ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΜΠΕΛΟΥΡΓΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΜΠΕΛΟΥΡΓΙΑΣ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΟ ΠΡΟΦΙΛ ΟΡΙΣΜΕΝΩΝ ΕΛΛΗΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΞΕΝΙΚΩΝ ΟΙΝΟΠΟΙΗΣΙΜΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΓΙΑΝΝΟΣ ΣΤΕΡΓΙΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΣΟΥΦΛΕΡΟΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στα πλαίσια της προσπάθειας, για µια ευρύτερη γνωριµία µε το πρωτεϊνικό δυναµικό ορισµένων ελληνικών οινοποιήσιµων ποικιλιών και σύγκρισή τους µε αντίστοιχες ξενικές, αναλύθηκαν 16 γλεύκη λευκών ποικιλιών από διάφορες αµπελουργικές περιοχές της Ελλάδας. Η ανάλυση των δειγµάτων γλεύκους για τον προσδιορισµό του πρωτεϊνικού τους προφίλ πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση της SDS - PAGE ηλεκτροφόρησης, όπου χρησιµοποιείται µια πηκτή πολυακρυλαµιδίου ως µέσο υποστήριξης και SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ως µέσο αποδόµησης των πρωτεϊνών. Αρχικά έγινε αξιολόγηση της µεθόδου (ηλεκτροφόρηση) και ειδικότερα στο σηµείο που σχετίζεται µε την αποµόνωση των πρωτεϊνών από τα διάφορα γλεύκη. Εξετάστηκαν τρείς µέθοδοι αποµόνωσης, η καταβύθιση µε αιθανόλη, η λυοφιλίωση µετά από καταβύθιση µε θειικό αµµώνιο και η συµπύκνωση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου µετά από διήθηση σε µεµβράνες διαχωρισµού, µε την τελευταία να επιλέγεται ως πιο εύχρηστη και πιο αξιόπιστη. Στη συνέχεια, χρησιµοποιήθηκε η τροποποιηµένη µέθοδος Bradford για να υπολογιστεί η συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνών στο γλεύκος των διαφόρων ποικιλιών. Το πρωτεϊνικό άζωτο κυµάνθηκε από 4,58 25,02 mg/l για το γλεύκος από τους συµβατικούς αµπελώνες και από 7,08-18,4 mg/l για το γλεύκος από τους αντίστοιχους βιολογικούς. Τέλος, µετά από ηλεκτροφόρηση, επετεύχθη η κατανοµή των πρωτεϊνών του γλεύκους σε διάφορες ζώνες. Το µεγαλύτερο µέρος των πρωτεϊνών εντοπίστηκε στην περιοχή των µικρών έως µέσων ΜΒ, οι οποίες φαίνεται να είναι υπεύθυνες για το πρόβληµα που εµφανίζεται σε λευκούς οίνους και γλεύκη, γνωστό ως πρωτεϊνικό θόλωµα. 2

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θεωρώ υποχρέωση και ευχαρίστησή µου να εκφράσω τις ειλικρινείς ευχαριστίες µου στον επιβλέποντα της µεταπτυχιακής µου διατριβής Καθηγητή Dr.Ing. Ευάγγελο Σουφλερό για την συνεχή καθοδήγηση και την αµέριστη συµπαράσταση του κατά τη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια ιδάκτορα κ. Μπουλούµπαση Ελισάβετ για την πολύτιµη βοήθεια που µου προσέφερε µε την εµπειρία της στα πλαίσια της συνεργασίας µας για την ολοκλήρωση της παρούσης εργασίας. Ευχαριστώ θερµά τους καθηγητές µου, κατά τη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών, κ. ηµήτριο Σταύρακα, κ. Νικολάου Νικόλαο, κυρία Ζιώζιου Ελευθερία, κ. Κουνδουρά Στέφανο και κυρία Αληχανίδου Άννα για τις πολύτιµες γνώσεις που µου προσέφεραν καθώς και την καθηγήτρια κ. Βαφοπούλου Άννα για τις πολύτιµες υποδείξεις της. Εκφράζω τέλος τις ευχαριστίες µου στα µέλη της οικογένειάς µου, την σύζυγο και την νεογέννητη κόρη µου, για την αγάπη τους και για τις θυσίες στις οποίες υποβλήθηκαν κατά την διάρκεια των σπουδών µου. 3

4 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη Ευχαριστίες Περιεχόµενα Περιεχόµενα Πίνακες Περιεχόµενα Εικόνες Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 1.1. Το γλεύκος (µούστος) Γλευκοποίηση Γλεύκος, Οίνος και Πρωτεΐνες Σκοπός της εργασίας 4 Κεφάλαιο 2 Ανασκόπηση Βιβλιογραφίας 2.1 Αµινοξέα Πεπτίδια Πρωτεΐνες Πρωτεϊνικό Θόλωµα σε Λευκούς Οίνους και Γλεύκη ιαδικασίες πρόληψης και αντιµετώπισης του πρωτεϊνικού θολώµατος Μέθοδοι πρόληψης πρωτεϊνικού θολώµατος Χρησιµοποίηση µπεντονίτη Ιδιότητες του µπεντονίτη Μειονεκτήµατα µπεντονίτη Χρήση µαννοπρωτεϊνών κυτταρικού τοιχώµατος ζυµών Η ηλεκτροφόρηση ως µέθοδος προσδιορισµού πρωτεϊνών Γενικά περί ηλεκτροφόρησης Προετοιµασία δείγµατος 31 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι 3.1. είγµατα σταφυλιών Προετοιµασία δειγµάτων Περιγραφή µεθόδων αποµόνωσης είγµατα που χρησιµοποιήθηκαν για την επιλογή µεθόδου αποµόνωσης των πρωτεϊνών Μεθοδολογία Υπολογισµός βασικών οινολογικών χαρακτηριστικών Προσδιορισµός υναµικού Αλκοολοµετρικού Τίτλου ( ΑΤ) Προσδιορισµός οξύτητας και ΡΗ Προσδιορισµός διαλυτών πρωτεινών ιαλύµατα Μέθοδος ιερεύνηση πρωτεϊνικού προφίλ του γλεύκους 43 5

6 SDS PAGΕ (SDS PolyAcrylamideGelElectrophoresis) Χρώση της πηκτής µε χρωστική Coomasie Blue Χρώση της πηκτής µε Νιτρικό Άργυρο (Silver Stain) 45 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα Συζήτηση 4.1. Επιλογή µεθόδου αποµόνωσης των πρωτεϊνών Συζήτηση Συµπεράσµατα ιερεύνηση πρωτεϊνικού προφίλ ελληνικών και ξενικών οινοποιήσιµων ποικιλιών Συγκέντρωση διαλυτών πρωτεϊνών στο γλεύκος ιερεύνηση πρωτεϊνικού προφίλ και κατανοµή των µοριακών βαρών ανα ποικιλία Σύγκριση µεταξύ διαφορετικών µεθόδων χρώσης (Coomassie Blue και νιτρικός άργυρος) 61 Κεφάλαιο 5 Συµπεράσµατα 5.1 Συµπεράσµατα 65 Κεφάλαιο 6 Βιβλιογραφία 69 6

7 ΠΙΝΑΚΕΣ Πίνακας 3.1.1: Βασικά οινολογικά χαρακτηριστικά (σάκχαρα, οξύτητα, ph), και προέλευση των γλευκών των ποικιλιών που χρησιµοποιήθηκαν για την ανίχνευση του πρωτεϊνικού τους προφίλ. Πίνακας 3.2.2: Συγκέντρωση διαλυτών πρωτεϊνών σε σχέση µε το είδος της µεθόδου διαχωρισµού Πίνακας 4.2.1: Συγκέντρωση διαλυτών πρωτεϊνών ανάλογα µε την ποικιλία, την ηµεροµηνία συλλογής και την εφαρµοζόµενη καλλιεργητική πρακτική. Πίνακας 4.2.2: Συγκέντρωση διαλυτών πρωτεϊνών διάφορων ξενικών ποικιλιών Πίνακας 4.2.3: Πρωτεϊνικές ζώνες σε γλεύκος της ποικιλίας Sauvignon Blanc Πίνακας 4.2.4: Πρωτεινικές ζώνες σε γλεύκη διαφόρων ελληνικών και ξενικών οινοποιήσιµων ποικιλιών 7

8 ΕΙΚΟΝΕΣ Εικόνα 3.4.1: Πρότυπη καµπύλη αναφοράς που προήλθε από το µέσο όρο έξι διαδοχικών µετρήσεων απορρόφησης διαλύµατος ορού αλβουµίνης σε µήκος κύµατος 595 nm µετά από 30min Εικόνα 3.4.2: Πρότυπη καµπύλη αναφοράς που προήλθε από το µέσο όρο έξι διαδοχικών µετρήσεωναπορρόφησης διαλύµατος ορού αλβουµίνης σε µήκος κύµατος 595 nm µετά από 45min Εικόνα 4.1.1: Ηλεκτρογράφηµα του δείγµατος 1 ( 1) που έχει επεξεργαστεί µε διάφορες µεθόδους προκειµένου να αποµονωθούν οι πρωτεΐνες του (Από αριστερά προς δεξιά, Α ): Με 70% θειικό αµµώνιο, µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου, απευθείας λυοφιλίωση, αµεταχείριστο δείγµα, µε αιθυλική αλκοόλη και standard διάλυµα Εικόνα 4.1.2: Ηλεκτρογράφηµα του δείγµατος 2 ( 2) που έχει επεξεργαστεί µε διάφορες µεθόδους προκειµένου να αποµονωθούν οι πρωτεΐνες του (Από αριστερά προς δεξιά, Α ): Με 50%, 60% και 70% θειικό αµµώνιο, µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου, απ ευθείας λυοφιλίωση, αµεταχείριστο δείγµα, µε αιθυλική αλκοόλη και standard διάλυµα Εικόνα 4.1.3: Συγκριτικό ηλεκτρογράφηµα όλων των δειγµάτων µετά από µεταχείριση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου (Από αριστερά προς δεξιά, Α ): Standard διάλυµα, είγµα 5 µε αραίωση 20/80 (δείγµα/νερό), είγµα 6 (100%), είγµα 4 (50/50), είγµα 1 (100%), είγµα 2 (100%), είγµα 3 (100%) Εικόνα 4.2.1: Ηλεκτρογράφηµα δειγµάτων γλεύκους από την ποικιλία Sauvignon Blanc µετά από χρώση µε χρωστική Coomassie Βlue Εικόνα 4.2.2: Ηλεκτρογράφηµα δειγµάτων γλεύκους από την ποικιλία Sauvignon Blanc µετά από χρώση µε νιτρικό άργυρο (Silver Stain) Εικόνα 4.2.1: Ηλεκτρογράφηµα δειγµάτων γλεύκους από την ποικιλία Sauvignon Blanc µετά από χρώση µε χρωστική Coomassie Βlue Εικόνα 4.2.2: Ηλεκτρογράφηµα δειγµάτων γλεύκους από την ποικιλία Sauvignon Blanc µετά από χρώση µε νιτρικό άργυρο (Silver Stain) 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 9

10 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Το γλεύκος (µούστος) Το γλεύκος είναι το υγρό προϊόν σύνθλιψης των καρπών της αµπέλου. Παίρνει το χρώµα του από τις χρωστικές ουσίες του φλοιού των σταφυλιών, οπότε µπορεί να είναι λευκωπός έως ερυθρός, µε υψηλή περιεκτικότητα σε σάκχαρα. Χρησιµοποιείται για την παραγωγή διαφόρων προϊόντων, όπως του οίνου, µετά από αλκοολική ζύµωση, καθώς και παραδοσιακών προϊόντων όπως το πετιµέζι, η µουσταλευριά και το µουστοκούλουρο ( 1.2 Γλευκοποίηση Μετά τον τρύγο τα σταφύλια πρέπει να µεταφερθούν χωρίς καθυστέρηση στο "πατητήρι", όπου θα εξαχθεί το γλεύκος από τις ράγες. Η έκθλιψη του γλεύκους µπορεί να γίνει µε διάφορες µεθόδους. Το παραδοσιακό πατητήρι, όπου τα σταφύλια πατιούνται κυριολεκτικά από τους τρυγητές σχεδόν δεν χρησιµοποιείται πλέον. Τη θέση του έχουν καταλάβει διάφορα µηχανήµατα (θλιπτήρια- απορραγιστήρια) χειροκίνητα ή ηλεκτρικά, που συνήθως λειτουργούν συνθλίβοντας το σταφύλι ανάµεσα σε περιστρεφόµενους κυλίνδρους. Υπάρχουν µηχανήµατα (πιεστήρια) τα οποία, προκειµένου να παραχθεί λευκός οίνος, διαχωρίζουν αυτόµατα το χυµό από τα στερεά συστατικά της ράγας. Για τον ερυθρό οίνο δεν χρειάζεται, παρά µόνο πολύ αργότερα, να γίνει αυτός ο διαχωρισµός -σε πρώτο στάδιο παίρνουµε το γλεύκος µαζί µε τα στερεά συστατικά, δηλαδή ολόκληρο το σταφυλοπολτό. Αυτό που είναι πάντα επιβεβληµένο τόσο στη λευκή, όσο και στην ερυθρή οινοποίηση, είναι η αφαίρεση των βοστρύχων (αποβοστρύχωση), καθ' ότι αυτά είναι επιζήµια τόσο για τη γεύση του κρασιού, όσο και για την υγεία του καταναλωτή ( 1.3 Γλεύκος, Οίνος και Πρωτεΐνες 10

11 Η µελέτη των πρωτεϊνών στο γλεύκος αλλά και στον προκύπτοντα, µετά την αλκοολική ζύµωση αυτού, οίνο παρουσιάζει µεγάλο οινολογικό ενδιαφέρον λόγω ενός προβλήµατος που σχετίζεται άµεσα µε αυτές και αφορά στη δηµιουργία θολώµατος και ιζήµατος στους τελειωµένους οίνους. Εκτός αυτού του προβλήµατος όµως, οι πρωτεΐνες παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ποιότητα των οίνων. Είναι υπεύθυνες για την αίσθηση του σώµατος και επειδή ενώνονται µε πτητικές ενώσεις συµβάλλουν στην διατήρηση της έντασης του αρώµατος των. Τέλος επηρεάζουν θετικά την σταθερότητα του αφρού στους αφρώδεις οίνους (ROBILLARD et al., 1993). Η φύση και η περιεκτικότητα των πρωτεϊνών στους οίνους φαίνεται να εξαρτάται αρχικά από την ποσότητα τους στο αρχικό γλεύκος, την ποικιλία, τις περιβαλλοντικές συνθήκες, και στη συνέχεια, από τις συνθήκες οινοποίησης (YOKOTSUKA et al.,1977). Είναι φανερό ότι υπάρχει µεγάλο εύρος σε συνολικό περιεχόµενο πρωτεϊνών που βρέθηκε ανάµεσα σε οίνους που προήλθαν από διαφορετικές ποικιλίες ή από την ίδια ποικιλία, όταν καλλιεργείται σε διαφορετικές περιοχές ή εποχές. Αυτή η ποικιλοµορφία οφείλεται σε παράγοντες που επηρεάζουν το συνολικό άζωτο στα σταφύλια σχετίζονται µε την ποικιλία, το κλίµα αλλά και το έδαφος του εκάστοτε αµπελώνα (BAYLY et al., 1967). Άλλοι ερευνητές θεωρούν πως και ο βαθµός ωρίµανσης επηρεάζει την συγκέντρωση πρωτεϊνών στο γλεύκος (MURPHEY, 1989b; SINGLETON, 1974). Γενικά, η ποσότητα των πρωτεϊνών αυξάνει όσο ο καρπός ωριµάζει. Είναι αποδεδειγµένο ότι η σύνθεση των πρωτεϊνών αρχίζει µετά το περκασµό και βαίνει παράλληλα µε την γρήγορη αύξηση των σακχάρων στα σταφύλια. Επιπρόσθετα, τα πρωτεινικά επίπεδα είναι υψηλότερα στις θερµότερες περιοχές (ZOECKLEIN et al.,1995). Η αλκοολική ζύµωση είναι υπεύθυνη κυρίως για τη διαφορά σε πρωτεϊνικό περιεχόµενο ανάµεσα σε γλεύκος και οίνο. Τα χαµηλότερα επίπεδα πρωτεϊνών στον οίνο σε σχέση µε το γλεύκος οφείλονται στην υδρόλυση, καθίζηση αλλά και στην µετουσίωση αυτών λόγω αλλαγών του ρη, κατά την ζύµωση 11

12 Είναι, λοιπόν, φανερό ότι η γνώση της ποσότητας των πρωτεϊνών στο σταφύλι, το γλεύκος και τον οίνο είναι σηµαντική για τους οινοποιούς αλλά και τους παραγωγούς σταφυλοχυµών. Ιδιαίτερης σηµασίας είναι η παρουσία ασταθών διαλυτών πρωτεϊνών που µπορεί να γίνουν αδιάλυτες και να δηµιουργήσουν θολώµατα και ίζηµα. 1.4 Σκοπός της εργασίας Στην παρούσα εργασία γίνεται µελέτη των πρωτεϊνών σε γλεύκη διαφόρων ελληνικών αλλά και ξενικών οινοποιήσιµων ποικιλιών που καλλιεργούνται στον ελληνικό χώρο. Σκοπός της είναι: 1) Να µελετηθεί το αρχικό πρωτεϊνικό δυναµικό διάφορων ελληνικών και ξενικών οινοποιήσιµων ποικιλιών όσον αφορά την περιεκτικότητα τους σε πρωτεΐνες. 2) Να γίνει σύγκριση των διαφόρων ποικιλιών, µετά από διερεύνηση του πρωτεϊνικού προφίλ των ποικιλιών µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. 3) Να γίνει αξιολόγηση της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης ως µεθόδου τόσο όσον αφορά τη µέθοδο αποµόνωσης των πρωτεϊνών πριν την χρησιµοποίηση τους αλλά και όσον αφορά την σύγκριση δυο διαφορετικών µεθόδων χρώσης ηλεκτρογραφηµάτων 12

13 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 13

14 2. ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Οι κυριότερες αζωτούχες ενώσεις που απαντώνται στο γλεύκος και κατά συνέπεια στον οίνο είναι οι εξής: 2.1. Αµινοξέα Πρόκειται για χηµικές ενώσεις µε µοριακό βάρος µικρότερο των 200 Da, οι οποίες συµµετέχουν στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του οίνου (HUANG and OUGH,1989; SOUFLEROS et al., 2003). + Η βιοσύνθεση τους γίνεται µε αρχή το ανόργανο άζωτο υπό µορφή ΝΗ 4 που προέρχεται από το έδαφος και το σχηµατισµό του α-κετογλουταρικού οξέος, κατά το κύκλο του Krebs. Τα + υπόλοιπα αµινοξέα σχηµατίζονται µε µεταφορά της οµάδας ΝΗ 4 σε άλλα κετονικά οξέα. Τα αµινοξέα µε βάση τη δηµιουργία πεπτιδικών δεσµών οδηγούν στο σχηµατισµό πρωτεϊνών ( ΙΑΜΑΝΤΙ ΗΣ, 1994). Η συγκέντρωση τους στο γλεύκος µεταβάλλεται από χρονιά σε χρονιά και µπορεί να κυµαίνεται από 1-4 g/l (RIBEREAU- GAYON et al., 2000). Σύµφωνα µε τους SOUFLEROS et al. (2003), το πρόγραµµα λίπανσης που εφαρµόζεται στον αµπελώνα και οι κλιµατολογικές συνθήκες κάθε χρονιάς επηρεάζουν σηµαντικά τη συγκέντρωση των αµινοξέων στο γλεύκος. Οι OUGH and ANELLI (1979), παρατήρησαν ότι αύξηση στην αζωτούχο λίπανση του αµπελώνα είχε σαν αποτέλεσµα την αύξηση της συγκέντρωσης του αµινοξέος αργινίνη, και µείωση αυτή της προλίνης. Είναι χαρακτηριστική η αύξηση που παρατηρείται στη συγκέντρωση των αµινοξέων όταν προσεγγίζεται το στάδιο της πλήρους ωρίµανσης. Η αύξηση όµως αυτή αφενός δεν παρατηρείται στο κάθε επιµέρους αµινοξύ και αφετέρου η µέγιστη συγκέντρωση µπορεί να προσδιορίζεται πριν την πλήρη ωρίµανση, όπως συµβαίνει για το αµινοξύ αργινίνη Η οξύτητα του γλεύκους, η θερµοκρασία ζύµωσης, η συµπαραµονή στεµφύλων και 14

15 γλεύκoυς, καθώς και οι διαφορετικές τεχνικές οινοποίησης, φαίνεται να αποτελούν επίσης παράγοντες που επηρεάζουν τη συγκέντρωση των αµινοξέων στον οίνο (RIBEREAU- GAYON et al. 2000; SOUFLEROS et al. 2003). Μέχρι σήµερα έχουν προσδιοριστεί στο γλεύκος και στον οίνο τριάντα τέσσερα αµινοξέα αν και τα είκοσι µόνο από αυτά απαντώνται συχνότερα που αποτελούν και το 20-30% του ολικού αζώτου στο γλεύκος (POUX and OURNAC, 1970). Το προφίλ των αµινοξέων έχει βρεθεί ότι παραλλάσει µεταξύ των ποικιλιών. Φαίνεται ότι οι διαφορές που παρατηρούνται είναι γενετικής φύσεως, καθώς για την ίδια ποικιλία σε διαφορετικές χρονιές και υπό τις ίδιες καλλιεργητικές φροντίδες, το προφίλ των αµινοξέων παραµένει το ίδιο µε µικρές µόνο παραλλαγές ως προς τις συγκεντρώσεις των αµινοξέων (HUANG and OUGH, 1991). Οι OUGH et al. (1968), οι KLUBA et al. (1978) και οι SOUFLEROS et al. (2003), έχουν πραγµατοποιήσει έρευνες, χρησιµοποιώντας τη µέθοδο της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής πίεσης, µε σκοπό την διαφοροποίηση των ποικιλιών, µε βάση τα αµινοξέα που περιέχουν. Τα δυο πιο άφθονα αµινοξέα στον οίνο είναι η προλίνη και η αργινίνη, ενώ το χαρακτηριστικό αµινοξύ του σταφυλιού είναι το α-αµινογλουταρικό οξύ (FEUILLAT et al.,1974). Οι BENA - TZOUROU et al (1999), µελετώντας οίνους ελληνικών ποικιλιών διαπίστωσαν ότι τα επικρατέστερα αµινοξέα ήταν η γλουταµίνη, αργινίνη, αλανίνη και λυσίνη, ενώ οι BOULOUMPASI et al (2003), αναφέρουν ως επικρατέστερα αµινοξέα στους ελληνικούς ερυθρούς οίνους τη γλυκίνη, αλανίνη, αργινίνη, αιθανολαµίνη, γ- αµινο-βουτυρικό οξύ, λυσίνη και στους ελληνικούς λευκούς οίνους τη λυσίνη, αλανίνη, γλυκίνη, ασπαραγίνη, λευκίνη και αιθανολαµίνη. Τέλος, οι YOKOTSUKA et al., (1994) έχουν βρει σε ερυθρό οίνο, ότι τα πρωτεϊνικά κλάσµατα ήταν πλούσια σε συγκέντρωση όξινων αµινοξέων (ασπαρτικό, γλουταµινικό οξύ, θρεονίνη, σερίνη) 2.2. Πεπτίδια 15

16 Τα πεπτίδια προκύπτουν από την συνένωση 1-4 αµινοξέων µε πεπτιδικούς δεσµούς και έχουν ΜΒ µικρότερο από 1000 Da. Τα πεπτίδια παρουσιάζουν ενδιαφέρουσες λειτουργικές ιδιότητες και µπορεί να είναι αντιοξειδωτικοί και αντιµικροβιακοί παράγοντες ενώ έχουν ικανότητες δηµιουργίας αφρού και γαλακτωµάτων. Μπορεί να παίξουν, επίσης, σηµαντικό ρόλο στις οργανοληπτικές ιδιότητες ενός οίνου. Οι γεύσεις που φαίνεται να αποδίδονται στα πεπτίδια είναι όλων των τύπων (γλυκιά, ξινή, πικρή, αλµυρή) (DESPORTES et al., 2001). Κατά τη διάρκεια του πρώτου σταδίου της ζύµωσης, τα πεπτίδια αφοµοιώνονται από τη ζύµη µαζί µε τα ελεύθερα αµινοξέα. Στο τέλος της ζύµωσης, υπάρχει µια απελευθέρωση των ελεύθερων αµινοξέων και των µικρών πεπτιδίων από τις ζύµες στον οίνο (OUGH et aι., 1991; DIZY et al., 1996). Αυτή η διαδικασία εµφανίζεται πάλι κατά τη διάρκεια της δευτερεύουσας ζύµωσης στην περίπτωση των αφρώδων οίνων. Μετά από µια περίοδο ανάπαυσης των κυττάρων, που υπολογίζεται από τους περισσότερους ερευνητές µεταξύ 3 και 9 µηνών (FEUILLAT et al., 1982), η αυτόλυση της ζύµης αρχίζει. Κατά τη διάρκεια αυτόλυσης, λόγω της διαδοχικής δράσης των διαφορετικών πρωτεάσεων (KELLY TREADWELL et al., 1988), οι πρωτεΐνες της ζύµης υδρολύονται. Κατ' αρχήν, σχηµατίζονται τα πεπτίδια και έπειτα αυτά αποδοµούνται σε αµινοξέα. Σε αυτό το στάδιο, στο οποίο η κυτταρική µεµβράνη των ζυµών µπορεί να είναι άθικτη, τα πεπτίδια χαµηλού και µέσού ΜΒ είναι διάχυτα στον οίνο. Τα αποτελέσµατα των MORENO-ARRIBAS et al. (1996), δείχνουν ότι η απελευθέρωση και η αποδόµηση των πεπτιδίων στον οίνο, διαµέσου της δράσης των ενζύµων των ζυµών, είναι δυο φαινόµενα που συµβαίνουν ταυτόχρονα. Έτσι, εκτός από την απελευθέρωση διαφόρου µεγέθους πεπτιδίων από την δράση ενδοκυτταρικών πρωτεασών, παράλληλα συµβαίνει και απελευθέρωση εξωκυτταρικών πρωτεασών µέσα στον οίνο που υδρολύουν τα πεπτίδια. Η αυτόλυση των ζυµών προωθείται από την αύξηση της θερµοκρασίας, την προσθήκη πλασµολυτικών ενζύµων, την µηχανική µεταχείριση των ζυµών και από άλλους παράγοντες που 16

17 διευκολύνουν την ενεργοποίηση λυτικών ενζύµων από το κύτταρο. (ΒABAYAN et al., 1981) 2.3. Πρωτεΐνες Στο σταφύλι το άζωτο υφίσταται µε την αµµωνιακή και την οργανική µορφή του (αµινοξέα, πεπτίδια, πρωτεΐνες). Η σχετική ποσότητα αυτών των δύο µορφών εξελλίσεται ( κινείται ) κατά την ανάπτυξη του σταφυλιού. Κατά την ωρίµανση, µειώνεται κατά πολύ το άζωτο, κατά κύριο λόγο η αµµωνιακή του µορφή. Αυτή η ανόργανη µορφή αζώτου έρχεται συνεχώς στην ράγα και σταδιακά χρησιµοποιείται για τη σύνθεση οργανικών αζωτούχων συστατικών. Η ωρίµανση σηµατοδοτεί την έναρξη της πρωτεοσύνθεσης και της σύνθεσης αξιοσηµείωτων ποσοτήτων αµινοξέων. Τα αµινοξέα και τα πολυπεπτίδια µετακινούνται τότε διαµέσου των µεµβρανών στο εσωτερικό της ράγας όπου και σχηµατίζονται οι πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητα δοµικά και λειτουργικά συστατικά όλων των ζωντανών οργανισµών. Αυτά τα µακροµόρια, µε ΜΒ πάνω από Da, αποτελούνται από ορισµένες αλυσίδες αµινοξέων ενωµένα µεταξύ τους µε πεπτιδικούς δεσµούς. Στην ωρίµανση, οι πρωτεΐνες δεν αποτελούν παραπάνω από 3%, κατά µέσο όρο, του οργανικού αζώτου της ράγας. Ο φλοιός είναι το µέρος της ράγας που περιέχει τις περισσότερες πρωτεΐνες, 10-15% του βάρους των (RIBEREAU GAYON and PEYNAUD,1971; RIBEREAU- GAYON et al., 1971). Είναι δύσκολο να αποµονωθούν και να χαρακτηριστούν οι πρωτεΐνες, εξαιτίας της αλληλεπίδρασης τους µε φαινολικές ενώσεις και µε ένζυµα (φαινολοξειδάσες και περοξιδάσες). Κάποιες πρωτεΐνες καθιζάνουν λόγω της παρουσίας των φαινολών και των οξειδασών, ενώ άλλες αλλοιώνονται και µεταβάλλονται (HSU and HEATHERBELL, 1987a). Στα γλεύκη, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες κυµαίνεται µεταξύ 20 και 100 mg/l. Υπάρχουν όµως και περιπτώσεις γλευκών µε πολύ χαµηλή περιεκτικότητα (1mg/L) ή και πολύ υψηλή περιεκτικότητα (790 mg/l) πράγµα που και στις δυο περιπτώσεις οφείλεται στις τεχνικές διαχωρισµού και αποµόνωσης των πρωτεϊνών. 17

18 Η ποσότητα των πρωτεϊνών στο γλεύκος είναι πάντα µεγαλύτερη από ότι στον τελειωµένο οίνο. Υπάρχει µάλιστα µια γραµµική σχέση ανάµεσα στο γλεύκος και τον οίνο, όσον αφορά την συγκέντρωση των πρωτεϊνών, η οποία είναι όµως διαφορετική ανάλογα µε την ποικιλία. Έτσι, για την ίδια συγκέντρωση πρωτεϊνών στον µούστο, ένας οίνος Gewürztraminer παρουσιάζει µια συγκέντρωση υψηλότερη από ότι ένας οίνος Riesling (MURPHEY et al.,1989b). Η µείωση της συγκέντρωσης των διαλυτών πρωτεϊνών κατά την ζύµωση οφείλεται στην αποδόµησή τους, στην υδρόλυσή τους ή στην καταβύθισή τους µαζί µε φαινολικές ενώσεις ή µεταλλικά ιόντα (YOKOTSUKA et al., 1991). Επιπλέον και οι ζύµες καταναλώνουν στοιχεία του γλεύκους: σάκχαρα αλλά και πρωτεΐνες. Η ποσότητα των πρωτεϊνών αρχίζει να µειώνεται µια µέρα µετά την έναρξη της ζύµωσης (YOKOTSUKA et al, 1977), ενώ λίγες πρωτεΐνες απελευθερώνονται από τις ζύµες κατά την ζύµωση και πρόκειται κυρίως για µαννοπρωτεΐνες (LLAUBERES et al., 1987). Αντίθετα κατά την συµπαραµονή του οίνου µε τις οινολάσπες απελευθερώνονται αρκετές πρωτεΐνες µετά από αυτόλυση των ζυµών. Αυτή η συνεισφορά, όµως, αν και ευεργετική αφού οι µαννοπρωτείνες βοηθάνε στην ευκολότερη σταθεροποίηση του οίνου, δεν αρκεί για να αντισταθµίσει τις απώλειες κατά την ζύµωση (CHARPENTIER et al., 1989; FEUILLAT et al., 1989; LURTON et al., 1989) Οι διαφορές που υπάρχουν στο γλεύκος και στον οίνο, όσον αφορά στην συγκέντρωση πρωτεϊνών µπορεί να αποδοθεί τόσο σε φυσικούς όσο και σε τεχνολογικούς παράγοντες. Φυσικοί Παράγοντες: Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες µιας ποικιλίας καθορίζεται από την γενετική της σύσταση. Κάποιες ποικιλίες αµπελιού παράγουν περισσότερες πρωτεΐνες από ότι άλλες (ποικιλίες από τις οποίες παράγονται θεωρητικά πιο αρωµατικοί οίνοι). Συχνά παρατηρούνται διαφορές και ανάµεσα στην ίδια ποικιλία που παράγεται στο ίδιο µέρος αλλά διαφορετική χρονιά. ιαφορετικές κλιµατικές συνθήκες, όπως διάρκεια ηλιοφάνειας και βροχοπτώσεων, αλλά και διαφορετικά είδη και µεταχειρίσεις εδαφών είναι µερικοί από τους παράγοντες που επηρεάζουν την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες στην ίδια ποικιλία. Άλλος ένας παράγοντας, είναι οι καλλιεργητικές τεχνικές που εφαρµόζονται, και έτσι µείωση του φορτίου 18

19 οδηγεί σε αύξηση των πρωτεϊνών (OUGH and ANELLI, 1979). Στο ίδιο αποτέλεσµα οδηγεί και ο όψιµος τρύγος, όταν τα σταφύλια είναι επαρκώς ώριµα (MURPHEY et al., 1989a; 1989b) Στο γλεύκος η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες ακολουθεί µια γραµµική σχέση µε το ρη. Αυξάνει όσο αυξάνεται το ρη. Σε αυτή την περίπτωση όµως µεσολαβεί και ο παράγοντας ποικιλία αφού στο ίδιο ρη το γλεύκος από Riesling είχε περισσότερες πρωτεΐνες από ότι αυτός από Gewürztraminer (MURPHEY et al., 1989b). Και στον οίνο, παρατηρείται η ίδια αντίδραση µε το ρη. Τέλος, και η µείωση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών από το γλεύκος στον οίνο, µπορεί να συνδεθεί µε το ρη. Τεχνολογικοί παράγοντες: Η χρησιµοποίηση διαφόρων τεχνικών οινοποίησης επηρεάζει την περιεκτικότητα των πρωτεϊνών ενός γλεύκους ή ενός οίνου. Οι οίνοι που προέρχονται από πίεση είναι πιο πλούσιοι σε πρωτεΐνες από ότι ο πρόρωγος. Αυτό το φαινόµενο εξηγείται από το γεγονός ότι οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες είναι εντοπισµένες στην επιδερµίδα και τα γίγαρτα των σταφυλιών. Η ποσότητα πρωτεϊνών του γλεύκους και του οίνου συσχετίζεται µε το ποσοστό των διαλυτών στερεών µέσα στο γλεύκος. Έναντι µιας άµεσης πίεσης, µια φάση προενζυµατικής εκχύλισης της σοδειάς συνοδεύεται από έναν εµπλουτισµό του γλεύκους σε πρωτεΐνες, των οποίων η συγκέντρωση µπορεί να διπλασιαστεί. Μπορεί επίσης να εµφανιστεί και µια καινούργια ζώνη, γεγονός που παρατηρήθηκε σε γλεύκη που προήλθαν από τις ποικιλίες Sauvignon Blanc και Semillon, όπου εµφανίστηκε µια νέα ζώνη των 10 kda (PAETZOLD et al.1990). Κατά τη διάρκεια εκχύλισης, η περιεκτικότητα των πρωτεϊνών αυξάνεται κυρίως στις πρώτες δέκα ώρες. Στην περίπτωση µιας άµεσης πίεσης, το γλεύκος που προέρχεται από σταφυλές οι οποίες έχουν αποβοστρυχωθεί, περιέχει πολύ περισσότερες πρωτεΐνες από αυτό που προέρχεται από ολόκληρες, άθικτες σταφυλές (DUBOURDIEU et al.,1988; PAETZOLD et al.,1990). Μάλλον οι ταννίνες των ποδίσκων και των βοστρύχων έχουν µια συγκεκριµένη ικανότητα να διορθώνουν (καταβυθίζουν) τις πρωτεΐνες στο γλεύκος κατά τη πίεση των σταφυλιών (DULAU et al., 1990). Με τον ίδιο τρόπο, τα γλεύκη που προήλθαν από µηχανική συγκοµιδή σταφυλιών είναι πλουσιότερα σε πρωτεΐνες, πράγµα που αποτελεί έναν σηµαντικό παράγοντα της πρωτεϊνικής αστάθειας των 19

20 λευκών οίνων, ορισµένου τύπου αµπέλων. Οι τεχνικές που ευνοούν την θραύση του φλοιού ή που αυξάνουν το χρόνο της επαφής µεταξύ των στερεών µερών και του χυµού, οδηγούν σε µια αύξηση στο περιεχόµενο των πρωτεϊνών των γλευκών. Η ποσότητα του SO 2, επίσης, επηρεάζει την τελική πρωτεϊνική συγκέντρωση. Η απουσία επεξεργασίας µε SO 2 προκαλεί µια µείωση 79% της ποσότητας πρωτεϊνών σε γλεύκος Riesling, σε σχέση µε το ίδιο γλεύκος θειωµένο (FLORES et al., 1988). Η δράση του SO 2 είναι διπλή. Θείωση, ακόµη και µε χαµηλή δόση ευνοεί αφ' ενός κατά τη διάρκεια της εκχύλισης την εξαγωγή των πρωτεϊνών των στερεών µερών (PAETZOLD et al., 1990) και αφετέρου καθιστά πιθανό να εµποδιστεί η δράση ενός ένζυµου, της πολυφαινολοξειδάσης (PPO), η οποία κατακρηµνίζει τις πρωτεΐνες αφού βοηθάει στην δηµιουργία συµπλόκων µε τις πολυµερισµένες φαινολικές ενώσεις (FLORES et al.,1988; MATHEIS et al.,1984). Φύση και χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών του γλεύκους και του οίνου : Μια πρωτεΐνη αποτελείται από µια γραµµική ακολουθία αµινοξέων. Όταν υπάρχουν λιγότερο από δέκα αµινοξέα, µιλάει κανείς για τα πεπτίδια, έπειτα για πολυπεπτίδια και πρωτεΐνες. Ο αριθµός των αµινοξέων και η σειρά της ακολουθίας τους χαρακτηρίζουν κάθε πρωτεΐνη. Στην πράξη, συνήθως εξετάζεται η µοριακή µάζα της πρωτεΐνης, της οποίας η µονάδα είναι το Dalton (Da). Μια πρωτεΐνη είναι επίσης ένα ηλεκτρικά φορτισµένο µόριο, το φορτίο του οποίου ποικίλλει ανάλογα µε το ph του γλεύκους και του οίνου. Το φορτίο καθορίζεται από το ισοηλεκτρικό σηµείο ή το phi, το οποίο αντιστοιχεί στο ph στο οποίο η πρωτεΐνη είναι ηλεκτρικά ουδέτερη. Το ισοηλεκτρικό σηµείο καθιστά πιθανό να καθοριστεί το φορτίο της πρωτεΐνης. Πράγµατι, σε ένα ph πιο όξινο από phi της, η πρωτεΐνη φορτίζεται θετικά. Αντιθέτως, σε ένα ph υψηλότερο από το phi της, φορτίζεται αρνητικά. Το φορτίο µιας πρωτεΐνης είναι χρήσιµο σε πρακτικές όπως η προσθήκη µπεντονίτη. Πράγµατι, οι µπεντονίτες είναι φορτισµένοι αρνητικά και έτσι οι θετικά φορτισµένες πρωτεΐνες, στο περιβάλλον του µούστου ή του οίνου, προσροφώνται στην επιφάνεια του και καταβυθίζονται. Χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών: Το προφίλ των µοριακών βαρών των πρωτεϊνών του 20

21 σταφυλιού είναι ευρύ, µεταξύ 11 και 190 kda. Εντούτοις, η πολύ µεγάλη πλειοψηφία των πρωτεϊνών έχει ενδιάµεσες τιµές ΜΒ, µεταξύ 20 και 70 kda (HSU et al., 1987a; LAMllKANRA et al., 1987; TESNIERE et al., 1992). Στα γλεύκη και τους οίνους, ελάχιστες είναι οι πρωτεΐνες µε µεγάλα ΜΒ. Μόνο πολύ σπάνια υπερβαίνουν τα 100 kda (MESROB et al., 1983). Οι περισσότερες πρωτεΐνες του οίνου έχουν ΜΒ που κυµαίνεται µεταξύ 20 και 35 kda (BRISSONNET et al., 1983; CORREA et al., 1988; DORRESTEIN et al., 1995; DUBOURDIEU et al., 1988; GONZALEZ-LARA et al., 1991; HSU and HEATHERBELL 1987a & 1987b,;HSU et al., 1987; YOKOTSUKA et al., 1991). Στο γλεύκος, η επικρατούσα ζώνη είναι σχεδόν ίδια: από 15 έως 25 kda (CORREA et al., 1988; YOKOTSUKA et al., 1991). Μια πρωτεΐνη 28 kda προσδιορίστηκε σε διάφορα γλεύκη και οίνους των ποικιλιών Chardonnay και Verdeca, η οποία θα µπορούσε να αντιπροσωπεύσει µέχρι 60% των συνολικών πρωτεϊνών (SANTORO, 1995). Η συνολική σύνθεση των αµινοξέων των πρωτεϊνών των γλευκών είναι σχετικά σταθερή από µια ποικιλία αµπέλου σε άλλη. Γλεύκη από 14 διαφορετικές ποικιλίες αµπέλου παρουσίασαν µεγάλη οµοιογένεια ως προς τη σχετική συγκέντρωση αµινοξέων (TESNIERE and ROBIN, 1992). εν συµβαίνει όµως το ίδιο όσον αφορά στα διάφορα πρωτεϊνικά κλάσµατα στον οίνο ή σε έναν γλεύκος. Τα phi των πρωτεϊνών του γλεύκους συγκεντρώνονται ανάµεσα στο 2,5 και 11. Στον οίνο η ψαλίδα των phi των πρωτεϊνών είναι µικρότερη, επί το πλείστον, από 3,5-6.0, δηλαδή µεγαλύτερο από το ρη του οίνου και εποµένως οι πρωτεΐνες είναι φορτισµένες θετικά. Επίδραση των περιβαλλοντικών παραγόντων: Ερευνητές πραγµατοποίησαν τα ηλεκτροφορητικά προφίλ 17 γλευκών που προήλθαν από έξι διαφορετικές ποικιλίες αµπέλου και από διαφορετική γεωγραφική προέλευση. Χρησιµοποιώντας στατιστικά εργαλεία, συνήγαγαν ότι από τα ηλεκτροφορητικά προφίλ είναι πιθανό να αναγνωριστεί ικανοποιητικά µια ποικιλία (GONZALEZ-LARA et al., 1989). Το προφίλ των µοριακών µαζών των πρωτεϊνών µπορεί να ποικίλλει ελαφρώς ανάλογα µε τα έτη, αλλά οι κύριες οµάδες των πρωτεϊνών είναι παρούσες από το ένα έτος στο άλλο (BAYLY 21

22 and BERG, 1967). Αφ' ετέρου, η γεωγραφική προέλευση έχει µικρή επιρροή στα πρωτεϊνικά προφίλ (DAWES et al., 1994). Κατά συνέπεια, οι οίνοι που προέρχονται από την ίδια ποικιλία αµπέλου αλλά από διαφορετικές περιοχές, παρουσιάζουν παρόµοια ηλεκτροφορητικά προφίλ (DAMODARAN, KINSELLA,1980; GONZALEZ-LARA et al., 1989; PUEYO et al 1993). Επιπρόσθετα, οι διαφορές στους βαθµούς ωριµότητας του σταφυλιού οδηγούν σε διαφορετικά ηλεκτροφορητικά προφίλ. Το µεγαλύτερο µέρος των πρωτεϊνών σε οίνους από σταφύλια Gewurztraminer λιγότερο ώριµα βρίσκεται στην περιοχή των µικρών ΜΒ (13 και kda). Οι οίνοι ως αποτέλεσµα πιο ώριµων σταφυλιών περιέχουν περισσότερες πρωτεΐνες µε ΜΒ 35 και 40 kda. Αφ' ετέρου, πρωτεΐνες υψηλότερων ΜΒ (61.63 και kda) δεν φαίνεται να επηρεάζονται από τη διαφορά στο βαθµό ωριµότητας. Παρόµοια αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν επίσης σε οίνους Riesling (MURPHEY et al 1989a; 1989b). Έδειξαν ότι αυξάνει η περιεκτικότητα σε διαλυτές πρωτεΐνες όσο αυξάνει η ωριµότητα της σταφυλής, τόσο για την ποικιλία Gewurztraminer όσο και για την Riesling. Επίσης, υπάρχει η τάση να µειώνονται οι πρωτεΐνες κατά την αλκοολική ζύµωση (πιο έντονα στην Riesling). Η απώλεια σε πρωτεΐνες γίνεται συνάρτηση του ρη του οίνου, δηλαδή αυξάνει όσο αυξάνει το ρη. Πάντως, ανεξάρτητα από την ωριµότητα, στους οίνους από Gewurztraminer βρέθηκαν έξι πρωτεϊνικά κλάσµατα µε ΜΒ από kda µε το πιο ώριµο από τα δείγµατα να παρουσιάζει µια επιπρόσθετη ζώνη των 41.2 kda, απούσα από τα υπόλοιπα λιγότερο ώριµα δείγµατα. Σε οίνους από Riesling ανιχνεύθηκαν 4-7 κλάσµατα (ανάλογα µε την ωριµότητα της πρώτης ύλης) µε ΜΒ που κυµαινόταν από kda. Αντίστοιχα, η Gewurztraminer περιείχε 8-10 πρωτεϊνικά κλάσµατα µε τα ισοηλεκτρικά τους σηµεία να κυµαίνονται από 8.5-3,1 ενώ στην Riesling ανιχνεύθηκαν 6-9 πρωτεΐνες µε ισοηλεκτρικά σηµεία από Οι οίνοι και από τις δυο ποικιλίες είχαν κλάσµατα πρωτεϊνών µε ισοηλεκτρικά σηµεία ίσα ή µικρότερα από το pη του οίνου πράγµα που σηµαίνει ότι αυτές οι πρωτεΐνες είναι και πιο δύσκολο να αποµακρυνθούν µετά από προσθήκη µπεντονίτη. Η δυσκολία αυτή αυξάνει όσο το pη του οίνου αυξάνει µε την αύξηση της ωριµότητας των σταφυλιών. 22

23 ιαφορές Γλεύκους - Οίνου: Γενικά, παρατηρούνται περισσότερες ζώνες σε ένα προφίλ οίνου απ'ότι ενός γλεύκους. Για να εξηγηθούν αυτές οι διαφορές, µελετήθηκαν οι µεταβολές των πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια των ζυµώσεων (αλκοολικής και µηλογαλακτικής). Μεταξύ ενός γλεύκους και του αντίστοιχου οίνου, ορισµένες ζώνες µπορεί να είναι εντονότερες, λιγότερο έντονες, να εµφανιστούν ή να εξαφανιστούν (BAYLY, BERG,1967; SANTORO, 1995). Πολλά πρωτεϊνικά κλάσµατα του σταφυλιού και του οίνου είναι του ίδιου ΜΒ, αλλά παρουσιάζουν διαφορετικό phi. Αλλαγές συµβαίνουν επίσης στην πρωτεϊνική διαµόρφωση κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης (LAMIKANRA, INYANG, 1988). Υπάρχουν µόνο λίγες διαφορές µεταξύ των όξινων πρωτεϊνών µεταξύ του µούστου και του οίνου Αντίθετα, παρατηρείται µια µείωση ή ακόµη και µια εξαφάνιση των βασικών πρωτεϊνών στον οίνο (SANTORO, 1995). Κατά την διάρκεια της µετατροπής του γλεύκους σε οίνο, µειώνεται τόσο η ποσότητα των πρωτεϊνών, όσο και τα µεγάλου ΜΒ κλάσµατα ενώ αντίθετα, αυξάνονται τα µικρού ΜΒ κλάσµατα. Αυτό παγιώνει την υπόθεση της πρωτεϊνικής υδρόλυσης από τις εξωκυτταρικές πρωτεάσες των ζυµών κατά τη διάρκεια της ζύµωσης (FEUILLAΤ et al., 1980). Είναι επίσης πιθανότατα κλάσµατα υψηλού ΜΒ να µετουσιώνονται (HSU and HEATHERBELL, 1987a). Η γλυκοπρωτεινική φύση του γλεύκους και του οίνου: Στις διάφορες έρευνες, ο αριθµός των γλυκοπρωτεινών φαίνεται να είναι αµφιλεγόµενος. Μόνο δύο και τρία κλάσµατα γλυκοπρωτεινών εντοπιστήκαν σε οίνους από Riesling και Gewurztraminer αντίστοιχα (HSU and HEATHERBELL, 1987b). Αφ' ετέρου, έξι κύριες γλυκοπρωτεινες και πολλές δευτερεύουσες εντοπίστηκαν σε οίνο από Chardonnay. Τουλάχιστον δύο από σηµαντικές γλυκοπρωτείνες προέρχονται απευθείας από τη σάρκα του σταφυλιού χωρίς τροποποιήσεις (MARCHAL, 1995). Για άλλους ερευνητές, όλες οι πρωτεΐνες του γλεύκους και η πλειοψηφία των πρωτεϊνών του οίνου είναι γλυκοπρωτείνες (YOKOTSUKA et al., 1991). Κατά τον ίδιο τρόπο, η σηµασία της γλυκοσυλίωσης των πρωτεϊνών ποικίλλει. Για ορισµένους, η ποσότητα του σακχάρου κυµαίνεται µόνο από 5 σε 11%, ανάλογα µε το κλάσµα, του ξηρού βάρους των γλυκοπρωτεινών, ενώ για άλλους, το γλυκιδικό µέρος κυµαίνεται µεταξύ 8 23

24 και 24 %, και αποτελείται κυρίως από γλυκόζη και ετεροζίδια (PAETZOLD et al., 1990). Η αφθονία σε θρεονίνη και σε σερίνη των πρωτεϊνών είναι ένας δείκτης υπέρ της γλυκοσυλίωσής τους, διότι αυτά τα δύο αµινοξέα είναι τα σηµεία δεσµών των πρωτεϊνών µε τους πολυσακχαρίτες (BRILLOUET et al., 1991; YOKOTSUKA et al., 1994). Η παρουσία σακχάρων δεµένων πάνω σε µια πρωτεΐνη της δίνει διαφορετικές ιδιότητες. Οι γλυκοπρωτείνες είναι πιο ανθεκτικές στην πρωτεόλυση (WATERS et al., 1992). Τα γλυκίδια είναι γενικότερα πολύ πιο υδρόφιλα από τις πρωτεΐνες και έτσι η γλυκοπρωτείνη έχει δύο πόλους: έναν υδρόφιλο και έναν µάλλον υδρόφοβο. Οι γλυκοπρωτείνες επηρεάζουν τους οίνους ποιοτικά: Στην διατήρηση της σταθερότητας, την ποιότητα αφρού και την αρωµατική αντίληψη. Επίδραση των πρωτεϊνών στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του οίνου: Οι κολλοειδείς ουσίες πρέπει να είναι παρούσες διότι έχουν µια θετική επιρροή στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του οίνου αφού ενισχύουν τον όγκο και τη δοµή, βοηθούν στη δηµιουργία των αρωµατικών ενώσεων και συνεισφέρουν στην δηµιουργία καλής ποιότητας αφρού στους αφρώδεις οίνους. Οι πρωτεΐνες µπορούν να σχηµατίσουν αρωµατικά µόρια και έτσι να µεταβάλλουν την αρωµατική αντίληψη. Οι πρωτεΐνες στη φυσική τους µορφή είναι αναδιπλωµένες σε τρισδιάστατες δοµές που µεταξύ τους σταθεροποιούνται µε υδροφοβικούς δεσµούς Οι υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών παίζουν σηµαντικό ρόλο στο επίπεδο των αλληλεπιδράσεων µε άπολα και µικρού ΜΒ µόρια όπως είναι τα µόρια των αρωµατικών ενώσεων (DAMODARAN, KINSELLA, 1980; 1983; O NEILL, KINSELLA, 1987). Οι αλληλεπιδράσεις βασίζονται στην φύση της αρωµατικής ένωσης (τύποι των χηµικών ενώσεων, µήκος ανθρακικής αλυσίδας) και στη φύση της πρωτεΐνης (σύνθεση σε αµινοξέα, καθεστώς διαµόρφωσης των µορίων). Ανάµεσα στις πρωτεΐνες του οίνου, οι γλυκοπρωτείνες και πιο συγκεκριµένα οι µαννοπρωτείνες, που απελευθερώνονται από τις ζύµες κατά την ζύµωση ή κατά την συµπαραµονή του οίνου µε τις οινολάσπες, φαίνεται να επηρεάζουν την πτητικότητα των αρωµατικών ενώσεων και κατά συνέπεια τις οργανοληπτικές ιδιότητες ενός οίνο (LUBBERS S. 1993, LUBBERS S. et al., 1994b). Αρωµατικές ενώσεις όπως η β-ιονονη (άρωµα βιολέτας), η αιθυλική εξανόνη (άρωµα φράουλας) και η οκτανάλη (άρωµα 24

25 βερίκοκου) συγκρατούνται από τις µαννοπρωτείνες. Το σχετικό ποσοστό που καταλαµβάνει το πρωτεϊνικό µέρος στην γλυκοπρωτεΐνη είναι ένας σηµαντικός παράγοντας όσον αφορά στην αλληλεπίδρασή της µε τις αρωµατικές ενώσεις. Η παρουσία, λοιπόν, των µαννοπρωτεινών των ζυµών σε ένα οίνο επηρεάζει άµεσα την πτητικότητα των αρωµατικών ουσιών. Χρησιµοποιώντας πρακτικές οινοποίησης που επιτρέπουν τον εµπλουτισµό σε µαννοπρωτείνες, όπως το batonage, αυξάνεται το αρωµατικό δυναµικό του µεταχειριζόµενου οίνου. Έτσι εξηγείται και η µείωση του αρωµατικού δυναµικού, τόσο από πλευράς ποσότητας όσο και από πλευράς µείωσης της πτητικότητας των αρωµατικών ενώσεων, ενός οίνου στον οποίο έχει αφαιρεθεί ένα µεγάλο µέρος πρωτεϊνών, π.χ. µετά από διαύγαση µε µπεντονίτη. 2.4 Πρωτεϊνικό Θόλωµα σε Λευκούς Οίνους και Γλεύκη Η παρουσία µιας ποσότητας εναποµεινάντων ασταθών πρωτεϊνών στους οίνους είναι ένα πρόβληµα για τους οινοποιούς. Αυτές, καθιζάνουν κατά τη διάρκεια της συντήρησης σε αυξηµένη θερµοκρασία και κατά την παλαίωση και επηρεάζουν την σταθερότητα και διαύγεια των οίνων ( πρωτεϊνικό θόλωµα - casse proteique). Αυτή η καθίζηση οφείλεται στην αδιαλυτοποίηση των πρωτεϊνών, οδηγώντας έτσι στην δηµιουργία ενός µη αποδεκτού και αποκρουστικού θολώµατος ή και ιζήµατος. Από την άλλη οι πρωτεΐνες θεωρούνται οι πιο σηµαντικές αζωτούχες ενώσεις του οίνου. Οι πρωτεΐνες του οίνου είναι µίγµα των πρωτεϊνών που προέρχονται από το σταφύλι και αυτών που προέρχονται από την αυτόλυση των ζυµών. Φαίνεται πάντως πως οι πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για το πρωτεϊνικό θόλωµα είναι αυτές που προϋπάρχουν στο σταφύλι. Αυτές είναι πολύ ανθεκτικές στην πρωτεόλυση, µια συµπεριφορά που δεν οφείλεται ούτε στην αλληλεπίδραση µε φαινόλες ούτε και στην γλυκοσυλίωση (MESQUITA et al., 2001). 25

26 Η πρωτεινική σταθερότητα στους οίνους επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες όπως η συνολική ποσότητα πρωτεϊνών, η φύση των πρωτεϊνών, η διαφορά µεταξύ του ρη του οίνου και του ισοηλεκτρικού τους σηµείου, το ρη από µόνο του και η παρουσία ενώσεων όπως οι φλαβονόλες, οι πολυφαινόλες και τα µεταλλικά ιόντα (MESQUITA et al., 2001). Αν και τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει πολυάριθµες µελέτες πάνω στις πρωτεΐνες του γλεύκους και του οίνου, η φύση των πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για το θόλωµα τους παραµένει ασαφής. Επίσης, υπάρχουν αντικρουόµενες εργασίες στη βιβλιογραφία όσον αφορά τη δοµή και τη σύνθεση αυτών των πρωτεϊνών. Κάποιες έρευνες δηλώνουν πως η αστάθεια των οίνων σχετίζεται µόνο µε την περιεκτικότητά τους σε πρωτεΐνες και συνεπώς η εκτίµησή της µπορεί να γίνει µόνο µε τον καθορισµό των ολικών διαλυτών πρωτεϊνών (ANELLI, 1977). Αυτό υποστηρίζεται και από την έρευνα των KOCH και SAJAK (1959), οι οποίοι χρησιµοποίησαν ηλεκτροφόρηση επί χάρτου για να δείξουν ότι ο οίνος περιέχει δύο πρωτεϊνικά κλάσµατα τα οποία µειώνονται µε την επίδραση θερµότητας. Οι SOMMERS και ZIEMELIS (1973), θεωρούν ότι υπεύθυνες για το πρωτεϊνικό θόλωµα είναι οι πρωτεΐνες που αντιδρούν, ενώνονται µε τις φαινόλες. Οι DAWES et al., (1994), προσθέσανε πέντε πρωτεϊνικά κλάσµατα µε διαφορετικό ισοηλεκτρικό σηµείο (Ι.Σ.) σε έναν οίνο χωρίς πρωτεΐνες και παρατήρησαν πως όλες οι πρωτεΐνες προκάλεσαν θόλωµα µετά από θερµική επεξεργασία (µε τις πρωτεΐνες όµως των µεσαίων περιοχών Ι.Σ να δηµιουργούν 4-5 φορές µεγαλύτερο θόλωµα από ότι οι πρωτεΐνες των άλλων περιοχών). Οι παραπάνω µελετητές προτείνουν επίσης ότι πρέπει να ληφθεί υπόψη η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών µε άλλα συστατικά του οίνου για να εξηγηθούν οι υπεύθυνοι παράγοντες για την αστάθεια του οίνου. Άλλοι θεωρούν πως οι µοριακές ιδιότητες των πρωτεϊνών επηρεάζουν την φυσική τους τάση να καθιζάνουν. Έχουν δηµοσιευτεί πολλές ερευνητικές εργασίες γύρω από τις µοριακές ιδιότητες των πρωτεϊνών, κατά κύριο λόγο των ΜΒ τους και των ισοηλεκτρικών τους σηµείων, που περιλαµβάνουν µεγάλο εύρος ποικιλιών και γεωγραφικών ζωνών. εν έχει ξεκαθαριστεί όµως εάν κάποια ιδιαίτερα κλάσµατα πρωτεϊνών προκαλούν το θόλωµα. Κάποιοι αναφέρουν πως κάποιο 26

27 συγκεκριµένο κλάσµα πρωτεϊνών είναι υπεύθυνο (BAYLY, BERG, 1967; FEUILLAT et al., 1989). Σύµφωνα µε άλλους ερευνητές, η πρωτεϊνική αστάθεια σχετίζεται µε την µοριακή µάζα των κλασµάτων: πρωτεΐνες κάτω από 10 kda δεν λαµβάνουν µέρος στην δηµιουργία του θολώµατος, κλάσµατα µεταξύ 10 και 30 kda εν µέρει εµπλέκονται ενώ είναι αυτά µε µοριακή µάζα πάνω από 30 kda που είναι και τα πιο ασταθή κλάσµατα. Από την άλλη οι ΜESROB et al., (1983) και οι HSU et al., (1987a;1987b) παρατήρησαν πως οι χαµηλής µοριακής µάζας και µε χαµηλό Ι.Σ. πρωτεΐνες είναι οι υπεύθυνες για το θόλωµα των οίνων. Και οι WATERS et al.(1991; 1992) αφού διαχώρισαν τις πρωτεΐνες ενός οίνου σε τέσσερα πρωτεϊνικά κλάσµατα µε καταβύθιση (προσθήκη θειικού αµµωνίου) και υπερδιήθηση, τα επαναπρόσθεσανε σε πρωτεϊνικά ελεύθερο οίνο και µετά από θερµική επεξεργασία κατέγραψαν την ένταση του θολώµατος σε σχέση µε µάρτυρα (ορός αλβουµίνης, BSA) καταλήγοντας σε παρόµοιες παρατηρήσεις, ότι δηλαδή δύο κλάσµατα µε έντονη την περιοχή ΜΒ των Da προκαλούν το εντονότερο θόλωµα όταν θερµαίνονται, επιβεβαιώνοντας την εµπλοκή των πρωτεϊνών χαµηλής µοριακής µάζας στο θόλωµα των οίνων. Στο ίδιο συµπέρασµα κατέληξαν και οι LEDOUX et al. (1992) αφού στις λευκές ποικιλίες του Μπορντό (Semillon, Muscadelle, Sauvignon blanc) οι πρωτεΐνες των γλευκών ή οίνων που είναι πιο ευαίσθητες στο να καταβυθιστούν µετά από επίδραση θερµότητας είναι αυτές µε ΜΒ µεταξύ kda (αποτελέσµατα HPLC) Oι MESQUITA et al. (2001) προσπάθησαν να εξηγήσουν την αυξηµένη ένταση του πρωτεϊνικού θολώµατος µε την αύξηση της θερµοκρασίας (από θερµοκρασία δωµατίου στους 80 o C). Αποµόνωσαν πρωτεΐνες από µια πορτογαλική ποικιλία (Fernao Pires) και στην συνέχεια τις προσέθεσαν σε οίνους (που µετά από µεταχείριση µε µπετονίτη ήταν ελεύθεροι πρωτεϊνών) από άλλες ποικιλίες και τους υπέβαλλαν σε υψηλή θερµοκρασία. Στην συνέχεια έκαναν σύγκριση των αποτελεσµάτων µε τα αποτελέσµατα που πήραν όταν εξέθεσαν τους οίνους όπως ήταν (µε τις δικές τους πρωτεΐνες). Αυτό έγινε για να καταλάβουν εάν η καθίζηση οφείλεται στις πρωτεΐνες από µόνες τους ή σε άλλα συστατικά του οίνου. 27

28 Επιχείρησαν το ίδιο (MESQUITA et al., 2001), αποµονώνοντας και προσθέτοντας πρωτεΐνες από άλλες ποικιλίες, καθώς και προσθέτοντας πρωτεΐνες µη οινικής προέλευσης. Όλα τα παραπάνω τους οδήγησαν στο συµπέρασµα πως το θόλωµα µάλλον δεν οφείλεται αποκλειστικά στην παρουσία πρωτεϊνών. Το επιβεβαίωσαν προσθέτοντας πολυσακχαρίτες στους οίνους και κάνοντας πειράµατα σε συνθήκες υψηλότερου ΡΗ από αυτό του οίνου. Τελικά, κατέληξαν ότι για το πρωτεϊνικό θόλωµα δεν είναι υπεύθυνες οι πρωτεΐνες από µόνες τους αλλά, οφείλεται στην αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών µε άλλα συστατικά του οίνου (όπως πολυσακχαρίτες και πολυφαινόλες) ενώ το φαινόµενο ενισχύεται επίσης λόγω του χαµηλού pη του οίνου. Σε άλλη εργασία, ο SANTORO (1995) βρήκε µε SDS-PAGE στις ποικιλίες Chardonnay, Verdeca και Pinot noir ότι οι πρωτεΐνες καλύπτουν ένα ευρύ φάσµα ΜΒ από kda µε µεγαλύτερη ένταση όµως να έχει η περιοχή των 28 kda, που αποτελεί το 60% του συνολικού πρωτεϊνικού µίγµατος των ποικιλιών Chardonnay και Pinot noir. Όσον αφορά στην ποικιλία Verdeca, η πιο έντονη περιοχή είναι αυτή των 50 kda. Η διαύγαση µε µπεντονίτη δεν καταβύθισε όπως ήταν αναµενόµενο όλες τις πρωτεΐνες. Επίσης, στην Pinot noir παρατηρήθηκαν διαφορές κατά την διάρκεια της οινοποίησης: οι µπάντες των 28 και 30 kda που δεν ανιχνεύθηκαν κατά την πίεση έγιναν εµφανείς κατά την οινοποίηση ενώ η ζώνη των 35 kda δείχνει να µειώνεται. Η πρωτεΐνη των 28 kda είναι εµφανής σε όλα τα δείγµατα και θεωρείται από τις κυρίως υπεύθυνες για την πρόκληση θολώµατος. Οι πιο έντονες µπάντες εµφανίζουν ισοηλεκτρικά σηµεία από Μετά και από ανάλυση των αµινοξέων τους αποδεικνύεται ότι περιέχουν υψηλές ποσότητες όξινων αµινοξέων. Οι γλυκοσυλιωµένες πρωτεΐνες φαίνεται να παίζουν έναν σηµαντικό ρόλο στο θόλωµα των οίνων αφού αντιδρούν µε τις ταννίνες, τις πολυφαινόλες και άλλες πρωτεΐνες. Οι RUIZ-LARREA et al. (1998), µετά από ηλεκτροφόρηση, βρήκαν τρεις οµάδες πρωτεϊνών: 1) µεγάλου ΜΒ πρωτεΐνες που κυµαίνονται από 60 έως 200 kda (3% των συνολικών πρωτεϊνών) 28

29 2) µέσου ΜΒ πρωτεΐνες που κυµαίνονται από 24 έως 34 kda (58% των συνολικών πρωτεϊνών) 3) µικρού ΜΒ πρωτεΐνες που κυµαίνονται από 16 kda και κάτω (4% των συνολικών πρωτεϊνών) Οι πρωτεΐνες της πρώτης οµάδας είναι ισχυρά γλυκοσυλιωµένες ενώ οι µικρότερες πρωτεΐνες όχι. Εδώ, τα αποτελέσµατα έρχονται σε αντίθεση µε άλλους ερευνητές που βρήκαν τις πρωτεΐνες χαµηλού ΜΒ γλυκοσυλιωµένες και υπεύθυνες για το θόλωµα των οίνων (TOLAND et al., 1996; SANTORO, 1995). Εξάλλου οι YOKOTSUKA et al., (1994) αναφέρουν πως ο βαθµός της γλυκοσυλίωσης των πρωτεϊνών µπορεί να επηρεάσει την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών µε τα φαινολικά συστατικά των οίνων και συνεπώς την δηµιουργία πρωτεϊνικού θολώµατος. Στην προηγούµενη περίπτωση, (RUIZ-LARREA et al., 1998), η έλλειψη γλυκοσυλίωσης των πρωτεϊνών χαµηλού ΜΒ µάλλον εξηγεί την πρωτεϊνική σταθερότητα των οίνων της εν λόγω περιοχής (Ριόχα, Ισπανία). Τέλος, οι PAETZOLD et al., (1990), θεώρησαν ότι υπεύθυνα µόρια πρωτεϊνών για το θόλωµα στους οίνους από τις ποικιλίες Semillon, Sauvignon blanc και Muscadelle είναι κυρίως γλυκοπρωτεΐνες των οποίων το ΜΒ κυµαίνεται από kda. Αυτές παρουσιάζουν µια εκτεταµένη γκάµα ισοηλεκτρικών σηµείων phi. Στο γλεύκος της ποικιλίας Sauvignon blanc, τρία κλάσµατα µε phi 6.17, 5.65 και >9.0 είναι τα περισσότερο υπεύθυνα για την εµφάνιση προβληµάτων που οφείλονται σε πρωτεΐνες. Το τελευταίο απορροφάται εύκολα εφαρµόζοντας µικρή δόση µπεντονίτη ενώ τα άλλα δύο τα οποία αντιστοιχούν σε ΜΒ 21 και 23 kda, απαιτούν µεγαλύτερες δόσεις. Εντόπισαν επίσης (PAETZOLD et al., 1990), ότι η περιεκτικότητα των γλευκών σε ασταθείς γλυκοπρωτεΐνες εξαρτάται από την εσοδεία, το βαθµό ωρίµανσης των σταφυλιών και προζυµωτικές µεταχειρίσεις (θείωση, ένταση πιέσεων, προζυµωτική εκχύλιση). 29

30 ιαδικασίες πρόληψης και αντιµετώπισης του πρωτεϊνικού θολώµατος Οι πρωτεΐνες στο γλεύκος είναι ένα γνωστό αίτιο µιας αστάθειας, που επηρεάζει την διαύγεια των λευκών οίνων. Όταν καθιζάνουν προκαλούν θόλωµα γνωστό παγκοσµίως µε τον όρο protein casse το οποίο αναφέρθηκε πρώτη φορά από τον Laborde ήδη το Το θόλωµα ή το χαρακτηριστικό ίζηµα της εν λόγω ασθένειας εµφανίζονται στη φιάλη κυρίως όταν οι οίνοι φυλάσσονται σε συνθήκες υψηλής θερµοκρασίας. Υπάρχουν διάφορα είδη δοκιµών µε τις οποία µπορεί να ελεγχτεί η πρωτεϊνική σταθερότητα ενός γλεύκους ή οίνου. Αυτές βασίζονται στην αστάθεια των πρωτεϊνών κάτω από ποικίλες συνθήκες όπως: σε υψηλές θερµοκρασίες ή στην παρουσία τανίνης, τριχλωροοξικού οξέος, αιθανόλης. Αυτές οι δοκιµές δεν δίνουν τα ίδια αποτελέσµατα. Κάποιες π.χ. υπερεκτιµούν την πιθανότητα θολώµατος κατά την παλαίωση του οίνου στο µπουκάλι µε αποτέλεσµα να εφαρµόζονται µεγαλύτερες δόσεις µπεντονίτη από το κανονικό για να διασφαλιστεί η πρωτεϊνική σταθεροποίηση των οίνων Μέθοδοι πρόληψης πρωτεϊνικού θολώµατος Έχουν δοκιµασθεί αρκετές µέθοδοι για την αποφυγή της δηµιουργίας πρωτεϊνικού θολώµατος: Η προσθήκη ταννινών µπορεί να καταβυθίσει τις πρωτεΐνες αλλά δεν είναι πρακτική µέθοδος, αφού χρειάζονται µεγάλες δόσεις ταννινών (2 g/l) για να τις εξαφανίσουν. Μικρότερες δόσεις µάλλον ενισχύουν παρά λύνουν το πρόβληµα. Η επίδραση της εκτεταµένης ψύξης, κοντά στο σηµείο ψύξης, προκαλεί µόνο µερική καταβύθιση πρωτεϊνών. 30

31 Η χρησιµοποίηση των πρωτεολυτικών ενζύµων προκαλεί ενζυµατική υδρόλυση των πρωτεϊνών µε αποτέλεσµα την απόκτηση µικρών πεπτιδίων και αµινοξέων. Το πρόβληµα που υπάρχει είναι ότι στις θερµοκρασίες οινοποίησης είναι µειωµένη η δραστηριότητα των εν λόγω ενζύµων (FERREIRA et al., 2000) Η υπερδιήθηση είναι µια αποτελεσµατική µέθοδος διαύγασης. Χρησιµοποιούνται µεµβράνες που αποκλείουν µέχρι και πολύ µικρά µόρια πρωτεϊνών µε ΜΒ Da. Πάντως, ακόµα και σε διαυγασµένους µε αυτή τη µέθοδο οίνους παρατηρήθηκαν θολώµατα µετά από θερµικές δοκιµές πράγµα που δείχνει ότι η υπερδιήθηση είναι µια µέθοδος διαύγασης που πρέπει να µελετηθεί περισσότερο (HSU et al., 1987) Χρησιµοποίηση Μπεντονίτη Ο µπεντονίτης βρέθηκε για πρώτη φορά βρέθηκε το 1888 στο Fort Benton της επαρχίας Wyoming των Η.Π.Α., απ' όπου πήρε και το όνοµά του. Προέρχεται από την αποσύνθεση ηφαιστειογενούς υαλώδους τέφρας, είναι χωρίς οσµή και γεύση και χηµικά αδρανής. Στην Αµερική, το 1934, ο Saywell δοκίµασε για πρώτη φορά τον µπεντονίτη για τη σταθεροποίηση και το λαµπικάρισµα των οίνων χωρίς να δώσει ιδιαίτερη σηµασία στην επίδραση του πάνω στις πρωτεΐνες. Την επόµενη χρονιά (1935), οι Riberau-Gayon και οι συνεργάτες του, µελέτησαν τις ιδιότητες του και την επίδραση του πάνω στις πρωτεΐνες. Ο µπεντονίτης έχει την ιδιότητα να προσροφά πρωτεΐνες, που πιθανώς να καταβυθιστούν, σε δόσεις 10 φορές µικρότερες του καολινίτη. Μετά από την ανακάλυψη του µπεντονίτη δεν έχει αναφερθεί άλλη µέθοδος ικανή να τον αντικαταστήσει στην πρόληψη των προβληµάτων που δηµιουργούν οι πρωτεΐνες στους λευκούς οίνους. Ο µπεντονίτης είναι µια αρνητικά φορτισµένη κολλοειδής άργιλλος που χρησιµοποιείται ευρέως στις βιοµηχανίες τροφίµων, και κατά συνέπεια στα οινοποιεία ιδιαίτερα κατά την παρασκευή λευκών οίνων ως µέσο διαύγασης των. Έχει υψηλή ικανότητα ανταλλαγής κατιόντων 31

32 και καταβυθίζει τις θετικά φορτισµένες πρωτεΐνες µε προσρόφηση. Ο µπεντονίτης σπάνια χρησιµοποιείται, όπως λαµβάνεται από τη φύση. Συνήθως ενεργοποιείται µε H 2 SO 4 ή κυρίως µε αλκαλικά άλατα, έτσι ώστε να διακρίνουµε τους µπεντονίτες σε όξινους ή σε µπεντονίτες µε Na, µε Ca, µε Mg κλπ. Οι µπεντονίτες νατρίου έχουν µεγαλύτερη προσροφητική ικανότητα από αυτή των ασβεστίου. οκιµές που έγιναν σε 17 µπεντονίτες εµπορίου έδειξαν ότι η επιφάνεια προσρόφησης τους ποικίλλει από 335 έως 691 m 2 /g. Οι διάφοροι αυτοί µπεντονίτες περιόρισαν από 63% έως 84% τις πρωτεΐνες ενός οίνου από Chardonnay και βρέθηκε µια θετική συσχέτιση ανάµεσα στην ποσότητα των καταβυθιζόµενων πρωτεϊνών και στην επιφάνεια προσρόφησης (LUBBERS et al.,1995). Η προσροφητικότητα του µπεντονίτη επηρεάζεται από το µέγεθος, το ΜΒ των πρωτεϊνών καθώς και από τη συγκέντρωση αλκοόλης. Όσον αφορά το ΜΒ φαίνεται πως οι πρωτεΐνες µε µεγάλο ΜΒ προσροφόνται καλύτερα αν όχι εξολοκλήρου από τον µπεντονίτη. Η επίδραση της αλκοόλης συνίσταται στο ότι αυξάνει ακόµα περισσότερο (από ότι το νερό) την επιφάνεια των επιπέδων που δηµιουργούνται όταν ο µπεντονίτης διογκώνεται µε αποτέλεσµα να αυξάνεται η προσροφητικότητά του, ειδικότερα για τα µεγάλου µεγέθους µόρια (ASCAERANDIO et al., 2001) Ιδιότητες του µπεντονίτη Ο µπεντονίτης παρουσιάζει έντονα τα χαρακτηριστικά των κολλοειδών, όπως: Η σηµαντική διόγκωση λόγω απορρόφησης µεγάλης ποσότητας νερού. Η δυνατότητα παρασκευής ζελατινώδους πάστας. Ο σχηµατισµός σταθερού αιωρήµατος σε µεγάλη αραίωση. Η µεγάλη προσροφητική του ικανότητα. Η ικανότητα ανταλλαγής ιόντων. Τα χαρακτηριστικά αυτά παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ικανότητα του µπεντονίτη να ενεργεί για τη διαύγαση, αλλά και τη σταθεροποίηση του οίνου. 32

33 Η µεγάλη επιφάνεια, που προκύπτει από τη σηµαντική διόγκωση του µπεντονίτη (απορρόφηση ποσότητας νερού 10πλάσια του βάρους του), αλλά και η σταθερή και οµοιόµορφη διασπορά του σε υγρό µέσο έχουν ως αποτέλεσµα τη µεγάλη προσροφητική του ικανότητα. Το αρνητικό ηλεκτροστατικό φορτίο του παίζει, επίσης, σηµαντικό ρόλο στις ικανότητες που προαναφέρθηκαν (ΣΟΥΦΛΕΡΟΣ, 2000).. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, όταν ο µπεντονίτης διαλυθεί σε νερό ή σε οίνο σχηµατίζει κολλοειδή διασπορά. Τα αρνητικά φορτισµένα σωµατίδια της διασποράς αυτής αφενός συσσωµατώνονται µε τα θετικά φορτισµένα µεταλλικά ιόντα και αφετέρου δεσµεύουν τα κολλοειδή σωµατίδια των πρωτεϊνών. Σηµειώνεται ότι οι πρωτεΐνες στο ρη του οίνου, το οποίο είναι κατώτερο από το ισoηλεκτρικό τους σηµείο (ρη 4,7), είναι φορτισµένες θετικά. Ο µπεντονίτης καταβυθίζει ευκολότερα τις πρωτεΐνες υψηλού ισοηλεκτρικού pηi ενώ οι πρωτεΐνες χαµηλού pηi (που είναι και οι αφθονότερες στον οίνο) χρειάζονται µεγαλύτερες δόσεις για να προσροφηθούν στην επιφάνεια του (ΣΟΥΦΛΕΡΟΣ, 2000). Ο µπεντονίτης προστίθεται στους οίνους σε µορφή αιωρήµατος. Η ποσότητα του µπεντονίτη, που χρησιµοποιείται για το σκοπό αυτό, ανέρχεται σε g/hl γλεύκους ή οίνου. Προστίθεται κατά προτίµηση σε απολασπωµένα γλεύκη "εν ζυµώσει" ή πριν από την έναρξη της ζύµωσης, αλλά και σε νέους οίνους ή ακόµη σε οίνους περισσότερο αναπτυγµένους. Η δόση του µπεντονίτη εξαρτάται από την εσοδεία, και πρέπει οι συνθήκες που επικράτησαν την εκάστοτε χρονιά, (κλιµατικοί παράγοντες, συνθήκες οινοποίησης, καλλιεργητικές τεχνικές) και που επηρεάζουν την συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε ένα γλεύκος ή σε έναν οίνο, να λαµβάνονται υπόψη έτσι ώστε να µην εφαρµόζονται αδικαιολόγητα υψηλές δόσεις µπεντονίτη (ΣΟΥΦΛΕΡΟΣ, 2000) Μειονεκτήµατα µπεντονίτη Όταν οι δόσεις του απαιτούµενου µπεντονίτη για διαύγαση είναι αυξηµένες, παρατηρείται µια αποδυνάµωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των µεταχειριζόµενων οίνων. 33

34 Αυτή η χρησιµοποίηση του µπεντονίτη σε πολύ υψηλές δόσεις φαίνεται καθαρά στην περίπτωση των οίνων από την ποικιλία Sauvignon blanc. Σ αυτούς αποµονώθηκε µια ουσία που είναι χαρακτηριστικό συστατικό του αρώµατος των και πρόκειται για µια µερκαπτοκετόνη (4- µεθύλ-4-µερκαπτοπεντανόνη). Αυτή είναι ένα µόριο εξαιρετικά αρωµατικό, του οποίου το όριο αντίληψης είναι εξαιρετικά χαµηλό (3 ng/l, στον οίνο). Μια µεταχείριση µε µπεντονίτη µεγαλύτερη από 50 g/l µειώνει κατά 20% τη συγκέντρωση της µερκαπτοπεντανόνης σε έναν οίνο Sauvignon blanc. Αυτό είναι εξαιρετικά σηµαντικό αφού αν µια τέτοια µεταχείριση προκαλέσει την µείωση µιας χαρακτηριστικής αρωµατικής ουσίας µιας ποικιλίας κάτω από τα όρια της οσφρητικής αντίληψης, το τυπικό άρωµα της ποικιλίας χάνεται (DUBOURDIEU et al.,1995) Χρήση µαννοπρωτεϊνών κυτταρικού τοιχώµατος ζυµών Η συστηµατική βελτίωση της πρωτεϊνικής σταθεροποίησης των λευκών οίνων κατά τη διάρκεια της παραµονής τους µε τις οινολάσπες είναι φαινόµενο που διαπιστώνεται εύκολα από τους οινοποιούς (LEDOUX et al. 1992; FEUILLAT et al. 1980; 1989). Παραµένοντας µε τις οινολάσπες, οι νεοπαραχθέντες οίνοι θολώνουν λιγότερο υπό την επίδραση της θερµότητας και επιπλέον απαιτούν µικρότερη δόση µπεντονίτη για την πρωτεϊνική σταθεροποίηση. Ωστόσο, γνωρίζουµε ότι οι πρωτεΐνες που ευθύνονται για το θόλωµα δεν υδρολύονται ούτε προσροφώνται από τις οινολάσπες. Αυτό που συµβαίνει είναι η εµφάνιση νέων πρωτεϊνών. Πρόκειται για µαwοπρωτείνες του κυτταρικού τοιχώµατος των ζυµών οι οποίες απελευθερώνονται κατά την παραµονή του οίνου µε τις οινολάσπες. Το φαινόµενο παρατηρήθηκε για πρώτη φορά σε οίνο από τους WΑΤERS et al., (1993) όπου άξια λόγου ήταν η µεγάλη θερµική σταθερότητα ενός κλάσµατος το οποίο ήταν πλούσιο σε υδρογονάνθρακες (µάλλον είναι γλυκοπρωτεΐνες, πρωτεογλυκάνες ή ασύνδετοι πολυσακχαρίτες) και το οποίο δείχνει ότι, τα συστατικά πλούσια σε υδρογονάνθρακες προσφέρουν προστασία στις πρωτεΐνες, κατά τη µεταχείρισή τους µε θερµότητα, παίζοντας έτσι σηµαντικό ρόλο στην διατήρηση της διαύγειας των οίνων. 34

35 Επίσης, αν και σε ερυθρό οίνο, οι YOKOTSUKA et al., (1994), βρήκαν ότι ο βαθµός της γλυκοσυλίωσης των πρωτεϊνών και η σακχαρική σύνθεση των γλυκοπρωτεινών µάλλον επηρεάζουν την αλληλεπίδρασή τους µε τις ταννίνες και αποτρέπουν έτσι τη δηµιουργία θολώµατος Ωστόσο, το φαινόµενο µελετήθηκε εκτενώς από την LEDOUX (1992). Η ερευνήτρια αποµόνωσε µία µαwοπρωτεΐνη η οποία εκχυλίζεται in νitro ενζυµατικά µε τη βοήθεια ενζύµων µε δράση β-γλουκανάσης και πρωτεάσης (DUBOURDIEU and LEDOUX, 1994), έχει µοριακό βάρος 32 kda και αποτελεί τµήµα ιµβερτάσης του κυτταρικού τοιχώµατος της ζύµης Saccharomyces cereνisiae (LEDOUX, 1996). Η πρωτεϊνική σταθεροποίηση των οίνων που παραµένουν µε τις οινολάσπες εξαρτάται από παράγοντες όπως η διάρκεια παραµονής, η ποσότητα των οινολασπών, η ηλικία των βαρελιών και η συχνότητα των αναδεύσεων Η ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΩΣ ΜΕΘΟ ΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Γενικά περί ηλεκτροφόρησης Παρ ότι οι πρωτείνες περιέχονται µόνο σε χαµηλές συγκεντρώσεις στους µούστους και στους οίνους, παρουσιάζουν πολύ σηµαντικές τεχνολογικές και οργανοληπτικές ιδιότητες. Μέχρι σήµερα, (MORRENO- ARIBBAS et al., 2002) ένας σχετικά µεγάλος αριθµός µεθόδων, ηλεκτροφορητικών (SDS - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis - SDS-PAGE, IsoElectricFocusing 35

36 - IEF, Capillary Electrophresis - CE), χρωµατογραφικών (LC-Liquid Chromatography, FPLC-Fast Protein Liquid Chromatography), έχουν αναφερθεί για τον χαρακτηρισµό και τον διαχωρισµό των πρωτεϊνών σε γλεύκος ή σε οίνο. Η επιλογή της µιας ή της άλλης εξαρτάται από το είδος της επιθυµητής πληροφορίας. Στην δική µας περίπτωση, για τον κλασµατικό διαχωρισµό των πρωτεϊνών από διάφορα δείγµατα γλευκών ελληνικών και ξένων ποικιλιών, χρησιµοποιήσαµε την µέθοδο της SDS-PAGE (Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου µε SDS). Ηλεκτροφόρηση είναι η µετακίνηση φορτισµένων εν διαλύσει µορίων ως αποτέλεσµα αντίδρασης σε ένα ηλεκτρικό πεδίο. Ο βαθµός της µετακίνησής τους εξαρτάται από την ισχύ του πεδίου, από το καθαρό φορτίο, µέγεθος και σχήµα των µορίων καθώς επίσης και από την ιοντική ισχύ, το ιξώδες και τη θερµοκρασία του µέσου στο οποίο κινούνται τα µόρια. Ως αναλυτική µέθοδος η ηλεκτροφόρηση είναι απλή, γρήγορη και έχει µεγάλη ευαισθησία. Μια από τις πιο συνηθισµένες και ευρέως χρησιµοποιούµενες µεθόδους είναι η ηλεκτροφόρηση που χρησιµοποιεί µια ασυνεχή* πηκτή πολυακρυλαµιδίου ως µέσο υποστήριξης και SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) ως µέσο αποδόµησης των πρωτεινών (SDS- PAGE-SodiumDodecylSulfate-PolyAcrylamideGelElectrophoresis). Το SDS είναι ένα ανιονικό αντιδραστήριο, που σηµαίνει ότι όταν διαλύεται τα µόρια του έχουν ένα καθαρό αρνητικό φορτίο σε ένα µεγάλο εύρος ρh. Με αυτόν τον τρόπο το SDS τυλίγει τα πρωτεϊνικά µόρια µε τα οποία και ενώνεται µε αναλογία µάζας 1,4:1. Έτσι, καταστρέφει τις περισσότερες από τις πολύπλοκες δοµές των πρωτεινών και απονέµει στα πολυπεπτίδια αρνητικό φορτίο τα οποία έλκονται ισχυρά απο την άνοδο του ηλεκτρικού πεδίου. Οι πηκτές πολυακρυλαµιδίου (είναι το πιο εύχρηστο υλικό για πηκτή, εξασφαλίζει δηµιουργία µικρών πόρων) εµποδίζουν τα µεγαλύτερα µόρια να µετακινηθούν το ίδιο γρήγορα µε τα µικρότερης µάζας µόρια. Επειδή η αναλογία φορτίου-µάζας είναι σχεδόν η ίδια ανάµεσα στα SDS-µεταχειριζόµενα πολυπεπτίδια, ο τελικός διαχωρισµός των πρωτεινών εξαρτάται σχεδόν αποκλειστικά στις διαφορές της µοριακής µάζας των πολυπεπτιδίων. 36

37 Η µοριακή µάζα m (ΜΜ) εκφράζεται σε Daltons (Da). Ένα Dalton καθορίζεται ως το 1/12 της µάζας του άνθρακα 12. Τα περισσότερα µακροµόρια είναι αρκετά µεγάλα ώστε να χρησιµοποιούν το kda (kilodalton) ως έκφραση της µοριακής τους µάζας. Το µοριακό βάρος ΜΒ δεν είναι το ίδιο µε την ΜΜ αφού αυτή ορίζεται ως το ποσοστό της µάζας ενός µακροµορίου στο 1/12 της µάζας ενός ατόµου άνθρακα 12. Είναι αδιάστατη ποσότητα. Πολλές φορές πάντως στην βιβλιογραφία, όπως και στην περίπτωση που αφορά πρωτείνες στο γλέυκος και στον οίνο, τα ΜΒ αναφέρονται µε Da ή µε kda. * Ασυνεχές είναι το σύστηµα στο οποίο η πηκτή αποτελείται από δύο στρώµατα διαφορετικής σύνθεσης. Το κατώτερο στρώµα (πηκτή διαχωρισµού) είναι πιο πηκτο µε µικρότερου µεγέθους πόρους και είναι υπεύθυνο για τον διαχωρισµό των µοριών ανάλογα µε το µέγεθος ενώ το ανώτερο µέρος (πηκτή συγκέντρωσης) εχει µεγαλύτερους πόρους επιτρέποντας την γρήγορη συγκέντρωση (συµπίεση) των µορίων σε λεπτά στρώµατα πριν φτάσουν στην πηκτή διαχωρισµού Προετοιµασία δείγµατος Είναι ίσως το πιο σηµαντικό στάδιο, κλειδί για την επιτυχία µιας ηλεκτροφόρησης. Παρακάτω περιγράφονται οι πιο συνήθεις µέθοδοι που εφαρµόζονται για την αποµόνωση των πρωτεινών. ιάλυση: Η διάλυση γλεύκους και οίνου σε νερό, είναι η πιο απλή µέθοδος αποµόνωσης πρωτεινών. Με αυτην αποκλείονται οι χαµηλού ΜΒ ενώσεις. Ακολουθείται από λυοφιλίωση ώστε να συµπυκνωθούν τα µεταχειριζόµενα δείγµατα. Υπερδιήθηση: Είναι παρόµοια µε τη διάλυση αλλά πολύ πιο γρήγορη µέθοδος. Γίνεται µε µεµβράνες διαφόρων υλικών που έχουν ζώνες αποκοπής διαφόρων ΜΒ, ώστε να συγκεντρωθούν οι ενώσεις των συγκεκριµένων ΜΒ που θέλουµε να ανιχνεύσουµε. Συχνά υποβοηθείται από περισταλτικές αντλίες ή φυγόκεντρους, ανάλογα µε τους εµπλεκόµενους όγκους δειγµάτων (GONZALEZ-LARA et al., 1989). 37

38 Καταβύθιση: Αποτελεί ίσως την πιο ευρέως χρησιµοποιούµενη τεχνική αποµόνωσης. Γίνεται είτε µε προσθήκη αλάτων σε υψηλή συγκέντρωση (όπως θειικό αµµώνιο) είτε µε διαλύµατα που περιέχουν οργανικούς διαλύτες (όπως αιθανόλη, µεθανόλη, ακετόνη) είτε τέλος, µε επίδραση οξέος (όπως το τριχλωροοξικό οξύ, θειοσαλυκιλικό οξύ, φωσφορικό οξύ) Κατά την καταβύθιση µε όλα αυτά τα µέσα, πρεπει να ληφθεί υπόψη ότι ενώσεις χαµηλού ΜΒ απορροφούνται από τις πρωτείνες και έτσι δυσκολεύουν την αποµόνωση τους. Μετά την καταβύθιση γίνεται διήθηση ή φυγοκέντρηση ώστε να διαχωριστούν οι πρωτείνες από τα διαλυτά πεπτίδια και διάλυση για να αποµακρυνθούν τα άλατα. Τέλος, έχουν αναφερθεί συνδυασµοί µεθόδων όπως π.χ. καταβύθιση µε θειικό αµµώνιο ακολοθούµενη από υπερδιήθηση. Μια αποτελεσµατική προετοιµασία δείγµατος θα πρέπει: Να διαλυτοποιεί όλες τις πρωτείνες Να αποτρέπει τη συσσώρευση των πρωτεινών Να µην επιτρέπει τη χηµική µεταβολή τους Να τις αποµονώνει από άλλα εµπλεκόµενα µόρια (π.χ. φαινόλες, σακχαρα) που µπορεί να επηρεάσουν το αποτέλεσµα Να συγκεντρώσει τις πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος µας σε ανιχνεύσιµα επίπεδα 38

39 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 39

40 3.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 3.1. είγµατα σταφυλιών Τα δείγµατα σταφυλιών που χρησιµοποιήθηκαν συγκοµίσθηκαν κατά την διάρκεια τριών αµπελουργικών περιόδων ( ) και προέρχονται από διάφορες αµπελουργικές περιοχές της Μακεδονίας (Πίνακας 3.1.1). Η συλλογή έγινε λίγο πριν την πλήρη ωρίµανση της ποικιλίας. Ακολουθεί πίνακας όπου είναι συγκεντρωµένα τα κυριότερα χαρακτηριστικά των δειγµάτων γλεύκους Προετοιµασία δειγµάτων Μετά την συλλογή τους τα δείγµατα σταφυλιών µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο Οινολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, όπου και ακολούθησε απαλή πίεση για την παραλαβή του χυµού τους (γλεύκος). Στη συνέχεια, αφού προστέθηκε θειώδης ανυδρίτης (100mg/l), ώστε να αποφευχθεί η άµεση ζύµωση, τα δείγµατα καταψύχονταν µέχρι τη στιγµή των αναλύσεων. Την προηγουµένη των αναλύσεων τα δείγµατα µεταφέρονταν στο ψυγείο (σε θερµοκρασία <4 o C) ώστε να αποψυχθούν. Προτού λάβει χώρα οποιαδήποτε επεξεργασία, τα δείγµατα τοποθετούνταν στη φυγόκεντρο ώστε να αποµακρυνθούν τυχόν λάσπες και µεγάλου µεγέθους σωµατίδια ενώ όπου υπήρχε ανάγκη (εντονο θόλωµα) ακολουθούσε και διήθηση. Για τον υπολογισµό των βασικών χαρακτηριστικών του γλεύκους (ρη, οξύτητα, σάκχαρα), χρησιµοποιηθήκαν τα δείγµατα απευθείας χωρίς να έχουν υποστεί κάποια επεξεργασία ενώ για τον προσδιορισµό των διαλυτών πρωτεϊνών έγινε πρώτα διήθηση. Για τον προσδιορισµό των µοριακών βαρών (ΜΒ) των πρωτεϊνικών κλασµάτων προηγήθηκε συµπύκνωση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου και φιλτράρισµα σε µεµβράνες διαχωρισµού. 40

41 Πριν χρησιµοποιηθεί η παραπάνω µέθοδος έγινε αξιολόγηση τριών µεθόδων προετοιµασίας δείγµατος µε σκοπό την καλύτερη αποµόνωση των πρωτεϊνών. Οι µέθοδοι που αξιολογήθηκαν είναι οι εξής: α) Καταβύθιση µε αιθανόλη (95%) β) Λυοφιλίωση µετά από καταβύθιση µε θειικό αµµώνιο γ) Συµπύκνωση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου και διήθηση σε µεµβράνες διαχωρισµού Περιγραφή µεθόδων αποµόνωσης α) Καταβύθιση µε αιθανόλη : Τα δείγµατα γλεύκους, µετά από διήθηση ώστε να µην υπάρχει περίσσεια οινολασπών, έµπαιναν σε µεµβράνες διαχωρισµού σωληνωτής διατοµής (Spectra Por, Da Cut Off), έτσι ώστε να αποµακρυνθούν όσο το δυνατόν περισσότερο άλλες ουσίες που θα επηρέαζαν το την ανάλυση όπως π.χ. άλατα, φαινολικές ενώσεις, µικρά πεπτίδια κ.α. Στη συνέχεια, σε ένα ποτήρι ζέσεως αναµειγνύονταν ποσότητα γλεύκους (10-15 ml) µε τετραπλάσιο όγκο αλκοόλης (τουλάχιστον > 70% καθαρότητα) ώστε να πραγµατοποιηθεί η καταβύθιση. Το ποτήρι τοποθετείται απλά στο ψυγείο (4 0 C) για 18 ώρες και αφού σχηµατιστεί ίζηµα, αυτό συλλέγεται και αφήνεται να στεγνώσει (από την αλκοόλη). Το ίζηµα τέλος, διαλύεται σε 1ml απιονισµένου νερού ή ρυθµιστικού διαλύµατος συσκευής και µπαίνει στην κατάψυξη µέχρι να χρησιµοποιηθεί (GONZALEZ-LARA et al., 1989). 41

42 Πίνακας 3.1.1: Βασικά οινολογικά χαρακτηριστικά (σάκχαρα, οξύτητα, ph), και προέλευση των γλευκών των ποικιλιών που χρησιµοποιήθηκαν για την ανίχνευση του πρωτεϊνικού τους προφίλ.. Α/Α ΚΩ ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΠΕΡΙΟΧΗ SAUVIGNON BLANC SAUVIGNON BLANC SAUVIGNON BLANC SAUVIGNON BLANC SAUVIGNON BLANC SAUVIGNON BLANC SAUVIGNON BLANC SAUVIGNON BLANC ΕΙ ΟΣ ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΣΑΚΧΑΡΑ (brix) ΑΓ.ΠΑΥΛΟΣ ΧΑΛΚΙ ΙΚΗ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 10,1 2,94 ΑΓ.ΠΑΥΛΟΣ ΧΑΛΚΙ ΙΚΗ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 8,3 3,03 ΑΓ.ΠΑΥΛΟΣ ΧΑΛΚΙ ΙΚΗ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 8,6 2,85 ΑΓ.ΠΑΥΛΟΣ ΧΑΛΚΙ ΙΚΗ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 8,1 3,05 ΑΓ.ΠΑΥΛΟΣ ΧΑΛΚΙ ΙΚΗ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 9,7 2,93 ΑΓ.ΠΑΥΛΟΣ ΧΑΛΚΙ ΙΚΗ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 10,6 3,21 ΕΥΚΑΡΠΙΑ ΣΕΡΡΩΝ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 10,8 3,3 ΕΥΚΑΡΠΙΑ ΣΕΡΡΩΝ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 10,9 3, ΖΟΥΜΙΑΤΙΚΟ ΓΕΦΥΡΑ ΘΕΣ/ΝΙΚΗΣ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 8,5 3, ΜΑΛΒΑΖΙΑ ΟΣΣΑ ΘΕΣ/ΝΙΚΗΣ ΣΤΑΦΥΛΟΧΥΜΟΣ 10 3, ΡΟ ΙΤΗΣ ΓΕΦΥΡΑ ΘΕΣ/ΝΙΚΗΣ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 8,7 3, ΡΟ ΙΤΗΣ ΓΕΦΥΡΑ ΘΕΣ/ΝΙΚΗΣ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 11,7 3, CHARDONNAY ΠΕΝΤΑΠΟΛΗ ΣΕΡΡΩΝ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 12,5 3, ΖΟΥΜΙΑΤΙΚΟ ΠΕΝΤΑΠΟΛΗ ΣΕΡΡΩΝ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 9,68 2, ΜΑΛΑΓΟΥΖΙΑ ΠΕΝΤΑΠΟΛΗ ΣΕΡΡΩΝ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 9,68 3, ΑΣΠΡΟΥ Α ΣΕΡΡΩΝ SAUVIGNON BLANC ΠΕΝΤΑΠΟΛΗ ΣΕΡΡΩΝ ΣΤΑΦΥΛΙΑ 7,78 3,87 ΠΛΑΤΑΝΟΤΟΠΟΣ ΚΑΒΑΛΑ PH ΣΤΑΦΥΛΙΑ 11,42 3,04 42

43 β) Λυοφιλίωση µετά από καταβύθιση µε θειικό αµµώνιο : Τα δείγµατα γλεύκους µεταφέρονταν σε ογκοµετρικούς κυλίνδρους και προσθέτονταν οι ποσότητες θειικού αµµωνίου (µετά από αναφορά σε σχετικό πίνακα) που απαιτούνταν για να προκαλέσουν 40% ή 70% ή 80% κορεσµό στο κάθε δείγµα. Η προσθήκη του θειικού αµµωνίου γινόταν σταδιακά και µε διαρκή ανάδευση σε θερµοκρασία δωµατίου (RUIZ LARREA et al., 1998). Μετά την πλήρη διάλυσή του, τα κορεσµένα διαλύµατα τοποθετούνταν στο ψυγείο στους 4 ο C, και παρέµεναν σε ηρεµία για χρονικό διάστηµα µιας ώρας. Κατόπιν τα διαλύµατα φυγοκεντρούνταν στους 4 ο C στις στροφές/λ για 15min. Ακολουθούσε απόχυση του υπερκείµενου υγρού, ενώ το ίζηµα το οποίο περιείχε τις καταβυθισµένες πρωτεΐνες διαλύονταν σε 5ml ρυθµιστικού διαλύµατος (οξικού οξέος/οξικού Νατρίου 10 mm, ph 3,5). Το διάλυµα µε τις καταβυθισµένες πρωτεΐνες µεταφέρονταν σε µεµβράνες διαπήδησης και ακολουθούσαν τρεις διαδοχικές αλλαγές ρυθµιστικού διαλύµατος (ph 3,5) για τρεις ηµέρες στους 4 0 C, προκειµένου να αποµακρυνθούν ανεπιθύµητες ενώσεις, όπως υπολείµµατα θειικού αµµωνίου, τρυγικά άλατα, τα οποία θα επηρέαζαν δυσµενώς τον προσδιορισµό του πρωτεϊνικού προφίλ των ποικιλιών. Στη συνέχεια, τα δείγµατα µεταφέρονταν σε κωνικές φιάλες και ακολουθούσε λυοφιλίωση. Τα λυοφιλιώµενα δείγµατα διαλύονταν σε 1ml απεσταγµένου νερού και µεταφέρονταν στην κατάψυξη όπου και παρέµεναν µέχρι τον προσδιορισµό του πρωτεϊνικού τους προφίλ (RUIZ LARREA et al., 1998). γ) Συµπύκνωση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου και διήθηση σε µεµβράνες διαχωρισµού: Τα δείγµατα γλεύκους µετά την απόψυξη, τοποθετούνταν στη φυγόκεντρο (Thermo ALC- Refrigarated Centrifuge PK120R) για την αποµάκρυνση των οινολασπών (6000 στροφές,4 0 C, για 20 λεπτά) ενώ ακολουθούσε διήθηση (µε απλό διηθητικό χαρτί) στην περίπτωση που το γλεύκος εξακολουθούσε να είναι θολωµένο. Στη συνέχεια, τα δείγµατα έµπαιναν σε

44 µεµβράνες διαχωρισµού (SpectraPor Da Cut-Off) και οι µεµβράνες εµβαπτίζονταν σε νερό µέσα σε ένα ποτήρι ζέσεως για 24 ώρες. Αυτό γίνεται για να αποµακρυνθούν όσο το δυνατόν περισσότερες ενώσεις που ενδέχεται να επηρέαζαν το τελικό αποτέλεσµα (ζάχαρα, οξέα, φαινολικές ενώσεις). Μετά το φιλτράρισµα, γινόταν αντικατάσταση του νερού µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου, συγκέντρωσης 20Μ, ώστε να προκληθεί συµπύκνωση. Η διάρκεια εµβάπτισης στην γλυκόλη ήταν ελεγχόµενη και κυµαινόταν από ώρες ανάλογα µε την πορεία της συµπύκνωσης. Τέλος, αφού έβγαιναν οι µεµβράνες από την γλυκόλη, συλλεγόταν το ίζηµα και τοποθετούνταν σε σωλήνες eppentorf στην κατάψυξη µέχρι να χρησιµοποιηθεί στην ηλεκτροφόρηση (CORREA-GOROSPE et al., 1991) είγµατα που χρησιµοποιήθηκαν για την επιλογή µεθόδου αποµόνωσης των πρωτεϊνών Χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 6 διαφορετικά δείγµατα, 3 στην 1 η δοκιµή και 3 στην είγµα Ποικιλία Chardonnay Αθήρι Ροδίτης Sauv. Blanc Ζουµιάτικο Malvasia συνέχεια για επιβεβαίωση της µεθόδου (βλ. πίνακα), όπου σε όλα και ανεξαρτήτως µεταχείρισης, µετρήθηκαν οι διαλυτές πρωτεΐνες (Πίνακας 3.2.2), για να βρεθεί εάν η ποσότητα των πρωτεϊνών αντικατοπτρίζεται ανάλογα στο ηλεκτρογράφηµα Μεθοδολογία Σκοπός ήταν να οριστεί ποια µέθοδος θα δώσει το καλύτερο δυνατό οπτικό αποτέλεσµα. Για να επιτευχθεί αυτό χρησιµοποιήθηκαν αρχικά τρία δείγµατα. Η καταβύθιση µε θειικό 48

45 αµµώνιο έγινε µε τρεις δόσεις (50%,60%,70%) και στη συνέχεια στα δείγµατα, µετά από λυοφιλίωση, έγινε αραίωση 1/2 µε νερό. Τα δείγµατα µετά την συµπύκνωση τη µε γλυκόλη και την µεταχείριση µε αλκοόλη, χρησιµοποιήθηκαν ως έχει χωρίς αραίωση. Τέλος, έγινε και ηλεκτροφόρηση δείγµατος γλεύκους χωρίς να προηγηθεί κάποια επεξεργασία, καθώς και λυοφιλιωµένου χωρίς προηγούµενη καταβύθιση µε θειικό αµµώνιο. Επιπρόσθετα, αφού επιλέχτηκε η µέθοδος που τελικά θα χρησιµοποιηθεί, δοκιµάστηκαν διαφορετικές αραιώσεις στα δείγµατα ώστε να επιλεχθεί η αραίωση που δίνει τα καλύτερα αποτελέσµατα. Πίνακας 3.2.2: Συγκέντρωση διαλυτών πρωτεϊνών σε σχέση µε το είδος της µεθόδου διαχωρισµού είγµα Μεταχείριση ιαλυτές Πρωτεΐνες (mg/l) 1 50% ΘΑ* % ΘΑ % ΘΑ 78 1 PAG** 23 1 Σκέτο Γλεύκος 3 1 Λυοφιλίωση 10 1 Αλκοόλη % ΘΑ % ΘΑ % ΘΑ 34 2 PAG 99 2 Σκέτο Γλεύκος 5 2 Λυοφιλίωση 0 2 Αλκοόλη % ΘΑ % ΘΑ % ΘΑ 58 3 PAG 10 3 Σκέτο Γλεύκος 5 3 Λυοφιλίωση 0 3 Αλκοόλη 16 *ΘΑ= Θειικό Αµµώνιο ** PAG= Polyethylene Glycol 3.3 Υπολογισµός βασικών οινολογικών χαρακτηριστικών 49

46 Προσδιορισµός υναµικού Αλκοολοµετρικού Τίτλου ( ΑΤ) Ο υπολογισµός του δυναµικού αλκοολοµετρικού τίτλου έγινε µε αραιόµετρο Baume βαθµολογηµένο στους 15 0 C αφού τοποθετήθηκαν 200ml γλεύκους σε ογκοµετρικό κύλινδρο. Ακολούθησε ο υπολογισµός του πραγµατικού ΑΤ µε την βοήθεια πινάκων αναγωγής Προσδιορισµός οξύτητας και ΡΗ Ο προσδιορισµός της οξύτητας έγινε τιτλοδότηση παρουσία χρωστικής κυανούν της βρωµοθυµόλης µε καυστικό νάτριο (NaOH) 1N, 5 ml δείγµατος γλεύκους στο οποίο προηγουµένως είχε αφαιρεθεί η περίσσεια διοξειδίου του άνθρακα µε ανάδευση υπό κενό. Ο υπολογισµός του ΡΗ έγινε µε την βοήθεια πεχάµετρου (Jenway 3505) 3.4. Προσδιορισµός διαλυτών πρωτεινών ιαλύµατα 1. Παρασκευή διαλύµατος ένυδρης αιθανόλης Σε ογκοµετρική φιάλη των 50ml φέρονταν 45ml απόλυτης αιθανόλης και συµπληρώνονταν µε απιονισµένο νερό. 2. Παρασκευή διαλύµατος χρωστικής CBB G-250 Σε 25 ml ένυδρης αιθανόλης, διαλύονταν 0,05g χρωστικής Coomassie Blue Brilliant G-250 και µεταφέρονταν σε ογκοµετρική φιάλη των 500ml. Στη συνέχεια, προσθέτονταν 50ml διαλύµατος 85% (v/v) φωσφορικού οξέος και ο τελικός όγκος των 500ml συµπληρώνονταν µε απιονισµένο νερό. Ακολουθούσε ανάδευση του διαλύµατος (περίπου 2 50

47 ώρες) και διηθηση υπό κενό µε διηθητικό χαρτί Blaudand. Tο χρονικό διάστηµα χρήσης της χρωστικής προσδιορίζονταν στις 30 ηµέρες Μέθοδος Εφαρµόστηκε η τροποποιηµένη µέθοδος Bradford, σύµφωνα µε την οποία 3 ml διαλύµατος χρωστικής CBB G-250 προσθέτονταν (µετά από αναµονή 3 λεπτών) σε 100 µl δείγµατος και 50µl ΝaOH. Ακολουθούσε ανάδευση και µέτρηση απορρόφησης σε µήκος κύµατος 595 nm (µε φασµατοφωτόµετρο Jenway 6300).Οι µετρήσεις απορρόφησης έγιναν µετά από 30 και 45 λεπτά. Ο µάρτυρας περιείχε στη θέση του δείγµατος απιονισµένο νερό. Η χάραξη της καµπύλης αναφοράς έγινε µε τη βοήθεια διαφόρων συγκεντρώσεων (0-100µl) ορού αλβουµίνης (A-7906) SIGMA Bovine Albumin (min 98%). Οι µετρήσεις απορρόφησης της αλβουµίνης έγιναν µετά από 30 και 45 λεπτά, εξι διαδοχικές φορές και οι καµπύλες αναφοράς (Εικ και 3.4.2) σχηµατίστηκαν από τον µέσο όρο των αποτελεσµάτων. Χρησιµοποιήθηκε η καµπύλη µε το µεγαλύτερο συντελεστή συσχέτισης (R), που όπως φαίνεται από τα παρακάτω διαγράµµατα ( ιαγ. 1,2) είναι αυτή µε τις µετρήσεις µετά από 45 λεπτά. 51

48 1 0,8 Bradford assay- προτυπη καµπύλη (30min) y = 0,0136x + 0,1437 R 2 = 0,9949 R= ,6 ABS 0,4 0, µg BSA Εικόνα 3.4.1: Πρότυπη καµπύλη αναφοράς που προήλθε από το µέσο όρο έξι διαδοχικών µετρήσεων απορρόφησης διαλύµατος ορού αλβουµίνης σε µήκος κύµατος 595 nm µετά από 30min ABS 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Bradford assay - πρότυπη καµπύλη (45 min) y = 0,0131x + 0,1366 R 2 = 0,9952 R=0, µg BSA/cuvette Εικόνα 3.4.2: Πρότυπη καµπύλη αναφοράς που προήλθε από το µέσο όρο έξι διαδοχικών µετρήσεωναπορρόφησης διαλύµατος ορού αλβουµίνης σε µήκος κύµατος 595 nm µετά από 45min 52

49 3.5 ιερεύνηση πρωτεϊνικού προφίλ του γλεύκους SDS PAGΕ (SDS PolyAcrylamideGelElectrophoresis - SDS Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου) Για να µελετηθούν οι ζώνες όπου κατανέµονται οι πρωτεΐνες των διαφόρων δειγµάτων γλεύκους εφαρµόστηκε SDS-PAG Ηλεκτροφόρηση. Χρησιµοποιήθηκε συσκευή κάθετης ηλεκτροφόρησης µε πλάκες διαστάσεων 10,0 x 8,0 x 0,75 cm (Amersham Pharmacia Biotech, Hoefer Mighty Small, SE 250 Dual Gel Caster). Η σύνθεση των διαλυµάτων που χρησιµοποιήθηκαν φαίνονται παρακάτω: Ρυθµιστικό διάλυµα συσκευής (pη 8,3) : 30,28 g γλυκίνη, 0,4 g τριςυδροξυµεθυλο-αµινοµεθάνιο (Tris) και 10 g SDS διαλυόταν σε 1 λίτρο νερό και το pη του τελικού διαλύµατος ρυθµιζόταν µε πυκνό υδροχλωρικό οξύ (HCL) στο 8,3. Ρυθµιστικό διάλυµα πηκτής διαχωρισµού (pη 8,8) : 18,18 g Tris και 0,4 g SDS διαλυόταν σε 100 ml απιονισµένου νερού και το pη ρυθµιζόταν µε πυκνό ΗCL στο 8,8. Ρυθµιστικό διάλυµα πηκτής συσσώρευσης (pη 6,8) : 6,06 g Tris και 0,4 g SDS διαλυόταν σε 100 ml απιονισµένου νερού και το τελικό pη του διαλύµατος ρυθµιζόταν στο 6,8 µε πυκνό ΗCL. Ρυθµιστικό διάλυµα δείγµατος : 1 ml 0,5 0 / 00 δείκτη µπλε της βρωµοφαινόλης, 1ml 2-µερκαπτοαιθανόλης και 2 ml γλυκερόλης διαλυόταν σε 6 ml ρυθµιστικού διάλυµατος πηκτής συσσώρευσης. Μητρικό διάλυµα : 29,1 g ακρυλαµιδίου και 0,9 γ Ν,Ν -µεθυλενο-δις-ακρυλαµιδίου (bis), διαλυόταν σε 100 ml απιονισµένου νερού. ιάλυµα υπερθειικού αµµωνίου : 80 mg υπερθειικού αµµωνίου διαλυόταν σε 1 ml απιονισµένο νερό (Παρασκευή λίγο πριν την χρήση του). 53

50 Οι πηκτές παρασκευάστηκαν µε την παρακάτω διαδικασία: Πηκτή διαχωρισµού (Resolving gel,l T=12,5%,C=3%): 8,8ml µητρικού διαλύµατος και 5,5 ml ρυθµιστικού διαλύµατος πηκτής διαχωρισµού, αναµιγνύονταν µε 6,9 ml απιονισµένου νερού. Στο διάλυµα προσθέτονταν 50ml Ν,Ν,Ν,Ν - τετραµεθυλ-αιθυλενοδιαµίνη (TEMED). Για τον πολυµερισµό χρησιµοποιούνταν 40ml διαλύµατος υπερθειικού αµµωνίου (APS). Πηκτή συσσώρευσης (Τ=5%, C=2%): 1,5ml µητρικού διαλύµατος και 2,1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος πηκτής συσσώρευσης, αναµιγνύονταν µε 5,2 ml νερό. Στο διάλυµα προσθέτονταν 24µl TEMED και 48 µl APS για τον πολυµερισµό. Η ανάµιξη του δείγµατος µε το ρυθµιστικό διάλυµα δείγµατος γίνονταν σε αναλογία 2 : 1. Ακολουθούσε θέρµανση για 15 min στους 85 0 C προκειµένου να µετουσιωθούν οι πρωτεΐνες µε τη βοήθεια του SDS. Η ποσότητα δείγµατος που χρησιµοποιήθηκε για την ηλεκτροφόρηση καθοριζόταν ανάλογα µε το πρωτεϊνικό δυναµικό της κάθε ποικιλίας (5-15 µl). Πάντως κατά κανόνα δοκιµάζονται διάφορες ποσότητες Για την ηλεκτροφόρηση δυο πλακών διοχετευ οταν στη συσκευή ρεύµα 40mA (µε όριο τάσης τα 470 V) για χρονικό διάστηµα 55 min Χρώση της πηκτής µε χρωστική Coomasie Blue Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης για τη χρώση των πρωτεϊνών χρησιµοποιήθηκε Coomassie Blue Brilliant R-250 σύµφωνα µε τη µέθοδο του Laemmli (1979). ιάλυµα χρωστικής: Σε ογκοµετρική φιάλη των 100ml φέρονταν 0,1g χρωστικής CBB R-250 και διαλυόταν σε 40 ml αιθυλικής αλκοόλης. Στη συνέχεια, προσθέτονταν µικρή ποσότητα απιονισµένου νερού και 10ml οξικού οξέος. Ο τελικός όγκος συµπληρώνονταν στα 100ml µε απιονισµένο νερό. ιάλυµα αποχρωµατισµού Ι: σε ογκοµετρική φιάλη των 100ml φέρονταν 25ml αιθυλικής αλκοόλης, 10ml οξικού οξέος. Η φιάλη συµπληρωνόταν µε απεσταγµένο νερό. 54

51 ιάλυµα αποχρωµατισµού ΙΙ : σε ογκοµετρική φιάλη των 100ml φέρονταν 5ml µεθυλικής αλκοόλης, 7ml οξικού οξέος και το διάλυµα συµπληρωνόταν µε απιονισµένο νερό. ιαδικασία χρώσης: µετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης οι πηκτές µεταφέρονταν σε γυάλινα τρυβλία και εµβαπτίζονταν σε 70 ml διαλύµατος χρωστικής. Παρέµεναν στο διάλυµα για 24 ώρες. ιαδικασία αποχρωµατισµού : µετά από 24 ώρες παραµονής στο διάλυµα της CBB R-250, η χρωστική αποµακρυνόταν και η πηκτή εµβαπτιζ οταν για µια ώρα στο διάλυµα αποχρωµατισµού Ι. Ακολούθως, το διάλυµα Ι αποµακρύνονταν και η πηκτή εµβαπτίζονταν για µια ώρα ακόµη στο διάλυµα αποχρωµατισµού ΙΙ. Μετά το πέρας της µιας ώρας, το διάλυµα αποχρωµατισµού ΙΙ ανανεωνόταν µε νέο, στο οποίο και παρέµενε η πηκτή Χρώση της πηκτής µε Νιτρικό Άργυρο (Silver Stain) Τα βήµατα που ακολουθήθηκαν κατά την χρώση µε Νιτρικό Άργυρο (Silver Stain) ήταν τα εξής (Alphalyse Silver Stain Protocol): 1.) Τοποθέτηση της πηκτής σε διάλυµα 10% οξικού οξέος. 40% αιθανόλης και 50% απιονισµένου νερού. 2.) Πλύσιµο της πηκτής µε απιονισµένο νερό για 30 min 3.) Ευαισθητοποίηση της πηκτής µε 0.02% Na2S2O3 (0.04 g Na2S2O3, 200 ml απιονισµένου νερού) για 1 min. 4.) Πλύσιµο της πηκτής µε νερό για 20 sec εις τριπλούν. 5.) Εκκόλαψη της πηκτής σε διάλυµα νιτρικού αργύρου (0.1% AgNO 3 [0.2 g, 200 ml νερό], 0,02% φορµαλδεΰδη) για 20 min στους 4 ο C 6.) Πλύσιµο της πηκτής µε νερό για 20 sec εις τριπλούν. 55

52 7.) Τοποθέτηση της πηκτής σε διάλυµα 3% Na2CO3, (7.5 g, 250 ml H2O) και 0.05% φορµαλδεΰδης. Παρατήρηση του χρώµατος και αλλαγή του διαλύµατος όταν το χρώµα του γίνει κίτρινο. 8.) Πλύσιµο της πηκτής µε νερό για 20 sec 9.) Τερµατισµός της χρώσης σε 5% οξικό οξύ για 5 min 10.) Αποθήκευση της πηκτής σε 1% οξικό οξύ, στους 4 ο C 56

53 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 57

54 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1. Επιλογή µεθόδου αποµόνωσης των πρωτεϊνών Για να επιλεχθεί ποια µέθοδος θα χρησιµοποιηθεί, έγιναν δοκιµές και ακολούθησε αξιολόγηση τριών µεθόδων προετοιµασίας δείγµατος µε σκοπό την καλύτερη αποµόνωση των πρωτεϊνών. Οι µέθοδοι που αξιολογήθηκαν είναι οι εξής: α) Καταβύθιση µε αιθανόλη β) Λυοφιλίωση µετά από καταβύθιση µε θειικό αµµώνιο γ) Συµπύκνωση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου και διήθηση σε µεµβράνες διαχωρισµού Συζήτηση Χρησιµοποιήθηκαν 3 δείγµατα ( 1, 2, 3), τα οποία επεξεργάστηκαν µε 4 διαφορετικές µεθόδους. Στα δείγµατα αυτά έγινε ηλεκτροφόρηση και στις εικόνες και φαίνονται τα ηλεκτρογραφήµατα από τα δείγµατα 1 και 2. Συγκρίνοντας τα ηλεκτρογραφήµατα των δύο δειγµάτων παρατηρηρήθηκε ότι -συνολικά- καλύτερα οπτικά αποτελέσµατα πρέκυψαν µε την µέθοδο της συµπύκνωσης µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου. Στο δείγµα 2 καλό αποτέλεσµα λήφθηκε και µε την καταβύθιση µε αιθανόλη (Εικ ), όπου φαίνεται ότι η ποσότητα των πρωτεϊνών αντικατοπτρίζεται ικανοποιητικά στο ηλεκτρογράφηµα (πιο έντονα τα ηλεκτρογραφήµατα µε τις περισσότερες πρωτεΐνες). Αυτό που ενδιέφερε ήταν, οι πρωτεΐνες που υπολογίζονταν να απεικονίζονταν το καλύτερο δυνατό πάνω στο ηλεκτρογράφηµα. Άλλωστε, µε οποιαδήποτε µεθοδολογία, ο περιορισµός της επίδρασης άλλων ουσιών π.χ. αλάτων και ιδίως των φαινολικών ουσιών που σχηµατίζουν µε τις πρωτεΐνες ενώσεις και ίσως µεταβάλλουν το τελικό αποτέλεσµα, είναι δύσκολο αν όχι αδύνατο. Συνοπτικά, στόχος ήταν να ληφθούν ηλεκτρογραφήµατα όπου αυτό που θα φαίνεται θα είναι κυρίως πρωτεΐνες και όχι άλλες ενώσεις. Για παράδειγµα, στο δείγµα 2 υπολογίστηκαν σχεδόν οι διπλάσιες πρωτεΐνες σε σχέση µε τα δείγµατα 1 και 58

55 3, πράγµα που φαίνεται καθαρά στα ηλεκτρογραφήµατα των τριών δειγµάτων, µετά από µεταχείριση µε γλυκόλη, Εικ Αφού επιλέχθηκε η µέθοδος ηλεκτροφόρησης, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση άλλων τριών ποικιλιών, ώστε να επιλεχθεί η αραίωση και η ποσότητα δείγµατος που θα χρησιµοποιούνταν στην πορεία µε σκοπό να ληφθούν ακόµα καλύτερα ηλεκτρογραφήµατα, διότι π.χ. είναι φανερό πως στο δείγµα 2 η ποσότητα που χρησιµοποιήθηκε ήταν µεγάλη και το ηλεκτρογράφηµα ήταν πυκνό µε αποτέλεσµα ίσως κάποιες ζώνες να επικαλύπτονται. Αυτό βέβαια εξαρτάται πάντα και από τις αρχικές διαλυτές πρωτεΐνες που υπάρχουν στο δείγµα. Αν ένα δείγµα είναι πλούσιο σε πρωτεΐνες, για να υπάρξει καλύτερη απεικόνιση, εφαρµόζεται αραίωση του αρχικού δείγµατος (µε νερό) ή χρησιµοποιείται µικρότερη ποσότητα δείγµατος. Όπως φαίνεται από την Εικ τα τελικά ηλεκτρογραφήµατα, αφού εφαρµόστηκαν διάφορες αραιώσεις (δείγµα/νερό: ¼ και ½ ) είναι συµπαγή µε ευδιάκριτες και καθαρές ζώνες (Αραιώσεις έγιναν στα δείγµατα 4, 5, 6, τα οποία χρησιµοποιήθηκαν σε περαιτέρω αναλύσεις) Συµπεράσµατα Επιλέχθηκε η τρίτη µέθοδος (συµπύκνωση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου και διήθηση σε µεµβράνες διαχωρισµού) για τους εξής λόγους: Είναι πιο εύχρηστη και µη χρονοβόρα Παρέχει τα καλύτερα (οπτικά), µετά από κατάλληλη επεξεργασία, αποτελέσµατα όσον αφορά την απεικόνιση των πρωτεϊνών στα ηλεκτρογραφήµατα Είναι πιο αξιόπιστη µέθοδος αφού µάλλον περιορίζεται σε µεγαλύτερο βαθµό η επίδραση άλλων ουσιών (π.χ φαινολικών) που αντιδρούν µε τις πρωτεΐνες και επηρεάζουν την πραγµατική τους συγκέντρωση 59

56 Εικόνα Ηλεκτρογράφηµα του δείγµατος 1 ( 1) που έχει επεξεργαστεί µε διάφορες µεθόδους προκειµένου να αποµονωθούν οι πρωτεΐνες του (Από αριστερά προς δεξιά, Α ): Με 70% θειικό αµµώνιο, µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου, απευθείας λυοφιλίωση, αµεταχείριστο δείγµα, µε αιθυλική αλκοόλη και standard διάλυµα Εικόνα Ηλεκτρογράφηµα του δείγµατος 2 ( 2) που έχει επεξεργαστεί µε διάφορες µεθόδους προκειµένου να αποµονωθούν οι πρωτεΐνες του (Από αριστερά προς δεξιά, Α ): Με 50%, 60% και 70% θειικό αµµώνιο, µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου, απ ευθείας λυοφιλίωση, αµεταχείριστο δείγµα, µε αιθυλική αλκοόλη και standard διάλυµα 60

57 Εικόνα Συγκριτικό ηλεκτρογράφηµα όλων των δειγµάτων µετά από µεταχείριση µε γλυκόλη πολυαιθυλενίου (Από αριστερά προς δεξιά, Α ): Standard διάλυµα, είγµα 5 µε αραίωση 20/80 (δείγµα/νερό), είγµα 6 (100%), είγµα 4 (50/50), είγµα 1 (100%), είγµα 2 (100%), είγµα 3 (100%) 61