τελικά κάθε κύτταρο να εκφράζει ένα μοναδικό υποδοχέα. Το ρεπερτόριο των υποδοχέων στο σύνολο του πληθυσμού των λεμφοκυττάρων είναι εξαιρετικά ευρύ και ποικίλο. Η διαδικασία παραγωγής επαρκούς αριθμού κλώνων και διαφοροποίησης τους σε δραστικά λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν και εξαλείφουν τους παθογόνους παράγοντες διαρκεί 3-5 ημέρες σε αντίθεση με τους μηχανισμούς της έμφυτης ανοσίας που ενεργοποιούνται ταχύτατα. Ωστόσο, στις ειδικές ανοσοαποκρίσεις παράγεται επίσης ένας μεγάλος αριθμός διαφοροποιημένων λεμφοκυττάρων μνήμης, γεγονός που εξασφαλίζει ταχύτερη και αποδοτικότερη άνοση απάντηση σε επόμενη έκθεση στο αντιγόνο. Οι ειδικές ανοσοαποκρίσεις διακρίνονται σε τρεις φάσεις. Η πρώτη φάση αφορά στην αναγνώριση του αντιγόνου και περιλαμβάνει την επεξεργασία και την παρουσίασή του από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα στα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα. Ακολουθεί η φάση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των Β και Τ λεμφοκυττάρων κυρίως σε εκτελεστικά και λιγότερο σε κύτταρα μνήμης με τη συμμετοχή κυτταροκινών. Τέλος, στην εκτελεστική φάση ο ξένος εισβολέας-αντιγόνο καταστρέφεται μέσω ενεργοποιημένων κυττάρων (κυτταρική ανοσία) ή ειδικών αντισωμάτων (χυμική ανοσία). Η χυμική ανοσία που μεσολαβείται από τα Β λεμφοκύτταρα και τα προϊόντα τους, τα αντισώματα, αποτελεί τον κατεξοχήν προστατευτικό μηχανισμό έναντι των εξωκυττάριων βακτηρίων και των τοξινών τους. Τα αντισώματα συμβάλλουν στην ανοσία με τρεις κύριους τρόπους: 1. Εξουδετέρωση των παθογόνων μικροοργανισμών και των τοξινών Οψωνινοποίηση, δηλαδή κάλυψη της επιφάνειας ενός παθογόνου μικροοργανισμού από αντισώματα με σκοπό την αύξηση της φαγοκυττάρωσής του Ενεργοποίηση του συμπληρώματος 3,9. Η κυτταρική ανοσία μεσολαβείται από τα Τ λεμφοκύτταρα που διακρίνονται περαιτέρω σε Τ κυτταροτοξικά (cytotoxic, Τ C ) και Τ βοηθητικά (helper, Τ Η ) με βάση την έκφραση των μεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών CD8 ή CD4 στην κυτταρική επιφάνειά τους 10. Τα υποχρεωτικά ενδοκυττάρια παράσιτα δεν αναγνωρίζονται από τα αντισώματα που κυκλοφορούν στον ορό. Η άμυνα εναντίον αυτών των μικροοργανισμών βασίζεται στην κυτταρική ανοσία, η οποία προκαλεί και προάγει την ενδοκυττάρια καταστροφή τους ή τη λύση των μολυσμένων κυττάρων. 18

19 Εικόνα 2. Σύνοψη της κυτταρικής και χυμικής άνοσης απάντησης. (Τροποποιημένη από Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Figure 2. Summary of cell-mediated and humoral immunity (Modified from Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) H άμυνα ενάντια στα παθογόνα ρυθμίζεται από τα αρχικά στάδια της έμφυτης ανοσίας μέχρι και τα τελικά στάδια της ειδικής ανοσοαπόκρισης. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των δυο μεγάλων κλάδων της ανοσοαπόκρισης, έμφυτη και ειδική ανοσία, είναι έντονη. Η έμφυτη ανοσία δρα άμεσα, δεν είναι ειδική για συγκεκριμένα παθογόνα, χαρακτηρίζεται από έλλειψη άνοσης μνήμης και συμμετέχει στην έναρξη της ειδικής ανοσοαπόκρισης με την παραγωγή κυτοκινών, την επεξεργασία και την παρουσίαση των αντιγόνων από τα μακροφάγα και άλλα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (π.χ δενδριτικά κύτταρα) στα κύτταρα της ειδικής ανοσίας. Επιπλέον, οι TLRs είναι υπεύθυνοι για την ωρίμανση και ενεργοποίηση των δενδριτικών κυττάρων (σε περίπτωση μικροβιακής εισβολής) που είναι 19

20 απαραίτητη για την έναρξη της ειδικής ανοσοαπόκρισης 11,12. Τέλος, ο ΒΚΥ και οι TLR μπορεί να συνεργάζονται στις λειτουργικές αποκρίσεις των Β κυττάρων, συνδέοντας άμεσα την έμφυτη και την ειδική ανοσία Αντιγόνα- Ανοσογόνα 2.1. Γενικές έννοιες - Ιδιότητες των αντιγόνων Οι μολυσματικοί παράγοντες περιέχουν πληθώρα ουσιών που μπορούν να προκαλέσουν μια ανοσοαπόκριση. Οι ουσίες αυτές ονομάζονται ανοσογόνα (immunogen) ή αντιγόνα (antigen - Ag). Συγκεκριμένα, ανοσογόνος είναι μια ουσία ικανή να επάγει χυμική και/ή κυτταρική ανοσοαπόκριση ενώ ως αντιγόνα χαρακτηρίζονται οι ουσίες με ικανότητα ειδικής σύνδεσης με τα τελικά προϊόντα των ανοσοαποκρίσεων, συμπεριλαμβανομένων των αντισωμάτων και του ΤΚΥ. Η διάκριση μεταξύ των όρων «αντιγόνου» και «ανοσογόνου» είναι απαραίτητη, επειδή παρότι όλα τα μόρια με την ιδιότητα της ανοσογονικότητας (immunogenicity) έχουν ταυτόχρονα και την ιδιότητα της αντιγονικότητας (antigenicity), το αντίθετο δε συμβαίνει πάντοτε. Οι απτίνες, για παράδειγμα, ουσίες συνήθως μικρού ΜΒ, διαθέτουν αντιγονικότητα, αλλά δεν μπορούν να επάγουν ανοσοαπόκριση από μόνες τους, παρά μόνο συνδεόμενες με μακρομοριακές πρωτεΐνες (φορείς). Ο «παραδοσιακός» ορισμός του αντιγόνου αποδίδεται καλύτερα με τον όρο ανοσογόνο (immunogen), όμως στην καθημερινή πράξη, ο όρος αντιγόνο αναφέρεται συνήθως και στις δύο ιδιότητες (ανοσογονικότητα, αντιγονικότητα) 3, Ιδιότητες των αντιγόνων Βασικοί παράγοντες που συμβάλλουν στην ανοσογονικότητα μιας ουσίας είναι: H ιδιότητα του «ξένου»: κανονικά, τα «ίδια» στοιχεία του οργανισμού δεν είναι ανοσογόνα. Το μοριακό μέγεθος: Μολονότι δεν υπάρχει απόλυτο μέγεθος πάνω από το οποίο μια ουσία είναι ανοσογόνος, ωστόσο, σε γενικές γραμμές, όσο μεγαλύτερο είναι το ΜΒ τόσο αυξάνεται η ανοσογονικότητα. Η χημική δομή: η χημική πολυπλοκότητα αυξάνει την ανοσογονικότητα. Δυνατότητα αποδόμησης από τα ένζυμα των μακροφάγων: μακρομόρια που δε μπορεί να διασπαστούν από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα είναι ασθενή ανοσογόνα. 20

21 Γενετικοί παράγοντες: η γενετική πολυμορφία των αντιγόνων του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας, των μεμβρανικών υποδοχέων των Β και Τ λεμφοκυττάρων, καθώς και των υπόλοιπων πρωτεϊνών που συμμετέχουν στους ανοσορρυθμιστικούς μηχανισμούς, καθορίζουν ή/και επηρεάζουν την ανοσογονικότητα μιας ουσίας. Έτσι, ορισμένες ουσίες είναι ανοσογόνα σε ένα είδος, αλλά όχι σε μια άλλη. Ομοίως, ορισμένες ουσίες είναι ανοσογόνα σε ένα άτομο, αλλά όχι σε άλλα. Η δόση χορήγησης: υπάρχει μια δόση του αντιγόνου πάνω ή κάτω από την οποία η ανοσοαπόκριση δεν είναι η βέλτιστη. Επίσης, οι εξαιρετικά μεγάλες δόσεις είναι δυνατό να μην προκαλέσουν την παραγωγή αντισωμάτων και να οδηγήσουν σε ανοχή. Η οδός χορήγησης: σε γενικές γραμμές, η υποδόρια οδός χορήγησης αυξάνει την ανοσογονικότητα μιας ουσίας σε σχέση με την ενδοφλέβια ή την ενδογαστρική οδό. Πρόσθετα: η ανοσοαπόκριση έναντι διαφόρων ανοσογόνων ενισχύεται με την ταυτόχρονη χορήγηση ουσιών που ονομάζονται ανοσοενισχυτικά (adjuvants). Το υδροξείδιο του αλουμινίου είναι το συχνότερα χρησιμοποιούμενο ανοσολογικό προσθετικό στην παρασκευή εμβολίων για τον άνθρωπο. Τα αντιγόνα, ανάλογα με την προέλευσή τους μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες: (α) εξωγενή που εισέρχονται στον οργανισμό από το εξωτερικό περιβάλλον και καταπολεμούνται από τον οργανισμό με τους μηχανισμούς φυσικής και ειδικής ανοσίας και (β) ενδογενή που δημιουργούνται μέσα στα κύτταρα ως αποτέλεσμα του φυσιολογικού κυτταρικού μεταβολισμού ή λόγω λοίμωξης από ιούς και ενδοκυττάρια βακτήρια. Ιδιαίτερη κατηγορία αντιγόνων είναι τα αυτοαντιγόνα. Πρόκειται συνήθως για φυσιολογικές πρωτεινες ή DNA/RNA που αναγνωρίζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα ως συστατικό του ίδιου του οργανισμού. Κανονικά, τα λεμφοκύτταρα που παράγουν αυτοαντισώματα και μπορεί να στραφούν εναντίον του οργανισμού αποκλείονται από το φυσιολογικό ρεπερτόριο με ειδικούς μηχανισμούς (απαλοιφή κλώνων, ανεργία, διόρθωση υποδοχέα- κεφάλαιο 4 ) 10. Φυσικά αυτοαντισώματα βρίσκονται στον ορό υγιών ατόμων χωρίς εξωτερική αντιγονική διέγερση. Στα ποντίκια, φυσικά αντισώματα παράγονται κυρίως από τα Β-1 κύτταρα (Κεφάλαιο 4.2.3). Τα Φυσικά Αυτοαντισώματα (ΦαΑ) παίζουν ρόλο στη φυσιολογική λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος και του οργανισμού γενικότερα, συμμετέχοντας στην πρώτη γραμμή άμυνας έναντι παθογόνων παραγόντων και στην απομάκρυνση παραπροϊόντων του μεταβολισμού και αποπτωτικών κυττάρων 14, ενώ φαίνεται να έχουν και ανοσορρυθμιστικό ρόλο (θεωρία του ιδιοτυπικού δικτύου, Niels Jerne, Βραβείο Nobel, 1974)

22 Τα κύρια χαρακτηριστικά των φυσικών αυτοαντισωμάτων είναι η πολυδραστικότητα, που αναφέρεται στην αναγνώριση ευρέος φάσματος αντιγόνων διαφορετικής δομής, ενδογενούς και εξωγενούς προέλευσης, και η παρουσία καθόλου ή ελάχιστων μεταλλάξεων στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών (Κεφάλαιο 3) Χημική φύση των ανοσογόνων Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος δεν αναγνωρίζουν ολόκληρο τον παθογόνο μικροοργανισμό ως ανοσογόνο, αλλά συγκεκριμένες περιοχές μακρομορίων (επίτοποι ή αντιγονικοί καθοριστές, Κεφάλαιο 2.4). Τα περισσότερα και δραστικότερα ανοσογόνα είναι πρωτεΐνες ή πολυσακχαρίτες. Οι πρωτεΐνες είναι ισχυρότερα ανοσογόνα από τους πολυσακχαρίτες και τα μόνα ανοσογόνα που επάγουν κυτταρική ανοσοαπόκριση. Όλες σχεδόν οι πρωτεΐνες είναι ανοσογόνα, τόσο σε καθαρή μορφή όσο και σε ενώσεις με υδατάνθρακες, λίπη, νουκλεικά οξέα. Όσο πιο πολύπλοκη είναι η δομή μιας πρωτεΐνης τόσο πιο ισχυρή είναι η ανοσοαπόκριση που υποκινούν. Οι πολυσακχαρίτες είναι λιγότερο ισχυρά ανοσογόνα από τις πρωτεΐνες. Ως συστατικά των γλυκοπρωτεïνών μπορούν να διεγείρουν ανοσοαπόκριση, μέρος της οποίας κατευθύνεται ειδικά έναντι του πολυσακχαριδικού τμήματος των γλυκοπρωτεϊνών. Πολυσακχαρίτες που βρίσκονται σε διάφορους μικροοργανισμούς και ευκαρυωτικά κύτταρα μπορούν να επάγουν χυμική ανοσοαπόκριση. Χαρακτηριστικό παράδειγμα της ανοσογονικότητας των πολυσακχαριτών είναι η απόκριση που διεγείρεται έναντι των αντιγόνων του συστήματος των ομάδων αίματος ΑΒΟ (πολυσακχαρίτες της επιφάνειας των ερυθρών αιμοσφαιρίων). Τα λιπίδια και τα νουκλεικά οξέα είναι πολύ ασθενή ή καθόλου ανοσογόνα. Διεγείρουν όμως ανοσοαποκρίσεις συνδεδεμένα με κάποια πρωτεΐνη-φορέα. Παρόλο που το DNA δεν είναι συνήθως ανοσογόνο, σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να διεγείρει ανοσοαπόκριση. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ανίχνευση αντι-dna-αντισωμάτων σε ασθενείς που πάσχουν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus - SLE) Αντιγονικοί καθοριστές Τα λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν και προσδένονται σε συγκεκριμένα τμήματα των ανοσογόνων μακρομορίων τα οποία αναφέρονται ως επίτοποι ή αντιγονικοί καθοριστές 3. Αντιγονικός επίτοπος ή αντιγονικός καθοριστής λέγεται κάθε προέχουσα χημική διαμόρφωση πάνω στην εξωτερική επιφάνεια του αντιγόνου που μπορεί να συνδεθεί στερεοχημικά με το ομόλογό της αντίσωμα ή τον ομόλογο της μεμβρανικό υποδοχέα του Τ- λεμφοκυττάρου. Δυνητικά, κάθε περιοχή της επιφάνειας ενός μακρομορίου μπορεί να 22

23 λειτουργήσει ως επίτοπος και, κατά συνέπεια, κάθε μακρομόριο περιέχει μεγάλο αριθμό επιτόπων. Όσον αφορά στα πρωτεϊνικά αντιγόνα, οι επίτοποι που αναγνωρίζονται από τα αντισώματα έχουν μήκος περίπου 5-7 αμινοξέα με συχνή την παρουσία των αμινοξέων λυσίνη, τρυπτοφάνη, γλουταμίνη, τυροσίνη και φαυνυλαλανίνη. Τα Τ λεμφοκύτταρα δεν αναγνωρίζουν ελεύθερα πεπτίδια αλλά μόνο πεπτίδια που παρουσιάζονται σε συνδυασμό πάντοτε με ένα μόριο του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (Major histocompatibility complex - MHC). Οι επίτοποι που συνδέονται με τα T λεμφοκύτταρα έχουν μεγαλύτερο μέγεθος (10-15 αμινοξέα) καθώς ένα μέρος του επιτόπου συνδέεται με τμήμα του αντιγόνου ιστοσυμβατότητας, ενώ το υπόλοιπο μέρος του επιτόπου συνδέεται με τον ΤΚΥ. Οι πρωτεϊνικοί επίτοποι είναι είτε συνεχείς (γραμμικοί) που αποτελούνται από αλληλουχία αμινοξέων τα οποία βρίσκονται σε συνεχή διάταξη στην πολυπεπτιδική αλυσίδα, είτε ασυνεχείς (διαμορφωτικοί) όταν αποτελούνται από αλληλουχία αμινοξέων που έχουν ασυνεχή διάταξη στην πρωτοταγή δομή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, αλλά συνεχή διάταξη στην τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης. Επιπλέον υπάρχουν οι νεοεπίτοποι (neoepitopes) που δημιουργούνται μετά από αντιδράσεις που αλλάζουν τη στερεοδομή των πρωτεϊνών (φωσφορυλιώσεις, πρωτεόλυση κ.ά.). Στα σακχαριτικά αντιγόνα, οι επίτοποι σχηματίζονται από 4-6 μονοσάκχαρα, συνηθέστερα γλυκόζη, γαλακτόζη, φουκόζη, γλυκοζαμίνη και γαλακτοζαμίνη. Τέτοιες μικρές ετεροσακχαρικές αλυσίδες βρίσκονται συνήθως πάνω σε άλλα μεγάλα πολυσακχαριτικά μόρια: πρωτεϊνες (γλυκοπρωτεϊνες), ή λιπίδια (γλυκολιπίδια). Κάθε αλλαγή σε ένα ή περισσότερα από τα μονοσάκχαρα που σχηματίζουν τον επίτοπο, είναι ικανή να αλλάξει σε μεγάλο βαθμό τη μορφή της προέχουσας στερεοχημικής διαμόρφωσης ώστε τελικά να προκύψει ένας νέος αντιγονικός επίτοπος. Κλασικό παράδειγμα είναι τα αντιγόνα Α και Β των ερυθροκυττάρων του ανθρώπου. Για κάθε αντιγονικό επίτοπο παράγονται στον οργανισμό πολλά αντισώματα έτσι ώστε η έννοια της απόλυτης ειδικότητας του αντισώματος με τον επίτοπο δεν είναι ακριβής. Τα αντισώματα συνδέονται μ ένα συγκεκριμένο αντιγονικό επίτοπο με διαφορετική γωνία σύνδεσης και με διαφορετική ευκολία που καθορίζει τη συγγένεια (affinity) του αντισώματος με τον επίτοπο. Η δύναμη σύνδεσης των επιμέρους αντισωμάτων με τον αντιγονικό επίτοπο ορίζει τον βαθμό ειδικότητας του αντισώματος (avidity). Τέλος, δύο ουσίες μπορεί να έχουν κοινούς έναν ή περισσότερους επιτόπους με αποτέλεσμα στοιχεία της ανοσοαπόκρισης που διεγείρονται έναντι επιτόπου της πρώτης 23

24 ουσίας ν αναγνωρίζουν έναν, ή περισσότερους, επιτόπους της δεύτερης. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται διασταυρούμενη αντίδραση (cross-reactivity) ή «φαινόμενο πληθυσμού» (population phenomenon) Αναγνώριση των αντιγονικών επιτόπων από τα λεμφοκύτταρα- Τύποι αντιγόνων Ο ΒΚΥ αναγνωρίζει και συνδέεται με επιτόπους που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια διαλυτών αντιγόνων. Η χυμική ανοσοαπόκριση μέσω των αντισωμάτων ξεκινά όταν τα Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίσουν το αντιγόνο και δεχθούν και το απαιτούμενο συνδιεγερτικό σήμα από ένα δραστικό Τ βοηθητικό λεμφοκύτταρο είτε απευθείας από τα μικροβιακά συστατικά. Με βάση την παραπάνω διάκριση τα αντιγόνα κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες, θυμοανεξάρτητα (Thymus Independent, TI) και θυμοεξαρτημένα (Thymus Dependent, TD). Τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα διεγείρουν άμεσα τα Β λεμφοκύτταρα σε παραγωγή αντισωμάτων χωρίς την ανάγκη βοήθειας από τα T λεμφοκύτταρα, ενώ τα θυμοεξαρτημένα αντιγόνα για να προκαλέσουν χυμική ανοσοαπόκριση χρειάζονται τη μεσολάβηση των Τ λεμφοκυττάρων 3. Τα T λεμφοκυτταρα αναγνωρίζουν επιτόπους στην επιφάνεια των κυττάρων παρουσιασης του αντιγόνου (Antigen Presenting Cells APCs) σε συνδυασμό με ένα αντιγόνο MHC. Οι επίτοποι αυτοί αποτελούν μετουσιωμένες εσωτερικές γραμμικές υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών. Οι πολυσακχαρίτες δεν έχουν τέτοιες περιοχές και, έτσι, δεν αναγνωρίζονται από τον υποδοχέα των T λεμφοκυττάρων. Κατά συνέπεια, οι πολυσακχαρίτες περιέχουν επιτόπους που αναγνωρίζονται μόνο από τα Β λεμφοκύτταρα (θυμοανεξάρτητα αντιγόνα). Αντίθετα, οι πρωτεΐνες περιέχουν επιτόπους που αναγνωρίζονται από τα Β και τα Τ λεμφοκύτταρα (θυμοεξαρτημένα αντιγόνα) 3. Τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα περιλαμβάνουν αντιγόνα με πολυμερή δομή και διακρίνονται σε δύο υποκατηγορίες, με βάση την ικανότητά τους να επάγουν πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων, δηλαδή πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση πολλών κλώνων Β λεμφοκυττάρων, ανεξάρτητα από την αντιγονική ειδικότητά τους. Τα θυμοανεξάρτητα αντιγονα τύπου 1 (TI-1), όπως οι βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες, είναι πολυκλωνικοί ενεργοποιητές ανεξάρτητα από τα Τ λεμφοκύτταρα. Αντίθετα, τα θυμοανεξάρτητα αντιγονα τύπου 2 (TI-2) απαιτούν την παρουσία μικρού αριθμού Τ λεμφοκυττάρων και κάποιων κυτοκινών και δεν έχουν την ικανότητα πολυκλωνικής 24

25 ενεργοποίησης. Σε αυτή την κατηγορία περιλαμβάνονται πολυμερείς ουσίες όπως πολυσακχαρίτες, πολυμερή των D-αμινοξέων, δεξτράνες, φικόλη 3. Τέλος, ιδιαίτερη κατηγορία αντιγόνων είναι τα υπεραντιγόνα (superantigens). Σε αντίθεση με τα θυμοεξαρτημένα αντιγόνα που διεγείρουν μονοκλωνική ή ολιγοκλωνική ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, τα υπεραντιγόνα έχουν ιδιαίτερο τρόπο σύνδεσης που τα καθιστά ικανά να διεγείρουν πολύ μεγάλους αριθμούς Τ λεμφοκυττάρων- έως και 20% του συνόλου των Τ λεμφοκυττάρων- και μαζική απελευθέρωση κυτοκινών 19. Τα υπεραντιγόνα αναγνωρίζονται από αλληλουχίες ανεξάρτητα από τις συμβατικές θέσεις πρόσδεσης του αντιγόνου του ΤΚΥ και των μορίων του MHC, ιδιότητα που εξηγεί την ικανότητα τους να ενεργοποιούν μεγάλους αριθμούς Τ λεμφοκυττάρων. Οι ασθένειες που συνδέονται με την έκθεση σε υπεραντιγόνα οφείλονται, εν μέρει, σε υπερ-ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος κι επακόλουθη μαζική απελευθέρωση κυτοκινών από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα και τα κύτταρα APC 20,21. Τα βακτηριακά υπεραντιγόνα είναι καλύτερα μελετημένα, αλλά υπάρχουν επίσης υπεραντιγόνα ιών και μυκοπλασμάτων 3. Τα υπεραντιγόνα παράγονται ενδοκυττάρια από τα βακτήρια και απελευθερώνονται κατά τη λοίμωξη ως εξωκυττάριες τοξίνες. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι η σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη και η τοξίνη του συνδρόμου του τοξικού shock που παράγονται από τον Staphylococcus aureus και προκαλούν τροφική δηλητηρίαση και το σύνδρομο του τοξικού shock, αντιστοίχως. Επιπλέον, άλλες παθολογικές καταστάσεις όπως η ατοπική δερματίτις, η ακραία πυρεξία, η νεκρωτική πνευμονία, το αυτοάνοσο σύνδρομο Kawasaki και το AIDS έχουν συσχετιστεί με υπεραντιγόνα 20, Αντισώματα: δομή και λειτουργία Η χυμική ανοσία εξαρτάται από τα αντισώματα (antibodies - Ab) ή αλλιώς ανοσοσφαιρίνες (immunoglobulins - Ig), γλυκοπρωτεϊνικά μόρια που παράγονται από τα Β λεμφοκύτταρα και επιτελούν δύο λειτουργίες. Η πρώτη είναι η ειδική πρόσδεση σε επιτόπους παθογόνων τα οποία επάγουν την ανοσοαπόκριση, ενώ η δεύτερη είναι η ενεργοποίηση των μηχανισμών ανοσίας εναντίον των παθογόνων έπειτα από την πρόσδεση των αντισωμάτων σε αυτά, με σκοπό την εξάλειψή τους. Τα αντισώματα είναι συμμετρικά μόρια αποτελούμενα από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες: δύο ταυτόσημες γλυκοσυλιωμένες βαριές αλυσίδες μοριακού βάρους (ΜΒ) 50 έως 75 kda, και ένα ζεύγος ταυτόσημων μη γλυκοσυλιωμένων ελαφριών αλυσίδων ΜΒ 25 kda περίπου 23. Δισουλφιδικοί δεσμοί ενώνουν τόσο τις βαριές αλυσίδες μεταξύ τους όσο 25

26 και κάθε ελαφριά αλυσίδα σε μια βαριά αλυσίδα με τελικό αποτέλεσμα μια δομή που μοιάζει με το γράμμα «Υ» (Εικόνα 3). Οι ανοσοσφαιρίνες διακρίνονται σε 5 τάξεις ή κλάσεις, καθεμία από τις οποίες έχει διαφορετική δομή και βιολογική λειτουργία. Στις ελαφριές αλυσίδες διακρίνονται μόνο δύο τύποι: κάππα (κ) ελαφριές αλυσίδες και λάμβδα (λ), χωρίς καμιά γνωστή διαφορά στη λειτουργία μεταξύ των αντισωμάτων με κ και λ ελαφριές αλυσίδες. Σε κάθε ανοσοσφαιρίνη εκφράζεται ένας μόνο τύπος ελαφριών αλυσίδων, είτε κ είτε λ. Η τάξη της ανοσοσφαιρίνης καθορίζεται από τον τύπο της βαριάς αλυσίδας. Έτσι προκύπτουν οι ανοσοσφαιρίνες IgM, IgD,IgG, IgA και IgE που φέρουν τις βαριές αλυσίδες μ, δ, γ, α και ε, αντίστοιχα. Οι τάξεις ανοσοσφαιρινών IgG και IgA διακρίνονται περαιτέρω σε υποτάξεις: IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4 και IgΑ 1, IgΑ 2. Οι τρεις κύριες τάξεις των ανοσοσφαιρινών είναι οι IgG, IgM και IgA ενώ οι ανοσοσφαιρίνες IgD και IgE αποτελούν μαζί λιγότερο από 1% του συνόλου των ανοσοσφαιρινών 24. Οι ανοσοσφαιρίνες IgM και IgA εκκρίνονται ως πολυμερή (πενταμερή και διμερή ή τριμερή, αντίστοιχα) της βασικής μονάδας του μορίου της ανοσοσφαιρίνης. Η δομή ενός αντισώματος σχετίζεται στενά με τη λειτουργία του. Κάθε αλυσίδα και κάθε μόριο αντισώματος υποδιαρείται σε δύο περιοχές: μεταβλητή (variable region, περιοχή V) στο αμινοτελικό ακρο και σταθερή (constant region, περιοχή C) στο καρβοξυτελικό άκρο, οι οποίες καθορίζουν την εξειδίκευση του αντισώματος (αναγνώριση του αντιγόνου) και την βιολογική δράση, αντίστοιχα. Ενδοπεπτιδικοί δισουλφιδικοί δεσμοί αναγκάζουν τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες να διπλωθούν και να σχηματίσουν σφαιρικές δομές (τομείς) μήκους περίπου 110 αμινοξέων, πλούσιες σε β-πτυχωτά φύλλα 25. Η μεταβλητή περιοχή των αλυσίδων των αντισωμάτων αποτελείται από ένα μόνο τομέα Ig (V H ή V L ). Οι βαριές αλυσίδες γ, α και δ έχουν σταθερή περιοχή που αποτελείται από τρεις τομείς (C H 1, C H 2, C H 3) ενώ οι βαριές αλυσίδες μ και ε έχουν ένα επιπλέον σταθερό τομέα. Η ελαφριά αλυσίδα περιέχει ένα μόνο σταθερό τομέα (C L )(Εικόνα 3) 26. Η περιοχή V εμφανίζει μεγάλο βαθμό μεταβλητότητας ως προς την αμινοξική αλληλουχία ανάμεσα στα διαφορετικά αντισώματα. Η μεταβλητότητα της αλληλουχίας δεν κατανέμεται ομοιόμορφα καθώς υπάρχουν τμήματα με εξαιρετική μεταβλητότητα (υπερμεταβλητές περιοχές, hypervariable regions - HR) και άλλα πιο συντηρημένα (Εικόνα 4)

27 Εικόνα 3. Τρισδιάστατο μοντεόλο της ανοσοσφαιρίνης IgG. (Τροποποιημένη από E.W. Silverton, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74:5140.) Figure 3. Three-dimensional model of IgG. (Adapted from E.W. Silverton, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74:5140.) Οι υπερμεταβλητές περιοχές αντιστοιχούν σε τρεις θηλιές (loops), στο άκρο κάθε β- φύλλου, τόσο στη βαριά όσο και στην ελαφριά αλυσίδα. Όταν η πρωτεΐνη διπλώνεται, συμπλησιάζουν και δημιουργούν τη θέση πρόσδεσης του αντιγόνου (παράτοπος). Κατ αυτόν τον τρόπο οι υπερμεταβλητές περιοχές καθορίζουν την εξειδίκευση του αντισώματος και για το λόγο αυτό ονομάζονται και περιοχές καθορισμού της συμπληρωματικότητας (complementarity determining regions, CDRs: CDR1, CDR2 και CDR3). Τα πιο συντηρημένα τμήματα μεταξύ των CDR περιοχών ορίζονται ως περιοχές πλαισίου (framework regions, FR): FR1, FR2, FR3 και FR4 καθώς σχηματίζουν το δομικό πλαίσιο της περιοχής με τις υπερμεταβλητές αλληλουχίες 27,28. Η περιοχή που ευθύνεται για τη λειτουργία του αντισώματος δεν εμφανίζει την ίδια ποικιλομορφία και καλείται σταθερή. Eμπλέκεται στην διαδικασία απομάκρυνσης των αντιγόνων από τα μακροφάγα, την εξαρτώμενη από αντισώματα κυτταρική κυτταροτοξικότητα και την ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος. 27

28 Εικόνα 4. Αμινοξική ποικιλότητα στη μεταβλητή περιοχή των βαριών και των ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών. (Τροποποιημένη από Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Figure 4. Amino acid variability in immunoglobulin heavy and light chain variable regions. (Modified from Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) 3.1. Γενετικοι τόποι των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Οι αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών κωδικοποιούνται από μια σειρά γονιδίων: V (Variable:μεταβλητό), J (Junctional:συνδετικό), και C (Constant:σταθερό). Ο γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας (IGΗ) περιλαμβάνει επιπλέον και τα γονίδια D (Diversity: ποικιλότητα) ανάμεσα στα γονίδια V και J 29. Για τη συναρμολόγηση των κωδικοποιητικών αλληλουχιών της μεταβλητής περιοχής των ανοσοσφαιρινών, τυχαία επιλέγεται ένα γονίδιο από την κάθε ομάδα. Στους γενετικούς τόπους των ανοσοσφαιρινών περιλαμβάνεται και πλήθος ρυθμιστικών γονιδίων, όπως οι αλληλουχίες-οδηγοί (leader sequences, L) πριν από κάθε γονίδιο V, οι οποίες κατευθύνουν τις νεσυντεθειμένες βαριές και ελαφριές αλυσίδες στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Στον άνθρωπο, τα γονίδια της βαριά αλυσίδας και της κ και λ ελαφριάς αλυσίδας εντοπίζονται στα χρωμοσώματα 14, 2 και 22, αντίστοιχα (Εικόνα 5) Ο γενετικός τόπος της βαριάς αλυσίδας (IGH) έχει μήκος 1250 kb και περιλαμβάνει 44 λειτουργικά IGHV γονίδια, 23 λειτουργικά γονίδια IGHD, 6 λειτουργικά γονίδια IGHJ και 11 γονίδια IGHC. Οι ομάδες των γονιδίων IGHV και IGHD υποδιαιρούνται σε 7 υποομάδες (IGHV1-IGHV7 και IGHJ1- IGHJ7, αντίστοιχα) 33. Ο γενετικός τόπος της κ ελαφριάς αλυσίδας (IGK) έχει μήκος kb και περιλαμβάνει λειτουργικά γονίδια IGKV που κατατάσσονται σε 7 υποομάδες(igkv1-igkv7), 5 λειτουργικά γονίδια IGKJ και 1 γονίδιο IGKC. Τα γονίδια IGKV οργανώνονται σε δύο συστοιχίες, οι οποίες απέχουν μεταξύ τους 800 kb. Στον σπάνιο απλότυπο με μόνο μια 28

29 συστοιχία το ρεπερτόριο των γονιδίων IGKV περιλαμβάνει μόνο λειτουργικά γονίδια 34. Τέλος, ο γενετικός τόπος της λ ελαφριάς αλυσίδας (IGL) έχει μήκος kb και περιέχει λειτουργικά γονίδια IGLV, που κατατάσσονται σε 11 υποομάδες. Τα γονίδια IGLJ είναι ισάριθμα με τα γονίδια IGLC και οργανώνονται σε ζεύγη γονιδίων(4-5 ζεύγη λειτουργικών γονιδιων) 35. Εικόνα 5. Η διάταξη των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στους γενετικούς τόπους IGH, IGK, IGL. (Τροποποιημένη από Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Figure 5: Gene configuration of the IGH, IGK and IGL genetic loci. (Modified from Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) 3.2. Μηχανισμοί δημιουργίας ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών Οι ανοσοσφαιρίνες παρουσιάζουν αξιοσημείωτη ποικιλότητα με σκοπό την αναγνώριση των πολυάριθμων αντιγονικών δομών και την αποτελεσματική προστασία του οργανισμού από ενδογενείς και εξωγενείς απειλές 8. Η τεράστια ποικιλότητα των ανοσοσφαιρινών είναι αποτέλεσμα της συλλογικής δράσης κάποιων ειδικών μηχανισμών που λειτουργούν κατά τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων: Συνδυαστική ποικιλότητα: ποικιλομορφία που προκύπτει από τον τυχαίο συνδυασμό των γονιδίων V, D και J της μεταβλητής περιοχής της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας. Tα γονίδια D υπάρχουν μόνο στις βαριές αλυσίδες και μάλιστα μπορεί να χρησιμοποιηθούν σε διαφορετικά πλαίσια ανάγνωσης (open reading frames). Η συνδυαστική ποικιλότητα περιλαμβάνει επίσης το συνδυασμό μιας βαριάς αλυσίδας με μια ελαφριά αλυσίδα τύπου κ ή λ. Συνδετική ποικιλότητα: ποικιλομορφία που προκύπτει στα σημεία ένωσης των γονιδίων V, (D) και J κατά τον ανασυνδυασμό τους για το σχηματισμό της μεταβλητής περιοχής των αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών, που περιλαμβάνει συχνά την αφαίρεση νουκλεοτιδίων από τις άκρες των ανασυνδυαζόμενων γονιδίων και την τυχαία (χωρίς εκμαγείο) προσθήκη νουκλεοτιδίων. 29

30 Σωματική υπερμεταλλαξιγένεση (Somatic hypermutation - SHM): εισαγωγή μεταλλάξεων στα ανασυνδυασμένα γονίδια της μεταβλητής περιοχής των ανοσοσφαιρινών. Συμβαίνει μετά τη συνάντηση με το αντιγόνο με σκοπό την αύξηση της συγγένειας του αντισώματος προς αυτό. Εναλλαγή ισοτύπου (Class switch recombination - CSR): αντικατάσταση του γονιδίου της σταθερής περιοχής (IGHC) από IGHM σε IGHG ή IGHE ή IGHA, οδηγώντας σε παραγωγή των αντίστοιχων ισοτύπων ανοσοσφαιρινών. Συνεπώς, η εναλλαγή ισοτύπου δεν αλλάζει την αντιγονική ειδικότητα της ανοσοσσφαιρίνης αλλά αυξάνει την ποικιλία των εκτελεστικών λειτουργιών της Συνδυαστική ποικιλότητα και Ανασυνδυασμός V(D)J Για το σχηματισμό ενός μορίου ανοσοσφαιρίνης πρέπει να συνδεθούν τέσσερις αλυσίδες, δύο ταυτόσημες βαριές και δύο ταυτόσημες ελαφριές. Η μεταβλητή περιοχή κάθε αλυσίδας προκύπτει από τον τυχαίο συνδυασμό ενός γονιδίου από κάθε ομάδα γονιδίων (V, D και J). Επειδή τα διαθέσιμα γονίδια για τη μεταβλητή περιοχή κάθε αλυσίδας είναι πολλά και ο ανασυνδυασμός θεωρητκά τυχαίος, προκύπτει ένας τεράστιος αριθμός συνδυασμών 36. Η δημιουργία της μεταβλητής περιοχής των ανοσοσφαιρινών περιλαμβάνει μια σειρά ιεραρχημένων αναδιατάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών που ονομάζεται ανασυνδυασμός V(D)J και πραγματοποιείται στο μυελό των οστών κατά την πρωιμη φάση της διαφοροποίησης των Β λεμφοκυττάρων (Κεφάλαιο 4). Η αναδιάταξη των γονιδίων V, D, J καθοδηγείται από πλευρικές αλληλουχίες στο DNA που ονομάζονται αλληλουχίες σηματοδότησης του ανασυνδυασμού (recombination signal sequences - RSS). Οι RSSs περιέχουν ένα συντηρημένο παλίνδρομο επτανουκλεοτίδιο (heptamer) (5 -CACΑGTG-3 ) κι ένα συντηρημένο εννεανουκλεοτίδιο (nonamer) (5 - ACAAAAACC-3 ) που διαχωρίζονται από διαστηματική αλληλουχία (spacer region) μήκους 12 ή 23 νουκλεοτιδίων (±1 νουκλεοτίδιο) (Εικόνα 6) 37,38. Αν και η αλληλουχία της διαστηματικής περιοχής δεν είναι συντηρημένη, το μήκος της είναι πολύ σημαντικό για τη λειτουργικότητά της. Τα γονίδια της ίδιας ομάδας (π.χ IGHV) σηματοδοτούνται με τον ίδιο τύπο αλληλουχίας RSS. Οι αλληλουχίες σηματοδότησης του ανασυνδυασμού εντοπίζονται στο 3 άκρο των γονιδίων V, στο 5 άκρο των γονιδίων J και στα 5 και 3 άκρα των γονιδίων D. Ανασυνδυασμός είναι εφικτός μόνο μεταξύ γονιδίων που διαθέτουν RSS με διαφορετική διαστηματική αλληλουχία. Ο κανόνας αυτός είναι γνωστός ως κανόνας 12/23 ή κανόνας one turn/two turns και προκύπτει από το γεγονός ότι 12 και 30

31 23 ζεύγη βάσεων αντιστοιχούν σε μία ή δύο στροφές της διπλής έλικας του DNA, αντιστοίχως, προσανατολίζοντας την επταμερή και την εννεαμερή ακολουθία στην ίδια πλευρά του μορίου (Εικόνα 6) Εικόνα 6. Αλληλουχίες σηματοδότησης ανασυνδυασμού και κανόνας 12/23. (Τροποποιημένη από Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Figure 6. Recombination signal sequences (RSS) and 12/23 rule. (Modified from Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Σε βιοχημικό επίπεδο, ο ανασυνδυανός V(D)J διαχωρίζεται σε δύο φάσεις: εντομή του DNA και ένωσή του. Η εντομή του DNA πραγματοποιείται από ειδικές πρωτεΐνες της λεμφικής σειράς, τις πρωτεΐνες RAG (recombination activating gene). Το ετεροδιμερές σύμπλοκο των πρωτεϊνών RAG-1/RAG-2 αναγνωρίζει και προσδένεται στις αλληλουχίες RSS δημιουργώντας ένα συναπτικό σύμπλοκο που περιλαμβάνει ένα ζευγάρι αλληλουχιών RSS με διαστηματικές αλληλουχίες 12bp και 23bp Από την εντομή προκύπτει ένα ελεύθερο 3 -ΟΗ άκρο στην πλευρά της κωδικής αλληλουχίας, το οποίο «επιτίθεται» στο συμπληρωματικό κλώνο και δημιουργεί μια δίκλωνη εντομή μέσω μιας αντίδρασης trans-εστεροποίησης. Κατά την αντίδραση, η ελεύθερη 3 -ΟΗ ομάδα δημιουργεί φωσφωδιεστερικό δεσμό με το συμπληρωματικό της νουκλεοτίδιο ενώνοντας τα άκρα των κωδικών αλληλουχιών σε μια κλειστή δομή φουρκέτας (hairpin) που περιέχει όλες τις βάσεις της κωδικής περιοχής και των δύο κλώνων. Συνολικά, παράγονται τέσσερα ελεύθερα DNA άκρα: δύο κωδικοποιητικά (coding ends) και δύο σηματοδοτικα (signal ends) 37,38. Στη συνέχεια, κινητοποιούνται διάφορα ένζυμα σύνδεσης των μη ομόλογων άκρων (Non Homologous End Joining - NHEJ) με σκοπό την ένωση των κωδικοποιητικών και των 31

32 σηματοδοτικών άκρων μεταξύ τους. Τα ένζυμα αυτά περιλαμβάνουν την κινάση DNA-PK, τις πρωτεΐνες Ku, XRCC4 και την DNA λιγάση ΙV. Τα σηματοδοτικά άκρα συνδέονται μεταξύ τους με τη δράση της DNA λιγάσης ΙV. Για τα κωδικοποιητικά άκρα η διαδικασία είναι πιο περίπλοκη καθώς απαιτείται πρώτα άνοιγμα της φουρκέτας από την πρωτεΐνη Artemis, κατεργασία και τελικά ένωσή τους από την DNA λιγάση ΙV. Η πρωτεΐνη Artemis ενεργοποιείται από την κινάση DNA-PK, η οποία με τη σειρά της έχει ενεργοποιηθεί από το σύμπλοκο των πρωτεïνών Ku70/Ku80, ενώ η XRCC4 αυξάνει την ενεργότητα της λιγάσης IV 38,36. Μετά τον ανασυνδυασμό V(D)J ακολουθεί μεταγραφή των ανασυνδυασμένων γονιδίων, συρραφή του πρόδρομου mrna και προσθήκη της poly-a ουράς. Ο ανασυνδυασμός V(D)J ρυθμίζεται σε τρία επίπεδα: Σε μεταγραφικό επίπεδο η έκφραση των πρωτεϊνών RAG περιορίζεται στα πρόδρομα Β και Τ λεμφοκύτταρα με σκοπό τον ανασυνδυασμό των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και των Τ κυττραρικών υποδοχέων, αντιστοίχως. Επιπρόσθετοι ρυθμιστικοί μηχανισμοί είναι απαραίτητοι για την εξειδίκευση για συγκεκριμένη λεμφική σειρά (Β ή T). Ο ανασυνδυασμός συμβαίνει με ιεραρχική σειρά. Στα Β λεμφοκύτταρα πρώτα ανασυνδυάζονται γονίδια της βαριάς αλυσίδας και ακολουθούν τα γονίδια των ελαφριών αλυσίδων (πρώτα τα γονίδια της κ ελαφριάς αλυσίδας κι έπειτα της λ). Τέλος, στους περισσότερους γενετικούς τόπους, ο ανασυνδυασμός ρυθμίζεται κατά τέτοιο τρόπο ώστε σε κάθε Β λεμφοκύτταρο να εκφράζεται μόνο ένα λειτουργικό αλληλόμορφο. Το φαινόμενο αυτό καλείται αλληλομορφικός αποκλεισμός (allelic exclusion). Έτσι, κάθε Β λεμφοκύτταρο εκφράζει ένα μοναδικό μόριο ανοσοσφαιρίνης Συνδετική ποικιλότητα Τόσο στις βαριές όσο και στις ελαφριές αλυσίδες οι δύο υπερμεταβλητές περιοχές (CDR1 και CDR2) κωδικοποιούνται αποκλειστικά από τα γονίδια V. Αντίθετα, η περιοχή CDR3 περιλαμβάνει την συμβολή των γονιδίων V-D-J και V-J για τις βαριές και ελαφριές αλυσίδες, αντίστοιχα. Η ποικιλότητα των περιοχών CDR3 αυξάνει πολύ μέσω της προσθήκης και αφαίρεσης νουκλεοτιδίων κατά το σχηματισμό των συμβολών μεταξύ των ανασυνδυαζόμενων γονιδίων. Κατά την επεξεργασία των κωδικοποιητικών άκρων, η πρωτεΐνη Artemis εντοπίζει τη δομή φουρκέτας και πραγματοποιεί τυχαία τομή σε οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο της. Αν η τομή δε συμβεί στην κορυφή της φουρκέτας προκύπτουν παλίνδρομα νουκλεοτίδια (P νουκλεοτίδια). Επίσης, η τελική δεοξυνουκλεοτιδική τρανσφεράση (Terminal 32

33 deoxynucleotidyl transferase - TdT) καταλύει την προσθήκη νουκλεοτιδίων, κατά προτίμηση γουανίνης, σε μονόκλωνες αλυσίδες χωρίς να απαιτεί εκμαγείο συνεισφέροντας καθοριστικά στην αύξηση της ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών. Τα νουκλεοτίδια που προστίθενται από την Tdt είναι γνωστά ως Ν-νουκλεοτίδια (non-templated nucleotides). Τέλος, η ετερογένεια των συμβολών αυξάνει ακόμη περισσότερο καθώς εξωνουκλεάσες συχνά αφαιρούν νουκλεοτίδια πριν την ένωση των γονιδίων (Εικόνα 7) 38. Εικόνα 7. Μηχανισμοί δημιουργίας συνδετικής ποικιλότητας. (Τροποποιημένη από Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Figure 7. Mechanisms of junctional diversity. (Modified from Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Σωματική υπερμεταλλαξιγένεση και εναλλαγή ισοτύπου Οι παραπάνω μηχανισμοί πρόκλησης ετερογένειας στα μόρια των ανοσοσφαιρινών συμβαίνουν κατά την αναδιάταξη των γονιδίων V(D)J στα αναπτυσσόμενα Β κύτταρα. Η τελική ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων, η οποία συμβαίνει σε βλαστικά κέντρα των δευτερογενών λεμφικών οργάνων (Κεφάλαιο 4) μετά την αναγνώριση αντιγόνου, περιλαμβάνει δυο επιπλέον μηχανισμούς αύξησης της ποικιλότητας των ανοσοσφαιρινών: (i) σωματική υπερματαλλαξιγένεση 39,40 και (ii) εναλλαγή ισοτύπου Σωματική υπερμεταλλαξιγένεση Η σωματική υπερμεταλλαξιγένεση (ΣΥΜ, somatic hypermutation - SHM) περιλαμβάνει την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων στις μεταβλητές περιοχές των ανασυνδυασμένων γονιδίων της βαριάς και των ελαφριών αλυσίδων ως συνέπεια της επαφής με το αντιγόνο με σκοπό την παραγωγή ανοσοσφαιρινών με υψηλή συγγένεια για το αντιγόνο 44. Η διεργασία αυτή ονομάζεται ωρίμανση συγγένειας (affinity maturation). Η εισαγωγή 33

34 μεταλλάξεων κατά τη σωματική υπερμεταλλαξιγένεση γίνεται με πολύ υψηλή συχνότητα (10-3 /bp/κυτταρική γενιά) 39,40. Η σωματική υπερμεταλλαξιγένεση φαίνεται να στοχεύει συχνότερα σε μερικά κωδικόνια των V γονιδίων, σε σχέση με άλλα 45. Τα σημεία αυτά ονομάζονται «επίκεντρα» ( hotspots ) για εισαγωγή μεταλλάξεων και συχνά είναι μοτίβα τριών ή τεσσάρων νουκλεοτιδίων όπως τα RGYW, WRCY και GNW (R: πουρίνη, Y: πυριμιδίνη, W: A ήt) 46,47. Γενικότερα, κατά το μοριακό μηχανισμό της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης υπάρχει προτίμηση για μεταβάσεις (transitions) έναντι των μεταπτώσεων (transversions), επιλεκτική στόχευση των πουρινών έναντι των πυριμιδινών και επικράτηση των σημειακών μεταλλάξεων σε σχέση με τις ελλείψεις (deletions) ή ενθέσεις (insertions) 48. Καθοριστικό ρόλο στο μηχανισμό της ΣΥΜ διαδραματίζει το ένζυμο δεαμινάση της κυτιδίνης (activationinduced cytidine deaminase - AID) και οι επιρρεπείς σε λάθη πολυμεράσες (error-prone polymerases) Η εναλλαγή ισοτύπου Οι βαριές αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών υφίστανται περαιτέρω ανασυνδυασμό κατά τον οποίο το γενετικό σύμπλοκο VDJ μπορεί να συνδυαστεί με οποιοδήποτε γονίδιο C. Ο συνδυασμός μιας μεταβλητής περιοχής με διαφορετικές σταθερές περιοχές διασφαλίζει ότι τα αντισώματα μιας ορισμένης ειδικότητας μπορεί να εκφράζονται με διαφορετικούς ισοτύπους και κατά συνέπεια να έχουν διαφορετική λειτουργία. Η εναλλαγή ισοτύπου είναι μη αντιστρεπτή διαδικασία, η οποία επιτυγχάνεται με ανασυνδυασμό μεταξύ ειδικών αλληλουχιών εναλλαγής (switch regions), που εντοπίζονται περίπου 2 kb στην 5 θέση κάθε C γονιδίου (εκτός του Cδ) 43. Κατ αυτόν τον τρόπο το σύμπλοκο VDJ συνδέεται και εκφράζεται και με τα υπόλοιπα γονίδια της σταθερής περιοχής. Η εναλλαγή ισοτύπου είναι αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης του υποδοχέα CD40 του B λεμφοκυκυττάρου με το συνδέτη CD40L ενός Τ λεμφοκυττάρου παρουσία κυτοκινών, όπως οι IFNγ, IL-4, και TGFβ. Στον ποντικό, οι ιντερλευκίνες κατευθύνουν τη διεργασία προκαλώντας επιλεκτικά εναλλαγές προς διαφορετικούς ισοτύπους (πχ. IFNγ: IgG3, IgG2a, IL-4: IgG1, IgE, TGFβ: IgG2β, IgA). Οι κυτοκίνες ενεργοποιούν υποκινητές που βρίσκονται στο 5 άκρο κάθε αλληλουχίας εναλλαγής, οδηγώντας σε παραγωγή «στείρων» μεταγράφων (sterile transcripts, δηλαδή μεταγράφων που δε μεταφράζονται). Η μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων C συμβαίνει πριν από τη εναλλαγή ισοτύπου. Τα μετάγραφα που παράγονται δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνη αλλά φαίνεται να κατευθύνουν σε επίπεδο 34

35 DNA τον μηχανισμό της εναλλαγής ισοτύπου 54. Η δεαμινάση της κυτιδίνης (AID) παίζει κύριο ρόλο στην έναρξη και αυτής της διαδικασίας 52, Β λεμφοκύτταρα 4.1. Ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων στο μυελό των οστών Τα Β λεμφοκύτταρα αναπτύσσονται από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (hematopoietic stem cells - HSC) μέσω μιας διαδικασίας ωρίμανσης που διαδραματίζεται στο εμβρυικό ήπαρ πριν τη γέννηση και το μυελό των οστών μετά τη γέννηση 55. H ανάπτυξη λειτουργικών Β λεμφοκυττάρων εξελίσσεται σε ποικίλα στάδια διαφοροποίησης, καθένα από τα οποία καθορίζεται από τις αναδιατάξεις των γονίδιων των ανοσοσφαιρινών και την έκφραση προσαρμοστικών μορίων και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων στην επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων 1,56,57. Τα αιμοποιητικά κύτταρα διαφοροποιούνται και πολλαπλασιάζονται σε στενή επαφή με τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών έτσι ώστε να λαμβάνουν τα απαραίτητα σήματα για την κανονική ανάπτυξη και ωρίμανσή τους 58. Αρχικά, τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (HCS) διαφοροποιούνται σε πολυδύναμα προγονικά κύτταρα (multipotent progenitor MPP) 57,59. Από τον MPP προκύπτει ο κοινός πρόγονος της μυελικής σειράς (common myeloid progenitor - CMP) 60 και ο πρώιμος λεμφοειδής πρόγονος (early lymphoid progenitor - ELP) 61. Τα CMP κύτταρα αποδίδουν κύτταρα της μυελικής σειράς. Τα κύτταρα ELP διαφοροποιούνται στο θύμο αδένα σε κύτταρα ETP (early T-cell-lineage progenitors - ETPs) και αποδίδουν τα Τ λεμφοκύτταρα, ενώ στο μυελό διαφοροποιούνται περαιτέρω στον κοινό λεμφοειδή πρόγονο (common lymphoid progenitor - CLP). Ο CLP βρίσκεται ακριβώς ένα βήμα πριν από τη δέσμευση στη Β λεμφική σειρά και χαρακτηρίζονται από την έκφραση των μορίων c-kit και του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-7 (IL-7R). Από τη διαφοροποίηση του, προκύπτουν ΝΚ-κύτταρα, Τ και Β λεμφοκύτταρα, καθώς και αντιγονοπαρουσιαστικά δενδριτικά κύτταρα (dendritic cells - DC) 62. Η ωρίμανση του CLP προς την Β λεμφική σειρά χαρακτηρίζεται από την έκφραση της ισομορφής Β220 του CD Ο δείκτης αυτός εκφράζεται σε όλα τα στάδια διαφοροποίησης των Β-λεμφοκυττάρων και τα επίπεδα του αυξάνουν κατά τη μετάβαση των Β-λεμφοκυττάρων σε ωριμότερα στάδια διαφοροποίησης. 35

36 Αναδιατάξεις των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Στον κοινό πρόδρομο των λεμφοκυττάρων, τα γονίδια των ανοσοσφαιρινών δεν έχουν αναδιαταχθεί και τα γονίδια ενεργοποίησης του ανασυνδυασμού (Rag1 και Rag2) εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα. Οι αναδιατάξεις των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών συμβαίνουν ιεραρχικά (Εικόνα 8) και ξεκινούν στο στάδιο του πρώιμου προ-προ Β λεμφοκυττάρου (early pro B cell) 66. Η πρώτη αναδιάταξη γίνεται και στα δύο αλληλόμορφα της βαριάς αλυσίδας μεταξύ γονιδίων IGHD και IGHJ και ακολουθεί, στο στάδιο του όψιμου προ-προ Β κυττάρου (late pro-b), ο ανασυνδυασμός μεταξύ ενός γονιδίου IGHV και του γενετικού συμπλόκου IGHD-IGHJ. Η μετάβαση από τον ανασυνδυασμό μεταξύ των γονιδίων IGHD και IGHJ στον ανασυνδυασμό IGHV-IGHD-IGHJ απαιτεί την παρουσία της IL-7, τους μεταγραφικούς παράγοντες Pax5 και YY1 και υψηλά επίπεδα των Rag1/Rag2 67,68. Εικόνα 8. Η διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων στο μυελό των οστών και τα περιφερικά λεμφικά όργανα. (Τροποποιημένη από Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Figure 8. Development of B cells in the bone marrow and the periphery. (Modified from Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) 36

37 Η περαιτέρω ωρίμανση των προ-προ Β λεμφοκυττάρων εξαρτάται από τον επιτυχημένο ανασυνδυασμό και την έκφραση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών της βαριάς αλυσίδας. Τα προ-προ Β κύτταρα που αποτυγχάνουν να δώσουν λειτουργικό ανασυνδυασμό IGHV- IGHD-IGHJ υφίστανται απόπτωση και φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα του μυελού των οστών 66. Υπολογίζεται ότι μόνο στο 1/3 των προ-προ Β λεμφοκυττάρων ο ανασυνδυασμός IGHV-IGHD-IGHJ καταλήγει σε λειτουργικό προϊόν, με αποτέλεσμα τη μετάβαση στο στάδιο του μεγάλου προ Β λεμφοκυττάρου (large pre B cell) 69. Στο στάδιο του μεγάλου προ Β λεμφοκυττάρου η βαριά αλυσίδα εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ τα γονίδια της ελαφριάς αλυσίδας δεν έχουν ακόμη αναδιαταχθεί. Στην επιφάνεια του κυττάρου εκφράζεται ο προ-β υποδοχέας (pre-bcr) ο οποίος αποτελείται από τη διαμεμβρανική μορφή της βαριάς αλυσίδας μ, μια «υποκαθιστώσα» ελαφριά αλυσίδα (surrogate light chain - SLC) και τους συνυποδοχείς Igα και Igβ. Η SLC αλυσίδα κωδικοποιείται από τα γονίδια VpreΒ και λ5. Τα γονίδια αυτά δεν αναδιατάσσονται και είναι ομόλογα με τα γονίδια της μεταβλητής και της σταθερής περιοχής της λ ελαφριάς αλυσίδας, αντίστοιχα 55,70. Οι νεοσυντεθειμένες βαριές αλυσίδες ελέγχονται ως προς την ικανότητά τους να συνδεθούν με την «υποκαθιστώσα» ελαφριά αλυσίδα. Ακόμη και από έναν λειτουργικό ανασυνδυασμό IGHV-IGHD-IGHJ μπορεί να προκύψει βαριά αλυσίδα ανίκανη να προσδεθεί με την SLC ελαφριά αλυσίδα. Υπολογίζεται ότι μόνο οι μισές βαριές αλυσίδες μπορούν να συνδεθούν επιτυχημένα με την υποκαθιστώσα ελαφριά αλυσίδα 71,72. Η έκφραση λειτουργικού pre-bcr απαιτείται για την περαιτέρω διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων και είναι σημαντικό σημείο ελέγχου της ανάπτυξής τους. Ο pre-bcr μεταβιβάζει πολλαπλά σήματα στο αναπτυσσόμενο Β λεμφοκύτταρο με συνέπεια (i) αναστολή της απόπτωσης, (ii) πολλαπλασιασμό του κυττάρου με 3 ή 4 κυτταρικές διαιρέσεις και (iii) παύση του ανασυνδυασμού με καταστολή της έκφρασης ποικίλων γονιδίων όπως RAG1/RAG2 και TdT, συμβάλλοντας έτσι στον αλληλομορφικό αποκλεισμό 73. Στο στάδιο του μικρού προ Β λεμφοκυττάρου (small pre B cell) ο προ-β υποδοχέας παύει να εκφράζεται, ο πολλαπλασιασμός σταματάει, τα γονίδια RAG, που είχαν προσωρινά κατασταλεί, ενεργοποιούνται ξανά και αρχίζει η αναδιάταξη των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων. Ο αλληλομορφικός αποκλεισμός στο επίπεδο των ελαφριών αλυσίδων φαίνεται να επιτυγχάνεται μέσω περιορισμένης προσβασιμότητας του μηχανισμού του ανασυνδυασμού στους γενετικούς τόπους των ελαφριών αλυσίδων. Οι αναδιατάξεις των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων συμβαίνουν διαδοχικά και καθεμία ελέγχεται για την 37

38 καταλληλότητά της να συνδεθεί με την ήδη υπάρχουσα βαριά αλυσίδα πριν ο μηχανισμός αναδιάταξης προχωρήσει σε νέο ανασυνδυασμό 74. O γενετικός τόπος IGK κατά κανόνα αναδιατάσσεται μετά τα γονίδια της βαριάς αλυσίδας. Οι ανακατατάξεις στο γενετικό τόπο της λ ελαφριάς αλυσίδας ξεκινούν με συχνότητα 5 φορές χαμηλότερη συγκριτικά με τις αναδιατάξεις στα αλληλόμορφα της κ ελαφριάς αλυσίδας και συνήθως στα αναπτυσσόμενα Β κύτταρα που έχουν μη παραγωγικές αναδιατάξεις στα γονίδια της κ ελαφριάς αλυσίδας 75,76. Όταν το προ Β λεμφοκύτταρο αποκτήσει μια παραγωγική αναδιάταξη και για την ελαφριά αλυσίδα, ο ΒΚΥ που αποτελείται από την βαριά αλυσίδα μ και την ελαφριά αλυσίδα σε συνδυασμό με τους συνυποδοχείς Igα και Igβ εκφράζεται στην επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων. Σε αυτό το στάδιο (ανώριμο Β λεμφοκύτταρο), τα Β λεμφοκύτταρα αποκτούν την ικανότητα ν αναγνωρίζουν πολυμορφικά αντιγόνα και υπόκεινται τόσο σε αρνητική επιλογή με σκοπό την εξάλειψη δυνητικά αυτοδραστικών κυττάρων, όσο και σε θετική επιλογή που μπορεί να προάγει την ωρίμανση σε μακρόβια περιφερικά Β λεμφοκύτταρα 66. Η αυτοανοχή (self tolerance) εξασφαλίζεται με τους τρεις παρακάτω μηχανισμούς 56,75 : - Απαλοιφή κλώνων (clonal deletion): ανώριμα Β λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν πολυσθενή αντιγόνα μέσω της επιφανειακής IgM υφίστανται εξάλειψη με απόπτωση. - Ανεργία (anergy): ανώριμα Β λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνα με μικρή συγγένεια πρόσδεσης γίνονται ανεργικά, χάνουν την επιφανειακή IgM (διατηρούν, ωστόσο, IgM στο κυτταρόπλασμα), ενώ στην επιφάνεια εκφράζουν υψηλά επίπεδα IgD. - Διόρθωση υποδοχέα (receptor editing): πολύ συχνά η πρόσδεση της IgM στον αντίστοιχο προσδέτη ενεργοποιεί το αυτοαντιδραστικό ανώριμο Β λεμφοκύτταρο να ενεργοποιήσει ξανά την έκφραση των πρωτεϊνών RAG-1 και -2 επιτρέποντας να συμβεί περαιτέρω ανασυνδυασμός. H διαδικασία αυτή μπορεί να προκαλέσει αντικατάσταση της ελαφριάς αλυσίδας, δημιουργώντας έτσι νέα αντιγονική ειδικότητα Ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια Τα Β λεμφοκύτταρα με καθόλου ή χαμηλή συγγένεια για αυτοαντιγόνα μετακινούνται προς την περιφέρεια. Σε αυτό το στάδιο αυξάνει η έκφραση της επιφανειακής IgM, ενώ παράλληλα αρχίζει η σύνθεση και έκφραση της επιφανειακής IgD ανοσοσφαιρίνης, με αποτέλεσμα τα ανώριμα κύτταρα να μεταπίπτουν σε ένα μεταβατικό στάδιο ωρίμανσης 38

39 τους (migm +++ migd +/- ). Τα κύτταρα αυτά καλούνται μεταβατικά (transitional) Β λεμφοκύτταρα και είναι ο σύνδεσμος μεταξύ των ανώριμων Β λεμφοκυττάρων του μυελού των οστών και των ώριμων περιφερικών Β λεμφοκυττάρων 77. Τα μεταβατικά Β λεμφοκύτταρα επιλέγονται στο ρεπερτόριο των ώριμων Β λεμφοκυττάρων είτε ως κύτταρα της οριακής ζώνης (marginal zone) είτε ως λεμφοζιδιακά Β λεμφκύτταρα (follicular - FO) Λεμφοζιδιακά Β λεμφοκύτταρα Follicular B cells Τα κύτταρα των λεμφοζιδίων (FO) έχουν φαινότυπο IgD high, IgM low, είναι σχετικά βραχύβια κύτταρα με χρόνο ημιζωής περίπου 2-3 μήνες. Τα FO κύτταρα είναι η κύρια πηγή μεταλλαγμένων ανοσοσφαιρινών που έχουν υποστεί μεταστροφή ισοτύπου και εμπλέκονται στις κλασικές Τ εξαρτώμενες απαντήσεις 66. Τα FO κύτταρα αποτελούν την πλειονότητα των σπληνικών Β λεμφοκυττάρων και εντοπίζονται στα πρωτογενή λεμφοζίδια ή θυλάκια τα οποία ανατομικά βρίσκονται δίπλα στις ζώνες των Τ λεμφοκυττάρων, έτσι ώστε να επιτρέπεται η αλληλεπίδραση των ενεργοποιημένων Τ και Β λεμφοκυττάρων. Όταν τα FO κύτταρα συναντήσουν αντιγόνα και ενεργοποιηθούν από τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα, πολλαπλασιάζονται πρώτα στις περιοχές των Τ λεμφοκυττάρων, οι οποίες επιτρέπουν εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Τ, των Β και των δενδριτικών κυττάρων. Στη συνέχεια, μερικά από τα διεγερμένα κύτταρα μεταναστεύουν στο κέντρο των λεμφοζιδίων. Επτά έως 10 ημέρες μετά την ανοσοποίηση, τα δευτερογενή λεμφοζίδια αποκτούν πολικότητα και το μικροοπεριβάλλον που δημιουργείται ονομάζεται βλαστικό κέντρο (germinal center) 66,78. Το βλαστικό κέντρο είναι ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον που συμμετέχει στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων (Εικόνα 9). Σε κάθε πόλο του βλαστικού κέντρου σχηματίζονται δυο περιοχές, η σκοτεινή ζώνη και η φωτεινή ζώνη. Στη σκοτεινή ζώνη των λεμφοζιδίων, τα Β λεμφοκύτταρα, που σε αυτή τη φάση ονομάζονται κεντροβλάστες, μειώνουν την έκφραση της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης, πολλαπλασιάζονται με ταχύ ρυθμό και υπόκεινται σε σωματική υπερμεταλλαξιγένεση, που αυξάνει πολύ την ποικιλότητα των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών, και σε εναλλαγή ισοτύπου. Στη συνέχεια τα κύτταρα μετακινούνται στον αντίθετο πόλο του βλαστικού κέντρου (φωτεινή ζώνη), όπου συγκεντρώνονται τα κεντροκύτταρα. Τα κεντροκύτταρα είναι μικρά, μη διαιρούμενα κύτταρα τα οποία προκύπτουν έπειτα από ωρίμανση των κεντροβλαστών 39

40 και εκφράζουν τη μεταλλαγμένη ανοσοσφαιρίνη επιφανείας που μπορεί να δεσμεύει το αντιγόνο καλύτερα, λιγότερο καλά ή καθόλου. Στη φωτεινή ζώνη υπάρχουν επίσης τα δενδριτικά κύτταρα των λεμφοζιδίων (follicular dendritic cells - FDC), CD4 Τ λεμφοκύτταρα και κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου, που παρουσιάζουν το αντιγόνο για μεγάλες περιόδους στην επιφάνεια τους και παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιλογή κεντροκυττάρων που δεσμεύουν το αντιγόνο με υψηλή συγγένεια. Τα κεντροκύτταρα με χαμηλή συγγένεια για το αντιγόνο πεθαίνουν με απόπτωση, ενώ όσα εκφράζουν μεταλλαγμένη ανοσοσφαιρίνη που προσδένει ικανοποιητικά το αντιγόνο δέχονται σήματα επιβίωσης από τα αντιγοοειδικά Τ λεμφοκύτταρα, εκφράζουν τελικά το αντιαποπτωτικό γονίδιο bcl-2 και διασώζονται από την απόπτωση. Τα Β λεμφοκύτταρα με υποδοχείς υψηλής συγγένειας που επιλέγονται από αντιγόνο εγκαταλείπουν το βλαστικό κέντρο και μετατρέπονται σε πλασματοκύτταρα (εκκρίνουν αντισώματα) ή σε Β λεμφοκύτταρα μνήμης. Τα πλασματοκύτταρα είναι τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα. Η διαφοροποίηση σε πλασματοκύτταρα φαίνεται ότι καθορίζεται από την παρουσία μορίων CD23, διαλυτών ή δεσμευμένων στα FDC. Ζουν τέσσερις εβδομάδες στο μυελό των οστών ή στη βασική μεμβράνη των βλεννογόνων, έτσι ώστε να περιορίζεται ο χρόνος της ανοσοαπόκρισης. Τα πλασματοκύτταρα εκφράζουν χαμηλά ή ανύπαρκτα επίπεδα επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης και MHCII και έτσι η έκκριση αντισωμάτων είναι ανεξάρτητη από την επίδραση του αντιγόνου ή των βοηθητικών Τ λεμφοκυττάρων 79. Τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης, αντίθετα από τα πλασματοκύτταρα, είναι μακρόβια κύτταρα σε ηρεμία τα οποία δεν παράγουν αντισώματα. Ωστόσο, διαθέτουν υποδοχέα με υψηλή συγγένεια για το αντιγόνο και έχουν υποστεί εναλλαγή ισοτύπου. Τα κύτταρα αυτά, σε επόμενη επαφή με το αντιγόνο, μπορεί να διαφοροποιηθούν σε πλασματοκύτταρα και να εκδηλώσουν ταχύτερη και εντονότερη δευτερογενή ανοσοαπόκριση. Επίσης, δεν περιορίζονται στο σημείο της αλληλεπίδρασης με το αντιγόνο, αλλά κυκλοφορούν στην περιφέρεια. Η διαφοροποίηση σε Β λεμφοκύτταρα μνήμης ίσως διεγείρεται από το συνδέτη του CD40 (CD40-L) των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων που υπάρχουν στις Τ- ζώνες

41 Εικόνα 9. Κυτταρικά γεγονότα που λαμβάνουν χώρα στα βλαστικά κέντρα κατά την ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων. (Τροποποιημένη από Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) Figure 9. Cellular events taking place in the germinal center during B cell maturation. (Modified from Goldsby RA, Immunology, 6th Ed, W H Freeman & Co) B κύτταρα της οριακής ζώνης του σπληνός (Splenic Marginal Zone B cells MZ B cells) Τα Β κύτταρα της οριακής ζώνης (ΜΖ Β κύτταρα) εντοπίζονται στην οριακή ζώνη (κυρίως του σπλήνα) αλλά και στις υποεπιθηλιακές περιοχές στις αμυγδαλές και στις πλάκες Peyer 81. Έχουν μερικώς ενεργοποιημένο φαινότυπο (IgM high IgD low/- CD23 - CD21 high CD1c high ) και ικανότητα αυτοανανέωσης 66. Τα MZ κύτταρα παίζουν κομβικό ρόλο στις θυμοανεξάρτητες ανοσοαποκρίσεις εναντίον αντιγόνων με πολύ επαναληπτικές δομές (TI-2 αντιγόνων), όπως οι βακτηριακοί πολυσακχαρίτες 82,83. 41

42 Στον άνθρωπο, η σωστή ανάπτυξη της οριακής ζώνης του σπλήνα καθυστερεί μέχρι την ηλικία των δύο ετών. Αυτό ίσως σχετίζεται με την ανικανότητα των βρεφών να εκδηλώσουν αποτελεσματική ανοσοαπόκριση σε πολυσακχαριτιδικά αντιγόνα 82, Επιπλέον, η σπληνεκτομή οδηγεί σε αυξημένη ευπάθεια σε βακτήρια με πολυσακχαριτιδική κάψα 87. Ακόμη πιο άμεσες ενδείξεις για το ρόλο των ΜΖ λεμφοκυττάρων στις ανοσοαποκρίσεις εναντίον ΤΙ-2 αντιγόνων προέρχονται από in vivo πειράματα σε ποντίκια στα οποία απουσιάζουν τα ΜΖ λεμφοκύτταρα. Τα συγκεκριμένα ζώα παρουσιάζουν ελαττωματικές ανοσοαποκρίσεις σε τεχνητά αντιγόνα με επαναληπτική δομή και σε Gram αρνητικά βακτήρια 66,88. Μολονότι τα ΜΖ Β λεμφοκύτταρα αντιπροσωπεύουν μόνο το 5% των Β λεμφοκυττάρων του σπλήνα, παίζουν κεντρικό ρόλο στις πρώιμες ανοσοαποκρίσεις σε αντιγόνα που βρίσκονται στην κυκλοφορία του αίματος. Μαζί με τα Β1 λεμφοκύτταρα (κεφάλαιο 4.2.3) γεφυρώνουν το χρονικό χάσμα μεταξύ των έμφυτων άνοσων απαντήσεων που ενεργοποιούνται εντός μερικών ωρών ή και λιγότερο και των ειδικών ανοσοαποκρίσεων που απαιτούν σχεδόν δυο εβδομάδες για να κορυφωθούν 66,87. Επειδή όμως τα MZ κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα των αντιγόνων MHC II και των πρωτεϊνών Β7.1 και Β7.2, που αποτελούν βασικής σημασίας συνδιεγέρτες των Τ λεμφοκυττάρων, μπορούν να παρουσιάσουν πρωτεϊνικά αντιγόνα στα CD4 + T λεμφοκύτταρα κι έτσι να συμμετέχουν και στις θυμοεξαρτημένες απαντήσεις εναντίον πρωτεϊνικών αντιγόνων που κυκλοφορούν στο αίμα 79,89,90. Επιπλέον, τα ΜΖ Β κύτταρα μπορούν να συγκεντρώσουν μεταλλάξεις με τη διεργασία της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης και να αλλάξουν τον ισότυπό τους 84, B1 κύτταρα Τα B1 κύτταρα έχουν φαινότυπο IgM high IgD low/- CD5 + και εμπλέκονται στις θυμοανεξάρτητες αντιδράσεις στους βλεννογόνους. Αφθονούν στην περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών, είναι μακρόβια και αυτοανανεούμενα. Τα Β-1b κύτταρα έχουν Β-1 φαινότυπο, αλλά δεν εκφράζουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD5. Τα Β-1 κύτταρα θεωρούνται ως πρώτη γραμμή άμυνας εναντίον μικροβίων και παράγουν πολυαντιδραστικά ή φυσικά αντισώματα. Σπανίως συγκεντρώνουν μεταλλάξεις στα γονίδια IGHV ή αλλάζουν τον ισότυπο τους από IgM σε άλλους ισοτύπους 92. Παραμένει άγνωστο αν υπάρχει ξεχωριστός Β-1 κυτταρικός πληθυσμός με μοναδικό γενετικό πρόγραμμα 93 ή αν τα κύτταρα αυτά επάγονται από τις αλληλεπιδράσεις του ΒΚΥ με το αντιγόνο 94, μολονότι έχει αναφερθεί ένας πρόδρομος για τα Β1 κύτταρα του ποντικού

43 Στον άνθρωπο, η ύπαρξη B-1 λεμφοκυττάρων είναι αμφιλεγόμενη. Ωστόσο, σε πρόσφατη έρευνα προσδιορίστηκε ένας πληθυσμός Β λεμφοκυττάρων με φαινότυπο CD20 + CD27 + CD43 + CD70 - ως τα ανθρώπινα ανάλογα των Β1 κυττάρων Σηματοδότηση μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα (ΒΚΥ) Στα Β λεμφοκύτταρα το μόριο της ανοσοσφαιρίνης από μόνο του δεν έχει καμία σηματοδοτική ικανότητα. Στην επιφάνεια του κυττάρου οι βαριές αλυσίδες της ανοσοσφαιρίνης είναι συνδεδεμένες με μη ομοιοπολικούς δεσμούς με τα βοηθητικά μόρια Igα (CD79a) και Igβ (CD79b) κι έτσι δημιουργείται το πλήρως λειτουργικό σύμπλοκο του ΒΚΥ που είναι απαραίτητο για τη μεταβίβαση σημάτων. Το κυτταροπλασματικό τμήμα των μορίων Igα και Igβ περιέχει μια αλληλουχία ενεργοποίησης των ανοσοϋποδοχέων (immunereceptor tyrosine-based activation motif, ITAM) και είναι απαραίτητη για τη σηματοδοτική λειτουργία του. Οι ITAM περιέχουν κατάλοιπα τυροσίνης, τα οποία, μετά τη σύνδεση του αντιγόνου στον υποδοχέα, φωσφορυλιώνονται από κινάσες της οικογένειας Src όπως οι Fyn, Blk, Hck, Fgr και Lyn. Η φωσφορυλίωση των ΙΤΑΜ παρέχει θέσεις για την επιστράτευση της πρωτεϊνικής κινάσης Syk που ενεργοποιείται με φωσφορυλίωσή της από πρωτεϊνικές κινάσες της οικογένειας Src ή με αυτοφωσφορυλίωση. Μόλις ενεργοποιηθεί, η Syk μεταδίδει το σήμα μέσω φωσφορυλίωσης καθοδικών σηματοδοτικών μορίων και αλληλεπιδράσεων με διάφορες πρωτεΐνες προσαρμογείς. Αυτός ο καταρράκτης αντιδράσεων έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση δύο κρίσιμων σηματοδοτικών μορίων, της 3-κινάσης της φωσφατίδυλοϊνοσιτόλης (phosphatidylinositol 3- kinase - PI3K) και της φωσφολιπάσης Cγ2 (phospholipase Cγ2 - PLCγ2) 97. Η PI3K οδηγεί στην ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K/Akt που προάγει την επιβίωση των Β λεμφοκυττάρων επάγοντας την έκφραση αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως η Mcl-1 (myeloid cell leukemia-1) και η XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), και απενεργοποιώντας προ-αποπτωτικές πρωτείνες, όπως η BAD (Bcl2 antagonist of cell death) και οι κασπάσες 98,99. Η ενεργοποίηση της PLCγ2 οδηγεί σε απελευθέρωση ενδοκυττάριου Ca 2+ κι ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC). Ο σηματοδοτικός καταρράκτης συνεχίζει με την ενεργοποίηση MAP κινασών (mitogen-activated protein kinases - MAPKs), όπως η ERK (extracellular signal-regulated kinase), η JNK (c-jun NH2-terminal kinase) και η p38, καθώς και μεταγραφικών παραγόντων, μεταξύ άλλων οι NF-κB (nuclear factor-κb) και NF-AT (nuclear factor of activated T cells). Ο βαθμός ενεργοποίησης αυτών των σηματοδοτικών μορίων τελικά καθορίζει το πεπρωμένο του Β λεμφοκυττάρου

44 Εικόνα 10. Μεταγωγή σήματος μέσω του ΒΚΥ. (Τροποποιημένη από Stevenson F et al; Blood 2011; 118: ) Figure 10. Signal transduction through the BCR. (Modified from Stevenson F et al; Blood 2011; 118: ) Η ενεργοποίηση του NF-κB ευνοεί την επιβίωση του Β λεμφοκυττάρου επάγοντας την έκφραση πολλών αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως οι Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) και Bcl-xL 100,101. Ο ρόλος των τριών MAP κινασών είναι λιγότερο σαφής καθώς η ενεργοποίησή τους έχει συσχετιστεί τόσο με πολλαπλασιασμό όσο και με απόπτωση των Β λεμφοκυττάρων. Παρόλ αυτά, για μια ολοκληρωμένη ανοσοαπόκριση είναι απαραίτητη η ενεργοποίηση όλων των παραπάνω κλάδων της σηματοδότησης (Εικόνα 10) 101, Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) 5.1. Γενικά Η ΧΛΛ είναι η πιο κοινή μορφή λευχαιμίας στο Δυτικό ημισφαίριο, με συχνότητα περίπου 5 νέες περιπτώσεις ανά άτομα ετησίως. Προσβάλλει κυρίως ηλικιωμένους, και περισσότερο άνδρες (αναλογία Α:Γ = 2:1). Χαρακτηρίζεται από κλωνικό 44

45 πολλαπλασιασμό και σταδιακή συσσώρευση νεοπλασματικών Β λεμφοκυττάρων στο αίμα, το μυελό των οστών, τους λεμφαδένες και το σπλήνα. Δεν υπάρχουν ενδείξεις που να ενοχοποιούν την έκθεση σε χημικούς παράγοντες και σε ακτινοβολία, ως αιτιοπαθογενετικούς παράγοντες για την πρόκληση της ΧΛΛ 103. Αντίθετα, φαίνεται να υπάρχει προδιάθεση για την ανάπτυξη της νόσου σε συγγενείς πρώτου και δεύτερου βαθμού ασθενών με ΧΛΛ 104. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η νόσος αυτή σπάνια εμφανίζεται στην Ινδία, την Κίνα και την Ιαπωνία, χωρίς όμως να είναι διευκρινισμένος ο λόγος αυτής της γεωγραφικής κατανομής της νόσου Διάγνωση Η διάγνωση της ΧΛΛ τίθεται πλέον όταν υπάρχουν 5000/μl μονοκλωνικά B λεμφοκύτταρα στο περιφερικό αίμα με συγκεκριμένους χαρακτηριστικούς μορφολογικούς και ανοσοφαινοτυπικούς δείκτες (μονοκλωνικότητα της ελαφριάς αλυσίδας, συνέκφραση των δεικτών CD5 και CD19 με τον δείκτη CD23, χαμηλά επίπεδα επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης και χαμηλά επίπεδα έκφρασης ή απουσία των δεικτών CD79b και CD20) για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 3 μηνών Σταδιοποίηση και πρόγνωση Η σταδιοποίηση της νόσου γίνεται σύμφωνα με τα συστήματα Rai 107 και Binet 108. Tα συστήματα ταξινόμησης βασίζονται στη φυσική εξέταση, από την οποία καθορίζεται η παρουσία ή όχι ηπατοσπληνομεγαλίας και περιφερικής λεμφαδενοπάθειας, και σε ορισμένες αιματολογικές εξετάσεις ρουτίνας που αναδεικνύουν την ύπαρξη ή όχι λεμφοκυττάρωσης, αναιμίας και θρομβοπενίας. Η κλινική πορεία της ΧΛΛ εμφανίζει μεγάλη ετερογένεια: μερικοί ασθενείς επιβιώνουν για πολλά χρόνια χωρίς θεραπεία και τελικά πεθαίνουν από άλλα αίτια, ενώ άλλοι έχουν επιθετική νόσο και μικρή επιβίωση 109. Η κλινική ετερογένεια είναι συνυφασμένη με την ετερογένεια που παρατηρείται σε γενετικό και φαινοτυπικό επίπεδο (Εικόνα 11) Κυτταρογενετικές ανωμαλίες Η συχνότητα ανίχνευσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών στα κλωνογενή κύτταρα φθάνει έως και το 80% των περιπτώσεων με τη μέθοδο του φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH) 110. Περίπου 50% των ασθενών παρουσιάζουν μια μόνο κυτταρογενετική ανωμαλία, 20% δυο κυτταρογενετικές ανωμαλίες, ενώ στο 10% των περιπτώσεων ο λευχαιμικός κλώνος 45

46 φέρει πάνω από δυο κυτταρογενετικές ανωμαλίες 111. Παρότι δεν υπάρχει μια συγκεκριμένη κυτταρογενετική βλάβη που να θεωρείται ειδική για τη ΧΛΛ, κάποιες ανωμαλίες όπως ελλείψεις των χρωμοσωμάτων 13q, 11q, 17p και τρισωμία του χρωμοσώματος 12 παρατηρούνται συχνότερα και αποτελούν δείκτες με προγνωστική αξία. Για παράδειγμα, η έλλειψη στο χρωμόσωμα 13q θεωρείται δείκτης καλής πρόγνωσης, η τρισωμία του χρωμοσώματος 12 έχει συσχετιστεί με δυσμενή πρόγνωση, ενώ ελλείψεις 17p όπου εντοπίζεται το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 σχετίζονται με κακή πρόγνωση και ανθεκτικότητα στη θεραπεία 109,111, Μεταλλάξεις σε γονίδια Η έλευση αναπτυγμένων τεχνολογιών για τη ανάλυση της αλληλουχίας του DNA (Next Generation Sequencing - NGS), επέτρεψε τον προσδιορισμό πρόσθετων γενετικών ανωμαλιών στο γονιδίωμα των ΧΛΛ κυττάρων. Χαρακτηριστικά γονίδια στα οποία εντοπίζονται συχνά μεταλλάξεις είναι τα TP53, Notch1, SF3B1, BIRC3 και το MyD Πρότυπο έκφρασης των microrna Ένας νέος παράγοντας με πιθανή προγνωστική αξία είναι το πρότυπο έκφρασης των microrna 114. Mελέτες έδειξαν ότι η έκφραση συγκεκριμένου πάνελ micrornas (mir186, mir132, mir16-1, mir102, και mir29c) συνδέεται με καλύτερη πρόγνωση 115. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι δύο microrna (mirn15a/mirn16-1) εντοπίζονται στην περιοχή 13q , που αποτελεί ιδιαίτερα συχνό στόχο για χρωμοσωμικές ελλείψεις στη ΧΛΛ CD38 Ο δείκτης CD38 είναι διαμεμβρανική πρωτεΐνη που μέσω της σύνδεσής της με τον προσδέτη της (CD31) προάγει τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των ΧΛΛ κυττάρων 117. Οι CD38 θετικές ΧΛΛ περιπτώσεις έχουν ταχεία εξέλιξη της νόσου και μικρότερη συνολική επιβίωση Παρόλα αυτά, υπάρχει ακόμη σκεπτικισμός όσον αφορά το ποσοστό έκφρασης του δείκτη που μπορεί να διαχωρίσει καλύτερα τους ασθενείς καλής και κακής πρόγνωσης, και τη σταθερότητα του κατά τη διάρκεια της νόσου, ειδικά μετά τη θεραπεία ZAP70 Η ZAP70 είναι κυτταροπλασματική κινάση της τυροσίνης με δομική ομολογία με την κινάση Syk και παίζει ρόλο στη μεταβίβαση σημάτων από τον Τ κυτταρικό υποδοχέα. 46

47 Εκφράζεται κυρίως στα Τ λεμφοκύτταρα και στα κυτταροκτόνα κύτταρα και λιγότερο στα Β λεμφοκύτταρα. Στα Β λεμφοκύτταρα η ZAP70 δεν είναι φωσφορυλιωμένη στα κρίσιμα κατάλοιπα που ρυθμίζουν την ενεργότητά της, συνεπώς δεν έχει σηματοδοτική λειτουργία αλλά εκτελεί κυρίως χρέη προσαρμογέα, επιστρατεύοντας σημαντικούς ρυθμιστές του σηματοδοτικού μονοπατιού 124. Υψηλά επίπεδα ZAP-70 (>20%) στη ΧΛΛ σχετίζονται με επιθετικότερη νόσο και μικρότερη επιβίωση (Εικόνα 11) 125,126. Εικόνα 11. Προγνωστικοί παράγοντες στη ΧΛΛ. (Τροποποιημένη από Zenz T et al; Nat Rev Cancer 2010; 10(1):37-50) Figure 11. Prognostic factors in CLL. (Modified from Zenz T et al; Nat Rev Cancer 2010; 10(1):37-50) Το φορτίο των μεταλλάξεων στα γονίδια IGHV Η ανάλυση των μεταλλάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών των λευχαιμικών κλώνων αποκάλυψε δυο κατηγορίες, με ή χωρίς σωματικές μεταλλάξεις 118,127. Οι αλληλουχίες των γονιδίων IGHV που έχουν διαφορές 2% σε σχέση με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο θεωρούνται ως «αμετάλλακτες». Τα γονίδια IGHV με διαφορές >2% από το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο θεωρούνται «μεταλλαγμένα». Tο όριο του 2% αρχικά επιλέχθηκε ώστε ν αποφευχθεί το ενδεχόμενο κάποιες από τις διαφορές ν αντιστοιχούν σε άγνωστους πολυμορφισμούς του γενετικού τόπου IGH. Το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV έχει καθιερωθεί ως ένας από τους σημαντικότερους γενετικούς δείκτες στον καθορισμό προγνωστικών υποομάδων στη ΧΛΛ. 47

48 Οι ασθενείς με μεταλλαγμένα γονίδια IGHV εμφανίζουν πιο ήπια κλινική εξέλιξη και μεγαλύτερη ολική επιβίωση ενώ οι ασθενείς με αμετάλλακτες αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV εμφανίζουν πιο επιθετική κλινική πορεία (Εικόνα 11) 118, Ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και στερεότυπες ανοσοσφαιρίνες στη Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία Η μελέτη των κλωνοτυπικών ανοσοσφαιρινών σε μοριακό επίπεδο έχει συνεισφέρει αποφασιστικά στην κατανόηση της μοριακής βάσης της ΧΛΛ και στην ανάδειξη ομάδων διαφορικής πρόγνωσης ενώ παρείχε σημαντικές ενδείξεις για το κύτταρο προέλευσης της ΧΛΛ. Η παρουσία σωματικών μεταλλάξεων θεωρείται ως χαρακτηριστικό γνώρισμα διέλευσης των κυττάρων μέσα από το βλαστικό κέντρο των δευτερογενών λεμφικών ιστών, που συνήθως ακολουθεί την in vivo συνάντηση με το αντιγόνο 128. Ωστόσο η απουσία σωματικών μεταλλάξεων δεν σημαίνει αναγκαστικά και απουσία προηγούμενης διέγερσης από το αντιγόνο, αλλά μπορεί να αντανακλά τον τύπο της αντιγονικής διέγερσης (π.χ θυμοανεξάρτητη διέγερση) ή το στάδιο στο οποίο συνέβη η μετάβαση από τη φυσιολογική στη νεοπλασματική κατάσταση του κυττάρου. Το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στη ΧΛΛ εμφανίζει επιλεκτικότητα και σημαντικές διαφορές από το αντίστοιχο των φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων. Ορισμένα γονίδια, όπως τα IGHV1-69, IGHV4-34, IGHV3-7 και IGHV3-23, είναι ιδιαίτερα συχνά στη ΧΛΛ σε αντίθεση με το φυσιολογικό ρεπερτότιο, αν και η σχετική συχνότητα διαφέρει στις διάφορες έρευνες 129,130. Διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ διαφορετικών γεωγραφικών περιοχών ίσως σχετίζονται και με γενετικές ιδιαιτερότητες των πληθυσμών 131. Επίσης, κάποια γονίδια συναντούνται συχνότερα στις αμετάλλακτες περιπτώσεις (π.χ IGHV1-69) 130 ενώ άλλα στις μεταλλαγμένες (π.χ IGHV4-34) 132,133. Η επιλεκτικότητα ως προς τη χρήση των γονιδίων IGHV λαμβάνεται ως ένδειξη ότι περιορισμένος αριθμός αντιγόνων ή δομικά όμοιων επιτόπων εμπλέκονται στην ανάπτυξη της νόσου διεγείροντας για πολλαπλασιασμό κύτταρα τα οποία εκφράζουν υποδοχείς που κωδικοποιούνται από συγκεκριμένα γονίδια. Μοναδικό χαρακτηριστικό του ρεπερτορίου των ανοσοσφαιρινών στη ΧΛΛ είναι η ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με σχεδόν ταυτόσημους ή πολύ όμοιους ΒΚΥ («στερεότυποι» ΒΚΥ) (χρησιμοποίηση των ίδιων γονιδίων IGHV και IGKV/IGLV με μοναδικά, κοινά μοτίβα VH CDR3 και CDR3 ελαφριών αλυσίδων)

49 Εικόνα 12. Συχνότητα των ετερογενών και των στερεότυπων αναδιατάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στη ΧΛΛ. (Τροποποιημένη από Kostareli et al; Mediterr J Hematol Infect Dis. 2012) Figure 12. Freuency of heterogeneous and stereotyped rearrangements of immunoglobulin genes in CLL. (Modified from Kostareli et al; Mediterr J Hematol Infect Dis. 2012) Η στερεοτυπία είναι πολύ συχνή στη ΧΛΛ. Σύμφωνα με την πιο πρόσφατη μελέτη σε 7428 ασθενείς, η συχνότητά της είναι περίπου 30% και ο αριθμός των υποσυνόλων πολύ μεγάλος. Μάλιστα το 12% των ασθενών κατατάχθηκε σε κάποιο από τα «κύρια» υποσύνολα, που περιλαμβάνουν >20 ασθενείς (Εικόνα 12) 137. Λαμβάνοντας υπόψη την εξαιρετικά χαμηλή πιθανότητα (10-12 ) της έκφρασης πανομοιότυπων ΒΚΥ, η ανακάλυψη υποδοχέων αξιοσημείωτης ομοιότητας ανάμεσα σε στερεότυπα υποσύνολα ασθενών με ΧΛΛ υποδηλώνει πιθανόν την αναγνώριση ιδιαίτερων, ξεχωριστών αντιγόνων ή κατηγοριών δομικά όμοιων επιτόπων, οι οποίοι επιλέγουν τους λευχαιμικούς κλώνους 132,135,137,138. Η έκφραση στερεότυπων ΒΚΥ είναι πολύ συχνότερη σε ασθενείς με αμετάλλακτα γονίδια (>40%) σε σύγκριση προς τους ασθενείς με μεταλλαγμένα γονίδια IGHV (~10%) 132,133. Εκτός από το status μεταλλάξεων, η συχνότητα της στερεοτυπίας διαφέρει ανάλογα με το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV. Ειδικότερα, γονίδια των υποομάδων IGHV1 και IGHV4 χρησιμοποιούνται συχνότερα σε στερεότυπους υποδοχείς σε σύγκριση με τα γονίδια της υποοομάδας IGHV3 (με σημαντική εξαίρεση τα γονίδια IGHV3-21 και IGHV3-48) 132,

50 Οι περιπτώσεις ΧΛΛ που ανήκουν σε στερεότυπα υποσύνολα φαίνεται ότι μοιράζονται κοινά κλινικά χαρακτηριστικά και συγκεκριμένα στερεότυπα υποσύνολα σχετίζονται πλέον με ιδιαίτερη πρόγνωση 132,139,140. Χαρακτηριστικά, οι περιπτώσεις που ανήκουν στο στερεότυπο υποσυνόλο #2 (IGHV3-21/IGLV3-21) παρότι φέρουν μεταλλαγμένες αλληλουχίες IGHV παρουσιάζουν κακή κλινική πορεία 141. Επίσης, οι ασθενείς του υποσυνόλου #8 παρουσιάζουν επιθετική κλινική πορεία και την υψηλότερη καταγεγραμμένη πιθανότητα μετατροπής της ΧΛΛ σε επιθετικό λέμφωμα (σύνδρομο Richter) Ο ρόλος του αντιγόνου στη ΧΛΛ- Ενεργοποίηση των λευχαιμικών κυττάρων στην ΧΛΛ Πολυάριθμα δεδομένα υποστηρίζουν την άποψη ότι για την ανάπτυξη και εκδήλωση της ΧΛΛ είναι κρίσιμος ο ρόλος του αντιγόνου σε κάποιο πρώιμο ή μεταγενέστερο στάδιο της λευχαιμογένεσης 109,143,144. Μολονότι αρχικά θεωρήθηκε ότι τα νεοπλασματικά Β κύτταρα των ασθενών με αμετάλλακτα γονίδια IGHV προέρχονταν από παρθένα Β λεμφοκύτταρα, αργότερα αποδείχθηκε ότι όλα τα νεοπλασματικά λεμφοκύτταρα, ανεξάρτητα από το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV, έχουν ανοσοφαινότυπο τυπικό έμπειρων Β λεμφοκυττάρων 145 και προφίλ γονιδιακής έκφρασης παρόμοιο με τα Β λεμφοκύτταρα μνήμης 146. Χαρακτηριστικά, στη ΧΛΛ εκφράζεται καθολικά ο δείκτης των κυττάρων μνήμης CD27 145,147, υποδεικνύοντας ότι τα λευχαιμικά κύτταρα όλων των περιπτώσεων ΧΛΛ, ανεξάρτητα από την παρουσία μεταλλάξεων στα γονίδια IGHV, έχουν έρθει σ επαφή με το αντίγονο. Πρόσφατα, οι Seifert και συν. πραγματοποίησαν λεπτομερή ανάλυση του προφίλ της γονιδιακής έκφρασης της ΧΛΛ και σύγκριση με το προφίλ διάφορων υποπληθυσμών φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων, μεταξύ άλλων παρθένων Β λεμφοκυττάρων, Β λεμφοκυττάρων της οριακής ζώνης, ώριμων CD5 + Β λεμφοκυττάρων, Β λεμφοκυττάρων που έχουν υποστεί εναλλαγή ισοτύπου και IgM + Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν ότι η ΧΛΛ παρουσιάζει προφίλ γονιδιακής έκφρασης παρόμοιο με των CD5 + φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων, οδηγώντας στην υπόθεση ότι τα τελευταία θα μπορούσε να αποτελούν το κύτταρο προέλευσης της ΧΛΛ. Όταν η ανάλυση περιορίστηκε στα CD27 + λεμφοκύτταρα, διαπιστώθηκε ότι τα CD5 + CD27 + κύτταρα (που φέρουν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV και μεταλλάξεις στο γονίδιο BCL6, χαρακτηριστικά Β λεμφοκυττάρων που έχουν υποστεί σωματική υπερμεταλλαξιγένεση στο βλαστικό κέντρο) 50

51 έχουν προφίλ γονιδιακής έκφρασης που προσομοιάζει περισσότερο με το αντίστοιχο της μεταλλαγμένης ΧΛΛ, ενώ για την αμετάλλακτη ΧΛΛ βρέθηκε μεγαλύτερη ομοιότητα με τα CD5 + CD27 - φυσιολογικά Β λεμφοκύτταρα 148. Η έκφραση του δείκτη CD27 και στην αμετάλλακτη ΧΛΛ δεν είναι κατ ανάγκη ασύμβατη με προέλευσή της από τα CD5 + CD27 - Β λεμφοκύτταρα, καθώς είναι γνωστό ότι αύξηση της έκφρασης του CD27 παρατηρείται και μετά από Τ ανεξάρτητη ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων 149. Επιπλέον, η ανακάλυψη των στερεότυπων ΒΚΥ αποτελεί ισχυρότατη ένδειξη για αντιγονική διέγερση 132, Η στερεοτυπία καταργεί τη λογική του τυχαίου στην οντογένεση της ΧΛΛ και μπορεί να θεωρηθεί ως ισχυρότατη ένδειξη για την αναγνώριση κοινού επιτόπου. Ο κρίσιμος ρόλος του ΒΚΥ στην παθογένεια της νόσου τονίζεται επίσης από το γεγονός ότι πολλά προϊόντα γονιδίων που συνδέονται με τη σηματοδότηση και την ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων (π.χ. CD38 και ZAP70) συσχετίζονται έντονα με την κλινική έκβαση 118,125,150,151. Επιπλέον, η λειτουργική διερεύνηση του ΒΚΥ υποστηρίζει τον ρόλο του στην παθογένεια της ΧΛΛ. Αρχικά, ένδειξη της in vivo επαφής με το αντιγόνο είναι η χαμηλή έκφραση της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης στα ΧΛΛ κύτταρα που πιθανόν προκλήθηκε από χρόνια διέγερση του ΒΚΥ in vivo (με επακόλουθη ενδοκυττάρωση του ΒΚΥ) 152. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι σε πολλές περιπτώσεις και παρά τα χαμηλά επίπεδα της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης, τα ΧΛΛ κύτταρα διατηρούν την ικανότητα σηματοδότησης μέσω του ΒΚΥ, τουλάχιστον όσον αφορά σε γεγονότα κοντά στη μεμβράνη, όπως η φωσφορυλίωση της Syk, της PLCγ2 και η απελευθέρωση ενδοκυττάριου Ca Η ικανότητα σηματοδότησης μέσω του ΒΚΥ συνήθως συνδέεται με την έκφραση αμετάλλακτων γονιδίων IGHV και ZAP70 και/ή CD38. Αντίθετα, οι περιπτώσεις ΧΛΛ που φέρουν μεταλλαγμένα γονίδια IGHV και δεν εκφράζουν ZAP70 και/ή CD38, δεν αποκρίνονται στη διέγερση μέσω της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης, κατάσταση που προσομοιάζει με την αντίστοιχη ανεργικών κυττάρων μετά από χρόνια έκθεση σε αντιγόνο 156,157. Ωστόσο, στην πλειονότητα των περιπτώσεων (μεταλλαγμένες και αμετάλλακτες) χωρίς ικανότητα απάντησης σε διέγερση της επιφανειακής IgM, η ανεργική κατάσταση είναι αντιστρεπτή μετά από επώαση των ΧΛΛ κυττάρων in vitro ή με ενδοκυττάρωση του ΒΚΥ και επανέκφραση. Στις πιθανές εξηγήσεις του φαινομένου συγκαταλέγονται γεγονότα in vitro, όπως αυθόρμητος επαναπρογραμματισμός της σηματοδότικής οδού που ξεκινάει από την 51

52 επιφανειακή IgM, η πιο πιθανή εξήγηση που προτάθηκε όμως από τους ερευνητές ήταν η απομάκρυνση του αντιγόνου που in vivo είχε επάγει ανεργία των ΧΛΛ κυττάρων 152. Επιπλέον, πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι η υποομάδα ασθενών στους οποίους η μεταβίβαση σήματος μέσω της IgM δεν ήταν δυνατή χαρακτηρίζεται από συνεχή ενεργοποίηση της Erk και του μεταγραφικού παράγοντα NF-AT και απουσία ενεργοποίησης της Αkt. Το συγκεκριμένο πρότυπο ενεργοποίησης στη ΧΛΛ θεωρείται ότι υποδεικνύει ανεργική κατάσταση, πιθανόν εξαιτίας παρατεταμένης έκθεσης σε (αυτό)αντιγόνα 158. Πρόσφατη έρευνα ανέφερε αλληλεπίδραση μεταξύ της περιοχής CDR3 της βαριάς αλυσίδας και ενός μοτίβου στη δεύτερη περιοχή πλαισίου (FR2), ικανή να επάγει έναρξη της σηματοδότησης όπως αξιολογήθηκε με βάση την απελευθέρωση ενδοκυττάριου Ca 2+. Η αλληλεπίδραση αυτή φαίνεται να είναι μοναδική για τη ΧΛΛ αφού δεν παρατηρήθηκε στα κακοήθη κύτταρα άλλων Β λεμφοϋπερπλασιών 159. Τα ευρήματα αυτά έθεσαν υπό αμφισβήτηση τη συμβολή «κλασικού» αντιγόνου για τη ενεργοποίηση και επέκταση των λευχαιμικών κυττάρων. Η αλληλεπίδραση αφορούσε όλες τις ΧΛΛ περιπτώσεις (μεταλλαγμένες και αμετάλλακτες οι οποίες χαρακτηρίζονται από πολύ διαφορετική κλινική πορεία) 159, υποδεικνύοντας ότι πρόσθετοι παράγοντες είναι σημαντικοί για τον καθορισμό της κλινικής εικόνας της νόσου. Ένα πιθανό σενάριο είναι ότι αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί σε παρατεταμένη επιβίωση των ΧΛΛ κυττάρων, ενώ η σηματοδότηση που ξεκινάει από τυπικό (αυτό)αντιγόνο (κυρίως στις αμετάλλακτες περιπτώσεις) οδηγεί σε πολλαπλασιασμό και κλωνική επέκταση των λευχαιμικών κυττάρων Αντιγόνα στη ΧΛΛ Τα ΧΛΛ κύτταρα είναι αντιγονικά έμπειρα κύτταρα. Η ακριβής φύση του/των αντιγόνου/αντιγόνων που αναγνωρίζει ο λευχαιμικός κλώνος μόλις πρόσφατα άρχισε να αποκαλύπτεται αν και αποτέλεσε αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητικών ομάδων ήδη από τη δεκαετία του 80. Γενική παρατήρηση όλων των αρχικών ερευνών πάνω σε αυτό το αντικείμενο ήταν η αναγνώριση διαφόρων αυτοαντιγόνων από τους ΧΛΛ ΒΚΥ. Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται το μονόκλωνο και δίκλωνο DNA, η σταθερή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης IgG (IgG-Fc), ιστόνες, καρδιολιπίνη, συστατικά του κυτταρικού σκελετού όπως η ακτίνη, η τουμπουλίνη και η μυσοσίνη 161,162,163. Το τοπίο άρχισε να ξεκαθαρίζει μετά την εισαγωγή στην ανοσοβιολογική μελέτη της ΧΛΛ του status των μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV ως προγνωστικού παράγοντα και τις πρώτες αναφορές για στερεοτυπία του ΒΚΥ. Μάλιστα οι Hervé και συν. (2005) δημοσίευσαν 52

53 ότι οι αμετάλλακτες περιπτώσεις εμφανίζουν πολύ υψηλότερο βαθμό πολυαντιδραστικότητας και ότι τα ΧΛΛ αντισώματα του ίδιου στερεότυπου υποσυνόλου παρουσιάζουν παρόμοια πρότυπα αναγνώρισης αντιγόνων. Έτσι για πρώτη φορά αποδείχθηκε πειραματικά ότι η στερεοτυπία σε επίπεδο αλληλουχιών των ανοσοσφαιρινών αντικατοπτρίζει στερεοτυπία της αντιγονικής διέγερσης 164. Πιο πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι πολλά ΧΛΛ αντισώματα αντιδρούν με μοριακές δομές αποπτωτικών κυττάρων και βακτηρίων. Τα χαρακτηριστικά αυτά θυμίζουν τις ιδιότητες των φυσικών αντισωμάτων που περιγράφονται σε αυτοάνοσες καταστάσεις και των φυσικών αντισωμάτων που ευθύνονται για την «εκκαθάριση» των αποπτωτικών κυττάρων και των μικροβιακών παθογόνων 165,166. Στις μελέτες αυτές πραγματοποιήθηκαν πειράματα με τη χρήση μακροσυστοιχιών ιστών του ανθρώπου και πειράματα ανοσοφθορισμού με ζωντανά Hep-2 κύτταρα που αποκάλυψαν ότι τα περισσότερα ΧΛΛ αντισώματα προσδένονται σε ενδοκυττάριες δομές, είτε κυτταροπλασματικές είτε περιπυρηνικές. Στις προαναφερθείσες μελέτες, αναγνώριση πυρηνικών δομών καταγράφηκε μόνο σε δύο περιπτώσεις. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε το εύρημα ότι ΧΛΛ αντισώματα του ίδιου υποσυνόλου εμφανίζουν παρόμοιο προφίλ αντιγονικής ειδικότητας 165,166. Περαιτέρω πρωτεωμικές αναλύσεις εντόπισαν αρκετές κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες (βιμεντίνη, κοφιλίνη, φιλαμίνη Β) ως στόχους των ΧΛΛ αντισωμάτων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι όλες αυτές οι πρωτεΐνες εκτίθενται στην κυτταρική επιφάνεια κατά την απόπτωση και σχετίζονται λειτουργικά με μικροβιακές μολύνσεις ή/και την απομάκρυνση των αποπτωτικών κυττάρων 165. Η βιμεντίνη δείχθηκε ότι είναι στόχος πολλών στερεότυπων αντισωμάτων (υποσύνολο # υποσύνολο #8 167, υποσύνολο #1 168 ) και μη στερεότυπων ΧΛΛ αντισωμάτων 165. Μια ακόμη πρωτεΐνη του κυτταρικού σκελετού που αναγνωρίστηκε ως στόχος των ΧΛΛ mabs ήταν η βαριά αλυσίδα ΙΙΑ της μη-μυϊκής μυοσίνης (nonmuscle myosin heavy chain IIA, MYHIIA). Οι Chu και συν. (2008) έδειξαν ότι η MYHIIA είναι ο αντιγονικός στόχος των ΧΛΛ αντισωμάτων με στερεότυπες αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV1-69/IGHD3-16/IGHJ3 (υποσύνολο #6) 167. Κατά την απόπτωση, η MYHIIA εκτίθεται στην κυτταρική επιφάνεια μιας υποομάδας κυττάρων τα οποία ονομάστηκαν MEACs (MYHIIA-exposed apoptotic cells, αποπτωτικά κύτταρα με εκτεθειμένη MYHIIA). Τα ΧΛΛ αντισώματα του υποσυνόλου #6 προσδέθηκαν in vitro στα MEACs αλλά όχι σε αποπτωτικά κύτταρα χωρίς εκτεθειμένη MYHIIA ή σε ζωντανά κύτταρα 169. Στην ίδια μελέτη, εκτός από τα αντισώματα του υποσυνόλου #6, πολλά άλλα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα αναγνώριζαν τα MEAC, χωρίς απαραίτητα αυτό να σημαίνει ότι 53

54 Εικόνα 13. Μοντέλο των πιθανών μορίων που εμπλέκονται στην διέγερση των ΧΛΛ κλώνων. (Τροποποιημένη από Rosen et al; Seminars in cancer biology 2010) Figure 13. Model of the possible molecules involved in triggering CLL clones. (Modified from Rosen et al; Seminars in cancer biology 2010) το αντιγόνο-στόχος είναι η MYHIIA. Η δέσμευση στα MEACs συσχετίστηκε ισχυρά με το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV: 15 από τα 16 ΧΛΛ αντισώματα που αναγνώρισαν τα MEAC κωδικοποιούνταν από αμετάλλακτα γονίδια IGHV. Η ισχυρή πρόσδεση στα MEAC συσχετίστηκε επίσης με κακή κλινική έκβαση. Επιπλέον, 14 από τα 16 ΧΛΛ αντισώματα που προσδέθηκαν στα MEACs ανήκαν σε κάποιο στερεότυπο υποσύνολο και μάλιστα τα αντισώματα του ίδιου υποσυνόλου παρουσίαζαν δέσμευση παρόμοιας ισχύος. Αυτό αποτελεί μια ακόμη απόδειξη ότι η ομαδοποίηση των ασθενών με βάση την στερεοτυπία των ανοσοσφαιρινών τους έχει βιολογική και κλινική σημασία 169,170. Κατά την απόπτωση αυτοαντιγόνα δημιουργούνται de novo. Τα αποπτωτικά κύτταρα εμφανίζουν οξειδωμένα μόρια στην επιφάνεια τους 171. Καθώς η οξείδωση και η απόπτωση σχετίζονται, οι ερευνητικές ομάδες των Chiorazzi και Rosen ανακάλυψαν σημαντική αντιδραστικότητα των ΧΛΛ αντισωμάτων, κυρίως του αμετάλλακτου υποσυνόλου, με μεταβολίτες της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Μάλιστα αυτή η αντιδραστικότητα συσχετιζόταν στενά με την αντιδραστικότητα εναντίον αποπτωτικών κυττάρων. Ισχυροί 54

55 συνδέτες αυτών των αντιγόνων ήταν τα ΧΛΛ αντισώματα των υποσυνόλων #1, #6, #8, #9 και #32 165,166. Τέλος σε πειράματα με τη χρήση μικροσυστοιχιών αυτοαντιγόνων εντοπίστηκε αντιδραστικότητα εναντίον αυτοαντιγόνων σχετιζόμενων με συστημική αυτοανοσία (τουμπουλίνη, Sm, Ku, snrnp και CENP-B). Πολλά από αυτά τα αυτοαντιγόνα εντοπίζονται στα αποπτωτικά σωμάτια Αναγνώριση μικροβιακών αντιγόνων Ο ρόλος των λοιμώξεων στην ανάπτυξη ορισμένων τύπων Β λεμφωμάτων είναι καλά εδραιωμένος. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η συσχέτιση της λοίμωξης από το βακτήριο Helicobacter pylori με το λέμφωμα MALT του στομάχου 172 και του ιού EBV με το λέμφωμα Burkitt 173. Στη ΧΛΛ, ανάλογες συσχετίσεις με κοινά παθογόνα είναι ακόμη αβέβαιες. Αρκετά από τα αντιγόνα που βρέθηκαν στις παραπάνω μελέτες έχουν λειτουργική σχέση με μικροβιακές λοιμώξεις. Για παράδειγμα έχει αναφερθεί μοριακός μιμητισμός μεταξύ των καψιδιακών πολυσακχαριτών του S. pneumoniae και των οξειδωμένων λιποσωματίων LDL (oxldl) 174. Ενδιαφέρουσα ήταν η μελέτη των Jahn και συν. (1991) που έδειξαν ότι ΧΛΛ αντισώματα από δυο ασθενείς αναγνώριζαν συγχρόνως αυτοαντιγόνα (dsdna) και εξωγενή αντιγόνα είτε του βακτηρίου N. meningitidis (class V outer membrane protein type C) είτε συστατικά του ιού H1N Υπό αυτό το πρίσμα, εύλογη είναι η υπόθεση ότι επιμένουσες λοιμώξεις από κοινά παθογόνα θα μπορούσαν να διεγείρουν τα πρόδρομα ΧΛΛ κύτταρα, ενδεχομένως και τα ίδια τα λευχαιμικά κύτταρα, συμβάλλοντας έτσι στην μετάβαση από τη φυσιολογική στη νεοπλασματική κατάσταση και την κλωνική επέκταση των λευχαιμικών κυττάρων, τουλάχιστον για ορισμένα υποσύνολα ασθενών με ΧΛΛ. Μάλιστα, πρόσφατη δημοσίευση ανέδειξε το ρόλο των μολύνσεων από μύκητες στην ανάπτυξη της ΧΛΛ σε ένα μικρό υποσύνολο με στερεότυπους ΒΚΥ που χρησιμοποιούν το γονίδιο IGHV Βακτηριακές λοιμώξεις Πρόσφατη μελέτη από την ερευνητική ομάδα του Rosen, έδειξε ότι αρκετά ΧΛΛ αντισώματα δεσμεύονται σε καψιδιακούς πολυσακχαρίτες του βακτηρίου S. pneumoniae

56 Η ερευνητική ομάδα του Chiorazzi εξέτασε το πρότυπο αντιδραστικότητας των ΧΛΛ αντισωμάτων ενάντια σε Gram θετικά βακτήρια (Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis) και Gram-αρνητικά βακτήρια (Enterobacter cloacae). Κυρίαρχοι προσδέτες των παραπάνω βακτηρίων βρέθηκαν να είναι τα αμετάλλακτα ΧΛΛ αντισώματα και ειδικότερα εκείνα που κωδικοποιούνται από το γονίδιο IGHV1-69. Η φύση των επιτόπων προσδιορίστηκε μετά από την κατεργασία των βακτηρίων με πρωτεϊνάση με σκοπό την πέψη των πρωτεϊνών ή με υπεριωδικό νάτριο για την οξείδωση των υδατανθράκων. Τα ΧΛΛ αντισώματα που κωδικοποιούνται από τα ίδια τα γονίδια αντέδρασαν με επιτόπους της ίδιας χημικής φύσης 177. Τέλος, πρόσφατα προτάθηκε ότι οι λοιμώξεις του αναπνευστικού που προκαλούνται από τα βακτήρια Streptococcus pneumoniae και Haemophilus influenzae, αυξάνουν τον κίνδυνο ΧΛΛ Ιογενείς λοιμώξεις Μοριακές ενδείξεις για την συσχέτιση επιμένουσας λοίμωξης των κοινών ερπητοϊών EBV και CMV με το στερεότυπο υποσύνολο #4 αποκαλύφθηκαν πρόσφατα. Τα αντισώματα του υποσυνόλου #4 κωδικοποιούνται από το γονίδιο IGHV4-34 που είναι πολύ συχνό στο ρεπερτόριο των ΧΛΛ ανοσοσφαιρινών, ενώ σε φυσιολογικές καταστάσεις παρατηρείται αύξηση των αντισωμάτων IGHV4-34 μετά από λοίμωξη από τους ιούς EBV και CMV 179,180. Επιπλέον ο Steininger και οι συν. (2009) ανέφεραν υψηλή CMV οροθετικότητα σε επιλεγμένες ομάδες ΧΛΛ σε σύγκριση με το γενικό πληθυσμό 181. Επακόλουθη μελέτη από την ίδια ερευνητική ομάδα αποκάλυψε ότι έξι ΧΛΛ αντισώματα κωδικοποιούμενα από τα γονίδια IGHV1-69 ή IGHV3-21 αντέδρασαν ειδικά με την πρωτεΐνη pul32 του CMV ενώ απέτυχαν να δεσμεύσουν άλλα βακτήρια και ιούς

57 Αντικείμενο μελέτης 57

58 Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία είναι κακοήθες νεόπλασμα Β λεμφοκυττάρων που παρουσιάζουν φαινότυπο ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων 109. Τα Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν δυνητικά παθογόνους παράγοντες μέσω σύνδεσης των αντιγονικών υποδοχέων στους αντίστοιχους αντιγονικούς επίτοπους με συνεπακόλουθα τη μεταβίβαση σημάτων στο εσωτερικό του Β λεμφοκυττάρου, την ενεργοποίησή του και τη σηματοδότηση προς άλλα συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος ώστε να αντιμετωπιστεί το παθογόνο. Συνεπώς, εύλογη είναι η υπόθεση ότι η νεοπλασματική εξαλλαγή των Β λεμφοκυττάρων μπορεί να οφείλεται σε απορύθμιση του μηχανισμού ενεργοποίησης τους. Την άποψη αυτή ενισχύουν οι παρατηρήσεις ότι τα ΧΛΛ κύτταρα in vitro υφίστανται «αυθόρμητη» απόπτωση 109 εκτός αν διασωθούν μέσω άμεσης επαφής με τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών ή τα δενδριτικά κύτταρα των λεμφοζιδίων 183,184 ή με σηματοδότητηση μέσω υποδοχέων, συμπεριλαμβανομένων του ΒΚΥ 185, των TLR 186 και των υποδοχέων κυτταροκινών και χημοκινών 187. Η σημασία της σηματοδότησης μέσω του ΒΚΥ υποστηρίζεται από πολυάριθμα δεδομένα 109,143. Ειδικότερα, η ανάλυση των αναδιατάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών έδειξε ότι το ρεπερτόριο των γονιδίων IGHV στη ΧΛΛ χαρακτηρίζεται από επιλεκτικότητα και εμφανίζει σημαντικές διαφορές από το αντίστοιχο των φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων 129,188. Μοναδικό χαρακτηριστικό της νόσου είναι η ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με σχεδόν πανομοιότυπους, «στερεότυπους» Β κυτταρικούς υποδοχείς. Η συχνότητα των στερεότυπων υποδοχέων είναι εξαιρετικά υψηλή, περίπου 30%, και ο αριθμός των υποσυνόλων πολύ μεγάλος 137. Δεδομένου ότι η πιθανότητα δύο διαφορετικοί κλώνοι Β λεμφοκυττάρων να εκφράζουν πανομοιότυπους υποδοχείς είναι απειροελάχιστη, η αξιοσημείωτη ομοιότητα των ΒΚΥ υποστηρίζει την ύπαρξη ενός περιορισμένου συνόλου αντιγόνων ή δομικά παρόμοιων επιτόπων που εμπλέκονται στην επιλογή του λευχαιμικού κλώνου 132,133. Η κατάταξη των ΧΛΛ ασθενών σε στερεότυπα υποσύνολα έχει και κλινική σημασία καθώς η παρουσία συγκεκριμένων στερεότυπων ΒΚΥ συσχετίζεται με διακριτή κλινική έκβαση, ακόμα και ανεξάρτητα από άλλους προγνωστικούς δείχτες ,132,139. Αυτό υποδηλώνει ότι ένα συγκεκριμένο αντιγόνο δεσμεύεται σε ένα διακριτό υποδοχέα και παίζει κρίσιμο ρόλο στη φυσική ιστορία της νόσου και στην κλινική έκβαση. Υπό αυτό το πρίσμα, δεν αποκλείεται στο μέλλον ο σχεδιασμός στοχευμένων θεραπειών για κάθε διακριτό στερεότυπο υποσύνολο. 58

59 Η ανακάλυψη υποσυνόλων ασθενών ΧΛΛ με στερεότυπους υποδοχείς και χαρακτηριστικά πρότυπα μεταλλάξεων στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών τους παρέχει ενδείξεις για τη φύση της αντιγονικής διέγερσης. Η αντιγονική ειδικότητα του ΒΚΥ όμως δεν μπορεί να προσδιοριστεί με βεβαιότητα αποκλειστικά και μόνο με βάση τις αλληλουχίες των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και για το λόγο αυτό είναι αναγκαία η πειραματική εξακρίβωση της. Η ακριβής φύση του αντιγόνου(ων) που αναγνωρίζει ο λευχαιμικός κλώνος καθώς και οι αλληλεπιδράσεις αυτών των αντιγονικών στοιχείων με τα προγονικά κύτταρα της ΧΛΛ ή τα ίδια τα λευχαιμικά κύτταρα δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως 143,189. Ωστόσο, πρόσφατα ευρήματα από διάφορες ομάδες, έδειξαν ότι τα ΧΛΛ αντισώματα αναγνωρίζουν ένα ευρύ φάσμα (αυτο)αντιγόνων, χωρίς να αποκλείεται η πιθανότητα ότι η διέγερση από υπεραντιγόνα μπορεί να παίξει κάποιο ρόλο, τουλάχιστον σε κάποια υποσύνολα ασθενών 132, Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις για την αναγνώριση κοινών βακτηρίων: συνεπώς, επιμένουσες ή παροδικές λοιμώξεις από κοινά παθογόνα μπορεί να εμπλέκονται στην παθογένεια της ΧΛΛ, τουλάχιστον για κάποια υποσύνολα 165,166. Μολονότι στις διάφορες μελέτες προσδιορίστηκαν ποικίλα (αυτό)αντιγόνα-στόχοι των ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων ,165,166,169,175, λίγα δεδομένα υπάρχουν για το ιδιαίτερο πρότυπο της αντιγονικής αναγνώρισης των διαφόρων στερεότυπων υποσυνόλων που πιθανώς συμβάλει στη διαμόρφωση των ιδιαίτερων κλινικοβιολογικών χαρακτηριστικών τους ,132,139. Συνεπώς, ο ορισμός της πραγματικής φύσης του(των) αντιγόνου(ων) που αναγνωρίζεται από τους στερεότυπους ΒΚΥ μπορεί να καταστεί ζωτικής σημασίας για την αποσαφήνιση της in vivo διέγερσης του λευχαιμικού κλώνου και για το σχεδιασμό καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών με βάση τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του ΒΚΥ τους. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ταυτοποίηση του(των) αντιγόνου(ων) που αναγνωρίζουν οι στερεότυποι αντιγονικοί υποδοχείς. Ο προσδιορισμός της αντιγονικής ειδικότητας του λευχαιμικού ΒΚΥ μπορεί να συμβάλει αποφασιστικά: (i) στην αποσαφήνιση της μοριακής βάσης της ΧΛΛ, (ii) στην αναγνώριση πιθανής αιτιολογικής σχέσης μεταξύ της ΧΛΛ και παθογόνων παραγόντων, (iii) στον επανακαθορισμό παραγόντων κινδύνου και στοιχείων επιδημιολογίας της νόσου, (iv) στη διάκριση ασθενών με βάση τον τύπο της αντιγονικής διέγερσης, (v) στην αντιμετώπιση της νόσου με παρέμβαση στη σηματοδοτική σχέση αντιγόνου-λευχαιμικού κλώνου. Ο χαρακτηρισμός του αντιγονικού υποδοχέα στη ΧΛΛ παρουσιάζει σημαντικές τεχνικές δυσκολίες καθώς τα λευχαιμικά λεμφοκύτταρα έχουν περιορισμένη ικανότητα ανάπτυξης 59

60 in vitro, ενώ εκφράζουν χαμηλά επίπεδα επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης. Για το σκοπό αυτό στην παρούσα διατριβή εφαρμόστηκε η τεχνική των υβριδωμάτων και του ανασυνδυασμένου DNA για την παραγωγή και το χαρακτηρισμό του αντιγονικού υποδοχέα 60 ασθενών με ΧΛΛ. Έμφαση δόθηκε στο χαρακτηρισμό των στερεότυπων ΒΚΥ και κυρίως αυτών που κατατάσσονται στα μεγαλύτερα από αριθμητική σκοπιά υποσύνολα (κύρια υποσύνολα) 137. Μάλιστα 45/60 ΒΚΥ που εξετάστηκαν στην παρούσα εργασία ανήκουν στα κύρια στερεότυπα υποσύνολα #1, #2,#4, #6, #8 και #59. 60

61 Υλικά και μέθοδοι 61

62 1. Παραγωγή υβριδωμάτων 1.1 Αρχή της μεθόδου Το πρωτόκολλο παραγωγής των ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων βασίστηκε στην κλασική τεχνολογία σύντηξης κυττάρων με τη βοήθεια του αντιδραστηρίου πολυαιθυλενική γλυκόλη (polyethylene glycol, PEG) 190. Ως «συνέταιροι» σύντηξης χρησιμοποιήθηκαν λευχαιμικά λεμφοκύτταρα από περιφερικό αίμα ασθενών και η μυελωματική κυτταρική σειρά ποντικού X63-Ag , η οποία προέρχεται από τη μυελωματική κυτταρική σειρά P3-X63-Ag-8 (X63) που χρησιμοποιήθηκε από τους Kohler και Milstein 190. Τα μυελωματικά κύτταρα X63-Ag8.653 δεν παρουσιάζουν έκκριση των ιδίων ανοσοσφαιρινών αλλά επιτρέπουν τη δημιουργία κυτταρικών σειρών υβριδωμάτων που εκκρίνουν αντισώματα. Η επιλογή των υβριδωμάτων και η απομάκρυνση των κυττάρων που δεν υπέστησαν σύντηξη πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του μέσου επιλογής ΗΑΤ (υποξανθίνηαμινοπτερίνη-θυμιδίνη). Η χρήση του μέσου HAT σε συνδυασμό με την ανεπάρκεια των μυελωματικών κυττάρων X63-Ag8.65 για το ένζυμο φωσφοριβοζυλο-τρανσφεράση της υποξανθίνης-γουανίνης (HGPRT) 191 και την εγγενή αδυναμία των Β λεμφοκυττάρων να αναπτυχθούν σε καλλιέργεια οδηγεί σε επιλογή μόνο των συντηγμένων κυττάρων (υβρίδια μυελωματικών κυττάρων και Β λεμφοκυττάρων). Η φωσφοριβοζυλο-τρανσφεράση της υποξανθίνης-γουανίνης (HGPRT, hypoxanthine - guanine - phosphoribosyl-transferase) συμμετέχει στο εναλλακτικό αναβολικό μονοπάτι της διάσωσης των πουρινών και επιτρέπει στο κύτταρο να συνθέτει πουρίνες χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα εξωκυττάρια υποξανθίνη. Συνήθως, η απουσία του δεν αποτελεί πρόβλημα για το κύτταρο επειδή το ένζυμο αυτό συμμετέχει μόνο στο εναλλακτικό μονοπάτι και όχι στη de novo σύνθεση των πουρινών. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε αμινοπτερίνη (ανάλογο του φυλλικού οξέος), τότε δε λειτουργεί το κύριο μονοπάτι της de dovo σύνθεσης των πουρινών και τα κύτταρα εξαρτώνται απόλυτα από το εναλλακτικό μονοπάτι για να επιβιώσουν. Συνεπώς, τα μυελωματικά κύτταρα που έχουν μεταβολική ανεπάρκεια για την HGPRT δεν επιζούν σε θρεπτικό μέσο HAT το οποίο περιέχει υποξανθίνη, αμινοπτερίνη και θυμιδίνη. Μετά τη διαδικασία σύντηξης, η καλλιέργεια των κυττάρων στο μέσο ΗΑΤ περιέχει Β λεμφοκύτταρα, κύτταρα μυελώματος ποντικού, καθώς και κύτταρα υβρίδια μυελωματικών κυττάρων και Β λεμφοκυττάρων. Τα Β λεμφοκύτταρα πεθαίνουν ύστερα από μερικές ημέρες, καθώς δεν έχουν ικανότητα πολλαπλασιασμού in vitro. Τα κύτταρα του μυελώματος θανατώνονται σε μέσο HAT, καθώς η εγγενής αδυναμία παραγωγής HGPRT τα 62

63 καθιστά απόλυτα εξαρτώμενα από το de novo μονοπάτι, το οποίο όμως παρεμποδίζει η αμινοπτερίνη. Μόνο τα συντηγμένα κύτταρα (ετεροϋβριδώματα) μπορούν να επιζήσουν στις συγκεκριμένες συνθήκες επειδή έχουν «κληρονομήσει» τη μεν ιδιότητα της «αθανασίας» από τα μυελωματικά κύτταρα τη δε ικανότητα της σύνθεσης του ενζύμου HGPRT από τα Β λεμφοκύτταρα. Μερικά από τα κύτταρα που έχουν υποστεί σύντηξη θα έχουν την ικανότητα να παράγουν τα επιθυμητά αντισώματα. 1.2 Διαδικασία παραγωγής ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων Η διαδικασία παραγωγής ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων περιλαμβάνει τα εξής βήματα (Εικόνα 14): 1. Απομόνωση Β λευχαιμικών κυττάρων από το αίμα ασθενών με ΧΛΛ. 2. Επιλογή και καλλιέργεια των μυελωματικών κυττάρων X63-Ag8.653 (OURI) πριν τη σύντηξη. 3. Συλλογή μακροφάγων από περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικού. 4. Σύντηξη των ΧΛΛ κυττάρων με τα κύτταρα OURI. 5. Καλλιέργεια των συντηγμένων κυττάρων σε μέσο ΗΑΤ (υποξανθίνηαμινοπτερίνη-θυμιδίνη) για 3-4 ημέρες. 6. Καλλιέργεια των συντηγμένων κυττάρων σε μέσο ΗΤ (υποξανθίνη-θυμιδίνη) για 3-4 ημέρες. Ακολουθούν τα στάδια επιβεβαίωσης της ΧΛΛ προέλευσης των ετεροϋβριδωμάτων, της παραγωγής και έκκρισης δηλαδή της κλωνοτυπικής ανοσοσφαιρίνης του ασθενούς και της δημιουργίας σταθερών κυτταρικών σειρών: 7. 1 ο στάδιο επιβεβαίωσης: εξέταση και επιλογή των υποψήφιων κλώνων. Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται ο πρώτος έλεγχος των υβριδωμάτων αναφορικά με την έκκριση ανοσοσφαιρίνης του ιδίου ισοτύπου με αυτόν του λευχαιμικού κλώνου του αντίστοιχου ασθενούς. Ο έλεγχος έκκρισης ανοσοσφαιρίνης πραγματοποιείται με ανοσοανίχνευση τύπου ELISA και επαναλαμβάνεται ανά τακτά χρονικά διαστήματα. 8. Παραγωγή σταθερών κυτταρικών σειρών από τους πιο «υποσχόμενους» θετικούς κλώνους με διαδκασία υποκλωνοποίησης (limiting dilution) ο στάδιο επιβεβαίωσης των κυττταρικών σειρών ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων: (i) απομόνωση RNA από τα κύτταρα των ετεροϋβριδωμάτων - συλλογή δεδομένων από RT-PCR/sequencing - σύγκριση των αλληλουχιών των ανοσοσφαιρινών των ετεροϋβριδωμάτων με τις αλληλουχίες των ανοσοσφαιρινών που εκφράζει ο λευχαιμικός κλώνος του αντίστοιχου ασθενούς (ii) ανοσοανίχνευση τύπου Western για 63

64 την ανάλυση της έκφρασης της λευχαιμικής ανοσοσφαιρίνης στα πρωτεινικά εκχυλίσματα των υβριδωμάτων. 10. Καλλιέργεια των σταθερών σειρών ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων σε μεγάλη κλίμακα. 11. Συλλογή του υπερκειμένου των καλλιεργειών των «επιβεβαιωμένων» ετεροϋβριδωμάτων. 12. Ποσοτικοποίηση της εκκρινόμενης ανοσοσφαιρίνης με ποσοτική δοκιμασία ELISA Εικόνα 14. Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων από Β λεμφοκύτταρα ασθενών με ΧΛΛ με την τεχνολογία των υβριδωμάτων. Figure 14. Production of monoclonal antibodies from CLL B cells using hybridomas technology. 64

65 Απομόνωση μακροφάγων της περιτοναϊκής κοιλότητας ποντικού Τα μακροφάγα κύτταρα από την περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικού χρησιμοποιήθηκαν ως «τροφοδοτικά» κύτταρα (feeder cells) για τα υβριδώματα. Για κάθε σύντηξη προετοιμάστηκαν 4 πλάκες καλλιέργειας 96 πηγαδιών με μακροφάγα κύτταρα από την περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικού ως εξής: Ο ποντικός θανατώθηκε με αυχενική εξάρθρωση ή αιθέρα και εμβαπτίστηκε σε 70% αιθανόλη. Η επιδερμίδα απομακρύνθηκε έτσι ώστε να εκτεθεί το τοίχωμα του περιτόναιου. Μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα εγχύθηκαν 10 ml θρεπτικού υλικού καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τη σύριγγα των 15 ml με βελόνα 25g. Τα μακροφάγα και τα λεμφοκύτταρα ελευθερώθηκαν με ελαφριά μάλαξη της κοιλιάς του ποντικού και ακολούθως το θρεπτικό μέσο αποσύρθηκε με τη χρήση της ίδιας σύριγγας. Τα μακροφάγα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε συγκέντρωση 2x10 5 κύτταρα/ml σε θρεπτικό υλικό RPMI 1640 το οποίο έχει συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου βοός (Fetal Bovine Serum - FBS) και 15 μg/ml γενταμυκίνη (gentamycin). Σε κάθε οπή της πλάκας καλλιέργειας προστέθηκαν 50μl του παραπάνω κυτταρικού εναιωρήματος. Τα κύτταρα πριν χρησιμοποιηθούν για σύντηξη παρέμειναν έως και δυο μέρες σε κλίβανο CO 2 στους 37 0 C Σύντηξη ΧΛΛ Β λεμφοκυττάρων με μυελωματικά κύτταρα ποντικού Η απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων από αίμα ή μυελό των οστών έγινε μετά από διαχωρισμό με φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας με χρήση του αντιδραστηρίου φικόλλη (Ficoll-Hypaque). Τα λευχαιμικά κύτταρα (10x10 6 ) αναμείχθηκαν σε RPMI με 20 x 10 6 κύτταρα μυελωματικής σειράς ποντικού (OURI X63-Ag8-653). Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Το ίζημα των κυττάρων αναδεύτηκε και 1 ml πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG 1500) προστέθηκε στάγδην με συνεχή κυκλική ανάδευση. Ακολούθησε επώαση στους 37 0 C για 2 λεπτά και τα κύτταρα επαναιωθήθηκαν σε 20 ml PBS. Μετά από επώαση 15 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου, το κυτταρικό διάλυμα φυγοκεντρήθηκε και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε θρεπτικό μέσο RPMI 1640 με περιεκτικότητα 10% ορό εμβρύου βοός και υποξανθίνη, αμινοπτερίνη και θυμιδίνη σε τελική συγκέντρωση 100 μm, 0,4μΜ και 16 μm, αντίστοιχα. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας όπου είχαν ήδη προστεθεί τα μακροφάγα κύτταρα της περιτοναϊκής κοιλότητας ποντικού. Μετά από 4 ημέρες το θρεπτικό μέσο αντικαταστήθηκε με RPMI 1640 με περιεκτικότητα 10% ορό εμβρύου βοός και υποξανθίνη και θυμιδίνη σε τελική συγκέντρωση 100 μm και 16 μm, αντίστοιχα. Μετά από 4 ημέρες η υποξανθίνη και η θυμιδίνη αφαιρέθηκαν από το θρεπτικό μέσο. Σε όλα τα 65

66 στάδια ανάπτυξης των ετεροϋβριδωμάτων, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο διοξειδίου του άνθρακα (5%), στους 37 ο C και με 95% υγρασία. Σε πρώιμο στάδιο, οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 οπών. Σε αυτό το στάδιο ήταν σημαντική η παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο και η εκτίμηση του αριθμού, της βιωσιμότητας και της μορφολογίας τους. Η παρατήρηση των καλλιεργειών στο μικροσκόπιο αποσκοπούσε στην ανίχνευση πιθανών υβριδωμάτων. Στο στάδιο αυτό ελέγχθηκαν οι πλάκες 96 θέσεων για βιώσιμα υβριδώματα- υποψηφίους γόνους κυτταρικών σειρών ΧΛΛ-ετεροϋβριδωμάτων. Τα κύτταρα των υβριδωμάτων ήταν στρογγυλά, χωρίς κόκκους, με μέγεθος μεγαλύτερο από το αντίστοιχο των Β λεμφοκυττάρων και των μυελωματικών κυττάρων του ποντικού και ανιχνεύονταν στο πρώιμο στάδιο ως μεμονωμένα κύτταρα ή ως μικρές εστίες πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. Στο στάδιο στο οποίο παρατηρήθηκαν οι πρώτοι ορατοί και με γυμνό μάτι κλώνοι κυττάρων (μετά από 20 μέρες περίπου), το υπερκείμενο από τα πηγαδάκια της πλάκας καλλιέργειας ελέγχθηκε με ανοσοανίχνευση τύπου ELISA για την παρουσία ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης του ιδίου ισοτύπου με αυτήν του λευχαιμικού κλώνου του ασθενούς Υποκλωνοποίηση των ΧΛΛ-ετεροϋβριδωμάτων για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών Οι κυτταρικοί κλώνοι των ετεροϋβριδωμάτων που αποδείχθηκαν θετικοί στη δοκιμασία ELISA απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε υποκλωνοποίηση με σκοπό τη δημιουργία σταθερής κυτταρικής σειράς (limiting dilution) 192. Τα κύτταρα απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν μαζί με μακροφάγα κύτταρα ποντικού σε πλάκες καλλιέργειας 96 οπών και συγκέντρωση 5, 2,5 και 1,25 κύτταρα/ οπή. Οι πλάκες κλωνοποίησης ήταν έτοιμες για έλεγχο με ανοσοανίχνευση τύπου ELISA περίπου 2 εβδομάδες μετά. Στη φάση αυτή οι κλώνοι των ετεροϋβριδωμάτων ήταν εμφανείς με γυμνό μάτι και κάλυπταν το 10-50% της επιφάνειας της οπής. Πλάκες καλλιέργειας με <30% οπές στις οποίες παρατηρήθηκε ανάπτυξη υβριδωμάτων χαρακτηρίστηκαν ως «πλάκες με <1 κύτταρο/πηγαδάκι» και το υπερκείμενό τους ελέγχθηκε ξανά με ELISA για την έκκριση μονοκλωνικού αντισώματος. Η παραπάνω διαδικασία επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές με τη χρήση των πιο «υποσχόμενων» κλώνων. Η παραγωγή σταθερής κυτταρικής σειράς ετεροϋβριδώματος θεωρήθηκε επιτυχής όταν τουλάχιστον το 90% των υποκλώνων κατά την υποκλωνοποίηση παρήγαγαν ανοσοσφαιρίνη. 66

67 Όψιμο στάδιο καλλιέργειας ΧΛΛ- ετεροϋβριδωμάτων Σε όψιμο στάδιο τα ετεροϋβριδώματα αναπτύχθηκαν σε φιάλες κυτταροκαλλιέργειας των 75 cm 2. Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων ήταν απαραίτητη 2-5 φορές την εβδομάδα, ανάλογα με το ρυθμό ανάπτυξης της κάθε κυτταρικής σειράς. Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων προσαρμόστηκε ώστε να περιέχει 0,4-2x10 6 κύτταρα/ml και επανατοποθετήθηκε σε νέο θρεπτικό μέσο ώστε να περιέχει 0,1-0,5 x10 6 κύτταρα/ml Συλλογή υπερκειμένου και επεξεργασία Κατά τη διάρκεια των ανακαλλιεργειών το θρεπτικό υλικό στο οποίο αναπτύσσονταν τα κύτταρα των ετεροϋβριδωμάτων συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε σε 1000 rpm για 15 λεπτά ώστε ν απομακρυνθούν τα κύτταρα. Συμπύκνωση του υπερκείμενου διαλύματος έως και 20 φορές πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των φίλτρων Vivapore 10/20 (Sartorius Stedim Biotech). Όπως περιγράφεται παρακάτω, διενεργήθηκαν δοκιμασίες ELISA προκειμένου να διαπιστωθεί η ύπαρξη αντισωμάτων, να χαρακτηριστεί ο ισότυπός τους και να ποσοτικοποιηθεί η συγκέντρωση τους. Το πλούσιο σε μονοκλωνικά αντισώματα υπερκείμενο των καλλιεργειών αποθηκεύτηκε στους -80 ο C Κρυοδιατήρηση κυττάρων Σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης των υβριδωμάτων και όπου αυτό ήταν δυνατό, μέρος των θετικών υβριδωμάτων καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες (-140 ο C, σε ψυγεία υγρού αζώτου) με χρήση κρυοπροστατευτικού διαλύματος που περιέχει 10% DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο) και 90% ορό εμβρύου βοός Έλεγχος παραγωγής και έκκρισης της ανοσοσφαιρίνης του λευχαιμικού κλώνου Ο έλεγχος της παραγωγής και έκκρισης από τα κύτταρα των ετεροϋβριδωμάτων ανοσοσφαιρίνης πανομοιότυπης με αυτή που εκφράζει ο λευχαιμικός κλώνος του ασθενούς πραγματοποιήθηκε με (i) RT-PCR ειδική για τις ανοσοσφαιρίνες του ανθρώπου και ανάλυση της αλληλουχίας με τη μέθοδο Sanger, ανοσοανίχνευση τύπου ELISA και ανοσοανίχνευση Western Blot. 67

68 RT-PCR και ανάλυση Sequencing Απομόνωση RNA Σύνθεση cdna Η απομόνωση ολικού RNA από μονοπύρηνα κύτταρα έγινε με τη μέθοδο ισοθειοκυανικού γουανιδινίου (Trizol) 192. Η σύνθεση του cdna έγινε με αντίστροφη μεταγραφή (reverse transcription - RT) in vitro χρησιμοποιώντας ως εκκινητές εξανουκλεοτίδια τυχαίας αλληλουχίας (random hexamers, 500 μg/ml). Η αντίδραση είχε τελικό όγκο 30 μl. Το ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε για την αντίδραση είναι η αντίστροφη μεταγραφάση Superscript II (200U/μl). Για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιήθηκαν: ρυθμιστικό διάλυμα 5x (RT buffer), τριφωσφορικά νουκλεοτίδια (dntps), αναστολέας RNAασών, και DTT. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε ολικό κυτταρικό RNA, το οποίο αρχικά διαλύθηκε σε ddη 2 Ο. Το διάλυμα RNA αρχικά θερμάνθηκε στους 65 0 C επί 10 λεπτά για τη αποδιάταξη δευτεροταγών δομών του RNA και στη συνέχεια επωάστηκε στους 4 0 C για 5 λεπτά. Οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων και οι συνθήκες της αντίδρασης παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Πίνακας 1. Αντιδραστήρια για την αντίδραση σύνθεσης cdna Table 1. Reagents for cdna synthesis reaction Υπόστρωμα Όγκος RNA 1μg (<10μl) ddη 2 Ο Μέχρι τελικό όγκο 10μl Αντιδραστήρια Όγκος RT buffer 5x (250 mm Tris-HCl, 375 mm 8 μl Αναστολέας RNAασών (40U/μl) 2 μl dntps (10 Mm) 4 μl DTT (0.1 M) 3 μl Tυχαία εξανουκλεοτίδια (500 μg/ml) 2 μl Superscript II RT (200 U/μl) 2 μl ddη 2 Ο Μέχρι τελικό όγκο 30 μl Τελικός όγκος 30 μl Συνθήκες αντίδρασης: 37 0 C, 60 λεπτά 65 0 C, 10 λεπτά τελική θερμοκρασία: 18 0 C Το ενδεχόμενο ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων από αδυναμία ενίσχυσης του RNA μπορεί να αποκλειστεί με ενίσχυση αλληλουχιών που αντιστοιχούν σε μετάγραφα γονιδίων τα οποία εκφράζονται πάντοτε στον υπό ανάλυση ιστό (μετάγραφα αναφοράς ). Στην παρούσα εργασία, ως μετάγραφο αναφοράς χρησιμοποιείται το mrna του γονιδίου RARα (retinoic acid receptor α) το οποίο κωδικοποιεί έναν από τους υποδοχείς του 68

69 ρετινοϊκού οξέος. Για την αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα 5 μl του διαλύματος cdna και ως εκκινητές τα ολιγονουκλεοτίδια RAR6 (5 - GGTGCCTCCCTACGCCTTCT-3 ) και RAR8 (5 -GGCGCTGACCCCATAGTGGT-3 ), που υβριδίζονται ειδικά σε θέσεις εκατέρωθεν της περιοχής του RARα mrna μετάγραφου που αντιστοιχεί στα εξόνια 6, 7 και 8 του γονιδίου RARα. Πίνακας 2. Αντιδραστήρια για την ενίσχυση των μεταγράφων RARα Table 2. Reagents for the PCR amplification of RARα gene transcripts. Αντιδραστήρια Υπόστρωμα (cdna) 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mm Tris-HCl (ph 8.4), 500 mm MgCl 2 (Invitrogen, 50mM) dntps (10 mm) RAR6 (10 pm/μl) RAR8 (10 pm/μl) Taq polymerase (5U/μl) ddh 2 O Τελικός όγκος Όγκος 5 μl 5 μl 1,5 μl 1 μl 2,5 μl 2,5 μl 0,5 μl 34 μl 50 μl Συνθήκες αντίδρασης: Αρχική αποδιάταξη: 94 0 C, 5 min Κυρίως αντίδραση (40 κύκλοι) o Αποδιάταξη: 94 0 C, 1 min o Υβριδισμός εκκινητών: 53 0 C, 1 min o Σύνθεση μορίων DNA: 72 0 C, 1.5 min Τελική επέκταση συντιθέμενων μορίων DNA: 72 0 C, 10 min Ενίσχυση κλωνικών αναδιατάξεων της μεταβλητής περιοχής των αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Κλωνικές αναδιατάξεις της μεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών ενισχύθηκαν με την τεχνική PCR χρησιμοποιώντας συναινετικούς εκκινητές (consensus primers), ειδικούς για την περιοχή-οδηγό (leader sequence, IGHV leader primers) που εντοπίζεται ανοδικά κάθε γονιδίου IGHV, σε συνδυασμό με εκκινητές ειδικούς για καθένα από τα έξι γονίδια IGHJ που εντοπίζονται στην 3 πλευρά της αναδιάταξης. Οι συναινετικοί εκκινητές είναι αντιπροσωπευτικοί για καθεμιά από τις έξι οικογένειες γονιδίων IGHV (IGHV1 IGHV6) και, αντιστοίχως για τα γονίδια IGHJ Για την ενίσχυση των κλωνικών αναδιατάξεων IGKV-J και IGLV-J των ελαφριών αλυσίδων χρησιμοποιήθηκαν οι συναινετικοί εκκινητές VK1-6 και JK1-5, και VL1-6 και JL1-7 ως μείγμα ολιγονουκλεοτιδίων, αντίστοιχα

70 Οι συναινετικοί εκκινητές είναι αντιπροσωπευτικοί για καθεμιά από τις έξι υποομάδες γονιδίων V (IGKV1-IGKV6 και IGLV1-IGLV6) και, αντιστοίχως για τα γονίδια J (IGΚJ1-5 και IGLJ1-7). Σε όλες τις παραπάνω αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα cdna. Πίνακας 3. Αντιδραστήρια για την ενίσχυση των αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ και IGKV- IGKJ/IGLV-IGLJ Table 3. Reagents for amplification of IGHV-IGHD-IGHJ and IGKV-IGKJ/IGLV-IGLJ rearrangements Αντιδραστήρια Όγκος Yπόστρωμα (cdna) 5 μl 10x PCR buffer [Invitrogen, 200 mm Tris-HCl (ph 8.4), 500 mm 10 μl MgCl 2 (Invitrogen, 50 mm) 3 μl dntps (10 mm) 2 μl Μείγμα εκκινητών VHL 1-6 (10 pm/μl ο καθένας) ή μείγμα εκκινητών VΚ 1-6 ή VL 1-6(10 pm/μl ο καθένας) 3 μl 6 μl Μείγμα εκκινητών JH1-6 (10 pm/μl ο καθένας) ή μείγμα εκκινητών JΚ1-5 ή JL1-7(10 pm/μl ο καθένας) 3 μl 6 μl Taq πολυμεράση(5 U/μl) 0,5 μl ddh 2 O Μέχρι τελικό Τελικός όγκος 100 μl Συνθήκες αντίδρασης: Αρχική αποδιάταξη: 94 0 C, 5 min Κυρίως αντίδραση (35 κύκλοι) o Αποδιάταξη: 94 0 C, 1 min o Υβριδισμός εκκινητών: 59 0 C, 1 min o Επιμήνυνση: 72 0 C, 1.5 min Τελικό στάδιο επιμήκυνσης: 72 0 C, 10 min Καθαρισμός των προϊόντων PCR Τα προϊόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξης 3% και ο καθαρισμός τους πραγματοποιήθηκε με το QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) Ανάλυση αλληλουχίας των προϊόντων PCR Η ανάλυση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων των καθαρισμένων προϊόντων PCR πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο τερματισμού των νεοσυντεθειμένων αλυσίδων DNA με διδεοξυριβονουκλεοτίδια (μέθοδος Sanger) σε αυτόματο αναλυτή (CEQ 8000 Genetic Analysis System) 192. Για την ανάλυση του αντισυνθετικού (3 5, antisense) κλώνου χρησιμοποιήθηκαν συναινετικά ολιγονουκλεοτίδια, συμπληρωματικά με τις αλληλουχίες των γονιδίων IGHV, IGKJ, IGLJ, ενώ για την ανάλυση του κωδικού κλώνου χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί για την αλληλουχία εκκινητές, οι οποίοι σχεδιάστηκαν με βάση την αλληλουχία που προέκυψε από το πρώτο διάβασμα (αλληλουχία antisense κλώνου). 70

71 Ανάλυση αλληλουχιών Οι αλληλουχίες IGHV-D-J, IGKV-J και IGLV-J διερευνήθηκαν με τη βοήθεια των αλγορίθμων του προγράμματος IMGT/V-QUEST ( Οι αλληλουχίες συγκρίθηκαν με τις συγγενέστερες, μη αναδιατεταγμένες αλληλουχίες γονίδιων ανοσοσφαιρινών που είναι καταχωρημένες στη διεθνή βάση δεδομένων ανοσογενετικής IMGT (International ImMunoGeneTics database). H αντιπαραβολή των αλληλουχιών των ανοσοσφαιρινών που ενισχύθηκαν από τα κύτταρα των υβριδωμάτων και απευθείας από το λευχαιμικό κλώνο πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος CLUSTALW ( Δοκιμασίες ELISA Ποιοτικός έλεγχος έκκρισης ανοσοσφαιρίνης Τα υβριδώματα ελέγχθηκαν για την έκκριση αντισωμάτων με δοκιμασία ELISA έτσι ώστε να αποφασιστεί ποια από αυτά ήταν κατάλληλα για περαιτέρω καλλιέργειες. Το υπερκείμενο των καλλιεργειών ελέγχθηκε αναφορικά με την έκκριση ανοσοσφαιρινών του ιδίου ισοτύπου με αυτόν που εκφράζει ο λευχαιμικός κλώνος. Ως αντίσωμα επικάλυψης χρησιμοποιήθηκε anti-igm ή αnti-igg (Sigma). Η επικάλυψη των κενών θέσεων πραγματοποιήθηκε με PBS 1%BSA. Στη συνέχεια, προστέθηκαν οι θετικοί μάρτυρες και τα υπό εξέταση δείγματα αραιωμένα με PBS Tween σε κατάλληλες συγκεντρώσεις. Ως δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν τα αντισώματα anti-igg gamma chain ή anti- IgM mu chain ή anti-kappa ή anti-lambda συνδεδεμένα με το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση (Sigma). Τέλος, προστέθηκε το υπόστρωμα της αλκαλικής φωσφατάσης p-nitrophenyl Phosphate (pnpp, Sigma) και η οπτική απορρόφηση μετρήθηκε στα 405nm σε ειδική συσκευή μέτρησης (ELISA reader, Biotech ELx800) Ποσοτικοποίηση μονοκλωνικού αντισώματος Η ποσοτικοποίηση του μονοκλωνικού αντισώματος βασίστηκε στη χρήση της ποσοτικής ELISA για ανοσοσφαιρίνη ανθρώπου τάξης ΙgG, IgM, Igκ και Igλ της εταιρίας Bethyl (Human IgG/M/k/λ ELISA Quantitation Kits, Bethyl laboratories Inc.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μέτρηση της οπτικής απορρόφησης έγινε στα 450 nm σε ειδική συσκευή μέτρησης (ELISA reader Biotech ELx800) και ο υπολογισμός της συγκέντρωσης έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού Graphpad/Prism. 71

72 Western Blot Συλλογή κυττάρων και λήψη κυτταρικού εκχυλίσματος Ολικές κυτταρικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από 5x10 6 κύτταρα υβριδωμάτων χρησιμοποιώντας κρύο διάλυμα λύσης που περιείχε 150 mm NaCl, 1% NP40, 50 mm Tris HCl, 1 mm EDTA, αναστολείς πρωτεασών και αναστολείς φωσφατασών 192. Η ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών έγινε με τη μέθοδο BCA (Bicinchoninic acid -BCA Protein Assay Kit, Pierce Biotechnology). Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η αλβουμίνη σε οκτώ διαφορετικές συγκεντρώσεις (εύρος μg/ml). Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε σε φασματοφωτόμετρο τύπου Elisa (Biotech ELx800) στα 562 nm και ο υπολογισμός της συγκέντρωσης έγινε με το λογισμικό Graphpad/Prism Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμίδης (SDS- PAGE) Κατά την SDS-ηλεκτροφόρηση επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός πρωτεϊνικών δειγμάτων σε πηκτή ακρυλαμίδης υπό αποδιατακτικές συνθήκες. Για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 20 μικρογραμμάρια πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Η προετοιμασία πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων παρουσιάζεται στον Πίνακα 4. Για την ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκαν το σύστημα και οι πηκτές ηλεκτροφόρησης της εταιρίας Invitrogen (Invitrogen XCell SureLock και NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Gel 1.0 mm) Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε με το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (MOPS 1x, Invitrogen). Εφαρμόστηκε τάση 200V για περίπου 1 ώρα (αναμενόμενη ένταση ηλεκτρικού ρεύματος: ma αρχικά, ma τελικά), οπότε το μέτωπο της χρωστικής φτάνει στο τέλος της πηκτής διαχωρισμού και η ηλεκτροφόρηση ολοκληρώνεται. Μαζί με τα δείγματα τοποθετήθηκαν και πρωτεϊνικοί μάρτυρες γνωστού μοριακού μεγέθους (SeeBlue 2 Plus Prestained standard, Invitrogen). Πίνακας 4. Προετοιμασία πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Table 4. Preparation of protein lysates Αντιδραστήρια Όγκοι Πρωτεϊνικό εκχύλισμα Ανάλογα με την συγκέντρωση της πρωτεΐνης NuPAGE LDS sample buffer 1/4 του τελικού όγκου NuPAGE Reducing buffer 10x 1/10 του τελικού όγκου dh 2 O Ανάλογα με την ποσότητα πρωτεϊνικού Τελικός όγκος Έως 40 μl Αποδιάταξη των δειγμάτων με βρασμό για 5 λεπτά στους 95 C 72

73 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης έγινε μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF (BioRad, USA) με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου 35 V για 2 ώρες. Χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς Tris-Glycine 1x με περιεκτικότητα 10% μεθανόλη. Μετά την ηλεκτρομεταφορά των πρωτεΐνών σε μεμβράνη PVDF έγινε χρώση της μεμβράνης με διάλυμα Ponceau S προκειμένου να διαπιστωθεί η επιτυχία της μεταφοράς και να παρατηρηθεί το πολυπεπτιδικό πρότυπο. Ο αποχρωματισμός έγινε με 2-3 πλύσεις της μεμβράνης για 5 λεπτά με PBS με περιεκτικότητα 0.001% Tween(PBS-Tween) Ανοσοανίχνευση τύπου WESTERN Η μέθοδος της ανοσοανίχνευσης τύπου Western 192 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της έκφρασης της κυτταροπλασματικής ανοσοσφαιρίνης των υβριδωμάτων. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε δέσμευση των μη ειδικών θέσεων προσδέσεως των αντισωμάτων με επώαση της μεμβράνης σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε μορφή σκόνης, διαλυμένο σε PBS-Tween για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησε ολονύκτια επώαση της μεμβράνης στους 4 ο C, με το πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα αραιωμένο στο ίδιο διάλυμα (5% αποβουτυρωμένο γάλα σε μορφή σκόνης, διαλυμένο σε PBS-Tween). Τα αντισώματα και οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: IgG, IgM, Ig κ chain, Ig λ chain(santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)και β-ακτίνη (Sigma-Aldrich). Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:500 σε γάλα. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις της μεμβράνης με PBS -Τween για πέντε λεπτά και επώαση με το δευτερογενές αντίσωμα το οποίο είναι συζευγμένο με το ένζυμο υπεροξιδάση ρεπανίου (horseradish peroxidase, HRP). Ανάλογα με το πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε είτε goat anti rabbit Ig or goat anti mouse Ig ως δευτερογενές αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση, για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση. Στη συνέχεια, η μεμβράνη πλύθηκε με PBS Τween και οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. 2. Παραγωγή ανασυνδυασμένων ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων 2.1 Περιγραφή των πλασμιδιακών φορέων Τα πλασμίδια piggamma1, pigκappa και piglambda περιέχουν τη σταθερή περιοχή της γαμμα1 βαριάς αλυσίδας και της κ και λ ελαφριάς αλυσίδας, αντιστοίχως (Εικόνα 15) 193. Ανοδικά βρίσκεται η αλληλουχία του πεπτιδίου-οδηγού από ποντικό (GenBank accession 73

74 no. DQ407610) και μια πολλαπλή θέση κλωνοποίησης. Η μεταγραφή βρίσκεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή του κυταρρομεγαλοϊού του ανθρώπου (human cytomegalovirus promoter). Τα πλασμίδια περιέχουν γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλίνη και τις περιοχές έναρξης της αντιγραφής puc ori, SV40 ori και F1 ori. Η μεταβλητή περιοχή των ανοσοσφαιρινών κλωνοποιήθηκε με PCR μεταξύ των θέσεων κοπής των ενζύμων περισορισμού AgeI και SalI για το πλασμίδιο piggamma1, AgeI και BsiWI για το πλασμίδιο pigkappa και AgeI και XhoI για το πλασμίδιο piglambda. 2.2 Κλωνοποίηση με τη βοήθεια της PCR Η μέθοδος της PCR χρησιμοποιείται ευρύτατα στην κλωνοποίηση του DNA Εικόνα 15. Πλασμίδια piggamma1 (A) pigκappa (B) και piglambda (Γ) για την παραγωγή ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων. Figure 15. Plasmids piggamma1 (A) pigκappa (B) and piglambda (Γ) for CLL monoclonal antibodies production. σε διάφορους πλασμιδιακούς φορείς 194. Στην παρούσα διατριβή, με τη βοήθεια της PCR έγινε κλωνοποίηση των περιοχών του cdna της μεταβλητής περιοχής της βαριάς αλυσίδας και των κ και λ ελαφριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών στους πλασμιδιακούς φορείς piggamma1, pigκappa και piglambda, αντιστοίχως. Κατ αυτόν τον τρόπο, όλα τα μονοκλωνικά αντισώματα παράχθηκαν ως μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες του ανθρώπου με ισότυπο IgG1 74

75 καανεξάρτητα του ισοτύπου της κλωνοτυπικής ανοσοσφαιρίνης που εξέφραζε ο λευχαιμικός κλώνος. Η κλωνοποίηση των γονιδίων των ελαφριών αλυσίδων πραγματοποιήθηκε στα πλασμίδια pigkappa ή piglambda ανάλογα με τον τύπο ελαφριάς αλυσίδας που εξέφραζε ο λευχαιμικός κλώνος. Χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές για την ενίσχυση της μεταβλητής περιοχής των ανοσοσφαιρινών και την προσθήκη αλληλουχιών-στόχων για τα ένζυμα περιορισμού AgeI, SalI, BsiWI και XhoI (Πίνακας 5) 193. Ακολούθησε καθαρισμός των προϊόντων PCR από 3% πηκτή αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξης (QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN) και ανάλυση αλληλουχίας των προϊόντων PCR που πραγματοποιήθηκε όπως προαναφέρθηκε. Στη συνέχεια, τα PCR προϊόντα υποβλήθηκαν σε πέψη με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού: AgeI και SalI για τη μεταβλητή περιοχή της βαριάς αλυσίδας, AgeI και XhoI και AgeI και BsiWI για τη μεταβλητή περιοχή της κ και λ ελαφριάς αλυσίδας, αντιστοίχως. Με τα ίδια ένζυμα επεξεργάστηκαν και οι αντίστοιχοι πλασμιδιακοί φορείς για την παραγωγή γραμμικών μορίων 193,194. Η πέψη του DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού γίνεται ανάλογα με τις ιδιότητες και τις απαιτήσεις του κάθε ενζύμου σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκαν ένζυμα της εταιρείας New England Biolabs (ΝΕΒ). Το κάθε ένζυμο έχει συγκεκριμένες απαιτήσεις ως προς το ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο γίνεται η αντίδραση, τη θερμοκρασία της αντίδρασης, την παρουσία της πρωτεΐνης BSA (Bovine Serum Albumin, αλβουμίνη ορού βοδιού) καθώς και το χρόνο της αντίδρασης. Οι πέψεις με τα ένζυμα περιορισμού έγιναν διαδοχικά καθώς τα ένζυμα δεν είχαν συμβατές απαιτήσεις, σε τελικό όγκο αντίδρασης 20 μl και 30 μl για την πρώτη και την δεύτερη αντίδραση, αντιστοίχως. Προηγήθηκε η πέψη με το ένζυμο το οποίο συνοδεύεται με ρυθμιστικό διάλυμα με τη χαμηλότερη συγκέντρωση αλάτων. Ο χρόνος επώασης κυμάνθηκε από 1,5 έως 3 ώρες με τυπικό χρόνο τις 2 ώρες. Χρησιμοποιήθηκαν 0,1 έως 2 μg DNA και 10 έως 20 μονάδες ενζυμικής δραστικότητας (Units) από την αντίστοιχη ενδονουκλεάση περιορισμού. Ως μονάδα ενζυμικής δραστικότητας (Unit) για τις ενδονουκλεάσες περιορισμού ορίζεται το ποσό του ενζύμου που είναι απαραίτητο για την πλήρη πέψη 1 μg DNA σε τελικό όγκο 50 μl υπό κατάλληλες συνθήκες. Η αντίδραση τερματίστηκε με επώαση διάρκειας 10 λεπτών σε υψηλότερη θερμοκρασία για την απενεργοποίηση του ενζύμου. Οι θερμοκρασίες δράσης και 75

76 απενεργοποίησης του κάθε ενζύμου καθώς και τα κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα και η χρήση της πρωτεΐνης BSA περιγράφονται στον Πίνακα 6. Ακολούθησε καθαρισμός των προϊόντων της πέψης με τη χρήση του QIAquick PCR purification kit (Qiagen). Πίνακας 5. Οι αλληλουχίες των εκκινητών για την ενίσχυση των αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ/ IGKV-IGKJ/ IGLV-IGLJ και την προσθήκη των θέσεων περιορισμού. Οι θέσεις περιορισμού εμφανίζονται με υπογράμμιση. Table 5. Primer sequences for amplification of IGHV-IGHD-IGHJ/ IGKV-IGKJ/ IGLV-IGLJ rearrangements and the insertion of restriction enzyme sites. Restriction sites are underlined. Forward εκκινητές 5-3 Νουκλεοτιδική αλληλουχία 5 AgeI VH1 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG 5 AgeI VH1/5/7 CTGCAACCGGTGTACATTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG 5 AgeI VH3 CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG 5 AgeI VH4 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG 5 AgeI VH 4-34 CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG 5 AgeI Vκ 1-39 CTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCCAGATGACCCAGTC 5 AgeI Vκ 2-30 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATGTTGTGATGACTCAGTC 5 Age Vκ 3-20 TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAG 5 AgeI Vκ 2-28 CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACTCAGTC 5 AgeI Vλ 1 CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTGACKCAG 5 AgeI Vλ 2 CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAG 5 AgeI Vλ 3 CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAGCTGACWCAG 5 AgeI Vλ 4/5 CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTGACTCA 5 AgeI Vλ 6 CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATGCTGACTCAG 5 AgeI Vλ 7/8 CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTGGTGACYCAG 5 AgeI Vλ CTGCTACCGGCAGTGGTCCAGGCAGGG Reverse εκκινητές 5-3 Νουκλεοτιδική αλληλουχία 3 SalI JH 1/2/4/5 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG 3 SalI JH 3 TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG 3 SalI JH 6 TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG 3 BsiWI Jκ 1/4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC 3 BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC 3 BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC 3 BsiWI Jκ 5 GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC 3 XhoI Cλ CTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG Συνθήκες αντίδρασης: Αρχική αποδιάταξη: 94 0 C, 5 min Κυρίως αντίδραση (50 κύκλοι) o Αποδιάταξη: 94 0 C, 30 sec o Υβριδισμός εκκινητών: 58 0 C (IgH/Igκ) ή 60 0 C (Igλ),30 sec o Σύνθεση μορίων DNA: 72 0 C, 55 sec Τελική επέκταση συντιθέμενων μορίων DNA: 72 0 C, 10 min 76

77 Πίνακας 6. Περιγραφή των ενζύμων περιορισμού Table 6. Description of restriction enzymes Ένζυμο Θέση κοπής Θερμοκρασί α δράσης Θερμοκρασία απενεργοποίησης NEBuffer AgeI A/CCGGT 37 o C 65 o C NEBuffer TGGCG/Α 1 SalI G/TCGAC 37 o C 65 o C NEBuffer CAGCT/G 3 BsiWI C/GTACG 55 o C 80 o C NEBuffer XhoI GCATG/C C/TCGAG GAGCT/C 1/3 37 o C 65 o C NEBuffer 3/4 A BS όχι ναι όχι ναι 2.3. Αποφωσφορυλίωση του πλασμιδιακού DNA Μετά την πέψη των πλασμιδιακών φορέων και τη μετατροπή τους σε γραμμικά μόρια DNA έγινε αποφωσφορυλίωση των άκρων τους έτσι ώστε να μην είναι δυνατή η επανασύνδεσή τους με τη βοήθεια της λιγκάσης 194. Η αποφωσφορυλίωση του DNA είναι απαραίτητη όταν τα άκρα του είναι συμβατά, έχουν δηλαδή κοπεί με το ίδιο ένζυμο. Συνιστάται επίσης και στην περίπτωση που έχει γίνει πέψη με διαφορετικά ένζυμα. Το ένζυμο που χρησιμοποιείται για την αποφωσφορυλίωση του DNA είναι η αλκαλική φωσφατάση από έντερο μοσχαριού (CIAP:Calf Intestine Alkaline Phosphatase, Promega). Η αντίδραση της αποφωσφορυλίωσης έγινε σε τελικό όγκο 50 μl σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα συγκέντρωσης 1x σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή ως εξής: Χρησιμοποιήθηκαν 40 μl DNA επαναιωρημένου σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα 1x. H ποσότητα του DNA δεν υπερέβαινε τα 10 pmol (1μg 1,000bp DNA = 1.52pmol DNA = 3.03 pmol άκρα). Κάθε pmol άκρων του DNA απαιτεί 0,01 units του ενζύμου. Στο διάλυμα του επαναιωρημενου DNA προστέθηκαν 5 μl ρυθμιστικού διαλύματος συγκέντρωσης 1x και κατάλληλη ποσότητα ενζύμου. Ακολούθησε επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C, προσθήκη ίσης ποσότητας ενζύμου όπως προηγουμένως και δεύτερη επώαση για 30 στους 37 ο C. Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 300 μl κατάλληλου διαλύματος τερματισμού (CIAP stop buffer: 10 mm Tris-HCl (ph 7.5), 1 mm EDTA (ph 7.5), 200 mm NaCl, 0.5% SDS) και ακολούθησε καθαρισμός του DNA με το QIAquick PCR purification kit (Qiagen) Σύνδεση του DNA με λιγκάση Η σύνδεση του DNA με λιγκάση πραγματοποιήθηκε για την ενσωμάτωση των μεταβλητών περιοχών των αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών στους πλασμιδιακούς φορείς κλωνοποίησης 194. Xρησιμοποιήθηκε η Τ4 DNA λιγκάση (Invitrogen). Η αντίδραση έγινε σε 77

78 τελικό όγκο 10μl, με επώαση στους 14 ο C για ώρες. Για την αντίδραση τοποθετήθηκαν σε μικροσωλήνα τύπου eppendorf τα εξής: ng του πλασμιδιακού φορέα κλωνοποίησης που έχει κοπεί με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού και έχει αποφωσφορυλιωθεί. 2. Τρεις φορές μοριακή περίσσεια από το κατάλληλο ένθεμα το οποίο έχει κοπεί με τα αντίστοιχα ένζυμα περιορισμού ώστε να δημιουργηθούν συμβατά άκρα. 3. Κατάλληλο ρυθμιστικό διαλυμα (Invitrogen) σε τελική συγκέντρωση 1x μονάδες ενζυμικής δράσης (Units) λιγάσης (Invitrogen) Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων με ανασυνδυασμένα πλασμίδια Για το μετασχηματισμό βακτηριακών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος κυττάρων E.coli TOP10F (Invitrogen). Η εισαγωγή των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων στα βακτηριακά κύτταρα πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή θερμικού πλήγματος και τα μετασχηματισμένα βακτήρια επιλέχθηκαν με βάση την ανοχή στην αμπικιλλίνη 194. Με χρήση μικροβιολογικού κρίκου συλλέχθηκαν από το τρυβλίο 5 βακτηριακές αποικίες για κάθε δείγμα και μεταφέρθηκαν σε σωληνάριο των 15 ml με υγρό θρεπτικό υλικό LB (Sigma) στο οποίο είχε προστεθεί αμπικιλλίνη σε συγκέντρωση100 μg/ ml. Ακολούθησε επώαση του διαλύματος σε κλίβανο στους 37 ο C επί ώρες. Ο έλεγχος της έκφρασης ανοσοσφαιρίνης από τους κλώνους των βακτηρίων πραγματοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τον εκκινητή 5 Absense που υβριδίζεται ανοδικά του ενθέματος και τους εκκινητές 3 IgGinternal, 3 Cκ494 και 3 Cλ που υβριδίζονται καθοδικά του ενθέματος (Πίνακας 7) 193,195. Οι βακτηριακοί κλώνοι που απέδωσαν προϊόντα PCR με το αναμενόμενο μέγεθος (650 bp για τη βαριά αλυσίδα γ1, 700 bp για την ελαφριά αλυσίδα κ and 590 bp για την ελαφριά αλυσίδα λ) επεκτάθηκαν σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας (250 ml) και στη συνέχεια ακολούθησε απομόνωση και καθαρισμός του πλασμιδίου με την χρήση του NucleoBond Xtra Maxi EF kit (Macherey Nagel). Η ενσωμάτωση της μεταβλητής περιοχής των αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών του κάθε ασθενούς στους πλασμιδιακούς φορείς επιβεβαιώθηκε τελικά με ανάλυση των αλληλουχιών των πλασμιδίων, όπως προαναφέρθηκε. 78

79 Πίνακας 7. Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο ενσωμάτωσης των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στους πλασμιδιακούς φορείς. Table 7. Primer sequences for the confirmation of the insertion of the immunoglobulin genes into the plasmid vectors. Εκκινητή 5-3 Νουκλεοτιδική Πλασμιδιακός φορέας 5'Ab GCTTCGTTAGAACGCGGCTAC piggamma1, pigkappa, 3'IgGinte GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGA piggamma1 3'Ck494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT pigkappa 3'Clamb CACCAGTGTGGCCTTGTTGGC piglambda Συνθήκες αντίδρασης: Αρχική αποδιάταξη: 94 0 C, 5 min Κυρίως αντίδραση (40 κύκλοι) o Αποδιάταξη: 94 0 C, 1 min o Υβριδισμός εκκινητών: 59 0 C, 1 min o Σύνθεση μορίων DNA: 72 0 C, 1.5 min Τελική επέκταση συντιθέμενων μορίων DNA: 72 0 C, 10 min 2.6. Παραγωγή ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων Καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων Για την παραγωγή ανασυνδυασμένων ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων καλλιεργήθηκε η ευκαρυωτική κυτταρική σειρά HEK293. Πρόκειται για εμβρυϊκά, νεφρικά κύτταρα ανθρώπου με μορφολογία επιθηλιακών κυττάρων που προσκολλούνται σε γυάλινο ή πλαστικό υπόστρωμα. Η καλλιέργεια των κυττάρων έγινε σε επωαστικό κλίβανο CO 2 με σταθερή παροχή CO 2 5%, σε θερμοκρασία 37 ο C και σε περιβάλλον κορεσμένο σε υγρασία. Χρησιμοποιήθηκε το θρεπτικό μέσο DMEM (Dulbeco s Modified Eagle Medium) εμπλουτισμένο με 10% (v/v) ορό εμβρύου βοός (Fetal Bovine Serum FBS) και 0,1% (v/v) υδατικού διαλύματος των αντιβιοτικών πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αποστειρωμένα τρυβλία καλλιέργειας των 155 cm 2 μέχρι τη δημιουργία απλοστιβάδας. Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων με επίδραση θρυψίνης γινόταν όταν αυτά εμφάνιζαν 70-90% κάλυψη της επιφάνειας ανάπτυξης και με διάστημα τουλάχιστον 48 ωρών μεταξύ δυο ανακαλλιεργειών. Μετά την πάροδο ενός μεγάλου χρονικού διαστήματος ανακαλλιεργειών και εφόσον παρατηρούνται μορφολογικές αλλοιώσεις στα κύτταρα γίνεται αντικατάστασή τους από κρυοδιατηρημένα κύτταρα στους -80 ο C τα οποία δεν έχουν υποστεί περισσότερες από δυο ανακαλλιέργειες. Η πειραματική διαδικασία της ανακαλλιέργειας των κυττάρων υπό αυστηρά άσηπτες συνθήκες έχει ως εξής: 79

80 Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου (~20 ml) και πλύση των κυττάρων με ~10 ml διαλύματος PBS. Προσθήκη 1 ml θρυψίνης (Gibco) και ανάδευση της φιάλης. O χρόνος επίδρασης της θρυψίνης εξαρτήθηκε από την ευαισθησία και την ανταπόκριση των κυττάρων σε αυτήν. Τα κύτταρα αρχίζουν να αποκολλούνται από την επιφάνεια προσκόλλησης ενώ εμφανίζουν και χαρακτηριστικές μορφολογικές μεταβολές, όπως στρογγυλό σχήμα. Η απενεργοποίηση της θρυψίνης έγινε με 10 όγκους (10 ml) θρεπτικού μέσου DMEM με 10% FBS και 0,1% αντιβιοτικά (πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη). Τα κύτταρα επαναιώρηθηκαν με τη βοήθεια αποστειρωμένης πιπέτας ώστε να αποκολληθούν πλήρως από την επιφάνεια προσκόλλησης και να μην σχηματίζουν συσσωματώματα και ακολούθως αραιώθηκαν και μεταφέρθηκαν σε νέα τρυβλία καλλιέργειας. Η αραίωση της αρχικής καλλιέργειας εξαρτήθηκε από το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων και κυμάνθηκε από 1:4 μέχρι 1: Κρυοδιατήρηση ευκαρυωτικών κυττάρων Όπως και στην περίπτωση των κυττάρων των ετεροϋβριδωμάτων, η κρυοδιατήρηση των κυττάρων HEK293 έγινε με χρήση κρυοπροστατευτικού διαλύματος που περιέχει 10% DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο) και 90% ορό εμβρύου βοός και σταδιακή ψύξη στους - 80 ο C. Για την κρυοδιατήρηση χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία δεν είχαν υποστεί περισσότερες από δυο ανακαλλιέργειες Διαμόλυνση κυττάρων ΗΕΚ293 Για τη διαμόλυνση των ευκαρυωτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο jetpei TM DNA Transfection (PolyPlus Transfections ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Εικόνα 16). Το αντιδραστήριο JetPei είναι συνθετικό κατιονικό πολυμερές, παράγωγο γραμμικής πολυαιθυλενιμίνης, ελεύθερο από συστατικά ζωικής προέλευσης. Η διαμόλυνση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε θρεπτικό μέσο DMEM με 10% FBS και 0,1% αντιβιοτικά. Δώδεκα έως δεκαέξι ώρες αργότερα, το θρεπτικό μέσο αφαιρέθηκε και αντικαταστήθηκε με DMEM εμπλουτισμένο με αντιβιοτικά και 1x Nutridoma-SP (Roche). To Nutridoma-SP χρησιμοποιήθηκε ως συμπλήρωμα του θρεπτικού μέσου αντί του ορού εμβρύου βοός έτσι ώστε να διευκολυνθεί ο επακόλουθος καθαρισμός των μονοκλωνικών αντισωμάτων από το υπερκείμενο των καλλιεργειών. Αποτελείται από αλβουμίνη, ινσουλίνη, τρανσφερίνη, και άλλες καθορισμένες οργανικές και ανόργανες ενώσεις, ενώ δεν περιέχει άλλους παράγοντες ανάπτυξης, μιτογόνα, ορμόνες ή στερόλες. 80

81 Εικόνα 16. Παροδικές διαμολύνσεις HEK 293 κυττάρων Figure 16. Transient transfections of HEK 293 cells Καθαρισμός των ΧΛΛ ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων Έξι έως επτά ημέρες μετά τη διαμόλυνση των κυττάρων, το υπερκείμενο των κυτταρικών καλλιεργειών συλλέχθηκε, τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση για 10 λεπτά 800 g και το υπερκείμενο αποθηκεύτηκε στους 4 C. Τα μονοκλωνικά αντισώματα καθαρίστηκαν με τη χρήση σφαιριδίων πρωτεΐνης G (GE Healthcare). Αναλυτικότερα, 25 ml υπερκειμένου από κάθε τρυβλίο καλλιέργειας επωάστηκαν με 25 μl του διαλύματος σφαιριδίων για τουλάχιστον 14 ώρες στους 4 C με κυκλική ανάδευση. Μετά την επώαση ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά 800 g, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα σφαιρίδια μεταφέρθηκαν σε κενές στήλες χρωματογραφίας (Biorad) οι οποίες είχαν προηγουμένως προετοιμαστεί με πλύση με PBS (Phosphate Buffered Saline). Ακολούθησαν 2 πλύσεις με 1 ml PBS και τα μονοκλωνικά αντισώματα εκχυλίστηκαν σε 4 φράγματα των 200 μl με 0,1 M γλυκίνη (ph 3.0). Τα εκχυλίσματα συλλέχθηκαν σε σωληνάρια τύπου eppendorf τα οποία περιείχαν 20 μl 1 M Tris (ph 8.0) έτσι ώστε το ph να προσαρμοστεί σε φυσιολογικά επίπεδα. Για την προστασία των δειγμάτων προστέθηκαν αναστολείς πρωτεασών και ο αντιβακτηριδιακός παράγοντας αζίδιο του νατρίου (NaN 3 ) σε τελική συγκέντρωση 0,05% (w/v) 193,

82 Ποσοτικοποίηση των ανασυνδυασμένων ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Η ποσοτικοποίηση των ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων βασίστηκε στη χρήση της ποσοτικής ELISA για ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη ΙgG, Igκ και Igλ της εταιρίας Bethyl (Human IgG/M/k/λ ELISA Quantitation Kits, Bethyl laboratories Inc.) Ηλεκτροφόρηση των μονοκλωνικών αντισωμάτων σε πηκτή SDSπολυακρυλαμίδης (SDS-PAGE) Η καθαρότητα και η ακεραιότητα των μονοκλωνικών αντισωμάτων ελέγχθηκε με ηλετροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης και χρώση με τη χρωστική Coomassie Brilliant Blue. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω για τα πρωτεινικά εκχυλίσματα των κυττάρων των υβριδωμάτων, με τη διαφορά ότι τα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα ηλεκτροφορήθηκαν τόσο σε αποδιατακτικές όσο και σε μη αποδιατακτικές συνθήκες. Σε συνθήκες πλήρους αποδιάταξης, η βαριά και η ελαφριά αλυσίδα των ανοσοσφαιρινών μετακινούνται ξεχωριστά ανάλογα με το μοριακό μέγεθος της καθεμιάς, ενώ σε μη αποδιατακτικές συνθήκες μετακινούνται ενιαία. Υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες η ανθρώπινη IgG1 μετακινείται με φαινομενικό μοριακό βάρος 150 kda περίπου, ενώ σε συνθήκες αποδιάταξης εμφανίζονται 2 ζώνες στα 50 kda και στα 25 kda που αντιστοιχούν στη βαριά και στην ελαφριά αλυσίδα. Η προετοιμασία των δειγμάτων περιγράφεται στον πίνακα 8. Μαζί με τα δείγματα τοποθετήθηκαν και πρωτεϊνικοί μάρτυρες γνωστού μοριακού μεγέθους (Biorad) Χρώση με Coomassie Brilliant Blue Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης ακολούθησε χρώση της πηκτής με τη χρωστική Cοomassie Brilliant Blue. Η χρωστική Coomassie Brilliant Blue έχει την ιδιότητα να συνδέεται με τις πρωτεΐνες σχηματίζοντας μη ομοιοπολικά σύμπλοκα, τα οποία σταθεροποιούνται από ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αμινοομάδων (-ΝΗ + 3 ) και δυνάμεις van der Waals. Η χρωστική συνδέεται με τις πρωτεΐνες αλλά όχι με την πηκτή επιτρέποντας μετά τον αποχρωματισμό την εμφάνιση του πολυπεπτιδικού προτύπου ως γαλάζιες ζώνες στο διαφανές υπόστρωμα της πηκτής. Η ευαισθησία της μεθόδου χρώσης με Coomassie Brilliant Blue είναι περίπου της τάξης των 0,1 μg πρωτεΐνης. Η προετοιμασία της χρωστικής έγινε ως εξής: 1. Παρασκευή 1 ου διαλύματος: 0,8 gr Coomassie Briliant blue G250 (CBB G250) (Biorad, cat no ) σε 200 ml αιθανόλης (EtOH) 82

83 2. Παρασκευή 2 ου διαλύματος: 80 gr θειικό αμμώνιο (NH 4 SO 4, ammonium sulphate) σε 781,2 ml ddh 2 O και 18,8 ml ορθοφωσφορικό οξύ (H 3 PO 4, orthophosphoric acid)85% ή 16 ml H 3 PO 4 100%. 3. Προσθήκη του διαλύματος 2 στο διάλυμα 1. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης η πηκτή τοποθετήθηκε μέσα σε διάλυμα σταθεροποίησης [40%μεθανόλη (CH 3 OH), 7% οξικό οξύ (CH 3 COOH)] για 1 ώρα υπό ανάδευση. Ακολούθησε χρώση με την χρωστική Coomassie Brilliant Blue για ώρες στους 4 ο C. Τέλος, πραγματοποιήθηκε αποχρωματισμός της πηκτής με διάλυμα αποχρωματισμού (1% οξικό οξύ) για 1-2 ώρες μέχρι τον πλήρη αποχρωματισμό της. Πίνακας 8. Προετοιμασία των δειγμάτων για SDS ηλεκτροφόρηση Table 8. Preparation of samples for SDS electrophoresis Αντιδραστήριο Αποδιαταγμένα δείγματα Μη αποδιαταγμένα δείγματα Δείγμα x μl x μl NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) 2.5 μl 2.5 μl NuPAGE Reducing Agent (10X) 1 μl ddh 2 O 6.5- x μl 7.5- x μl Τελικός όγκος 10 μl 10 μl Μόνο τα αποδιαταγμένα δείγματα υποβλήθηκαν σε βρασμό για 5 λεπτά στους 95 C 3. Έλεγχος της ειδικότητας των μονοκλωνικών αντισωμάτων 3.1. Δοκιμασίες ELISA με την χρήση εμπορικά διαθέσιμων συσκευασιών Τα μονοκλωνικά αντισώματα που παράχθηκαν με την τεχνική των υβριδωμάτων ελέγχθηκαν αρχικά για την αναγνώριση κοινών αυτοαντιγόνων και μικροβιακών αντιγόνων με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμων συσκευασιών (Κit) ELISA των εταιριών IBL Hamburg και Abbott (Πίνακας 9). Τα Κit χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με τη διαφορά ότι αντί για ορό χρησιμοποιήθηκαν τα μονοκλωνικά αντισώματα που παράχθηκαν με την τεχνική των υβριδωμάτων σε συγκέντρωση 10μg/ml. Όλα τα αντισώματα υποβλήθηκαν σε διπλή εξέταση. 83

84 Πίνακας 9. ELISA kit για κοινά αυτοαντιγόνα και μικροβιακά αντιγόνα Table 9. ELISA kit for common autoantigens and microbial antigens IBL Hamburg ELISA kits Αυτοανοσία Ονομασία συσκευασίας Ανίχνευση IgG/Μ* ANA HEp2 Screen Αντισώματα κατά πυρηνικών αντιγόνων λυμμένων HEp2 IgG κυττάρων ANA Screen 8-Ab Αντισώματα κατά των πυρηνικών αντιγόνων: dsdna, RNP, IgG Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, CENP-B και Jo-1 ENA Screen 6-Ab Αντισώματα κατά RNP, Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, Jo-1 IgG dsdna Screen Αντισώματα κατά dsdna IgG ssdna Screen Αντισώματα κατά ssdna IgG Histone-C-Ab Aντισώματα κατά ιστονών H1, H2A, H2B, H3, H4 IgG Histone-H1-Ab Αντισώματα κατά ιστόνης Η1 IgG SS-A/Ro Αντισώματα κατά SS-A/Ro IgG SS-B/La Αντισώματα κατά SS-B/La IgG Jo-1 Αντισώματα κατά Jo-1 IgG Sm Αντισώματα κατά Sm IgG U1-RNP Αντισώματα κατά U1-RNP IgG Rheumatoid Factor Screen Ρευματοειδείς παράγοντες ΙgG IBL Hamburg ELISA kits- Θρόμβωση Ονομασία συσκευασίας Ανίχνευση IgG/ Beta2-glycoprotein I Αντισώματα κατά της β 2 γλυκοπρωτεΐνης IgG Cardiolipin IgM Αντισώματα κατά της καρδιολιπίνης Ιg IBL Hamburg ELISA kits - Αγγειίτιδα Ονομασία συσκευασίας Ανίχνευση IgG/ PR3 (c-anca) Αντισώματα κατά της πρωτεϊνάσης 3 IgG MPO(p-ANCA) Αντισώματα κατά της μυελοπεροξειδάσης IgG IBL Hamburg ELISA kits - Μολυσματικές νόσοι Ονομασία συσκευασίας Ανίχνευση IgG/ Cytomegalovirus Αντισώματα κατά κυτταρομεγαλοϊού IgG Epstein-Barr Virus EA Αντισώματα κατά του πρώιμου αντιγόνου (ΕΑ) του EBV IgG Epstein-Barr Virus VCA Αντισώματα κατά του καψιδιακού αντιγόνου (VCA) του IgG Epstein-Barr Virus EBNA-1 Αντισώματα κατά του πυρηνικού αντιγόνου (EBNA) του IgG Herpes simplex Virus 1 /2 Αντισώματα κατά ερπητοϊού τύπου 1 και 2 IgG Leishmania infantum Αντισώματα κατά παρασίτου λεϊσμανίασης IgG Mycobacterium Αντισώματα κατά του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης IgG tuberculosis Mycoplasma pneumoniae Αντισώματα κατά του μυκοπλάσματος της πνευμονίας IgG Abbot ELISA kits - Μολυσματικές νόσοι Ονομασία συσκευασίας Ανίχνευση IgG/ AxSYM Anti-HCV 3.0 Αντισώματα κατά των HCr43, c200, c100-3 και NS5 αντιγόνων του ιού της ηπατίτιδας Γ (HCV) Ιg M * Ισότυπος αντισωμάτων που ανιχνεύονται, Isotype of detected antibodies. Μολονότι η συσκευασία ANA Screen 8-Ab είναι σχεδιασμένη για την ανίχνευση αντιπυρηνικών αντισωμάτων ισοτύπου IgG, χρησιμοποιήθηκε και για την ανίχνευση αντιπυρηνικών αντισωμάτων ισοτύπου IgM ως εξής: 84

85 Χρησιμοποιήθηκε η πλάκα πολυστυρενίου επικαλυμμένη με πυρηνικά αντιγόνα από το kit της εταιρίας Hamburg ANA Screen 8-Ab (Πίνακας 9). Ως πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν IgM μονοκλωνικά αντισώματα που παράχθηκαν με την τεχνική των υβριδωμάτων σε συγκέντρωση 10μg/ml. Ως δευτερογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα ανίχνευσης των ανθρώπινων ανσοσφαιρινών IgM συνδεδεμένο με υπεροξιδάση ρεπανίου (horseradish peroxidase - HRP) (Bethyl Laboratories, HRP conjugated anti-human IgM)και στη συνέχεια προστέθηκε το υπόστρωμα του HRP, 3,3',5,5- τετραµεθυλο-βενζιδίνης (3,3,5,5 tetramethylbenzidine, TMB) (Bethyl laboratories). Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 0,18 M θειικού οξέος (H 2 SO 4 ) (Bethyl laboratories) και η οπτική απορρόφηση μετρήθηκε στα 450nm με τη συσκευή ELISA reader (Biotech ELx800). 3.2 Δοκιμασίες ELISA Τα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα, τόσο αυτά που παράχθηκαν με την τεχνολογία των υβριδωμάτων όσο και τα ανασυνδυασμένα, ελέγχθηκαν επιπλέον αναφορικά με την αναγνώριση κατηγοριών αντιγόνων που έχει δειχθεί ότι είναι συχνοί αντιγονικοί στόχοι των ΧΛΛ αντισωμάτων. Αναλυτικότερα, τα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα ελέγχθηκαν για πιθανή αντι-dna δράση, δράση ρευματοειδούς παράγοντα ενώ εξετάστηκε και η αναγνώριση νέο-αντιγόνων που παράγονται σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες και, πιο συγκεκριμένα, η αντιδραστικότητα εναντίον τροποποιημένου BSA με μεταβολίτες της οξείδωσης των λιπαρών οξέων, όπως MDA και HNE (Μηλονική διαλδεϋδη και 4-υδροξυνονενάλη), καθώς και BSA τροποποιημένου με πρωτεινικά προιόντα προχωρημένης οξείδωσης (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP). Τέλος, ελέγχθηκε η ειδικότητα εναντίον αντιγόνων του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) και εναντίον βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών. Επιπλέον, κάποια μονοκλωνικά αντισώματα ελέγχθηκαν και ως προς την αναγνώριση και άλλων μικροβιακών συστατικών που τυπικά αναγνωρίζονται από τους υποδοχείς της έμφυτης ανοσίας. Συγκεκριμένα ελέγχθηκε η αναγνώριση των εξής προσδετών των υποδοχέων TLR και NOD2 (Εικόνα 17): Λιποπολυσακχαρίτες (LPS) από E.coli 055:B5 - προσδέτης του υποδοχέα TLR4 Pam3CSK4 (synthetic triacylated lipoprotein)- προσδέτης του ετεροδιμερούς των υποδοχέων TLR1/2 85

86 MALP2 (Mycoplasmal Macrophage-activating Lipopeptide-2) - προσδέτης του ετεροδιμερούς των υποδοχέων TLR2/6. Loxoribine (ανάλογο της γουανοσίνης) - προσδέτης του υποδοχέα TLR7 Poly(U) (Polyuridylic acid) - προσδέτης του υποδοχέα TLR8 CpG (μη μεθυλιωμένο DNA) - προσδέτης του υποδοχέα TLR9 MDP (Muramyldipeptide L isoform) - προσδέτης του υποδοχέα NOD2 Εικόνα 17. Υποδοχείς TLR και οι αντίστοιχοι προσδέτες τους. Figure 17. TLRs and their corresponding ligands. Οι δοκιμασίες ELISA πραγματοποιήθηκαν ως εξής: Πλάκες πολυστυρενίου 96 οπών (Corning) καλύφθηκαν με 100 μl κάθε εξεταζόμενου αντιγόνου (Πινακας 10) σε συγκέντρωση 2-5 μg/ml και ακολούθησε ολονύχτια επώαση στους 4 ο C. Στη συνέχεια οι πλάκες πλύθηκαν 5 φορές με PBS-Tween και οι κενές θέσεις επικαλύφτηκαν με PBS 3%BSA. Ακολούθησε πλύσιμο των πλακών όπως προηγουμένως και προσθήκη 100μl από τα εξεταζόμενα μονοκλωνικά αντισώματα σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν από 1,25 έως 20 μg/ml (διαδοχικές αραιώσεις 1:2) και οι πλάκες επωάστηκαν ολονυχτίως στους 4 ο C. Στη συνέχεια προστέθηκαν 100μl από το κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα ανίχνευσης των ανθρώπινων ανσοσφαιρινών IgM και IgG, συνδεδεμένο με υπεροξιδάση ρεπανίου (horseradish peroxidase - HRP) (Bethyl Laboratories, HRP conjugated anti-human IgM και HRP conjugated anti-human IgG) και οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Τέλος, οι πλάκες πλύθηκαν ξανά όπως προηγουμένως και ακολούθως προστέθηκαν 50 μl από το υπόστρωμα του HRP, 3,3',5,5- τετραµεθυλο-βενζιδίνης (3,3,5,5 tetramethylbenzidine, TMB) (Bethyl laboratories, E102). 86

87 Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 50 μl 0,18 M θειικού οξέος (H 2 SO 4 ) (Bethyl laboratories) και η οπτική απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm με χρήση της συσκευής ELISA reader (Biotech ELx800). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού GraphPad Prism 5 software (La Jolla, CA, USA). Για κάθε αντιγόνο πραγματοποιήθηκαν 2 ανεξάρτητα πειράματα και σε κάθε πείραμα τα δείγματα εξετάστηκαν σε 3 αντίγραφα. Πίνακας 10. Αντιγόνα στόχοι για τις δοκιμασίες ELISA. Table 10. Target antigens for ELISA assays. Αντιγόνο επικάλυψης Human IgG Fc MDA-BSA HNE-BSA AOOP-HSA Salmon sperm DNA HCV nucleocapsid protein HCV core 24 protein HCV NS3+NS4+NS5 proteins Lipopolysaccharides from E. coli 055:B5 Pam3CSK4 MALP-2 Loxoribine Poly(U) CpG MDP Προμηθεύτρια εταιρία Bethyl laboratories. Cellbiolabs, Inc. Cellbiolabs, Inc. Cellbiolabs, Inc. Invitrogen Abcam Abcam Abcam Sigma-Aldrich Invivogen Invivogen Invivogen Invivogen Invivogen Invivogen 3.3 Δοκιμασία ELISA παρεμπόδισης Κατόπιν της πραγματοποίησης της δοκιμασίας ELISA για την ανίχνευση δράσης ρευματοειδούς παράγοντα πραγματοποιήθηκε ELISA παρεμπόδισης με σκοπό την επιβεβαίωση της ειδικής δράσης ρευματοειδούς παράγοντα ενός ΧΛΛ μονοκλωνικού αντισώματος που εμφάνισε ισχυρή δέσμευση στη σταθερή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης IgG. Αναλυτικότερα, η διαδικασία ήταν η εξής: 100 μl του υπό εξέταση ΧΛΛ μονοκλωνικού αντισώματος (ITARF, του ασθενούς IT ) σε συγκέντρωση βέλτιστη (0,5 μg/ml) για τη σύνδεση ενάντια στο αντιγόνο - στόχο (σταθερή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης IgG - IgG-Fc) επωάστηκε με αυξανόμενες ποσότητες (0,1 to 5μg) του πεπτιδίου ανταγωνιστή (ανθρώπινη φυσιολογική IgG, Bethyl laboratories) για 2 ώρες στους 37 C. Τα μείγματα εξετάστηκαν στη συνέχεια με δοκιμασία ELISA όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αποτελέσματα απεικονίστηκαν ως ποσοστό δέσμευσης στο αντιγόνο-στόχο έναντι της συγκέντρωσης του ανταγωνιστή. Το ποσοστό της δέσμευσης στο αντιγόνο-στόχο 87

88 υπολογίστηκε με βάση την οπτική απορρόφηση (OD), λαμβάνοντας την τιμή της οπτικής απορρόφησης χωρίς ανταγωνιστή ως 100% δέσμευση. 3.4 Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμασιών ELISA Η αξιολόγηση της αναγνώρισης των διαφόρων αντιγόνων έγινε με βάση κλίμακα που έχει χρησιμοποιηθεί σε αντίστοιχα πειράματα ELISA με τη χρήση ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων 166. Υπολογίστηκε ο λόγος της οπτικής απορρόφησης προς την οπτική απορρόφηση του αρνητικού μάρτυρα (background) και τα αποτελέσματα ερμηνεύτηκαν ως εξής: = < 2, + = 2-5, + + = 5-10, = 10-15, = > 15. Με βάση την κλίμακα αυτή αξιολογήθηκαν τα αποτελέσματα της δέσμευσης των μονοκλωνικών αντισωμάτων στα αντιγόνα στη συγκέντρωση 20 μg/ml. Η ίδια κλίμακα χρησιμοποιήθηκε και κατά την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμασιών ELISA με την χρήση kit (συγκέντρωση μονοκλωνικών αντισωμάτων 10 μg/ml). 3.5 Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων και γραφική απεικόνιση Η στατιστική ανάλυση και γραφική απεικόνιση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος Εxcell 2007 της Microsoft και του λογισμικού Graphpad Prism 5.0 (La Jolla, CA, USA). Για τα ποσοτικά δεδομένα υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές και η τυπική απόκλιση. Οι συγκριτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με δοκιμές t-test για ανεξάρτητα δείγματα (μη παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney). Για την ανάλυση συσχέτισης υπολογίστηκε ο συντελεστής συσχέτισης Spearman. Όλες οι αναλύσεις έγιναν σε επίπεδο σημαντικότητας 5%. 88

89 4. Ομάδα μελέτης 4.1 Παραγωγή ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Η ομάδα μελέτης περιλάμβανε 47 ασθενείς με τυπική χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία οι οποίοι παρακολουθούνται στην Αιματολογική Κλινική του ΓΝ «Γ. Παπανικολάου», του ΓΝ Νίκαιας Πειραιά «Άγ. Παντελεήμων» και του νοσοκομείου San Raffaele στο Μιλανο. Κατά τη λήψη των δειγμάτων είχε ληφθεί έγγραφη κατάθεση των ασθενών. Η διάγνωση έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια του NCI (National Cancer Institute). Σαράντα από τις 47 περιπτώσεις ανήκαν σε στερεότυπα υποσύνολα, σύμφωνα με τα καθιερωμένα κριτήρια. Τα «κύρια» υποσύνολα #1, #2, #4 και #8 υπεραντιπροσωπεύονται 137. Δημογραφικά δεδομένα, κλινικά χαρακτηριστικά και ανοσοφαινοτυπικά ευρήματα των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 11. To ρεπερτόριο των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και τα στερεότυπα υποσύνολα παρουσιάζονται στον Πίνακα 12. Σύντηξη λευχαιμικών κυττάρων με σκοπό την παραγωγή ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων πραγματοποιήθηκε για 37 ασθενείς και παραγωγή ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων πραγματοποιήθηκε για 20 ασθενείς (Πίνακας 12). Πίνακας 11. Δημογραφικά, κλινικά και βιολογικά δεδομένα. Table 11. Demographic, clinical and biological data. Υποσύνολο#1 (n= 10) Υποσύνολο#2 (n=6 ) Υποσύνολο#4 (n= 10) Υποσύνολο #8 (n= 4) Λοιπές περιπτώσεις (n=17) Άνδρες Γυναίκες Διάμεση ηλικία κατά τη διάγνωση (εύρος) 63 (39-77) 67 (57-81) 51 (37-69) 56 (21-73) 59 (38-73) Στάδιο Binet A B C Έκφραση CD38 Θετική Αρνητική Επιφανειακή Ig MD G Γονίδια IGHV Μεταλλαγμένα Αμετάλλακτα Πρόοδος Νόσου Προοδευτική νόσος Σταθερή νόσος

90 Πίνακας 12. Ρεπερτόριο IGHV γονιδίων και στερεότυπα υποσύνολα στην ομάδα μελέτης. Table 12. IGHV gene repertoire and stereotyped subsets in the study group. Ασθενής Σ.Υ ΙGHV Νουκλεοτιδική ταυτότητα % VH CDR3 IGKV/IGLV Τεχνική* P IGHV ,70 CARVQWLATYYFDYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ/Α.Α P IGHV ,00 CARAQWLVVTNFDYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ. P IGHV ,00 CARGQWLVQLNFDYW IGKV1-39(1D-39) Α.Α P IGHV1-2 99,70 CAREQWLVRIYFDYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ. P IGHV ,00 CAREQWLVRVNFDYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ/Α.Α GM056 1 IGHV ,00 CAREQWLAITHFDYW IGKV1-39(1D-39) Α.Α RS038 1 IGHV ,00 CAREQWLGPYYFDYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ/Α.Α P IGHV5-a 100,00 CAREQWLGIKNFDYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ. P IGHV5-a 100,00 CAREQWLVLEHFDYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ/Α.Α P IGHV ,00 CARGQWLPTPNFDYW IGKV1-39(1D-39) Α.Α P IGHV ,60 CAIDRNGMDVW IGLV3-21 ΥΒΡ/Α.Α P IGHV ,20 CVTDRNGMDVW IGLV3-21 ΥΒΡ. BV035 2 IGHV ,22 CASDKNGMDVW IGLV3-21 Α.Α P IGHV ,99 CARDQNAMDVW IGLV3-21 Α.Α P IGHV ,60 CARDQNAMDVW IGLV3-21 Α.Α N IGHV ,92 CATDRNGMDVW IGLV3-21 Α.Α P IGHV ,90 CARGYPDTPVVRRYYYYGMDVW IGKV2-30 ΥΒΡ/Α.Α P IGHV ,20 CARGYGTSATTKRYYYYGMDVW IGKV2-30 ΥΒΡ. P IGHV ,90 CARGYADTPTFRRYYYYGMDVW IGKV2-30 ΥΒΡ. P IGHV ,80 CASGSTPTTRRYYYYGMDVW IGKV2-30 ΥΒΡ. P IGHV ,50 CVRGYPDTAVVKRYYYYGMEVW IGKV2-30 ΥΒΡ. P IGHV ,70 CVRGYADTAVVRRYYYYGMDVW IGKV2-30 ΥΒΡ. P IGHV ,50 CARGYGDSPDTKRYYYFGLDVW IGKV2-30 ΥΒΡ. P IGHV ,30 CARGWPEDAVTRRYYYYGMEIW IGKV2-30 ΥΒΡ. P IGHV ,20 CARGYADSDVIRRYYYYGMDVW IGKV2-30 ΥΒΡ. PM013 4 IGHV ,15 CARSYGDSPSVRRYYYYGLDVW IGKV2-30 ΥΒΡ. LF094 6 IGHV ,00 CARGGDYDYIWGSYRPNDAFDIW IGKV3-20 ΥΒΡ. KM1PL 6 IGHV ,00 CARGGNYDYIWGSYRSNDAFDIW IGKV3-20 Α.Α P IGHV ,00 CATINYDFWSGYYKNYYYGMDVW ΥΒΡ. P IGHV ,00 CASRRGYSSSWFNVVAWFDPW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ/Α.Α BG012 8 IGHV ,00 CATRQSYSSGWYGGVNWFDPW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ/Α.Α KAO121PL 8 IGHV ,00 CARHNLGYSSSWYSRNNWFDPW IGKV1-39(1D-39) Α.Α P IGHV ,70 CASLTGYSSSWYTPANWFDPW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ/Α.Α P IGHV ,60 CARDRGGYCSSTSCYLFYYGMDVW IGLV1-51 ΥΒΡ. P IGHV ,00 CARHRLGYCSSTSCYYYYYGMDVW IGLV1-40 Α.Α ITA IGHV ,10 CARDRYCSGGTCFDWYFDLW IGKV3-20 ΥΒΡ. P IGHV ,00 CAGRFYCYGGNCNNANYYYYYGMDVW IGKV3-20 ΥΒΡ. CE IGHV4-b 96,53 CARVRWGSNWFSYFDFW IGLV1-44 ΥΒΡ. BE IGHV ,00 CAAGPDFWSGYPYW IGKV2-28 ΥΒΡ/Α.Α P IGHV ,60 CARDLTGVGAVVVILPQYYFDYW IGKV3-20 ΥΒΡ. P IGHV ,00 CARDDPAIVVVPAAISYYYGMDVW IGKV1-39 ΥΒΡ. P IGHV ,00 CASLGGGYYDILTGYRILFDYW IGLV1-44 ΥΒΡ. P IGHV ,00 CARDGGGYCSGGSCYYNYYYYYMDVW IGLV3-21 ΥΒΡ. P IGHV ,00 CARSRRGYYDFWSGSPEDYW IGLV2-11 ΥΒΡ. P IGHV ,00 CARGTSLGEYDFWSGYLFQEARYYYYGMDVW IGLV1-51 ΥΒΡ. P IGHV ,30 CARGLYSSSLESAFDIW IGLV2-8 ΥΒΡ. P IGHV ,60 CAREDRYYDFWSGYLYW IGKV1-39(1D-39) ΥΒΡ. Σ.Υ: στερεότυπο υποσύνολο, stereotyped subset Νουκλεοτιδική ταυτότητα %: Status μεταλλάξεων των IGHV γονιδίων %, Mutation Status of IGHV genes %. *:ΥΒΡ= τεχνολογία των υβριδωμάτων, hybridomas technology Α.Α= ανασυνδυασμένα αντισώματα, recombinant antibodies 90

91 Επίσης παράχθηκαν ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα από 13 επιπλέον ασθενείς με τη χρήση ΧΛΛ πλασμιδίων σε συνεργαζόμενο ινστιτούτο στη Νέα Υόρκη, ΗΠΑ (Feinstein Institute for Medical Research, North Shore-LIJ Health System, Manhasset, New York, United States of America). To ρεπερτόριο των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και τα στερεότυπα υποσύνολα παρουσιάζονται στον Πίνακα 13. Πίνακας 13. ΧΛΛ πλασμίδια από τις ΗΠΑ: Ρεπερτόριο IGHV γονιδίων και στερεότυπα υποσύνολα. Table 13. CLL plasmids from USA: IGHV gene repertoire and stereotyped subsets. Ασθενής Σ.Υ ΙGHV Status % HCDR3 IGKV/IGLV CLL270 1 IGHV ,00 CARVQWLGLRHFDYW IGKV1-39(1D-39) CLL340 1 IGHV ,00 CAREQWLVLKNFDYW IGKV1-39(1D-39) CLL360 1 IGHV ,00 CAREQWLVLNYFDYW IGKV1-39(1D-39) CLL154 1 IGHV ,92 CAREQWLVLSHFDY IGKV1-39(1D-39) CLL282 2 IGHV ,57 CARDANGMDVW IGLV3-21 CLL342 4 IGHV ,19 CARGWGDTPMLKRYYYYGLDVW IGKV2-30 CLL183 4 IGHV ,84 CARGYGDTPTIRRYYYYGMDVW IGKV2-30 CLL68 6 IGHV ,00 CARGGDYDYVWGSYRSNDAFDIW IGKV3-20 CLL657 8 IGHV ,66 CASKTGYSSSWYGRDWFDPW IGKV1-39(1D-39) CLL114 8 IGHV ,00 CARRFGYSSSWYGLDWFDPW IGKV1-39(1D-39) CLL845 8 IGHV ,00 CASSTGYSSSWYSPTNWFDPW IGKV1-39(1D-39) CLL376 - IGHV ,00 CATSAFTVTHAEYFQHW IGKV3-11 CLL415 - IGHV ,00 CARRPESGYSFVTPFDYW IGKV1-39(1D-39) Σ.Υ: στερεότυπο υποσύνολο, Status %: Status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV %. Σ.Υ: stereotyped subset; Status %: Mutation Status of IGHV genes %. 4.2 Συλλογή αλληλουχιών των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Για τη μελέτη του στερεότυπου υποσυνόλου #13 και την εύρεση αλληλουχιών με χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου υποσυνόλου μελετήθηκαν 5798 παραγωγικές IGHV-D-J αναδιατάξεων από ασθενείς με ΧΛΛ από συνεργαζόμενα Αιματολογικά κέντρα στην Ελλάδα, την Ιταλία, τη Γαλλία, το Ηνωμένο Βασίλειο, την Τσεχία, την Δανία και την Σουηδία, Η ανάλυση των αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της διεθνούς βάσης δεδομένων ανοσογενετικής IMGT (International ImMunoGeneTics database) και αλγορίθμων του προγράμματος IMGT/V-QUEST ( 196,197. Επίσης, από τη βάση δεδομένων IMGT / LIGM DB ανακτήθηκαν συνολικά IGHV-D- J και 2446 IGKV-J αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση με τις αλληλουχίες των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών του υποσυνόλου #13. Συμπεριλήφθηκαν 221 IGHV-D-J και 150 IGKV-J αλληλουχίες ανοσοσφαιρινών που έχουν προηγουμένως αναφερθεί ως προερχόμενες από αντι-ηcv αντισώματα και HCV-σχετιζόμενες λεμφοϋπερπλασίες (Παράρτημα). των 91

92 Αποτελέσματα 92

93 1. Παραγωγή ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη μέθοδο των υβριδωμάτων 1.1. Συντήξεις λευχαιμικών λεμφοκυττάρων με μυελωματικά κύτταρα ποντικού OURI Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 94 συντήξεις λευχαιμικών λεμφοκυττάρων 37 ασθενών με ΧΛΛ (1-8 πειράματα σύντηξης για κάθε ασθενή). Από τις 94 συντήξεις, οι 46 (49%) κρίθηκαν ως «επιτυχείς», συντήξεις δηλαδή από τις οποίες προέκυψαν υβριδώματα βιώσιμα για παρατεταμένο χρονικό διάστημα. Οι υπόλοιπες 48 συντήξεις χαρακτηρίστηκαν ως «αποτυχείς», δηλαδή συντήξεις στις οποίες δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη υβριδωμάτων (Πίνακας 14). Το υψηλό ποσοστό αποτυχίας της διαδικασίας της σύντηξης οφειλόταν κυρίως στους εξής λόγους: (i) Χαμηλή ποιότητα των μυελωματικών κυττάρων OURI: η παραμονή των μυελωματικών κυττάρων σε καλλιέργεια για μεγάλο χρονικό διάστημα οδηγεί πιθανά σε προοδευτικό εκφυλισμό τους με αποτέλεσμα τη μείωση της ικανότητας σύντηξης με τα Β λεμφοκύτταρα (8/48 αποτυχίες). (ii) Χρήση επιμολυσμένων μακροφάγων με αποτέλεσμα την αχρήστευση της σύντηξης ακόμη κι αν αυτή δυνητικά θα παρήγαγε βιώσιμα υβριδώματα, αφού η επιμόλυνση εξαπλώθηκε από τα μακροφάγα και στα πιθανά υβριδώματα (13/48 αποτυχίες). (iii) Σχετικά χαμηλή συχνότητα επιτυχημένων συντήξεων των ΧΛΛ κυττάρων ακόμα και συγκριτικά με άλλες εφαρμογές των υβριδωμάτων, πιθανόν από «απροθυμία» των λευχαιμικών Β λεμφοκυττάρων να συντηχθούν Από τις 46 επιτυχημένες συντήξεις προέκυψαν συνολικά 405 βιώσιμα επί μακρώ υβριδώματα. Τα βιώσιμα υβριδώματα παρουσίασαν ικανοποιητικό -αν και κατά κανόνα αργό- ρυθμό ανάπτυξης που επέτρεψε τη διαδοχική μεταφορά τους από το στάδιο της πλάκας 96-οπών σε καλλιέργεια μεγάλης κλίμακας σε φλάσκες 75cm 2 και τη μετέπειτα συλλογή ικανής ποσότητας υπερκειμένου πλούσιου σε ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα. 93

94 Πίνακας 14. Συντήξεις λευχαιμικών Β λεμφοκυττάρων με μυελωματικά κύτταρα ποντικού OURI. Table 14. Fusion of leukemic B cells with OURI murine myeloma cells. Σύντηξη Δείγμα Ασθενής Βιώσιμα Υβριδώματα Σύντηξη Δείγμα Ασθενής Βιώσιμα Υβριδώματα # P1422 όχι # P3916 όχι # P1422 όχι # P3916 όχι # P1422 όχι # P6090 όχι # P2920 ναι # P781 όχι # P2920 ναι # P6539 όχι # P1939 όχι # P3916 ναι #7 907 P907 ναι # P1626 ναι #8 907 P907 ναι # P6090 ναι #9 103 P103 όχι # P103 όχι # P103 όχι # P3916 όχι # P3574 όχι # P2355 ναι # P3574 όχι # P907 ναι # P2355 όχι # P3916 ναι # P2355 ναι # P907 ναι # P3000 ναι # P103 ναι # P3073 ναι # P2355 όχι # P3073 ναι # P5239 όχι #18 ITARF IT ναι # P6539 όχι # P1615 ναι # P6539 όχι # P907 όχι # P2355 ναι # P1610 ναι # P2355 ναι # P4699 όχι # P5975 όχι # P3551 ναι # P6539 ναι # P2446 ναι # P907 ναι # P2355 όχι # P1626 ναι # P103 όχι # P1626 ναι # P1626 όχι # P7395 ναι # P2920 όχι # P1837 ναι # P5092 όχι # P7260 ναι # P2451 όχι # P1837 ναι # P2920 όχι # P7260 όχι # P103 όχι # P104 ναι # P1626 όχι # P1522 ναι # P103 όχι #81 PM PM013 όχι # P1626 όχι #82 PM PM013 όχι # P1615 όχι #83 PM PM013 όχι # P2446 όχι #84 BE BE064 όχι # P103 όχι #85 BE BE064 ναι # P103 ναι #86 RS RS038 όχι # P3916 ναι #87 RS RS038 ναι # P103 ναι #88 RS RS038 ναι # P3916 ναι #89 BG BG012 όχι # P326 ναι #90 BG BG012 ναι # P326 ναι #91 BG BG012 ναι # P2920 όχι #92 LF LF094 όχι # P2920 όχι #93 LF LF094 όχι # P2920 ναι #94 CE CE015 ναι 94

95 1.2. Επιβεβαίωση ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων RT-PCR και Sequencing RNA απομονώθηκε από τα βιώσιμα υβριδώματα στο στάδιο της καλλιέργειας κατά το οποίο ήταν δυνατή η συλλογή 5x10 6 κυττάρων. Η συγκεκριμένη χρονική στιγμή διέφερε πολύ μεταξύ των διαφόρων υβριδωμάτων (2-6 εβδομάδες μετά τη σύντηξη). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών με RT-PCR και sequencing σε όλα τα βιώσιμα υβριδώματα. Η ανάλυση επιβεβαίωσε ότι 79 από τα βιώσιμα ετεροϋβριδώματα έφεραν μετάγραφα της βαριάς και/ή ελαφριάς αλυσίδας πανομοιότυπα με τις λειτουργικές κλωνοτυπικές αναδιατάξεις του αντίστοιχου ασθενούς. Αναλυτικότερα, 27 υβριδώματα επιβεβαιώθηκαν για παραγωγή πλήρους αντισώματος (βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας), 50 για παραγωγή μόνο βαριάς αλυσίδας και 2 για παραγωγή μόνο ελαφριάς αλυσίδας. (Πίνακας 15) Χαρακτηριστικό παράδειγμα επιβεβαίωσης με ανάλυση RT-PCR και sequencing της ΧΛΛ προέλευσης των υβριδωμάτων απεικονίζεται στην εικόνα ELISA Δοκιμασίες ELISA με σκοπό τον έλεγχο της έκκρισης ανοσοσφαιρίνης από τα ετεροϋβριδώματα του ιδίου ισοτύπου με αυτόν του λευχαιμικού κλώνου του αντίστοιχου ασθενούς πραγματοποιήθηκαν πολλαπλές φορές. Σε πρώιμη φάση, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία ELISA στα υπερκείμενα των υβριδωμάτων στη φάση των πλακών καλλιέργειας 96 οπών. Στη συνέχεια, ο έλεγχος επαναλήφθηκε ανά τακτά χρονικά διαστήματα έτσι ώστε να επιβεβαιωθεί ότι τα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα εξακολουθούσαν να παράγουν και να εκκρίνουν τις ΧΛΛ-ανοσοσφαιρίνες και δεν είχαν εκφυλιστεί. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την έκκριση του αναμενόμενου ισοτύπου βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας σε όλα τα επιβεβαιωμενα με RT-PCR /sequencing υβριδώματα (Πίνακας 15) Σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε έκκριση χαμηλής ποσότητας ανοσοσφαιρίνης του αναμενόμενου ισοτύπου (με δοκιμασία ELISA) η οποία όμως δεν επιβεβαιώθηκε με RT- PCR και sequencing. Συγκεκριμένα, σε 14 περιπτώσεις ετεροϋβριδωμάτων που επιβεβαιώθηκαν με RT-PCR /sequencing για παραγωγή μόνο της βαριάς αλυσίδας, διαπιστώθηκε έκκριση χαμηλής ποσότητας και της ελαφριάς αλυσίδας. Τα θετικά αποτελέσματα της δοκιμασίας ELISA για τα συγκεκριμένα υβριδώματα περιορίστηκαν κατά κανόνα στα πρώιμα στάδια ανάπτυξης των ετεροϋβριδωμάτων, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι τα ετεροϋβριδώματα αυτά αρχικά παρήγαγαν πλήρη αντισώματα, στη 95

96 συνέχεια όμως εκφυλίστηκαν ταχύτατα. Ήδη στο στάδιο ανάπτυξης στο οποίο έγινε δυνατή η συλλογή κυττάρων για απομόνωση RNA και εφαρμογή της ανάλυσης RT-PCR είχαν εκφυλιστεί και δεν επιβεβαιώθηκε παραγωγή της ελαφριάς αλυσίδας. Πίνακας 15. Επιβεβαίωση των υβριδωμάτων με RT-PCR/ Sequencing και ELISA. Table 15. Hybridomas confirmation by RT-PCR/ Sequencing and ELISA Υβρίδωμα Ασθενής Σ.Υ./ Rt-PCR & Sequencing ELISA Γονίδιο IgH IgL IgH IgL Χαρακτηρισμός Υβριδώματος P3000 # H+L(κ) P3000 # H+L(κ) P2355 # H+L(κ) P2355 # Η P2355 # Η P3073 #1 + + Η RS-35 RS038 #1 + + Η RS-43 RS038 #1 + + Η RS-44 RS038 #1 + + Η RS-48 RS038 # H+L(κ) RS-51 RS038 #1 + + Η P326 # Η P326 #2 + + Η P326 # Η P6090 # H+L(λ) P6090 #2 + + Η P6090 # Η P907 #4 + + Η P907 #4 + + Η P907 # Η P907 #4 + + Η P907 #4 + + Η P3551 # Η P3551 #4 + + Η P3916 # Η P3916 # Η P3916 #4 + + Η P3916 #4 + + Η P2920 #4 + + Η P103 # Η P103 #4 + + Η P103 # Η P103 # Η P103 # Η P103 # Η P103 #4 + + Η P1626 #4 + + Η P1626 #4 + + Η P1626 #4 + + Η 96

97 Υβρίδωμα Ασθενής Σ.Υ./ Γονίδιο Rt-PCR & Sequencing IgH IgL IgH ELISA IgL Χαρακτηρισμός Υβριδώματος P2446 #8 + + L(κ) P2446 #8 + + L(κ) BG-18 BG012 #8 + + Η BG-19 BG012 #8 + Η ** P104 # Η * P104 # H+L(λ) ** P104 # Η P104 # H+L(λ) P104 # H+L(λ) P104 # H+L(λ) P104 # H+L(λ) P104 # H+L(λ) P104 # H+L(λ) P104 # H+L(λ) ITARF ITA # H+L(λ) CE-2 CE015 # H+L(λ) P1610 IGHV Η P1610 IGHV H+L(κ) P IGHV Η P IGHV H+L(λ) P7395 IGHV H+L(λ) P IGHV H+L(λ) P IGHV H+L(λ) P7395 IGHV3 + + Η P IGHV H+L(λ) P IGHV H+L(λ) P IGHV Η P IGHV H+L(λ) P IGHV Η P IGHV4 + + Η P IGHV Η P IGHV H+L(λ) P IGHV H+L(λ) P IGHV H+L(λ) P IGHV Η P IGHV4 + + Η P IGHV Η G146b*** G IGHV H+L(κ) *: Το ετεροϋβρίδωμα έφερε μια παραγωγική αναδιάταξη (εντος αναγνωστικού πλαισίου) και μια μη παραγωγική αναδιάταξη εκτός αναγνωστικού πλαισίου για την ελαφριά αλυσίδα. The heterohybridoma carried both a productive rearrangement (in-frame) and an unproductive, out-of-frame rearrangement for the light chain. **: Τα ετεροϋβριδώματα αυτά έφεραν μια αναδιάταξη μόνο, εκτός αναγνωστικού πλαισίου για την ελαφριά αλυσίδα. These heterohybridomas carried an out-of-frame rearrangement only for the light chain. ***: To ετεροϋβρίδωμα αυτό ήταν προσφορα του καθ. Dimitar Efremov. This heterohybridoma was kindly provided by Prof. Dimitar Efremov (Molecular Hematology Laboratory, Monterotondo Outstation, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, CNR Campus "Adriano Buzzati-Traverso",Rome, Italy). 97

98 Εικόνα 18. Επιβεβαίωση με sequencing. Ανάλυση της αλληλουχίας της βαριάς αλυσίδας του υβριδώματος ITARF με τη χρήση του εργαλείου IMGT/V-QUEST (A). Αντιπαραβολή των αλληλουχιών βαριάς (B) και ελαφριάς (Γ) αλυσίδας του υβριδώματος ITARF με την αντίστοιχη του ασθενούς με τη χρήση του εργαλείου CLUSTALW. Αλληλουχίες 100% ταυτόσημες. Figure 18. Sequencing confirmation. ITARF hybridoma s heavy chain sequence analysis using IMGT/V- QUEST tool (A). Alignement of heavy (Β) and light (Γ) chain of ITARF hybridoma with those of the corresponding patient using CLUSTALW tool. Sequences are 100% identical. 98

99 Western-blot Πρωτεϊνικά κυτταρικά εκχυλίσματα επιβεβαιωμένων υβριδωμάτων ελέγχθηκαν επιπλέον με ανάλυση Western blot. Bαριές αλυσίδες ισοτύπου γ ανιχνεύθηκαν με ανάλυση Western blot σε πρωτεϊνικά κυτταρικά εκχυλίσματα όλων των επιβεβαιωμένων υβριδωμάτων ισοτύπου IgG που αναλύθηκαν (5/5). Παρομοίως, αλυσίδες ισοτύπου μ ανιχνεύθηκαν σε 5/5 επιβεβαιωμένα υβριδώματα. Τέλος, ελαφριές αλυσίδες κ και λ ανιχνεύθηκαν σε όλα τα ετεροϋβριδωμάτα που ελέγχθηκαν (3/3 και 2/2, αντίστοιχα) (Eικόνα 19). Εικόνα 19. Ανάλυση Western Blot σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ετερουβριδωματων. Figure 19. Western Blot analysis in protein lysates from heterohybridomas «Επιβεβαιωμένα» ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα Συνολικά, ως «επιβεβαιωμένα» θεωρήθηκαν τα υβριδώματα στα οποία διαπιστώθηκε παραγωγή και έκκριση των αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών τόσο μέσω της ανάλυσης RT- PCR/sequencing όσο και μέσω της δοκιμασίας ELISA. Τα ετεροϋβριδώματα τα οποία παρήγαγαν πλήρες αντίσωμα (βαριά και ελαφριά αλυσίδα) χαρακτηρίστηκαν ως H+L υβριδώματα, ενώ όσα παρήγαγαν μόνο βαριά ή μόνο ελαφριά αλυσίδα χαρακτηρίστηκαν ως H-υβριδώματα και L-υβριδώματα, αντίστοιχα (Πίνακας 15). Συνολικά, επιβεβαιώθηκαν 27 H+L υβριδώματα από τα οποία 21 παρήγαγαν λ ελαφριά αλυσίδα και 6 κ ελαφριά αλυσίδα, 50 H-υβριδώματα και 2 L-υβριδώματα τα οποία 99

100 προήλθαν από 22 διαφορετικούς ασθενείς, 17 από τους οποίους ανήκουν στα εξής στερεότυπα υποσύνολα: υποσύνολο #1, #2, #4, #8, #10, #13 και #37 (Πίνακας 16). Πίνακας 16. Στερεότυπα υποσύνολα και γονίδια των ανοσοσφαιρινών των ασθενών από τους οποίους παράχθηκαν επιβεβαιωμένα υβριδώματα. Table 16. Stereotyped subsets and immunoglobulin genes from patients that confirmed hybridomas were produced. Ασθενείς ΣΥ Επιφανειακή Μ/Α* Βαριά αλυσίδα Ελαφριά αλυσίδα ανοσοσφαιρίνη P3000, P2355, #1 IgMD(κ) Α IGHV1/5/7 IGKV1-39(1D-39) P3073, RS038 P326, P6090 #2 IgMD(λ) Μ IGHV3-21 IGLV3-21 P907, P3551 P3916, P2920 P0103, P1626 #4 IgG(κ) Μ ΙGHV4-34 IGKV2-30 P2446, BG012 #8 IgG(κ) Α IGHV4-39 IGKV1-39(1D-39) P104 #10 IgMD(λ) Α IGHV4-39 IGLV1-51 IT #13 IgMD(κ) Μ IGHV4-59 IGKV3-20 CE015 #37 IgMD(λ) Μ IGHV4-b IGLV1-44 P IgMD(λ) Α IGHV4-61 IGLV2-8 P IgMD(λ) Α IGHV3-30 IGLV3-21 P IgMD(λ) Α IGHV1-2 IGLV2-11 G146 - IgMD(κ) A IGHV1-69 IGKV3-15 P IgMD(κ) A IGHV1-18 IGKV1-39(1D-39) *Μ/Α: Μεταλλαγμένα (ταυτότητα <98% με τη βλαστική σειρά ή αμετάλλακτα (ταυτότητα 98% με την βλαστική σειρά) γονίδια IGHV. *Μ/Α: Mutated ( <98%identity to germline) or Unmutated ( 98% identity to germline) IGHV genes Συλλογή και επεξεργασία των μονοκλωνικών αντισωμάτων από τα υπερκείμενα της καλλιέργειας των ετεροϋβριδωμάτων Στην περίπτωση παραγωγής περισσότερων του ενός υβριδωμάτων από τον ίδιο ασθενή επιλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε περαιτέρω καλλιέργειες για τη συλλογή του ΧΛΛ μονοκλωνικού αντισώματος τα πιο «υποσχόμενα» υβριδώματα. Επιπλέον, στην περίπτωση παραγωγής από τον ίδιο ασθενή υβριδωμάτων που παράγουν ολόκληρα αντισώματα και υβριδωμάτων που παράγουν μόνο τη μια αλυσίδα του αντισώματος επιλέχθηκαν για καλλιέργεια και οι δύο τύποι υβριδωμάτων έτσι ώστε να αξιολογηθούν διαφορές στην αναγνώριση των πιθανών αντιγονικών στόχων και ο ρόλος των δυο αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών. Υπερκείμενα πλούσια σε μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν φορές με τη χρήση φιλτρων Vivapore 10/20 έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση της ανοσοσφαιρίνης να είναι τουλάχιστον 10 μg/ml (Πίνακας 17). 100

101 Πίνακας 17. Συγκέντρωση μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης στα συμπυκνωμένα υπερκείμενα καλλιεργειών των ετεροϋβριδωμάτων. Table 17. Concentration of monoclonal immunoglobulin in concentrated supernatants of heterohybridoma cultures. Υβρίδωμα μg/ml* Υβρίδωμα μg/ml* Υβρίδωμα μg/ml* ITARF , RS G146b CE ** κ: 8μg/ml *: Συγκέντρωση της βαριάς αλυσίδας σε μg/ml. Concentration of heavy chain in μg/ml **: Το υβρίδωμα εξέφραζε μόνο ελαφριά αλυσίδα, οπότε υπολογίστηκε μόνο η συγκέντρωση της κ ελαφριάς αλυσίδας. Hybridoma expressed only light chain, so concentration of κ light chain was calculated. 2. Παραγωγή ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων με τη μέθοδο του ανασυνδυασμένου DNA Πραγματοποιήθηκε παραγωγή 20 ΧΛΛ πλασμιδίων και ακολούθως έκφραση των ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων ως μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες του ανθρώπου ισοτύπου IgG Επιβεβαίωση της παραγωγής ΧΛΛ πλασμιδίων Η επιβεβαίωση της ενσωμάτωσης των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στους πλασμιδιακούς φορείς πραγματοποιήθηκε με PCR και με ανάλυση sequencing. Προϊόντα PCR με το αναμενόμενο μέγεθος (650 bp για την βαριά αλυσίδα Igγ1, 700 bp για την ελαφριά αλυσίδα Igκ and 590 bp για την ελαφριά αλυσίδα Igλ) ενισχύθηκαν από τις βακτηριακές καλλιέργειες μικρής κλίμακας, ενώ η τελική επιβεβαίωση πραγματοποιήθηκε με sequencing των πλασμιδίων (Εικόνα 20). 101

102 Εικόνα 20. Επιβεβαίωση της ενσωμάτωσης των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στους πλασμιδιακούς φορείς με sequencing. Ανάλυση με τη χρήση του εργαλείου IMGT/V-QUEST του ΧΛΛ πλασμιδίου που φέρει τις αναδιατάξεις των γονιδίων της βαριάς (Α) και της ελαφριάς αλυσίδας (Β) των ανσοσοσφαιρινών του ασθενούς P3870. Figure 20. Sequencing confirmation of the immunoglobulin genes insertion to the plasmid vectors. Analysis using IMGT/V-QUEST tool of the CLL plasmid carrying heavy (A) and light chain (B) rearrangements of patient P3870 immunoglobulin genes Έλεγχος της έκφρασης ανασυνδυασμένων ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Η ποιότητα των καθαρισμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακριλαμίδης και χρώση με Coomassie Brilliant Blue (Εικόνα 21). Τα μονοκλωνικά αντισώματα ποσοτικοποιήθηκαν και τα φράγματα με συγκεντρώσεις άνω των 20μg/ml επιλέχθηκαν για ανάλυση της αντιγονικής ειδικότητας. 102

103 Εικόνα 21. Χαρακτηριστικό παράδειγμα ηλεκτροφόρησης έξι καθαρισμένων ανασυνδυασμένων αντισωμάτων σε πηκτή SDS-PAGE σε μη αποδιατακτικές (αριστερά) και σε αποδιατακτικές συνθήκες (δεξια) και χρώση με Coomassie Brilliant Blue. +: Ανθρώπινη φυσιολογική IgG (Bethyl Laboratories), ΠΜ: πρωτεϊνικός μάρτυρας γνωστού μοριακού μεγέθους (Biorad). Figure 21. Representative example of SDS-PAGE electrophoresis and Coomassie Brilliant Blue staining of six purified recombinant antibodies under non-reducing (left) and reducing conditions (right). +:Normal human IgG (Bethyl Laboratories), ΠΜ: protein marker of known molecular weight (Biorad). 3. Έλεγχος αντιγονικής ειδικότητας των αντισωμάτων που προήλθαν από τα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα Τα αντισώματα που προήλθαν από τα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα ελέγχθηκαν αναφορικά με την ειδικότητά τους χρησιμοποιώντας ένα panel αντιγόνων, το οποίο περιλάμβανε αυτοαντιγόνα, τόσο κυτταροπλασματικά όσο και πυρηνικά, ιϊκά και βακτηριακά αντιγόνα (Πίνακας 9). Οι δοκιμασίες αυτές έγιναν με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμων συσκευασιών ELISA. Όλα τα νοσοειδικά αντισώματα υποβλήθηκαν σε διπλή ανάλυση, σε συγκέντρωση 10 μg/ml. Συνολικά ελέγχθηκε το προφίλ της αντιγονικής αναγνώρισης 21 μονοκλωνικών αντισωμάτων ισοτύπου G που προήλθαν από 5 ασθενείς του υποσυνόλου #4 και έναν ασθενή του υποσυνόλου #8 (Πίνακας 18) και 33 μονοκλωνικά αντισώματα ισοτύπου ΜD που προήλθαν από 3 ασθενείς του υποσυνόλου #1, 2 ασθενείς του υποσυνόλου #2, 1 ασθενή του υποσυνόλου #10, και 3 ασθενείς που δεν άνηκαν σε κάποιο στερεότυπο υποσύνολο (Πίνακας 19). Επτά μονοκλωνικά αντισώματα ισοτύπου IgG παρουσίασαν επιβεβαιωμένη αντιδραστικότητα εναντίον αυτοαντιγόνων και 4 εναντίον του παρασίτου Leishmania infantum (Πίνακας 18, Εικόνα 22). Τα IgG μονοκλωνικά αντισώματα dsdna ssdna Histone-C (Συνολική) Histone-H1 SS-A/Ro SS-B/La Jo-1 Sm U1-RNP Ρευματοειδής παράγοντας β2-γλυκοπρωτεΐνη I PR3 (c-anca) MPO (p-anca) CMV Epstein-Barr Virus EA Epstein-Barr Virus Epstein-Barr Virus EBNA-1 Herpes simplex Virus 1/2 Leishmania infantum Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma pneumoniae Τα IgM μονοκλωνικά αντισώματα dsdna ssdna Ρευματοειδής παράγοντας Καρδιολιπίνη Herpes simplex Virus 1/2 Mycoplasma pneumoniae β2-γλυκοπρωτεΐνη I 103

104 Αναλυτικότερα, από τα 20 μονοκλωνικά αντισώματα που προήλθαν από 5 ασθενείς του υποσυνόλου #4: Επτά από τα 20 μονοκλωνικά αντισώματα εμφάνισαν αντιδραστικότητα εναντίον ιστονών. Τα αντισώματα αυτά προήλθαν από το υβρίδωμα της ασθενούς Ρ907, από 4 υβριδώματα της ασθενούς Ρ103 (4814-1, , και ), από το υβρίδωμα του ασθενούς P3916 και από το υβρίδωμα του ασθενούς P1626. Το μονοκλωνικό αντίσωμα του υβριδώματος της ασθενούς Ρ907 εμφάνισε πολυαντιδραστικότητα, καθώς αντέδρασε και εναντίον της β 2 -γλυκοπρωτεΐνης και του πυρηνικου αντιγόνου SS-A. Τα μονοκλωνικά αντισώματα των υβριδωμάτων και της ασθενούς Ρ907 καθώς και τα αντισώματα των υβριδωμάτων και της ασθενούς Ρ103 αντέδρασαν με συστατικά του παρασίτου Leishmania infantum. Πίνακας 18. Αποτελέσματα της δοκιμασίας ELISA για την αναγνώριση (αυτό)αντιγόνων από τα μονοκλωνικά αντισώματα ισοτύπου IgG που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα. ΣΥ: Στερεότυπο Υποσύνολο Table 18. ELISA assay results for the recognition of (auto)antigens by IgG monoclonal antibodies derived from CLL heterohybridomas. ΣΥ:Stereotyped Subset Υβρίδωμα Ασθενής ΣΥ Τύπος Υβριδώματος SS-A-Ab Ιστόνη C (total) Η1 β2-γλυκοπρωτεΐνη Leishmania infantum P0907 #4 Η P0907 #4 Η P0907 #4 Η P0907 #4 Η P0103 #4 Η P0103 #4 Η P0103 #4 Η P0103 #4 Η P0103 #4 Η P0103 #4 Η P0103 #4 Η P0103 #4 Η P3916 #4 Η P3916 #4 Η P3916 #4 Η P3916 #4 Η P2920 #4 Η P1626 #4 Η P1626 #4 Η P1626 #4 Η P2446 #8 L - - * Κλίμακα: Λόγος της οπτικής απορρόφησης προς την οπτική απορρόφηση του αρνητικού μάρτυρα, Scale: signal-to-background ratio: = < 2, + = 2-5, + + = 5-10, = 10-15, = >

105 Όσον αφορά στα μονοκλωνικά αντισώματα ισοτύπου Μ, 23 παρουσίασαν επιβεβαιωμένη αντιδραστικότητα εναντίον αυτοαντιγόνων και 13 εναντίον συστατικών των ιών Herpes simplex Virus 1/2 ή/και Mycoplasma pneumonia (Πίνακας 19, Εικόνα 22): Και τα 3 μονοκλωνικά αντισώματα του ασθενούς P2355 (υποσύνολο #1) παρουσίασαν αντιδραστικότητα εναντίον του μονόκλωνου DNA και της β 2 -γλυκοπρωτεΐνης. Τα αντισώματα του υποσυνόλου #2 δεν αναγνώρισαν κανένα από τα αντιγόνα του panel. Και τα 8 αντισώματα του ασθενούς P104 του υποσυνόλου #10 παρουσίασαν ισχυρή αντιδραστικότητα εναντίον της καρδιολιπίνης, μονόκλωνου DNA και εναντίον αντιγόνων των ιών HSV I/II. Τέσσερα από αυτά αναγνώρισαν επίσης δίκλωνο DNA. Χαρακτηριστικό ήταν το γεγονός ότι τα μη ακέραια αντισώματα, οι βαριές δηλαδή αλυσίδες μόνες τους, σχεδόν σε κάθε περίπτωση, αναγνώριζαν πιο ισχυρά τα εκάστοτε αντιγόνα. Χαμηλή δράση ρευματοειδούς παράγοντα καθώς και αναγνώριση του βακτηρίου Mycoplasma pneumonia παρουσιάστηκε μόνο σε εκείνες τις περιπτώσεις όπου το εκκρινόμενο αντίσωμα δεν ήταν ακέραιο (μόνο βαριά αλυσίδα) Το αντίσωμα του υβριδώματος ITARF του υποσυνόλου #13 έδειξε πολύ ισχυρή δράση ρευματοειδούς παράγοντα μόνο. Τα αντισώματα του ασθενούς P7395 αντέδρασαν εναντίον της καρδιολιπίνης (7/7), του μονόκλωνου DNA (2/8) και αντιγόνων των ιών HSV I/II (4/8). Το αντίσωμα του ασθενούς P1837 αντέδρασε εναντίον του μονόκλωνου DNA και αντιγόνων των ιών HSV I/II. Δύο από τα 4 αντισώματα του ασθενούς P1522 αντέδρασαν εναντίον της καρδιολιπίνης. 105

106 Πίνακας 19. Αποτελέσματα της δοκιμασίας ELISA για την αναγνώριση (αυτό)αντιγόνων από τα μονοκλωνικά αντισώματα ισοτύπου IgΜ που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα. ΣΥ: Στερεότυπο Υποσύνολο. Table 19. ELISA assay results for the recognition of (auto)antigens by IgΜ monoclonal antibodies derived from CLL heterohybridomas. ΣΥ:Stereotyped Subset Υβρίδωμα Ασθενής ΣΥ Τύπος Υβριδώματος Καρδιολιπίνη dsdna ssdna ΡΠ* β2 -γλυκοπρωτεΐνη HSV I/II Mycoplasma pneumoniae P3000 #1 H+L P3000 #1 H+L P2355 #1 H+L P2355 #1 H P2355 #1 H P0326 #2 H P0326 #2 H P6090 #2 H+L P6090 #2 H P0104 #10 H P0104 #10 H+L P0104 #10 H P0104 #10 H+L P0104 #10 H+L P0104 #10 H+L P0104 #10 H+L P0104 #10 H+L ITARF ITA409 #13 H+L P1610 IGHV1-18 H+L P7395 IGHV3-30 H P7395 IGHV3-30 H+L P7395 IGHV3-30 H+L P7395 IGHV3-30 H+L P7395 IGHV3-30 H+L P7395 IGHV3-30 H+L P7395 IGHV3-30 H P7395 IGHV3-30 H+L P1837 IGHV1-2 H P1522 IGHV4-61 H P1522 IGHV4-61 H+L P1522 IGHV4-61 H+L P1522 IGHV4-61 H+L *ΡΠ: Ρευματοειδής παράγοντας, Rheumatoid Factor ** Κλίμακα: Λόγος της οπτικής απορρόφησης προς την οπτική απορρόφηση του αρνητικού μάρτυρα, Scale: signal-to-background ratio: = < 2, + = 2-5, + + = 5-10, = 10-15, = >

107 Εικόνα 22. Αναγνώριση (αυτό)αντιγόνων από τα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα που προήλθαν από ετερουβριδώματα, ομαδοποιημένα σε στερεότυπα υποσύνολα. Για κάθε υποσύνολο παρουσιάζεται το ποσοστό των αντισωμάτων που αντέδρασαν εναντίον κάθε αντιγόνου επί του συνόλου των αντισωμάτων του υποσυνόλου που εξετάστηκαν. Figure 22. (Auto)antigen recognition by CLL monoclonal antibodies derived from heterohybridomas, grouped in stereotyped subsets. The results are plotted as the percentage of antibodies reacting against each antigen versus the total number of antibodies within each subset. 4. Υποσύνολο #13: Στερεότυποι IGHV4-59/IGKV3-20 υποδοχείς με δράση ρευματοειδούς παράγοντα Με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα ELISA έναντι κοινών (αυτό)αντιγόνων, εστιάσαμε την προσοχή μας σε ένα ιδιαίτερο υποσύνολο, το υποσύνολο #13. Το υβρίδωμα από ασθενή του συγκεκριμένου υποσυνόλου παρήγαγε αντίσωμα με ισχυρή δράση ρευματοειδούς παράγοντα το οποίο δεν αναγνώρισε κανένα άλλο (αυτο)αντιγόνο από το πάνελ των αντιγονικών ειδικοτήτων που ελέγχθηκαν στην παρούσα εργασία. Το υποσύνολο #13 περιγράφηκε πρώτη φορά το και περιλάμβανε 5 ΧΛΛ περιπτώσεις που έφεραν μεταλλαγμένες, στερεότυπες αναδιατάξεις IGHV4-59/IGHD2-15/IGHJ2 και παρουσίαζαν ομολογία με τις εξής αλληλουχίες: (1) GenBank/U85234, ρευματοειδής παράγοντας από υγιή δότη ανοσοποιημένο με μη συμβατά ερυθρά 200, (2) GenBank/AF301516, κλωνοτυπικός υποδοχέας από ασθενή με ΧΛΛ, με ιστορικό μικτής κρυοσφαιριναιμίας τύπου ΙΙ (ΜΚΤΙΙ) και θετικότητα για αντι-hcv αντισώματα

108 4.1 Εντοπισμός και συχνότητα του υποσυνόλου #13 στην ΧΛΛ Στην παρούσα διατριβή, μέσω ανοσογενετικών αναλύσεων, εντοπίστηκαν 12 ΧΛΛ περιπτώσεις που έφεραν μεταλλαγμένες, στερεότυπες αναδιατάξεις IGHV4-59/IGHD2-15/IGHJ2 (στερεότυπο υποσύνολο #13). Αναλυτικότερα, μεταξύ 5798 παραγωγικών IGHV-D-J αναδιατάξεων από ασθενείς με ΧΛΛ από συνεργαζόμενα Αιματολογικά κέντρα στην Ελλάδα, την Ιταλία, τη Γαλλία, το Ηνωμένο Βασίλειο, την Τσεχία, την Δανία και την Σουηδία το γονίδιο IGHV4-59 εντοπίστηκε σε 157 περιπτώσεις (2,71%), ενώ 12 από αυτές τις περιπτώσεις (7,6%) ή 0,2% (12/5798) του συνόλου των εξετασθέντων ΧΛΛ ασθενών έφεραν περιοχές VH CDR3 χαρακτηριστικές του υποσυνόλου #13 (Πίνακας 20). Όλοι οι ασθενείς του υποσυνόλου έφεραν μεταλλαγμένες βαριές αλυσίδες IgM/IgD ισοτύπου ενώ και οι 10 περιπτώσεις στις οποίες ελέγχθηκαν οι αναδιατάξεις της ελαφριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών βρέθηκαν να εκφράζουν τα γονίδια IGKV3-20/IGKJ Εντοπισμός του στερεότυπου Β κυτταρικού υποδοχέα του υποσυνόλου #13 και σε άλλες Β λεμφοϋπερπλασίες Σύγκριση των αλληλουχιών του υποσυνόλου #13 με αλληλουχίες διαθέσιμες στα συνεργαζόμενα ινστιτούτα Η σύγκριση των αλληλουχιών του υποσυνόλου #13 με ένα πάνελ IGHV4-59 αλληλουχιών από διάφορες, μη ΧΛΛ οντότητες από ασθενείς των συνεργαζόμενων ινστιτούτων, έδειξε υψηλή ομολογία με τις παρακάτω αλληλουχίες (Πίνακας 20): 1. Δυο ασθενείς με άτυπη ΧΛΛ (GR και UK ). Στον ένα από τους δύο ασθενείς όπου ήταν διαθέσιμες κλινικές πληροφορίες βρέθηκε οροθετικότητα για αντισώματα ενάντια στον ιό της ηπατίτιδας C (Hepatitis C Virus - HCV) 2. Δύο ασθενείς ( και DK ) με Σπληνικό Λέμφωμα της Οριακής Ζώνης (ΣΛΟΖ) και οροθετικότητα για αντι-hcv αντισώματα. 3. Μια περίπτωση (89Vb) μονοκλωνικής Β λεμφοκυττάρωσης (ΜΒΛ) και οροθετικότητα για αντισώματα εναντίον του HCV Σύγκριση των αλληλουχιών του υποσυνόλου #13 με αλληλουχίες από δημόσιες τράπεζες αλληλουχιών Η σύγκριση των αλληλουχιών με αλληλουχίες από δημόσιες τράπεζες αλληλουχιών είχε αποκαλύψει ομοιότητες με ένα ρευματοειδή παράγοντα από υγιή δότη (U85234) 200 και έναν κλωνοτυπικό υποδοχέα από ασθενή με ΧΛΛ, με ιστορικό μικτής κρυοσφαιριναιμίας 108

109 τύπου ΙΙ (ΜΚΤΙΙ) και θετικότητα για anti-hcv αντισώματα (AF301516) 132. Στην παρούσα εργασία, περαιτέρω συγκρίσεις με αλληλουχίες από δημόσιες τράπεζες δεδομένων έδειξαν ομοιότητα και με τις κλωνοτυπικές αλληλουχίες (AF και AF303914) δύο ασθενών με μυοεπιθηλιακή σιελαδενίτιδα που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο συνδρόμου Sjögren (Sjögren's syndrome-associated myoepithelial sialadenitis, SS-MESA) 203. Συνολικά, μετά από τις εκτεταμένες ανοσογενετικές αναλύσεις το υποσύνολο #13 περιλαμβάνει 16 περιπτώσεις Β λεμφοϋπερπλασιών. Οι 3 από τις 8 περιπτώσεις του υποσυνόλου για τις οποίες υπήρχαν διαθέσιμες πληροφορίες ήταν θετικοί για αντι-hcv αντισώματα στον ορό. Συγκεκριμένα, οροθετικοί για αντι-hcv αντισώματα βρέθηκαν 2 ασθενείς με ΣΛΟΖ καθώς και η περίπτωση της ΜΒΛ. Επιπλέον, θετικός για αντι-hcv αντισώματα στον ορό ήταν και ένας ασθενής με ΧΛΛ και ΒΚΥ τυπικό του υποσυνόλου #13 (AF301516) όπως έχει δημοσιευτεί από άλλη ερευνητική ομάδα 201. Πίνακας 20. Στερεότυποι IGHV4-59 ανασυνδυασμοί από ΧΛΛ και άλλες οντότητες με χαρακτηριστικά των αλληλουχιών του υποσυνόλου #13. Τα αμινοξικά κατάλοιπα στα σημεία ένωσης των γονιδίων V(D)J στην VH και στη VK CDR3 περιοχή επισημαίνονται με μπλε χρώμα Table 20. Stereotyped IGHV4-59 rearrangements from CLL and other entities with sequence features of subset #13. Highlighted in blue are junctional residues in both VH and VK CDR3s. Περίπτωση Οντότητα VH CDR3 VK CDR3 HCV στον ορό «Εσωτερικές» Αλληλουχίες CZ ΧΛΛ ARDRYCSGGSCFDWYFDL QQYGSSPRT ΑΡΝΗΤΙΚΟ CZ ΧΛΛ T ΑΡΝΗΤΙΚΟ CLL-188 ΧΛΛ ---Q-----T ΑΡΝΗΤΙΚΟ DK ΧΛΛ ---Q--K F ΑΡΝΗΤΙΚΟ FRA-P0127 ΧΛΛ ---A-----T V ----F---- FRA-P0886 ΧΛΛ V -H FRA-P0898 ΧΛΛ ---S F--- GR ΧΛΛ Y A---- ΑΡΝΗΤΙΚΟ GR ΧΛΛ T H------S IT ΧΛΛ T IT ΧΛΛ R---- UK ΧΛΛ ---G-----T GR Άτυπη ΧΛΛ F UK Άτυπη ΧΛΛ Vb ΜΒΛ ---A ΘΕΤΙΚΟ DK ΣΛΟΖ ---T ΘΕΤΙΚΟ ΣΛΟΖ ----F ΘΕΤΙΚΟ Αλληλουχίες από δημόσιες τράπεζες αλληλουχιών U85234 ΡΠ ---S AF ΧΛΛ/ΜΚΤΙΙ ----F ΘΕΤΙΚΟ AF SS-MESA AF SS-MESA

110 4.3. Χαρακτηριστικά των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών του υποσυνόλου #13 Η χαρακτηριστική κλωνοτυπική αναδιάταξη του υποσυνόλου #13 (ΧΛΛ και άλλες Β λεμφοϋπερπλασίες) δημιουργείται από το συνδυασμό των γονιδίων IGHV4-59, IGHD2-15 και IGHJ2. Η αμινοξική ταυτότητα της περιοχής VH CDR3 μεταξύ των 16 περιπτώσεων του υποσυνόλου ξεπερνούσε το 80% ενώ υπογραμμίζεται με στερεότυπα Ν νουκλεοτίδια, δημιουργώντας συντηρημένα αμινοξικά μοτίβα. Χαρακτηριστικά, ασπαρτικό οξύ (D) βρέθηκε και στις δυο συμβολές (V-D και D-J) σε όλες τις περιπτώσεις (Πίνακας 20). Η ανάλυση των ελαφριών αλυσίδων 12 περιπτώσεων του υποσυνόλου #13, (δέκα περιπτώσεις ΧΛΛ, μία περίπτωση άτυπης ΧΛΛ και μια περίπτωση ΣΛΟΖ) έδειξε ότι όλες έφεραν στερεότυπες αναδιατάξεις κωδικοποιημένες από το γονίδιο IGKV3-20 με υψηλό βαθμό αμινοξικής ταυτότητας μεταξύ των περιοχών VK CDR3. Αμινοξικό κατάλοιπο αργινίνης (R) βρέθηκε στη σύνδεση V-J σε όλες τις περιπτώσεις που εξετάσθηκαν (Πίνακας 20). Σύγκριση με δημόσιες τράπεζες αλληλουχιών αποκάλυψε 6 περιπτώσεις με πανομοιότυπη ή σχεδόν πανομοιότυπη περιοχή CDR3 για την κάππα ελαφριά αλυσίδα. Αναλυτικότερα, δείχθηκε υψηλή ομολογία με: 1. την ελαφριά αλυσίδα (AF303897)- ζευγάρι της βαριάς αλυσίδας AF από HCV+ ασθενή με ΧΛΛ την κλωνοτυπική κάππα ελαφριά αλυσίδα ασθενούς με ΣΛΟΖ, HCV+ (AF301528) την κάππα ελαφριά αλυσίδα αντισώματος ενάντια στη γλυκοπρωτεΐνη Ε2 του ιού HCV (AF301528) τους ανασυνδυασμούς της κάππα ελαφριάς αλυσίδας που φέρει ο κλωνικός πληθυσμός Β λεμφοκυττάρων στην σχετιζόμενη με τον HCV ΜΚΤΙΙ (EF624093, EF624200, EF624214) Ανάλυση της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης Όλες οι αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ και IGKV-IGKJ του υποσυνόλου #13, έφεραν σωματικές μεταλλάξεις με μέση τιμή ταυτότητας με τη βλαστική σειρά 93,8% (εύρος: 89,3-95,1) και 96,1% (εύρος: 93,8 97,8) για τα γονίδια της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας, αντιστοίχως. Η ανάλυση της κατανομής των σιωπηρών μεταλλάξεων (silent mutations, S) και των μεταλλάξεων αντικατάστασης (replacement mutations, R) αποκάλυψε πρότυπο χαρακτηριστικό κυττάρων που έχουν επιλεγεί από αντιγόνο. Συγκεκριμένα, ο λόγος R/S ήταν σημαντικά υψηλότερος στις περιοχές CDR της βαριάς αλυσίδας σε σχέση με τις 110

111 περιοχές FR και ελαφρά υψηλότερος για τις αντίστοιχες περιοχές της κάππα ελαφριάς αλυσίδας. (Πινακας 21) Η μεταβλητή περιοχή τόσο της βαριάς όσο και της ελαφριάς αλυσίδας έφεραν χαρακτηριστικές «στερεότυπες» σωματικές μεταλλάξεις, ισχυρή ένδειξη επιλογής από κοινό αντιγόνο ή δομικά όμοιους επιτόπους (Εικόνα 23). Πίνακας 21. Κατανομή μεταλλάξεων αντικατάστασης (R) και σιωπηρών μεταλλάξεων ( S) στη μεταβλητή περιοχή των αναδιατάξεων IGHV-IGHD-IGHJ και IGKV-IGKJ του στερεότυπου υποσυνόλου #13 (περιπτώσεις τυπικής και άτυπης ΧΛΛ) Table 21. Distribution of replacement (R) and silent (S) mutations throughout the VK domain for subset #4 and non-subset #4 IGKV-IGKJ rearrangements (typical and atypical CLL cases) Αριθμός μεταλλάξεων Ποσοστό Μεταλλάξεων% R R% S S% R/S Βαριές αλυσίδες: 15 αλληλουχίες HFR1 27 9, , ,23 1,25 HFR ,2 23 8,1 23 8,1 1,00 HFR , ,2 1,54 HCDR , ,32 4 1,41 8,75 HCDR , ,97 6 2,11 5,67 Σύνολο , ,32 1,68 Ελαφριές αλυσίδες: 12 αλληλουχίες KFR ,21 7 6,03 6 5,17 1,17 KFR ,79 7 6,03 9 7,76 0,78 KFR , ,17 9 7,76 3,89 KCDR , ,86 6 5,17 5 KCDR2 7 6,03 4 3,45 3 2,59 1,33 Σύνολο , ,45 2,52 111

112 A B Εικόνα 23. Λογότυπα της ευθυγράμμισης των αμινοξικών αλληλουχιών της μεταβλητής περιοχής της βαριάς (Α) και της ελαφριάς αλυσίδας (Β) 12 περιπτώσεων του υποσυνόλου #13. Σε αυτά τα λογότυπα, κάθε θέση στις περιοχές FR και CDR εμφανίζεται ως στοίβα όρθιων μονογραμματικών συμβόλων των αμινοξέων. Το μέγεθος κάθε συμβόλου αμινοξέος αντιστοιχεί στη συχνότητα του δεδομένου αμινοξέος στη συγκεκριμένη θέση. Τα αμινοξέα της βλαστικής σειράς παρουσιάζονται ανεστραμμένα: το ύψος του ανεστραμμένου συμβόλου του αμινοξέος της βλαστικής σειράς είναι το άθροισμα του ύψους των όρθιων αμινοξέων. Οι θέσεις με κατανομή ίδια με τη βλαστική σειρά μένουν κενές. Η αρίθμηση των θέσεων έγινε σύμφωνα με την αρίθμηση IMGT για τις μεταβλητές περιοχές V 206. Figure 23. Sequence logos for alignments of the variable Heavy (a) and kappa (b) amino acid sequences of 12 subset#13 cases. In these logos, each FR and CDR position is displayed as a stack of upright one-letter amino acid symbols. The height of each amino acid symbol is directly proportional to the relative frequency of that amino acid at a given position. The germline amino acids are shown upside down: the height of the inverted germline amino acid symbol is the sum of the heights of the upright amino acids. Positions with a distribution identical to germline are left blank. Positions are according to the IMGT unique numbering for V domains

113 4.4 Λειτουργικές δοκιμές του διαλυτού Β κυτταρικού υποδοχέα από έναν ασθενή του υποσυνόλου #13: Απόδειξη δράσης ρευματοειδούς παράγοντα Με βάση τις ενδείξεις από τις βιοπληροφορικές και ανοσογενετικές αναλύσεις και τις αρχικές αναλύσεις του προτύπου της αντιγονικής αναγνώρισης που έδειξαν αποκλειστική δράση ρευματοειδούς παράγοντα, ακολούθησε ο αναλυτικότερος χαρακτηρισμός της ειδικότητας του κλωνοτυπικού υποδοχέα του υποσυνόλου #13. Η δράση ρευματοειδούς παράγοντα του μονοκλωνικού αντισώματος του ασθενούς ΙΤ αποδείχθηκε με ανοσοανίχνευση τύπου ELISA σε δύο ακόμη ανεξάρτητα πειράματα: 1. H σταθερή περιοχή της IgG ανοσοσφαιρίνης (IgG-Fc) του ανθρώπου χρησιμοποιήθηκε ως αντιγόνο επικάλυψης και ως πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα IgM ισοτύπου (τεχνολογία υβριδωμάτων) σε συγκέντρωση των 10 μg/ml. Διαπιστώθηκε ξανά ισχυρή αναγνώριση του τμήματος IgG- Fc μόνο από το μονοκλωνικό αντίσωμα του ασθενούς ΙΤ Μάλιστα, το επίπεδο της οπτικής απορρόφησης ξεπέρασε αυτό του θετικού μάρτυρα (ορός από ασθενή με ρευματοειδή αρθρίτιδα σε αραίωση 1:200)(Εικόνα 24). Εικόνα 24. Δέσμευση των IgM μονοκλωνικών αντισωμάτων που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα στη σταθερή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης IgG (IgG-Fc). Θετικός μάρτυρας: ορός από ασθενή με ρευματοειδή αρθρίτιδα σε αραίωση 1:200. *: H-Υβριδώματα Figure 24. Binding of IgM monoclonal antibodies produced by CLL heterohybridomas, to IgG-Fc. Positive control (last column on the right): 1:200 diluted serum from patient with rheumatoid arthritis. *: H-Hybridomas 2. Σε δεύτερη δοκιμασία ELISA χρησιμοποιήθηκε ως πρωτογενές αντίσωμα μονοκλωνικό αντίσωμα του ασθενούς ΙΤ και 2 ακόμη ασθενών με ανασυνδυασμούς των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών διαφορετικούς από αυτούς του υποσυνόλου #13, σε 113

114 διάφορες συγκεντρώσεις (διαδοχικές αραιώσεις από 4 μg/ml ως 15,6 ng/ml). Βρέθηκε ότι μόνο το μονοκλωνικό αντίσωμα του ασθενούς IT παρουσίαζε ισχυρή δράση ρευματοειδούς παράγοντα. Η αντίδραση έφτανε σε plateau σε συγκέντρωση ΧΛΛ mab περίπου 1 μg/ml όπως συμβαίνει με τους «καλά χαρακτηρισμένους» ρευματοειδείς παράγοντες (Εικόνα 25Α). Στη συνέχεια, για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του ΧΛΛ μονοκλωνικού αντισώματος για τo αντιγόνο IgG-Fc, πραγματοποιήθηκε ELISA παρεμπόδισης κατά την οποία το ΧΛΛ μονοκλωνικό αντίσωμα σε συγκέντρωση 0,5 μg/ml -στην οποία ήταν μέγιστη η δράση ρευματοειδούς παράγοντα- επωάστηκε με καθαρή φυσιολογική ανθρώπινη IgG ανοσοσφαιρίνη σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις. Ακολούθησε δοκιμασία ELISA ακριβώς όπως και προηγουμένως. Διαπιστώθηκε ότι η αναγνώριση της σταθερής περιοχής της IgG ανοσοσφαιρίνης από το ΧΛΛ μονοκλωνικό αντίσωμα του υποσυνόλου #13 είναι ειδική καθώς η δέσμευση του mab του υποσυνόλου #13 στο αντιγόνο IgG-Fc μειωνόταν όσο αυξανόταν η ποσότητα της IgG με την οποία είχε προ-επωαστεί (Εικόνα 25Β). Εικόνα 25. (A) Δέσμευση του IgM μονοκλωνικού αντισώματος στην περιοχή IgG-Fc. Χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα του υβριδώματος του ασθενούς IT και 2 ακόμη ασθενών που δεν ανήκουν στο υποσύνολο #13 σε διαδοχικές αραιώσεις από 4μg/ml ως 15,6 ng/ml. (B) Παρεμπόδιση της δέσμευσης του IT IgM μονοκλωνικού αντισώματος στην περιοχή IgG-Fc από την ανοσοσφαιρίνη IgG. Αυξανόμενες ποσότητες (0,1 έως 5μg) φυσιολογικής ανθρώπινης IgG ανοσοσφαιρίνης χρησιμοποιήθηκαν ως πεπτίδιο παρεμπόδισης. Τα αποτελέσματα απεικονίστηκαν ως το ποσοστό δέσμευσης στο αντιγόνο-στόχο έναντι της συγκέντρωσης του ανταγωνιστή. Το ποσοστό της δέσμευσης στο αντιγόνο-στόχο υπολογίστηκε με βάση την οπτική απορρόφηση (OD), λαμβάνοντας την τιμή της οπτικής απορρόφησης χωρίς ανταγωνιστή ως 100% δέσμευση. Figure 25. (A) IgM binding to human IgG-Fc. Monoclonal Abs from IT hybridoma and 2 other non subset #13 hybridomas were used in serial dilutions from 4μg/ml to 15,6 ng/ml. (B) IgG inhibition of IT IgM binding to human IgG Fc. Increasing amounts of human IgG (0.1-5 μg) were used as inhibitors. The results were plotted as the percent bound versus the concentration of the competitor. The percent bound was calculated by using the optical density (OD), taking the OD without a competitor as 100% bound. 114

115 Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ELISA του αντισώματος από το υβρίδωμα ITARF εναντίον αντιπυρηνικών αντιγόνων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε η πλάκα πολυστυρενίου επικαλυμένη με πυρηνικά αντιγόνα από το kit ANA Screen 8-Ab ELISA της εταιρίας IBL hamburg (Πίνακας 9 μεθοδολογίας). Τα αντιγόνα στην πλάκα περιλάμβαναν τα πυρηνικά αντιγόνα dsdna, RNP, Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, CENP-B και Jo-1. Ως πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε το αντίσωμα ITARF και άλλα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα IgM ισοτύπου σε συγκέντρωση 10 μg/ml. Κάποια αντισώματα αναγνώρισαν αυτά τα ενδοκυττάρια αντιγόνα, όχι όμως και το αντίσωμα του υποσυνόλου #13 (Εικόνα 26). Εικόνα 26. Δέσμευση των IgM μονοκλωνικών αντισωμάτων που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα σε πυρηνικά αντιγόνα. Ο θετικός και αρνητικός μάρτυρας παρέχεται από το kit. *: H-Υβριδώματα Figure 26. Binding of IgM monoclonal antibodies produced by CLL heterohybridomas, to nuclear antigens. Positive and negative control (last two columns on the right) provided by the kit. *: H-Hybridomas Τέλος, με αφορμή τις έμμεσες ενδείξεις για συσχέτιση του υποσυνόλου #13 με τον ιό της ηπατίτιδας C, ελέγχθηκε και η αναγνώριση συστατικών του με δοκιμασίες ELISA. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα με τη χρήση εμπορικών συσκευασιών για την ανίχνευση αντισωμάτων εναντίον των αντιγόνων HCr43, c200, c100-3 και NS5 του ιού που απέδωσαν αρνητικό αποτέλεσμα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ELISA με τη χρήση ως αντιγόνων επικάλυψης των εξής πρωτεϊνών του ιού: πρωτεΐνη του νουκλεοκαψιδίου (HCV 115

116 nucleocapsid protein), πυρηνική πρωτεΐνη 24 (HCV core 24 protein) και τις πρωτεΐνες NS3, NS4 και NS5 (HCV NS3+NS4+NS5 proteins). Τα αποτελέσματα ήταν αρνητικά, καθώς το μονοκλωνικό αντίσωμα του υποσυνόλου #13 δεν αναγνώρισε κανένα ιϊκό συστατικό σε αντίθεση με μονοκλωνικά αντισώματα άλλων ασθενών, με διαφορετικούς ανασυνδυασμούς των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών (Εικόνα 27). Εικόνα 27. Δέσμευση των IgM μονοκλωνικών αντισωμάτων που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα, σε αντιγόνα του ιού HCV. *: H-Υβριδώματα Figure 27. Binding of IgM monoclonal antibodies produced by CLL heterohybridomas, to HCV antigens. *: H-Hybridomas 5. Έλεγχος αντιγονικής ειδικότητας των ανασυνδυασμένων αντισωμάτων Σύγκριση αντισωμάτων που προήλθαν από τις δυο τεχνικές Μετά την ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων που παράχθηκαν με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της αντιγονικής ειδικότητας των κλωνοτυπικών ανοσοσφαιρινών αναφορικά με την αναγνώριση κατηγοριών ουσιών που έχουν αναφερθεί ως συχνοί αντιγονικοί στόχοι των ΧΛΛ αντισωμάτων. Στις δοκιμασίες ELISA χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενή αντισώματα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία παράχθηκαν τόσο με τη μέθοδο του ανασυνδυασμένου DNA όσο και με την τεχνική των υβριδωμάτων. Κατ αυτόν τον τρόπο ήταν εφικτή η σύγκριση των δυο τεχνικών παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων. Όλα τα αντισώματα υποβλήθηκαν σε διπλή εξέταση σε διαδοχικές αραιώσεις 1:2 για όλα τα αντιγόνα (20 μg/ml έως 1,25 μg/ml για τα ανασυνδυασμένα αντισώματα και τα IgM μονοκλωνικα αντισώματα των ετεροϋβριδωμάτων και 10 μg/ml έως 1,25 μg/ml για τα IgG μονοκλωνικα αντισώματα των ετεροϋβριδωμάτων). 116

117 Εικόνα 28. Αναγνώριση δίκλωνου DNA από τα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα. IgM (Α) και IgG (B) μονοκλωνικά αντισώματα (20μg/ml και 10μg/ml, αντιστοίχως) που προήλθαν από επιβεβαιωμένα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα. Με αστερίσκο επισημαίνονται τα ετροϋβριδώματα που παρήγαγαν μόνο βαριά αλυσίδα. (Γ) Ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα (20μg/ml). Θετικός μάρτυρας από ασθενή με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο σε αραίωση 1:200. #: Στερεότυπο υποσύνολο. Μ.Σ: Μη στερεότυπες περιπτώσεις. Figure 28. Recognition of dsdna by CLL monoclonal antibodies. IgM (A) and (IgG) (B) monoclonal antibodies (20μg/ml και 10μg/ml respectively) produced by CLL heterohybridomas. Heterohybridomas that produced only heavy chain are marked with an asterisk. (Γ) Recombinant monoclonal antibodies (20μg/ml). Positive control from a patient with systemic lupus erythematosus diluted 1:200. #: Stereotyped subset. Μ.Σ: Non stereotyped cases. 117

118 Εικόνα 29. Αναγνώριση βακτηριακων πολυσακχαριτών από τα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα. IgM (Α) και IgG (B) μονοκλωνικά αντισώματα (20μg/ml και 10μg/ml, αντιστοίχως) που προήλθαν από επιβεβαιωμένα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα. Με αστερίσκο επισημαίνονται τα ετροϋβριδώματα που παρήγαγαν μόνο βαριά αλυσίδα. (Γ) Ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα (20μg/ml). #: Στερεότυπο υποσύνολο. Μ.Σ: Μη στερεότυπες περιπτώσεις. Figure 29. Recognition of bacterial lipopolysaccharides by CLL monoclonal antibodies. IgM (A) and (IgG) (B) monoclonal antibodies (20μg/ml και 10μg/ml respectively) produced by CLL heterohybridomas. Heterohybridomas that produced only heavy chain are marked with an asterisk. (Γ) Recombinant monoclonal antibodies (20μg/ml). #: Stereotyped subset. Μ.Σ: Non stereotyped cases. 118

119 Εικόνα 30. Αναγνώριση δεικτών οξείδωσης από τα μονοκλωνικά αντισώματα που προήλθαν από επιβεβαιωμένα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα. Με αστερίσκο επισημαίνονται τα ετροϋβριδώματα που παρήγαγαν μόνο βαριά αλυσίδα. (A) IgM αντισώματα σε συγκέντρωση 20μg/ml. (Β) IgG αντισώματα σε συγκέντρωση 10μg/ml. #: Στερεότυπο υποσύνολο. Μ.Σ: Μη στερεότυπες περιπτώσεις. Figure 30. Recognition of oxidation markers by monoclonal antibodies produced by CLL heterohybridomas. Heterohybridomas that produced only heavy chain are marked with an asterisk. (A) IgM antibodies at a concentration of 20μg/ml. (B) IgG antibodies at a concentration of 10μg/ml. #: Stereotyped subset. Μ.Σ: Non stereotyped cases. 119

120 Εικόνα 31. Αναγνώριση δεικτών οξείδωσης από τα ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα (20μg/ml). #: Στερεότυπο υποσύνολο. Μ.Σ: Μη στερεότυπες περιπτώσεις. (A) Αντισώματα των υποσυνόλων #1 και #2. (Β) Αντισώματα των υποσυνόλων #4, #6, #8, #10, #59 και μη στερεότυπες περιπτώσεις. Figure 31. Recognition of oxidation markers by recombinant monoclonal antibodies (20μg/ml). #: Stereotyped subset. Μ.Σ: Non stereotyped cases. (A) Antibodies from subsets #1 and #2. (B) Antibodies from subsets #4, #6, #8, #10, #59 and non stereotyped cases. 120

121 Πίνακας 22. Αποτελέσματα της δοκιμασίας ELISA για την αναγνώριση κοινών αντιγονικών στόχων των ΧΛΛ αντισωμάτων. Αντιπαραβάλλονται τα αποτελέσματα δέσμευσης των μονοκλωνικών αντισωμάτων που προήλθαν από την τεχνολογία των υβριδωμάτων και του ανασυνδυασμένου DNA. Table 22. ELISA assay results for the recognition of common antigenic targets for CLL antibodies. Binding of monoclonal antibodies derived by hybridomas and recombinant DNA technology is compared Αντίσωμα Ασθενής ΥΒΡ/ Α.Α* dsdna LPS MDA-BSA HNE-BSA AOPP-HSA Στερεότυπο υποσύνολο # P2355 ΥΒΡ/ H P3000 ΥΒΡ/H+L RS-48 RS038 ΥΒΡ/H+L RS038 RS038 Α.Α CLL270 CLL270 Α.Α P3870 P3870 Α.Α CLL340 CLL340 Α.Α CLL360 CLL360 Α.Α CLL154 CLL154 Α.Α P4699 P4699 Α.Α P3073 P3073 Α.Α GM056 GM056 Α.Α P5092 P5092 Α.Α P7937 P7937 Α.Α Στερεότυπο υποσύνολο # P6090 ΥΒΡ/H+L P6090 ΥΒΡ/H P326 P326 Α.Α CLL282 CLL282 Α.Α BV035 BV035 Α.Α P11475 P11475 Α.Α P1321 P1321 Α.Α N4755 N4755 Α.Α Στερεότυπο υποσύνολο # P907 ΥΒΡ/H P1626 ΥΒΡ/H P3916 ΥΒΡ/H P3916 ΥΒΡ/H P103 ΥΒΡ/H P103 ΥΒΡ/H P103 ΥΒΡ/H P103 P103 Α.Α CLL342 CLL342 Α.Α CLL183 CLL183 Α.Α Στερεότυπο υποσύνολο #6 KM1PL KM1PL Α.Α CLL 68 CLL 68 Α.Α

122 Αντίσωμα Ασθενής ΥΒΡ/ Α.Α* dsdna LPS MDA-BSA HNE-BSA AOPP-HSA Στερεότυπο υποσύνολο #8 CLL657 CLL657 Α.Α CLL114 CLL114 Α.Α P1615 P1615 Α.Α KAO121PL KAO121PL Α.Α CLL845 CLL845 Α.Α BGO12 BGO12 Α.Α P2446 P2446 Α.Α Στερεότυπο υποσύνολο # P104 ΥΒΡ/H P104 ΥΒΡ/H+L P104 ΥΒΡ/H+L P104 ΥΒΡ/H+L P5071 P5071 Α.Α Στερεότυπο υποσύνολο #13 ITARF IT ΥΒΡ/H+L Στερεότυπο υποσύνολο #37 CE-2 CE015 ΥΒΡ/H+L Στερεότυπο υποσύνολο #59 BE064 BE064 Α.Α Μη στερεότυπες αναδιατάξεις P7395 ΥΒΡ/H+L P7395 ΥΒΡ/H P7395 ΥΒΡ/H+L P1837 ΥΒΡ/H G146b G146 ΥΒΡ/H+L CLL376 CLL376 Α.Α CLL415 CLL415 Α.Α *ΥΒΡ ή Α.Α: Μονοκλωνικά αντισώματα που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα ή ανασυνδυασμένα σντισώματα, αντιστοίχως. Ο τύπος των ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων επισημαίνεται (H ή Η+L ). Monoclonal antibodies produced by CLL heterohybridomas or as recombinant antibodies respectively. The type of CLL heterohybridomas is indicated (H or H+L) **Κλίμακα: Λόγος της οπτικής απορρόφησης προς την οπτική απορρόφηση του αρνητικού μάρτυρα, Scale: signal-to-background ratio: = < 2, + = 2-5, + + = 5-10, = 10-15, = > Στερεότυπο υποσύνολο #1 Συνολικά, τα μονοκλωνικά αντισώματα του υποσυνόλου #1, τόσο αυτά που παράχθηκαν με τη μέθοδο των υβριδωμάτων όσο και τα ανασυνδυασμένα αντισώματα, αναγνώρισαν το δίκλωνο DNA- άλλα σε υψηλό και άλλα σε χαμηλότερο βαθμό (Εικόνα 28, Πίνακας 22). Επίσης, σχετικά ετερογενές ήταν το πρότυπο αναγνώρισης του δείκτη οξείδωσης MDA-BSA, με τα ανασυνδυασμένα αντισώματα να προσδένονται στο αντιγόνο σε μικρότερο βαθμό από τα αντισώματα των ετεροϋβριδωμάτων (Εικόνες 30Α και 31Α, Πίνακας 22). Παρατηρήθηκε επίσης χαμηλού βαθμού αναγνώριση των βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών (Εικόνα 29, Πίνακας 22). Μόνο ένα αντίσωμα προερχόμενο από ΧΛΛ 122

123 ετεροϋβρίδωμα αναγνώρισε επίσης το δείκτη οξείδωσης AOPP-HSA. Ανασυνδυασμένο αντίσωμα από τον ίδιο ασθενή δεν έδειξε την ίδια δράση (Εικόνες 30Α και 31Α, Πίνακας 22) Στερεότυπο υποσύνολο #2 Τα αντισώματα του υποσυνόλου #2 δεν παρουσίασαν αξιοσημείωτη δέσμευση στα αντιγόνα του πάνελ της παρούσας διατριβής. Παρατηρήθηκε ασθενής αναγνώριση του δίκλωνου DNA μόνο από τα ανασυνδυασμένα αντίσωματα των ασθενών Ρ326 και P1321 (Εικόνα 28Γ), ενώ το αντίσωμα του ασθενούς P11475 δεσμεύθηκε σε βακτηριακούς πολυσακχαρίτες (Εικόνα 29Γ). Τα αντισώματα του υποσυνόλου #2 που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα δεν παρουσιάσαν επίσης αντιδραστικότητα στα αντιγόνα που ελέγχθηκαν με εμπορικά διαθέσιμες συσκευασίες ELISA (Πίνακας 19) Στερεότυπο υποσύνολο #4 Τα αντισώματα του υποσυνόλου #4 παρουσίασαν ετερογενές προφίλ αντιγονικής αναγνώρισης. Αυτά που προήλθαν με τη μέθοδο των υβριδωμάτων έφεραν μόνο τη βαριά αλυσίδα και δεν αναγνώρισαν κανένα αντιγόνο (Εικόνες 28-30, Πινακας 22). Αντίθετα τα ανασυνδυασμένα αντισώματα -που ήταν πλήρη, έχοντας βαριά και ελαφριά αλυσίδααναγνώρισαν το δίκλωνο DNA, το δείκτη οξείδωσης MDA-BSΑ και βακτηριακούς λιποπολυσακχαρίτες. Τα παραπάνω αντιγόνα δεν αναγνωρίστηκαν στον ίδιο βαθμό και από τα τρία ανασυνδυασμένα αντισώματα του υποσυνόλου #4. Πιο συγκεκριμένα, πολύ ισχυρή αναγνώριση για το δίκλωνο DNA και το MDA-BSΑ παρουσίασαν τα αντισώματα CLL183 και P10, αντιστοίχως (Εικόνες 28Γ, 29Γ, 31Β, Πίνακας 22) 5.4. Στερεότυπο υποσύνολο #6 Ένα από τα 2 αντισώματα του υποσυνόλου #6 αναγνώρισε δίκλωνο DNA και βακτηριακούς λιποπολυσακχαρίτες, ενώ και τα δύο δέσμευσαν το δείκτη οξείδωσης MDA- BSΑ (Εικόνες 28Γ, 29Γ,31Β Πίνακας 22) 5.5. Στερεότυπα υποσύνολα #8 και #10 Τα αντισώματα του υποσυνόλου #8 και #10 που κωδικοποιούνται από το γονίδιο IGHV4-39 αναγνώρισαν όλους τους αντιγονικούς στόχους. Μάλιστα, για το υποσύνολο #10 υπήρχαν διαθέσιμα ανασυνδυασμένα αντισώματα και αντισώματα από κυτταρικές σειρές 123

124 ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων που εξέφραζαν είτε πλήρη αντισώματα είτε μόνο τη βαριά αλυσίδα. Σε όλες τις περιπτώσεις η αναγνώριση των αντιγόνων ήταν ισχυρή. Στις περιπτώσεις που ελέγχθηκε μόνο η βαριά αλυσίδα υπήρξε μια τάση η σύνδεση με τα αντιγόνα-στόχους να είναι ελαφρά ισχυρότερη (Εικόνες28-31, Πίνακας 22) 5.6. Στερεότυπο υποσύνολο #13 Το μοναδικό αντίσωμα του υποσυνόλου #13 για το οποίο βρέθηκε προηγουμένως ισχυρή και ειδική δράση ρευματοειδούς παράγοντα δεν αναγνώρισε κανένα από τους υπόλοιπους κοινούς για την ΧΛΛ αντιγονικούς στόχους, ισχυροποιώντας ακόμα περισσότερο τα αποτελέσματα που περιγράφηκαν στο κεφάλαιο 4 των αποτελεσμάτων (Εικόνες28-30, Πίνακας 22) Στερεότυπα υποσύνολα #37, #59 και ετερογενείς περιπτώσεις Το ανασυνδυασμένο αντίσωμα του υποσυνόλου #37 συνδέθηκε ασθενώς με το δίκλωνο DNA, βακτηριακούς λιποπολυσακχαρίτες και τους δείκτες οξείδωσης MDA-BSΑ και AOPP- HSA. Το ανασυνδυασμένο αντίσωμα του υποσυνόλου #59 αναγνώρισε ασθενώς το δίκλωνο DNA και τον δείκτη οξείδωσης MDA-BSΑ (Εικόνες 28Γ, 29Γ, 31Β, Πίνακας 22). Τέλος, κάποια από τα αντισώματα που δεν ανήκουν σε κανένα στερεότυπο υποσύνολο δεν αναγνώρισαν κανένα αντιγόνο, ενώ κάποια άλλα αντέδρασαν εναντίον του δίκλωνου DNA, MDA-BSΑ και βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών (Εικόνες 28-31, Πίνακας 22). 5.8 Στερεότυπο υποσύνολο #8 Το στερεότυπο υποσύνολο #8 παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς οι ασθενείς που ανήκουν σε αυτό παρουσιάζουν εξαιρετικά επιθετική νόσο και υψηλή πιθανότητα μετατροπής της ΧΛΛ σε επιθετικό λέμφωμα (σύνδρομο Richter) 142. Με σκοπό να διαλευκάνουμε τη βιολογική βάση για την επιθετική συμπεριφορά του υποσυνόλου #8, συγκρίναμε το πρότυπο αντιγονικής αναγνώρισης των μονοκλωνικών αντισωμάτων του υποσυνόλου #8 με το αντίστοιχο άλλων στερεότυπων υποσυνόλων είτε καλής πρόγνωσης (στερεότυπο υποσύνολο #4) είτε κακής πρόγνωσης (στερεότυπα υποσύνολα #1 και #2). Στην σύγκριση συμπεριλήφθηκαν 11 αντισώματα του υποσυνόλου #1, 6 αντισώματα του υποσυνόλου #2, 2 αντισώματα του υποσυνόλου #4 και 5 αντισώματα του υποσυνόλου #8. Τα ανασυνδυασμένα αντισώματα του υποσυνόλου #8 παρουσίασαν έντονη πολυαντιδραστικότητα καθώς αναγνώρισαν όλα τα αντιγόνα του πάνελ. Έντονη 124

125 αντιδραστικότητα παρατηρήθηκε έναντι του δίκλωνου DNA, των βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών, του BSA και του τροποποιημένου BSA με μηλονική διαλδεϋδη (MDA). Τα αντισώματα του υποσυνόλου #8 αναγνώρισαν και τους άλλους δείκτες οξείδωσης που στο πάνελ των αντιγόνων, αν και σε μικρότερο βαθμό. Η σύγκριση του προτύπου αντιγονικής αναγνώρισης των αντισωμάτων του υποσυνόλου #8 σε σχέση με τα άλλα τρία υποσύνολα (#1, #2 και #4) έδειξε έντονες (και στις περισσότερες περιπτώσεις στατιστικά σημαντικές) διαφορές (Εικόνα 32). Τα αντισώματα του υποσυνόλου #8 ήταν τα μοναδικά μεταξύ των τεσσάρων αυτών υποσυνόλων που αναγνώρισαν ισχυρά βακτηριακούς πολυσακχαρίτες (Εικόνα 20Γ). Καθώς το συγκεκριμένο αντιγόνο αποτελεί προσδέτη του υποδοχέα έμφυτης ανοσίας TLR4 προχωρήσαμε στον έλεγχο της αναγνώρισης και των υπολοίπων προσδετών των υποδοχέων TLR. Διαπιστώσαμε ότι αρκετά μονοκλωνικά αντισώματα των υποσυνόλων #1, #4 και όλα τα αντισώματα του υποσυνόλου #8 προσδέθηκαν στο μη μεθυλιωμένο DNA (CpG) (Εικόνα 33Α). Επιπλέον, όμως, μόνο τα μονοκλωνικά αντισώματα του υποσυνόλου #8 προσδέθηκαν στο MDP (Muramyldipeptide), που είναι το ελάχιστο βιοδραστικό μοτίβο πεπτιδογλυκάνης κοινό σε όλα τα βακτήρια 207 (Εικόνα 33Β), στο πολυμερές μονόκλωνου RNA (Εικόνα 33Γ), στον προσδέτη του TLR7 loxoribine, ανάλογο της γουανοσίνης (Εικόνα 33Δ) και σε μικρότερο βαθμό στα λιποπεπτίδια MALP2 (Εικόνα 33Ε) και PAM3CSK4 (Εικόνα 33ΣΤ) προσδέτες των ετεροδιμερών των υποδοχέων TLR1/2 και TLR2/6, αντίστοιχα. 125

126 Εικόνα 32. Σύγκριση του προτύπου αναγνώρισης των αντισωμάτων των υποσυνόλων #1, #2, #4 και #8. (A) Δίκλωνο DNA, (Β) Δείκτης οξείδωσης μηλονική διαλδεϋδη, (Γ) βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες και (Δ) πρωτεινικά προιόντα προχωρημένης οξείδωσης. Figure 32. Compasrison of antigen reactivity profile of subset #1, #2, #4 and #8 monoclonal antibodies. (A) Double-stranded DNA, (B) Oxidation marker malondialdehyde, (Γ) bacterial lipopolysaccharides and (Δ) Advanced Oxidation Protein Products 126

127 A Β Γ Δ Ε ΣΤ Εικόνα 33. Δοκιμασία ELISA για την αναγνώριση των προσδετών των υποδοχέων TLR από τα ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα. #: Στερεότυπο υποσύνολο. Figure 33. ELISA assays for the recognition TLR ligands by recombinant monoclonal antibodies. #:Stereotyped Subset 127

128 Πίνακας 23. Αποτελέσματα της δοκιμασίας ELISA για την αναγνώριση των προσδετών των υποδοχέων TLR από τα ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα. Table 23. ELISA assay results for the recognition TLR ligands by recombinant monoclonal antibodies. Αντίσωμα Σ.Υ. LPS PAM Poly(U) MDP Loxoribin CpG MALP CLL270 # P3870 # CLL340 # CLL360 # CLL154 # P4699 # P3073 # GM056 # RS038 # P5092 # P7937 # CLL282 # BV035 # P326 # P11475 # P1321 # N4755 # CLL342 # CLL183 # CLL657 # CLL114 # P1615 # KAO121PL # CLL845 # BGO12 # P2446 # ΣΥ: Στερεότυπο Υποσύνολο, Stereotyped Subset *Κλίμακα: Λόγος της οπτικής απορρόφησης προς την οπτική απορρόφηση του αρνητικού μάρτυρα, Scale: signal-to-background ratio: = < 2, + = 2-5, + + = 5-10, = 10-15, = >

129 Συζήτηση 129

130 1. Εφαρμογή της τεχνολογίας των υβριδωμάτων και του ανασυνδυασμένου DNA στη μελέτη του Β κυτταρικού υποδοχέα στη ΧΛΛ Η στερεοτυπία του Β κυτταρικού υποδοχέα (ΒΚΥ) αποτελεί μοναδικό χαρακτηριστικό της ΧΛΛ και η συχνότητά της φτάνει το 30%, εύρημα που αντικρούεται με την απειροελάχιστη πιθανότητα ύπαρξης δύο Β λεμφοκυττάρων με ίδια ανοσοσφαιρίνη. Η δομική στερεοτυπία των ΒΚΥ ενισχύει τη θεωρία της αντιγονικής διέγερσης στη ΧΛΛ αντικατοπτρίζοντας παράλληλα πιθανή ανάλογη στερεοτυπία ως προς τους αντιγονικούς επιτόπους που διεγείρουν τα Β λεμφοκύτταρα και επάγουν τον κλωνικό πολλαπλασιασμό τους 132,133,137,138. Σε αυτό το πλαίσιο, ήδη από τη δεκαετία του 1980, διάφορες ερευνητικές ομάδες έχουν επιχειρήσει να προσδιορίσουν την ακριβή φύση του(των) αντιγόνου(ων) που αναγνωρίζουν τα λευχαιμικά κύτταρα. Τεχνικές δυσκολίες στη μελέτη της ειδικότητας του ΧΛΛ ΒΚΥ, όπως η μειωμένη ικανότητα ανάπτυξης των λευχαιμικών κυττάρων in vitro και η περιορισμένη έκκριση της λευχαιμικής ανοσοσφαίρινης, αρχικά ξεπεράστηκαν είτε με τη χρήση μιτογόνων (π.χ. phorbol myristate acetate - PMA) για διέγερση του λευχαιμικού κλώνου και έκκριση της «λευχαιμικής» ανοσοσφαιρίνης, είτε με τη χρήση της τεχνολογίας των υβριδωμάτων ,175. Σε δύο πιο σύγχρονες μελέτες υιοθετήθηκαν διαφορετικές στρατηγικές προκειμένου να ξεπεραστούν οι δυσκολίες της μελέτης του ΧΛΛ ΒΚΥ. Η ερευνητική ομάδα του Chiorazzi χρησιμοποίησε την τεχνική του ανασυνδυασμένου DNA 166,167, ενώ η ομάδα του Rosen βασίστηκε στη δημιουργία κυτταρικών σειρών από μετασχηματισμό λευχαιμικών κυττάρων με τον ιό EBV 165. Η τεχνική του ανασυνδυασμένου DNA είναι αποτελεσματική ως προς την παραγωγή της επιθυμητής ανοσοσφαιρίνης. Μολαταύτα, τα ανασυνδυασμένα αντισώματα συχνά είναι μονομερή ενώ ενδέχεται να παρουσιάζουν διαφορές σε σχέση με τ αντίστοιχα φυσιολογικά ως προς τη συγγένεια (affinity) και την ισχύ σύνδεσης (avidity) με το αντιγόνο. Η στρατηγική της δημιουργίας κυτταρικών σειρών από μετασχηματισμό λευχαιμικών κυττάρων με τον ιό EBV εμφανίζει σημαντικά μειονεκτήματα, επειδή το κυτταρικό σύστημα διατηρεί ελάχιστα στοιχεία του λευχαιμικού κλώνου Τα μετασχηματισμένα με τον EBV Β λεμφοκύτταρα ενδέχεται να είναι ασταθή και συνήθως εκκρίνουν μικρές ποσότητες ανοσοσφαιρίνης

131 Στην παρούσα διατριβή, αρχικά εφαρμόστηκε η τεχνική των υβριδωμάτων για ευρείας κλίμακας παραγωγή διαλυτής ανοσοσφαιρίνης, ταυτόσημης με την επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη του λευχαιμικού κλώνου 190,198. Η συγκεκριμένη μεθοδολογία παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα επειδή η παραγόμενη ανοσοσφαιρίνη είναι φυσική και δεν προκύπτει από γενετικό ανασυνδυασμό ή μετασχηματισμό από ιό. Συνεπώς, ο έλεγχος της ειδικότητας της παραγόμενης ανοσοσφαιρίνης θεωρείται αξιόπιστος σε σχέση με το αντιγόνο που πιθανόν αναγνωρίζει ο λευχαιμικός κλώνος in vivo. Τα αποτελέσματα της διατριβής ενισχύουν την άποψη ότι η τεχνική των υβριδωμάτων είναι αποτελεσματική και αξιόπιστη στη μελέτη της αντιγονικής ειδικότητας των κλωνοτυπικών ΒΚΥ στη ΧΛΛ. Τα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα που προήλθαν από το ίδιο πείραμα σύντηξης παρήγαγαν μονοκλωνικά αντισώματα με ίδιο ή σχεδόν ίδιο προφίλ αντιγονικής αναγνώρισης. Το ίδιο παρατηρήθηκε και σε περιπτώσεις μονοκλωνικών αντισωμάτων που προήλθαν από συντήξεις διαφορετικών δειγμάτων του ίδιου ασθενούς. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι οι ασθενείς Ρ103 και Ρ104. Τέσσερα ετεροϋβριδώματα του ασθενούς P103 που προήλθαν από τρία πειράματα σύντηξης τριών διαφορετικών δειγμάτων του ίδιου ασθενούς ελέγχθηκαν για την αναγνώριση της ιστόνης Η1 και έδωσαν θετικό αποτέλεσμα. Ανάλογα, και τα οχτώ μονοκλωνικά αντισώματα του ασθενούς P104 παρουσίασαν το ίδιο πρότυπο δέσμευσης στα αντιγόνα-στόχους στις δοκιμασίες ELISA. Ωστόσο, εγγενείς δυσκολίες της τεχνολογίας των υβριδωμάτων σε ορισμένες περιπτώσεις κατέστησαν την παραγωγή των ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων προβληματική. Ένα εμπόδιο υπήρξε η «απροθυμία» των λευχαιμικών Β λεμφοκυττάρων να συντηχθούν, που οδήγησε σε σχετικά χαμηλή συχνότητα επιτυχημένων συντήξεων συγκριτικά με άλλες εφαρμογές των υβριδωμάτων 198,199. Πιθανό ρόλο παίζει η προέλευση των Β λεμφοκυττάρων που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή των ετεροϋβριδωμάτων (περιφερικό αίμα στην παρούσα διατριβή), καθώς έχει διαπιστωθεί ότι η δημιουργία ετεροϋβριδωμάτων που εκκρίνουν αντισώματα του ανθρώπου είναι αποτελεσματικότερη όταν συντήκονται λεμφοκύτταρα με προέλευση το σπλήνα ή τους λεμφαδένες και όχι τόσο το αίμα ή το μυελό των οστών 212. Η μεγαλύτερη ικανότητα σύντηξης των σπληνοκυττάρων έχει αποδειχθεί και στον ποντικό 213. Ένα ακόμη σημαντικό πρόβλημα ήταν ο ταχύς εκφυλισμός ορισμένων υβριδωμάτων λόγω αστάθειας του γενετικού υλικού, που οδήγησε σε απώλεια της έκφρασης των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών. Από τα 405 βιώσιμα για μεγάλο χρονικό διάστημα ετεροϋβριδώματα της παρούσας μελέτης, επιβεβαιωμένη έκκριση ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών έδειξαν μόνο τα 79. Παρατηρήθηκε επίσης συχνότατη απώλεια της 131

132 έκφρασης της ελαφριάς αλυσίδας και κατά προτίμηση της κ, καθώς 50/79 «επιβεβαιωμένα» υβριδώματα παρήγαγαν μόνο βαριά αλυσίδα και 21/27 «πλήρη» ετεροϋβριδώματα αφορούσαν στην παραγωγή αντισωμάτων που φέρουν λ ελαφριά αλυσίδα. Η σταδιακή απώλεια των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων στα ετεροϋβριδώματα αποτελεί εγγενή αδυναμία της μεθόδου κι έχει αναφερθεί στο παρελθόν από πολλές ερευνητικές ομάδες. Η απώλεια των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων δεν είναι τυχαία, καθώς κατά προτίμηση διατηρούνται τα ανθρώπινα χρωμοσώματα 5, 14 και 22 ενώ τα χρωμοσώματα 1 και 2 χάνονται συχνότερα Οι γενετικοί τόποι των γονιδίων της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών και της κ και λ ελαφριάς αλυσίδας εντοπίζονται στα χρωμοσώματα 14, 2 και 22, αντιστοίχως, 218 εξηγόντας τη σταθερότερη έκφραση της βαριάς αλυσίδας και της λ ελαφριάς αλυσίδας σε σχέση με την κ ελαφριά αλυσίδα στα κύτταρα των ετεροϋβριδωμάτων 214,215. Στην παρούσα εργασία παρατηρήθηκε εκλεκτική απώλεια της κ ελαφριάς αλυσίδας ημέρες μετά από τη σύντηξη. Στις περισσότερες περιπτώσεις τα ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα απέτυχαν να διατηρήσουν την παραγωγή της κ ελαφριάς αλυσίδας ακόμη και ύστερα από πολλούς κύκλους υποκλωνοποιήσεων. Αντίθετα, ορισμένα ετεροϋβριδώματα που παρήγαγαν λ ελαφριά αλυσίδα βρέθηκαν σταθερά ακόμη και δυο χρόνια μετά τη σύντηξη. Οι παρατηρήσεις αυτές συνάδουν απόλυτα με τις προηγούμενες μελέτες 163,215,219. Στα μειονεκτήματα της μεθόδου συγκαταλέγεται επίσης η εξαιρετικά χρονοβόρος διαδικασία παραγωγής. Στην παρούσα μελέτη, για την παραγωγή μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης των λευχαιμικών λεμφοκυττάρων της ΧΛΛ σε ικανοποιητική ποσότητα απαιτήθηκαν σε ορισμένες περιπτώσεις έως και 6 μήνες. Τέλος, η ίδια η φύση της τεχνικής δεν επιτρέπει τον παράλληλο χειρισμό πολλών διαφορετικών δειγμάτων. Παρά τις εγγενείς τεχνικές δυσχέρειες που προαναφέρθηκαν, η παρούσα μελέτη απέδωσε μεγάλο αριθμό βιώσιμων ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων που παρήγαγαν και εξέκριναν νοσοειδική ανοσοσφαιρίνη. Ο ταχύς εκφυλισμός των ετεροϋβριδωμάτων που οδηγούσε σε απώλεια του ανθρώπινου γενετικού υλικού ήταν ο κύριος λόγος για τον οποίο παράλληλα με την παραγωγή ΧΛΛ-ετεροϋβριδωμάτων επιστρατεύτηκε και η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA. Mε τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων 193,195,220 παράχθηκαν ανασυνδυασμένα ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα από 33 ασθενείς. Η παραγωγή ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι λιγότερο χρονοβόρα και επιτρέπει τη διαχείριση πολλών δειγμάτων συγχρόνως. Επιπλέον, η ίδια η φύση της 132

133 μεθόδου εξασφαλίζει την παραγωγή αντισωμάτων με βαριά και ελαφριά αλυσίδα στο 100% των περιπτώσεων. Όλα τα ανασυνδυασμένα αντισώματα προετοιμάστηκαν ως ανθρώπινες IgG1 ανοσοσφαιρίνες. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών με ΧΛΛ o λευχαιμικός κλώνος εκφράζει ανοσοσφαιρίνες IgM(D) ισοτύπου. Σε μικρό ποσοστό, μεταξύ άλλων ασθενείς που ανήκουν στα στερεότυπα υποσύνολα #4 και #8, εκφράζεται IgG ανοσοσφαιρίνη. Έτσι, παρά την αποτελεσματικότητα ως προς την παραγωγή της επιθυμητής ανοσοσφαιρίνης, τα ανασυνδυασμένα αντισώματα ενδέχεται να διαφέρουν σε σχέση με τα αντίστοιχα αντισώματα που εκφράζονται στην επιφάνεια του λευχαιμικού κλώνου ως προς την συγγένεια και την ισχύ σύνδεσης με το αντιγόνο Αντιπαραβολή των τεχνικών παραγωγής ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων Η χρησιμοποίηση της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA έδωσε τη δυνατότητα να συγκριθεί η αποτελεσματικότητας των δυο τεχνικών όσον αφορά στη μελέτη των ποιοτικών χαρακτηριστικών της ανοσοσφαιρίνης και την αναγνώριση των πιθανών αντιγόνωνστόχων. Στην παρούσα εργασία, παράχθηκε σημαντικός αριθμός ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων με έμφαση στις περιπτώσεις με μοριακή στερεοτυπία του Β κυτταρικού υποδοχέα. Ο in vitro έλεγχος της αντιγονικής ειδικότητας πολλών στερεότυπων υποδοχέων ανά υποσύνολο προσέφερε τη δυνατότητα να ελεγχθεί πειραματικά η σχέση της μοριακής στερεοτυπίας σε επίπεδο επιλεκτικής χρήσης γονιδίων και προτύπων σωματικών μεταλλάξεων με πιθανή στερεοτυπία στο επίπεδο της αναγνώρισης του αντιγόνου. Η σύγκριση της αποτελεσματικότητας των δυο τεχνολογιών ήταν εφικτή κυρίως στην περίπτωση των υποσυνόλων #1, #2 και #10 όπου υπήρχαν ανασυνδυασμένα αντισώματα και πλήρη μονοκλωνικά αντισώματα που προήλθαν από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα. Οι δοκιμασίες αντιγονικής αναγνώρισης απέδωσαν σχεδόν ή εντελώς όμοια αποτελέσματα και για τις δυο τεχνικές για τα αντισώματα του ίδιου υποσυνόλου. Στην περίπτωση του ασθενούς RS038 όπου ήταν άμεση η σύγκριση των τεχνολογιών, καθώς παράχθηκε ανασυνδυασμένο αντίσωμα και αντίσωμα από ΧΛΛ ετεροϋβρίδωμα, παρατηρήθηκαν μικρές διαφορές κυρίως ως προς την ισχύ σύνδεσης με το αντιγόνο που πιθανόν οφείλονται στο γεγονός ότι το ετεροϋβριδωμα εξέφραζε ανοσοσφαιρίνη Μ ισοτύπου, όπως και ο λευχαιμικός κλώνος ενώ το ανασυνδυασμένο αντίσωμα ήταν μονομερές IgG1. 133

134 2. Αντιγονική διέγερση 2.1. Γενικές παρατηρήσεις Πολυαντιδραστικότητα H πολυαντιδραστικότητα των ΧΛΛ ΒΚΥ και η αναγνώριση διαφόρων αυτοαντιγόνων είναι γνωστή ήδη από τις πρώτες μελέτες πάνω στο συγκεκριμένο αντικείμενο 161,162,163,175. Στην παρούσα μελέτη παρατηρήθηκε πολυαντιδραστικότητα των ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων που αφορούσε κυρίως τις αμετάλλακτες περιπτώσεις και συνάδει με άλλες ενδείξεις από τη βιβλιογραφία 164. Για παράδειγμα, τα αντισώματα των υποσυνόλων #1, #8 και #10 παρουσίασαν σαφή πολυαντιδραστικότητα, σε αντίθεση με το υποσύνολο # Στερεότυπη αντιγονική διέγερση Πρόσφατα, μελέτες κυρίως από τις ερευνητικές ομάδες των Chiorazzi και Rosen, έδειξαν ότι πολλά ΧΛΛ mabs αντιδρούν με μοριακές δομές αποπτωτικών κυττάρων (π.χ. τροποποιημένες πρωτεΐνες του κυτταρικού σκελετού και νέο-επίτοπους που δημιουργούνται σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες) και βακτηρίων 165,166,169, ενώ πρόσφατη δημοσίευση ανέδειξε το ρόλο μυκήτων στην ανάπτυξη της ΧΛΛ σε ένα μικρό υποσύνολο με στερεότυπους ΒΚΥ 176. Παρά τη σχετική πρόοδο, δεν υπάρχουν ακόμη αρκετά δεδομένα για το ιδιαίτερο προφίλ της αντιγονικής αναγνώρισης των διαφόρων διακριτών στερεότυπων υποσυνόλων, το οποίο πιθανόν συμβάλλει στην διαμόρφωση των ιδιαίτερων κλινικοβιολογικών χαρακτηριστικών τους ,132,139. Σε αυτό το πλαίσιο, στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε η πιθανή αντιγονική διέγερση των ΧΛΛ μονοκλωνικών αντισωμάτων από διάφορα κοινά αυτοαντιγόνα, ιικά και βακτηριακά αντιγόνα καθώς και η αναγνώριση νέο-αντιγόνων που παράγονται σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες. Έμφαση δόθηκε στη διευκρίνηση της ειδικότητας των στερεότυπων ΒΚΥ, κυρίως αυτών που ανήκουν στα «κύρια» υποσύνολα 137. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν και ενίσχυσαν την άποψη ότι η στερεοτυπία σε επίπεδο αλληλουχιών αντικατοπτρίζει και στερεοτυπία στο επίπεδο της αντιγονικής ειδικότητας. Το «στερεότυπο» προφίλ της αντιγονικής αναγνώρισης είναι ιδιαίτερα προφανές στις περιπτώσεις των υποσυνόλων #1, #2 και #8 όπου παράχθηκε μεγάλος αριθμός ακέραιων αντισωμάτων και με τις δυο τεχνολογίες που χρησιμοποιήθηκαν. 134

135 Ο ρόλος της ελαφριάς αλυσίδας Σε πολλές περιπτώσεις λόγω του εκφυλισμού των ΧΛΛ ετεροϋβριδωμάτων παράχθηκε μόνο η βαριά αλυσίδα της ανοσοσφαιρίνης. H έλλειψη της ελαφριάς αλυσίδας πιθανόν οδηγεί σε μη σωστό «δίπλωμα» της βαριάς αλυσίδας και σαφώς το παραγόμενο «ελλιπές» αντίσωμα δεν αντικατοπτρίζει αυτό που εκφράζεται στην επιφάνεια των λευχαιμικών κυττάρων του ασθενούς. Μολονότι ένα τέτοιο «ελλιπές» αντίσωμα, χωρίς ελαφριά αλυσίδα, δεν έχει φυσιολογικό ρόλο, η παράλληλη εξέταση των δυο παρασκευασμάτων (της βαριάς αλυσίδας μόνο και του ακέραιου αντισώματος) από τον ίδιο ασθενή ή από ασθενείς του ίδιου υποσυνόλου, ανέδειξε το σημαντικό ρόλο της ελαφριάς αλυσίδας όσον αφορά την αντιγονική ειδικότητα και την ισχύ σύνδεσης με τα διάφορα αντιγόνα-στόχους ενισχύοντας έτσι τις σημαντικές ενδείξεις που υπήρχαν και από ανοσογενετικές μελέτες 221. Χαρακτηριστικό παράδειγμα του ρόλου της ελαφριάς αλυσίδας προσφέρεται από τα αντισώματα του υποσυνόλου #4. Αυτά που προήλθαν με τη μέθοδο των υβριδωμάτων έφεραν μόνο βαριά αλυσίδα και δεν αναγνώρισαν κανένα αντιγόνο. Αντίθετα, τα ανασυνδυασμένα αντισώματα -που ήταν πλήρη, έχοντας βαριά και ελαφριά αλυσίδααναγνώρισαν δίκλωνο DNA, το δείκτη οξείδωσης MDA-BSΑ και βακτηριακούς λιποπολυσακχαρίτες Στερεότυπο υποσύνολο #1 και αντιγονική διέγερση Το στερεότυπο υποσύνολο #1 132,136,140 είναι το μεγαλύτερο «αμετάλλακτο» υποσύνολο αφού οι ασθενείς που συγκαταλέγονται σε αυτό αντιστοιχούν στο 2.4% του συνόλου των ασθενών 137. Χαρακτηρίζεται από αναδιατάξεις των γονιδίων της φυλογενετικής ομάδας Ι (γονίδια IGHV των υποομάδων IGHV1, IGHV5 και IGHV7) 222,223, σε συνδυασμό με τα γονίδια IGHD6-19 και IGHJ Οι ελαφριές αλυσίδες είναι τύπου κ και κωδικοποιούνται από τα γονίδια IGKV1-39/1D-39-IGKJ Οι περιοχές VH CDR3 των ΒΚΥ του στερεότυπου υποσυνόλου #1 φέρουν τη συντηρημένη αλληλουχία αμινοξέων QWL (Q= γλουταμίνη W= τρυπτοφάνη L= λευκίνη). Πολλές ανεξάρτητες έρευνες έδειξαν ότι οι περιπτώσεις του υποσυνόλου #1 πέρα από την ομολογία των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών έχουν κοινά γενετικά, λειτουργικά και κλινικοβιολογικά χαρακτηριστικά 132,133,140,224,225. Οι ασθενείς που κατατάσσονται στο υποσύνολο #1 έχουν δυσμενή πρόγνωση και επιθετική νόσο 132, εκφράζουν υψηλά επίπεδα των δεικτών CD38 και ZAP70 και φέρουν κυτταρογενετικές ανωμαλίες δυσμενούς προγνωστικής σημασίας, με πιο συχνή την del17 132,140,

136 Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τα μονοκλωνικά αντισώματα του υποσυνόλου #1 αναγνωρίζουν αποπτωτικά κύτταρα και μεταβολίτες της λιπιδικής υπεροξείδωσης 165,166,169. Άλλοι στόχοι του υποσυνόλου είναι η τροποποιημένη με κιτρουλίνη βιμεντίνη καθώς και η πρωτεΐνη καλρετικουλίνη 168. Οι πρωτεΐνες αυτές συνδέονται λειτουργικά με αποπτωτικές διαδικασίες και με μικροβιακές λοιμώξεις: η βιμεντίνη είναι πρωτεΐνη του κυτταρικού σκελετού και κατά την απόπτωση εκτίθεται στην κυτταρική επιφάνεια 227. Επιπλέον, η εξωκυττάρια βιμεντίνη που εκκρίνεται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα εμπλέκεται στην εξουδετέρωση των βακτηριακών παθογόνων και τη δημιουργία οξειδωτικών μεταβολιτών 228. Τόσο η βιμεντίνη όσο και η καλρετικουλίνη μπορεί να πυροδοτήσουν τη δημιουργία αυτοαντισωμάτων σε αυτοάνοσες διαταραχές 168,227. Στην παρούσα μελέτη παράχθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα του υποσυνόλου #1 από ΧΛΛ ετεροϋβριδώματα και μονοκλωνικά ανασυνδυασμένα αντισώματα και εξετάστηκε το προφίλ της αντιγονικής αναγνώρισης. Τα αντισώματα του υποσυνόλου παρουσίασαν πολυαντιδραστικότητα αναγνωρίζοντας β 2 -γλυκοπρωτεΐνη, μονόκλωνο και δίκλωνο DNA, μη μεθυλιωμένο CpG, το δείκτη οξείδωσης MDA-BSA και, σε μικρότερο βαθμό, βακτηριακούς λιποπολυσακχαρίτες. Τα αντισώματα εναντίον της β2-γλυκοπρωτεΐνης Ι ανήκουν στην κατηγορία των αντιφωσφωλιπιδικών αντισωμάτων (anti-phospholipid antibodies), τα οποία στοχεύουν κυρίως σύμπλοκα αποτελούμενα από αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια (π.χ. καρδιολιπίνη) και κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες, π.χ. β 2 -γλυκοπρωτεΐνη Ι, προθρομβίνη, πρωτεΐνη C ή πρωτεΐνη S 229. Αυτοαντισώματα εναντίον της β 2 -γλυκοπρωτεΐνης I συσχετίζονται με θρόμβωση, ανάπτυξη αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου (Αntiphospholipid syndrome, APS) και συστηματικού ερυθηματώδους λύκου (SLE) Η β 2 -γλυκοπρωτεϊνη Ι φαίνεται να εμπλέκεται σε μηχανισμούς απόπτωσης μεσολαβώντας στην αναγνώριση του αποπτωτικού κυττάρου από αντισώματα, γεγονός που συνάδει με τις ενδείξεις για ανάπτυξη αυτοανοσίας κατά την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα 233. Επίσης, έρευνες αναφέρουν επιλεκτική πρόσδεση ανθρώπινων μονοκλωνικών αντισωμάτων από ασθενείς με SLE στην β 2 - γλυκοπρωτεΐνη Ι του συμπλόκου β 2 -γλυκοπρωτεΐνης Ι/ φωσφολιπιδίων στην επιφάνεια αποπτωτικών κυττάρων 234. Η απόπτωση συνδέεται στενά με τις διαδικασίες οξείδωσης των πρωτεϊνών και των λιπιδίων, οπότε η αναγνώριση του μεταβολίτη της οξείδωσης των λιπαρών οξέων MDA από τα αντισώματα του υποσυνόλου #1 συνάδει με την υπόθεση της αναγνώρισης μορίων που σχετίζονται με την απόπτωση. 136

137 Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν DNA ανήκουν στην κατηγορία των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (antinuclear antibodies - ΑΝΑ) 235 και παρατηρούνται συχνά σε αυτοάνοσα νοσήματα, όπως ο SLE και η νεανική ρευματοειδής αρθρίτις 17,236. Το DNA απελευθερώνεται στον εξωκυττάριο χώρο από κύτταρα που αποπίπτουν 237. Μολαταύτα, δεν έχει διευκρινιστεί αν το DNA ή τα νουκλεοσώματα επάγουν απευθείας την παραγωγή αντι-dna αντισωμάτων ή αν αυτά τα αντισώματα παράγονται σε απάντηση σε κάποιο άλλο (αυτο)αντιγόνο. Είναι γνωστό ότι τα αντι-dna αντισώματα παρουσιάζουν διασταυρούμενες αντιδράσεις με βακτηριακά αντιγόνα ,240 και ότι οι βακτηριακοί πολυσακχαρίτες μπορεί να υποκινήσουν την παραγωγή αντι-dna αντισωμάτων 241. Επίσης έρευνες σε υγιή ποντίκια έδειξαν ότι αυτοαντισώματα εναντίον δίκλωνου DNA παρόμοια με αυτά των αυτοάνοσων καταστάσεων μπορούν να παραχθούν μετά από ανοσοποίηση των πειραματοζώων με μη μεθυλιωμένο DNA (CpG) 242. Συνολικά, και σε συμφωνία με προϋπάρχουσα βιβλιογραφία, τα αντισώματα του υποσυνόλου #1 παρουσιάζουν χαρακτηριστικά «φυσικών» αντισωμάτων που αναγνωρίζουν συστατικά κυττάρων που αποπίπτουν και μικροβιακά συστατικά. Ο σχετικά πολυαντιδραστικός χαρακτήρας των αντισωμάτων του υποσυνόλου ίσως σχετίζεται με την κλινική επιθετικότητα που χαρακτηρίζει το υποσύνολο # Στερεότυπο υποσύνολο #2 και αντιγονική διέγερση Το υποσύνολο #2 είναι το μεγαλύτερο υποσύνολo (2.8% του συνόλου των περιπτώσεων) 137 και χαρακτηρίζεται από αναδιατάξεις με οριακό status μεταλλάξεων και πολύ μικρή περιοχή VH CDR3 (9 αμινοξέα), η οποία κωδικοποιείται κατά κύριο λόγο από τα γονίδια IGHV3-21/IGHJ6. Εντυπωσιακό μοριακό χαρακτηριστικό της «στερεοτυπίας» του συγκεκριμένου υποσυνόλου είναι ότι όλες σχεδόν οι αναδιατάξεις διαθέτουν ένα ασπαρτικό οξύ (D) στο κέντρο της περιοχής VH CDR3 μεταξύ των αμινοξέων που κωδικοποιούνται από τα γονίδια IGHV και IGHJ 134,135, ,137. Το υποσύνολο #2 περιλαμβάνει ασθενείς με δυσμενείς προγνωστικούς παράγοντες (προχωρημένο κλινικό στάδιο κατά τη διάγνωση, θετικότητα για CD38), ταχεία εξέλιξη νόσου παρά την παρουσία σωματικών μεταλλάξεων στα γονίδια IGHV 132,140. Επιπλέον, ανάλυση του προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του υποσυνόλου # 2 έδειξε υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναμικό με αύξηση της έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου 245. Πιθανοί αντιγονικοί στόχοι του στερεότυπου υποδοχέα IGHV3-21/IGLV3-21 του υποσυνόλου #2 άρχισαν να προτείνονται πολύ πρόσφατα. Συγκεκριμένα, η ομάδα του Rosen έδειξε ότι ένα ανασυνδυασμένο αντίσωμα του υποσυνόλου αναγνώρισε γαστρικό 137

138 βλεννογόνο και κύτταρα του στομάχου, ενώ σε πειράματα με τη χρήση πρωτεϊνικών μικροσυστοιχιών αναγνώρισε 4 πρωτεΐνες ανάμεσα στις οποίες και η κοφιλίνη, πρωτεΐνη του κυτταρικού σκελετού που σχετίζεται με μικροβιακές λοιμώξεις από Gram αρνητικά βακτήρια 165. Στην παρούσα μελέτη τα αντισώματα του υποσυνόλου #2 δεν αναγνώρισαν κάποιον από τους «κλασικούς» αντιγονικούς στόχους για τη ΧΛΛ, σε συμφωνία και με προηγούμενες μελέτες στις οποίες δεν παρατηρήθηκε αντιδραστικότητα εναντίον οξειδωμένων λιποσωματίων LDL και αποπτωτικών κυττάρων 165,166. Πιθανή εξήγηση της μειωμένης αντιδραστικότητας των αντισωμάτων του υποσυνόλου #2 είναι το πολύ μικρό μήκος της περιοχής VΗ CDR3 (μόλις 9 αμινοξικά κατάλοιπα) που περιορίζει το εύρος των πιθανών διαμορφώσεων της θηλιάς αναγνώρισης του αντιγόνου και κατά συνέπεια το εύρος των αντιγόνων-στόχων Στερεότυπο υποσύνολο #4 και αντιγονική διέγερση Το στερεότυπο υποσύνολο #4 είναι το μεγαλύτερο υποσύνολο με μεταλλαγμένους στερεότυπους Β κυτταρικούς υποδοχείς ισοτύπου IgG που κωδικοποιούνται από τα γονίδια IGHV4-34/IGKV Οι ασθενείς που κατατάσσονται στο υποσύνολο #4 έχουν κοινά κλινικά χαρακτηριστικά όπως μικρή ηλικία κατά τη διάγνωση και ήπια κλινική πορεία 132. Το γονίδιο IGHV4-34 κωδικοποιεί ανοσοσφαιρίνες με εγγενή αυτοαντιδραστικότητα, οι οποίες αναγνωρίζουν τον ολιγοσακχαρίτη Ν-ακετυλο-λακτοζαμίνη (N-acetyllactosamine, NAL), που εκφράζεται στην ομάδα των αντιγόνων αίματος I/i. Anti-I/i IGHV4-34 αντισώματα προσδένονται ισχυρά στις ευθύγραμμες πολυ-nal ομάδες γλυκοζυλίωσης της ισομορφής του CD45 που εκφράζεται κυρίως από τα άωρα Β λεμφοκύτταρα (B220) 246. Η αναγνώριση αυτή μεσολαβείται όχι από τις κλασικές θέσεις πρόσδεσης του αντιγόνου αλλά από ένα μοτίβο στην περιοχή VH FR1 των ανοσοσφαιρινών IGHV4-34. Οι ανοσοσφαιρίνες IGHV4-34, ιδίως του ισοτύπου IgG, είναι σπάνιες στον ορό των φυσιολογικών ανθρώπων, μολονότι το γονίδιο IGHV4-34 είναι πολύ συχνό στο ρεπερτόριο των περιφερικών Β κυττάρων. Αντίθετα, αφθονούν στον ορό ασθενών με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, όπου αντιπροσωπεύουν πάνω από το 10% των αντισωμάτων IgG και, μάλιστα, αποτελούν δείκτη ενεργότητας της νόσου 180. Συνεπώς, το «πεπρωμένο» των περισσότερων φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων που εκφράζουν ανοσοσφαιρίνες IGHV4-34 είναι να γίνουν ανεργικά, ώστε να περιοριστεί το ενδεχόμενο κλινικών εκδηλώσεων αυτοανοσίας

139 Οι αναδιατάξεις του υποσυνόλου #4 χαρακτηρίζονται από «νοσο-ειδικά» πρότυπα σωματικών μεταλλάξεων 133,247,248. Η εντυπωσιακή στερεοτυπία υπαινίσσεται αναγνώριση κοινού επιτόπου. Αν και τα μοριακά χαρακτηριστικά της περιοχής VH CDR3 του υποσυνόλου (μεγάλο μήκος, θετικό φορτίο, άφθονα αρωματικά και θετικά φορτισμένα αμινοξέα) είναι ενδεικτικά αναγνώρισης νουκλεοπρωτεϊνικών δομών 249,250, μόνο σε μια περίπτωση του υποσυνόλου #4 βρέθηκε ισχυρή πρόσδεση στο δίκλωνο DNA, ενώ η βαριά αλυσίδα («ελλιπή» αντισώματα που παράχθηκαν με τη μέθοδο των υβριδωματων) έδειξε χαμηλού βαθμού δέσμευση κυρίως στην ιστόνη Η1. Αυτά τα ευρήματα βρίσκονται σε συμφωνία με άλλες μελέτες από την ερευνητική ομάδα του Chiorazzi ότι τα αντισώματα του υποσυνόλου #4 δεν παρουσίαζαν αντι-dna δράση παρά μόνο όταν αφαιρέθηκαν ορισμένες μεταλλάξεις που είχαν εισαχθεί μέσω της διαδικασίας της σωματικής υπερμεταλλαξιγενεσης (ΣΥΜ) 251. Oι διακριτές τροποποιήσεις που χαρακτηρίζουν τις στερεότυπες αναδιατάξεις του υποσυνόλου #4 και εισάχθηκαν με τη διαδικασία της ΣΥΜ αντιπροσωπεύουν πιθανώς μηχανισμό «διόρθωσης» (editing) για την αποφυγή της έντονης αυτο-αντιδραστικότητας που θα οδηγούσε σε κλωνική απαλοιφή. Τέλος, τα (αυτό)αντιγόνα ιστόνες και MDA που αναγνωρίστηκαν ως στόχοι κάποιων BKY του υποσυνόλου #4 γίνονται «διαθέσιμα» στην επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη του λευχαιμικού κλώνου κατά τη διάρκεια διαδικασιών όπως η απόπτωση και η στενά συνδεδεμένη με αυτήν, οξείδωση. Υπό αυτό το πρίσμα, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης στηρίζουν την υπόθεση ότι οι πρόδρομοι των λευχαιμικών κυττάρων του στερεότυπου υποσυνόλου IGHV4-34/IGKV2-30 ίσως εμπλέκονταν (και) στην απομάκρυνση αποπτωτικών σωματίων, δηλαδή διεκπεραίωναν μια χρήσιμη λειτουργία για τον οργανισμό και γι αυτό διατηρήθηκαν αντί να απαλοιφούν παρά τη δυνητική αυτοαντιδραστικότητά τους, την οποία περιόρισαν μέσω της διαδικασιας της ΣΥΜ 252. Παρότι οι ανοσοσφαιρίνες του υποσυνόλου #4 είναι έντονα μεταλλαγμένες, ωστόσο, σε λίγες μόνο περιπτώσεις εντοπίζονται μεταλλάξεις στο μοτίβο της περιοχής VH FR1 που ευθύνεται για την πρόσδεση στον επίτοπο NAL, υποδεικνύοντας ότι οι IGHV4-34 ανοσοσφαιρίνες του υποσυνόλου #4 διατηρούν την ικανότητα πρόσδεσης στον επίτοπο NAL τόσο σε αυτό-αντιγόνα όσο και σε εξω-αντιγόνα. Στην παρούσα διατριβή, τα αντισώματα του υποσυνόλου αναγνώρισαν ασθενώς επιτόπους του βακτηρίου Leishmania infantum και βακτηριακούς πολυσακχαρίτες, ενώ πρόσφατη μελέτη ανέδειξε τον πιθανό ρόλο των κοινών ερπητοϊών CMV και EBVστην ανάπτυξη της ΧΛΛ τουλάχιστον στην 139

140 περίπτωση ασθενών του υποσυνόλου # Η δομική ομοιότητα συστατικών διαφόρων παθογόνων με συστατικά αυτοαντιγόνων (π.χ. υδατανθρακικές ομάδες Ν-ακετυλολακτοζαμίνης) μπορεί να σχετίζεται με την παράλληλη αναγνώριση τόσο αυτόλογων όσο και εξωγενών αντιγόνων που αρχικά αφορά στη διέγερση και τον κλωνικό πολλαπλασιασμό δυνητικά επικίνδυνων, αυτοαντιδραστικών κυττάρων και τελικά οδηγεί σε άναρχο πολλαπλασιασμό και νεοπλασία 253. Συνολικά, τα αντισώματα του υποσυνόλου #4 παρουσίασαν «ολιγοαντιδραστικότητα» καθώς δεσμεύθηκαν ασθενώς σε αυτοαντιγόνα και σε μικροβιακά αντιγόνα. Η ήπια κλινική εξέλιξη της νόσου στους ασθενείς του υποσυνόλου #4 πιθανώς σχετίζεται με ένα «ανεργικό» προφίλ του λευχαιμικού κλώνου ύστερα από χρόνια διέγερση από αντιγόνο(α) άφθονο(α) στο μικροπεριβάλλον του λευχαιμικού κλώνου. Στη ΧΛΛ, περιπτώσεις που απαντούν στη διέγερση του ΒΚΥ συνήθως φέρουν αμετάλλακτες αλληλουχίες IGHV κι εκφράζουν ZAP70 και/ή CD38. Αντίθετα, οι περιπτώσεις ΧΛΛ που φέρουν μεταλλαγμένες αλληλουχίες IGHV και δεν εκφράζουν ZAP70 και/ή CD38, όπως οι περιπτώσεις του υποσυνόλου #4, δεν αποκρίνονται στη διέγερση μέσω της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης, κατάσταση που προσομοιάζει με την αντίστοιχη ανεργικών κυττάρων μετά από χρόνια έκθεση σε αντιγόνο 156,157. Επιπλέον, πρόσφατη ανάλυση του προτύπου λειτουργικότητας των υποδοχέων TLR στη ΧΛΛ παρείχε πολύ ισχυρές ενδείξεις ότι τα λευχαιμικά λεμφοκύτταρα του υποσυνόλου #4 είναι ανεργικά μέσω του TLR7 πιθανόν λόγω προηγούμενης in vivo επαφής τους με προσδέτες ειδικούς για τον υποδοχέα (μονόκλωνο ιικό RNA) Στερεότυποι υποδοχείς IGHV4-59/IGKV3-20 στην ΧΛΛ και άλλες λεμφοϋπερπλασίες: ανοσοπαθογενετικές συσχετίσεις Στην παρούσα εργασία προέκυψαν για πρώτη φορά στοιχεία που συνδέουν την ειδική δράση ρευματοειδούς παράγοντα μ ένα διακριτό υποσύνολο στερεότυπων υποδοχών στη ΧΛΛ αλλά και σε άλλες Β λεμφοϋπερπλασίες, συγκεκριμένα Σπληνικό Λέμφωμα Οριακής Ζώνης (ΣΛΟΖ), μονοκλωνικές Β λεμφοϋπερπλασίες στο σύνδρομο Sjogren (SS) και μικτή κρυοσφαιριναιμία τύπου ΙΙ (ΜΚΤΙΙ) η οποία συσχετίζεται με τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV). Όλες οι παραπάνω περιπτώσεις εξέφραζαν τον στερεότυπο ΒΚΥ IGHV4-59/IGKV3-20. Τα δεδομένα αυτά συμπεριλαμβάνουν αξιοσημείωτες ομοιότητες των αλληλουχιών των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών, λειτουργική απόδειξη της ειδικής δράσης ρευματοειδούς παράγοντα και για κάποιες, τουλάχιστον, περιπτώσεις συσχέτιση με HCV λοίμωξη. Οι ρευματοειδείς παράγοντες (RF) είναι οι πιο συχνοί τύποι αυτοαντισωμάτων στις αυτοάνοσες διαταραχές, ιδίως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) και στο πρωτοπαθές 140

141 σύνδρομο Sjogren (SS), ενώ ανιχνεύονται και σε Β λεμφοϋπερπλασίες όπως η ΜΚΤΙΙ και άλλα Β λεμφώματα Μάλιστα, η ΜΚΤΙΙ και μερικοί τύποι λεμφωμάτων αποδίδονται αιτιολογικά σε χρόνια λοίμωξη από τον ιό HCV, η οποία οδηγεί σε επιλογή και επέκταση μονοκλωνικού πληθυσμού Β λεμφοκυττάρων που στην περίπτωση της ΜΚΤΙΙ εκκρίνουν συνήθως κρυοσφαιριναιμίνες με δράση ΡΠ Η ΜΚΤΙΙ θεωρείται ως ένα in vivo μοντέλο Β λεμφοϋπερπλασίας που πυροδοτείται είτε απευθείας από αντιγόνα του HCV είτε έμμεσα, μέσω ανοσοσυμπλεγμάτων 205. Ωστόσο, απόδειξη της άμεσης διέγερσης από αντιγόνα του ιού δεν υπάρχει και οι πραγματικοί μηχανισμοί που οδηγούν στο μετασχηματισμό των κυττάρων δεν είναι γνωστοί. Ανοσογενετικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ισχυρές ομοιότητες μεταξύ του ΡΠ στην HCV-σχετιζόμενη ΜΚΤΙΙ και τις ανοσοσφαιρίνες που εκφράζονται από τον ολιγο/μονοκλωνικό πληθυσμό Β λεμφοκυττάρων στους σιελογόνους αδένες ασθενών με πρωτοπαθές SS 203. Το πρωτοπαθές SS μπορεί να επιπλακεί από λέμφωμα, ενώ δεν υπάρχει κάποιος γνωστός συσχετισμός με τον HCV. Αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του ανοσοποιητικού συστήματος ή κάποιος μηχανισμός μοριακού μιμητισμού ίσως συμμετέχουν στην ανάπτυξη αυτών των οντοτήτων 203. Η ανοσογενετική ανάλυση του υποσυνόλου #13 ανέδειξε ενιαία έκφραση μεταλλαγμένων στερεότυπων IGHV4-59/IGKV3-20 ανοσοσφαιρινών, ισοτύπου Μ, με υψηλή αμινοξική ταυτότητα στην περιοχή CDR3 και πανομοιότυπα αμινοξέα στην περιοχή των συμβολών IGHV-IGHD-IGHJ και IGKV-IGKJ. Εκτός από την περιοχή CDR3, κοινά μοτίβα σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης παρατηρήθηκαν καθόλο το μήκος της μεταβλητής περιοχής της βαριάς και της ελαφριάς αλυσίδας. Δεδομένου ότι η πιθανότητα οι περιορισμοί αυτοί να συμβαίνουν από τύχη και μόνο είναι εξαιρετικά χαμηλή, αν όχι μηδαμινή, τα συγκεκριμένα ευρήματα υποστηρίζουν την πιθανότητα ισχυρής επιλογής των Β λεμφοκυτταρικών κλώνων με ιδιαίτερα μοναδικά χαρακτηριστικά του ΒΚΥ. Η κατανομή των R και S μεταλλάξεων στις CDR (περιοχές συμπληρωματικότητας) και FR (περιοχές πλαισίου) επιβεβαιώνει την πολύ ακριβή και αποτελεσματική στόχευση της διαδικασίας SHM, υπογραμμίζοντας την επιλογή από ειδικό αντιγόνο(α). Η σύγκριση των αλληλουχιών του υποσυνόλου #13 με αλληλουχίες από δημόσιες τράπεζες δεδομένων αποκάλυψε περαιτέρω ομοιότητες μ ένα ρευματοειδή παράγοντα από υγιή δότη 200, τον κλωνοτυπικό υποδοχέα από ασθενή με ΧΛΛ με ιστορικό μικτής κρυοσφαιριναιμίας τύπου ΙΙ (ΜΚΤΙΙ) και θετικότητα για αντι-hcv αντισώματα 201 και τις κλωνοτυπικές αλληλουχίες δύο ασθενών με μυοεπιθηλιακή σιελαδενίτιδα που 141

142 αναπτύχθηκε στο πλαίσιο συνδρόμου Sjögren (SS-MESA). Στον ορό των ασθενών αυτών εντοπίστηκε ρευματοειδής παράγοντας. 203 Επιπλέον, παρατηρήθηκε υψηλή ομολογία της μεταβλητής περιοχής της κάππα ελαφριάς αλυσίδας του υποσυνόλου # 13 και των κλωνικών Β λεμφοκυττάρων στην SS- MESA και την ΜΚΤΙΙ 205. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο IGKV3-20, το οποίο επίσης χρησιμοποιείται κατά προτίμηση σε σχετιζόμενα με τον HCVλεμφώματα 258 και στην MKTII 205. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν ομοιότητες μεταξύ των χαραστηριστικών αντιγονικών υποδοχέων του υποσυνόλου #13 στη ΧΛΛ και σε άλλες λεμφοϋπερπλασίες και στην ανάπτυξη αντισωμάτων με δράση ΡΠ. Η παρουσία ΡΠ σε υγιείς ανθρώπους, χωρίς εμφανή νόσο, συνδέεται με ανοσοαποκρίσεις σε βακτήρια και ιούς. Σε αυτές τις περιπτώσεις οι ΡΠ είναι κυρίως ισοτύπου IgM και διευκολύνουν την κάθαρση του αντιγόνου ενισχύοντας την ενεργοποίηση του συμπληρώματος και τη φαγοκυττάρωση 259. Κάποιες από τις περιπτώσεις με τις στερεότυπες IGHV4-59/IGKV3-20 ανοσοσφαιρίνες που περιγράφονται στην παρούσα μελέτη ήταν θετικές για την παρουσία αντισωμάτων HCV στον ορό. Παρά την πιθανή συσχέτιση με λοίμωξη από τον HCV, η ανοσοσφαιρίνη μιας τυπικής περίπτωσης ΧΛΛ του υποσυνόλου #13 δεν αναγνώρισε άμεσα αντιγόνα του ιού, αλλά είχε ειδική δράση ΡΠ. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η διέγερση του Β λεμφοκυτταρικού κλώνου από τον HCV ή κάποιο άλλο παθογόνο ίσως δεν είναι άμεση αλλά έμμεση, στο πλαίσιο της επαγόμενης φλεγμονώδους αντίδρασης. Στο σενάριο της έμμεσης διέγερσης, oι στερεότυπoι IGHV4-59/IGKV3-20 BKY με δράση ΡΠ δε δεσμεύονται απευθείας στον παθογόνο παράγοντα, αλλά λαμβάνουν έμμεση διέγερση συνδεόμενοι σε ανοσοσυμπλέγματα που αποτελούνται από πολυκλωνικές IgG ανοσοσφαιρίνες οι οποίες με τη σειρά τους αναγνωρίζουν μικροβιακά αντιγόνα (Εικόνα 34). Αντίστοιχο σενάριο έχει προταθεί για την παθογένεση της ΜΚΤΙΙ και της SS-MESA. To υποσύνολο #13 παρότι μικρό αριθμητικά μπορεί να θεωρηθεί ως ένα in vivo μοντέλο για τη μελέτη του ρόλου της αντιγονικής διέγερσης στην παθογένεια της ΧΛΛ. Η ύπαρξη των υποδοχέων του υποσυνόλου σε ευρύ φάσμα Β λεμφοϋπερπλαστικών διαταραχών υποδεικνύει την ύπαρξη κάποιου κοινού μοριακού μηχανισμού και τη λειτουργία κοινών μηχανισμών του ανοσοποιητικού συστήματος που ενεργοποιούνται σε απόκριση προς παθογόνα και οδηγούν σε ετερογενείς αλλά συναφείς κλινικές οντότητες. 142

143 Εικόνα 34. Έμμεση διέγερση της στερεότυπης IGHV4-59/IGKV3-20 ανοσοσφαιρίνης με δράση ρευματοειδούς παράγοντα. Figure 34. Indirect stimulation of the stereotyped IGHV4-59/IGKV3-20 immunoglobulin with rheumatoid factor activity Στερεότυπο υποσύνολο #8: η εξαιρετική πολυαντιδραστικότητα οδηγεί στην κλινική επιθετικότητα; Το στερεότυπο υποσύνολο #8 260 παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον. Οι ασθενείς που κατατάσσονται σε αυτό παρουσιάζουν εξαιρετικά επιθετική κλινική πορεία 139 και την υψηλότερη καταγεγραμμένη πιθανότητα μετατροπής της ΧΛΛ σε επιθετικό λέμφωμα (σύνδρομο Richter) 142. Εμφανίζει υψηλή συχνότητα τρισωμίας ,261 και της χρωμοσωμικής μετάθεσης t(14;19)(q32;q13) που οδηγεί σε απορρύθμιση του γονιδίου BCL Οι ασθενείς του υποσυνόλου #8 φέρουν αμετάλλακτους, στερεότυπους υποδοχείς IGHV4-39/IGKV1(D)-39, ισοτύπου IgG 132,260. Οι βαριές αλυσίδες του υποσυνόλου #8 κωδικοποιούνται από το συνδυασμό των γονιδίων IGHV4-39/IGHD6-13/IGHJ5 με περιοχές VH CDR3 μήκους 19 αμινοξέων. Παρότι οι περιοχές μεταξύ των γονιδίων IGHV-IGHD και IGHD-IGHJ είναι ετερογενείς σε αμινοξικό επίπεδο, η εκτενής ανάλυση των αναδιατάξεων της βαριάς αλυσίδας σε δημόσιες βάσεις δεδομένων (IMGT/LIGM-DB) αποκάλυψε ότι ο συγκεκριμένος συνδυασμός γονιδίων IGHV-IGHD-IGHJ είναι ειδικός για το υποσύνολο # Δεν είναι σαφές ποιοι μηχανισμοί διέπουν την επιθετική κλινική συμπεριφορά του υποσυνόλου #8. Στην παρούσα μελέτη δόθηκαν κάποιες απαντήσεις σχετικά με την επιθετικότητα της ασθένειας σε αυτό το υποσύνολο. Συγκεκριμένα, συγκρίθηκε το πρότυπο αντιγονικών στόχων των μονοκλωνικών αντισωμάτων του υποσυνόλου #8 με το αντίστοιχο άλλων στερεότυπων υποσυνόλων, καλής και κακής πρόγνωσης (στερεότυπα υποσύνολα #1, #2 και #4). Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν εξαιρετική 143

144 πολυαντιδραστικότητα για το υποσύνολο #8, αφού σε αντίθεση με τα αντισώματα άλλων υποσυνόλων τα αντισώματα του υποσυνόλου #8 αναγνώρισαν σχεδόν κάθε αντιγονικό στόχο (αυτοαντιγόνα, δείκτες οξείδωσης, μικροβιακά αντιγόνα και προσδέτες των TLR). Μελέτες από άλλες ερευνητικές ομάδες έχουν δείξει δέσμευση των αντισωμάτων του υποσυνόλου #8 σε οξειδωμένα λιποσωμάτια LDL και σε υγιή και αποπτωτικά κύτταρα 165,166,169. Μάλιστα, τα αντισώματα του υποσυνόλου #8 παρουσίασαν την ισχυρότερη δέσμευση σε αποπτωτικά κύτταρα με εκτεθειμένη MYHIIA (nonmuscle myosin heavy chain IIA, MYHIIA) σε σύγκριση με όλα τα άλλα ΧΛΛ αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων αντισωμάτων των υποσυνόλων #1, #2 και # Επιπλέον, μέσω λειτουργικών μελετών σηματοδότησης βρέθηκε ότι τα ΧΛΛ κύτταρα του υποσυνόλου #8 απαντούν έντονα ύστερα από διέγερση με τους προσδέτες των υποδοχέων TLR 1/2, 2/6, 7 και 9, σε αντίθεση με τα ΧΛΛ κύτταρα άλλων υποσυνόλων που αντιδρούν πιο εκλεκτικά σε ορισμένους TLR μόνο 224. Συνολικά, τα ΧΛΛ κύτταρα του υποσυνόλου # 8 αντιδρούν έντονα κατά τη διέγερση με αρκετούς προσδέτες TLR, ενώ ο BCR του υποσυνόλου είναι εξαιρετικά πολυαντιδραστικός αναγνωρίζοντας υγιή και αποπτωτικά κύτταρα, αυτοαντιγόνα, νεο-επιτόπους που δημιουργούνται κατά την οξείδωση και μικροβιακά αντιγόνα. Αυτά τα χαρακτηριστικά συμβάλλουν στη δημιουργία ενός ιδιαίτερου προφίλ ακόμα και σε σύγκριση με άλλα στερεότυπα υποσύνολα κακής πρόγνωσης (Εικόνα 35Α). Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης συνδέουν την έντονη πολυαντιδραστικότητα με την κλινική επιθετικότητα και την αυξημένη τάση εξαλλαγής σε επιθετικό λέμφωμα. Σε ένα πιθανό σενάριο, η σχεδόν απεριόριστη ικανότητα απάντησης μέσω των αντιγονικών υποδοχέων τόσο της επίκτητης ανοσίας (ΒΚΥ) όσο και της έμφυτης ανοσίας (TLR) σε ποικίλα σήματα παρόντα στο μικροπεριβάλλον του λευχαιμικού κλώνου του υποσυνόλου #8, προκαλεί συνεχή διέγερση των κακοηθών κυττάρων, καθόλη την διάρκεια της φυσικής πορείας της νόσου, οδηγώντας προοδευτικά στην επιλογή των πιο επιθετικών υποκλώνων (Εικόνα 35Β). 144

145 Εικόνα 35. A. Υποσύνολο #8: Εξαιρετική πολυαντιδραστικότητα. B. Υποθετικό μοντέλο: Απεριόριστη ικανότητα απάντησης σε ποικίλα ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος του λευχαιμικού κλώνου οδηγεί σταδιακά στην επιλογή των πιο επιθετικών υποκλώνων Figure 35. A. Subset #8: Extreme polyreactivity. B. A putative model: Unlimited capacity to respond to multiple immune/inflammatory stimuli present in the microenvironment leads to progressive selection of the more aggressive clonal variants. 145