Βασικές αρχές φυλογένεσης

Transcript

1 Βασικές αρχές φυλογένεσης Οποιαδήποτε ομάδα οργανισμών προέρχεται από έναν κοινό πρόγονο μέσω της εξέλιξης Υπάρχει διχαλωτό πρότυπο στην εξέλιξη Αλλαγή στα χαρακτηριστικά εμφανίζεται μετά το πέρασμα πολλών γενιών

2 Εισαγωγικές έννοιες Φυλογένεση είναι η εξέλιξη γενετικά συγγενικών ομάδων οργανισμών Ταξινόμηση είναι η επιστήμη κατηγοριοποίησης των οργανισμών. Η μελέτη σχέσεων μεταξύ ομάδων / πραγμάτων (γονίδια, πρωτεΐνες, ιστοί...) που προέρχονται από έναν κοινό πρόγονο. Ευρύ φάσμα εφαρμογής των μεθόδων φυλογενετικής στο οποίο πέραν από τη μοριακή και συστηματική εξέλιξη, συμπεριλαμβάνονται οι μελέτες βιοποικιλότητας, η φαρμακευτική έρευνα και οι επιδημιολογικές μελέτες κτλ.

3 Βάσεις δεδομένων Φυλεγενετικής Entrez: Ribosomal database project: Internal trasncribed spacer 2 : Softwares and packages: tml

4 Γιατι φυλογενετική; Για να βρούμε δεσμούς συγγένειας μεταξύ οργανισμών (και να αναλύσουμε τις αλλαγές που συμβαίνουν σε διαφορετικούς οργανισμούς κατά την εξέλιξη τους) Να κατανοήσουμε τις φυλογενετικές σχέσεις της προγονικής αλληλουχίας με τους απογόνους της Πώς εξελίσσονται οι οικογένειες πρωτεϊνών Πρόβλεψη λειτουργίας (π.χ. διάγνωση ορθόλογων γονιδίων) Υπολογισμός του χρόνου απόκλισης ομάδων οργανισμών από την προγονική αλλληλουχία. Μελέτη αλλαγών σε γρήγορα εξελισσόμενα είδη (π.χ. ιός HIV). ).

5 Φυλλογενετική ανάλυση Φυλογενετική είναι η μελέτη εξελικτικών σχέσεων. Η φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιείται ως το μέσο για την εκτίμηση αυτών των σχέσεων. Η συνηθέστερη μέθοδος για την αναπαράσταση της εξελικτικής ιστορίας (οργανισμών, αλληλουχιών, κοκ), είναι τα φυλογενετικά δένδρα ή δεδρογράμματα.

6 Δενδρογράμματα

7 Φυλογενετικό δένδρο Ένα φυλογενετικό δένδρο είναι ένα συνδεδεμένο μη κυκλικό δυαδικό γράφημα το οποίο αποτελείται από ένα σύνολο από κλάδους οι οποίοι συνδέουν τα τάξα, ώστε 1.Ο κάθε κόμβος συνδέεται με κάθε άλλο κόμβο μέσω μίας και μόνο μια διαδρομής. 2.Τα μήκη των κόμβων αντιπροσωπεύουν αποστάσεις (χρονικές, μοριακών διαφορών). 3.Με κλίμακα απόστασης ή χωρίς.

8 Εισαγωγή Κλαδος ενός δενδρογράμματος είναι ένα μονοφυλετικό τάξο, δηλαδή ομάδες οργανισμών ή αλληλουχιών οι οποίες περιλαμβάνουν τον πλέον πρόσφατο εξελικτικό τους πρόγονο και όλους τους απογόνους αυτού του προγόνου. Συχνά, το μήκος των διακλαδώσεων ενός δενδρογράμματος είναι ανάλογο της εξελικτικής απόκλισης μεταξύ των κλάδων του.

9 Ορολογία δενδρογράμαμτος Φύλα: ανιπαριστούν ταξονομικές μονάδες οι οποίες είναι ομάδες οργανισμών, ειδών, γονιδίων Κόμβος : ο κόμβος περιλαμβάνει έναν κλάδο και όλες τις ταξινομικές μονάδες που προκύπτουν από αυτόν ή ένα άγνωστο προγονικό είδος (ρίζα). Ένας εσωτερικός κόμβος αντιπροσωπεύει τον πιο πρόσφατο κοινό πρόγονο των ταξινομικών μονάδων που προήλθαν από αυτόν. Οι τερματικοί κόμβοι είναι τα φύλλα του δένδρου. Βραχίονας : καθορίζει τη σχέση μεταξύ των φύλων με βάση την απόκλιση των αλληλουχιών και την καταγωγή της. Το μήκος του βραχίονα ανιπαραστά τον αριθμό αλλαγών που συνέβησαν σε ένα βραχίονα. Τοπολογία : Ο τρόπος διακλάδωσης του δένδρου.. Ρίζα : είναι ο κοινός πρόγονος όλων των ταξών. Κλίμακα απόστασης : η κλίμακα αντιστοιχίας απόστασης με τον αριθμό των διαφορών μεταξύ των αλληλουχιών (π.χ. 0.1 σημαίνει 10% διαφορών μεταξύ δύο αλληλουχιών).

10 Απαιτήσεις Οι συνηθισμένες υποθέσεις στις οποίες βασίζεται η φυλογενετική ανάλυση (στα πλαίσια της εξελικτικής θεωρίας) είναι: 1.Κάθε ομάδα οργανισμών προέρχεται από κάποιο κοινό πρόγονο. 2.Η μεταβολή των χαρακτηριστικών γίνεται προοδευτικά με την πάροδο του χρόνου (δηλαδή η μεταβολή χαρακτηριστικών είναι συνάρτηση του χρόνου). 3.Οι φυλογενετικές σχέσεις και τα αντίστοιχα δενδρογράμματα είναι δυαδικές/ά (κάθε κόμβος χωρίζεται σε δύο κλάδους).

11 Δένδρο με ρίζα (rooted rooted tree) ή χωρίς (rooted unrooted tree) Τα δενδρογράμματα μπορεί να είναι με ρίζα (rooted) ή χωρίς ρίζα (unrooted) Τα δενδοργράμματα με ρίζα αντικατροπτίζουν τον πιο βασικά κοινό πρόγονο των αλληλοουχιών/οργανισμών Η τοποθέτηση ρίζας σε ένα φυλογεννετικό δένδρο γίνεται με διάφορους τρόπους. Παραδείγματος χάρην, εάν δεχθούμε την ύπαρξη ενός μοριακού ρολογιού (ίδιος/παρόμοιος ρυθμός εξέλικτικής διαφοροποίησης για όλες τις αλληλυχίες) τότε η ρίζα βρίσκεται στον κόμβο του μακρύτερου βραχίονα του φυλογενετικού δένδρου. Η τοποθέτηση ρίζας μπορεί επίσης να γίνει με βάση μια ταξινομική μονάδα αναφοράς η οποία σχετίζεται λιγότερο με τις μονάδες υπό εξέταση. Τα δενδρογράμματα χωρίς ρίζα δεν υποδεικνύουν κοινή προγονική ρίζα.

12 Τρόποι σχεδιάσης δένδρων Trees can be drawn in different ways. There are trees with unscaled branches and with scaled branches. Unscaled branches : the length is not proportional to the number of changes. Sometimes, the number of changes are indicated on the branches with numbers. The nodes represents the divergence event on a time scale. Scaled branches : the length of the branch is proportional to the number of changes. The distance between 2 species is the sum of the length of all branches connecting them. It is also possible to draw these trees with or without a root. For rooted trees, the root is the common ancestor. For each species, there is a unique path that leads from the root to that species. The direction of each path corresponds to evolutionary time. An unrooted tree specifies the relationships among species and does not define the evolutionary path.

13 Εξελικτικές σχέσεις Ορθόλογες: είναι οι ομόλογες αλληλουχίες που προέρχονται από γεγονότα ειδογένεσης. Εκπροσωπούν γονίδια προερχόμενα από ένα προγονικό γονίδιο στον τελευταίο κοινό πρόγονο των ειδών με τα οποία είναι συνδεδεμένα. Συνήθως έχουν κοινή λειτουργία. Παράλογες: είναι οι ομόλογες αλληλουχίες που προέρχονται απο γονιδιακούς διπλασιασμούς. Εκπροσωπούν γονίδια προερχόμενα από ένα κοινό προγονικό γονίδιο το οποίο διπλασιάστηκε σε ένα είδος και ύστερα απέκλινε. Συνήθως έχουν διαφορετική λειτουργία. Ξενόλογες: είναι οι ομόλογες ακολουθίες που προκύπτουν από οριζόντια μεταφορά γενετικού υλικού μεταξύ των ειδών.

14 Orthologs vs Paralogs

15 Globin sequences

16 Εξελικτικό δείγμα Η πράξη εύρεσης ενός φυλογενετικού δένδρου από ένα σύνολο στοιχισμένων αλληλουχιών προϋποθέτει: Οι αλληλουχίες είναι ομόλογες. Κάθε θέση ή τμήμα των στοιχισμένων αλληλουχιών είναι ομόλογο με κάθε άλλη θέση ή τμήμα της στοίχισης Οι αλληλουχίες έχουν κοινή φυλογενετική ιστορία (δεν ισχύει, για παράδειγμα, στη σύγκριση ανάμεσα σε πυρηνικές -μιτοχονδριακές αλληλουχίες). Το ταξινομικό εύρος των αλληλουχιών αρκεί για την προσδοκώμενη φυλογενετική ανάλυση.

17 Εξελικτικό δείγμα Η ποικιλότητα των αλληλουχιών που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση είναι αντιπροσωπευτική της ποικιλότητας (σε επίπεδο αλληλουχιών) που υπάρχει στα τάξα υπό έλεγχο. Η ποικιλότητα των αλληλουχιών του δείγματος εμπεριέχει αρκετή φυλογενετική πληροφορία ώστε να μπορεί να πραγματοποιηθεί η προσδοκώμενη φυλογενετική ανάλυση.

18 Επιλογή αλληλουχιών στη φυλογενετική ανάλυση Η επιλογή των αλληλουχιών που υπόκεινται σε φυλογενετική ανάλυση εξαρτάται από τη γενικότερη φιλοσοφία της ανάλυσης. Για τη μελέτη συγγενών οργανισμών (π.χ. πρωτευόντων) το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) είναι μια χρήσιμη πηγή αλληλουχιών, διότι συσσωρεύει πολύ ταχύτερα ενδογενείς μεταλλάξεις από ότι το πυρηνικό DNA. Όσον αφορά τη φυλογενετική ανάλυση εξελικτικά απομακρυσμένων οργανισμών (π.χ. βακτήρια και ευκαρυώτες) χρειάζεται ένα μόριο το οποίο είναι παρόν σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Σε αυτές τις περιπτώσεις συνιστάται το ριβοσωμικό RNA (rrna), το οποίο παρουσιάζει ένα χαμηλό βαθμό ανεκτικότητας στις μεταλλάξεις και εξελίσσεται με πολύ αργό ρυθμό. Για τη μελέτη μιας πρωτεΐνης ή συγκεκριμένης δομικής περιοχής ενδείκνυνται οι αμινοξικές αλληλουχίες. Οι μεταλλάξεις σε αυτές τις αλληλουχίες επιβιώνουν υπό την προϋπόθεση ότι δεν έχουν επιβλαβείς συνέπεις στη δομή και στη λειτουργία της πρωτεΐνης.

19 Εξελικτικό μοντέλο Μερικές από τις μεθόδους που θα περιγραφούν θέτουν και επιπλέον περιορισμούς, όπως για παράδειγμα: Οι αλληλουχίες του δείγματος θεωρείται ότι εξελίχθηκαν μέσω μια τυχαίας (στοχαστικής) διαδικασίας, η οποία ήταν η ίδια για όλες τις αλληλουχίες. Όλες οι θέσεις των αλληλουχιών θεωρείται ότι εξελίχθηκαν μέσω της ίδια τυχαίας διαδικασίας. Κάθε θέση των αλληλουχιών θεωρείται ότι εξελίχθηκε ανεξάρτητα από τις υπόλοιπες θέσεις.

20 Πρότυπα υποκατάστασης Τα πρότυπα υποκατάστασης (αντικατάστασης) επηρεάζουν σημαντικά την κατασκευή του φυλογενετικού δένδρου διότι αποτελούν το βιολογικό υπόβαθρο των μαθηματικών τύπων που ορίζουν την ομοιότητα των νουκλεοτιδίων και αμινοξέων. Τα πρότυπα υποκατάστασης βασίζονται στην υπόθεση ότι η εξέλιξη είναι μια τυχαία διαδικασία που εξαρτάται από τις αντικαταστάσεις μεταξύ βάσεων (μεταπτώσεις και μεταστροφές) ή από τις αντικαταστάσεις μεταξύ μεταξύ αμινοξικών καταλοίπων. Ο καθορισμός του ρυθμού των αντικαταστάσεων μεταξύ θέσεων απεικονίζεται ως πλαίσιο.

21 Μοντέλο υποκατάστασης Για πρωτεϊνικές αλληλουχίες, οι συχνότητες (πιθανότητες) υποκατάστασης δίδονται απο τους γνωστούς πίνακες PAM, BLOSUM. Ο υπολογισμός της απόστασης μεταξύ δύο αλληλουχιών μπορεί να μετατραπεί σε άλλες μονάδες όπως η αναμενόμενη επί τοις εκατό αλλαγή νουκλεοτιδίων/αμινοξέων μεταξύ δύο αλληλουχιών. Στα μοντέλα υποκατάστασης μπορούν να ενσωματωθούν επίσης διαφορές στο ρυθμό υποκατάστασης διαφορετικών τμημάτων της αλληλουχίας (π.χ. 3η βάση του κώδικα). Γενικά, όπως και σε κάθε διαδικασία μοντελοποίησης το πιο σύνθετο μοντέλο είναι και το καλύτερο, αλλά, από την άλλη απαιτεί περισσότερα δεδομένα και αλλά και υπολογιστική ισχύ, καθώς χρειάζεται η εκτίμηση μεγαλύτερου αριθμού παραμέτρων

22 Πίνακας αποστάσεων Ο πίνακας των αποστάσεων δυο ακολουθιών θα μπορούσε γενικά να προκύψει με πολλούς τρόπους. Ένας εύκολος τρόπος θα ήταν μετρώντας απλά το ποσοστό από τις θέσεις, στις οποίες τα κατάλοιπα διαφέρουν. Αυτό είναι ένα λογικό μέτρο, αλλά δεν αποδίδει καλά για ασυσχέτιστες ακολουθίες, καθώς θέλουμε σε αυτή την περίπτωση η απόσταση να αυξάνει. Μια καλύτερη λύση, προκύπτει από την αρχική πολλαπλή στοίχιση με χρήση κάποιου από τα πιθανοθεωρητικά μοντέλα της εξέλιξης Μόλις οι αποστάσεις υπολογιστούν, η πολλαπλή στοίχιση δεν χρησιμοποιείται ξανά, και όλοι οι υπολογισμοί γίνονται με χρήση του πίνακα.

23 Πιθανοθεωρητικά Αλληλουχιών Μοντέλα της Εξέλιξης των Νουκλεοτιδικών Το πρώτο θέμα που χρειάζεται σχεδόν σε όλες σχεδόν τις φυλογενετικές αναλύσεις, με την εξαίρεση της φειδωλότητας, είναι ο καθορισμός του μοντέλου με το οποίο θεωρούμε ότι έχει συντελεστεί η εξελικτική διαδικασία. Η έννοια της ανέλιξης Markov. Η διαφορά σε σχέση με τα μοντέλα που θα παρουσιάσαμε στις ευθυγραμίσεις/συναρμολογήσεις είναι ότι δεν ενδιαφερόμαστε για το ποιο νουκλεοτίδιο ακολουθεί κάποιο άλλο στην ίδια αλυσίδα αλλά ποιο νουκλεοτίδιο θα αντικαταστήσει ένα συγκεκριμένο, σε κάποια μελλοντική χρονική στιγμή.

24 Aνέλιξη νέλιξη Markov Πρέπει να τονίσουμε εδώ ότι μια ανέλιξη Markov, σαν αυτές που περιγράφουμε εδώ, μπορεί να έχει τρεις βασικές ιδιότητες (Lio & Goldman, 1998). ). 1.Πρώτον, η αλυσίδα Markov μπορεί να είναι ομογενής χρονικά (homogeneity), δηλαδή οι πιθανότητες μεταβάσεως να μην εξαρτώνται από το χρόνο. Σε μια ομογενή αλυσίδα οδηγούμαστε τελικά σε μια κατάσταση ισορροπίας (equilibrium). 2.Δεύτερον, η αλυσίδα Markov να είναι στάσιμη (stationary), δηλαδή σε κάθε χρονική στιγμή η κατανομή των βάσεων είναι αυτή της κατάστασης ισορροπίας. 3.Και τρίτον, είναι δυνατόν να ισχύει η αντιστρεπτότητα (reversibility) των πιθανοτήτων μεταβάσεως, δηλαδή οι πιθανότητες να είναι ίδιες και για τις αντίστροφες μεταβάσεις. Στα μοντέλα φυλογενετικής εξέλιξης συνήθως υποθέτουμε ότι πληρούν και τις 3 παραπάνω προϋποθέσεις, για λόγους υπολογιστικής απλότητας. Το κλασικό μοντέλο JC69 -όλες οι μεταβάσεις έχουν την ίδια πιθανότητα εμφάνισης (στοχαστικό).

25 Kimura-K2P βελτιωμένο στοχαστικό το μοντέλο του διάσημου εξελικτικού βιολόγου Kimura (Kimura, 198). 0) το οποίο συμβολίζεται ως K2P το μοντέλο αυτό είναι δι-παραμετρικό καθώς προβλέπει άλλες πιθανότητες υποκαταστάσεως για μεταπτώσεις (π.χ. A<- > G, T<->C ) και άλλες για μεταστροφές (π.χ. A<->T, G<->C ). βασική ιδιότητα του είναι ότι καθώς t-> ισχύει q A = q T = q G = q C = 1/4 δηλαδή στην κατάσταση ισορροπίας μετά την παρέλευση «άπειρου» χρόνου θα έχουμε μια ισοκατανομή των βάσεων του DNA. αυτό όμως ξέρουμε ότι δεν είναι τόσο ρεαλιστικό καθώς οι οργανισμοί παρουσιάζουν μεγάλη μεταβλητότητα στο λόγο των βάσεων (A+T)/(G+C)

26 Tοοντέο μοντέλο των Hasegawa-Kishono-Yano (rooted Hasegawa, Kishino, & Yano, 1985) (rooted HKY85) Για να αντιμετωπισθεί αυτό έχουν προταθεί άλλα πιο σύνθετα μοντέλα (Felsenstein, 198). 1; Lio & Goldman, 1998). ; Penny & Hendy, 2001). Σ αυτά, ο πίνακας των ρυθμών υποκαταστάσεως στηρίζεται σε παρατηρηθησες συχνότητες νουκλεοτιδίων στις υπό μελέτη ακολουθίες (π Α, π G, π C, π T ), και κατά συνέπεια επιτρέπει στην κατάσταση ισορροπίας να έχουμε διαφορετικές κατανομές των νουκλεοτιδίων, μια προσέγγιση η οποία είναι πιο ρεαλιστική. Για παράδειγμα, το μοντέλο F8). 1 του Fenselstein (Felsenstein, 198). 1), μοιάζει αρκετά με το κλασικό μοντέλο JC69, στο ότι χρησιμοποιεί μόνο μία παράμετρο (μ) για τις μεταπτώσεις και τις μεταστροφές, αλλά μοντελοποιεί τα τέσσερα νουκλεοτίδια με διαφορετικές πιθανότητες εμφάνισης (π Α, π G, π C, π T ): Μια λογική επέκταση αυτού του μοντέλου, είναι εφικτή αν θεωρήσουμε ότι οι μεταπτώσεις έχουν διαφορετικό ρυθμό από τις μεταστροφές, χρησιμοποιώντας δύο παραμέτρους (κ και μ): Αυτό είναι το μοντέλο των Hasegawa-Kishono-Yano (Hasegawa, Kishino, & Yano, 198). 5) (HKY8). 5), ενώ παρόμοιο είναι και το μεταγενέστερο μοντέλο του Fenselstein, το λεγόμενο F8). 4, το οποίο μοντελοποιεί το ίδιο φαινόμενο αλλά διαφέρει στην παραμετροποίηση.

27 Διαδικασία ανάλυσης Η φυλογενετική ανάλυση αλληλουχιών μπορεί να χωριστεί σε πέντε στάδια, αν και μερικά από αυτά είναι αλληλοεξαρτώμενα και μπορεί να επαναλαμβάνονται κυκλικά μέχρις συγκλίσεως. Τα στάδια είναι: 1.Στοίχιση αλληλουχιών. 2.Μετατροπή στης στοίχισης πολλών αλληλουχιών ώστε να γίνει κατάλληλη για φυλογενετική ανάλυση. 3.Προσδιορισμός του μοντέλου υποκατάστασης. 4.Κατασκευή δένδρου. 5.Εκτίμηση δενδρογράμματος.

28 Problems and Errors in Phylogenetic Reconstruction Inherent strengths and weaknesses in different tree-making methodologies. More is better Errors in inferred phylogeny may be caused by small data sets and/or limited sampling. Unsuitable sequences those undergoing rapid nucleotide changes or slow to zero changes overtime may skew phylogenetic estimations

29 Problems and Errors in Phylogenetic Reconstruction Mutations:Duplications, inversions, insertions, Deletions etc. Can give inaccurate signals. Genomic hotspots: Small regions of rapid evolution are not easily detected. Homoplasy: nucleotide changes that are similar but occurred independently in separate lineages are mistakenly assumed as inherited changes. Sample contamination / mislabeling: always a possibility when working with large data set.

30 Στοίχιση αλληλουχιών Ενώ στη χρήση των στοιχίσεων για την εύρεση ομολόγων πρωτεϊνών η έμφαση είναι στην ομοιότητα (π.χ. % ταυτότητα) των αλληλουχιών, για την φυλογενετική ανάλυση η κυρίως πληροφορία βρίσκεται όχι τόσο στις ταυτόσημες υποκαλουθίες, αλλά στις θέσεις της στοίχισης που οι αλληλουχίες διαφέρουν (χωρίς να παύουν, βέβαια, να είναι ομόλογες).

31 Στοίχιση αλληλουχιών Οι σημαντικότεροι παράμετροι της στοίχισης φαίνεται να είναι τα gap penalties. Ιδιαίτερα για στοιχίσεις που θα χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία φυλογενετικών δένδρων τα μεταβαλλόμενα gap penalties (αυτά που εξαρτώνται την απόκλιση των αλληλουχιών) φαίνεται να είναι ιδιαίτερα χρήσιμα. Ευρείας αποδοχής είναι επίσης μεθόδοι που μειώνουν τη συνεισφορά στην ολική βαθμολογία της στοίχισης εκείνων των αλληλουχιών που είναι στενά συσχετιζόμενες και σε πολλά αντίγραφα. με αυτόν τον τρόπο μειώνεται η πιθανότητα να καθορίσουν οι συγγενείς αλληλουχίες τη στοίχιση των πλέον απομακρυσμένων.

32 Πολλαπλή στοίχιση αλληλουχιών 1.Αναζήτηση νουκλεϊκών ή αμινοξικών αλληλουχιών πρός στοίχιση σε βάσεις δεδομένων 2.Περικοπή αλληλουχιών, ούτως ώστε να στοιχίζονται αλληλουχίες που έχουν παρόμοιο μήκος 3.Εκτέλεση προγράμματος πολλαπλής στοίχισης 4.Χειροκίνητη επεξεργασία της στοίχισης με ιδιαίτερη έμφαση στις περιοχές που είναι πλούσιες σε κενά 5.Ενδείκνυται διόρθωση της στοίχισης με διαγραφή αλληλουχιών οι οποίες αλλοιώνουν τη στοίχιση σε σημαντικό βαθμό 6.Συνιστάται επίσης η επαναστοίχιση των αλληλουχιών χρησιμοποιωτας διαφορετικούς πίνακες αντικατάστασης και /ή τρόπο βαθμολόγησης

33 Προοδευτική πολλαπλή στοίχιση 1.Αρχικές κατά ζεύγη στοιχίσεις όλων των ακολουθιών 2.Με βάση αυτές τις στοιχίσεις, κατάσκευή πίνακα αποστάσεων και ενός δέντρου οδηγού (guide tree) 3.Προοδευτική στοίχιση των πιο όμοιων ακολουθιών μεταξύ τους, μέχρι τέλους Όπως είναι εμφανές, τα βήματα αυτά, θα μπορούσαν να υλοποιηθούν με διαφορετικούς τρόπους. Για παράδειγμα, οι κατά ζεύγη στοιχίσεις θα μπορούσαν να γίνουν με δυναμικό προγραμματισμό ή με ευριστική μέθοδο (BLAST, FASTA). Ο πίνακας των αποστάσεων θα μπορούσε να οριστεί με τελείως διαφορετικά κριτήρια, ενώ και το δέντρο οδηγός θα μπορούσε να κατασκευαστεί με μια πλειάδα αλγορίθμων ομαδοποίησης (clustering).

34 Παράδειγμα προοδευτικής (rooted ιεραρχικής) πολλαπλής στοίχισης 5 ακολουθιών Αφού έχουν υπολογιστεί οι αποστάσεις, ο αλγόριθμος κατασκευάζει ένα δέντρο με τη χρήση του αλγορίθμου των Fitch και Margoliash (Fitch & Margoliash, 1967). Ο αλγόριθμος αυτός είναι από τους πιο γρήγορους αλγόριθμους ομαδοποίησης, και προτάθηκε αρχικά για την κατασκευή φυλογενετικών δέντρων. Γενικά, το δέντρο οδηγός της προοδευτικής πολλαπλής στοίχισης, έχει πολλά κοινά με τα φυλογενετικά δέντρα αλλά πρέπει να σημειώσουμε, ότι δεν είναι το ίδιο ένα τέτοιο δέντρο, τουλάχιστον όχι με την αυστηρή έννοια. Ο σκοπός εδώ είναι να παραχθεί γρήγορα μια ομαδοποίηση η οποία θα κατευθύνει τη στοίχιση, και όχι να βρεθεί ο κοινός πρόγονος των ακολουθιών και ο χρόνος απόκλισης της κάθε μίας.

35 Στοίχιση και δενδρογράμαμτα Οι προοδευτικές μέθοδοι στοίχισης χρησιμοποιούν ένα δενδρόγραμμα-οδηγό (βασισμένο στις ανά ζεύγη στοιχίσεις των αλληλουχιών) προκειμένου να πραγματοποιήσουν τη στοίχιση. Στη συνέχεια, δημιουργείται η πολλαπλή στοίχιση ξεκινώντας από το ζεύγος των πιο κοντινών αλληλουχιών και προσθέτωντας προοδευτικά τα ζεύγη των πιο απομακρυσμένων αλληλουχιών. Αυτές οι μέθοδοι έχουν το μειονέκτημα οτι τα κενά που έχουν εισαχθεί στις αρχικές στοιχισείς διατηρούνται και στις επόμενες.

36 Χειρισμός κενών Η πλέον ακραία μορφής επέμβαση είναι η αφαίρεση από τη στοίχιση όλων των θέσεων που περιλαμβάνουν κενά. Αυτός ο χειρισμός αποφεύγει το πρόβλημα της εκτίμισης των σχέσεων μεταξύ των αλληλουχιών χωρίς τις επιπλοκές από την παρουσία indels. Το εμφανές πρόβλημα είναι ότι όλη η φυλογενετική πληροφορία που περιέχεται στις αντίστοιχες περιοχές δεν χρησιμοποιείται. Μερικές από τις μεθόδους κατασκευής δένδρων μπορούν να χρησιμοποιήσουν τα κενά ως ξεχωριστούς χαρακτήρες (5ός τύπος νουκλεοτιδίων, 21ο αμινοξύ).

37 Aνέλιξη lignment surgery Αυτό είναι το τμήμα διαδικασίας φυλογενετικής ανάλυσης αλληλουχιών που συνήθως απαιτείται τόσο η ανθρώπινη παρέμβαση όσο και η κατανόηση της βιολογικής σημασίας των δεδομένων και του εξελικτικού προβλήματος. Σε αυτό το στάδιο γίνεται η επεξεργασία της στοίχισης, σκοπός της οποίας είναι : 1) να απαλοιφούν από τη στοίχιση τμήματα αμφίβολης αξίας (βιολογικής σημασίας) και 2) να χρησιμοποιηθούν τα κενά (indels) ανάλογα με το ποιά μέθοδος θα επιλεγεί για την κατασκευή της πολλαπλής στοίχισης και του δένδρου.

38 Βελτιστοποιημένες μέθοδοι πολλαπλής στοίχισης Η προοδευτική μέθοδος στοίχισης, δεν είναι πάντα αποτελεσματική, καθώς το ζευγάρι με τη μεγαλύτερη ομοιότητα μπορεί να προσδώσει συστηματικό σφάλμα (bias) στην πολλαπλή στοίχιση, και όπως είπαμε τα λάθη στην προοδευτική πολλαπλή στοίχιση δεν διορθώνονται σε κάποιο επόμενο βήμα. Για το λόγο αυτό, θα ήταν επιθυμητό, όλες οι ακολουθίες της πολλαπλής στοίχισης να παίζουν κάποιο ρόλο στο πώς μια άλλη ακολουθία θα προστεθεί στη στοίχιση. Ένας τρόπος για να γίνει αυτό, θα ήταν να δημιουργηθεί από κάθε μια πολλαπλή στοίχιση, μια συναινετική ακολουθία (consensus), δηλαδή μια «ψεύτικη» ακολουθία στην οποία κάθε σύμβολο θα ήταν αυτό το οποίο εμφανίζεται με μεγαλύτερο ποσοστό στην πολλαπλή στοίχιση. Αυτή θα ήταν μια εύκολη λύση, αλλά και πάλι αδυνατεί να λάβει υπόψη όλες τις ακολουθίες.

39 profile alignment Μια καλύτερη λύση, είναι το λεγόμενο profile alignment, το οποίο μετράει τη σχετική συνεισφορά όλων των ακολουθιών της κάθε στοίχισης και τελικά πραγματοποιεί την στοίχιση λαμβάνοντας υπόψη όλες τις ακολουθίες. Τα μαθηματικά της μεθόδου είναι πολύπλοκα, αλλά μπορούν να απλοποιηθούν αν θεωρήσουμε, όπως και παραπάνω, το κενό σαν ένα πέμπτο σύμβολο (-), οπότε θα έχουμε και γραμμική ποινή για τα κενά. Η βελτιστοποίηση, γίνεται με τον κλασικό πίνακα του δυναμικού προγραμματισμού αλλά διαφέρει ανάλογα με το επιλεγμένο σύστημα σκόρ και το πώς ο αλγόριθμος επιλογής χειρίζεται τα κενά.

40 CLUSTο μοντέaνέλιξη LW Ίσως το πιο γνωστό και περισσότερο χρησιμοποιημένο, πρόγραμμα πολλαπλής στοίχισης το CLUSTALW (Julie D Thompson, Higgins, & Gibson, 1994) ήταν το πρώτο που χρησιμοποίησε profile alignment με την προοδευτική πολλαπλή στοίχιση. 1.Στις αρχικές εκδόσεις της μεθόδου, ο αλγόριθμος έκανε τις στοιχίσεις κατά ζεύγη με έναν ευριστικό αλγόριθμο (FASTA), με αποτέλεσμα να είναι ιδιαίτερα γρήγορος. Σε κατοπινές εκδόσεις δίνει τη δυνατότητα, εναλλακτικά, να χρησιμοποιηθεί ένας αλγόριθμος δυναμικού προγραμματισμού, για καλύτερα αποτελέσματα. 2.Οι αποστάσεις υπολογίζονται απευθείας από την επί τοις εκατό ομοιότητα των ακολουθιών x (D=1-x/100) ενώ το δέντροοδηγός κατασκευάζεται με την ιδιαίτερα αποτελεσματική και σταθερή, μέθοδο Neighbor-Joining (ένωση γειτόνων) (Saitou & Nei, 198). 7). 3.Για την προσθήκη μιας ακολουθίας (ή μιας πολλαπλής στοίχισης) σε μια υπάρχουσα πολλαπλή στοίχιση, χρησιμοποιεί τη μέθοδο profile alignment. 4.Τέλος, χρησιμοποιεί μια σειρά από πολύ προσεκτικά επιλεγμένες ευριστικές τεχνικές οι οποίες μεγιστοποιούν το αποτέλεσμα. i. Οι πολύ όμοιες ακολουθίες λαμβάνουν μικρό σχετικό βάρος (weight) έτσι ώστε να μην επηρεάζουν τόσο πολύ και να μην κατευθύνουν την πολλαπλή στοίχιση. ii.μια άλλη ιδιαιτερότητα είναι ότι ο πίνακας υποκατάστασης δεν είναι σταθερός, αλλά επιλέγεται από τον αλγόριθμο ανάλογα με το ποσοστό ομοιότητας που εντοπίζεται στις υπό μελέτη ακολουθίες. iii.επιπλέον, οι ποινές για τα κενά, δεν είναι σταθερές, αλλά ειδικές ανά θέση (υδρόφοβες περιοχές λαμβάνουν μεγαλύτερη ποινή για τα κενά, με συνέπεια να καθίσταται πιο δύσκολη η εισαγωγή κενών σε αυτές τις περιοχές, αντίθετα, η ποινή μειώνεται αν βρεθούν πάνω από 5 συνεχόμενα υδρόφιλα κατάλοιπα). iv.τέλος, οι ποινές για τα κενά αυξάνονται αν στην ίδια στήλη της στοίχισης δεν υπάρχουν κενά, αλλά αντίθετα υπάρχει κάπου δίπλα μια περιοχή με πολλά κενά. Αυτό έχει σαν συνέπεια τα κενά να «συσσωρεύονται» σε συγκεκριμένες θέσεις σε μια στοίχιση

41 Αξιολόγηση πολλαπλών στοιχίσεων Ένας τρόπος για να αξιολογήσουμε εάν η στοίχιση είναι καλής ποιότητας και έχει πραγματικά βιολογική σημασία είναι η βαθμολόγηση της στοίχισης. Το sum-of-pair (SP) είναι ένας συνηθισμένος τρόπος βαθμολόγησης πολλαπλής στοίχισης, όπου τα σκόρσ κάθε ζεύγους σειρών της στοίχισης αθροίζονται για ν απροκύψει το SP score. Ένα υψηλό SP-σκόρ υποδηλώνει ότι η στοίχιση είναι σωστή. Εναλλακτικός τρόπος βαθμολόγησης είναι το Z-score, για να προκύψει αυτό, οι αλληλουχίες στοιχίζονται και υπολογίζεται το αρχικό σκόρ. Μετά γίνεται τυχαία αναδιάταξη των αλληλουχιών και υπολογίζεται ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση των τυχαιοπoιημένων σκόρς που προκύπτουν από τη σύγκριση των αναδιαταγμένων αλληλουχιών. Η παραπάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται αρκετές φορές. Το Z-score ισούται με : [(αρχικό σκόρμέσος όρος των τυχαιποιημένων σκόρς)]/τυπική απόκλιση των τυχαιοποιημένων σκόρς). Συνήθως ένα Z-score=6 αντιπροσωπεύει μια πιθανή ομολογία και ένα Z-score>9 μια σαφή ομολογία

42 Methods of phylogenetic analysis Phenetic (phenotypic) or distance methods : trees are calculated by similarities of sequences and are based on distance methods. The resulting tree is called a dendrogram and does not necessarily reflect evolutionary relationships. Distance methods compress all of the individual differences between pairs of sequences into a single number (if they are scaled). Cladistic or character-based methods : trees are calculated by considering the various possible pathways of evolution and are based on parsimony or likelihood methods. The resulting tree is called a cladogram. Cladistic methods use each alignment position as evolutionary information to build a tree.

43 Αλγόριθμοι -Μέθοδοι κατασκευής φυλογενετικών δένδρων Οι αλγόριθμοι δημιουργίας δένδρων χωρίζονται σε δύο κύριες κατηγορίες: τους αλγόριθμους που στηρίζονται στις αποστάσεις μεταξύ των αλληλουχιών (distance-based). και τους αλγόριθμους που βασίζονται στους χαρακτήρες των αλληλουχιών (character-based).

44 Μέθοδοι βασισμένες στην απόσταση Mία μεγάλη κατηγορία μεθόδων, είναι οι λεγόμενες μέθοδοι που χρησιμοποιούν τις αποστάσεις (distance-based methods). Οι μέθοδοι αυτές, ξεκινούν από μία πολλαπλή στοίχιση, υπολογίζουν με κάποιον τρόπο έναν πίνακα αποστάσεων για όλα τα ζευγάρια αλληλουχιών και μετά με βάση αυτόν τον πίνακα κατασκευάζουν το φυλογενετικό δέντρο Η μεγαλύτερη ομάδα από τις προαναφερόμενες μεθόδους, είναι στην ουσία κλασικές τεχνικές της στατιστικής ομαδοποίησης (clustering), και συγκεκριμένα, αυτές οι μέθοδοι που ονομάζονται «ιεραρχικές», οι οποίες παράγουν ένα είδους δέντρο το οποίο δηλώνει την ομαδοποίηση των δεδομένων. Τέτοια παραδείγματα, είδαμε στην προοδευτική πολλαπλή στοίχιση ενώ θα ξανασυναντήσουμε στην ανάλυση βιολογικών δικτύων και δεδομένων γονιδιακής έκφρασης.

45 Αλγόριθμοι αποστάσεων Οι αλγόριθμοι αυτοί χρησιμοποιούν τη στοίχιση μόνο ως μέσο για τον υπολογισμό ενός πίνακα αποστάσεων μεταξύ των αλληλουχιών. Είναι μόνο αυτές οι αποστάσεις (και όχι αυτή καθεαυτή η στοίχιση) χρησιμοποιούνται για την ομαδοποίηση των ακολουθιών σύμφωνα με τις καθορισμένες αποστάσεις και την κατασκευή του δένδρου. Οι αλγόριθμοι αυτοί μπορούν να υπολογίσουν το πραγματικό φυλογενετικό δένδρο μόνο εάν η αρχική στοίχιση περιλαμβάνει πληροφορία για το σύνολο των εξελικτικών γεγονότων που έχουν οδηγήσει τις αλληλουχίες σε απόκλιση. Το πρόβλημα είναι ότι άπαξ και μια θέση μεταλλαχθεί, οι εκ νέου μεταλλάξεις στην ίδια θέση δεν μπορούν να διαγνωστούν.

46 Αλγόριθμοι αποστάσεων Για το λόγο αυτό, πολλοί από αυτούς τους αλγόριθμους διορθώνουν τον πίνακα αποστάσεων σε μια απόπειρα να λάβουν υπόψη τους τέτοιες αόρατες υποκαταστάσεις. Οι ανά ζεύγη αποστάσεις μεταξύ των αλληλουχιών υπολογίζονται από τις συχνότητες υποκατάστασης και αντιπροσωπεύουν ένα μέτρο της απόκλισης τους (πόσο ανόμοιες είναι)

47 Construction of a distance tree using clustering with the UPGMAνέλιξη. Suppose we have the following tree consisting of 6 OTUs The pairwise evolutionary distances are given by the following distance matrix: We now cluster the pair of OTUs with the smallest distance, being A and B, that are separated a distance of 2. The branching point is positioned at a distance of 2 / 2 = 1 substitution. We thus constuct a subtree as follows:

48 Construction of a distance tree using clustering with the UPGMAνέλιξη. Following the first clustering A and B are considered as a single composite OTU(A,B) and we now calculate the new distance matrix as follows: dist(a,b),c = (distac + distbc) / 2 = 4 dist(a,b),d = (distad + distbd) / 2 = 6 dist(a,b),e = (distae + distbe) / 2 = 6 dist(a,b),f = (distaf + distbf) / 2 = 8). In other words the distance between a simple OTU and a composite OTU is the average of the distances between the simple OTU and the constituent simple OTUs of the composite OTU. Then a new distance matrix is recalculated using the newly calculated distances and the whole cycle is being repeated:

49 Construction of a distance tree using clustering with the UPGMAνέλιξη. Second Cycle Third Cycle Fourth Cycle Ή έως ότου προκύψουν 2 κλάδοι

50 Μοριακό ρολόι, Υπερμετρικά ή μόνο Προσθετικά δένδρα Αναλόγως το πλαίσιο αποστάσεων και τις αλληλουχίες υπό εξέταση, τα δεδομένα προς ανάλυση μπορεί να χαρακτηρίζονται ως υπερμετρικά εάν μπορούν παράγουν ένα δένδρο με ρίζα. Επίσης, επειδή όλα τα δένδρα με ρίζα ΔΕΝ είναι απαραίτητα υπερμετρικά, ένα υπερμετρικό δένδρο ικανοποιεί επίσης τη θεωρία του μοριακού ρολογιού, έχει όλες τις αποστάσεις του ίσες και όλα τα μήκη των βραχίονων είναι ανάλογα του χρόνου. Όλα τα υπερεμετρικά δένδρα είναι προσθετικά άλλα όλα τα προσθετικά δένδρα δεν είναι απαραίτητα υπερμετρικά (δεν ικανοποιούν τη θεωρία του μοριακού ρολογιού).

51 Ποιό δένδρο είναι μόνο προσθετικό και όχι υπερμετρικό; Α Β Γ

52 Η προσθετική ιδιότητα των αποστάσεων στο δενδρο Η μέθοδος UPGMA, εκτός από την υπόθεση του μοριακού ρολογιού, έχει και μια άλλη ιδιότητα, παράγει εξ ορισμού δέντρα στα οποία ισχύει η προσθετική ιδιότητα. Με αυτό, εννοούμε δέντρα στα οποία η απόσταση δύο οποιονδήποτε άκρων, είναι ίση με το άθροισμα των μηκών των ακμών που τα συνδέουν. Παρόλα αυτά, είναι δυνατόν να υπάρχουν περιπτώσεις στις οποίες δεν ισχύει η υπόθεση του μοριακού ρολογιού, αλλά η προσθετική ιδιότητα να εξακολουθεί να ισχύει. Σε αυτή την περίπτωση, πρέπει να αναζητηθεί κάποιος άλλος κατάλληλος αλγόριθμος.

53 Neighbor Joining (rooted NJ) Ο αλγόριθμος UPGMA θα βρεί το σωστό δένδρο όταν τα δεδομένα είναι υπερμετρικά δεδομένα. Το πρόβλημα είναι οτι τα υπερμετρικά δεδομένα είναι μάλλον σπάνια στη βιολογία: η πίεση της φυσικής επιλογής συνήθως διαφέρει για διαφορετικούς οργανισμούς, χρονικές περιόδους, γονίδια περιοχές γονιδίων κτλ. Η μέθοδος NJ είναι μια διαδεδομένη και σχετικά γρήγορη μέθοδος δημιουργίας δένδρων η οποία δεν απαιτεί ότι τα δεδομένα έχουν προσθετική ιδιότητα για τα μήκη των κλάδων. Η NJ είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται από το CLUSTALW για τη δημιουργία του δενδρογράμματος-οδηγού.

54 Μέθοδος ένωσης γειτόνων Η πιο διαδεδομένη μέθοδος βασισμένη στην απόσταση. Η δόμηση του εξελικτικού δένδρου ξεκινάει με ένα δένδρο-αστέρι όπου όλες οι ταξινομικές μονάδες συνδέονται σε ένα εσωτερικό κόμβο. Η ιδεά είναι να χρησιμοποιηθούν άλλου τύπου αποστάσεις που να λαμβάνουν υπόψη τους πόσο απέχει το κάθε τάξο από όλα τα άλλα τάξα: Η μέση απόσταση δύο μονάδων σε σχέση με όλες τις άλλες. Έτσι δε βρίσκει μόνο τις μονάδες που είναι πιο κοντά μεταξύ τους αλλά και πιο μακρυά συντοχρόνως από όλες τις άλλες. Στη συνέχεια, το κοντινότερο ζεύγος ταξινομικών μονάδων συνδέεται με ένα διαφορετικό κόμβο. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρι το να αποσυντεθεί σε ένα πλήρως δομημένο δένδρο.

55 Μέθοδοι βασισμένοι σε χαρακτήρες Οι μέθοδοι που βασίζονται στους χαρακτήρες (character-based methods), σε αντίθεση με τις μεθόδους αποστάσεων, δεν μετασχηματίζουν τις αλληλουχίες, αλλά τις χρησιμοποιούν σε όλη τη διαδικασία της εκτίμησης, αντιμετωπίζοντας αυτές, όπως ακριβώς είναι: μια ακολουθία διακριτών συμβόλων από ένα πεπερασμένο αλφάβητο, Ω, (Durbin, et al., 1998). ). Διακρίνονται σε δύο μεγάλες ομάδες: και στις μεθόδους μέγιστης πιθανοφάνειας, οι οποίες χρησιμοποιούν (ή καλύτερα, απαιτούν) ένα ξεκάθαρο μαθηματικό μοντέλο για την εξέλιξη. στις μεθόδους φειδωλότητας, οι οποίες δεν κάνουν καμιά υπόθεση για τον τρόπο που συντελέστηκε η εξελικτική διαδικασία,

56 Μέγιστη Πιθανοφάνεια Η μέθοδος της Μέγιστης Πιθανοφάνειας είναι μια πιθανοθεωρητική μέθοδος που αναζητά το δένδρο που ικανοποιεί ένα συγκεκριμένο εξελικτικό μοντέλο με τη μέγιστη πιθανότητα για την παραγωγή των δοθέντων δεδομένων. Η πιθανοφάνεια κάθε δένδρου κάθε φορά υπολογίζεται ως συνάρτηση της τοπολογίας του δέντρου και του μήκους των βραχιόνων του Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για όλα τα πιθανά δέντρα και αυτό που δίνει τη μέγιστη πιθανοφάνεια, από όλα τα δέντρα, επιλέγεται τελικά ως το δέντρο μέγιστης πιθανοφάνειας.

57 Μέγιστη φειδωλότητα (rooted parsimony) Οι μέθοδοι που στηρίζονται στη μέγιστη φειδωλότητα (maximum parsimony) διαφέρουν ριζικά από τις προηγούμενες μεθόδους των αποστάσεων, στο ότι κάνουν διάκριση μεταξύ πληροφοριακών και μη-πληροφοριακών θέσεων στις αλληλουχίες, με τις πληροφοριακές θέσεις να είναι αυτές που παρουσιάζουν πολυμορφισμό (ύπαρξη θέσεων με πάνω από δυο διαφορετικών αλλαγών νουκλεοτιδίων) τουλάχιστον σε δυο από τις αλληλουχίες. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται στην εξελικτική βιολογία προτού να εμφανιστεί η μοριακή φυλογένεση (εφαρμοζόταν για παράδειγμα σε διάφορα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά) και έχει σκοπό να εξηγήσει τις εξελικτικές διάφορες με το μικρότερο δυνατό αριθμό αλλαγών.

58 Μέγιστη φειδωλότητα (rooted parsimony) Η μέθοδος της μέγιστης φειδωλότητας αποσκοπεί στην εύρεση ενός φυλογενετικού δένδρου που απαιτεί τον ελάχιστο αριθμό αντικαταστάσεων χαρακτήρων για την ερμηνεία των διαφορών των εξεταζόμενων αλληλουχιών. Η μέθοδος βασίζεται στην αρχή ότι η απλουστερη εξήγηση των δεδομένων είναι πιθανότερα η σωστότερη. Ποιό δένδρο είναι πιο φειδωλό (δηλ. εξηγεί τα δεδομένα με το λιγότερο αριθμό μεταλλάξεων).

59 Maximum Parsimony-example Assuming we have 4 sequences There are 3 possible trees The optimal tree is obtained by adding the number of changes at each informative site for each tree, and picking the tree requiring the least total number of changes. For a large number of sequences the number of trees to examine becomes so large that it might not be possible to examine all possible trees.

60 Character-based Distance methods: Εvolutionary distances are computed for all OTUs and build tree where distance between OTUs matches these distances Maximum parsimony (MP): choose tree that minimizes number of changes required to explain Data Maximum likelihood (ML): under a model of sequence evolution, find the tree which gives the highest likelihood of the observed data

61

62 Διαθέσιμο Software PAUP ( PHYLIP ( PAML ( HYPHY ( MrBayes( MEGA ( PhyML ( RAxML ( BEAST ( GARLI ( TNT ( Treeview (