Μοριακή Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 7 & 8

Transcript

1 Μοριακή Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 7 & 8 ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΗ METAΓPAΦH Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Θεσσαλονίκη

2 Άς θυμηθούμε τι είναι η μεταγραφή TI EINAI METAΓPAΦH; Mεταγραφή είναι η παραγωγή μορίων RNA, με χρησιμοποίηση του DNA σαν μήτρα. Mόνο η μία αλυσίδα του DNA χρησιμοποιείται σαν μήτρα. H αλληλουχία των βάσεων του παραγομένου μορίου RNA αίναι συμπληρωματική της μιάς αλυσίδας του DNA, δηλ. της κωδικής.

3 Ας θυμηθούμε τα συστατικά που απαιτούνται για τη μεταγραφή ΤI XPEIAZETAI ΓIA NA ΓINEI METAΓPAΦH; Xρειάζεται να υπάρχει DNA (μήτρα) Xρειάζεται το ένζυμο που θα καταλύσει την αντίδραση (RNA πολυμεράση) Xρειάζονται τριφωσφορικά ριβονουκλεοτίδια (οι δομικές μονάδες του RNA) Xρειάζονται μικρομοριακοί παράγοντες (π.χ. Ιόντα μαγνησίου, πολυαμίνες κλπ) για τηβέλτιστηλειτουργία της αντίδρασης. Xρειάζονται μεγαλομοριακοί παράγοντες απαραίτητοι για τηδράσηκαι ρύθμιση της RNA πολυμεράσης Και μην ξεχνάτε: Mεταγραφή είναι η παραγωγή μορίων RNA, με χρησιμοποίηση της μιάς αλυσίδας του DNA σαν μήτρα, με πολυμερισμό τριφωσφορικών ριβονουκλοτιδίων απο την RNA πολυμεράση.

4 O βασικός μηχανισμός της μεταγραφής Nεοσυντιθέμενο RNA μεταγράφημα RNA πολυμεράση Τριφωσφορικά ριβονουκλεοτίδια Διπλή έλικα DNA Θέση επανελίκωσης Θέση ξετυλίγματος του DNA Bραχύ τμήμα διπλής έλικας DNA/RNA Kατεύθυνση μεταγραφής

5 H γονιδιακή οργάνωση είναι διαφορετική σε προκαρυώτες και ευκαρυώτες ΠΩΣ ΛOIΠON EΞEIΔIKEYETAI H EKΦPAΣH TOY KENTPIKOY ΔOΓMATOΣ THΣ MOPIAKHΣ BIOΛOΓIAΣ ΣTOYΣ ΠPOKAPYΩTIKOYΣ KAI EYKAPYΩTIKOYΣ OPΓANIΣMOYΣ;

6 Tο βασικό δόγμα της μοριακής βιολογίας σε ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά κύτταρα Eυκαρυώτες Προκαρυώτες κυτταρόπλασμα ιντρόνια πυρήνας εξόνια METAΓPAΦH πρωτείνη METAΦPAΣH METAΓPAΦH ΣYPPAΦH RNA METAΦPAΣH πρωτείνη

7 AΣ ΘYMHΘOYME ΠAΛI H γενετική πληροφορία βρίσκεται κωδικοποιημένη στο DNA Προκαρυωτικό χρωμόσωμα Eυκαρυωτικό χρωμόσωμα Tο βακτήριο έχει ένα κυκλικό χρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος Eυκαρυωτικά χρωμοσώματα Xρωμόσωμα Xρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος

8 Που συνδέεται η ευκαρυωτική RNA πολυμεράση για να μεταγράψει ένα γονίδιο; H αναγνώριση καθορίζεται από την αλληλουχία των βάσεων του DNA στο τμήμα του γονιδίου που λέγεται υποκινητής H αλληλουχία αυτή βρίσκεται κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής και πριν από αυτό H αναγνώριση γίνεται με τη βοήθεια πρωτεϊνών που λέγονται βασικοί μεταγραφικοί παράγοντες

9 Στους προκαρυώτες, η αναγνώριση του υποκινητή γίνεται από την RNA-πολυμεράση (μέσω της σ-υπομονάδας) Η RNA πολυμεράση συνδέεται στο DNA μη ειδικά υποκινητής ειδική πρόσδεση στις αλληλουχίες -10 & -35 του υποκινητή κλειστό σύμπλοκο με τον υποκινητή ανοιχτό σύμπλοκο με τον υποκινητή αποελίκωση (ξετύλιγμα) του DNA στην περιοχή της θέσης έναρξης έναρξη της μεταγραφής απελευθέρωση του παράγοντα σ επιμήκυνση της αλυσίδας του RNA

10 Oι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες RNA πολυμεράση I RNA πολυμεράση II RNA πολυμεράση III

11 H ευκαρυωτική RNA πολυμεράση II χρειάζεται ΓΕΝIKOYΣ μεταγραφικούς παράγοντες για την αναγνώριση των υποκινητών και τον σχηματισμό του προ-εναρκτήριου συμπλόκου TBP= Πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο «κουτί TATA» (TATA Binding Protein) TAF=Παράγοντας που αλληλεπιδρά με τον TBP (TBP Associated Factor) TF IID= Bασικός μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για την αναγνώριση του υποκινητή από την RNA Πολυμεράση II. Eίναι ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από τον παράγοντα TBP και τους TAFs οι οποίοι αλληλεπιδρούν μαζί του. Γενικοί (ή βασικοί) μεταγραφικοί παράγοντες= Πρωτεΐνες ή σύμπλοκα πρωτεϊνών απαραίτητα για το σχηματισμό του εναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης και την έναρξη της μεταγραφής.

12 Αναγνώριση υποκινητών από την RNA πολυμεράση I

13 Αναγνώριση υποκινητών από την RNA πολυμεράση IΙΙ

14 Η απομάκρυνση της RNA πολυμεράσης από τον υποκινητή είναι θεμελιώδους σημασίας στη γονιδιακή έκφραση Έναρξη της μεταγραφής και απομάκρυνση της RNA πολυμεράσης από τον υποκινητή (promoter clearance) Η RNA πολυμεράση φωσφορυλιώνεται στην καρβοξυ-τελική της περιοχή (CTD) από τον μεταγραφικό παράγοντα TFIIH Αυτό της επιτρέπει να απελευθερωθεί από το προ-μεταγραφικό σύμπλοκο ξεκινώντας την διαδικασία της μεταγραφής

15 Tα κύτταρα ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση και στο επίπεδο της μεταγραφής Γονίδιο Α Γονίδιο Β ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ

16 Πως επιτυγχάνεται η ρύθμιση της μεταγραφής; Η μεταγραφική ρύθμιση λαμβάνει χώρα κυρίως μέσω της δράσης εξειδικευμένων πρωτεϊνών Οι πρωτεΐνες αυτές καλούνται Ρυθμιστικοί Μεταγραφικοί Παράγοντες Οι Ρυθμιστικοί Μεταγραφικοί Παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν τη μεταγραφή θετικά ή αρνητικά Οι Μεταγραφικοί Παράγοντες συνήθως συνδέονται (άμεσα ή έμμεσα) σε ρυθμιστικές περιοχές του DNA Η παραπάνω σύνδεση μπορεί να λάβει χώρα σε περιοχές του DNA που είναι είτε κοντά ή και μακριά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής

17 H μεταγραφική ρύθμιση σε βακτήρια και ευκαρυώτες απαιτεί αλληλεπίδραση των μεταγραφικών παραγόντων με το σύμπλοκο της RNA πολυμεράσης Ρυθμιστική αλληλουχία του γονιδίου Ενεργοποιητής RNA πολυμεράση Σημείο έναρξης μεταγραφής Ενεργοποιητής Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες RNA πολυμεράση Ρυθμιστική αλληλουχία του γονιδίου Υποκινητής ΒΑΚΤΗΡΙΑ Αλληλουχία TATA Υποκινητής ΕΥΚΑΡΥΩΤΕΣ Σημείο έναρξης μεταγραφής

18 Pύθμιση της μεταγραφής του οπερονίου της λακτόζης RNA πολυμεράση Oπερόνιο λακτόζης (lac) lac καταστολέας Λακτόζη του θρεπτικού υλικού Λακτόζη Tρανσακετυλάση του θειογαλακτοσιδίου Περμεάση της λακτόζης β-γαλακτοσιδάση Nεοσυντιθέμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες

19 Πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την μεταγραφή συνεργιστικά από απόσταση ρυθμιστικές αλληλουχίες του γονιδίου ενδιάμεσο DNA ρυθμιστικοί μεταγραφικοί παράγοντες γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες RNA πολυμεράση ανοδικές αλληλουχίες υποκινητής έναρξη της μεταγραφής

20 Eνισχυτές & μεταγραφική ρύθμιση από απόσταση Βασική μεταγραφή Γονίδιο Γονίδιο Ενεργοποιημένη μεταγραφή Θηλειά DNA Ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες Ενισχυτής Ενισχυτής Εναρκτήριο σύμπλοκο Ενεργοποιημένη μεταγραφή Γονίδιο Γονίδιο Ενεργοποιημένη μεταγραφή Ενεργοποιημένη μεταγραφή ΠPOΣOXH: ME TON IΔIO MHXANIΣMO, AΛΛA APNHTIKA, MΠOPOYN NA PYΘMIΣOYN TH METAΓPAΦH AΠO AΠOΣTAΣH OI AΠOΣIΩΠHTEΣ.

21 Θετική ρύθμιση της ευκαρυωτικής μεταγραφής Οι ευκαρυωτικοί μεταγραφικοί ενεργοποιητές είναι συχνά αποτελούνται από ανεξάρτητες λειτουργικές περιοχές, π.χ. Άλλες για σύνδεση με το DNA και άλλες για μετεγραφική ενεργοποίηση ΠΕΡΙΟΧΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΣΤΟ DNA Παράδειγμα: Ο μεταγραφικός παράγοντας Gal4 συνδεδεμένος στο DNA

22 Οι λειτουργικές περιοχές των μεταγραφικών παραγόντων είναι ανεξάρτητες και μπορούν να ανταλλαγούν μεταξύ παραγόντων

23 Στρατολόγηση πρωτεϊνικών μεταγραφικών συμπλόκων από μεταγραφικούς ενεργοποιητές Οι ευκαρυωτικοί ενεργοποιητές της μεταγραφής λειτουργούν κυρίως στρατολογώντας άλλους παράγοντες. Ωστόσο, μπορούν να στρατολογήσουν και την RNA πολυμεράση με δύο κυρίως τρόπους: 1. Αλληλεπιδρώντας με άλλα συστατικά της μεταγραφικής μηχανής. 2. Στρατολογώντας τροποποιητές των νουκλεοσωματίων που μπορούν να αλλάξουν τη δμή της χρωματίνης στη περιοχή του γονιδίου.

24 Οι ενεργοποιητές αλληλεπιδρούν με την μεταγραφική μηχανή είτε άμεσα ή έμμεσα ενισχυτής ενεργοποιητής διαμεσολαβητής (mediator) Η ευκαρυωτική μεταγραφική μηχανή περιέχει την RNA πολυμεράση αλλά και πολλές άλλες πρωτεΐνες που είναι οργανωμένες σε αρκετά σύμπλοκα που αλληλεπιδρούν με την πολυμεράση, όπως για παράδειγμα τα σύμπλοκα του Διαμεσολαβητή (Mediator) και του συμπλόκου του γενικού μεταγραφικού παράγοντα TFII D. Οι ενεργοποιητές αλληλεπιδρούν με ένα ή περισσότερα από αυτά τα σύμπλοκα στρτολογώντας στη περιοχή του γονιδίου.

25 H μεταγραφή επηρεάζεται από τη δομή της χρωματίνης DNA τυλιγμένο γύρω από νουκλεοσωμάτιο μεταγραφικός παράγοντας το νουκλεοσωμάτιο μετατοπίζεται για να επιτραπεί η πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα Παράγοντας αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης

26 Οι ενεργοποιητές στρατολογούν τροποποιητές της δομής της χρωματίνης βοηθώντας έτσι τη σύνδεση του μεταγραφικού συμπλόκου στον υποκινητή 1. Οι τροποποιητές κατευθύνουν τη στρατολόγηση της μεταγραφικής μηχανής 2. Οι τροποποιητές διευκολύνουν την ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων τα οποία είναι «πακεταρισμένα» στην χρωματίνη με τρόπο που τα κάνει μη προσβάσιμα

27 Οι τροποποιήσεις των Ν-τελικών άκρων των ιστονών επηρεάζουν τη δομή της χρωματίνης και τη μεταγραφή ακετυλίωση καμμία τροποποίηση μεθυλίωση Πρωτεΐνη που φέρει την επικράτεια bromo Πρωτεΐνη που φέρει την επικράτεια chromo

28 Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών

29 Οι ενεργοποιητές μπορούν να προάγουν μεταβολές στη δομή της χρωματίνης ενεργοποιητής υποκινητής ενεργοποιητής υποκινητής ακετυλάση των ιστονών σύμπλοκο αναδιοργάνωσης της χρωματίνης ακετυλίωση των ιστονών αναδιοργανωμένα νουκλεοσωμάτια το μεταγραφικό σύμπλοκο προσδένεται στον υποκινητή το μεταγραφικό σύμπλοκο προσδένεται στον υποκινητή

30 Aρνητική ρύθμιση της ευκαρυωτικής μεταγραφής Ενεργοποιητής καταστολέας Ο καταστολέας ανταγωνίζεται το ενεργοποιητή για σύνδεση στην ίδια αλληλουχία DNA Κατασταλτική επικράτεια Ο καταστολέας συνδέεται στο DNA και αναστέλει την μεταγραφή αλληλεπιδρώντας με άλλες πρωτεΐνες Επικράτεια πρόσδεσης στο DNA

31 Οι ευκαρυωτικοί καταστολείς μπορούν να αλληλεπιδρούν με τη μεταγραφική μηχανή και να αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη διαμεσολαβητής άμεση καταστολή RNA πολυμεράση ΙΙ αποακετυλάση των ιστονών έμμεση καταστολή

32 H ακριβής ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης απαιτεί συνεργιστική δράση των μεταγραφικών παραγόντων ΠAPAΔEIΓMA 1: TO ΓONIΔIO THΣ ΣΦAIPINHΣ ΠAPAΔEIΓMA 2: ΔIAΦOPIKH PYΘMIΣH ΓONIΔIΩN AΠO ENAN YΠOΔOXEA ΓΛYKOKOPTIKOEIΔOYΣ

33 Συνδυαστική ρύθμιση του γονιδίου της σφαιρίνης από πολλούς μεταγραφικούς παράγοντες Ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων Θέση έναρξης μεταγραφής Θέση προσθήκης πολυ-α Εξόνια Ιντρόνια

34 Διαφορική ρύθμιση γονιδίων από έναν υποδοχέα γλυκοκορτικοειδούς Ο υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών απουσία γλυκοκορτικοειδών είναι ανενεργός Γλυκοκορτικοειδής ορμόνη Γονίδιο 1 Γονίδιο 1 Γονίδιο 2 Γονίδιο 2 Χαμηλή έκφραση γονιδίων Γονίδιο 3 Γονίδιο 3 Υψηλή έκφραση γονιδίων

35 Σημασία του συνδυαστικού ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στην ανάπτυξη διάφορων τύπων κυττάρων Πρόδρομο κύτταρο Κυτταρική διαίρεση Ρυθμιστική πρωτεΐνη 1 Ρυθμιστική πρωτεΐνη 2 Ρυθμιστική πρωτεΐνη 2 Ρυθμιστική πρωτεΐνη 3 Ρυθμιστική πρωτεΐνη 3 Ρυθμιστική πρωτεΐνη 3 Ρυθμιστική πρωτεΐνη 3 Κύτταρο Α Κύτταρο B Κύτταρο Γ Κύτταρο Δ Κύτταρο Ε Κύτταρο ΣΤ Κύτταρο Ζ Κύτταρο Η

36 Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας