ΚΑΤ ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΑΘΗΜΑ «ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ» ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟΥ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ ΕΚΛΟΓΗ ΤΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΥ ΖΩΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ

Transcript

1 ΚΑΤ ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΑΘΗΜΑ «ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ» ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟΥ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ ΕΚΛΟΓΗ ΤΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΥ ΖΩΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ Ισμήνη Δοντά Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστήριο Πειραματικής Χειρουργικής και Χειρουργικής Έρευνας «Ν.Σ. Χρηστέας» Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών 1

2 Εισαγωγή Σχεδόν όλα τα βιοϊατρικά επιτεύγματα του τελευταίου αιώνα θεμελιώθηκαν ύστερα από έρευνα σε ζώα. Οι μελέτες στα ζώα έδωσαν στον άνθρωπο τα επιστημονικά στοιχεία χάρι στα οποία το προσδόκιμο επιβίωσής του αυξήθηκε θεαματικά από 47 έτη ζωής το 1900 σε 79 έτη το 2000 στην Ευρωπαϊκή Ένωση καθώς επίσης βελτιώθηκε και η ποιότητα ζωής, ανθρώπων και ζώων, με σημαντική μείωση της νοσηρότητας και του πόνου. Αναμφίβολα οι πληροφορίες από ανθρώπινες μελέτες είναι επιστημονικά οι πλέον αξιόπιστες. Οι κλινικές όμως μελέτες είναι το τελευταίο στάδιο έρευνας ύστερα από πολλά έτη εργαστηριακών και προκλινικών (δηλ. σε ζώα εργαστηρίου) δοκιμών. Τόσο ο Κώδικας της Νυρεμβέργης (Άρθρο 3, 1948)(Shuster 1997), όσο και η Διακήρυξη των Δικαιωμάτων του Ανθρώπου του Ελσίνκι (Άρθρο 12, 1964), που καθορίζουν την ιατρική δεοντολογία στην κλινική έρευνα, απαιτούν τα πρωτόκολλα κλινικών μελετών σε εθελοντές να είναι βασισμένα στα αποτελέσματα ικανοποιητικά εκτελεσμένων εργαστηριακών και πειραματικών δοκιμών. Οι σύγχρονοι στόχοι της πειραματικής έρευνας είναι η παρασκευή αποτελεσματικών και ασφαλών φαρμάκων και προϊόντων με την ταυτόχρονη εφαρμογή των τριών R (replacement, reduction, refinement: αντικατάσταση, μείωση, εξευγένιση της χρήσης ζώων εργαστηρίου) (Russell & Burch 1959) σε κάθε στάδιο της έρευνας όπου είναι εφικτό. Σχεδιασμός Στο σχεδιασμό ενός ερευνητικού πρωτοκόλλου σε ζώα εργαστηρίου καθορίζονται κατά κανόνα οι ακόλουθοι παράμετροι: 1) το θέμα, 2) το υλικό και η μέθοδος, 3) οι συνεργάτες και 4) η άδεια πειραματισμού. 1) Θέμα Στην περίπτωση κατά την οποία ο ερευνητής έχει επιστημονικό σύμβουλο που θα του ορίσει ένα συγκεκριμένο θέμα μελέτης, η διαδικασία ενημέρωσης επί του θέματος είναι αρκετά απλή, καθόσον η εμπειρία και οι πληροφορίες του 2

3 συμβούλου είναι διαθέσιμες στον υποψήφιο ερευνητή, και η αναζήτηση περισσοτέρων στοιχείων του θέματος στο διαδίκτυο με λέξεις-κλειδιά αποτελεί πλέον καθημερινή πράξη. Συχνά ο ερευνητής δεν έχει συγκεκριμένο θέμα υπόψιν του αλλά μετά από ανάγνωση επίκαιρων άρθρων μπορεί να γεννηθεί μια ιδέα προς μελέτη. Μπορεί να είναι εντελώς πρωτότυπη ή επέκταση ή παραλλαγή υπάρχουσας μελέτης. Στην τελευταία περίπτωση, δεδομένης της παγκόσμιας προσπάθειας μείωσης του αριθμού των χρησιμοποιούμενων ζώων εργαστηρίου, σκοπός του νεόυ ερευνητικού προγράμματος πρέπει να είναι ουσιαστική παραλλαγή, και όχι επανάληψη. 2) Υλικό και μέθοδος Στον σχεδιασμό του πρωτοκόλλου, πρωταρχικό ρόλο παίζει η εκλογή του καταλληλότερου ζωικού προτύπου και δευτερεύοντα ρόλο η μέθοδος που θα ακολουθηθεί. Από τις παρατηρήσεις και την εμπειρία των ερευνητών, έχει διαπιστωθεί ότι ορισμένα είδη ζώων είναι καταλληλότερα από άλλα για τη μελέτη μιας παθολογικής κατάστασης, η οποία μπορεί να αντιστοιχεί σε ανθρώπινη νόσο. «Πειραματικό πρότυπο» για μια ασθένεια θεωρείται το είδος του ζώου (συνήθως είναι υποείδος), στο οποίο μια αυθόρμητη ή προκλητή παθολογική κατάσταση μπορεί να ερευνηθεί και η οποία μοιάζει, σε μικρότερο ή μεγαλύτερο βαθμό, με την ίδια κατάσταση στον άνθρωπο. Υπάρχουν ζώα τα οποία λόγω φυσιολογικής ιδιατερότητας παρουσιάζουν αυθόρμητα μια νόσο, π.χ. σε μερικές φυλές σκύλων παρουσιάζεται αυθόρμητα αιμοφιλία, σε μερικά είδη περιστεριών και χοίρων παρουσιάζεται αθηρωμάτωση, κ.ά. (Andrews et al. 1979, Δοντά 1994). Συνήθως όμως η αναζήτηση και εύρεση ικανοποιητικού αριθμού ομοιογενών τέτοιων ζώων για μια μελέτη είναι δύσκολη. Ενας άλλος τρόπος απόκτησης πειραματικού προτύπου είναι η δημιουργία ορισμένης σειράς ενός είδους ζώων εργαστηρίου με ομομεικτική διασταύρωση και επιλογή των ζώων που έχουν την επιθυμητή παθολογική 3

4 μετάλλαξη, η οποία κληρονομείται στους απογόνους τους, π.χ. υπερτασικοί επίμυες. Ενας διαφορετικός τρόπος είναι μεταβάλλοντας τη φυσιολογική κατάσταση ενός υγιούς ζώου σε συγκεκριμένη νοσολογική, με ανθρώπινη παρέμβαση, και συγκεκριμένα με χειρισμούς διαιτητικούς (π.χ. πρόκληση αθηρωμάτωσης με αθηρογόνο δίαιτα), φαρμακευτικούς (π.χ. πρόκληση καρδιομυοπάθειας με χορήγηση κυτταροστατικών) ή χειρουργικούς (π.χ. πρόκληση οστεοπόρωσης με αφαίρεση ωοθηκών)(δοντά 1994). Επειδή αφενός μεν ζωικά πρότυπα που έχουν διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο (genetic background) θα απαντήσουν με ανόμοιο τρόπο σε δοκιμές των ίδιων προϊόντων, αφετέρου δε ζωικά πρότυπα γενετικά όμοια αλλά με διαφορετικό επίπεδο υγείας (health status) επίσης θα απαντήσουν με ανόμοιο τρόπο σε δοκιμές των ίδιων προϊόντων, επιβάλλεται η χρησιμοποίηση ενός ζωικού προτύπου με καθορισμένο γενετικό υλικό και επίπεδο υγείας, προκειμένου να λάβει κανείς αξιόπιστα ερευνητικά αποτελέσματα (Conn 2008). Οι ερευνητές έχουν σήμερα στη διάθεσή τους αρκετές βιβλιογραφικές πηγές για τα αυθόρμητα και προκλητά πειραματικά πρότυπα που υπάρχουν (Wood & Hart 2007). Το καταλληλότερο πρότυπο για ένα συγκεκριμένο ερευνητικό πρωτόκολλο θα πρέπει να πληρεί τις εξής προϋποθέσεις: - να αναπαράγει με ακρίβεια τη νόσο ή την αλλοίωση που θα μελετηθεί - το πρότυπο να είναι προσιτό σε περισσότερους του ενός ερευνητές και ερευνητικά κέντρα και να μπορεί να μεταφερθεί χωρίς ιδιαίτερη δυσκολία - για τη μελέτη μιας νόσου, που έχει σχέση με την κληρονομικότητα, το πειραματικό πρότυπο θα πρέπει να έχει μεγάλη τοκετοομάδα, δηλαδή να γεννά πολλά νεογνά σε κάθε τοκετό - το μέγεθός του να είναι αρκετά μεγάλο ώστε να επιτρέπει τη ληψη πολλών δειγμάτων (π.χ. αίματος, βιοψιών,..) και όχι τόσο μεγάλο, που να δημιουργεί πρόβλημα στέγασης - να είναι συνεργάσιμο, δηλαδή να μπορεί να αντιμετωπισθεί από το μέσο ερευνητή με ασφάλεια. Με ορισμένα είδη ζώων ίσως ο ερευνητής χρειασθεί λίγο χρόνο εξοικείωσης 4

5 - η διάρκεια επιβίωσής του να είναι αρκετά μεγάλη ώστε να επιτρέπει την ολοκλήρωση της μελέτης. Πολλές φορές υπάρχουν πρακτικά προβλήματα, που ίσως εμποδίζουν την επιλογή του ιδανικότερου προτύπου, όπως η διαθεσμότητά του, το κόστος αγοράς ή η εξασφάλιση των συνθηκών διατήρησής του. Στη βιοϊατρική έρευνα σήμερα χρησιμοποιούνται περισσότερο οι μύες και οι επίμυες, πολλά είδη των οποίων είναι πειραματικά πρότυπα για ορισμένες παθήσεις. Μύες Οι μύες χρησιμοποιούνται στη βιοϊατρική έρευνα από τις αρχές του 20ού αιώνα και σήμερα υπάρχουν περίπου 3000 γενετικά καθορισμένα διαφορετικά είδη διαθέσιμα, πολλά από τα οποία έχουν δημιουργηθεί -και συνεχίζονται να δημιουργούνται νέα- με γενετική τροποποίηση. Μερικά πλεονεκτήματα που τα καθιστούν πρωταγωνιστές στη βιοϊατρική έρευνα είναι το μικρό τους μέγεθος και η εξ αυτού ευκολία στέγασης, η σύντομη διάρκεια ζωής και του κύκλου αναπαραγωγής, και η μεγάλη ποικιλία των προτύπων που υπάρχουν για τα ανθρώπινα νοσήματα. Επί πλέον, οι γενετικά τροποποιημένοι μύες δεν παρουσιάζουν αποκλίσεις στις παραμέτρους τους, λόγω της γενετικής τους ομοιομορφίας, και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν λιγότερα ζώα με αξιόπιστα αποτελέσματα, εφαρμόζοντας το R της μείωσης (Festing 2004, Δοντά 2008). Μερικοί τομείς έρευνας για τους οποίους επιλέγονται μύες συγκεκριμένου υποείδους σαν ζωικά πρότυπα είναι η λευχαιμία, ο καρκίνος του μαστού, η ακτινοευαισθησία, η παχυσαρκία, ο διαβήτης, η οστεοπόρωση, η νόσος του Αlzheimer, η κατάθλιψη, κ.ά. (Rees & Alcolado 2005). Οι μύες χρησιμοποιούνται επίσης κατ εξοχήν στην τοξικολογία, σε μελέτες οξείας τοξικότητας φαρμάκων για τον προσδιορισμό της μέσης θανατηφόρου δόσης και της μέσης θεραπευτικής δόσης τους, καθώς και σε μελέτες χρόνιας τοξικότητας, όπου εντός δύο ετών, που είναι η μέση διάρκεια ζωής τους, εμφανίζονται (εάν υπάρχουν) συμπτώματα τοξικής συσσώρευσης (Gad et al. 2006). Επιπλέον χρησιμοποιούνται στη μελέτη της επίδρασης των φαρμάκων στην 5

6 αναπαραγωγή, όπως εάν επηρεάζουν τη γονιμότητα, ή εάν έχουν μεταλλαξιογόνο ή τερατογόνο δράση (Δοντά 1994, 2007). Επίμυες Οι επίμυες αποτελούν το δεύτερο μετά τους μύες ζωικό είδος που χρησιμοποιείται περισσότερο στη βιοϊατρική έρευνα, με αρκετά είδη γενετικά τροποποιημένων ζώων. Τα πλεονεκτήματά τους είναι το λίγο μεγαλύτερο σωματικό μέγεθος που επιτρέπει ευκολότερα χειρουργικούς χειρισμούς και δειγματοληψίες (είναι περίπου 10 φορές μεγαλύτεροι από τους μύες), επίσης η σχετικά εύκολη στέγαση, η σύντομη διάρκεια ζωής και του κύκλου αναπαραγωγής, και ο συνεργάσιμος χαρακτήρας τους. Οι επίμυες χρησιμοποιούνται επίσης στην έρευνα νέων φαρμακευτικών ουσιών, καθώς και ως ζωικά πρότυπα για τη μελέτη της υπέρτασης, του διαβήτη, του καρκίνου, του γήρατος, της οστεοπόρωσης, της μυϊκής δυστροφίας, των νόσων του Alzheimer και του Parkinson, της κατάχρησης ουσιών, των νεφρίτιδων, κ.ά. (Rees & Alcolado 2005, Lelovas et al. 2008). Κόνικλοι Οι κυριότεροι τομείς στους οποίους επιλέγονται οι κόνικλοι σαν ζωικά πρότυπα είναι στην έρευνα του καρδιοαγγειακού συστήματος (αθηρωμάτωση, καρδιομυοπάθεια), του ανοσοποιητικού συστήματος, του βρογχικού άσθματος, της κυστικής ίνωσης, του καρκίνου, των δερματικών παθήσεων, στην οφθαλμολογική έρευνα, στην παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων, κ.ά. (Yanni 2004, Gad et al. 2006). Οι έλεγχοι ερεθιστικότητας ουσιών στο δέρμα και στον οφθαλμό κονίκλων έχουν σχεδόν αντικατασταθεί πλήρως με πιστοποιημένες εναλλακτικές μεθόδους. Σκύλοι Στην Ευρωπαϊκή Ένωση μόνο σκύλοι προερχόμενοι από εκτροφεία για πειραματικούς σκοπούς επιτρέπονται πλέον και ο αριθμός τους μειώνεται κάθε χρόνο. Η φυλή που χρησιμοποιείται κατά προτίμηση είναι των Beagle hounds, 6

7 μικρού σχετικά μεγέθους (10-13 κιλά) και πολύ συνεργάσιμη. Οι κυριότεροι τομείς έρευνας στους οποίους επιλέγονται οι σκύλοι σαν ζωικά πρότυπα είναι η καρδιοχειρουργική, η χειρουργική του πεπτικού, οι μεταμοσχεύσεις, ο διαβήτης, η ενδοκρινολογία, το μυοσκελετικό σύστημα, η τοξικολογία, κ.ά. (Rees & Alcolado 2005, Gad et al. 2006). Χοίροι Οι χοίροι άρχισαν να αντικαταστούν τον σκύλο στη βιοϊατρική έρευνα πριν από 25 περίπου χρόνια, και έκτοτε ανεπτύχθηκαν μικρόσωμες φυλές (minipigs, micropigs) ειδικές για τις ερευνητικές ανάγκες. Οι κυριότεροι τομείς έρευνας στους οποίους επιλέγονται οι χοίροι σαν ζωικά πρότυπα είναι το καρδιοαγγειακό σύστημα, οι μεταμοσχεύσεις, ο διαβήτης, η ανοσολογία, οι δερματικές παθήσεις, κ.ά. (Wyler et al. 1979, Hubert et al. 2003, Xanthos et al. 2007). Ανθρωποειδή Οι κυριότεροι τομείς έρευνας στους οποίους επιλέγονται τα πρωτεύοντα σαν ζωικά πρότυπα είναι η παραγωγή και ο έλεγχος εμβολίων (πολυομυελίτιδας, ηπατίτιδας Β, έρευνες με HIV), ο έλεγχος φαρμάκων και χημικών ουσιών, η ανάπτυξη προϊόντων της ιατρικής, οδοντιατρικής και κτηνιατρικής επιστήμης, οι μεταμοσχεύσεις, η καρδιοχειρουργική, η νευρολογία (νόσος του Parkinson) και η ψυχολογία, η ελονοσία, η φυματίωση, κ.ά. (Δοντά 1994, von Bolen-Halbach 2005). Το 2007 υποστήριξαν τη μείωση της έρευνας σε ορισμένα είδη πρωτευόντων και τη σταδιακή αντικατάστασή τους με εναλλακτικές μεθόδους 429 Ευρωβουλευτές (Written Declaration 40/2007). Ψυχρόαιμα ζώα Τις τελευταίες δεκαετίες χρησιμοποιείται πολύ ένα ξεχωριστό σπονδυλωτό: το ψάρι Danio rerio (zebrafish). Είναι πολύτιμο ζωικό πρότυπο για την έρευνα της ανάπτυξης, των συγγενών διαμαρτιών διάπλασης, της γήρανσης, του νευρικού συστήματος, της συμπεριφοράς και για τον έλεγχο ασφάλειας χημικών ουσιών (Danilova et al. 2008, Segner 2008). Με τη χρήση αυτών των 7

8 «νευροφυσιολογικά κατώτερων» ζώων εργαστηρίου ολοένα και περισσότερο, αποσκοπείται η μείωση της χρήσης θηλαστικών, με την παράλληλη απόκτιση αξιόπιστων αποτελεσμάτων. Ασπόνδυλα Πολλοί ερευνητές χρησιμοποιούν ασπόνδυλους οργανισμούς ως πειραματικά πρότυπα, όπως τη Drosophila melanogaster (Skorupa et al. 2008) και τoν Caenorhabditis elegans (Brenner 2003). Μεταξύ των πλεονεκτημάτων τους είναι το απλό γονιδίωμά τους που έχει πλήρως αποκαλυφθεί και το ότι δεν εγείρουν φιλοζωικά αισθήματα της κοινής γνώμης. Το νηματώδες C. elegans έδωσε και συνεχίζει να δίνει πολύτιμες πληροφορίες για τη γήρανση και τους μηχανισμούς που ελέγχουν τη μακροβιότητα. Ο σύντομος κύκλος ζωής του (περίπου 2-3 εβδομάδες σε εργαστηριακές συνθήκες) δίνει τη δυνατότητα ολοκλήρωσης μελετών γήρανσης σε σύντομο χρονικό διάστημα και το μικρό του μέγεθος (1 χιλιοστό) διευκολύνει την εργαστηριακή του στέγαση. Συμπερασματικά Από τα ανωτέρω στοιχεία διαπιστώνεται ότι κάθε τομέας έρευνας μπορεί να εξυπηρετηθεί από περισσότερα του ενός είδη ζώων εργαστηρίου, συνήθως όμως ένα είναι εκείνο το οποίο εμφανίζει τις περισσότερες ομοιότητες με την ανθρώπινη νόσο και καλύπτει ειδικές ανάγκες ερευνητών, ώστε να πρέπει επομένως να επιλέγεται. 3) Συνεργάτες Θέματα τα οποία απαιτούν εξειδικευμένες τεχνικές ή προσδιορισμούς χρειάζονται τη συνεργασία πολλών επιστημόνων. Είναι βασικής σημασίας η λεπτομερής ανάλυση κάθε σταδίου της μελέτης πριν την έναρξή της με όλους τους συνεργάτες, ώστε να αποφευχθούν απρόβλεπτες καταστάσεις, τεχνικές δυσχέρειες ή απώλεια στοιχείων κατά τη διάρκειά της. Ένα πιλοτικό πείραμα πριν την κανονική μελέτη βοηθάει να αναδεικνύονται οι περισσότερες αδυναμίες σχεδιασμού και εκτέλεσης από όλους τους συνεργάτες. 8

9 4) Αδεια πειραματισμού Σύμφωνα με την ισχύουσα Ελληνική νομοθεσία, πριν από την έναρξη μιας μελέτης σε ζώα εργαστηρίου, ο επιστημονικός υπεύθυνος της μελέτης υποβάλλει ειδική αίτηση στην αρμόδια Διεύθυνση Κτηνιατρικής του Νομού όπου πρόκειται να γίνει η μελέτη για να του δοθεί η έγκριση πραγματοποίησής της. Η άδεια έχει διάρκεια ενός έτους με δυνατότητα ανανέωσης. 9

10 Βιβλιογραφία Andrews FJ, Ward BC, Altman NH (eds.). Spontaneous Animal Models of Human Disease. Academic Press, New York, Brenner S. Nobel lecture. Nature s gift to science. Biosci Rep, 23(5-6):225-37, Conn PM. Sourcebook of models for biomedical research. Humana Press, Totowa, NJ, Danilova N, Sakamoto KM, Lin S. Role of p53 family in birth defects: lessons from zebrafish. Birth Defects Res C Embryo Today 84(3):215-27, Declaration of Helsinki Δοντά I. Η επιλογή του καταλληλότερου πειραματοζώου ως πειραματικό πρότυπο. Acta Chir Hellen 66:28-31, Δοντά Ι. Ζωικά πρότυπα και επιλογή κατάλληλου ζωικού προτύπου. Πρακτικά 1 ου Πανελληνίου Σεμιναρίου Πειραματικής Βιοϊατρικής Έρευνας, σελ , Δοντά Ι. Πειραματική βιοϊατρική έρευνα: επιτεύγματα και μελλοντικοί στόχοι. Πρακτικά 2 ου Πανελληνίου Σεμιναρίου Πειραματικής Βιοϊατρικής Έρευνας, σελ , Festing MFW. The choice of animal model and reduction. ATLA 32(2):59-64, Gad SC, Cassidy CD, Aubert N, Spainhour B, Robbe H. Nonclinical vehicle use in studies by multiple routes in multiple species. Int J Toxicol 25: ,

11 Hubert MB, Salazkin I, Desjardins J, Blaise G. Cardiopulmonary bypass surgery in swine: a research model. J Exp Anim Sci 43:135-19, Lelovas PP, Xanthos TT, Thoma SE, Lyritis GP, Dontas IA. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med 58(5):424-30, Rees DA, Alcolado JC. Animal models of diabetes mellitus. Diabet Med 22: , Russell WMS, Burch RL. The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen, Segner H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 148(2);187-95, Shuster E. Fifty years later: the significance of the Nuremberg Code. N Engl J Med 337: , Skorupa DA, Dervisefendic A, Zwieer J, Pletcher SD. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell 7(4):478-90, von Bolen-Halbach O. Animal models of Parkinson s disease. Neurodegenerative Dis 2: , Wood MW, Hart LA. Selecting appropriate animal models and strains: making the best use of research, information and outreach. AATEX 14: ,

12 Written Declaration 40/ //EP//NONSGML+PV SIT+DOC+WORD+V0//EN&language=EN Wyler F, Rutishauser M, Stalder G. Distribution of cardiac output and organ blood flow in the minipig, an experimental animal for haemodynamic research. Eur J Cardiol 10: , Xanthos T, Lelovas P, Vlachos I, Tsirikos-Karapanos N, Kouskouni E, Perrea D, Dontas I. Cardiopulmonary arrest and resuscitation in Landrace/Large White swine: a research model. Lab Anim 41: , Yanni AE. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim 38: ,