Gene expression regulation by heat- shock proteins: the cardinal roles of HSF1 and Hsp90

Transcript

1 Gene expression regulation by heat- shock proteins: the cardinal roles of HSF1 and Hsp90 Mazaira GI(1), Daneri- Becerra C(2), Zgajnar NR(2), Lotufo CM(2), Galigniana MD(3)(2). Author information: (1)Departamento de Quimica Biologica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. (2)Instituto de Biologia y Medicina Experimental (IBYME)- CONICET, Buenos Aires 1428, Argentina. (3)Departamento de Quimica Biologica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina The ability to permit gene expression is managed by a set of relatively well known regulatory mechanisms. Nonetheless, this property can also be acquired during a life span as a consequence of environmental stimuli. Interestingly, some acquired information can be passed to the next generation of individuals without modifying gene information, but instead by the manner in which cells read and process such information. Molecular chaperones are classically related to the proper preservation of protein folding and anti- aggregation properties, but one of them, heat- shock protein 90 (Hsp90), is a refined sensor of protein function facilitating the biological activity of properly folded client proteins that already have a preserved tertiary structure. Interestingly, Hsp90 can also function as a critical switch able to regulate biological responses due to its association with key client proteins such as histone deacetylases or DNA methylases. Thus, a growing amount of evidence has connected the action of Hsp90 to post- translational modifications of soluble nuclear factors, DNA, and histones, which epigenetically affect gene expression upon the onset of an unfriendly environment. This response is commanded by the activation of the transcription factor heat- shock factor 1 (HSF1). Even though numerous stresses of diverse nature are known to trigger the stress response by activation of HSF1, it is still unknown whether there are different types of molecular sensors for each type of stimulus. In the present review, we will discuss various aspects of the regulatory action of HSF1 and Hsp90 on transcriptional regulation, and how this regulation may affect genetic assimilation mechanisms and the health of individuals. Εισαγωγή Στις μέρες μας, οι μηχανισμοί ρύθμισης που διέπουν την γονιδιακή έκφραση, θεωρούνται επι το πλείστον, γνωστοί. Παρόλα αυτά όμως, η γονιδιακή έκφραση μπορεί να προωθηθεί και μέσω περιβαλλοντικών ερεθισμάτων. Όταν ένας οργανισμός βρίσκεται σε ένα μη φιλικό για αυτόν περιβάλλον, μπορεί να ενεργοποιήσει τον μεταγραφικό παράγοντα HSF- 1 (Heat Shock Factor - 1). Η αλληλεπίδραση αυτού του μεταγραφικού παράγοντα, με την πρωτεΐνη- συνοδό Hsp90 (Heat shock protein 90), μπορεί να οδηγήσει την Hsp90 σε μετα- μεταφραστικές τροποποιήσεις διαλυτών πυρηνικών παραγόντων, DNA και ιστονών, οι οποίοι μέσω επιγενετικών διαδικασιών, μπορούν να επηρεάσουν την γονιδιακή έκφραση. Στα πλαίσια αυτής της εργασίας, και όπως αναλύεται και στην παραπάνω ανασκόπηση, θα συζητήσουμε την δράση των HSF- 1 και Hsp90 στη μεταγραφική ρύθμιση, καθώς και πώς αυτή τους η δράση, μπορεί να επηρεάσει μηχανισμούς γεντικής αφομοίωσης αλλά και την υγεία μεμονωμένων ατόμων.

2 HSF- 1 και η αντίδραση στο στρες Ένας επιγενετικός παράγοντας ο οποίος είναι γνωστό ότι προάγει επιγενετικές αλλαγές είναι το στρες. Το κυριότερα αποτέλεσμα της ανταπόκρισης στο στρες είναι η αυξημένη παραγωγή HSPs (heat shock proteins). Οι HSPs έχουν την ικανότητα να προστατεύουν τα κύτταρα και να τους επιτρέπουν να επιβιώνουν σε συνθήκες που ειδάλλως, θα ήταν θανατηφόρες. Σε κατώτερους οργανισμούς όπως τις ζύμες, τους νηματώδεις αλλά και την Drosophila η μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις HSPs ρυθμίζεται από έναν και μοναδικό μεταγραφικό παράγοντα, τον HSF1 (Heat Shock Factor 1). Στα σπονδυλωτά, μια οικογένεια τεσσάρων παραγόντων HSF έχει εξελιχθεί (HSF1, HSF2, HSF3, HSF4), εκ των οποίων ο HSF1 είναι το λειτουργικό ανάλογο του HSF1 των κατώτερων οργανισμών. Σύμφωνα με μελέτες, η δράση του HSF1 στα σπονδυλωτά, δεν υπερκαλύπτεται από την δράση των άλλων τριών παραγόντων της οικογένειας, κάτι που υπογραμμίζει την υψηλή του σημασία. Όσον αφορά την δομή του HSF1, αξίζει να σημειωθεί ότι θεωρείται αρθρωτή. Αποτελείται από το στοιχείο αντίδρασης στο θερμικό σοκ HSE (Heat Shock Element), το οποίο παράλληλα αποτελεί και δομική αυτοτελή περιοχή υπεύθυνη για την δέσμευση του DNA. Επιπλέον, αποτελείται από τρείς αυτοτελείς δομικές περιοχές 7 αμινοξικών επαναλήψεων, τις HR- A, HR- B και HR- C, αλλά και αυτοτελείς δομικές περιοχές που είναι υπεύθυνες για την μεταγραφική ενεργοποίηση. Ο παράγοντας HSF1 βρίσκεται κατά κύριο λόγο στο κυτταρόπλασμα ως μονομερές και δεν έχει την ικανότητα να πραγματοποιήσει ειδική δέσμευση DNA απουσία κάποιου ερεθίσματος. Στην ανενεργή του μορφή, βρίσκεται να αλληλεπιδρά με το ετεροσύμπλοκο της τσαπερόνης Hsp90, το οποίο μάλιστα εμποδίζει την μεταγραφική ενεργότητα του παράγοντα. Με την επίδραση του παράγοντα στρες, το σύμπλοκο της τσαπερόνης απομακρύνεται, ο φωσφορυλιωμένος HSF1 ομοτριμερίζεται και μεταβάινει στον πυρήνα. Η υπερφωσφορυλίωσή του οδηγεί σε μεταγραφική ενεργότητα, ενώ η σουμοϊλίωση του οδηγεί στην αποσυναρμολόγησή του, την απομάκρυνση του από τον πυρήνα και στην επανασυναρμολόγησή του, ως μονομερές πλέον, με το ετεροσύμπλοκο της τσαπερόνης Hsp90 στο κυτταρόπλασμα. Ένα αναπάντητο ερώτημα είναι αν υπάρχουν διαφορετικοί αισθητήρες για τις διαφορετικές συνθήκες καταπόνησης, ή αν ένα ερέθισμα λόγω καταπόνησης οδηγεί μέσω σύγκλισης σε ένα τελικό και όμοιο πάντα σήμα. Για την ενεργοποίηση του παράγοντα HSF1 έχουν προταθεί τρεις διαφορετικές θεωρίες. Η πρώτη, αναφέρει ότι υπο φυσιολογικές συνθήκες ο παράγοντας είναι ανενεργός, και κατά το θερμικό σοκ λόγω αυξημένου λανθασμένου πρωτεϊνικού διπλώματος ο Hsp90 απελευθερώνεται από τα HSF1 μονομερή και αυτά με τη σειρά τους τριμερίζονται. Γενικότερα, μέσω πιο εξειδικευμένων μελετών έχει προταθεί ότι το συγκεκριμένο μονοπάτι είναι αυτορυθμιζόμενο και σε μεταγραφικό αλλά και σε μετα- μεταγραφικό επίπεδο. Κάτι τέτοιο σημαίνει ότι τα σύμπλοκα HSF1- HSPs ενεργοποιούν έναν μηχανισμό αρνητικής ανάδρασης για να διαβεβαιώσουν ότι η λειτουργία του HSF1 συντονίζεται και από την ευρύτερη κατάσταση της ποιότητας του πρωτεϊνικού διπλώματος αλλά και του επιπέδου έκφρασης των γονιδίων στόχων. Η δεύτερη θεωρία στηρίζεται σε μια ενδογενή ικανότητα του παράγοντα HSF1 να εντοπίσει προτοξικά ερεθίσματα. Κύριο πλεονέκτημα της θεωρίας αυτής είναι ότι μπορεί να εξηγήσει την ταχεία ενεργοποίηση του HSF1. Τέλος, η τρίτη θεωρία, η αλλιώς το μοντέλο του RNA θερμόμετρου, υποστηρίζει ότι η ενεργοποίηση του HSF1 στηρίζεται σε ένα σύμπλοκο ενός παράγοντα επιμήκυνσης και ενός RNA μορίου με ικανότητα θεμρικής αίσθησης. Αυτό το μοντέλο συνδέει την ενεργοποίηση του HSF1 με την καταστολή των μεταφραστικών διαδικασιών σε περιόδους θερμικού σοκ. Παρόλα αυτά, περιορίζει την ενεργοποίηση του HSF1 σε θερμοκρασίες που δεν ξεπερνούν το θερμικό κατώφλι του θερμομέτρου. Hsp90 Η Hsp90 (Heat shock protein 90) είναι ένας μοριακός συνοδός (τσαπερόνη) που εκφράζεται στους περισσότερους οργανισμούς. Η Hsp90 είναι ρυθμιστής βιολογικής δραστηριότητας, παρέχοντας δραστηριότητα συνοδού μορίου σε πρωτεΐνες- υποστρώματα που έχουν ήδη τριτοταγή δομή, ενώ

3 αλληλεπιδρά με εκατοντάδες μόρια πρωτεϊνών και μορίων σηματοδότησης. Η έκφρασή της ελέγχεται από τον HSF1. Η Hsp90 αποτελείται από τρία domains: μία καλά συντηρημένη Ν- τελική περιοχή, στην οποία συνδέονται το ATP, το ADP και οι αναστολείς βενζοκινόνης ανσαμυκίνης (π.χ. αντιβιοτικό γελαδαναμυκίνη), η μεσαία περιοχή, κύρια περιοχή αλληλεπίδρασης με πρωτεΐνες- υποστρώματα και η C- τελική περιοχή, υπεύθυνη για το διμερισμό της Hsp90 και περιέχει στο άκρο της το πενταπεπτίδιο MEEVD, που είναι υπεύθυνο για την αλληλεπίδραση με βοηθητικά συνοδά μόρια που έχουν TPR μοτίβα, όπως η HOP (heat- shock organizing protein). Τα διμερή της Hsp90 βρίσκονται σε δυναμική ισορροπία μεταξύ δύο καταστάσεων, της ισομορφής που συνδέεται με ADP και της ισομορφής που είναι συνδεδεμένη με την ΑΤΡ. Η συνδεδεμένη με ΑΤΡ ισομορφή του Hsp90 είναι καλύτερος τροποποιητής της βιολογικής δραστηριότητας των πρωτεϊνών- υποστρωμάτων. Ως αποτέλεσμα της γονιδιακής επικάλυψης πάρχουν δύο Hsp90 ισομορφές που είναι 85% ταυτόσημες στα κύτταρα των θηλαστικών, δηλαδή η Hsp90α (η ισόμορφη επαγόμενη από το στρες) και η Hsp90β (η συστατικά εκφρασμένη ισομορφή). Το Hsp90 αντιπροσωπεύει ~2-3% των ολικών διαλυτών πρωτεϊνών στα κύτταρα που βρίσκονται σε ηρεμία, ~6-7% σε καρκινικά κύτταρα και έως και 10% σε εξαιρετικά καταπονημένα κύτταρα. Εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, ενώ ένα σχετικά μικρό τμήμα του πληθυσμού Hsp90 είναι πυρηνικό. Παρ 'όλα αυτά, και υπό ορισμένες συνθήκες, το Hsp90 συσσωρεύεται στον πυρήνα. Οι ιστόνες υποβάλλονται σε πολλές μετα- μεταφραστικές τροποποιήσεις που αλλάζουν τις εγγενείς ιδιότητες της χρωματίνης και αποτελούν τον επιγενετικό κώδικα. Από τις πιο βασικές επιγενετικές αλλαγές- σήματα είναι η μεθυλίωση του DNA. Η προσθήκη CH3 στις περιοχές με κυτοσίνες CpG δινουκλεοτιδίων αλλάζει την εμφάνιση και τη δομή του DNA, το οποίο έπειτα τροποποιεί τις αλληλεπιδράσεις των γονιδίων με τους μεταγραφικούς μηχανισμούς. Από παλαιές μελέτες σε ιστούς πασχόντων από καρκίνο του παχέος εντέρου, δηλαδή καθαρισμό DNA από πρωτογενείς καρκινικούς και γειτονικούς φυσιολογικούς ιστούς, έπειτα πέψη με περιοριστικά ένζυμα και μέθοδο Southern, εξετάζεται το επίπεδο της μεθυλίωσης μέσω υβριδισμού. Διαπιστώθηκε ότι χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης αλλάζουν τη μορφή της χρωματίνης και αυξάνουν αφύσικα τη δραστηριότητα τυπικά σιωπηλών γονιδίων με αποτέλεσμα την εμφάνιση καρκίνου. Στον αντίποδα, και η υπερμεθυλίωση έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση καρκινικών κυττάρων. Μπορεί να ανταγωνίζεται τα προστατευτικά αποτελέσματα των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, ενώ υπάρχουν επεκτάσεις του DNA με υψηλές συγκεντρώσεις CpG που είναι απαλλαγμένες από μεθυλίωση σε φυσιολογικά κύτταρα, αλλά μεθυλιώνονται υπερβολικά σε καρκινικά κύτταρα και προκαλούν ενεργοποίηση σιωπηλών γονιδίων. Αυτή είναι η επιγενετική αλλαγή που εμφανίζεται στους όγκους και συμβαίνει σε σύντομο χρονικό διάστημα κατά την ανάπτυξη του καρκίνου. Όλες αυτές οι διαδικασίες επηρεάζονται άμεσα από τη σωστή λειτουργία της Hsp90, μέσω της ρύθμισης της βιολογικής δραστηριότητας πολλών πυρηνικών παραγόντων και η διαμόρφωση της αρχιτεκτονικής του πυρήνα (και, συνεπώς, επηρεάζοντας τη γονιδιακή έκφραση) Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες με cross- talks της Hsp90 με τροποποιητές χρωματίνης έγιναν με σκοπό την παρατήρηση για το πώς επηρεάζεται η ισορροπία μεθυλίωσης- απομεθυλίωσης. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι ανάλογα με το επίπεδο της μεθυλίωσης απενεργοποιούνται και ενεργοποιούνται γονίδια με μηχανισμούς όπως η χαλάρωση ιστονικών ουρών και επομένως την μεταβολή του βαθμού πρόσβασης μεταγραφικών παραγόντων στο DNA. Η ιστονική μεθυλοτρανσφεράση SMYD3 υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και του καρκίνου του παχέος εντέρου. Στην καρκινογένεση προάγει τον πολλαπλασιασμό, ενώ in vitro, αυτή η δραστηριότητα ενισχύεται από την Hsp90, με την οποία το SMYD3 αλληλεπιδρά στα κύτταρα. Άλλη μεθυλοτρανσφεράση που ρυθμίζεται από την Hsp90 είναι η DNMT1, της οποίας η δραστηριότητα εντοπίζεται υψηλή σε κύτταρα καρκίνου του μαστού. Εστιάζοντας στην αλληλεπίδραση πρωτεΐνης- πρωτεΐνης και τη διατηρημένη αλληλουχία της Hsp90 μεταξύ των ειδών, παρατηρείται ο ζωτικός της ρόλος στην κυτταρική επιβίωση. Ως πρωτεΐνη- κλειδί

4 στο σταυροδρόμι γενετικής- επιγενετικής μελετώνται τα αποτελέσματα σε περίπτωση διακοπής της λειτουργίας της με πρωτεϊνική μετάλλαξη ή φαρμακολογικά (γελδαναμυκίνη ή ραντισικόλη) με τη χρήση επιλεκτικών παραγόντων διάσπασης. Στην Drosophila το αποτέλεσμα ήταν φαινοτυπικές παραλλαγές στα ενήλικα άτομα, αλλά και στο Arabidopsis thaliana εμφανίστηκαν νέοι σπάνιοι φαινότυποι, οι οποίοι ήταν ευεργετικοί για το φυτό στις νέες συνθήκες περιβάλλοντος. Επομένως, αποδείχθηκε πως όταν οι περιβαλλοντικοί ή οι γενετικοί παράγοντες διαταράσσουν τη σταθερή πορεία ανάπτυξης ενός οργανισμού, μπορεί στη συνέχεια να εμφανιστούν φαινοτυπικές παραλλαγές που του επιτρέπουν να παραμείνει σε ένα νέο, σχετικά εχθρικό περιβάλλον. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν ένα μοντέλο στο οποίο η Hsp90 αποτελεί έναν ενδοκυτταρικό ρυθμιστή προσαρμογής. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι πολλές από τις πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε καρκινικά μονοπάτια μεταβίβασης σήματος είναι υποστρώματα της Hsp90, που σταθεροποιούνται από τη δράση της ως μοριακός συνοδός. Επομένως, η αναστολή της Hsp90 μπορεί να επιδράσει ταυτόχρονα σε πολλά διαφορετικά σημεία, προσφέροντας έτσι μια πολύ σημαντική αντικαρκινική θεραπεία. Μόρια αναστολής που στοχεύουν ειδικά την Hsp90, όπως αναφέρθηκε, είναι η γελδαναμυκίνη και η ραντισικόλη. Η Hsp90 είναι ο κύριος ρυθμιστής γονιδιακής έκφρασης πολλών μεταγραφικών παραγόντων. Ανάμεσα σε αυτούς είναι και οι υποδοχείς στεροϊδών, για τους οποίους η Hsp90 ελέγχει την πυρηνική τους μετατόπιση. Με την επίδραση των αναστολέων ο χρόνος πυρηνικής μετατόπισης των κυτοπλασματικών υποδοχέων αυξάνεται. Μεταξύ των υποδοχέων αυτών ήταν και οι υποδοχείς ανδρογόνων (AR) οι οποίοι εντοπίζονται στον πυρήνα σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Ακόμα, δηλαδή, και απουσία του στεροϊδούς, οι υποδοχείς οδηγούνται στον πυρήνα όπου προκαλούν μεταγραφική ενεργοποίηση των στοχευμένων γονιδίων, με αποτέλεσμα αύξηση όγκου. Η γελδαναμυκίνη εμποδίζει τον πυρηνικό εντοπισμό του AR. Μελέτες πάνω στη συναρμολόγηση της RNA πολυμεράσης II σε ανθρώπινα κύτταρα κατέστησαν πιο ξεκάθαρο τον ρόλο της Hsp90 σε αυτή τη διαδικασία και κυρίως στον έλεγχο που ασκεί στην έκφραση συγκεκριμένων συνόλων στοχευμένων γονιδίων (target genes) ρυθμίζοντας την παύση λειτουργίας της RNA pol II σε αυτές τις περιοχές. Αυτός ο μοριακός δεσμός διατηρείται εξελικτικά και ανταποκρίνεται στους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Σε κατάσταση στρες, μετά από θερμικό σοκ η HSF δεσμεύεται σε 464 θέσεις, η πλειοψηφία των οποίων περιέχει στοιχεία δέσμευσης αλληλουχίας HSF (HSEs). Μετά τη δέσμευση ακολουθεί η ενεργοποίηση των περιοχών αυτών Με αναλύσεις ChIP- sequencing (για να εξεταστεί τη γενική κατανομή του παράγοντα HSF) στη Drosophila έγινε σύγκριση των θέσεων πρόσδεσης HSF1 στα κύτταρα μετά από θερμικό σοκ με τις θέσεις πρόσδεσης της Hsp90 σε φυσιολογικά κύτταρα και διαπιστώθηκε ότι ένα μεγάλο ποσοστό των στόχων HSF καταλαμβάνονται από την Hsp90 σε μη καταπονημένα κύτταρα. Αυτό υποδηλώνει συνεργασία μεταξύ HSF και Hsp90,στην οποία η Hsp90 βοηθάει τη δέσμευση του HSF σε γειτονικές αλληλουχίες HSE. Θα μπορούσε επίσης να είναι πιθανό ότι η HSF δεσμεύεται σε πολλές θέσεις, αλλά ενεργοποιεί γονίδια μόνο στο πλαίσιο δεσμευμένου Hsp90 και πολυμεράσης σε παύση. Σύμφωνα με αυτή την πιθανότητα, στα πολυταινικά χρωμοσώματα της Drosophila, δεν δείχνουν όλες οι θέσεις, που συσχετίζονται με την HSF, πρόσληψη παραγόντων επιμήκυνσης. H Hsp90 είναι επίσης γνωστό ότι δεσμεύει και ρυθμίζει τον υποκινητή (promoter) του HIV σε μολυσμένα κύτταρα. Επάγει επίσης τη συμπύκνωση της χρωματίνης και συνεπώς μπορεί να συμβάλλει στην αυστηρότερη πυρηνική δομή των κυττάρων υπό θερμικό σοκ, ίσως εμποδίζοντας τη δραστηριότητα πολλών μεταγραφικών παραγόντων. Αλλοιωμένη αρχιτεκτονική χρωματίνης εμποδίζει την ανταπόκριση σε θερμικό σοκ και μπορεί να επηρεάσει ακόμη και τη συναισθηματική συμπεριφορά. HDAC6 και αλληλεπίδραση με την Hsp90 και τον παράγοντα HSF1 Η HDAC6 (histone deacetylase 6) σχετίζεται με την αρχιτεκτονική του κυτταροσκελετού και τους καταρράκτες σηματοδότησης. Η υπερέκφρασή της έχει ως αποτέλεσμα ογκογένεση, ενώ η

5 αναστολή της απόπτωση. Με knockdown της HDAC6, γίνεται υπερακετυλίωση της Hsp90, οποία είναι φυσικό υπόστρωμα και ρυθμιστής της HDAC6, και οδηγεί στην αποσύνδεσή της από την συν- συνοδό p23 και στην απώλεια δραστηριότητας της συνοδού. Κατά συνέπεια, αυτό εμποδίζει την ωρίμανση του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών (GR), επηρεάζοντας την πρόσδεση του συνδέτη, την πυρηνική μετατόπιση και την μεταγραφική ενεργοποίηση. Ομοίως, knockdown της HDAC6 σε κύτταρα του καρκίνου του προστάτη οδηγεί επίσης στην υπερακετυλίωση του Hsp90, οπότε και στον εξασθενημένο, ανεξάρτητο από στεροειδή, πυρηνικό εντοπισμό του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και την επακόλουθη αναστολή της έκφρασης αντιγόνου ειδικού για τον προστάτη και την κυτταρική ανάπτυξη. Αυτό δείχνει ότι η HDAC6 επηρεάζει τη μεταγραφική δραστηριότητα άλλων πρωτεϊνών- υποστρωμάτων με ρύθμιση της Hsp90. Όσον αφορά την συσχέτισή της HDAC6 με τον παράγοντα HSF1, έχει βρεθεί ότι η δέσμευσή της σε ουβικουιτιλιωμένες πρωτεΐνες μπορεί να επιτρέψει την ενεργοποίηση του παράγοντα HSF1 και συνεπώς την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις HSP πρωτεΐνες. Σύμφωνα με αυτή τη λογική, φάρμακα τα οποία θα μπορούν να στοχεύουν την αυτοτελή δομική περιοχή ουβικουιτίνης της HDAC6 μπορούν να μειώσουν η ακόμα και να αποτρέψουν την συσσώρευση των HSPs σε καρκινικά κύτταρα. Γνωρίζουμε πολύ λίγα για τη μοριακή βάση της αναγνώρισης πρωτεΐνη- υποστρώματος από την Hsp90, γεγονός που βρίσκεται σε αξιοσημείωτη αντίθεση με άλλες μοριακές συνοδούς. Ωστόσο, λόγω της τεράστιας ποικιλίας πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά η Hsp90 προκύπτει η υπόθεση πως δεν υπάρχει κάποιο καθορισμένο μοτίβο αναγνώρισης. Παρόλο που σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση υποστρωμάτων πιθανά έχουν οι πρωτεΐνες που συλλειτουργούν με την Hsp90 (συν- τσαπερόνες), χρειάζεται να διερευνηθεί περισσότερο η εγγενής ικανότητα της Hsp90 να δημιουργεί την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης- πρωτεΐνης. Με αυτό τον τρόπο μπορεί να προκύψουν περισσότερα συμπεράσματα σχετικά με τα υποστρώματα με τα οποία σχετίζεται πιο πολύ, καθώς και περισσότερες δυνατότητες λειτουργίας της. Ο τρόπος με τον οποίο το Hsp90 μπορεί να ρυθμίζει τη φαινοτυπική παραλλαγή, το πώς ένας συγκεκριμένος ζωντανός οργανισμός είναι σε θέση να εξελιχθεί αφού εντοπίσει και εκτιμήσει τους σωστούς παράγοντες μέσα σε ένα περιβάλλον καταπόνησης ή πώς το Hsp90 είναι σε θέση να έχει τη βέλτιστη αντίδραση σε ένα συγκεκριμένο στρες δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Η διευκρίνηση όλων των παραπάνω θα οδηγήσει σε νέες έρευνες σχετικές με γενετική και επιγενετική. Έχει παρατηρηθεί ότι η παρατεταμένη θεραπεία με αναστολείς Hsp90 όχι μόνο μπορεί να οδηγήσει στην ανθεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων προς τα συγκεκριμένα φάρμακα, αλλά και σε άλλους δομικά όμοιους αναστολείς της Hsp90. Βέβαια, παρατηρήθηκε ότι αυτή η ανθεκτικότητα μπορεί να εμποδιστεί με τη χρήση αναστολέων HDAC, κάτι που υποστηρίζει την ιδέα της συνδυασμένης χρήσης αναστολέων Hsp90 και HDAC για θεραπεία. Για να εκτιμηθεί, ωστόσο, καλύτερα η χρησιμότητα των επιγενετικών φαρμάκων, απαιτείται ακόμη καλύτερη κατανόηση των ακριβών επιγενετικών μηχανισμών και ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στην ιδιαιτερότητα και τους μηχανισμούς δράσης των φαρμάκων, παράλληλα με το χρονικό περιθώριο για θεραπεία.