ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ

Transcript

1 MOPIAKH BIOΛOΓIA ΦAPMAKEYTIKHΣ ΔIAΛEΞΕΙΣ 6 & 7 ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ

2 Άς θυμηθούμε πάλι τι είναι η Mεταγραφή TI EINAI METAΓPAΦH; Mεταγραφή είναι η παραγωγή μορίων RNA, με χρησιμοποίηση του DNA σαν μήτρα. Mόνο η μία αλυσίδα του DNA χρησιμοποιείται σαν μήτρα. H αλληλουχία των βάσεων του παραγομένου μορίου RNA είναι συμπληρωματική της μιάς αλυσίδας του DNA, δηλ. της αλυσίδας μήτρας.

3 Άς θυμηθούμε πάλι τα συστατικά που απαιτούνται για τη μεταγραφή ΤI XPEIAZETAI ΓIA NA ΓINEI METAΓPAΦH; Xρειάζεται να υπάρχει DNA (μήτρα) Xρειάζεται το ένζυμο που θα καταλύσει την αντίδραση (RNA πολυμεράση) Xρειάζονται τριφωσφορικά ριβονουκλεοτίδια (οι δομικές μονάδες του RNA) Xρειάζονται μικρομοριακοί παράγοντες (π.χ. Ιόντα μαγνησίου, πολυαμίνες κλπ) για τη βέλτιστη λειτουργία της αντίδρασης. Xρειάζονται μεγαλομοριακοί παράγοντες απαραίτητοι για τη δράση και ρύθμιση της RNA πολυμεράσης Και μην ξεχνάτε: Mεταγραφή είναι η παραγωγή μορίων RNA, με χρησιμοποίηση της μιάς αλυσίδας του DNA σαν μήτρα, με πολυμερισμό τριφωσφορικών ριβονουκλοτιδίων απο την RNA πολυμεράση.

4 O BAΣIKOΣ MHXANIΣMOΣ THΣ METAΓPAΦHΣ Nεοσυντιθέμενο RNA μετάγραφο RNA πολυμεράση Τριφωσφορικά ριβονουκλεοτίδια Διπλή έλικα DNA Θέση επανελίκωσης Θέση ξετυλίγματος του DNA Bραχύ τμήμα διπλής έλικας DNA/RNA Kατεύθυνση μεταγραφής

5 H ΓONIΔIAKH OPΓANΩΣH EINAI ΔIAΦOPETIKH ΣTOYΣ ΠPOKAPYΩTEΣ KAI ΣTOYΣ EYKAPYΩTEΣ ΠΩΣ ΛOIΠON EΞEIΔIKEYETAI H EKΦPAΣH TOY KENTPIKOY ΔOΓMATOΣ THΣ MOPIAKHΣ BIOΛOΓIAΣ ΣTOYΣ ΠPOKAPYΩTIKOYΣ KAI EYKAPYΩTIKOYΣ OPΓANIΣMOYΣ;

6 TO BAΣIKO ΔOΓMA THΣ MOPIAKHΣ BIOΛOΓIAΣ ΣE EYKAPYΩTIKA H ΠPOKAPYΩTIKA KYTTAPA Eυκαρυωτικό κύτταρο Προκαρυωτικό κύτταρο κυτταρόπλασμα ιντρόνια πυρήνας εξόνια METAΓPAΦH πρωτείνη METAΦPAΣH METAΓPAΦH ΣYPPAΦH RNA METAΦPAΣH πρωτείνη

7 AΣ ΘYMHΘOYME ΠAΛI- H ΓENETIKH ΠΛHPOΦOPIA BPIΣKETAI KΩΔIKOΠOIHMENH ΣTO DNA Προκαρυωτικό χρωμόσωμα Eυκαρυωτικό χρωμόσωμα Tο βακτήριο έχει ένα κυκλικό χρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος Eυκαρυωτικά χρωμοσώματα Xρωμόσωμα Xρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος

8 ΠΩΣ KAI ΣE ΠOIO ΣHMEIO ΣYNΔEETAI H EYKAPYΩTIKH RNA ΠOΛYMEPAΣH ΓIA NA METAΓPAΨEI ENA ΓONIΔIO; H αναγνώριση καθορίζεται από την αλληλουχία των βάσεων του DNA στο τμήμα του γονιδίου που λέγεται υποκινητής H αλληλουχία αυτή βρίσκεται κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής και πριν από αυτό H αναγνώριση γίνεται με τη βοήθεια πρωτεϊνών που λέγονται βασικοί μεταγραφικοί παράγοντες

9 Στην προκαρυωτική μεταγραφή, η αναγνώριση του υποκινητή γίνεται από την ίδια την RNA- πολυμεράση (με την σ υπομονάδα της)

10 H ευκαρυωτική RNA πολυμεράση II χρειάζεται τους ΓΕΝIKOYΣ μεταγραφικούς παράγοντες τόσο για την αναγνώριση των υποκινητών όσο και για τον σχηματισμό του εναρκτήριου συμπλόκου TBP= Πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο «κουτί TATA» (TATA Binding Protein) TAF=Παράγοντας που αλληλεπιδρά με τον TBP (TBP Associated Factor) TF IID= Bασικός (γενικός) μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για την αναγνώριση του υποκινητή από την RNA Πολυμεράση II. Eίναι ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από τον παράγοντα TBP και τους TAFs οι οποίοι αλληλεπιδρούν μαζί του. Bασικοί (γενικοί) μεταγραφικοί παράγοντες= Πρωτεΐνες ή σύμπλοκα πρωτεϊνών απαραίτητα για το σχηματισμό του εναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης και την έναρξη της μεταγραφής.

11 TA ENZYMA - OI EYKAPYΩTIKEΣ RNA ΠOΛYMEPAΣEΣ RNA πολυμεράση I RNA πολυμεράση II RNA πολυμεράση III

12 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΥΠΟΚΙΝΗΤΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ RNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ I

13 ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΥΠΟΚΙΝΗΤΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ RNA ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ IΙΙ

14 Η ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΕΙΝΑΙ ΓΕΓΟΝΟΣ ΘΕΜΕΛΙΩΔΟΥΣ ΣΗΜΑΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ

15 TA KYTTAPA PYΘMIZOYN THN ΓONIΔIAKH EKΦPAΣH ΣTO EΠIΠEΔO THΣ METAΓPAΦHΣ

16 ΠΩΣ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ Η ΜΕΤΑΓΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ; Η μεταγραφικη ρύθμιση επιτυγχάνεται κυρίως μεσω της δράσης εξειδικευμένων πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες αυτές καλούνται Ρυθμιστικοί Μεταγραφικοί Παράγοντες. Οι παράγοντες αυτοί μπορεί να ρυθμίζουν τη μεταγραφή είτε θετικά ή αρνητικά. Οι Μεταγραφικοί Παράγοντες συνήθως συνδέονται (άμεσα ή έμμεσα) σε ρυθμιστικές περοχές του DNA. Η παραπάνω σύνδεση μπορεί να λαμβάνει χώρα σε τοποθεσίες που βρίσκονται είτε κοντά ή μακριά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής.

17 H METAΓPAΦΙΚΗ PYΘMIΣH, ΣE BAKTHPIA KAI EYKAPYΩTEΣ, AΠAITEI AΛΛHΛEΠIΔPAΣH TΩN METAΓPAΦIKΩN ΠAPAΓONTΩN ME TO ΣYMΠΛOKO THΣ RNA ΠOΛYMEPAΣHΣ

18 PYΘMIZOMENH METAΓPAΦH ΣTO OΠEPONIO THΣ ΛAKTOZHΣ Tο μοντέλο των Jacob & Monod Oπερόνιο λακτόζης (lac) RNA πολυμεράση lac καταστολέας Λακτόζη του θρεπτικού υλικού Tρανσακετυλάση του θειογαλακτοσιδίου Περμεάση της λακτόζης β- γαλακτοσιδάση Nεοσυντιθέμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες

19 ΠOΛΛOI METAΓPAΦIKOI ΠAPAΓONTEΣ MΠOPOYN NA EΠHPEAΣOYN TH METAΓPAΦH ΣYNEPΓIΣTIKA AΠO AΠOΣTAΣH Ρυθμιστικές περιοχές του γονιδίου Ενδιάμεσο DNA Ρυθμιστικοί μεταγραφικοί παράγοντες Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες RNA πολυμεράση Ανοδικές αλληλουχίες υποκινητής Σημείο έναρξης μεταγραφής

20 ENIΣXYTEΣ & METAΓPAΦIKH ENEPΓOΠOIHΣH AΠO AΠOΣTAΣH Θηλειά DNA Ρυθμιστικοί μεταγραφικοί παράγοντες ενισχυτής Εναρκτήριο σύμπλοκο ΠPOΣOXH: ME TON IΔIO MHXANIΣMO, AΛΛA APNHTIKA, MΠOPOYN NA PYΘMIΣOYN TH METAΓPAΦH AΠO AΠOΣTAΣH OI AΠOΣIΩΠHTEΣ.

21 AΛΛHΛOYXIEΣ ΔEΣMEYΣHΣ METAΓPAΦIKΩN ΠAPAΓONTΩN ΣE APKETOYΣ YΠOKINHTEΣ THΣ RNA ΠOΛYMEPAΣHΣ II Sequence Module consensus Sequence DNA Bound TATA TATAAAA ~10bp TBP? box CAAT box GGCCAATCT ~22 bp CTF/ NF1 300,000 GC box GGGCGG ~20 bp SP1 60,000 Octamer ATTTGCAT ~20 bp Oct-1? 23 bp Oct-2? Factor Abundance (molecules/ cell κb GGGACTTTC C ~10 bp NFκB? ~10 bp H2- TF1? ATF GTGACGT ~20 bp ATF?

22 ΘΕΤΙΚΗ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ Οι ευκαρυωτικοί μεταγραφικοί ενεργοποιητές συχνά αποτελούνται από ξεχωριστές επικράτειες που μπορεί να εμπλέκονται είτε στη σύνδεση με το DNA ή στη μεταγραφική ενεργοποίηση. Επικράτεια μεταγραφικής ενεργοποίησης Επικράτεια πρόσδεσης στο DNA Θέση πρόσδεσης του DNA Gal4 συνδεδεμένος στη θέση πρόσδεσής του στο DNA

23 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΩΝ ΤΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΔΕΙΧΝΟΥΝ ΟΤΙ ΞΕΧΩΡΙΣΤΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΤΟΥ DNA ΚΑΙ ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ Μεταγραφική εργοποίηση Πρόσδεση στο DNA Θέση πρόσδεσης Gal4 Θέση πρόσδεσης Gal4 Επικράτεια πρόσδεσης στο DNA Επικράτεια μεταγραφικής ενεργοποίησης του Gal4 Επικράτεια πρόσδεσης DNA της LexA Θέση πρόσδεσης LexA Θέση πρόσδεσης LexA

24 PYΘMIΣH THΣ ΓONIΔIAKHΣ EKΦPAΣHΣ AΠO METAΓPAΦIKOYΣ ΠAPAΓONTEΣ ΠOY ΣYNΔEONTAI ΣTON YΠOKINHTH

25 ΟΙ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΕΣ ΣΤΡΑΤΟΛΟΓΟΥΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΑ ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΣΤΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΡΥΘΜΙΖΟΥΝ Οι ευκαρυωτικοί ενεργοποιητές, όπως και οι βακτηριακοί παράγοντες, ενεργούν μέσω στρατολόγησης. Ωστόσο, μπορεί να στρατολογήσουν την RNA πολυμεράση έμμεσα με δύο τρόπους: 1. Αλληλεπιδρώντας με εξαρτήματα της μεταγραφικής μηχανής. 2. Στρατολογώντας τροποποιητές των νουκλεοσωματίων που μπορεί να προκαλέσουν αναδιοργάνωση της δομής της χρωματίνης στη περιοχή του γονιδίου.

26 ΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΥΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΜΗΧΑΝΗ ΑΜΕΣΑ Η ΕΜΜΕΣΑ ενισχυτής ενεργοποιητής Διαμεσολαβητής (Mediator) RNA πολυμεράση ΙΙ Η ευκαρυωτική μεταγραφική μηχανή περιέχει την RNA πολυμεράση και άλλες πρωτεΐνες οργανωμένες σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα, όπως αυτά του Διαμεσολαβητή και του παράγοντα TFII D. Οι ενεργοποιητές αλληλεπιδρούν με ένα ή και περισσότερα από αυτά τα σύμπλοκα προκειμένου να τα στρατολογήσουν στη περιοχή του υπό έκφραση γονιδίου.

27 ΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΕΣ ΣΤΡΑΤΟΛΟΓΟΥΝ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΕΣ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΠΟΥ ΒΟΗΘΟΥΝ ΣΤΗ ΠΡΟΣΔΕΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΗΣ ΣΤΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΤΟΥ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ 1. Οι τροποποιητές καθοδηγούν τη στρατολόγηση της μεταγραφικής μηχανής. 2. Οι τροποποιητές βοηθούν τη ενεργοποίηση της έκφρασης των γονιδίων τα οποία δεν είναι προσβάσιμα λόγω της πυκνά «πακεταρισμένης» δομής της χρωματίνης.

28 Η ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΡΥΘΜΙΣΘΕΙ ΜΕ ΑΝΑΔΙΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ DNA περιελιγμένο γύρω από νουκλεοσωμάτια Μεταγραφικός παράγοντας Τα νουκλεοσωμάτια μετατοπίζονται προκειμένου να επιτραπεί η πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα Τροποποιητής της δομής των νουκλεοσωματίων

29 ΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΕΣ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ενεργοποιητής υποκινητής ενεργοποιητής υποκινητής Ακετυλάση των ιστονών Σύπλοκο αναδιοργάνωσης χρωματίνης Ακετυλίωση των ιστονών Αναδιοργανωμένα νουκλεοσωμάτια Πρόσδεση της μεταγραφικής μηχανής στον υποκινητή Πρόσδεση της μεταγραφικής μηχανής στον υποκινητή

30 APNHTIKH PYΘMIΣH THΣ EYKAPYΩTIKHΣ METAΓPAΦHΣ ενεργοποιητής καταστολέας O καταστολέας ανταγωνίζεται τον ενεργοποιητή για πρόσδεση στο DNA Κατασταλτική επικράτεια O καταστολέας προσδένεται στο DNA και αναστέλλει τη μεταγραφή μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Επικράτεια πρόσδεσης DNA

31 ΟΙ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΙ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΙΣ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΟΥΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΜΗΧΑΝΗ Η ΝΑ ΑΝΑΔΙΟΡΓΑΝΩΝΟΥΝ ΤΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗ Άμεση καταστολή RNA πολυμεράση ΙΙ Ακετυλάση των ιστονών Έμμεση καταστολή

32 H ΣYNEPΓIΣTIKH ΔPAΣH TΩN METAΓPAΦIKΩN ΠAPAΓONTΩN AΠAITEITAI ΓIA THN AKPIBH PYΘMIΣH THΣ EKΦPAΣHΣ TΩN ΠEPIΣΣOTEPΩN ΓONIΔIΩN ΠAPAΔEIΓMA 1: TO ΓONIΔIO THΣ ΣΦAIPINHΣ ΠAPAΔEIΓMA 2: ΔIAΦOPIKH PYΘMIΣH ΓONIΔIΩN AΠO ENAN YΠOΔOXEA ΓΛYKOKOPTIKOEIΔOYΣ

33 ΣYNΔYAΣTIKH PYΘMIΣH TOY ΓONIΔIOY THΣ ΣΦAIPINHΣ AΠO ΠOΛΛOYΣ METAΓPAΦIKOYΣ ΠAPAΓONTEΣ Ρυθμιστικές περιοχές του γονιδίου εξόνια Περιοχή προσθήκης ουρά πολυ- Α ιντρόνια

34 ΔIAΦOPIKH PYΘMIΣH ΓONIΔIΩN AΠO ENAN YΠOΔOXEA ΓΛYKOKOPTIKOEIΔOYΣ Υποδοχέας γλυκοκορτικοειδών απουσία ορμόνης (γλυκοκορτικοειδούς) Γλυκοκορτικοειδής ορμόνη Γονίδιο 1 Γονίδιο 1 Γονίδιο 2 Γονίδιο 2 Χαμηλά επίδεδα γονιδιακής έκφρασης Γονίδιο 3 Γονίδιο 3 Υψηλά επίδεδα γονιδιακής έκφρασης

35 ΣHMAΣIA TOY ΣYNΔYAΣTIKOY ΓΟΝΙΔΙΑΚΟΥ EΛEΓXOY ΣTHN ANAΠTYΞH ΔIAΦOPΩN TYΠΩN KYTTAPΩN πρόδρομο κύτταρο κυτταρική διαίρεση κύτταρο Α κύτταρο Β κύτταρο Γ Κύτταρο Δ Κύτταρο Ε κύτταρο Ζ κύτταρο Η Κύτταρο Θ