ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΕΛΕΓΧΟΣ ΜΕΤΑΒΟΛΟΜΙΚΩΝ ΜΕ NMR ΣΕ ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΑ ΕΚΠΝΕΟΜΕΝΟΥ ΑΕΡΑ ΠΑΙΔΙΩΝ ΜΕ ΒΡΟΓΧΙΚΟ ΑΣΘΜΑ: ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΝΟΣΗΡΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΑΣΘΜΑΤΙΚΗ ΑΓΩΓΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΟΛΓΑ Κ. ΛΑΓΙΟΥ ΙΑΤΡΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ: ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΒΑΡΒΑΡΗΓΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗΣ-ΝΕΟΓΝΟΛΟΓΙΑΣ, ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ 2018

2 2 Όλγα Κ. Λάγιου

3 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 3 UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENTS OF CHEMISTRY, PHARMACY AND MEDICINE POSTGRADUATE PROGRAM MEDICINALCHEMISTRY: DRUG DISCOVERY AND DESIGN NMR METABOLOMIC ANALYSIS OF EXHALED BREATH CONDENSATE IN CHILDREN WITH ASTHMA: CORRELATION WITH MORBIDITY AND TREATMENT MSc. THESIS OLGA K. LAGIOU, MD SUPERVISOR: ANASTASIA VARVARIGOU, PROFESSOR OF PAEDIATRICS-NEONATOLOGY, DEPT. OF MEDICINE, UNIVERSITY OF PATRAS PATRAS 2018

4 4 Όλγα Κ. Λάγιου

5 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 5 Επιβλέπουσα: Αναστασία Βαρβαρήγου, Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Νεογνολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Αναστασία Βαρβαρήγου, Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Νεογνολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μιχαήλ Ανθρακόπουλος, Καθηγητής Παιδιατρικής-Παιδοπνευμονολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Γεώργιος Σπυρούλιας, Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Supervisor: Anastasia Varvarigou, Professor of Paediatrics-Neonatology, Dept. of Medicine, University of Patras Examiners Committee: Anastasia Varvarigou, Professor of Paediatrics-Neonatology, Dept. of Medicine, University of Patras Michael Anthracopoulos, Professor of Paediatrics-Paediatric Pulmonology, Dept. of Medicine, University of Patras Georgios Spyroulias, Professor, Dept. of Pharmacy, University of Patras

6 6 Όλγα Κ. Λάγιου

7 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 7 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμότατες ευχαριστίες μου στην επιβλέπουσα της παρούσας εργασίας κ. Βαρβαρήγου Αναστασία, Καθηγήτρια Παιδιατρικής - Νεογνολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την ευκαιρία να συμμετέχω στη μελέτη αυτή καθώς και για τη στήριξή της. Θα ήθελα να ευχαριστήσω, επίσης, τον κ. Γεώργιο Σπυρούλια, Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την πολύτιμη βοήθειά του τόσο σε ηθικό, όσο και σε πρακτικό επίπεδο για την ολοκλήρωση της εργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον κ. Μιχάλη Ανθρακόπουλο, Καθηγητή Παιδιατρικής - Παιδοπνευμονολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, που δέχθηκε να αποτελεί μέρος της Τριμελούς Επιτροπής, καθώς και για την πολύτιμη υποστήριξη του σε όλα τα επίπεδα. Ακόμη, θα ήθελα να εκφράσω τις εγκάρδιες ευχαριστίες μου στον κ. Σωτήρη Φούζα, επιμελητή της Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την αμέριστη βοήθειά του σε πρακτικά και θεωρητικά ζητήματα, καθώς και την καίρια συμβολή του στην πραγματοποίηση και ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συναδέλφους και το προσωπικό της Παιδιατρικής Κλινικής και του Παιδοπνευμονολογικού Τμήματος του ΠΓΝΠ, όπως και τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ιωάννα Γεωργακοπούλου και τη διδακτορική φοιτήτρια Στέλλα Χασάπη για τη συνεισφορά τους στη μελέτη. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ ανήκει στου οικείους μου και πάνω απ όλα στην οικογένειά μου, στη μητέρα μου, Αντωνία, και στον αδερφό μου, Δημήτρη, οι οποίοι με στηρίζουν με όλη τους την αγάπη και την καλή τους θέληση όλα τα χρόνια των σπουδών μου. Φυσικά, δεν μπορώ να μην ευχαριστήσω και την εγκάρδια φίλη μου και δασκάλα, Μαρία Βέρρα, που πάντα με ενθαρρύνει. Κλείνοντας, ένα ξεχωριστό ευχαριστώ ανήκει στο σύζυγό μου Δημοσθένη Λυκούρα, Πνευμονολόγο Ιατρό, για την συνεχή ηθική και πρακτική υποστήριξή του κατά την πραγματοποίηση της εργασίας αυτής. Όλγα Κ. Λάγιου, MD

8 8 Όλγα Κ. Λάγιου

9 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 9 Στην οικογένειά μου, στον πατέρα μου με βαθύ σεβασμό.

10 10 Όλγα Κ. Λάγιου

11 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 11 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ Άσθμα Ορισμός άσθματος Επιδημιολογία Μεθοδολογία της επιδημιολογίας Επιπολασμός Θνητότητα Παιδικό άσθμα Παράγοντες κινδύνου Αλλεργία Η υπόθεση της υγιεινής του περιβάλλοντος Ανθρώπινο μικροβίωμα Ιογενείς λοιμώξεις αναπνευστικού Άτυπες βακτηριακές λοιμώξεις Ρύπανση του περιβάλλοντος Άλλοι παράγοντες στην παιδική ηλικία Επαγγελματική έκθεση Παθοφυσιολογία και παθογένεση Παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί στη φλεγμονή των αεραγωγών Παθογένεση Φαινότυποι άσθματος Φαινότυποι με βάση την ηλικία Φαινότυποι συριγμού Επιδημιολογικά καθορισμένοι φαινότυποι Άλλες μορφές συριγμού Διάγνωση Ιστορικό Φυσική Εξέταση Λειτουργικός έλεγχος του αναπνευστικού Εκτίμησης της αλλεργίας Μέτρηση βρογχικής υπεραπαντητικότητας... 49

12 12 Όλγα Κ. Λάγιου Εκτίμηση της φλεγμονής στους αεραγωγούς Θεραπεία Φαρμακευτική θεραπεία Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός (NMR) Εισαγωγή Ορισμός Ανάλυση δομής μορίων Θεωρία πειράματος με χρήση ενός παλμού Θεωρία πειράματος δύο διαστάσεων Θεωρία φάσματος δύο διαστάσεων Πυρηνικό φαινόμενο Overhauser Μηχανισμοί αποδιέγερσης στο NMR Αποδιέγερση spin-πλέγματος Αποδιέγερση spin-spin Τύποι φασμάτων NMR Φάσματα ευρείας γραμμής Φάσματα υψηλής διακρισιμότητας Επιδράσεις περιβάλλοντος στα φάσματα NMR Είδη περιβαλλοντικών επιδράσεων Θεωρία της χημικής μετατόπισης Θεωρία της σχάσης spin-spin Φασματόμετρα NMR Τμήματα φασματόμετρου με μετασχηματισμό Fourier Μαγνήτες και μαγνητικό πεδίο Υποδοχείς δείγματος Πηνία εκπομπής και λήψης Ανιχνευτής και σύστημα επεξεργασίας Προετοιμασία του δείγματος Εφαρμογές του πρωτονιακού NMR ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χαρακτηριστικά μελέτης Ασθενείς Κριτήρια εισόδου... 76

13 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 13 Κριτήρια αποκλεισμού Διαγνωστικές δοκιμασίες Σπιρομέτρηση Μέτρηση FeNO API Score Δειγματοληψία Exhaled Breathe Condensate (EBC) Αποθήκευση δειγμάτων Οργανολογία NMR Μεθοδολογία NMR για τον προσδιορισμό μεταβολιτών στο EBC Προετοιμασία δείγματος Πειράματα NMR Επεξεργασία NMR φασμάτων Επεξεργασία αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δημογραφικά στοιχεία Ομάδες μελέτης API Score Επικύρωση της μεθόδου NMR Συνολικό φάσμα NMR Αποτελέσματα NMR για το EBC Εφαρμογή τεχνικής PLS για ανίχνευση διαφοράς ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

14 14 Όλγα Κ. Λάγιου ΠΕΡΙΛΗΨΗ Εισαγωγή: Το άσθμα είναι μία χρόνια φλεγμονώδης νόσος των αεραγωγών και είναι το συχνότερο χρόνιο νόσημα στα παιδιά. Η γνώση της φλεγμονώδους κατάστασης των αεραγωγών παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπισή του. Η ποσοτική ανάλυση μεταβολιτών (μεταβολομική) στον εκπνεόμενο αέρα αποτελεί αναδυόμενη μη-επεμβατική μέθοδο προσδιορισμού της φλεγμονής αυτής. Σκοπός της μελέτης είναι η ανίχνευση μεταβολιτών με τη χρήση πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα (EBC) παιδιών με βρογχικό άσθμα, καθώς και σε υγιή παιδιά και η συσχέτιση των αποκλίσεων των παρατηρούμενων μετρήσεων ανάμεσα στους ασθενείς και την ομάδα ελέγχου. Υλικό και μέθοδος: Στη μελέτη εντάχθηκαν 23 παιδιά συνολικά, από τα οποία τα 11 παρουσίαζαν συριγμό μετά την ηλικία των 5 ετών (ασθενείς), ενώ τα 12 δεν είχαν συριγμό μετά την ηλικία των 5 ετών (ομάδα ελέγχου). Από κάθε παιδί ελήφθη αναλυτικό ιστορικό και υπεβλήθη σε σπιρομέτρηση, μέτρηση του μονοξειδίου του αζώτου στον εκπνεόμενο αέρα (FeNO) και τέλος, έγινε συλλογή του EBC. Τα δείγματα του EBC αναλύθηκαν με φασματογράφο NMR και έγιναν συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων. Αποτελέσματα: Από την επεξεργασία των δεδομένων μας πρόκυψε ότι η τιμή της FEV1 (βίαια εκπνεόεμενος όγκος αέρα στο πρώτο δευτερόλεπτο) από τη σπιρομέτρηση παρουσίαζε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των παιδιών της ομάδας συριγμού και της ομάδας ελέγχου, αλλά όχι η τιμή του FeNO. Επιπλέον, από την ανάλυση των φασμάτων NMR των δειγμάτων του EBC προσδιορίστηκαν διάφοροι μεταβολίτες στις δύο ομάδες της μελέτης. Από αυτούς στατιστικά σημαντική διαφορά εμφάνισε η διμεθυλαμίνη και η φαινόλη. Συμπεράσματα: Η μελέτη αυτή ανέδειξε τη δυνατότητα ανάλυσης του συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα με φασματογραφία NMR. Μεταξύ των μεταβολιτών που ανιχνεύθηκαν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά για τη διμεθυλαμίνη και τη φαινόλη, με υψηλότερη σχετική ένταση σήματος να εμφανίζεται στα φυσιολογικά άτομα. Κατ επέκταση, η χρήση NMR στο EBC παιδιών με άσθμα μπορεί να βοηθήσει στην περαιτέρω διερεύνηση της παθοφυσιολογίας της νόσου. Λέξεις Κλειδιά: Nuclear Magnetic Resonance, Exhaled Breath Condensate, Παιδικό άσθμα, Παιδοπνευμονολογία.

15 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 15 ABSTRACT Introduction: Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways and it is supposed to be the most common chronic disease in children. The knowledge of the inflammatory state of the airways plays a major role in its therapeutics. The identification and quantification of metabolites (metabolomics) in exhaled breath is an emerging non-invasive method to determine the inflammation of the airways. The aim of this study is to measure metabolites in exhaled breath condensate (EBC) by the means of nuclear magnetic resonance (NMR) in asthmatic children, as well as in healthy children and to correlate the findings between the two groups. Materials and methods: A total of 23 children enrolled in this study, 11 children suffering from wheezing after the age of 5 years old (patients) and 12 children without wheezing after the age of 5 years old (controls). A thorough medical history was taken from every child, followed by spirometry, measurement of exhaled nitrous oxide (FeNO) and collection of the exhaled breath condensate (EBC). The specimens of EBC were analyzed using NMR spectrometry and correlation between the two groups were performed. Results: Data analysis has shown statistically significant difference in FEV1 (forced exhaled volume in first second) in spirometry between children with wheezing and normal ones, but not in FeNO measurements. In addition, the results of NMR spectrometry of EBC specimens identified various metabolites in both groups of the study. Amongst them dimethylamine and phenol presented statistically significant difference between the two groups. Coclusions: This study has shown the potential of NMR spectrometry in the analysis of exhaled breath condensate. Among the identified metabolites, a statistically significant difference was found for dimethylamine and phenol, with a higher relative intensity in the group of normal children. Therefore, the use of NMR spectrometry for the analysis of EBC in children with asthma may contribute to the clarification of the pathogenesis of the disease. Key words: Nuclear Magnetic Resonance, Exhaled Breath Condensate, Childhood asthma, Paediatric Respiratory Medicine.

16 16 Όλγα Κ. Λάγιου

17 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Άσθμα Το άσθμα είναι ένα συχνό νόσημα με επιπολασμό που έχει αυξητική τάση σε ολόκληρο τον κόσμο τα τελευταία χρόνια. Για αρκετό καιρό είχε δοθεί μεγάλη βαρύτητα στη διερεύνηση των μηχανισμών της αλλεργίας, που σε αρκετές περιπτώσεις σχετίζεται με περιστατικά άσθματος. Σήμερα, όμως, είναι πλέον γνωστό από τις μελέτες της επιδημιολογίας, της φυσικής πορείας και της παθογένειας του άσθματος, ότι το άσθμα είναι μια νόσος ετερογενής, με αρκετούς αιτιολογικούς και συνοδούς επιβαρυντικούς παράγοντες, καθώς και με πολύπλοκους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς, που τελικά οδηγούν στην εμφάνιση διαφορετικών φαινοτύπων. Η κατανόηση αυτής ακριβώς της ετερογένειας είναι απαραίτητη, ώστε να είναι αποτελεσματικότερη η αντιμετώπιση των διαφόρων φαινοτύπων της νόσου. Ορισμός άσθματος Το άσθμα είναι μία χρόνια φλεγμονώδης νόσος των αεραγωγών που χαρακτηρίζεται κλινικά από επαναλαμβανόμενα επεισόδια δύσπνοιας, συριγμού, θωρακικού συσφικτικού άλγους ή/και βήχα, τα οποία σχετίζονται με περιορισμό της ροής του αέρα, που είναι όμως αναστρέψιμη (1). Το άσθμα, επίσης, χαρακτηρίζεται από αυξημένη απαντητικότητα των αεραγωγών σε ποικίλα ερεθίσματα, και στις περισσότερες περιπτώσεις υπάρχει + χρόνια φλεγμονή των αεραγωγών που χαρακτηρίζεται από την παρουσία CD 4 T-βοηθητικών λεμφοκυττάρων (Th2 λεμφοκύτταρα), ηωσινοφίλων και μεταχρωματικών κυττάρων στο βλεννογόνο των αεραγωγών. Επίσης, παρατηρείται πάχυνση του υποβλεννογόνιου υμένα και της βασικής μεμβράνης και αύξηση του όγκου των λείων μυϊκών ινών των αεραγωγών (2). Η γενετική και η οικογενής προδιάθεση, η εμφάνιση ατοπίας και η έκθεση σε αλλεργιογόνα και παράγοντες ευαισθητοποίησης στο σπίτι ή την εργασία, πιθανόν να είναι σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση άσθματος (3). Ωστόσο, οι παράγοντες που οδηγούν στην εμφάνιση και εξέλιξη του άσθματος, και όχι μόνο στις παροξύνσεις του, δεν είναι ακόμα καλά κατανοητοί και μελετημένοι. Το άσθμα είναι ετερογενές σύνδρομο και κατά τη μελέτη του μπορεί να διαχωριστεί σε διάφορες κατηγορίες, όπως στο κλασικό αλλεργικό άσθμα, το

18 18 Όλγα Κ. Λάγιου άσθμα της ενηλίκου ζωής που συνήθως δε σχετίζεται με αλλεργία, το επαγγελματικό άσθμα, το άσθμα των καπνιστών και το άσθμα της παχυσαρκίας. Επιδημιολογία Το άσθμα είναι ένα συχνό νόσημα του αναπνευστικού και τα τελευταία χρόνια ο επιπολασμός του αυξάνεται σταδιακά. Στις ΗΠΑ, ο επιπολασμός και η σοβαρότητα του άσθματος είναι υψηλότερα σε ειδικές πληθυσμιακές ομάδες, όπως τα παιδιά, οι άνθρωποι που ζουν σε κακές συνθήκες υγιεινής και οι μειονότητες. Αν και το οικογενειακό ιστορικό είναι ο ισχυρότερος παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση άσθματος, οι λοιμώξεις σε μικρή ηλικία παίζουν, επίσης, σημαντικό ρόλο με τουλάχιστον δύο τρόπους. Από τη μία μεριά, η αύξηση στον επιπολασμό του άσθματος μπορεί να σχετίζεται με την αυξημένη οικιακή υγιεινή που μειώνει την έκθεση σε βακτήρια ή αλλάζει το μικροβίωμα στην πρώιμη παιδική ηλικία. Έτσι, αντί να έχουμε την ενεργοποίηση των μηχανισμών ανοσίας έναντι μικροβίων, πιθανόν να έχουμε την εκδήλωση ανοσολογικών μηχανισμών που σχετίζονται με την αλλεργία. Από την άλλη μεριά, οι ιογενείς λοιμώξεις κατά την παιδική ηλικία φαίνεται ότι σχετίζονται με αύξηση του κινδύνου για την εμφάνιση συριγμού και άσθματος με την πάροδο του χρόνου. Άλλοι παράγοντες κινδύνου που έχουν ενοχοποιηθεί για το άσθμα περιλαμβάνουν την ενδομήτρια έκθεση σε βλαπτικούς παράγοντες, την προωρότητα, το μητρικό θηλασμό, τη δίαιτα (ειδικά την πρόσληψη βιταμινών), το στρες, τη συναναστροφή με άλλα παιδιά, την παχυσαρκία, τη ρύπανση του αέρα, τη χρήση αντιβιοτικών, τη χρήση παρακεταμόλης και την επαγγελματική έκθεση. Τέλος, η φυσική πορεία του άσθματος μπορεί να ποικίλλει. Ενώ, υπάρχουν γενικά χαρακτηριστικά που είναι κοινά, η εικόνα του άσθματος ανάλογα με την περίοδο εμφάνισής του, δηλαδή στην παιδική ηλικία, στην εφηβεία και στην ενήλικο ζωή, μπορεί να διαφέρει. Μεθοδολογία της επιδημιολογίας Στις επιδημιολογικές μελέτες του άσθματος ένα σημαντικό πρόβλημα αποτελεί ο ορισμός του άσθματος. Ανάλογα με τη μελέτη, το άσθμα μπορεί να καθορίζεται από τη χρήση ερωτηματολογίων σχετικά με τα συμπτώματα του

19 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 19 ασθενούς, τη χρήση φαρμάκων, τις αναφορές του θεράποντα ιατρού. Αυτά τα ερωτηματολόγια μπορεί να συνοδεύονται από έλεγχο της πνευμονικής λειτουργίας ή/και μέτρηση της βρογχικής υπεραπαντητικότητας. Γενικά, η χρήση μόνο ερωτηματολογίων για την καταγραφή συμπτωμάτων άσθματος μπορεί να οδηγήσει σε εκτίμηση υψηλότερου επιπολασμού, σε σχέση με τη χρήση αντικειμενικών εξετάσεων. Επιπολασμός Διεθνώς, ο επιπολασμός του άσθματος ποικίλει σημαντικά από χώρα σε χώρα, με υψηλότερα ποσοστά σε αναπτυγμένες χώρες, όπως το Ηνωμένο Βασίλειο, η Νέα Ζηλανδία, η Αυστραλία, οι Ηνωμένες Πολιτείες και ο Καναδάς (Εικόνα 1) (4). Ο επιπολασμός του άσθματος αυξάνει σταδιακά σε όλο τον κόσμο, ενώ στα παιδιά είναι το συχνότερο χρόνιο νόσημα. Εικόνα 1. Ο επιπολασμός του άσθματος διεθνώς. Δύο είναι οι μεγάλες μελέτες που έχουν γίνει για τη συστηματική εκτίμηση του επιπολασμού του άσθματος στα παιδιά και τους ενήλικες, η μελέτη ECRHS (European Community Respiratory Health Survey) και η μελέτη ISAAC (International Study of Asthma and Allergies in Childhood). Στη μελέτη ECRHS χρησιμοποιήθηκε ένα ερωτηματολόγιο με 7 ερωτήσεις σχετικά με την εμφάνιση συμπτωμάτων συμβατών με άσθμα και συμμετείχαν άνδρες και γυναίκες 20 ως 44 ετών από 48 κέντρα, κυρίως της Δυτικής Ευρώπης (5). Η μελέτη ISAAC είναι μία μεγάλη μελέτη, η οποία έχει συμπεριλάβει περίπου 2 εκατομμύρια παιδιά σχολικής ηλικίας (6-7 και ετών) από

20 20 Όλγα Κ. Λάγιου περισσότερες από 100 χώρες. Σχεδιάστηκε για να συγκρίνει τον επιπολασμό του άσθματος, της ρινίτιδας και του εκζέματος ανάμεσα στις χώρες (φάση Ι, ) και την πορεία τους στο χρόνο (φάση III, 5-10 χρόνια αργότερα) (6). Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν τυποποιημένα ερωτηματολόγια. Βασικά ευρήματα της μελέτης ήταν ο υψηλός επιπολασμός των συμπτωμάτων άσθματος και διαγνώσεων άσθματος στα παιδιά σε Αγγλόφωνες χώρες και στη Λατινική Αμερική (> 20% στα περισσότερα κέντρα), ενδιάμεσο επιπολασμό στη Δυτική Ευρώπη και χαμηλό επιπολασμό (< 5%) στην Ανατολική Ευρώπη. Ο χαμηλότερος επιπολασμός παρατηρήθηκε στην Αφρική και την Ασία, με εξαίρεση πλουσιότερες χώρες, όπως η Σιγκαπούρη και η Ιαπωνία. Στις περιοχές με τον υψηλότερο επιπολασμό, ειδικά στις Αγγλόφωνες χώρες, ο επιπολασμός του συριγμού άλλαξε λίγο μεταξύ της φάσης Ι και ΙΙΙ, ή και μειωνόταν σε ορισμένες περιπτώσεις, ενώ στις περισσότερες χώρες με χαμηλό και ενδιάμεσο επιπολασμό σημειώθηκε αύξηση. Θνητότητα Στο παρελθόν θεωρούνταν ότι ο θάνατος από άσθμα είναι απίθανος. Στην πραγματικότητα, όμως βάσει δεδομένων από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ), κάθε έτος καταγράφονται θάνατοι λόγω άσθματος σε όλο τον κόσμο (7). Αν και η συχνότητα των θανάτων αρχικά παρατηρήθηκε ότι σχετιζόταν με τον υψηλότερο επιπολασμό σε ορισμένες χώρες, φαίνεται όμως ότι και η περιορισμένη πρόσβαση σε υπηρεσίες υγείας αυξάνει τον κίνδυνο του θανάτου από άσθμα. Επίσης, η αυξημένη παρατηρούμενη θνητότητα σε ορισμένες χώρες σχετίστηκε και με τη χρήση ορισμένων β2- αγωνιστών, όπως της ισοπροτερενόλης (8). Παιδικό άσθμα Στη διάρκεια των δεκαετιών του 1970 έως και του 1990 σημειώθηκε μεγάλη αύξηση του επιπολασμού της νόσου σε παγκόσμια κλίμακα, αλλά τα τελευταία χρόνια φαίνεται ότι στις περισσότερες χώρες τείνει να σταθεροποιηθεί. Στις χώρες που κατά τις προηγούμενες δεκαετίες παρατηρήθηκε ιδιαίτερα υψηλός επιπολασμός, όπως στο Ηνωμένο Βασίλειο, διαπιστώνεται πλέον επιπέδωση της καμπύλης της διαχρονικής τάσης, ενώ σε ορισμένες παρατηρείται μείωση. Αντίθετα, στις αναπτυσσόμενες χώρες παρατηρείται ακόμη αυξητική τάση. Ο επιπολασμός σήμερα είναι δύσκολο να προσδιορισθεί με ακρίβεια και ποικίλλει από 1-35%. Σε παιδιά που ζουν σε αναπτυγμένες χώρες το ενεργό

21 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 21 άσθμα κατά τη σχολική ηλικία είναι 10-15% και διαφέρει ανάλογα με την ηλικία και το φύλο. Στη σχολική ηλικία η αναλογία είναι μεγαλύτερη στα αγόρια 1,5:1, όμως μετά την εφηβεία η αναλογία είναι μεγαλύτερη στα κορίτσια. Στην Ελλάδα σύμφωνα με τη μελέτη της Πάτρας, όπου καταγράφηκε η πορεία του επιπολασμού της νόσου τα τελευταία 30 και πλέον χρόνια ( ), με πέντε συγχρονικές μελέτες, παρατηρήθηκε συνεχής αύξηση του επιπολασμού του ενεργού άσθματος (συμπτώματα την τελευταία διετία) μέχρι το 2003, ενώ στη συνέχεια παρατηρήθηκε σταθεροποίηση στο επίπεδο του 6,9% (Εικόνα 2) (9) (10). Εικόνα 2. Επιπολασμός του άσθματος στη μελέτη της Πάτρας. Παράγοντες κινδύνου Αλλεργία Ο ισχυρότερος παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση άσθματος είναι το οικογενειακό ιστορικό ατοπίας (11). Αυτό αυξάνει τον κίνδυνο για την ανάπτυξη αλλεργικής ρινίτιδας κατά 5 φορές και 3-πλασιάζει έως 4-πλασιάζει τον κίνδυνο για την εκδήλωση άσθματος. Στα παιδιά 3-14 ετών, τόσο οι δερματικές δοκιμασίες, όσο και τα επίπεδα αναοσοσφαιρίνης IgE στον ορό σχετίζονται με τη βρογχική υπεραπαντητικότητα (12). Στους ενήλικες, η πιθανότητα εμφάνισης άσθματος αυξάνει σε άτομα με θετική δερματική δοκιμασία στα συνήθη αλλεργιογόνα.

22 22 Όλγα Κ. Λάγιου Το αλλεργικό, ατοπικό άσθμα σχετίζεται ιδιαίτερα με τα αλλεργιογόνα που υπάρχουν στο οικιακό περιβάλλον, και καθώς ο δυτικός τρόπος ζωής αυξάνει την έκθεση σε αυτά είχε παλαιότερα δοθεί έμφαση στην παρατήρηση της αυξημένης έκθεσης σε οικιακά αλλεργιογόνα κατά τη βρεφική και την πρώιμη παιδική ηλικία και την πιθανότητα αυτό να οδηγεί στην εκδήλωση άσθματος. Τα αλλεργιογόνα που μελετήθηκαν ήταν τα ακάρεα, το τρίχωμα της γάτας και του σκύλου και αλλεργιογόνα από κατσαρίδες (13). Αρχικά θεωρείτο ότι η μείωση της έκθεσης σε αυτά τα αλλεργιογόνα θα μπορούσε να μειώσει των κίνδυνο εμφάνισης άσθματος (14). Όμως, μετα-αναλύσεις έχουν δείξει αντικρουόμενα αποτελέσματα και το θέμα αυτό είναι ακόμα υπό μελέτη (15). Η υπόθεση της υγιεινής του περιβάλλοντος Η υπόθεση της υγιεινής του περιβάλλοντος είναι ένα καλό μοντέλο που μπορεί να εξηγήσει την αύξηση του άσθματος και των αλλεργιών στις δυτικές κοινωνίες. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζει ότι η αύξηση των αλλεργιών στα παιδιά αποτελεί ανεπιθύμητη ενέργεια της υπερβολικής οικιακής υγιεινής, που μειώνει το ρυθμό λοιμώξεων και την έκθεσή τους σε βακτήρια, κατά την πρώιμη παιδική ηλικία. Αυτή η υπόθεση αρχικά χρησιμοποιήθηκε για να εξηγήσει την αντιστρόφως ανάλογη σχέση ανάμεσα στην αλλεργική ρινίτιδα και τον αριθμό των μελών μιας οικογένειας. Παιδιά που μεγάλωναν στη Δυτική Γερμανία είχαν υψηλότερα ποσοστά αλλεργικής ρινίτιδας και άσθματος σε σχέση με παιδιά που μεγάλωναν στην Ανατολική Γερμανία, όπου υπήρχε σοβαρή ρύπανση της ατμόσφαιρας από τη βαριά βιομηχανία και τη χρήση οργανικών καυσίμων για τη θέρμανση των σπιτιών (16). Σε αυτές τις μελέτες, φάνηκε, επίσης, ότι παιδιά που μεγάλωναν σε φάρμες είχαν ακόμη μικρότερο κίνδυνο για την ανάπτυξη αλλεργικής ρινίτιδας και άσθματος (17). Ανθρώπινο μικροβίωμα Μία πιθανή σχέση ανάμεσα στην αλλαγή της υγιεινής και την εμφάνιση αλλεργίας αποτελεί το γεγονός ότι οι καλύτερες συνθήκες υγιεινής μπορεί να αλλάζουν τον ενδογενή πληθυσμό μικροβίων (μικροβίωμα - microbiota), που συμβιούν αρμονικά με τον ανθρώπινο οργανισμό και παίζουν ρόλο στη διαμόρφωση του ανοσοποιητικού συστήματος (18). Το βιολογικό μοντέλο που έχει προταθεί για να εξηγήσει αυτή τη σχέση, δείχνει ότι η έκθεση σε παράγοντες που ευοδώνουν την ενεργοποίηση της Th1 ανοσίας στην πρώιμη παιδική ηλικία είναι απαραίτητοι, ώστε να παρεμποδίζεται η υπερενεργοποίηση της Th2 ανοσίας (19). Μελέτες σε πειραματικά ζωικά μοντέλα

23 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 23 έχουν δώσει κάποια πρώτα αποτελέσματα, ωστόσο οι μελέτες σε ανθρώπους δεν έχουν ακόμα κάποιο απτό αποτέλεσμα. Ιογενείς λοιμώξεις αναπνευστικού Ο ρόλος των ιογενών λοιμώξεων στην ανάπτυξη άσθματος έχει γίνει αντικείμενο μελέτης και έχει τεκμηριωθεί. Μία σημαντική μελέτη έχει δείξει ότι παιδιά με ιστορικό βρογχιολίτιδας και croup στην πρώιμη παιδική ηλικία είχαν προδιάθεση για εμφάνιση βρογχικής υπεραπαντητικότητας και ατοπίας στη μετέπειτα ζωή τους (20). Παιδιά τα οποία εμφανίζουν λοιμώξεις του κατωτέρου αναπνευστικού που οφείλεται στον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (Respiratory Syncytial Virus - RSV) έχουν 3-πλάσιο ως και 4-πλάσιο κίνδυνο να εμφανίσουν συριγμό κατά τη σχολική ηλικία (21). Επιπλέον, επεισόδια συριγμού που οφείλονται σε λοίμωξεις από ρινοϊούς σχετίζονται ισχυρά με την εμφάνιση άσθματος. Γενικά, φαίνεται ότι υπάρχει αλληλεπίδραση της ατοπικής προδιάθεσης και των συχνών ιογενών λοιμώξεων του κατώτερου αναπνευστικού στην πρώιμη παιδική ηλικία για την εμφάνιση άσθματος (22). Συνολικά φαίνεται ότι οι ιογενείς λοιμώξεις του κατωτέρου αναπνευστικού δεν επάγουν το άσθμα, αλλά αποκαλύπτουν την προδιάθεση για ανοσολογική απάντηση Th2, η οποία προϋπάρχει κατά τη στιγμή της λοίμωξης, και που αργότερα εκδηλώνεται ως άσθμα (23). Άτυπες βακτηριακές λοιμώξεις Αν και τα κλασικά αίτια βακτηριακής λοίμωξης του κατωτέρου αναπνευστικού δε σχετίζονται με την εκδήλωση άσθματος, τουλάχιστον δύο από τα λεγόμενα «άτυπα» αίτια πνευμονίας, τα Chlamydia pneumoniae και το Mycoplasma pneumoniae, έχει αποδειχθεί ότι σχετίζονται με την εμφάνιση χρόνιου συριγμού. Και τα δύο μικρόβια προσβάλλουν το κατώτερο αναπνευστικό, έχουν χρόνια πορεία και ενεργοποιούν την ανοσολογική απόκριση. Μελέτες έχουν αποδείξει ότι τόσο τα Chlamydia pneumoniae, όσο και το Mycoplasma pneumoniae είναι παρόντα συχνότερα στους αεραγωγούς ασθενών με άσθμα σε σχέση με τους υγιείς, ενώ συνδέονται και με την αύξηση των ιστιοκυττάρων (mast cells). Επίσης, έχει αποδειχθεί ότι οι άτυπες λοιμώξεις του κατωτέρου αναπνευστικού από Chlamydia και Mycoplasma σχετίζονται με παροξύνσεις του άσθματος (24).

24 24 Όλγα Κ. Λάγιου Ρύπανση του περιβάλλοντος Παρά το γεγονός ότι η ρύπανση του περιβάλλοντος έχει ενοχοποιηθεί σε αρκετές περιπτώσεις για την παρόξυνση του άσθματος, δεν έχει τεκμηριωθεί επαρκώς η σχέση της με την ανάπτυξη του άσθματος. Κατά βάση, η έκθεση του αναπνευστικού συστήματος στη ρύπανση μπορεί να αυξήσει το οξειδωτικό στρες, να επάγει ή να τροποποιήσει την τοπική φλεγμονή των αεραγωγών, να ενισχύσει την ευαισθητοποίηση σε αλλεργιογόνα, να προκαλέσει καθυστερημένη ανάπτυξη των πνευμόνων ή/και βλάβη των μικρών αεραγωγών (25). Ωστόσο, μελέτες που επιχειρούν να συσχετίσουν τα επίπεδα της ρύπανσης με την επίπτωση του άσθματος δεν έχουν δώσει σαφή αποτελέσματα. Τέλος, έχει αποδειχθεί ότι η έκθεση σε αιωρούμενα σωματίδια και NO 2 λόγω εγγύτητας σε περιοχές με μεγάλη κυκλοφορία αυτοκινήτων, μπορεί να σχετίζεται με την ανάπτυξη άσθματος (26). Άλλοι παράγοντες στην παιδική ηλικία Άλλοι παράγοντες που επιδρούν νωρίς στη ζωή του παιδιού και σχετίζονται με την ανάπτυξη άσθματος, είναι βλαπτικοί παράγοντες κατά την ενδομήτρια ζωή, περιγεννητικοί παράγοντες ή παράγοντες στην πρώιμη παιδική ηλικία. Ενδομήτρια, μπορεί να επιδρά ο ρυθμός ανάπτυξης (π.χ. ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης), η ανεπαρκής διαιτητική πρόσληψη βιταμινών (ανεπάρκεια βιταμίνης D και E), η έκθεση σε μικρόβια, το κάπνισμα των γονιών, το στρες της εγκύου. Περιγεννητικά, με το άσθμα σχετίζεται η προωρότητα και η χοριοαμνιονίτιδα. Τέλος, κατά την παιδική ηλικία με την ανάπτυξη άσθματος συνδέεται η πρώιμη διακοπή του θηλασμού, η παχυσαρκία, η έλλειψη αδελφών, ο αποικισμός των αεραγωγών με μικρόβια, η χρήση αντιβιοτικών και η χρήση παρακεταμόλης (27). Επαγγελματική έκθεση Η επαγγελματική έκθεση σε δυνητικά βλαπτικούς και ερεθιστικούς παράγοντες είναι βασική αιτία για την εμφάνιση άσθματος. Υπολογίζεται ότι το 17% των περιστατικών άσθματος που εμφανίζεται κατά την ενήλικη ζωή σχετίζεται με παράγοντες στην εργασία (28).

25 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 25 Παθοφυσιολογία και παθογένεση Ο περιορισμός της ροής του αέρα στο άσθμα είναι διαλείπων και προκαλείται από διάφορες αλλαγές που συμβαίνουν στους αεραγωγούς. Οι αλλαγές αυτές περιλαμβάνουν τα εξής (29): Βρογχόσπασμο. Στο άσθμα, η απόφραξη των αεραγωγών και η επακόλουθη διαταραχή στη ροή του αέρα, είναι το κύριο παθοφυσιολογικό γεγονός. Στις παροξύνσεις του άσθματος, συμβαίνει γρήγορη σύσπαση των λείων μυϊκών ινών των βρόγχων (βρογχόσπασμος) και μειώνεται το εύρος των αεραγωγών ως απάντηση στην έκθεση ποικίλων ερεθισμάτων, όπως τα αλλεργιογόνα ή οι ερεθιστικοί παράγοντες. Ο βρογχόσπασμος που προκαλείται από αλλεργιογόνα οφείλεται σε μια εξαρτώμενη από την IgE απελευθέρωση μεσολαβητών από τα ιστιοκύτταρα (mast cells), όπως η ισταμίνη, η τρυπτάση, τα λευκοτριένια και οι προσταγλανδίνες, που προκαλούν απευθείας σύσπαση των λείων μυϊκών ινών (30). Η ασπιρίνη, καθώς και άλλα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα μπορούν να προκαλέσουν οξεία απόφραξη της ροής του αέρα σε μερικούς ασθενείς, και υπάρχουν ενδείξεις ότι και αυτή η μη εξαρτώμενη από την IgE απάντηση περιλαμβάνει απελευθέρωση μεσολαβητών από τα κύτταρα των αεραγωγών (31). Επιπλέον, άλλα ερεθίσματα, όπως η άσκηση, ο κρύος αέρας και άλλοι ερεθιστικοί παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν απόφραξη των αεραγωγών. Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην απάντηση σε αυτούς τους παράγοντες είναι λιγότερο κατανοητοί, αλλά η ένταση της απάντησης φαίνεται να σχετίζεται με την υποκείμενη φλεγμονή. Επίσης, το στρες μπορεί να παίζει ρόλο στην πυροδότηση ασθματικών παροξύνσεων. Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται και εδώ δεν έχουν διευκρινιστεί, όμως θεωρείται πως ίσως περιλαμβάνουν ενισχυμένη παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Οίδημα των αεραγωγών. Καθώς η νόσος γίνεται πιο επίμονη και η φλεγμονή πιο επιθετική, άλλοι παράγοντες περιορίζουν περαιτέρω την ροή του αέρα. Αυτοί περιλαμβάνουν, το οίδημα, τη φλεγμονή, την υπερέκκριση βλέννης και το σχηματισμό βυσμάτων βλέννης, καθώς επίσης και δομικές αλλαγές, όπως η υπερτροφία και η υπερπλασία των λείων μυϊκών ινών των αεραγωγών. Αυτές οι αλλαγές μπορεί να μην επηρεάζονται από τη θεραπεία. Βρογχική υπεραπαντητικότητα. Η βρογχική υπεραπαντητικότητα (υπερβολική απάντηση βρογχόσπασμου σε ποικίλα ερεθίσματα) είναι ένα κύριο, αλλά όχι απαραίτητα μοναδικό χαρακτηριστικό του άσθματος. Ο βαθμός της βρογχικής υπεραπαντητικότητας, που μπορεί να προσδιοριστεί με τη δοκιμασία πρόκλησης με μεταχολίνη, σχετίζεται με την κλινική βαρύτητα του άσθματος. Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται είναι πολλοί και περιλαμβάνουν τη φλεγμονή, τη δυσλειτουργία της νευρορύθμισης και δομικές

26 26 Όλγα Κ. Λάγιου αλλαγές. Η φλεγμονή φαίνεται να είναι ο κύριος παράγοντας καθορισμού του βαθμού της βρογχικής υπεραπαντητικότητας. Η θεραπεία που έχει ως στόχο τη φλεγμονή μπορεί να μειώσει την βρογχική υπεραπαντητικότητα και να βελτιώσει τον έλεγχο του άσθματος. Αναδιαμόρφωση των αεραγωγών (airway remodeling). Σε μερικούς ασθενείς που πάσχουν από άσθμα, η απόφραξη των αεραγωγών μπορεί να είναι μερικώς αναστρέψιμη. Μόνιμες δομικές αλλαγές μπορεί να συμβούν στους αεραγωγούς και αυτές σχετίζονται με προοδευτική απώλεια της πνευμονικής λειτουργίας, η οποία δεν μπορεί να αποτραπεί ή να αναστραφεί πλήρως με την τρέχουσα θεραπεία (Εικόνα 3). Η αναδιαμόρφωση των αεραγωγών περιλαμβάνει ενεργοποίηση των δομικών κυττάρων, με αποτέλεσμα μόνιμες αλλαγές στη δομή των αεραγωγών. Έτσι, αυξάνει η απόφραξη των αεραγωγών και η θεραπεία γίνεται λιγότερο αποτελεσματική για τον ασθενή (32). Αυτές οι δομικές αλλαγές μπορεί να περιλαμβάνουν πάχυνση της βασικής μεμβράνης, ίνωση, υπερτροφία και υπερπλασία των λείων μυϊκών ινών, πολλαπλασιασμό και διαστολή των αιμοφόρων αγγείων, υπερπλασία των βλεννογόνων αδένων και υπερέκκριση βλέννης. Η ρύθμιση της επιδιόρθωσης καθώς και η διαδικασία του remodeling δεν είναι πλήρως κατανοητές, αλλά πιθανόν και οι δύο να είναι το κλειδί στην εξήγηση της επίμονης φύσης της νόσου και των περιορισμών στη θεραπευτική απάντηση. Εικόνα 3. Η διαρκής φλεγμονή στο άσθμα και η διαμόρφωση των αεραγωγών.

27 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 27 Παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί στη φλεγμονή των αεραγωγών Η φλεγμονή έχει κεντρικό ρόλο στην παθοφυσιολογία του άσθματος. Όπως τονίστηκε και στον ορισμό του άσθματος, η φλεγμονή των αεραγωγών περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση πολλών κυτταρικών τύπων και πολλών μεσολαβητών στους αεραγωγούς, η οποία τελικά οδηγεί στα παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά της νόσου: φλεγμονή και απόφραξη των βρόγχων. Αυτά έχουν ως αποτέλεσμα επαναλαμβανόμενα επεισόδια βήχα, συριγμού και δυσκολίας στην αναπνοή. Οι διεργασίες που λαμβάνουν χώρα για να συμβούν αυτές οι αλληλεπιδράσεις και οδηγούν στην κλινική εκδήλωση του άσθματος είναι υπό διερεύνηση. Επιπλέον, αν και υπάρχουν διαφορετικοί φαινότυποι άσθματος, η φλεγμονή των βρόγχων παραμένει ένα σταθερό μοτίβο. Το μοτίβο αυτό, ωστόσο, δεν μεταβάλλεται απαραίτητα με την βαρύτητα και τη διάρκεια της νόσου. Κύτταρα της φλεγμονής Λεμφοκύτταρα. Η αυξανόμενη κατανόηση της ανάπτυξης και της ρύθμισης της φλεγμονής των βρόγχων στο άσθμα ακολούθησε την ανακάλυψη και την περιγραφή των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων, τύπου 1 και τύπου 2 Τ-βοηθητικών κυττάρων (Th1 και Th2), με διακριτό φλεγμονώδες προφίλ μεσολαβητών (Εικόνα 4). Μετά την ανακάλυψη αυτών των υποπληθυσμών σε ζωικά μοντέλα αλλεργικής φλεγμονής, προέκυψε ότι στον άνθρωπο συμβαίνει μετατόπιση της ανοσολογικής απάντησης προς Th2 απάντηση, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την χαρακτηριστική για το άσθμα ηωσινοφιλική φλεγμονή (33). Επιπλέον, η παραγωγή Th2 κυτταροκινών (IL-4, IL-5 και IL-13) μπορεί να εξηγήσει την υπερπαραγωγή της IgE, την παρουσία ηωσινόφιλων και την ανάπτυξη υπεραπαντητικότητας. Ακόμα, μπορεί να υπάρχει μία μείωση στον υποπληθυσμό των λεμφοκυττάρων, των ρυθμιστικών Τ κυττάρων, τα οποία φυσιολογικά αναστέλλουν τα Th2 κύτταρα, όπως, και αύξηση στα κύτταρα φυσικούς φονείς (Natural Killer - NK), τα οποία απελευθερώνουν μεγάλα ποσά Th1 και Th2 κυτταροκινών (34) (35). Τα T λεμφοκύτταρα, μαζί με άλλα κύτταρα των αεραγωγών, μπορούν επίσης να καθορίσουν την ανάπτυξη και τον βαθμό της αναδιαμόρφωσης των αεραγωγών. Αν και είναι υπεραπλούστευση μιας πολύπλοκης διαδικασίας να περιγράψουμε το άσθμα ως Th2 νόσο, η αναγνώριση της σημαντικότητας της οικογένειας των κυτταροκινών και χημειοκινών βοήθησε στην κατανόηση της ανάπτυξης της φλεγμονής των αεραγωγών (36) (37).

28 28 Όλγα Κ. Λάγιου Εικόνα 4. Ο καταρράκτης της φλεγμονής μετά από την εισπνοή αλλεργιογόνου. (VCAM- 1: vascular-cell adhesion molecule 1 / μόριο αγγειακής προσκόλλησης, ICAM-1: intercellular adhesion molecule 1 / μόριο προσκόλλησης κυττάρων, GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor / παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων, MCP-1: monocyte chemotactic protein / χημειοτακτική πρωτεΐνη μονοκυττάρων, MIP-1α: macrophage inflammatory protein α / φλεγμονώδης πρωτεΐνη μακροφάγων α). Ιστιοκύτταρα. Η ενεργοποίηση των ιστιοκυττάρων οδηγεί στην απελευθέρωση μεσολαβητών που προκαλούν βρογχόσπασμο (ισταμίνη, κυστεϊνυλο-λευκοτριένια, προσταγλαδίνη D2) (38) (39) (40). Αν και η ενεργοποίηση από αλλεργιογόνο συμβαίνει μέσω υψηλής συγγένειας IgE υποδοχέων και είναι πιθανόν η πιο συχνή αντίδραση, τα ιστιοκύτταρα μπορούν, επίσης, να ενεργοποιηθούν από ωσμωτικά ερεθίσματα, όπως στο βρογχόσπασμο επαγόμενο από άσκηση. Ο αυξημένος αριθμός ιστιοκυττάρων στους λείους μυς των αεραγωγών μπορεί να συνδέεται με υπεραπαντητικότητα

29 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 29 των αεραγωγών (41). Τα ιστιοκύτταρα μπορούν να απελευθερώσουν έναν μεγάλο αριθμό κυτταροκινών, να αλλάξουν το περιβάλλον των αεραγωγών και να προάγουν τη φλεγμονή, ακόμα και εάν, η έκθεση στα αλλεργιογόνα είναι περιορισμένη. Ηωσινόφιλα. Αυξημένος αριθμός ηωσινόφιλων βρίσκεται στους αεραγωγούς των περισσότερων, αλλά όχι όλων των ασθενών που πάσχουν από άσθμα (42) (43) (44). Αυτά τα κύτταρα περιέχουν ένζυμα φλεγμονής, παράγουν λευκοτριένια και εκφράζουν μία ποικιλία προφλεγμωνωδών κυτταροκινών. Αύξηση των ηωσινοφίλων συχνά σχετίζεται με μεγαλύτερη βαρύτητα άσθματος. Επιπλέον, αρκετές μελέτες δείχνουν ότι η θεραπεία του άσθματος με κορτικοστεροειδή μειώνει τόσο τα ηωσινόφιλα στην κυκλοφορία του αίματος, όσο και στους αεραγωγούς, παράλληλα με την κλινική βελτίωση. Ωστόσο, ο ρόλος και η συνεισφορά των ηωσινόφιλων στο άσθμα επαναξιολογείται μετά από μελέτες με αντι-il-5 θεραπεία στην οποία υπήρχε σημαντική μείωση των ηωσινόφιλων, αλλά καμία επίδραση στον έλεγχο του άσθματος (45). Επομένως, αν και μπορεί τα ηωσινόφιλα να μην είναι τα μοναδικά κύτταρα με πρωταρχικό ρόλο στο άσθμα, είναι πιθανόν ότι έχουν διακριτό ρόλο σε διάφορες φάσεις της νόσου. Ουδετερόφιλα. Τα ουδετερόφιλα είναι αυξημένα στους αεραγωγούς και τα πτύελα των ασθενών που πάσχουν από σοβαρό άσθμα, που βρίσκονται σε παρόξυνση και στους ασθενείς που καπνίζουν. Ο παθοφυσιολογικός τους ρόλος παραμένει αδιευκρίνιστος. Ίσως, μπορεί να είναι καθοριστικός παράγοντας για την μη ανταπόκριση στη θεραπεία με κορτικοστεροειδή (46). Δενδριτικά κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα λειτουργούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα αλληλεπιδρώντας με αλλεργιογόνα στην επιφάνεια των αεραγωγών και στη συνέχεια, μεταναστεύουν στους τοπικούς λεμφαδένες για να αλληλεπιδράσουν με ρυθμιστικά κύτταρα και να ενεργοποιήσουν την Th2 κυτταρική απάντηση από παρθένα Τ-κύτταρα (47). Μακροφάγα. Τα μακροφάγα είναι τα πιο πολυάριθμα κύτταρα στους αεραγωγούς και μπορούν να ενεργοποιηθούν από αλλεργιογόνα μέσω χαμηλής συγγένειας IgE υποδοχέων για να απελευθερώσουν μεσολαβητές της φλεγμονής και κυτταροκίνες που ενισχύουν τη φλεγμονώδη απάντηση (48). Κύτταρα των αεραγωγών. Τα λεία μυϊκά κύτταρα δεν είναι μόνο στόχος της απάντησης του άσθματος (προκαλώντας στένωση και μείωση της ροής του αέρα), αλλά επίσης, συνεισφέρουν σε αυτό (μέσω της παραγωγής δικής τους οικογένειας προφλεγμονωδών μεσολαβητών). Ως συνέπεια της φλεγμονής των αεραγωγών και της παραγωγής αυξητικών παραγόντων, τα λεία μυϊκά κύτταρα μπορούν να υποβληθούν σε πολλαπλασιασμό, ενεργοποίηση, σύσπαση και υπερτροφία, δηλαδή να οδηγήσουν σε δυσλειτουργία των αεραγωγών.

30 30 Όλγα Κ. Λάγιου Επιθηλιακά κύτταρα. Τα κύτταρα του επιθηλίου των αεραγωγών είναι ένας άλλος κυτταρικός τύπος των αεραγωγών με μεγάλη σημασία στο άσθμα (49). Η παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών, η προσέλκυση και ενεργοποίηση φλεγμονωδών κυττάρων και η λοίμωξη από ιούς του αναπνευστικού μπορούν να κάνουν τα επιθηλιακά κύτταρα να παράγουν περισσότερους μεσολαβητές της φλεγμονής και να βλάψουν το ίδιο το επιθήλιο. Η διαδικασία επούλωσης, που θα ακολουθήσει τη βλάβη του επιθηλίου, μπορεί να μην είναι φυσιολογική στο άσθμα, ευνοώντας έτσι τις αποφρακτικές βλάβες που συμβαίνουν στο νόσο. Μεσολαβητές της φλεγμονής Χημειοκίνες. Οι χημειοκίνες είναι σημαντικές για την προσέλκυση φλεγμονωδών κυττάρων στους αεραγωγούς και εκφράζονται κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών (37). Η ηωταξίνη είναι σχετικά εκλεκτικός χημειοτακτικός παράγοντας των ηωσινόφιλων, ενώ ο θύμος και οι ρυθμιστικές χημειοκίνες του θύμου (TARCs), καθώς και οι χημειοκίνες παραγόμενες από τα μακροφάγα (MDCs) προσελκύουν Th2-κύτταρα. Κυτταροκίνες. Οι κυτταροκίνες κατευθύνουν και τροποποιούν την φλεγμονώδη απόκριση στο άσθμα και πιθανόν να καθορίζουν τη βαρύτητά του. Οι παραγόμενες από Th2-κύτταρα κυτταροκίνες, όπως η IL-5, που είναι απαραίτητη για την διαφοροποίηση και επιβίωση των ηωσινόφιλων, και η IL-4 που είναι σημαντική για την διαφοροποίηση των Th2 κυττάρων, μαζί με την IL-13 είναι σημαντικές για την παραγωγή IgE. Βασικές κυτταροκίνες αποτελούν η IL-1β και o TNF-α (Παράγοντας Νέκρωσης Όγκων α) που ενισχύουν την φλεγμονώδη απόκριση, και ο GM-CSF (Παράγοντας Διέγερσης Αποικιών Κοκκιοκυττάρων-Μακροφάγων) που παρατείνει την επιβίωση των ηωσινόφιλων στους αεραγωγούς. Πρόσφατες μελέτες θεραπειών που στόχευαν κυτταροκίνες (π.χ. αντι-il-5 μονοκλωνικό αντίσωμα ή διαλυτός υποδοχέας της IL-4) δεν έδειξαν βελτίωση στα συμπτώματα του άσθματος. Κυστεϊνυλο-λευκοτριένια. Τα κυστεϊνυλο-λευκοτριένια είναι ισχυροί παράγοντες που προκαλούν βρογχόσπασμο παραγόμενα από ιστιοκύτταρα. Είναι οι μόνοι μεσολαβητές των οποίων η αναστολή έχει συσχετιστεί με βελτίωση της πνευμονικής λειτουργίας και των συμπτωμάτων του άσθματος (50) (51). Μελέτες έδειξαν, επίσης, πως το λευκοτριένιο B4 μπορεί να συνεισφέρει στη φλεγμονή προσελκύοντας ουδετερόφιλα (52). Μονοξείδιο του αζώτου (NO). Το μονοξείδιο του αζώτου παράγεται κυρίως από τη δράση της επαγώγιμης συνθετάσης του NO στα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών και είναι ένας ισχυρός αγγειοδιασταλτικός παράγοντας (53) (54). Η μέτρηση της συγκέντρωσης του μονοξείδιου του

31 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 31 αζώτου στον εκπνεόμενο αέρα (Fractional exhaled NO - FeNO) μπορεί να είναι χρήσιμη για την παρακολούθηση της θεραπευτικής ανταπόκρισης στο άσθμα, καθώς θεωρείται πως υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του FeNO και της παρουσίας φλεγμονής (55). IgE ανοσοσφαιρίνη. Η IgE ανοσοσφαιρίνη είναι αντίσωμα υπεύθυνο για την ενεργοποίηση της αλλεργικής αντίδρασης και παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση των αλλεργικών ασθενειών και στην ανάπτυξη και επιμονή της φλεγμονής. Η IgE ανοσοσφαιρίνη προσδένεται στην επιφάνεια των κυττάρων μέσω συγκεκριμένου υποδοχέα υψηλής συγγένειας. Τα ιστιοκύτταρα διαθέτουν έναν μεγάλο αριθμό IgE υποδοχέων, και όταν ενεργοποιηθούν από την αλληλεπίδραση με ένα αντιγόνο απελευθερώνουν μία ποικιλία μεσολαβητών που προκαλούν βρογχόσπασμο, αλλά και προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες για να διαιωνίσουν την υποκείμενη φλεγμονή των αεραγωγών (38) (56). Επίσης, άλλα κύτταρα, όπως τα βασεόφιλα, τα δενδριτικά και τα λεμφοκύτταρα, διαθέτουν IgE υποδοχείς υψηλής συγγένειας. Η ανάπτυξη μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της IgE έδειξε ότι η μείωση της IgE ήταν αποτελεσματική στην θεραπεία του άσθματος (57) (58). Αυτές οι κλινικές παρατηρήσεις υποστηρίζουν ακόμα περισσότερο την σημασία της IgE στο άσθμα. Παθογένεση Δεν είναι ξεκάθαρο ακόμα τι είναι αυτό που αρχικά πυροδοτεί την φλεγμονώδη διαδικασία και κάνει κάποια άτομα ευαίσθητα. Δεν υπάρχει σαφής απάντηση ακόμα, όμως μελέτες δείχνουν ότι κάτι συμβαίνει στα πρώτα χρόνια της ζωής. Η έκφραση του άσθματος είναι μία περίπλοκη διαδικασία αλληλεπίδρασης δύο κυρίως παραγόντων, του ξενιστή (ιδιαίτερα το γονιδίωμα) και του περιβάλλοντος, που συμβαίνει κατά την ανάπτυξη του ανοσολογικού συστήματος (Εικόνα 5).

32 32 Όλγα Κ. Λάγιου Εικόνα 5. Συριγμός και άσθμα. Παράγοντες του ξενιστή Φυσική ανοσία. Υπάρχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στο ρόλο της απάντησης της φυσικής και της επίκτητης ανοσίας που σχετίζονται με την ανάπτυξη και τη ρύθμιση της φλεγμονής (59). Ειδικότερα, η έρευνα έχει επικεντρωθεί στην ανισορροπία μεταξύ του Th1 και του Th2 προφίλ κυτταροκινών και στην ένδειξη πως οι αλλεργικές νόσοι, και πιθανόν το άσθμα, χαρακτηρίζονται από ανοσολογική στροφή προς τον Th2 φαινότυπο, είτε ως υπερ-έκφραση του Th2 είτε ως υπο-έκφραση του Th1 φαινοτύπου (Εικόνα 6). Η φλεγμονή των αεραγωγών στο άσθμα μπορεί να αντιπροσωπεύει την απώλεια της ισορροπίας μεταξύ των δύο T λεμφοκυτταρικών πληθυσμών, του Th1 και του Th2. Τα Τh1 κύτταρα παράγουν IL-2 και ιντερφερόνη-γ (IFNγ), οι οποίες είναι ιδιαίτερα σημαντικές στο μηχανισμό της κυτταρικής άμυνας ως απάντηση στη λοίμωξη. Σε αντίθεση, τα Th2 κύτταρα παράγουν μία οικογένεια κυτταροκινών (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 και IL-13) οι οποίες προάγουν την αλλεργική φλεγμονή. Η τρέχουσα «θεωρία της υγιεινής» για το άσθμα δείχνει πως η ανισορροπία μεταξύ των κυτταροκινών μπορεί να εξηγήσει την δραματική αύξηση του άσθματος στις δυτικές χώρες. Η υπόθεση βασίζεται στη θεωρία πως το ανοσοποιητικό σύστημα του νεογέννητου τείνει προς Th2 παραγωγή κυτταροκινών. Μετά τη γέννηση, τα περιβαλλοντικά ερεθίσματα, όπως οι λοιμώξεις, ενεργοποιούν την Th1 απάντηση και φέρνουν τη σχέση Th1/Th2 σε

33 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 33 ισορροπία. Υπάρχουν ενδείξεις πως η επίπτωση του άσθματος μειώνεται μετά από συγκεκριμένες λοιμώξεις (φυματίωση, ιλαρά, ηπατίτιδα Α), όταν υπάρχει επαφή με άλλα παιδιά (π.χ παρουσία μεγαλύτερων αδερφών και συμμετοχή των παιδιών σε βρεφονηπιακούς σταθμούς νωρίς στη ζωή), και με τη λιγότερο συχνή χρήση των αντιβιοτικών (60) (61). Επιπλέον, η απουσία αυτών των παραγόντων στον τρόπο ζωής σχετίζεται με την επιμονή του Th2 προφίλ κυτταροκινών. Κάτω από αυτές τις συνθήκες, το γενετικό υπόβαθρο του παιδιού, το οποίο παρουσιάζει στροφή προς Th2 προφίλ κυτταροκινών, θα θέσει τη βάση για την παραγωγή IgE αντισωμάτων σε βασικά περιβαλλοντικά αντιγόνα, όπως η οικιακή σκόνη, η κατσαρίδα, ο μύκητας Alternaria και πιθανόν η γάτα. Ως εκ τούτου, συμβαίνει αλληλεπίδραση γονιδίουπεριβάλλοντος σε έναν ευαίσθητο ξενιστή, ο οποίος εκτίθεται σε περιβαλλοντικούς παράγοντες που είναι ικανοί να παράγουν IgE και επέρχεται η ευαισθητοποίηση. Όμως, ο λόγος που οι αεραγωγοί κάποιων ατόμων είναι ευαίσθητοι σε αυτά τα αλλεργικά συμβάντα παραμένει άγνωστος. Επίσης, φαίνεται να υπάρχει μια αμφίδρομη αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο υποπληθυσμών, όπου οι Th1 κυτταροκίνες μπορούν να αναστείλουν την παραγωγή των Th2 κυτταροκινών και αντίστροφα. Η αλλεργική φλεγμονή μπορεί να είναι το αποτέλεσμα της υπερβολικής έκφρασης των Th2 κυτταροκινών. Εναλλακτικά, μελέτες έχουν δείξει την πιθανότητα η απώλεια της φυσιολογικής ανοσολογικής ισορροπίας να προέρχεται από απορρύθμιση των κυτταροκινών, ώστε η Th1 δράση στο άσθμα να είναι μειωμένη. Παράγοντες που ενισχύουν τον Th1 φαινότυπο Παράγοντες που ενισχύουν τον Th2 φαινότυπο Αγροτικό περιβάλλον Ευαισθητοποίηση με αντιγόνα οικιακής σκόνης Φυματίωση, ιλαρά ή ηπατίτιδα Α Δίαιτα Παρουσία οικιακής βοηθού νωρίς στη ζωή Δυτικός τρόπος ζωής και αστικό περιβάλλον Μεγαλύτερα αδέρφια Ευρεία χρήση αντιβιοτικών Εικόνα 6. Η ισορροπία των κυτταροκινών. Η Th1 ανοσία αποτελεί προστατευτική ανοσία. Η Th1 ανοσία ευοδώνει την ανάπτυξη αλλεργικών νοσημάτων και άσθματος.

34 34 Όλγα Κ. Λάγιου Γενετική. Είναι γνωστό ότι το άσθμα έχει μία κληρονομική συνιστώσα στην έκφραση του, αλλά ο ρόλος των γονιδίων στην ανάπτυξη άσθματος παραμένει αδιευκρίνιστη (62). Μελέτες σε μονοζυγωτικούς και διζυγωτικούς διδύμους, μαζί με τη συσχέτιση του ασθματικού φαινοτύπου μεταξύ συγγενών πρώτου βαθμού, έδειξε πως υπάρχει γενετική βάση στο άσθμα. Μέχρι σήμερα, αρκετά γονίδια έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται ή συνδέονται με την παρουσία άσθματος και ορισμένων χαρακτηριστικών του. Η συσχέτιση γονιδίων με φαινοτύπους του άσθματος έχει επιτευχθεί, χωρίς ωστόσο να υπάρχει σαφής εμπλοκή στην παθοφυσιολογία του άσθματος. Ο ρόλος του γονιδιώματος στην παραγωγή IgE, την υπεραπαντητικότητα των αεραγωγών και τη ρύθμιση της παραγωγής μεσολαβητών της φλεγμονής (όπως οι κυτταροκίνες, οι χημειοκίνες και οι αυξητικοί παράγοντες) έχει ερευνητικό ενδιαφέρον. Επιπλέον, μελέτες πραγματοποιούνται για το ρόλο γενετικών πολυμορφισμών στην απάντηση στη θεραπεία, όπως στην περίπτωση των β-αδρενεργικών υποδοχέων και των υποδοχέων των κορτικοστεροειδών. Πρόσφατα, μελέτες ταυτοποίησαν γενετικούς τόπους που σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης άσθματος σε συγκεκριμένους πληθυσμούς (63). Η επίδραση της γενετικής ποικιλότητας στο άσθμα, δείχνει πως υπάρχει μεγάλη ετερογένεια, και πως μπορεί να σχετίζεται έντονα με περιβαλλοντικούς παράγοντες (64) (65). Έτσι, πολλά παιδιά με άσθμα δεν έχουν γονείς που πάσχουν, ενώ πολλοί γονείς που πάσχουν έχουν παιδιά φυσιολογικά. Φύλο. Η επίπτωση του άσθματος στα πρώτα χρόνια ζωής είναι μεγαλύτερη στα αγόρια. Ωστόσο, η τάση αυτή αλλάζει στην εφηβεία και το άσθμα εμφανίζεται κυρίως στα κορίτσια (66). Μελέτες πάνω στην επίπτωση και στον επιπολασμό του άσθματος στην παιδική ηλικία δείχνουν πως ο επιπολασμός είναι μεγαλύτερος στα αγόρια απ ότι στα κορίτσια, στην πρώτη δεκαετία της ζωής (67), αν και μία πρόσφατη μελέτη έδειξε πως αυτή η διαφορά ανάμεσα στα φύλα μειώθηκε (68). Ωστόσο, αργότερα, όσο πλησιάζουμε την εφηβεία, το πρωτο-εμφανιζόμενο άσθμα γίνεται συχνότερο στα κορίτσια, ειδικά στα παχύσαρκα και εκείνα με πρώιμη ήβη (69). Οι διαφορές αυτές ανάμεσα στα δύο φύλα δεν είναι πλήρως κατανοητές. Ο ακριβής ρόλος του φύλου, καθώς και των ορμονών του φύλου στο άσθμα δεν έχει διευκρινιστεί, όμως θεωρείται πως συνεισφέρουν στην έναρξη και την επιμονή της νόσου. Περιβαλλοντικοί Παράγοντες Δύο κύριοι περιβαλλοντικοί παράγοντες θεωρείται πως είναι οι πιο σημαντικοί για την ανάπτυξη, την επιμονή και την βαρύτητα του άσθματος: τα αεριοαλλεργιογόνα και οι ιώσεις του αναπνευστικού. Σε έναν ευαίσθητο

35 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 35 ξενιστή, σε μία σημαντική στιγμή της ανάπτυξης (π.χ. ανοσολογικά ή ψυχολογικά), τόσο οι αναπνευστικές λοιμώξεις, όσο και τα αλλεργιογόνα έχουν σημαντική επιρροή στην ανάπτυξη του άσθματος και την επιμονή των συμπτωμάτων. Ακόμη, είναι προφανές ότι η έκθεση στο αλλεργιογόνο, η αλλεργική ευαισθητοποίηση και οι αναπνευστικές λοιμώξεις δεν είναι ξεχωριστές καταστάσεις, αλλά δρουν από κοινού στην ανάπτυξη του άσθματος. Ωστόσο, πλην των αλλεργιογόνων και των λοιμώξεων κι άλλοι περιβαλλοντικοί παράγοντες θεωρούνται ότι λαμβάνουν μέρος στην παθογένεση του άσθματος. Αλλεργιογόνα. Η έκθεση σε αλλεργιογόνα εξωτερικού χώρου και σε οικιακά αλλεργιογόνα είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για το αλλεργικό άσθμα (70). Η έκθεση στη βρεφική ηλικία σχετίζεται με πρώιμη ευαισθητοποίηση, και ο συνδυασμός ευαισθητοποίησης και συνεχούς έκθεσης σε υψηλό φορτίο αλλεργιογόνων στο σπίτι, συσχετίζεται με επίμονο άσθμα και επηρεασμένη πνευμονική λειτουργία (71). Οι κλινικές εκδηλώσεις ποικίλουν, κάτι το οποίο εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως τα χαρακτηριστικά του αλλεργιογόνου, η εποχικότητά του, η γεωγραφική κατανομή του και η παρουσία του σε εξωτερικούς χώρους ή εντός του σπιτιού. Στη βρεφική ηλικία, οι τροφικές αλλεργίες με δερματικές εκδηλώσεις ή εκδηλώσεις από το γαστρεντερικό ή το αναπνευστικό σύστημα είναι πιο συχνές απ ότι οι αλλεργίες από εισπνεόμενα αλλεργιογόνα. Η παρουσία τροφικής αλλεργίας αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη συμπτωμάτων άσθματος σε ηλικία > 4 ετών (65). Όσο αυξάνεται η ηλικία, αναπτύσσονται συμπτώματα που σχετίζονται με εισπνεόμενα αλλεργιογόνα, ιδιαίτερα με οικιακά αλλεργιογόνα, όπως η οικιακή σκόνη, τα κατοικίδια, οι κατσαρίδες και η μούχλα, και αργότερα με τα αλλεργιογόνα εξωτερικού χώρου, όπως η γύρη και η μούχλα. Η έκθεση και η ευαισθητοποίηση στα ακάρεα της οικιακής σκόνης και στον μύκητα Alternaria είναι σημαντικοί παράγοντες για την ανάπτυξη άσθματος στα παιδιά. Παλαιότερες μελέτες έχουν δείξει ότι το τρίχωμα των ζώων, ειδικά του σκύλου και της γάτας, σχετίζεται με την ανάπτυξη άσθματος. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν πως, κάτω από ορισμένες συνθήκες, η έκθεση στον σκύλο και στη γάτα νωρίς στη ζωή μπορεί να δρα προστατευτικά έναντι της ανάπτυξης άσθματος, χωρίς να είναι γνωστό γιατί αυτό συμβαίνει. Σε μελέτες που αξιολογούν την έκθεση στα ακάρεα της οικιακής σκόνης και στις κατσαρίδες φαίνεται πως η επίπτωση της ευαισθητοποίησης και της επακόλουθης ανάπτυξης του άσθματος συνδέονται (13) (72). Η έκθεση στο αλλεργιογόνο της κατσαρίδας, για παράδειγμα, ένα κύριο αλλεργιογόνο στα συγκροτήματα κατοικιών στα κέντρα των πόλεων, είναι μία σημαντική αιτία αλλεργικής ευαισθητοποίησης (73).

36 36 Όλγα Κ. Λάγιου Η κλασσική αλλεργική αντίδραση περιλαμβάνει σύνδεση των ειδικών για το αλλεργιογόνο IgE αντισωμάτων στα ιστιοκύτταρα. Μετά από επανέκθεση στο αλλεργιογόνο, αυτό μπορεί να ακολουθείται από απόκριση πρώιμης φάσης που σχετίζεται με απελευθέρωση μεσολαβητών από τα ιστιοκύτταρα και εμφάνιση τυπικών συμπτωμάτων αλλεργίας, ακολουθούμενο από απόκριση όψιμης φάσης. Καθώς η επαναλαμβανόμενη έκθεση στο αλλεργιογόνο και η αλλεργική απάντηση καταστρέφουν τους εμπλεκόμενους στην αλλεργία ιστούς, η επίδραση της αλλεργίας συνεχίζεται ακόμη και μετά την απομάκρυνση του αλλεργιογόνου. Αναπνευστικές λοιμώξεις. Κατά τη βρεφική ηλικία, ένας μεγάλος αριθμός αναπνευστικών ιών έχει συσχετιστεί με την έναρξη ή την ανάπτυξη άσθματος. Πιο συγκεκριμένα, νωρίς στη ζωή, ο αναπνευστικός συγκυτιακός ιός (RSV) και ο ιός της παραϊνφλουέντζας προκαλούν βρογχιολίτιδα που έχει πολλά κοινά χαρακτηριστικά με το άσθμα της παιδικής ηλικίας (60). Ένας αριθμός μακροχρόνιων προοπτικών μελετών σε παιδιά που εισήχθησαν στο νοσοκομείο με τεκμηριωμένη λοίμωξη από RSV έδειξαν ότι το 40% αυτών των παιδιών θα συνεχίζει να εμφανίζει συριγμό ή θα πάσχει από άσθμα αργότερα στην παιδική του ηλικία (74). Ακόμη, οι συμπτωματικές λοιμώξεις από ρινοϊούς, στην πρώιμη παιδική ηλικία, φαίνεται να είναι παράγοντας κινδύνου για υποτροπιάζοντα συριγμό. Οι λοιμώξεις μπορούν να καταστρέψουν το επιθήλιο των αεραγωγών, να προάγουν τη φλεγμονή και να ενεργοποιήσουν την ανοσολογική αντίδραση και την υπεραπαντητικότητα των αεραγωγών (75). Ακόμη και μετά την υποχώρηση της λοίμωξης, η υπεραπαντητικότητα των αεραγωγών παραμένει για ένα μεγάλο χρονικό διάστημα (76). Οι λοιμώξεις παραμένουν ένας σημαντικός εκλυτικός παράγοντες κατά την παιδική ηλικία και την ενήλικο ζωή. Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν ενδείξεις πως συγκεκριμένες αναπνευστικές λοιμώξεις νωρίς στη ζωή, συμπεριλαμβανομένου του ιού της ιλαράς, του RSV ή και επαναλαμβανόμενων ιώσεων (εκτός από λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού) μπορούν να δρουν προστατευτικά έναντι της ανάπτυξης άσθματος (77). Η συμμετοχή των αναπνευστικών ιώσεων στην ανάπτυξη του άσθματος μπορεί να εξαρτηθεί από την αλληλεπίδρασή τους με την ατοπία. Η ατοπία μπορεί να επηρεάσει την απάντηση του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος στις ιώσεις, και οι ιώσεις μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη αλλεργικής ευαισθητοποίησης. Προς το παρών, δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι ο εμβολιασμός κατά τα πρώτα χρόνια ζωής τροποποιεί τον κίνδυνο ατοπίας ή άσθματος (78). Η έκθεση στα αντιβιοτικά κατά τη βρεφική ηλικία έχει συσχετιστεί με αυξημένο

37 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 37 κίνδυνο άσθματος (79). Ωστόσο, τα αποτελέσματα από αυτές τις μελέτες παραμένουν ασαφή και οι κατευθυντήριες οδηγίες του παιδικού εμβολιασμού και η συνετή πρακτική χρήσης αντιβιοτικών παραμένει αμετάβλητη. Καπνός τσιγάρου. Κατά τη διάρκεια της ενδομήτριας ζωής, η έκθεση στον καπνό του τσιγάρου προκαλεί διαταραχή στην ανάπτυξη των πνευμόνων του αναπτυσσόμενου εμβρύου αυξάνοντας την πιθανότητα συριγμού στην βρεφική ηλικία (80). Η παθητική έκθεση στον καπνό του τσιγάρου είναι ένας από τους πιο σημαντικούς οικιακούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη διαλείποντα βήχα/συριγμού ή ασθματικών συμπτωμάτων σε οποιαδήποτε ηλικία στα παιδιά. Στο άσθμα, το κάπνισμα σχετίζεται με επίμονη νόσο, και μπορεί να εμποδίζει την απάντηση στην αντιασθματική αγωγή (81). Ο καπνός του τσιγάρου αυξάνει το οξειδωτικό στρες και ενεργοποιεί τη φλεγμονή, τόσο στους κατώτερους, όσο και στους ανώτερους αεραγωγούς. Αν και ο καπνός του τσιγάρου είναι βλαβερός για όλους, για τα παιδιά είναι περισσότερο επιβλαβής λόγω των μικρότερων σε μέγεθος αεραγωγών. Άλλωστε, η αποφυγή του καπνού του τσιγάρου είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες στην πρόληψη του άσθματος και των άλλων αναπνευστικών νοσημάτων. Στους ενήλικες που πάσχουν από άσθμα, το κάπνισμα έχει συσχετιστεί θετικά με τη βαρύτητα της νόσου και με μειωμένη ανταπόκριση στα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή (82). Ρύποι. Η επίδραση της ατμοσφαιρικής μόλυνσης που προκαλείται από τα μέσα μεταφοράς ή τη βιομηχανία στα παιδιά με άσθμα έχει μελετηθεί εκτενώς (83). Πέρα από την άμεση τοξικότητα στους πνεύμονες, οι ρύποι προκαλούν οξειδωτικό στρες, φλεγμονή των αεραγωγών, και μπορούν να προκαλέσουν άσθμα σε άτομα που είναι γενετικά ευαίσθητα στο οξειδωτικό στρες (84). Αν και ως ρύποι, τυπικά, θεωρούνται αυτοί στο εξωτερικό περιβάλλον, υψηλή συγκέντρωση ρύπων μπορεί να βρεθεί και στο εσωτερικό του σπιτιού (π.χ. τζάκια, ξυλόσομπες). Διατροφή. Η αξία του μητρικού θηλασμού είναι ξεκάθαρη και μία πρόσφατη συστηματική ανασκόπηση έδειξε ότι προστατεύει από την ανάπτυξη ατοπικής νόσου, κυρίως σε παιδιά με ατοπική κληρονομικότητα (85). Η χρήση γάλακτος εκτεταμένης υδρόλυσης δεν φαίνεται να μειώνει την επίπτωση του άσθματος. Ενώ, η αυστηρή αποφυγή πρωτεϊνών, όπως το γάλα αγελάδας ή τα αυγά, μειώνει την επίπτωση ατοπικής δερματίτιδας τον πρώτο χρόνο ζωής, δεν εμποδίζει την ανάπτυξη του άσθματος (86). Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι διαιτητικοί παράγοντες, όπως η πρόσληψη νατρίου και λιπιδίων και τα επίπεδα των αντιοξειδωτικών μπορεί να σχετίζονται με την ενεργότητα του άσθματος, ωστόσο αυτές οι μελέτες είναι δύσκολο να ελεγχθούν, λόγω της πολυπλοκότητας της διατροφής. Μελέτες σε ασθενείς με άσθμα και

38 38 Όλγα Κ. Λάγιου παχυσαρκία συνιστούν την αποφυγή υπερβολικής αύξησης βάρους και την διατήρηση ενός τρόπου ζωής που να περιλαμβάνει ισορροπημένη διατροφή. Η αύξηση της παχυσαρκίας στον πληθυσμό παρατηρείται παράλληλα με την αύξηση του επιπολασμού του άσθματος, όμως, η σχέση τους είναι ασαφής (87). Η παχυσαρκία μπορεί να είναι παράγοντας κινδύνου για το άσθμα, λόγω της εμπλοκής προφλεγμονωδών παραγόντων. Άλλες μελέτες δείχνουν ότι τα συμπληρώματα με ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα μπορούν να μειώσουν τα συμπτώματα συριγμού, και αν συνδυαστούν και με άλλα προστατευτικά μέτρα, όπως η αποφυγή έκθεσης στην οικιακή σκόνη, μπορεί να μειώσουν την πιθανότητα ατοπικής ευαισθητοποίησης (88). Ωστόσο, καθώς οι μελέτες δεν είναι ξεκάθαρες, αυτή η στρατηγική δεν πρέπει γενικά να εφαρμόζεται. Άσκηση. Η άσκηση μπορεί να πυροδοτήσει ασθματικά συμπτώματα στην πλειοψηφία των παιδιών με άσθμα, και ο βρογχόσπασμος κατά την άσκηση μπορεί να αποτελεί ένα ξεχωριστό ασθματικό φαινότυπο (89). Ο μηχανισμός μπορεί να περιλαμβάνει αλλαγές στην ωσμωτικότητα των αεραγωγών λόγω της απώλειας νερού ή/και αλλαγές της θερμοκρασίας, τα οποία οδηγούν στη σύσπαση των λείων μυϊκών ινών και βρογχόσπασμο (90). Η τακτική αερόβια άσκηση είναι κρίσιμη για την υγιή ανάπτυξη και γι αυτό δεν θα πρέπει να αποφεύγεται. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι η φτωχή φυσική δραστηριότητα στη παιδική ηλικία συνδέεται με ανάπτυξη άσθματος στην νεαρή ενήλικο ζωή (91). Κατά συνέπεια, η φλεγμονή των αεραγωγών στο άσθμα θα πρέπει να διατηρείται υπό έλεγχο για να βελτιωθεί η αναπνοή και να επιτραπεί η συμμετοχή σε φυσική άσκηση. Ερεθιστικά. Ένας μεγάλος αριθμός ερεθιστικών παραγόντων έχει συσχετιστεί με συμπτώματα από το αναπνευστικό και με το άσθμα στα παιδιά, όπως τα αρώματα, η σκόνη και η χλωρίνη. Αυτοί οι εκλυτικοί παράγοντες μπορεί να έχουν ιδιαίτερη σημασία σε συγκεκριμένα μέρη (π.χ. πισίνες) (92). Ο μηχανισμός μπορεί να μην είναι ο ίδιος για όλους τους ερεθιστικούς παράγοντες και μπορεί να εμπλέκονται τόσο νευρικά, όσο και οξειδωτικά μονοπάτια. Είναι φρόνιμο να αποφεύγονται οι ερεθιστικοί παράγοντες. Το χλωριωμένο νερό μπορεί να αποτελεί έναν ερεθιστικό παράγοντα, ωστόσο αυτό μπορεί να αντιμετωπισθεί με ένα καλό σύστημα εξαερισμού και δεν πρέπει να αποτελεί για τα παιδιά λόγο αποφυγής της κολύμβησης. Καιρός. Οι διάφορες καιρικές συνθήκες, όπως η ακραία θερμοκρασία και τα υψηλά επίπεδα υγρασίας έχουν συσχετιστεί με την ενεργότητα του άσθματος, όπως οι παροξύνσεις. Καθώς είναι δύσκολο να αποφύγουμε τις καιρικές αλλαγές, οι γονείς θα πρέπει να γνωρίζουν τους πιθανούς εκλυτικούς παράγοντες και να τροποποιούν τη φαρμακευτική αγωγή.

39 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 39 Στρες. Ψυχολογικοί παράγοντες, ειδικά το χρόνιο στρες μπορεί να επηρεάσει την ενεργότητα του άσθματος, αν και τα ευρήματα απαιτούν περισσότερη μελέτη στα παιδιά. Ακόμα, η πνευμονική λειτουργία και η ενεργότητα του άσθματος μπορεί να επηρεαστεί από το στρες των γονιών (93). Το στρες μπορεί να προκαλέσει παρόξυνση του άσθματος και υπάρχει συσχέτιση μεταξύ άσθματος και ψυσικών διαταραχών. Η αποφυγή αναίτιου και περιττού άγχους ή/και η εκπαίδευση για τη διαχείρισή του μπορεί να είναι ευεργετικές. Ταυτόχρονοι εκλυτικοί παράγοντες. Η ταυτόχρονη ή επακόλουθη έκθεση σε διαφορετικούς εκλυτικούς παράγοντες παράγοντες μπορεί να έχει αθροιστικό ή ακόμα και συνεργικό ρόλο στα συμπτώματα και τις παροξύνσεις του άσθματος (94). Αν και στην πλειοψηφία των περιπτώσεων ένας συγκεκριμένος εκλυτικός παράγοντας είναι κυρίαρχος, αλληλεπιδράσεις πρέπει να αποφεύγονται καθώς μπορεί να επηρεάσουν το αποτέλεσμα. Εν κατακλείδι, οι γνώσεις μας για την παθογένεια του άσθματος και των υποκείμενων μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξή του περιλαμβάνουν την αλληλεπίδραση γονιδίων και περιβάλλοντος, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη και διατήρηση της φλεγμονής των αεραγωγών, ώστε να εμφανιστεί κλινικά το άσθμα. Φαινότυποι άσθματος Στο άσθμα, η ηλικία και οι εκλυτικοί παράγοντες μπορεί να χρησιμοποιηθούν για να ορίσουν τους διάφορους φαινότυπους της νόσου. Αυτοί οι φαινότυποι μπορεί να είναι χρήσιμοι καθώς αναγνωρίζουν την ετερογένεια του άσθματος στην παιδική ηλικία. Δεν αντιπροσωπεύουν ξεχωριστές νόσους, αλλά αποτελούν μέρος του άσθματος. Κατευθυντήριες οδηγίες που αναγνωρίζουν διαφορετικούς φαινότυπους δίνονται για την καλύτερη πρόγνωση και θεραπεία των ασθενών. Φαινότυποι με βάση την ηλικία Η ηλικία είναι ένας από τους πιο σημαντικούς παράγοντες καθορισμού των ασθματικών φαινοτύπων. Εξαιτίας των διαφορών στην εμφάνιση της νόσου μεταξύ των ηλικιακών ομάδων, είναι σημαντικό να σχεδιαστεί διαφορετική διαγνωστική και θεραπευτική στρατηγική βάσει της ηλικίας. Πρακτικές ηλικιακές ομαδοποιήσεις για το σκοπό αυτό είναι (29):

40 40 Όλγα Κ. Λάγιου Βρέφη (0-2 ετών) Παιδιά προσχολικής ηλικίας (3-5 ετών) Παιδιά σχολικής ηλικίας (6-12 ετών) Έφηβοι Βρέφη (0-2 ετών). Στα βρέφη, η επιμονή των συμπτωμάτων είναι κύριος δείκτης σοβαρότητας της νόσου. Επομένως, θα πρέπει να διαπιστωθεί εάν το παιδί εμφανίζει συριγμό τις περισσότερες ημέρες της εβδομάδας, τους τελευταίους 3 μήνες. Εάν ναι, αυτά τα παιδιά θα πρέπει να διαγνωστούν με επίμονο βρεφικό συριγμό, μετά από προσεκτικό αποκλεισμό άλλων καταστάσεων. Τα παιδιά με διαλείπουσα νόσο (υποτροπιάζοντα επεισόδια) μπορούν να θεωρηθούν πως έχουν σοβαρή ή ήπια νόσο, ανάλογα με την ανάγκη τους για ιατρική φροντίδα (συστηματικά στεροειδή και νοσηλεία). Παιδιά προσχολικής ηλικίας (3-5 ετών). Στα παιδιά προσχολικής ηλικίας, ο βασικός παράγοντας διαφοροποίησης του ασθματικού φαινότυπου είναι η επιμονή των συμπτωμάτων κατά το τελευταίο έτος. Εάν τα συμπτώματα εξαφανίζονται τελείως μεταξύ των επεισοδίων, και συνήθως ακολουθούν ένα κοινό κρυολόγημα, τότε το άσθμα που προκαλείται από ιώσεις είναι η πιο κατάλληλη διάγνωση. Οι ιώσεις είναι ο πιο συχνός εκλυτικός παράγοντας σε αυτή την ηλικία. Επιπλέον, το άσθμα κατά την άσκηση μπορεί να αποτελεί ένα ξεχωριστό φαινότυπο σε αυτή την ηλικία. Δερματικές δοκιμασίες ή in vitro test για την παρουσία συγκεκριμένων IgE αντισωμάτων μπορούν να πραγματοποιηθούν για να διαπιστωθεί εάν υπάρχει κλινική συσχέτιση μεταξύ έκθεσης και εμφάνισης των συμπτωμάτων. Εάν ναι, ο φαινότυπος είναι αλλεργικό άσθμα. Πρέπει να τονιστεί πως η ατοπία είναι ένας παράγοντας κινδύνου για επίμονο άσθμα ανεξάρτητα με το εάν τα αλλεργιογόνα είναι εμφανείς εκλυτικοί παράγοντες της ενεργότητας της νόσου. Εάν κανένας εκλυτικός παράγοντας της αλλεργίας δεν μπορεί να προσδιοριστεί, ο φαινότυπος χαρακτηρίζεται ως μη αλλεργικό άσθμα με κάποια προσοχή. Ωστόσο, αυτό σημαίνει πως κάποιος αλλεργικός εκλυτικός παράγοντας δεν έχει ακόμα ανευρεθεί. Παιδιά σχολικής ηλικίας (6-12 ετών). Οι διαφοροποιήσεις στα παιδιά σχολικής ηλικίας είναι οι ίδιες με αυτές στα παιδιά προσχολικής ηλικίας. Ωστόσο, οι περιπτώσεις που προκαλούνται από αλλεργιογόνα είναι πιο συχνές και διακριτές και η εποχικότητα των συμπτωμάτων μπορεί να είναι εμφανής. Το άσθμα που προκαλείται από ιώσεις είναι κοινό και σε αυτήν την ηλικιακή ομάδα. Η βαρύτητα των συμπτωμάτων είναι ένα σημαντικό ζήτημα στη θεραπεία του αλλεργικού άσθματος. Έφηβοι. Το ατοπικό άσθμα μπορεί να ξεκινήσει στην εφηβεία και υπάρχουν περισσότερες νέες περιπτώσεις απ ότι υφέσεις. Το μη ατοπικό

41 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 41 άσθμα μπορεί, επίσης, να ξεκινήσει στην εφηβεία (95). Υπάρχουν επιπλέον προβλήματα που σχετίζονται με τη διαχείριση και την κατηγοριοποίηση του άσθματος στους εφήβους. Πολλοί έφηβοι είναι απρόθυμοι να ακολουθήσουν την καθημερινή θεραπεία τους και δεν επιθυμούν να έχουν περιορισμούς στη ζωή τους. Ακόμη, το κάπνισμα μπορεί να αποτελεί ένα πρόβλημα. Επίσης, μπορεί να υπάρξει μια δύσκολη μεταβατική περίοδος, όταν οι ασθενείς σταματούν να παρακολουθούνται από παιδίατρο και απευθύνονται σε πνευμονολόγο ενηλίκων. Φαινότυποι συριγμού Επιδημιολογικά καθορισμένοι φαινότυποι Οι επιδημιολογικά καθορισμένοι φαινότυποι του συριγμού που έχουν μελετηθεί περισσότερο είναι εκείνοι που προτάθηκαν αρχικά από τη μελέτη της Tucson. Οι κύριες επιδημιολογικές παράμετροι που έχουν ελεγχθεί για τον καθορισμό τους είναι η ηλικία έναρξης των συμπτωμάτων, η επιμονή του συριγμού με την πρόοδο της ηλικίας, η συνοδός ύπαρξη ατοπίας, η αναπνευστική λειτουργία και η βρογχική υπεραπαντητικότητα. Η μελέτη αυτή επιβεβαίωσε ότι τα γεγονότα που επηρεάζουν τον πνεύμονα κατά τα πρώτα 6 χρόνια της ζωής παίζουν καθοριστικό ρόλο στη μετέπειτα εξέλιξη της πνευμονικής λειτουργίας. Ο συριγμός στους πρώτους μήνες της ζωής έχει μελετηθεί λιγότερο, πιθανόν λόγω της δυσκολίας αναγνώρισής του από τους γονείς, με συνέπεια τη συχνή υπερεκτίμηση του προβλήματος. Πολλά βρέφη που παρουσιάζουν θορυβώδη αναπνοή ή/και συριγμό στην ηλικία αυτή, δεν εμφανίζουν μετέπειτα συμπτώματα (96). Σε δύο συστηματικές ανασκοπήσεις (97) (98), διερευνήθηκε εάν τα βρέφη που νοσηλεύθηκαν με βρογχιολίτιδα από RSV θα εμφανίσουν συριγμό σε μεγαλύτερη ηλικία και βρέθηκε ότι σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό (40%) θα εκδηλώσει μεταβρογχιολιτιδικό συριγμό στην πρώτη πενταετία της ζωής σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (11%), ενώ η διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων παύει να είναι στατιστικά σημαντική κατά τη δεύτερη πενταετία της ζωής. Στην προσχολική ηλικία (1-6 ετών) ο καθορισμός των περισσότερο αποδεκτών επιδημιολογικών φαινοτύπων βασίσθηκε στην προοπτική μελέτη της Tucson (99). Στη μελέτη συμμετείχαν παιδιά που παρακολουθήθηκαν μέχρι τη νεαρή ενήλικο ζωή (100). Στην ηλικία των 6 ετών τα παιδιά υποβλήθηκαν σε δερματικές δοκιμασίες νυγμού για κοινά αεροαλλεργιογόνα.

42 42 Όλγα Κ. Λάγιου Επίσης, ελέγχθηκε η αναπνευστική λειτουργία κατά τους πρώτους μήνες της ζωής και στα 6 χρόνια. Βασικά κριτήρια για την κατηγοριοποίηση σε διαφορετικές ομάδες αποτέλεσαν η ηλικία έναρξης του συριγμού και η επιμονή των συμπτωμάτων. Μετά την επεξεργασία των αποτελεσμάτων της Tucson προέκυψαν οι 3 κλασσικοί, πλέον, φαινότυποι συριγμού των παιδιών προσχολικής ηλικίας: α) ο πρώιμος παροδικός, β) ο επίμονος και γ) ο όψιμος συριγμός. Αξίζει να τονισθεί ότι τα δεδομένα της μελέτης της Tucson ενισχύθηκαν από τη μελέτη ALSPAC (101). Αυτή πρότεινε έξι φαινότυπους: α) τον πρώιμο παροδικό συριγμό, β) τον πρώιμο παρατεταμένο συριγμό, γ) τον ενδιάμεσης έναρξης συριγμό, δ) τον όψιμης έναρξης συριγμό, ε) τον επίμονο συριγμό και τέλος στ) τον φαινότυπο με απουσία ή σπάνια εμφάνιση συριγμού. Θεωρείται ότι οι επιπλέον φαινότυποι που περιγράφονται στη μελέτη ALSPAC αποτελούν υποφαινότυπους εκείνων της μελέτης της Tucson. Πρώιμος παροδικός συριγμός Οι ασθενείς με πρώιμο παροδικό συριγμό εμφανίζουν συμπτώματα στα 3 πρώτα χρόνια της ζωής, αλλά όχι αργότερα. Τα παιδιά αυτά έχουν επηρεασμένη αναπνευστική λειτουργία λίγο μετά τη γέννηση και πριν από το πρώτο επεισόδιο συριγμού. Η πρώιμη έκπτωση στην αναπνευστική λειτουργία των παιδιών αυτών οφείλεται πιθανότατα σε αίτια που έχουν δράσει στον αναπτυσσόμενο πνεύμονα προγεννητικά. Το κάπνισμα της εγκύου είναι ένας προφανής αιτιολογικός παράγοντας (102). Επιπλέον, η ενδομήτρια έκθεση στον καπνό του τσιγάρου έχει επιγενετικές επιδράσεις, καθώς αυξάνεται ο κίνδυνος εμφάνισης άσθματος στον εγγονό που γεννήθηκε από μητέρα που υπέστη τη βλαπτική έκθεση ως έμβρυο, ακόμη και αν η μητέρα δεν έχει καπνίσει ποτέ. Επίσης, η ατοπία της μητέρας σχετίζεται με επηρεασμένη αναπνευστική λειτουργία κατά τη γέννηση. Η προεκλαμψία, ο σακχαρώδης διαβήτης κύησης, η λήψη αντιβιοτικής αγωγής από την έγκυο στα πλαίσια λοίμωξης αυξάνουν την πιθανότητα εμφάνισης συριγμού στο παιδί, πιθανόν λόγω αύξησης του στρες (103). Οι ασθενείς που ανήκουν στο φαινότυπο του πρώιμου συριγμού παρουσιάζουν ύφεση των συμπτωμάτων μετά την ηλικία των 3 ετών και δεν έχουν αυξημένη πιθανότητα ατοπίας σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Το οικογενειακό ιστορικό είναι αρνητικό για ατοπική νόσο. Σύνηθες εκλυτικό αίτιο των ασθματικών συμπτωμάτων αποτελούν οι ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού (101), ενώ η φλεγμονή των αεραγωγών είναι ουδετεροφιλική (104). Η πνευμονική λειτουργία, παρότι βελτιώνεται ως ένα βαθμό με την

43 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 43 αύξηση της ηλικίας, υπολείπεται της φυσιολογικής, ενώ η βρογχική απαντητικότητα δεν είναι αυξημένη (101). Επίμονος συριγμός Ο επίμονος συριγμός, που χαρακτηρίζεται από πρώιμη έναρξη (ήδη από τα πρώτα 3 χρόνια της ζωής) και παραμονή των συμπτωμάτων μετά τα 6 χρόνια, παρουσιάζει ισχυρή συσχέτιση με την ατοπία. Τα παιδιά παρουσιάζουν φυσιολογική αναπνευστική λειτουργία κατά την έναρξη των συμπτωμάτων και προοδευτική έκπτωσή της, έτσι ώστε στην ηλικία των 6 ετών αυτή να υπολείπεται σημαντικά σε σύγκριση με τα φυσιολογικά παιδιά (105). Η έκπτωση της αναπνευστικής λειτουργίας φαίνεται ότι είναι μεγαλύτερη στα ατοπικά παιδιά με αυξημένη έκθεση σε αεροαλλεργιογόνα, στα οποία αυτά έχουν ήδη ευαισθητοποιηθεί (71). Το χαμηλότερο επίπεδο αναπνευστικής λειτουργίας των παιδιών αυτών παραμένει χαμηλό και κατά την ενήλικο ζωή (100). Επίσης, η βρογχική απαντητικότητα στην ομάδα αυτή ανευρίσκεται αυξημένη (106). Όψιμος συριγμός Ο όψιμος συριγμός σχετίζεται με την ευαισθητοποίηση σε αεροαλλεργιογόνα και υπάρχει υψηλή πιθανότητα να διαγνωσθεί ως άσθμα στην ενήλικο ζωή. Παρουσιάζει μικρότερη έκπτωση της αναπνευστικής λειτουργίας σε σύγκριση με τον επίμονο συριγμό, όμως έχει αυξημένη πιθανότητα βρογχικής υπεραπαντητικότητας. Οι ασθενείς με όψιμο συριγμό έχουν συχνά θετικό οικογενειακό και ατομικό ιστορικό ατοπίας (τροφική αλλεργία, έκζεμα, αλλεργική ρινίτιδα) (99) (100). Τόσο ο επίμονος, όσο και ο όψιμος συριγμός έχουν χαρακτηριστικά επίμονου άσθματος σύμφωνα με τον ορισμό της GINA και θεωρείται ότι προκύπτουν από την αλληλεπίδραση γονιδιώματος, προγεννητικών συμβάντων και περιβαλλοντικών παραγόντων μετά τη γέννηση (101). Η υιοθέτηση των φαινοτύπων του συριγμού που ανέδειξαν οι μακροχρόνιες προοπτικές επιδημιολογικές μελέτες είχε ουσιαστική προσφορά στην κατανόηση των μηχανισμών του άσθματος και της απώτερης πρόγνωσης του συριγμού των μικρών ασθενών (99) (100) (107). Παρά τη σημαντική συμβολή των επιδημιολογικών κριτηρίων στην κατανόηση της παθογένειας του συριγμού στα παιδιά, αυτά δεν επαρκούν για την αντιμετώπισή του στην κλινική πράξη.

44 44 Όλγα Κ. Λάγιου Άλλες μορφές συριγμού Συριγμός υπέρβαρων κοριτσιών με πρώιμη ήβη Εκτός από τους επιδημιολογικά καθορισμένους φαινοτύπους συριγμού, όπως αυτοί προτάθηκαν από τη μελέτη της Tucson,, οι Castro-Rodriguez και συν. (108) διέκριναν ότι στη σειρά της Tucson τα κορίτσια που έγιναν υπέρβαρα σε ηλικία μεταξύ 6 και 11 ετών, ανεξάρτητα από τη φυσική τους δραστηριότητα και την ύπαρξη αλλεργίας, είχαν επταπλάσια πιθανότητα να εκδηλώσουν άσθμα από εκείνα που διατήρησαν φυσιολογικό βάρος. Η περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων αυτών έδειξε ότι η αύξηση του άσθματος αφορούσε μόνο στα κορίτσια που ενηβώθηκαν πριν από τα 11 χρόνια της ζωής. Σε άλλη ανάλυση του δείγματος της Tucson δείχθηκε ότι η παχυσαρκία, όπως και η πρώιμη έναρξη της εφηβείας, η ρινοπαραρρινοκολπίτιδα και η ευαισθητοποίηση σε αλλεργιογόνα, αποτελούσε ανεξάρτητο παράγοντα επιμονής του άσθματος και μετά την εφηβεία (109). Σε μια Γαλλική μελέτη, οι Varraso και συν. (110) βρήκαν μεγαλύτερη συσχέτιση μεταξύ παχυσαρκίας και άσθματος μεταξύ γυναικών με πρώιμη ήβη, επιβεβαιώνοντας έτσι τα ευρήματα της Tucson (111). Το εύρημα αυτό ενισχύθηκε περαιτέρω από μια Μεξικάνικη (112) και μια Ισπανική μελέτη (113). Επίσης, νεότερη ανασκόπηση επιβεβαιώνει ότι ούτε η αλλεργία, ούτε η βρογχική υπεραπαντητικότητα παίζουν κάποιο ρόλο στη συσχέτιση μεταξύ παχυσαρκίας και άσθματος (114). Συριγμός που καθορίζεται από τον εκλυτικό παράγοντα Η αναζήτηση ενός φαινοτυπικού μοντέλου που θα βοηθούσε στην αντιμετώπιση των ασθενών προσχολικής ηλικίας στην καθημερινή κλινική πράξη οδήγησε στη διάκριση δύο φαινότυπων με βάση το πρότυπο των εκλυτικών παραγόντων. Ο πρώτος είναι ο επεισοδιακός (ιογενής) συριγμός (episodic / viral wheeze) που αφορά σε παιδιά με διακριτά επεισόδια συριγμού, τα οποία εκλύονται από ιώσεις του αναπνευστικού συστήματος, χωρίς συμπτώματα στα μεσοδιαστήματα. Αντίθετα, ο δεύτερος φαινότυπος, δηλαδή ο συριγμός από πολλαπλούς εκλυτικούς παράγοντες (πολυπαραγοντικός συριγμός, multiple trigger wheeze), πυροδοτείται και από άλλα ερεθίσματα χωρίς να υπάρχει ή να έχει προηγηθεί ίωση του αναπνευστικού συστήματος. Οι δύο αυτοί φαινότυποι δεν αλληλοαποκλείονται, ενώ κάποιοι ασθενείς μεταπηδούν στην πορεία από τον ένα φαινότυπο στον άλλο (115) (116).

45 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 45 Διάγνωση Η διάγνωση του άσθματος μπορεί να μην είναι εύκολη υπόθεση. Αν και το άσθμα θεωρείται η πιο κοινή κατάσταση που παρουσιάζει συριγμό, αυτό δεν σημαίνει ότι όσα παιδιά έχουν συριγμό πάσχουν από άσθμα. Στη βρεφική ηλικία δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμένο διαγνωστικό εργαλείο ή δείκτης που να υποδεικνύει την ύπαρξη του άσθματος, ωστόσο η υποψία του άσθματος θα πρέπει να υπάρχει σε κάθε βρέφος με επαναλαμβανόμενα επεισόδια συριγμού και βήχα. Συνήθως, η διάγνωση του άσθματος γίνεται μέσω μακροχρόνιας παρακολούθησης του παιδιού, μέσω διαφοροδιαγνωστικής σκέψης και αποκλεισμού κι άλλων καταστάσεων και μέσω αξιολόγησης της ανταπόκρισης του παιδιού σε βρογχοδιασταλτική και αντιφλεγμονώδη θεραπεία. Οι άξονες για τη διάγνωση του άσθματος είναι: το ιστορικό, η αντικειμενική αξιολόγηση της βρογχικής απόφραξης και της αναστρεψιμότητάς της, η εκτίμηση της αλλεργίας και της βρογχικής υπεραπαντητικότητας και η εκτίμηση της φλεγμονής στους αεραγωγούς, όπου είναι πιθανό. Η λήψη ακτινογραφίας συνίσταται στην πρώτη επίσκεψη, τόσο για τη διάγνωση, όσο και τον αποκλεισμό άλλων καταστάσεων. Ιστορικό Η διάγνωση της ατοπίας μπορεί να είναι δύσκολη στα μικρά παιδιά (117). Το ατομικό ιστορικό θα πρέπει να επικεντρώνεται στη συχνότητα και τη βαρύτητα των συμπτωμάτων συμπεριλαμβανομένου του συριγμού, του νυκτερινού βήχα, των επαγόμενων από την άσκηση συμπτωμάτων, την επιμονή του βήχα στα επεισόδια κοινού κρυολογήματος (118), την ατοπική κληρονομικότητα και την έκθεση σε παράγοντες, όπως τα αλλεργιογόνα και ο καπνός του τσιγάρου. Το συμπτώματα θα πρέπει να εξετάζονται για τους τελευταίους 3-4 μήνες και πιο συγκεκριμένα για τις τελευταίες 2 εβδομάδες. Η ύπαρξη συριγμού θα πρέπει να έχει επιβεβαιωθεί από ιατρό, λόγω της παρερμηνείας των αναπνευστικών ήχων από τους γονείς (119). Για όλα τα παιδιά πρέπει να αναζητούνται τα εξής: Συριγμός, βήχας. Πιθανοί εκλυτικοί παράγοντες:

46 46 Όλγα Κ. Λάγιου o παθητικό κάπνισμα, κατοικίδια, υγρασία, μούχλα, αναπνευστικές λοιμώξεις, έκθεση σε κρύο αέρα, φυσική δραστηριότητα/ άσκηση, βήχας μετά το γέλιο/ κλάμα. Αλλαγές στο προφίλ του ύπνου: o αφυπνίσεις, νυχτερινός βήχας, άπνοια του ύπνου. Παροξύνσεις το τελευταίο χρόνο. Ρινικά συμπτώματα: o ρινική συμφόρηση, καταρροή, φαγούρα, φτέρνισμα. Σε βρέφη (< 2 ετών), ρωτάμε για: Θορυβώδη αναπνοή, εμετό που προκαλείται από το βήχα. Εισολκές μεσοπλευρίων. Δυσκολία στη σίτιση (δυσκολία στο θηλασμό, ήχος γρυλίσματος). Αλλαγές του αναπνευστικού ρυθμού. Σε παιδιά >2 ετών, ρωτάμε για: Δύσπνοια (κατά τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας). Εξάντληση (μειωμένη δραστηριότητα και ενασχόληση με παιχνίδια σε σχέση με συνομήλικους, αυξημένη ευερεθιστότητα). Παράπονα για αδιαθεσία. Φτωχή σχολική απόδοση και απουσίες από το σχολείο. Μειωμένη συχνότητα ή ένταση φυσικής δραστηριότητας π.χ σε αθλήματα, σε μαθήματα γυμναστικής. Αποφυγή άλλων δραστηριοτήτων (π.χ διανυκτέρευση εκτός σπιτιού, σε σπίτια φίλων ή επίσκεψη σε σπίτια φίλων με κατοικίδια ζώα). Συγκεκριμένοι εκλυτικοί παράγοντες: αθλήματα, μαθήματα γυμναστικής, φυσική δραστηριότητα/άσκηση. Στους εφήβους πρέπει να εξετάζεται εάν καπνίζουν. Φυσική Εξέταση Μία ολοκληρωμένη φυσική εξέταση θα πρέπει να περιλαμβάνει το ανώτερο αναπνευστικό σύστημα, το θώρακα και το δέρμα. Ευρήματα που συνηγορούν υπέρ άσθματος είναι: Η υπερδιάταση του θωρακικού κλωβού, η χρήση επικουρικών μυών, η παρουσία κυρτότητας των ώμων και η δυσμορφία του θώρακα. Ο συριγμός στην ήρεμη αναπνοή ή η παράταση εκπνοής.

47 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 47 Σε περιπτώσεις που υπάρχουν ρινικοί πολύποδες, η κυστική ίνωση θα πρέπει να διερευνάται. Τα κλινικά συμπτώματα που θα μας καθοδηγήσουν για την ανίχνευση αλλεργικού φαινοτύπου είναι: Ατοπικό έκζεμα ή δερματίτιδα. Ξηρό δέρμα. Μαύροι κύκλοι κάτω από τα μάτια (allergic shiners). Ερεθισμένος επιπεφυκότας. Επίμονο οίδημα του ρινικού βλεννογόνου, ρινική καταρροή, αλλεργική πτυχή της μύτης (εγκάρσια πτυχή στη μύτη). Λειτουργικός έλεγχος του αναπνευστικού Ο λειτουργικός έλεγχος του αναπνευστικού εκτιμά τη βαρύτητα του περιορισμού της ροής του αέρα, την παρουσία αναστρεψιμότητας και μεταβλητότητας, και ως εκ τούτου συμβάλει στην επιβεβαίωση της διάγνωσης του άσθματος. Η σπιρομέτρηση είναι η συνιστώμενη μέθοδος μέτρησης του περιορισμού της ροής του αέρα και της αναστρεψιμότητας. Μια χρήσιμη εκτίμηση του περιορισμού της ροής αέρα είναι ο λόγος του FEV1 (Forced Exhaled Volume in first sec / βίαια εκπνεόμενος όγκος αέρα στο πρώτο δευτερόλεπτο) προς FVC (Forced Vital Capacity) < 0,80. Ο βαθμός της αναστρεψιμότητας της FEV1 που είναι συμβατός με τη διάγνωση άσθματος είναι 12% ή > 200 ml αύξηση σε σχέση με την τιμή προ της βρογχοδιαστολής 10 λεπτά μετά την εισπνοή 400 μg σαλβουταμόλης. Ωστόσο, η εξέταση αυτή έχει μειωμένη ευαισθησία, καθώς υπάρχουν ασθενείς με άσθμα που δεν εμφανίζουν θετική δοκιμασία βρογχοδιαστολής, όπως για παράδειγμα ασθενείς με άσθμα υπό αγωγή και μπορεί να απαιτηθεί επανάληψη της εξέτασης μέχρι να καταστεί εμφανής (120). Εκτίμησης της αλλεργίας IgE-μεσολαβούμενη αλλεργία Η αλλεργική ευαισθητοποίηση είναι ο κύριος παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη του άσθματος, την επιμονή και τη βαρύτητά του (71) (108). Επιπλέον, η παρουσία ατοπικής δερματίτιδας ή/και τροφικής αλλεργίας με αυξημένη IgE αυξάνει τον κίνδυνο ευαισθητοποίησης σε εισπνεόμενα αλλεργιογόνα και μπορεί να προδιαθέτει την ανάπτυξη άσθματος. Επομένως, στη διαγνωστική εκτίμηση θα πρέπει να περιλαμβάνονται η μέτρηση των ηωσινόφιλων στο περιφερικό αίμα, αλλά και τα αλλεργικά τεστ (121). Η

48 48 Όλγα Κ. Λάγιου διάγνωση της αλλεργίας βασίζεται στην αξιολόγηση των συμπτωμάτων, στο ιστορικό και στα in vivo και in vitro τεστ. In vivo δοκιμασία για την εκτίμηση της αλλεργίας. Η δοκιμασία νυγμού (skin prick test) είναι μία απλή, φθηνή και γρήγορη μέθοδος (122). Χρησιμοποιούνται τυποποιημένες μέθοδοι και δείγματα αλλεργιογόνων, ενώ ο πίνακας των αλλεργιογόνων που εξετάζεται εξαρτάται από την ηλικία, το ιστορικό και το περιβάλλον του κάθε παιδιού. Δεν υπάρχει κατώτερο όριο ηλικίας για την πραγματοποίηση της δοκιμασίας νυγμού (123). Σε παιδιά υψηλού κινδύνου με συριγμό, η δοκιμασία νυγμού αναδεικνύει την υψηλή ευαισθητοποίηση σε τροφές και εισπνεόμενα αλλεργιογόνα, τα οποία είναι ένας σημαντικός παράγοντας ανάπτυξης άσθματος. Ωστόσο, αν και μία θετική απάντηση της δοκιμασίας σε κάποιο οικιακό αλλεργιογόνο σχετίζεται σημαντικά με το άσθμα, μία αρνητική απάντηση δεν αποκλείει τη διάγνωση του άσθματος (65). Καθώς ευαισθητοποίηση σε κάποιο αλλεργιογόνο μπορεί να συμβεί και κατά τη διάρκεια της εφηβείας, τα αλλεργικά τεστ θα πρέπει να επαναλαμβάνονται ετησίως σε παιδιά που εμφανίζουν συριγμό και έχουν αρνητική απάντηση σε προηγούμενο αλλεργικό τεστ, αλλά παραμένουν συμπτωματικά (95). Στη βρεφική και στην πρώιμη παιδική ηλικία, το μέγεθος του πομφού στη δοκιμασία νυγμού εξαρτάται από την ηλικία (124). In vitro δοκιμασία για την εκτίμηση της αλλεργίας. Η in-vitro δοκιμασία για την ανίχνευση ειδικής για αλλεργιογόνο IgE μπορεί να είναι χρήσιμη εάν η δοκιμασία νυγμού δεν μπορεί να εφαρμοστεί λόγω σοβαρής ατοπικής δερματίτιδας/εκζέματος, εάν είναι αδύνατο να διακοπεί η θεραπεία με αντιϊσταμινικά, ή εάν υπάρχει πιθανότητα εμφάνισης επικίνδυνης για τη ζωή αντίδρασης σε φαγητό ή αεριοαλλεργιογόνο. Η μέτρηση της ειδικής IgE στον ορό του αίματος δεν προσφέρει ακριβέστερα αποτελέσματα από τη δοκιμασία νυγμού. Η in-vitro δοκιμασία θα πρέπει να πραγματοποιείται με αξιόπιστες εργαστηριακές μεθόδους, όπως η ImmunoCAP (Phadia AB, Uppsala, Sweden), θα πρέπει να λαμβάνει υπόψη το ιστορικό του ασθενούς και θα πρέπει να χρησιμοποιείται για ενδείξεις για τις οποίες επιλέγεται και η δοκιμασία νυγμού (121). Ο πίνακας για τη μέτρηση IgE, με τον οποίον εξετάζεται ταυτόχρονα μία πληθώρα κοινών αλλεργιογόνων, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση της ευαισθητοποίησης κατά τον προσδιορισμό του ασθματικού φαινοτύπου. Έχει φανεί ότι οι δοκιμασίες αυτές εμφανίζουν υψηλή αρνητική προγνωστική αξία στον αποκλεισμό της αλλεργικής ευαισθητοποίησης μεταξύ των ασθματικών παιδιών (125).

49 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 49 Μέτρηση βρογχικής υπεραπαντητικότητας Η βρογχική υπεραπαντητικότητα (ΒΥΑ) αντιπροσωπεύει την ανώμαλη αντίδραση των αεραγωγών σε διάφορα ερεθίσματα με αποτέλεσμα τον βρογχόσπασμο. Η αξιολόγησή της γίνεται με χορήγηση σε προοδευτικά αυξανόμενες δόσεις μιας ερεθιστικής ουσίας μέχρι τη μεταβολή ενός επιλεγμένου δείκτη της διαμέτρου των αεραγωγών κατά ένα συγκεκριμένο ποσοστό. Η ΒΥΑ είναι ένα από τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα που μπορούν να υποστηρίξουν τη διάγνωση του άσθματος, ιδίως σε περιπτώσεις στις οποίες το άσθμα είναι μια σοβαρή πιθανότητα, αλλά η σπιρομέτρηση που έγινε πριν και μετά βρογχοδιαστολή δεν επιβεβαίωσε τη διάγνωση. Ωστόσο, μπορεί να μεταβάλλεται με την πάροδο του χρόνου, συχνά αυξάνεται κατά τη διάρκεια των παροξυσμών και μειώνεται κατά τη διάρκεια της θεραπείας με αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Οι άμεσες προκλήσεις προκαλούν περιορισμό της ροής μέσω άμεσης δράσης στις λείες μυϊκές ίνες των αεραγωγών. Οι έμμεσες προκλήσεις επάγουν περιορισμό της ροής του αέρα μέσω δράσης σε κύτταρα, εκτός των λείων μυϊκών κυττάρων, τα οποία κατά την πρόκληση απελευθερώνουν μεσολαβητές που προκαλούν σύσπαση των λείων μυών. Η μεταχολίνη και η ισταμίνη είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες ουσίες για άμεσες προκλήσεις, χορηγούμενες μέσω νεφελοποιητή ή δοσιμέτρου σε διπλασιαζόμενες συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η συγκέντρωση ή δόση που προκαλεί μια πτώση στην FEV1 κατά 20% (PC20 και PD20 αντίστοιχα). Μια PC20 8mg/ml ή PD20 800μg είναι χαρακτηριστικό του άσθματος με αυξημένη ευαισθησία, αλλά περιορισμένη ειδικότητα. Αυτό σημαίνει ότι μια αρνητική δοκιμασία μπορεί να είναι χρήσιμη για να αποκλειστεί η διάγνωση του άσθματος, ειδικά σε άτομα που δεν παίρνουν στεροειδή, ενώ ένα θετικό τεστ δεν σημαίνει πάντα ότι ο ασθενής έχει άσθμα, καθόσον η ΒΥΑ έχει περιγραφεί και σε ασθενείς με άλλες παθήσεις όπως για παράδειγμα: αλλεργική ρινίτιδα, Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια, βρογχεκτασίες ή κυστική ίνωση. Οι έμμεσες προκλήσεις εκτελούνται χρησιμοποιώντας φυσικά ερεθίσματα (άσκηση, υπέρτονο απεσταγμένο νερό, μαννιτόλη, εθελοντικό ισοκαπνικό υπεραερισμό ξηρού αέρα) ή φαρμακολογικά ερεθίσματα (αδενοσίνη, ασπιρίνη, αλλεργιογόνο). Η άσκηση προκαλεί στένωση των αεραγωγών λόγω απώλειας νερού με εξάτμιση από την επιφάνεια των αεραγωγών διεγείροντας την απελευθέρωση μεσολαβητών. Στο πρωτόκολλο της άσκησης χρησιμοποιείται διάδρομος ή εργομετρικό ποδήλατο μέχρι η καρδιακή συχνότητα να φθάσει το % της προβλεπόμενης μέγιστης τιμής.

50 50 Όλγα Κ. Λάγιου Ο μεγαλύτερος FEV1 μετριέται πριν και σε 5, 10, 15 και 30 λεπτά μετά την άσκηση. Με πτώση στον FEV1 10% η δοκιμασία θεωρείται θετική. Εκτίμηση της φλεγμονής στους αεραγωγούς Η ηωσινοφιλική φλεγμονή των αεραγωγών είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του άσθματος και μπορεί να αξιολογηθεί μη επεμβατικά χρησιμοποιώντας το ποσοστό των ηωσινόφιλων στα προκλητά πτύελα ή τη μέτρηση της συγκέντρωσης του μονοξειδίου του αζώτου στον εκπνεόμενο αέρα (FeNΟ). Ωστόσο, τα προκλητά πτύελα είναι μια χρονοβόρα διαδικασία και δεν συνιστάται από τις διεθνείς οδηγίες. Αντίθετα, σε ασθματικούς ασθενείς βρέθηκαν υψηλά επίπεδα FeNΟ στον εκπνεόμενο αέρα και αυτό οδήγησε γρήγορα στην αξιολόγηση του FeNΟ ως πιθανή μη επεμβατική μέθοδο για τη διάγνωση του άσθματος και για την παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία με εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή (126). Η προγνωστική αξία του FeNΟ είναι υψηλότερη από τις συμβατικές μεθόδους, όπως η μέγιστη ροή και η σπιρομέτρηση και παρόμοια με αυτή που σχετίζεται με δοκιμασίες βρογχικής πρόκλησης (127). Θεραπεία Καθώς το άσθμα είναι μία χρόνια νόσος, η αντιμετώπισή του απαιτεί τη συνεργασία ανάμεσα στον ασθενή και τον ιατρό, ο οποίος πρέπει να έχει ενημερώσει τον ασθενή για τη σωστή αντιμετώπιση των συμπτωμάτων και να τον έχει πείσει για την ανάγκη του επαρκούς ελέγχου της νόσου, ώστε να μην υπάρχουν παροξύνσεις. Η εκπαίδευση του ασθενούς είναι απαραίτητη (128) (2). Φαρμακευτική θεραπεία Ο στόχος της φαρμακευτικής θεραπείας στο άσθμα είναι να επιτυγχάνεται επαρκής έλεγχος των ημερήσιων συμπτωμάτων του άσθματος και να προλαμβάνονται οι παροξύνσεις (Πίνακας 1). Η επιλογή της θεραπείας εξαρτάται από το επίπεδο ελέγχου που επιτυγχάνεται, ενώ πρέπει διαρκώς να γίνεται αξιολόγηση των συμπτωμάτων, ώστε να γίνονται οι τροποποιήσεις στη θεραπεία. Συνήθως, οι τροποποιήσεις γίνονται ανά 3 μήνες, εφόσον δεν υπάρχει επιδείνωση των συμπτωμάτων του ασθενούς. Στόχος της θεραπείας

51 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 51 είναι να μην έχει ο ασθενής περιορισμό στις ημερήσιες δραστηριότητες, αλλά ούτε και κατά τον ύπνο, με όσο το δυνατόν λιγότερα φάρμακα (129). Πίνακας 1. Επίπεδο ελέγχου του άσθματος. Χαρακτηριστικό Ελεγχόμενο Μερικώς ελεγχόμενο Ημερήσια συμπτώματα Περιορισμός δραστηριοτήτων Βραδινά συμπτώματα/ αφυπνίσεις Ανάγκη για χρήση ανακουφιστικής θεραπείας Πνευμονική λειτουργία Καθόλου (ή < 2 φορές την εβδομάδα) Καθόλου Καθόλου Καθόλου (ή < 2 φορές την εβδομάδα) Φυσιολογική > 2 φορές την εβδομάδα Οποιαδήποτε Οποιαδήποτε > 2 φορές την εβδομάδα < 80% του προβλεπόμενου Μη ελεγχόμενο 3 ή περισσότερο στοιχεία του μερικώς ελεγχόμενου κάθε εβδομάδα Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του άσθματος χωρίζονται σε φάρμακα ρυθμιστές της φλεγμονής (controllers) και σε ανακουφιστικά φάρμακα (relievers). Συνήθως, τα φάρμακα είναι εισπνεόμενα, καθώς έτσι επιτυγχάνεται το μέγιστο θεραπευτικό αποτέλεσμα με τις λιγότερες δυνατές ανυπιθύμητες ενέργειες (Εικόνα 7) (Πίνακας 2). Στα φάρμακα ρυθμιστές ανήκουν τα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή, τα οποία χορηγούνται μόνα τους ή σε συνδυασμό με β2-αγωνιστές μακράς δράσης (Long-Acting β2-αgonists - LABA) (Πίνακας 3). Στο άσθμα οι β2- αγωνιστές μακράς δράσης πρέπει να χορηγούνται μόνο συμπληρωματικά μαζί με εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή, και πρέπει να αφαιρούνται από την αγωγή όταν έχει επιτευχθεί έλεγχος των συμπτωμάτων. Εφόσον με τα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή και τους β2-αγωνιστές μακράς δράσης δεν υπάρχει έλεγχος των συμπτωμάτων του άσθματος, τότε πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο προσθήκης επιπλέον φαρμάκου. Σε αυτά ανήκουν οι ανταγωνιστές των υποδοχέων λευκοτριενίων, η θεοφυλλίνη, τα συστηματικά κορτικοστεροειδή και τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της ανοσοσφαιρίνης Ε (anti-ige) και της ιντερλευκίνης-5 (anti-il-5).

52 52 Όλγα Κ. Λάγιου Ανταπόκριση Συμπτώματα Παροξύνσεις Ανεπιθύμητες ενέργειες Ποιότητα ζωής Πνευμονική λειτουργία Εκτίμηση Διάγνωση Παράγοντες κινδύνου Επιλογή θεραπείας Προσαρμογή θεραπείας Φαρμακευτική αγωγή Μη-φαρμακευτικά μέτρα Τροποποίηση παραγόντων κινδύνου Εικόνα 7. Θεραπεία του άσθματος βάσει του επιπέδου του ελέγχου. Πίνακας 2. Επιλογή θεραπείας ανάλογα με το επίπεδο ελέγχου. (ICS: Inhaled Corticosteroid / Εισπνεόμενο κορτικοστεροειδές, LTRA: Leukotriene Receptor Antagonist / Ανταγωνιστής υποδοχέων λευκοτριενίων, LABA: Long-Acting β2-αgonists / β2-αγωνιστές μακράς δράσης, SABA: Short-Acting β2-agonists / β2-αγωνιστές βραχείας δράσης) Βήμα 1 Βήμα 2 Βήμα 3 Βήμα 4 Βήμα 5 Προτιμώμενη επιλογή Εναλλακτική επιλογή Ανακουφιστική θεραπεία - Χαμηλή δόση ICS Χαμηλή δόση ICS LTRA, χαμηλή δόση θεοφυλλίνης Χαμηλή δόση ICS/LABA Μέτρια/υψηλή δόση ICS ή χαμηλή δόση ICS + LTRA (ή/και θεοφυλλίνη) Μέτρια/ υψηλή δόση ICS/ LABA Τιοτρόπιο ή υψηλή δόση ICS + LTRA Προσθήκη αγωγής με τιοτρόπιο ή anti- IgE ή anti-il-5 Κορτικοστεροειδή από το στόμα Κατ επίληση SABA Κατ επίληση SABA ή χαμηλή δόση ICS/φορμοτερόλη

53 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 53 Πίνακας 3. Εισπνεόμενα ανά κατηγορία που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του άσθματος. ICS LABA SABA LAMA Μπεκλομεθαζόνη Φορμοτερόλη Σαλβουταμόλη Τιοτρόπιο Βουδεσονίδη Σαλμετερόλη Σικλεσονίδη Βιλαντερόλη Φλουτικαζόνη Μομεταζόνη Τριαμσινολόνη Στα ανακουφιστικά φάρμακα ανήκουν οι β2-αγωνιστές βραχείας δράσης (Short-Acting β2-agonists - SABA), τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατ επίκληση για την ανακούφιση των συμπτωμάτων. Ο ασθενής που έχει επιτύχει επαρκή έλεγχο του άσθματος τυπικά δε χρειάζεται καθόλου να χρησιμοποιήσει ανακουφιστική αγωγή (130). Σύμφωνα με τη GINA (Global Intitiative for Asthma), η φαρμακευτική αγωγή που δίνεται στα παιδιά, όπως και η δόση αυτών, εξαρτάται από τον έλεγχο των συμπτωμάτων, το επίπεδο της αναπνευστικής λειτουργίας, καθώς και την ηλικία του παιδιού. Σε γενικές γραμμές, η καθημερινή χρήση εισπνεόμενων κορτικοστεροειδών με ή χωρίς β-αγωνιστές μακράς-δράσης, συνοδευόμενη από ανταγωνιστές των λευκοτριενικών υποδοχέων είναι η ενδεικνυόμενη θεραπεία για τη μακροχρόνια αντιμετώπιση του άσθματος (2).

54 54 Όλγα Κ. Λάγιου Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισμός (NMR) Εισαγωγή Ο πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (Nuclear Magnetic Reasonance - NMR) είναι μία μορφή φασματοσκοπίας απορρόφησης, όπου κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες, το δείγμα απορροφά ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε συχνότητες χαρακτηριστικές για αυτό. Η απορρόφηση αυτή συναρτάται με τον παρατηρούμενο πυρήνα. Το φάσμα του NMR είναι το διάγραμμα των κορυφών απορρόφησης σε σχέση με τη συχνότητα (131). Η φασματοσκοπία NMR έχει εξελιχθεί σε μία σημαντική τεχνική στην μελέτη της τρισδιάστατης δομής βιο-μακρομορίων, στην αλληλεπίδραση μεταξύ τους, καθώς και στην αναγνώριση και τον σχεδιασμό, μέσω της δομής, νέων βιοδραστικών ενώσεων. Η μέθοδος του NMR έχει βρει έως σήμερα πολλές εφαρμογές σε διάφορους επιστημονικούς τομείς, όπως: Ταυτοποίηση και διαμόρφωση ανόργανων συμπλόκων, καθώς και οργανικών ουσιών. Μελέτη ζεολίθων, πολυμερών, υάλων και κεραμικών. Μελέτη αλληλεπίδρασης φαρμακευτικών ουσιών και των θέσεων δράσης τους. Μελέτη τροφίμων και ποτών. Μελέτη βιολογικών μηχανισμών. Ανάλυση μορίων προτύπων και συμβολή στη σύνθεση μορίων με φαρμακευτική δράση. Ορισμός Η φασματοσκοπία NMR ανακαλύφθηκε το 1946 από τους επιστήμονες Felix Bloch, Edward Purcell και τους συνεργάτες τους. Η πρώτη λέξη της μεθόδου είναι Πυρηνικός, γιατί βασίζεται στην ανίχνευση πυρήνων με αυτοστροφορμή. Σε ένα μαγνητικό πεδίο, πυρήνες με περιττό μαζικό αριθμό, όπως 1 13 H, C και 15 N, διαθέτουν μία φυσική ιδιότητα γνωστή ως μαγνήτιση και υιοθετούν καταστάσεις πυρηνικών spin διαφορετικού προσανατολισμού και διαφορετικής ενέργειας, των οποίων ο πληθυσμός διαταράσσεται με εφαρμογή ραδιοσυχνότητας. Οι μαγνητικοί πυρήνες επηρεάζονται από το εφαρμοσμένο πεδίο και επηρεάζουν ο ένας τον άλλον είτε μέσω χημικών δεσμών (spin-spin coupling) είτε λόγω της εγγύτητας τους στο χώρο (dipoledipole coupling). Αξιοποιώντας τα παραπάνω είναι δυνατή η αποτίμηση των

55 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 55 σημάτων συντονισμού του συγκεκριμένου πυρήνα, των σημάτων συντονισμού που προέρχονται από την συσχέτιση των πυρήνων μέσα σε ένα βιολογικό μόριο καθώς και η εξαγωγή δομικών πληροφοριών (διατομικές αποστάσεις, δίεδρες γωνίες, δεσμοί υδρογόνου, κ.λ.π.). Πυρήνες με άρτιο ατομικό και μαζικό αριθμό, όπως C 6, O 8 και Fe 28 δεν μπορούν να ανιχνευθούν με τη μέθοδο του μαγνητικού πυρηνικού συντονισμού, γιατί στερούνται αυτοστροφορμής (132). Η λήψη των φασμάτων του NMR γίνεται μετά από εφαρμογή μαγνητικού πεδίου, γι αυτό και η λέξη Μαγνητικός στον όρο. Ο φασματογράφος αποτελείται από έναν σωληνοειδή μαγνήτη, ο οποίος περιέχει ένα υπεραγώγιμο υλικό. Από την ένταση του μαγνητικού πεδίου εξαρτάται και η διακριτική ικανότητα της διάταξης. Κάποια πηνία μέσα στο μαγνήτη έχουν στόχο την ομογενοποίηση του πεδίου. Η ομοιογένεια και η σταθερότητα του πεδίου είναι απαραίτητα στοιχεία για την επιτυχή λήψη του φάσματος. Αυτή εξετάζεται με την εκπομπή και λήψη μιας δεδομένης συχνότητας αναφοράς (δευτέριο). Στο κέντρο του συστήματος τοποθετείται ο αισθητήρας (probe). Αυτός περιλαμβάνει τον απαραίτητο εξοπλισμό για την εκπομπή υψίσυχνων παλμών προς το δείγμα, ώστε να διεγερθούν οι παρατηρούμενοι πυρήνες και να γίνει στη συνέχεια η λήψη της κυματομορφής αποδιέγερσης. Η παλμοσειρά περιλαμβάνει το πιθανό εύρος των συχνοτήτων που απαιτούνται για τη διέγερση όλων των πυρήνων του παρατηρούμενου στοιχείου. Έτσι, έχουμε το Συντονισμό των πυρήνων, επομένως εξηγείται και η τελευταία λέξη. Η αποδιέγερση των πυρήνων επάγει ρεύμα - σήμα στο πηνίο, το οποίο ενισχύεται και καταλήγει στο δέκτη, όπου και αποδιαμορφώνεται. Στη συνέχεια εφαρμόζεται μαθηματική επεξεργασία με το μετασχηματισμό Fourier και λαμβάνεται στο πεδίο συχνοτήτων το φασματικό περιεχόμενο του συστήματος που εξετάζεται. Τέλος, γίνεται βελτίωση του ληφθέντος φάσματος, οπότε και η ολοκλήρωση των κορυφών μας δίνει πληροφορίες για τον αριθμό πρωτονίων της εξεταζόμενης ένωσης σε φάσματα πρωτονίων (133). Η παρασκευή των δειγμάτων γίνεται με διάλυσή τους σε δευτεριωμένο διαλύτη. Το διαλυμένο δείγμα μεταφέρεται σε σωληνίσκο κατάλληλης διαμέτρου, τα δείγματα εισάγονται στον αισθητήρα, όπου και περιστρέφονται με χρήση ξηρού αέρα. Ανάλυση δομής μορίων Για την ανάλυση της διαμόρφωσης ενός μορίου ακολουθούνται τα εξής βήματα. Αρχικά γίνεται ταυτοποίηση του μελετούμενου μορίου μέσω

56 56 Όλγα Κ. Λάγιου μονοδιάστατων φασμάτων 1 H και 13 C. Εάν η ταυτοποίηση δεν είναι πλήρης, τότε χρησιμοποιούνται πειράματα δισδιάστατα συσχετισμού χημικών μετατοπίσεων (COSY, HC-COSY, NOESY). Οι παράμετροι που χρησιμοποιούνται για την εύρεση της ευνοϊκής διαμόρφωσης του μορίου είναι οι σταθερές σύζευξης (J couplings) και οι συζεύξεις στο χώρο (NOE). Οι σταθερές σύζευξης μετρώνται με πειράματα δύο διαστάσεων E.COSY και DQF-COSY, ενώ οι συζεύξεις στο χώρο με πειράματα NOESY (ROESY). Με την πρόοδο της φασματοσκοπίας NMR μπορούν να πραγματοποιηθούν πειράματα για τον προσδιορισμό χημικών μορίων σε περιβάλλον που είναι παρόμοιο με το πραγματικό (133). Θεωρία πειράματος με χρήση ενός παλμού Πριν από την εισαγωγή του δείγματος στο μαγνητικό πεδίο B 0, οι πυρήνες έχουν τυχαίους προσανατολισμούς και το προς μελέτη δείγμα δεν έχει μαγνήτιση. Η εισαγωγή του δείγματος μέσα στο μαγνητικό πεδίο B 0 προσανατολίζει όλους τους πυρήνες σε σχέση με την ένταση B 0. Το πρωτόνιο λόγω κβαντικών περιορισμών μπορεί να πάρει δύο προσανατολισμούς, είτε να ευθυγραμμιστεί με την ένταση B 0 (χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση) είτε να έχει αντίθετη φορά από την ένταση του μαγνητικού πεδίου (υψηλότερη ενεργειακή κατάσταση) (Εικόνα 8) (133) (134). Μεταβάσεις μεταξύ των δύο καταστάσεων γίνονται με απορρόφηση ή εκπομπή κβαντικής ενέργειας από ένα ηλεκτρομαγνητικό πεδίο ισοδύναμης με την ενεργειακή διαφορά των δύο καταστάσεων (συχνότητα Larmor). Τότε ο πυρήνας και η ακτινοβολία της πηγής συντονίζονται (πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός) (135). ΑΠΟΥΣΙΑ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΠΕΔΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΠΕΔΙΟΥ B 0 Εικόνα 8. Προσανατολισμοί των ιδιοπεριστροφών πρωτονίων απουσία και παρουσία μαγνητικού πεδίου. Όταν δεν υπάρχει μαγνητικό πεδίο, οι ιδιοπεριστροφές προσανατολίζονται τυχαία, ενώ όταν υπάρχει μαγνητικό πεδίο οι ιδιοπεριστροφές προσανατολίζονται είτε παράλληλα είτε αντιπαράλληλα προς το πεδίο.

57 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 57 Αυτός ο προσανατολισμός ονομάζεται μαγνήτιση και συμβολίζεται με ένα άνυσμα M, που συμπίπτει με τον άξονα και την ένταση B 0, αφού οι μαγνητίσεις στο επίπεδο ΧΨ αλληλοεξουδετερώνονται (Εικόνα 9). z z B 0 y B 0 M 0 y x x Εικόνα 9. Συνολική μαγνήτιση στους άξονες Ζ και στο επίπεδο ΧΨ. Το πηνίο ραδιοσυχνοτήτων συμβατικά τοποθετείται στον άξονα των X σε ένα εργαστηριακό πλαίσιο αναφοράς, όπως στην Εικόνα 9. Το ηλεκτρομαγνητικό πεδίο που δημιουργείται από παλμικές ραδιοσυχνότητες ταλαντώνεται γύρω από τον άξονα των Χ με συχνότητες ±ω 0. Μόνο η συχνότητα ω 0 (Β 1 ) επιδρά στις πυρηνικές ιδιοπεριστροφές (Εικόνα 10). Κατά την ακτινοβόληση του δείγματος με ισχυρή ραδιοσυχνότητα όλοι οι μαγνητικοί πυρήνες διεγείρονται και αλλάζουν προσανατολισμό. Η ακτινοβόληση γίνεται με τη χρήση ενός παλμού που παράγεται με το άνοιγμα-κλείσιμο μιας συγκεκριμένης συχνότητας ν πολύ γρήγορα. z B 0 +ω 0 x B 1 ω 0 y ΠΕΔΙΟ RF ΠΗΝΙΟ RF Εικόνα 10. Ραδιοσυχνότητες που εφαρμόζονται στο πλαίσιο αναφοράς.

58 58 Όλγα Κ. Λάγιου Τότε λαμβάνεται ένα πλήθος συχνοτήτων γύρω από τη ν 0 με πλάτος περίπου 1 t. Το δείγμα, δηλαδή, ακτινοβολείται συγχρόνως με συχνότητες του εύρους ν ± 1 t. Με την κατάλληλη επιλογή χρόνου είναι δυνατόν να επιτευχθεί η ταυτόχρονη διέγερση όλων των πυρήνων. Τότε η αρχική μαγνήτιση (Μ 0 ) διαταράσσεται και υπάρχει νέα μαγνήτιση που σχηματίζει γωνία με τον άξονα z και η οποία μεταπίπτει ανάλογα με το χρόνο γύρω από το Β 1 με γωνιακή ταχύτητα ω 1. Ταυτόχρονα μεταπίπτει γύρω από το B 0. Αυτή η χρονικά εξαρτώμενη μαγνήτιση ονομάζεται Μ t. Για την απλοπλοίηση του μελετώμενου συστήματος έχει εισαχθεί το περιστρεφόμενο πλαίσιο αναφοράς, στο οποίο περιστρέφονται οι άξονες X και Ψ με γωνιακή ταχύτητα ω 0. Έτσι η επίδραση του Β 0 εξαλείφται στην πράξη και όποιο διάνυσμα που μεταπίπτει με γωνιακή ταχύτητα ω 0, όπως το Β 1 παριστάνεται σαν στάσιμο (Εικόνα 11) (133). Εικόνα 11. Η επίδραση ενός παλμού ραδιοσυχνοτήτων στο εργαστηριακό πλαίσιο αναφοράς. Ο νέος προσανατολισμός και η νέα μαγνήτιση Μ, η οποία διαφέρει από πυρήνα σε πυρήνα ανάλογα με το χημικό και μαγνητικό περιβάλλον διαρκεί όσο και η ακτινοβόληση του δείγματος και είναι της τάξης των λίγων μsec. Η γωνία περιστροφής είναι ανάλογη του Β 1 και του χρόνου που διαρκεί. Η επίδραση του παλμού 90 ο έχει σαν αποτέλεσμα να αποκλίνει η μαγνήτιση Μ 0 κατά μήκος του άξονα των Ψ, όπου και ο φασματογράφος ανιχνεύει το σήμα. Επομένως η στροφή της Μ 0 κατά 90 ο είναι αυτή που παράγει το μέγιστο σήμα (Εικόνα 12) (133).

59 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 59 Εικόνα 12. Η επίδραση ενός παλμού 90 ο. Ελεύθερη επαγόμενη ταλάντωση. Με τη διακοπή της ακτινοβόλησης οι πυρήνες επανέρχονται στην αρχική τους κατάσταση και η μαγνήτιση φθίνει και έχουμε απόσβεσή της. Αυτή η απόσβεση είναι χρονικά εξαρτώμενη και κάθε πυρήνας έχει το δικό του χρόνο απόσβεσης. Η συνάρτηση της απόσβεσης της μαγνήτισης του πυρήνα και του χρόνου απόσβεσης λέγεται ελεύθερη επαγόμενη απόσβεση (FID) και έχει τη μορφή φθίνουσας ταλάντωσης (Εικόνα 12). Αυτή η συνάρτηση περιέχει το φάσμα του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, που είναι το σήμα της απορρόφησης του πυρήνα, που φθίνει με εκθετικό τρόπο. Η ταχύτητα απόσβεσης σχετίζεται και με το πλάτος της απορρόφησης. Όσο πιο γρήγορα γίνεται η απόσβεση, τόσο πιο μεγάλο είναι και το πλάτος. Αντίστοιχα, όσο πιο αργά γίνεται η απόσβεση, τόσο πιο μικρό είναι το πλάτος, δηλαδή πιο οξεία η κορυφή με καλύτερη διαχωριστικότητα. Έτσι, η φθίνουσα ταλάντωση περιέχει διπλή πληροφορία: τη συχνότητα της απορρόφησης και το πλάτος της απορρόφησης.

60 60 Όλγα Κ. Λάγιου Με μια μαθηματική μέθοδο που ονομάζεται μετασχηματισμός Fourier (Fourier Τransform - FT) (f (ξ) = + f(x) e 2πixξ dx), μετασχηματίζεται το φάσμα συναρτήσει του χρόνου σε φάσμα συναρτήσει συχνότητας, που είναι και το φάσμα του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. Κάθε πυρήνας έχει το δικό του συντονισμό λόγω διαφορετικής προάσπισης (chemical shielding), επειδή το ηλεκτρονιακό του περιβάλλον που δημιουργεί σ ένα μαγνητικό πεδίο ποικίλλει από κάθε άλλο πυρήνα. Θεωρία πειράματος δύο διαστάσεων Η χρήση υψηλού πεδίου παράγει φάσμα υψηλής διαχωριστικότητας, τα οποία όμως μπορεί να αποτελούνται από πληθώρα σημάτων. Σε αρκετές περιπτώσεις μπορεί να υπάρχουν κορυφές που αλληλοεπικαλύπτονται, επομένως πρέπει να χωριστούν τα σήματα σε διάφορες διαστάσεις. Επομένως είναι απαραίτητη η εισαγωγή της δεύτερης διάστασης για τη μελέτη μορίων (133) (134). Στα πειράματα μίας διάστασης λαμβάνονται οι συντονισμοί των πυρήνων υπό μελέτη. Η δεύτερη διάσταση θα μας πληροφορήσει ποιοι από τους πυρήνες συνδέονται μέσω δεσμού ή μέσω εγγύτητας στο χώρο. Τα πειράματα δύο διαστάσεων είναι σημαντικά για την ταυτοποίηση ενός μορίου. Η ακριβής σειρά που θα γίνουν τα πειράματα εξαρτάται από: το είδος του μορίου, τις βιβλιογραφικές πληροφορίες που είναι διαθέσιμες και από το σχεδιασμό της μελέτης. Θεωρία φάσματος δύο διαστάσεων Σε ένα φάσμα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού δύο διαστάσεων (2D-NMR), υπάρχει καταγραφή δύο διαφορετικών πληροφοριών σε δύο διαφορετικές διαστάσεις ή σε δύο διαφορετικούς άξονες συχνοτήτων F 2 και F 1. Στον έναν άξονα F 2 καταγράφονται συνήθως οι απορροφήσεις ενός συγκεκριμένου πυρήνα ενός μορίου, ενώ στον άλλο άξονα F 1 καταγράφονται άλλες πληροφορίες, όπως σταθερά σύζευξης ή απορροφήσεις άλλων πυρήνων που σχετίζονται ή αλληλεπιδρούν με αυτούς του άξονα F 2. Οι σημαντικότερες κατηγορίες φασμάτων 2D-NMR είναι: 2D-J NMR: φάσμα ανάλυσης σταθεράς σύζευξης COSY-NMR: φάσμα συσχέτισης πυρήνων (Correlated SpectroscopY-NMR)

61 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 61 NOESY-NMR: φάσμα συσχετισμού αλληλεπίδρασης πυρήνων με ΝΟΕ μέσω του χώρου (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY- NMR) Στην κατηγορία των 2D-J NMR φασμάτων ο ένας άξονα F 2 του 2D- NMR φάσματος περιέχει τις απορροφήσεις ενός συγκεκριμένου πυρήνα ( 1 Hή 13 C ), ενώ ο άλλος άξονας F 1 περιέχει τη σταθερά σύζευξης J. Η σταθερά σύζευξης μπορεί να αναφέρεται σε ομοπυρηνική σύζευξη, δηλαδή σε σύζευξη με ίδιο γειτονικό πυρήνα ή σε ετεροπυρηνική σύζευξη, δηλαδή σε σύζευξη με διαφορετικό γειτονικό πυρήνα. Στην κατηγορία COSY-NMR ανήκουν τα 2-D φάσματα συσχέτισης NMR. Η συσχέτιση των πυρήνων είναι αποτέλεσμα της σύζευξης μέσω δεσμών με μία σταθερά σύζευξης J. Και οι δύο άξονες F 2 και F 1 του COSY- NMR φάσματος αφορούν τις απορροφήσεις. Στα ομοπυρηνικά φάσματα COSY και οι δύο άξονες περιέχουν απορροφήσεις του ίδιου πυρήνα. Στα ετεροπυρηνικά φάσματα COSY οι δύο άξονες αφορούν τις απορροφήσεις άλλου πυρήνα. Οι κηλίδες που εμφανίζονται στη διαγώνιο ενός COSY φάσματος είναι η προβολή των απορροφήσεων αμφοτέρων των αξόνων στη διαγώνιο του φάσματος 2D-NMR. Ένα COSY-NMR φάσμα μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για τις υπάρχουσες συζεύξεις μεταξύ δεσμών οποιουδήποτε πυρήνα του μορίου και, επομένως, να κατανοήσουμε τη δομή του μορίου. Στην κατηγορία NOESY-NMR, όπως και στα COSY-NMR, υπάρχουν απορροφήσεις ίδιων ή διαφορετικών πυρήνων στους άξονες F 2 και F 1. Τα συμμετρικά σημεία που εμφανίζονται στους άξονες σε ένα NOESY-NMR φάσμα, τα οποία συνδέουν τις απορροφήσεις δύο πυρήνων στους δύο άξονες, μας πληροφορούν για την αλληλεπίδραση μέσω του χώρου αυτών των πυρήνων. Η αλληλεπίδραση αυτή είναι εφικτή όταν δύο πυρήνες βρεθούν αρκετά κοντά (< 5 Å), ώστε να υπάρχει πυρηνικό φαινόμενο Overhauser (Nuclear Overhauser Effect) μέσω της εγγύτητας στο χώρο κατά τη διέγερση και την αποκατάσταση των πυρήνων. Έτσι, μέσω του NOESY πειράματος λαμβάνουμε πληροφορίες για τις ενδομοριακές επιδράσεις των πυρήνων του μορίου, επομένως γνωρίζουμε τη διαμόρφωση των πυρήνων (136). Πυρηνικό φαινόμενο Overhauser Το πυρηνικό φαινόμενο Overhauser παίζει σημαντικό ρόλο στη μελέτη της διαμόρφωσης και της στερεοχημείας ενός μορίου. Σε ένα σύστημα πυρήνων A και X, η αλλαγή στην ένταση μιας απορρόφησης NMR του πυρήνα Α επέρχεται όταν διαταράσσονται οι πληθυσμοί αυτοστροφορμών των

62 62 Όλγα Κ. Λάγιου ενεργειακών καταστάσεων του πυρήνα Χ. Η διατάραξη των πληθυσμών των ενεργειακών καταστάσεων του πυρήνα Χ είναι δυνατόν να γίνει με τον κορεσμό (saturation) της αντίστοιχης απορρόφησης, δηλαδή με την ακτινοβόλησή της, ώστε να μην υπάρχει περίσσεια πυρήνων στη βασική κατάσταση και κατά συνέπεια να υπάρχουν οι ίδιοι πληθυσμοί στη βασική και τη διεγερμένη κατάσταση. Σε αυτή την περίπτωση όλο το σύστημα των πυρήνων Α και Χ, επιχειρεί να επανέλθει σε μία κατάσταση θερμικής ισορροπίας. Αυτό ονομάζεται φαινόμενο Overhauser (Nuclear Overhauser Effect - NOE) (133) (137). Στην ουσία, το ΝΟΕ δείχνει την προσπάθεια του συστήματος των πυρήνων Α και Χ να αντισταθμίσουν μία τεχνητή μεταβολή που προκλήθηκε από την ακτινοβόληση ενός μέρους του συστήματος. Μία μεταβολή πληθυσμού ενός άλλου μέρους του συστήματος επέρχεται, ώστε τελικά να επικρατήσει θερμική ισορροπία. Η μαθηματική έκφραση του φαινομένου ΝΟΕ μπορεί να απεικονιστεί ως εξής: NOE ή na(x) = (I I O ), όπου na(x) το αποτέλεσμα στην I O απορρόφηση των πυρήνων Α, όταν ακτινοβολείται η απορρόφηση των πυρήνων Χ, I O η ένταση της απορρόφησης των πυρήνων Α σε κατάσταση θερμικής ισορροπίας πριν την ακτινοβόληση των πυρήνων Χ, και I η ένταση της απορρόφησης των πυρήνων Α σε κατάσταση θερμικής ισορροπίας μετά την ακτινοβόληση των πυρήνων Χ. Έτσι, το ΝΟΕ θα έχει θετική τιμή αν η νέα ένταση είναι μεγαλύτερη της αρχικής και αρνητική τιμή αν η νέα ένταση είναι μικρότερη της αρχικής. Μηχανισμοί αποδιέγερσης στο NMR Όταν ένας πυρήνας εκτίθεται σε ακτινοβολία κατάλληλης συχνότητας, πραγματοποιείται απορρόφηση εξαιτίας της πολύ μικρής περίσσειας πυρήνων χαμηλότερης ενεργειακής κατάστασης, οι οποίοι βρίσκονται στο ισχυρό μαγνητικό πεδίο. Κατά τη διεργασία της απορρόφησης μπορεί να εξισωθεί ο αριθμός των πυρήνων στις δύο καταστάσεις και να μειωθεί η ένταση του σήματος απορρόφησης μέχρι το μηδέν. Τότε το σύστημα των spin αναφέρεται ως κορεσμένο. Για να αποφευχθεί ο κορεσμός, η ταχύτητα αποδιέγερσης (relaxation) των διεγερμένων πυρήνων στη χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση θα πρέπει να είναι μεγάλη, ή τουλάχιστον μεγαλύτερη από την ταχύτητα με την οποία τα spin απορροφούν ενέργεια. Αποδιέγερση μπορεί να γίνει με εκπομπή ακτινοβολίας με συχνότητα αντίστοιχη προς την ενεργειακή διαφορά μεταξύ των δύο καταστάσεων.

63 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 63 Υπάρχουν, όμως, και μηχανισμοί αποδιέγερσης χωρίς εκπομπή ακτινοβολίας. Οι δύο σημαντικοί μηχανισμοί αποδιέγερσης στη φασματοσκοπία NMR είναι η αποδιέγερση spin-πλέγματος (spin-lattice) ή διαμήκης αποδιέγερση (longitudinal relaxation) και η αποδιέγερση spin-spin ή εγκάρσια αποδιέγερση (transverse relaxation) (138). Αποδιέγερση spin-πλέγματος Οι απορροφούντες πυρήνες σε ένα πείραμα NMR αποτελούν μέρος των ατόμων του δείγματος. Το σύνολο των ατόμων αναφέρεται ως πλέγμα (lattice), ανεξάρτητα από το εάν το δείγμα είναι στερεό, υγρό, ή αέριο. Ειδικά στις δύο τελευταίες καταστάσεις, οι πυρήνες του πλέγματος βρίσκονται σε μια έντονη δονητική και περιστροφική κίνηση, γεγονός το οποίο δημιουργεί ένα σύνθετο μαγνητικό πεδίο γύρω από κάθε μαγνητικό πυρήνα. Επομένως, το μαγνητικό πεδίο του πλέγματος περιέχει ένα συνεχές μαγνητικών συνιστωσών, μερικές από τις οποίες πρέπει να αντιστοιχούν σε συχνότητα και φάση με τη μεταπτωτική συχνότητα του εξεταζόμενου μαγνητικού πυρήνα. Αυτές οι δονητικά και περιστροφικά αναπτυσσόμενες συνιστώσες αλληλεπιδρούν με τους πυρήνες και τους εξαναγκάζουν να μεταπέσουν από υψηλότερη σε χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση spin, οπότε η απορροφούμενη ενέργεια απλά αυξάνει το πλάτος των θερμικών δονήσεων και περιστροφών. Αυτή η αλλαγή προκαλεί μια απειροελάχιστη αύξηση της θερμοκρασίας του δείγματος. Η αποδιέγερση spin-πλέγματος ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης (εκθετική απόσβεση) και χαρακτηρίζεται από ένα χρόνο αποδιέγερσης Τ1, που αποτελεί μέτρο του μέσου χρόνου ζωής των πυρήνων στην υψηλότερη ενεργειακή κατάσταση. Ο χρόνος Τ1 εξαρτάται από τον γυρομαγνητικό λόγο των απορροφούντων πυρήνων και επιπλέον επηρεάζεται ισχυρά από την κινητικότητα του πλέγματος. Σε κρυσταλλικά στερεά και υγρά υψηλού ιξώδους, όπου η κινητικότητα είναι μικρή, ο Τ1 είναι μεγάλος. Όσο αυξάνει η κινητικότητα (π.χ. σε μεγάλες θερμοκρασίες) αυξάνουν και οι δονητικές και οι περιστροφικές συχνότητες και επομένως αυξάνει η πιθανότητα να εμφανισθεί μαγνητική διακύμανση με τιμή κατάλληλη για αποδιέγερση, με άμεση συνέπεια τη συντόμευση του χρόνου μετάπτωσης Τ1. Ωστόσο, σε μεγάλες κινητικότητες η διακύμανση των συχνοτήτων αυξάνει περισσότερο και απλώνονται σε μεγαλύτερο εύρος, οπότε μειώνεται η πιθανότητα παρουσίας συχνότητας κατάλληλης για μια μετάπτωση spin-πλέγματος. Το αποτέλεσμα είναι η εμφάνιση ενός ελαχίστου στη σχέση μεταξύ Τ1 και κινητικότητας πλέγματος (138).

64 64 Όλγα Κ. Λάγιου Αποδιέγερση spin-spin Πολλά άλλα φαινόμενα τείνουν να ελαττώσουν τους χρόνους αποδιέγερσης και επομένως να διευρύνουν τις γραμμές NMR. Τα αποτελέσματα των φαινομένων αυτών συνήθως συναθροίζονται και περιγράφονται από ένα εγκάρσιο ή χρόνο Τ2 αποδιέγερσης spin-spin. Όταν δύο γειτονικοί πυρήνες του ίδιου είδους έχουν τις ίδιες ταχύτητες αποδιέγερσης αλλά βρίσκονται σε διαφορετικές μαγνητικές κβαντικές καταστάσεις, τα μαγνητικά τους πεδία μπορεί να αλληλεπιδράσουν και να προκαλέσουν τη μεταξύ τους ανταλλαγή καταστάσεων. Δηλαδή, ένας πυρήνας στη χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση διεγείρεται, ενώ ένας διεγερμένος πυρήνας επανέρχεται στη χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση. Έτσι, στην ουσία δεν μεταβάλλονται οι πληθυσμοί των καταστάσεων και επομένως δεν μειώνεται ο κορεσμός, αλλά ο χρόνος ζωής ενός συγκεκριμένου διεγερμένου πυρήνα. Το αποτέλεσμα είναι η διεύρυνση των κορυφών (138). Τύποι φασμάτων NMR Υπάρχουν πολλοί τύποι φασμάτων NMR, ανάλογα με το είδος του χρησιμοποιούμενου οργάνου, το είδος του απορροφούντος πυρήνα, τη φυσική κατάσταση του δείγματος, το περιβάλλον του πυρήνα της προσδιοριζόμενης ουσίας και τον σκοπό συλλογής των δεδομένων. Ωστόσο, συνήθως, τα φάσματα NMR διακρίνονται σε φάσματα ευρείας γραμμής και σε φάσματα υψηλής διακρισιμότητας (139). Φάσματα ευρείας γραμμής Τα φάσματα ευρείας γραμμής (wide-line spectra) είναι εκείνα τα φάσματα, των οποίων το εύρος των κορυφών είναι αρκετά μεγάλο, ώστε χάνεται η λεπτή υφή που οφείλεται στο χημικό περιβάλλον. Τα φάσματα ευρείας γραμμής είναι χρήσιμα για τον ποσοτικό προσδιορισμό ισοτόπων και για μελέτες του φυσικού περιβάλλοντος των απορροφούντων πυρήνων. Τα φάσματα αυτά συνήθως λαμβάνονται σε μαγνητικά πεδία σχετικά χαμηλής έντασης (Εικόνα 13).

65 Απορρόφηση Απορρόφηση ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 65 Φάσματα υψηλής διακρισιμότητας Τα περισσότερα φάσματα NMR είναι υψηλής διακρισιμότητας (highresolution spectra) και συλλέγονται από όργανα ικανά να διακρίνουν πολύ μικρές διαφορές συχνοτήτων, 0,01 ppm ή λιγότερο. Για ένα δεδομένο ισότοπο τέτοια φάσματα παρουσιάζουν πολλές κορυφές, οι οποίες προκύπτουν από διαφορές στο χημικό τους περιβάλλον (Εικόνα 13). Μαγνητικό πεδίο Μαγνητικό πεδίο Εικόνα 13. Φάσμα χαμηλής διακρισιμότητας (αριστερά) και υψηλής διακρισιμότητας (δεξιά). Επιδράσεις περιβάλλοντος στα φάσματα NMR Η συχνότητα της ακτινοβολίας RF η οποία απορροφάται από έναν πυρήνα επηρεάζεται έντονα από το χημικό του περιβάλλον, δηλαδή από γειτονικά ηλεκτρόνια και πυρήνες. Έτσι, ακόμη και απλά μόρια παρέχουν πλήθος φασματικών πληροφοριών, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διευκρίνιση της χημικής δομής τους. Σημαντικότερα είναι τα πρωτονιακά φάσματα, επειδή το 1 H είναι το ισότοπο που έχει μελετηθεί αναλυτικότερα (138). Είδη περιβαλλοντικών επιδράσεων Στα καταγραφόμενα φάσματα υπάρχουν μικρές διαφορές στη συχνότητα απορρόφησης του πρωτονίου. Οι διαφορές αυτές εξαρτώνται από την ομάδα με την οποία συνδέεται το άτομο του υδρογόνου. Αυτό το φαινόμενο καλείται χημική μετατόπιση (chemical shift). Το φάσμα υψηλής διακρισιμότητας είναι πιθανό να αποκαλύψει ότι μία κορυφή του φάσματος χαμηλής διακρισιμότητας διαχωρίζεται σε περισσότερες κορυφές. Αυτή η δευτερογενής περιβαλλοντική επίδραση συναθροίζεται στη

66 66 Όλγα Κ. Λάγιου χημική μετατόπιση, οφείλεται σε διαφορετικούς λόγους και αναφέρεται ως σχάση spin-spin (spin-spin splitting). Τόσο η χημική μετατόπιση, όσο και η σχάση spin-spin, αποτελούν σημαντικά στοιχεία για την ανάλυση της χημικής δομής του δείγματος που μελετάται. Πειραματικά, οι δύο αυτές επιδράσεις διακρίνονται εύκολα, επειδή οι αποστάσεις των κορυφών οι οποίες προκύπτουν από χημική μετατόπιση, είναι ευθέως ανάλογες προς την ένταση του πεδίου ή τη συχνότητα του ταλαντωτή. Αντίθετα, η απόσταση μεταξύ των πολλαπλών κορυφών δεν μεταβάλλεται με αλλαγή της συχνότητας (138). Θεωρία της χημικής μετατόπισης Τη χημική μετατόπιση προκαλούν μικρά μαγνητικά πεδία, τα οποία δημιουργούνται από τα ηλεκτρόνια καθώς αυτά κινούνται γύρω από τους πυρήνες. Τα πεδία αυτά συνήθως αντιτίθενται στο εφαρμοζόμενο πεδίο. Επομένως, οι πυρήνες εκτίθενται σε ένα πεδίο, το οποίο είναι συνήθως ελάχιστα μικρότερο από το εξωτερικό πεδίο. Το μέγεθος του πεδίου που αναπτύσσεται είναι: Β 0 = Β εφ σβ εφ = Β εφ (1 σ), όπου Β εφ είναι η τιμή του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου και Β 0 η τιμή του προκύπτοντος πεδίου, το οποίο καθορίζει τελικά και τη συμπεριφορά συντονισμού του πυρήνα. Το σ είναι η σταθερά προάσπισης (screening constant), η οποία καθορίζεται από την ηλεκτρονιακή πυκνότητα και την κατανομή της στον χώρο γύρω από τον πυρήνα. Η ηλεκτρονιακή πυκνότητα εξαρτάται από τη δομή της ένωσης, που περιέχει τον πυρήνα. Η συνθήκη συντονισμού εκφρασμένη με συχνότητες είναι: ν 0 = γ 2π Β 0(1 σ). Θεωρία της σχάσης spin-spin Η σχάση των κορυφών χημικής μετατόπισης συμβαίνει καθώς η μαγνητική ροπή ενός πυρήνα αλληλεπιδρά με τις μαγνητικές ροπές των αμέσως γειτονικών πυρήνων. Το μαγνητικό πεδίο που δημιουργεί ο περιστρεφόμενος πυρήνας, επηρεάζει την κατανομή των ηλεκτρονίων στους δεσμούς του με άλλους πυρήνες. Η μεταβολή αυτή στην ηλεκτρονιακή κατανομή προκαλεί μεταβολές στο μαγνητικό πεδίο γειτονικών πυρήνων, προκαλεί σχάση στα ενεργειακά επίπεδα και επομένως δημιουργεί πολλαπλές μεταπτώσεις. Η μαγνητική σύζευξη των πυρήνων η οποία μεταβιβάζεται μέσω δεσμικών ηλεκτρονίων, συχνά αναφέρεται ως αλληλεπίδραση πόλωσης (polarization interaction). Τα φαινόμενα αυτά δεν εξαρτώνται από το

67 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 67 εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο και συναθροίζονται στα φαινόμενα χημικής μετατόπισης. Φασματόμετρα NMR Τα φασματόμετρα NMR που χρησιμοποιούνται σήμερα είναι δύο τύπων: φασματόμετρα ευρείας γραμμής (ή χαμηλής διακριτικής ικανότητας) και φασματόμετρα υψηλής διακριτικής ικανότητας. Τα όργανα χαμηλής διακριτικής ικανότητας έχουν μαγνήτες με εντάσεις μερικών δεκάτων του Tesla και είναι απλούστερα και φθηνότερα από τα όργανα υψηλής διακριτικής ικανότητας, τα οποία μπορεί έχουν μαγνήτες εντάσεως από 1,4 έως και 14 Τesla, που αντιστοιχούν σε πρωτονιακές συχνότητες 60 έως 1000 MHz (132). Πριν από το 1970 τα φασματόμετρα NMR υψηλής διακριτικής ικανότητας, ήταν όλα του τύπου συνεχούς κύματος και χρησιμοποιούσαν μόνιμους μαγνήτες ή ηλεκτρομαγνήτες. Ο τύπος αυτός του οργάνου έχει αντικατασταθεί από τα φασματόμετρα μετασχηματισμού Fourier (FT), εξοπλισμένα με υπεραγώγιμα πηνία για δημιουργία του μαγνητικού πεδίου. Οι υπολογιστές είναι αναπόσπαστο τμήμα των μοντέρνων οργάνων NMR: μετατρέπουν το σήμα σε ψηφιακό και το αποθηκεύουν, εκτελούν μετασχηματισμό Fourier για να δημιουργηθεί το σήμα ως προς τη συχνότητα, διαχειρίζονται τα δεδομένα και ελέγχουν τις λειτουργίες του οργάνου. Τα όργανα αυτά, τα οποία χρησιμοποιούν το μετασχηματισμό Fourier είναι περισσότερο δημοφιλή, γιατί επιτρέπουν τον ταχύ υπολογισμό της μέσης μορφής του σήματος και επομένως έχουν πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία. Τα όργανα NMR με FT είναι πολύ ακριβότερα από τα όργανα συνεχούς κύματος, με τιμές που μπορεί να φθάνουν το Ωστόσο, η αποδοτικότητά τους τα έχει καταστήσει κυρίαρχα (133). Τμήματα φασματόμετρου με μετασχηματισμό Fourier Το σχηματικό διάγραμμα (Εικόνα 14) απεικονίζει τα κύρια τμήματα ενός φασματομέτρου NMR με ενσωματωμένο μετασχηματισμό Fourier FT- NMR. Το βασικό τμήμα του οργάνου είναι o σταθερός μαγνήτης στον οποίο τοποθετείται το δείγμα. Το δείγμα περιβάλλεται από ένα πηνίο, το οποίο παίζει ρόλου πομπό και δέκτη. Οι ραδιοσυχνότητες παράγονται από μια γεννήτρια συχνοτήτων, που ελέγχεται από κρυσταλλικό ταλαντωτή. Το σήμα έπειτα οδηγείται μέσω της πύλης παλμών σε έναν ενισχυτή, ο οποίος δημιουργεί ένα έντονο και αναπαραγώγιμο παλμό ραδιοσυχνοτήτας (RF) στο πηνίο εκπομπής.

68 68 Όλγα Κ. Λάγιου Η παραγόμενη ακτινοβολία RF επιδρά στο δείγμα εντός του πηνίου. Η διάρκεια, το πλάτος, η κυματομορφή και η φάση του παλμού μπορούν να επιλεγούν κατά το πείραμα (140). Το παραγόμενο σήμα συλλέγεται από το ίδιο πηνίο, που τώρα χρησιμεύει ως δέκτης, ενισχύεται και μεταφέρεται σε έναν ανιχνευτή ευαίσθητο στη φάση του σήματος. Το σήμα ψηφιοποιείται και συλλέγεται στη μνήμη του υπολογιστή για επεξεργασία με πρόγραμμα μετασχηματισμού Fourier και με λογισμικό ανάλυσης δεδομένων. Τα αποτελέσματα του προγράμματος καταγράφονται παρέχοντας το τελικό φάσμα (σήμα ως προς συχνότητα) (138). Μαγνητικό πεδίο Πομπός RF ΔΕΙΓΜΑ Ενισχυτής RF Πύλη παλμών Ανιχνευτής ευαίσθητος στη φάση Γεννήτρια συχνοτήτων Υπολογιστής χρονικής σάρωσης και FT Εικόνα 14. Σχηματικό διάγραμμα φασματομέτρου NMR με μετασχηματισμό Fourier. Μαγνήτες και μαγνητικό πεδίο Το βασικότερο στοιχείο ενός οργάνου NMR είναι ο μαγνήτης του. Η ευαισθησία και η διακριτική ικανότητα της διάταξης εξαρτώνται αναλογικά από την ένταση του μαγνητικού πεδίου και την ποιότητα του μαγνήτη. Επομένως, είναι χρήσιμη η λειτουργία στην υψηλότερη δυνατή ένταση μαγνητικού πεδίου. Επιπλέον, το πεδίο πρέπει να είναι εξαιρετικά ομογενές και σταθερό. Στα φασματόμετρα NMR έχουν χρησιμοποιηθεί μόνιμοι μαγνήτες, συμβατικοί ηλεκτρομαγνήτες και υπεραγώγιμα πηνία. Μόνιμοι μαγνήτες είχαν χρησιμοποιηθεί ευρύτατα στο παρελθόν, αλλά ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητοι στη θερμοκρασία. Σήμερα οι συμβατικοί ηλεκτρομαγνήτες σπάνια χρησιμοποιούνται στα όργανα NMR. Στα σύγχρονα όργανα NMR υψηλής διακριτικής ικανότητας χρησιμοποιούνται τα υπεραγώγιμα πηνία. Με τους μαγνήτες αυτούς επιτυγχάνονται πεδία έως και 21 Τ, τα οποία αντιστοιχούν σε συχνότητα 900 MHz για τα πρωτόνια. Τα πλεονεκτήματα των υπεραγώγιμων

69 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 69 πηνίων είναι η υψηλή τους ένταση, η σταθερότητα, το χαμηλό κόστος λειτουργίας και το μικρό τους μέγεθος σε σχέση με τον ηλεκτρομαγνήτη. Το υπεραγώγιμο πηνίο κατασκευάζεται από σύρμα νιοβίου/κασσιτέρου, ή νιοβίου/τιτανίου και εμβαπτίζεται σε υγρό ήλιο σε θερμοκρασία 4 Κ. Το δοχείο Dewar με το υγρό ήλιο είναι εμβαπτισμένο σε εξωτερικό δοχείο Dewar με υγρό άζωτο. Τα περισσότερα υπεραγώγιμα μαγνητικά συστήματα πρέπει να φορτίζονται περιοδικά με υγρό άζωτο και με υγρό ήλιο (131) (133). Κλείδωμα μαγνητικού πεδίου Για αντιστάθμιση των διακυμάνσεων του μαγνητικού πεδίου στα σύγχρονα όργανα NMR χρησιμοποιείται ένα σύστημα κλειδώματος πεδίου/συχνότητας. Στα συστήματα αυτά, ένας πυρήνας αναφοράς ακτινοβολείται συνεχώς και η συχνότητα που αντιστοιχεί στο μέγιστο του συντονισμού του παρακολουθείται στην αναφερόμενη ένταση μαγνητικού πεδίου. Μεταβολές στην ένταση του σήματος απορρόφησης αναφοράς, ελέγχουν ένα κύκλωμα ανατροφοδότησης του οποίου η έξοδος εισάγεται σε πηνία τοποθετημένα μέσα στο μαγνητικό πεδίο με τέτοιο τρόπο, ώστε να διορθωθεί η διολίσθηση. Βέβαια, οι περισσότεροι σύγχρονοι υπεραγώγιμοι μαγνήτες είναι αρκετά σταθεροί, ώστε φάσματα να μπορούν να ληφθούν σε χρονικό διάστημα από 1 έως 20 λεπτά, χωρίς να απαιτείται κλείδωμα πεδίου. Ομογενοποίηση πεδίου Μέσα στον κύριο μαγνήτη υπάρχουν διορθωτικά πηνία από τα οποία διέρχονται επακριβώς ελεγχόμενα ρεύματα. Τα πηνία αυτά παράγουν ασθενή μαγνητικά πεδία για να αντισταθμισθούν οι ανομοιογένειες του βασικού μαγνητικού πεδίου. Η διαδικασία ελέγχεται από τον υπολογιστή με αλγόριθμους ικανούς να βελτιστοποιούν την ομοιογένεια του πεδίου. Συνήθως η διαδικασία ομογενοποίησης πρέπει να εκτελείται κάθε φορά που ένα νέο δείγμα εισάγεται στο φασματόμετρο. Περιστροφή δείγματος Η επίδραση της ανομοιογένειας του πεδίου αντισταθμίζεται επίσης με περιστροφή του δείγματος κατά μήκος της καθέτου διαμήκους τομής του. Η περιστροφή γίνεται με ταχύτητα 20 έως 50 περιστροφών ανά δευτερόλεπτο. Ένα μικρό μειονέκτημα της περιστροφής είναι ότι το μαγνητικό πεδίο διαμορφώνεται στη συχνότητα περιστροφής και έτσι μπορεί να δημιουργηθούν πλευρικές κορυφές γύρω από τις κορυφές απορρόφησης.

70 70 Όλγα Κ. Λάγιου Υποδοχείς δείγματος Μια σημαντική μονάδα ενός φασματομέτρου NMR είναι o υποδοχέας δείγματος (probe), ο οποίος χρησιμεύει στη συγκράτηση του δείγματος σε σταθερή θέση στο μαγνητικό πεδίο, περιλαμβάνει το σύστημα περιστροφής του δείγματος και στεγάζει το πηνίο ή τα πηνία διέγερσης και ανίχνευσης των σημάτων NMR. Οι κυψελίδες δείγματος, γνωστοί ως «σωλήνες NMR», είναι γυάλινοι σωλήνες εξωτερικής διαμέτρου 5 mm, που μπορούν να περιέχουν περίπου 0,4 ml υγρού. Πηνία εκπομπής και λήψης Τα πρώτα όργανα NMR περιείχαν ξεχωριστά πηνία τοποθετημένα σε ορθή γωνία μεταξύ τους για να παράγουν τον παλμό διέγερσης και να ανιχνεύουν το παραγόμενο σήμα NMR. Τα σύγχρονα φωτόμετρα NMR έχουν, συνήθως, ανιχνευτές απλού πηνίου, όπως φαίνεται, οι οποίοι είναι απλούστεροι και αποδοτικότεροι (138). Γεννήτρια παλμών Οι γεννήτριες ραδιοσυχνοτήτων και τα όργανα σύνθεσης συχνοτήτων παράγουν ουσιαστικά σήμα μίας συχνότητας. Ωστόσο, για παραγωγή φασμάτων με μετασχηματισμό Fourier, το δείγμα πρέπει να ακτινοβοληθεί με ένα εύρος συχνοτήτων αρκετά μεγάλο για να διεγείρει πυρήνες με διαφορετικές συχνότητες συντονισμού. H γεννήτρια παλμών αποτελείται από τρία μέρη: ένα συνθέτη συχνοτήτων, μια πύλη για το άνοιγμα και κλείσιμο του παλμού στους κατάλληλους χρόνους και έναν ενισχυτή. Σύστημα λήψης Τα δυναμικά που δημιουργούνται από το ρεύμα στο πηνίο ανίχνευσης κυμαίνονται από nv έως μv και επομένως πρέπει να ενισχυθούν για να φθάσουν στην περιοχή 0 έως 10 V για να γίνει επεξεργασία και ψηφιοποίηση. Το πρώτο στάδιο της ενίσχυσης πραγματοποιείται στον προενισχυτή, ο οποίος βρίσκεται επάνω στον ανιχνευτή και πολύ κοντά στο πηνίο λήψης έτσι, ώστε να ελαχιστοποιείται η επιδράση θορύβου από άλλα τμήματα του οργάνου.

71 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 71 Ανιχνευτής και σύστημα επεξεργασίας Το σύστημα ανίχνευσης μετατρέπει πρώτα το σήμα υψηλής ραδιοσυχνότητας σε ακουστική συχνότητα, η οποία ψηφιοποιείται ευκολότερα. Το σήμα από τον ενισχυτή ραδιοσυχνότητας μπορεί να θεωρηθεί ότι αποτελείται από δύο συνιστώσες. Ένα φέρον σήμα (carrier signal) με τη συχνότητα του ταλαντωτή που χρησιμοποιείται για παραγωγή του και το σήμα NMR από τον αναλύτη. Το σήμα από τον αναλύτη διαφέρει από το φέρον ως προς τη συχνότητα κατά μερικά ppm. Η ψηφιοποίηση σημάτων τόσο υψηλής συχνότητας για να υπολογισθεί η μικρή διαφορά που οφείλεται στο δείγμα δεν είναι εύκολη. Γι αυτό η συχνότητα του φέροντος σήματος ν c αφαιρείται ηλεκτρονικά από το σήμα του αναλύτη με συχνότητα ν n στην αναλογική περιοχή σημάτων. Η διαδικασία αυτή είναι παρόμοια με αυτήν, που εφαρμόζεται στα ραδιόφωνα για την παραλαβή του ακουστικού σήματος από τη φέρουσα ραδιοσυχνότητα (138). Προετοιμασία του δείγματος Μέχρι πρόσφατα, οι μελέτες με NMR υψηλής διακριτικής ικανότητας είχαν περιορισθεί σε δείγματα, τα οποία μπορούσαν να μετατραπούν σε μια λεπτόρευστη, υγρή κατάσταση. Τις περισσότερες φορές χρησιμοποιείται διάλυμα του δείγματος 2%-15%, αν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν καθαρά υγρά δείγματα, εφόσον το ιξώδες τους είναι αρκετά χαμηλό (138). Οι καλύτεροι διαλύτες για φασματομετρία NMR πρωτονίου δεν περιέχουν πρωτόνια. Από αυτήν την άποψη ο τετραχλωράνθρακας είναι ιδανικός. Ωστόσο, η χαμηλή διαλυτότητα πολλών ενώσεων στον τετραχλωράνθρακα περιορίζει τη χρήση ως διαλύτη σε μετρήσεις NMR, οπότε χρησιμοποιούνται δευτεριωμένοι διαλύτες, όπως το δευτεριωμένο χλωροφόρμιο (CDCl 3 ) και το δευτεριωμένο βενζόλιο (C 6 D 6 ). Σήμερα είναι πλέον εφικτή η λήψη φασμάτων NMR υψηλής διακρισιμότητας και από στερεά δείγματα. Έχουν αναπτυχθεί και εφαρμόζονται με αυξανόμενη συχνότητα διάφορες τεχνικές για να ληφθούν 13 φάσματα NMR C πολυμερών, ορυκτών καυσίμων και άλλων ουσιών υψηλού μοριακού βάρους.

72 72 Όλγα Κ. Λάγιου Εφαρμογές του πρωτονιακού NMR Αναμφισβήτητα, οι σημαντικότερες χημικές εφαρμογές της φασματοσκοπίας NMR πρωτονίου είναι η ταυτοποίηση και η διευκρίνηση της δομής οργανικών, οργανομεταλλικών και βιοχημικών μορίων. Επιπλέον όμως, η τεχνική χρησιμοποιείται συχνά για τον ποσοτικό προσδιορισμό των απορροφούντων μορίων (133). Ταυτοποίηση ουσιών: Ένα φάσμα NMR, όπως ένα φάσμα υπερύθρου, είναι σπάνια αρκετό από μόνο του για την ταυτοποίηση μιας οργανικής ένωσης. Ωστόσο σε συνδυασμό με άλλες παρατηρήσεις, όπως φάσματα μαζών, υπερύθρου και υπεριώδους και στοιχειακή ανάλυση, το NMR αποτελεί ένα απαραίτητο και αποτελεσματικό μέσο για τον χαρακτηρισμό καθαρών ουσιών. Ποσοτική ανάλυση: Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό των φασμάτων NMR είναι η άμεση αναλογία μεταξύ των εμβαδών των κορυφών και του αριθμού των πυρήνων, που ευθύνονται για την κορυφή. Κατά συνέπεια, ένας ποσοτικός προσδιορισμός μίας συγκεκριμένης ένωσης δεν απαιτεί καθαρά δείγματα για βαθμονόμηση. Έτσι, εάν μια αναγνωρίσιμη κορυφή για ένα από τα συστατικά του δείγματος δεν επικαλύπτεται από κορυφές άλλων συστατικών του δείγματος, το εμβαδόν της κορυφής αυτής μπορεί άμεσα να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας Ανάλυση πολυσύνθετων μιγμάτων: Για την ανάλυση πολλών πολυσύνθετων μιγμάτων έχουν αναφερθεί διάφορες μέθοδοι.

73 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 73 ΣΚΟΠΟΣ Το άσθμα είναι το συχνότερο χρόνιο νόσημα στα παιδιά. Αποτελεί ένα από τα συνηθέστερα αίτια επίσκεψής τους στο Τμήμα Επειγόντων Περιστατικών, και παραμένει συχνό αίτιο εισαγωγής στο Νοσοκομείο. Είναι γνωστό ότι η συχνότητα του παιδικού άσθματος αυξάνεται σε παγκόσμιο επίπεδο. Ωστόσο, λόγω της ετερογένειας και της ποικιλίας των φαινοτύπων της νόσου, η περιγραφή της φυσικής πορείας δεν είναι ακόμα ικανοποιητικά ακριβής. Η ποσοτική ανάλυση μεταβολιτών σε βιολογικά υγρά ή ιστούς (γνωστή ως μεταβολομική), καθώς και η μελέτη της μεταβολικής απάντησης σε διάφορα παθοφυσιολογικά ερεθίσματα, αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο πεδίο έρευνας, λόγω των προφανών εφαρμογών στην κλινική πράξη. Αντίθετα με τις παραδοσιακές βιοχημικές μεθόδους, η μεταβολομική αναλύει ταυτόχρονα μεγάλο αριθμό ενδογενών και εξωγενών ουσιών (υποστρώματα ή προϊόντα μεταβολικών οδών), προκειμένου να πιστοποιήσει το μεταβολικό προφίλ του ατόμου και να προσδιορίσει πιθανές αποκλίσεις σε σχέση με το μοντέλο αναφοράς (μάρτυρες). Έτσι, η μεταβολομική μελέτη μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη στην πρόβλεψη, στην πρώιμη διάγνωση, στην εκτίμηση της σοβαρότητας και στην πρόγνωση συγκεκριμένων νοσημάτων. Οι αναφερόμενες εφαρμογές μπορεί να είναι εξαιρετικής σημασίας για την φροντίδα παιδιών με βρογχικό άσθμα. Το άσθμα είναι αποτέλεσμα πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων μεταξύ γενετικών παραγόντων, περιβάλλοντος, και έκθεσης σε βλαπτικούς παράγοντες. Επομένως, οι παραπάνω διαταραχές είναι εξαιρετικά δύσκολο να προσδιοριστούν με τις κλασσικές βιοχημικές μεθόδους. Η χρήση του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear Magnetic Reasonance - NMR) βρίσκει ολοένα και μεγαλύτερη εφαρμογή στην ανάλυση των μεταβολιτών. Ο πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός είναι μία μορφή φασματοσκοπίας απορρόφησης, όπου κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες, το δείγμα απορροφά ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε συχνότητες χαρακτηριστικές για αυτό. Η απορρόφηση αυτή συναρτάται με τον παρατηρούμενο πυρήνα. Το φάσμα του NMR είναι το διάγραμμα των κορυφών απορρόφησης σε σχέση με τη συχνότητα. Οι ασθενείς που εντάχθηκαν στη μελέτη ήταν παιδιά που επισκέφθηκαν τα εξωτερικά ιατρεία του Παιδοπνευμονολογικού Τμήματος της Παιδιατρικής Κλινικής του Περιφερειακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών λόγω συμπτωμάτων από το αναπνευστικό (συριγμός, βήχας).

74 74 Όλγα Κ. Λάγιου Ο σκοπός της διπλωματικής αυτής εργασίας ήταν διττός: 1. Η ανίχνευση μεταβολιτών σε συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα από παιδιά με βρογχικό άσθμα και υγιείς μάρτυρες (μοντέλο αναφοράς). 2. Η συσχέτιση των αποκλίσεων των παρατηρούμενων μετρήσεων ανάμεσα στους ασθενείς και τους μάρτυρες. Η ερευνητική υπόθεσή μας ήταν πως το παθοφυσιολογικό υπόβαθρο του άσθματος θα μπορούσε να αντανακλάται σε μετρήσιμες μεταβολές του μεταβολικού προφίλ των πασχόντων παιδιών.

75 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 75 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χαρακτηριστικά μελέτης Η μελέτη αυτή είναι προοπτική, ελεγχόμενη με μάρτυρες και πραγματοποιήθηκε στην Παιδοπνευμονολογικό Τμήμα της Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών (ΠΓΝΠ). Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του ΠΓΝΠ. Η μελέτη έγινε σύμφωνα με τις αρχές καλής κλινικής πρακτικής και χωρίς να τίθενται σε κίνδυνο η ζωή των ασθενών ή να επηρεάζεται η έκβαση της θεραπείας και της νόσου τους. Επίσης, οι ασθενείς ενημερώθηκαν πλήρως για την εκτέλεση της μελέτης και δόθηκε έγγραφη συγκατάθεσή τους μέσω των γονέων ή εχόντων την επιμέλεια τους (παιδιατρικοί ασθενείς). Τα δείγματα που ελήφθησαν από τους ασθενείς δεν προκάλεσαν με οιονδήποτε τρόπο επιβάρυνση του ασθενούς ούτε τον εξέθεσαν σε κίνδυνο. Ασθενείς Στη μελέτη εντάχθηκαν 23 άτομα, Καυκάσιοι, που επισκέφθηκαν τα εξωτερικά ιατρεία του Παιδοπνευμονολογικού Τμήματος της Παιδιατρικής Κλινικής του Περιφερειακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Οι ασθενείς που συμμετείχαν είχαν προσέλθει λόγω συμπτωμάτων από το αναπνευστικό (συριγμός, βήχας). Τα παιδιά που εντάχθηκαν στη μελέτη δεν ελάμβαναν αντιασθματική φαρμακευτική αγωγή για > 8 εβδομάδες. Δημιουργήθηκε μια βάση δεδομένων στην οποία έγινε καταγραφή των παρακάτω πεδίων σε κατάλληλη φόρμα για όλα τα παιδιά που συμμετείχαν στη μελέτη: Ηλικία Ύψος Βάρος Φύλο Αλλεργία Φαρμακευτική αγωγή Σπιρομετρικά στοιχεία o FEV1 (Forced Exhaled Volume in first second) o FVC (Forced Vital Capacity) o FEV1/FVC

76 76 Όλγα Κ. Λάγιου o PEFR (Peak Expiratory Flow Rate) Μέτρηση μονοξειδίου αζώτου στον εκπνεόμενο αέρα (FeNO) o FeNO (Fractional Exhaled NO) Κριτήρια εισόδου Τα κριτήρια ένταξης ενός παιδιού στην παρούσα μελέτη ήταν τα παρακάτω: Ομάδα ελέγχου: o Ηλικία 6-9 ετών o Άνευ αγωγής με εισπνεόμενα βρογχοδιασταλτικά φάρμακα για > 8 εβδομάδες o Άνευ αγωγής με εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή φάρμακα για > 8 εβδομάδες o Χωρίς άλλα γνωστά καρδιολογικά και αναπνευστικά προβλήματα Ομάδα συριγμού: o Ηλικία 6-9 ετών o Διαπιστωμένο άσθμα βάσει του ιστορικού o Διαπιστωμένο άσθμα βάσει σπιρομετρικών δεδομένων o Άνευ αγωγής με εισπνεόμενα βρογχοδιασταλτικά φάρμακα για > 8 εβδομάδες o Άνευ αγωγής με εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή φάρμακα για > 8 εβδομάδες Κριτήρια αποκλεισμού Τα κριτήρια με βάση τα οποία γινόταν η απόρριψη ενός υποψηφίου παιδιού για ένταξη στην παρούσα μελέτη ήταν τα παρακάτω: Ιστορικό χρόνιας πνευμονοπάθειας: o Κυστική ίνωση o Βρογχοπνευμονική δυσπλασία o Σύνδρομο δυσκινησίας των κροσσών o Βρογχεκτασίες άλλης αιτιολογίας Σοβαρό καρδιολογικό ιστορικό: o Συγγενείς καρδιοπάθειες

77 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 77 o Σοβαρές ανατομικές παραλλαγές της καρδιάς και των αγγείων Χρωμοσωμικές ανωμαλίες και γενετικά σύνδρομα Ηπατοπάθειες και διαταραχές του μεταβολισμού Σοβαρό λοιμώδες μεταδοτικό νόσημα με τα σωματικά υγρά, όπως ηπατίτιδα Β (HBV), ηπατίτιδα C (HCV), ιός του συνδρόμου ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου (HIV) Διαγνωστικές δοκιμασίες Οι ασθενείς που εντάχθηκαν στη μελέτη είχαν εξεταστεί στο Παιδοπνευμονολογικό Τμήμα της Παιδιατρικής Κλινικής, είτε λόγω επεισοδίων συριγμού είτε για άλλη αιτία, οπότε και εντάσσονταν στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 15). Σε κάθε ασθενή πραγματοποιήθηκε λήψη ιστορικού και πλήρης φυσική εξέταση και συμπληρώθηκε ο προβλεπόμενος ιατρικός φάκελος. Οι γονείς του παιδιού ενημερώνονταν πλήρως για την ένταξη στη μελέτη και συμπλήρωναν το έντυπο συγκατάθεσης. Σε κάθε παιδί ολοκληρώθηκε η διαγνωστική προσπέλαση με τις απαραίτητες εξετάσεις, όπως σπιρομέτρηση και μέτρηση εκπνεομένου μονοξειδίου του αζώτου (FeNO). Μετά ακολούθησε η συλλογή του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα (Exhaled Breathe Condensate - EBC). Για τη συλλογή του EBC χρησιμοποιήθηκε η συσκευή RTube, όπως περιγράφεται παρακάτω. Το συμπύκνωμα στη συνέχεια αποθηκεύτηκε στους -80 ο C μέχρι να γίνει η τελική του επεξεργασία. Η επεξεργασία και ανάλυση του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα (EBC) έγινε με τη βοήθεια φασματογράφου πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR).

78 78 Όλγα Κ. Λάγιου Παιδοπνευμονολογικό ιατρείο Κριτήρια αποκλεισμού NAI Απόρριψη ασθενούς OXI Ιστορικό Λειτουργικές δοκιμασίες Συλλογή συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα Μετρήσεις με φασματογράφο NMR Εικόνα 15. Διαδικασία διαγνωστικών δοκιμασιών παιδιών της μελέτης. Σπιρομέτρηση Στα παιδιά προσχολικής ηλικίας έχουν δοκιμαστεί τεχνικές, όπως οι μετρήσεις κατά τη διάρκεια του αναπνευστικού ρυθμού, όπου δεν απαιτείται συνεργασία του παιδιού κατά τη μέτρηση. Πλέον υπάρχουν διεθνείς οδηγίες για τις λειτουργικές δοκιμασίες του αναπνευστικού, από την ATS (American Thoracic Society), την ERS (European Respiratory Society) και την BTS (British Thoracic Society) (120). Σε παιδιά προσχολικής και σχολικής ηλικίας, η σπιρομέτρηση είναι η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη εξέταση για την εκτίμηση της λειτουργικότητας του αναπνευστικού συστήματος. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει την αξία της σπιρομέτρησης σε παιδιά προσχολικής ηλικίας (αποδοτική εξέταση σε ποσοστό από 47% ως και 92%), ειδικά με τη χρήση κατάλληλου λογισμικού. Χαμηλότερα είναι τα ποσοστά σε παιδιά < 4 ετών (κάτω από 21%), καθώς και σε παιδιά με νευρολογικά νοσήματα και αναπτυξιακές ανωμαλίες. Στη μελέτη μας χρησιμοποιήθηκε η τυπική εξέταση σπιρομέτρησης για ενήλικες και παιδιά > 6 ετών με το σπιρόμετρο SpiroUSB (CareFusion, UK). Σε αυτή ο ασθενής αρχικά εισέπνεε μέχρι το επίπεδο της ολικής πνευμονικής χωρητικότητας (Total Lung Capacity - TLC), και έπειτα εξέπνεε βίαια και για τουλάχιστον 3 sec, για παιδιά < 10 ετών, ή για τουλάχιστον 6 sec, για παιδιά > 10 ετών, και έως το επίπεδο του υπολειπόμενου όγκου (Residual Volume -

79 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 79 RV). Με αυτή τη δοκιμασία ήταν δυνατόν να μετρηθούν με ακρίβεια οι τιμές του εκπνεόμενου όγκου αέρα κατά το πρώτο sec της βιαιότατης και βαθύτατης εκπνοής (Forced Expiratory Volume in first sec - FEV1) και η ζωτική χωρητικότητα κατά τη βιαιότατη και βαθύτατη εκπνοή (Forced Vital Capacity - FVC). Για να είναι σωστός ο χειρισμός, έπρεπε να είναι βίαιη η αρχή της εκπνοής, ώστε να μετρηθεί με ακρίβεια η FEV1. Η σπιρομέτρηση επαναλήφθηκε για 3 τουλάχιστον φορές και κρατήθηκαν οι 2 μεγαλύτερες τιμές της FVC και της FEV1, οι οποίες δεν είχαν διαφορά > 150 ml μεταξύ τους (141). Μέτρηση FeNO Το εκπνεόμενο μονοξείδιο του αζώτου (FeNO) θεωρείται ότι είναι ο πιο αξιόπιστος δείκτης στον εκπνεόμενο αέρα για την εκτίμηση της ηωσινοφιλικής φλεγμονής των αεραγωγών. Επομένως, παίζει σημαντικό ρόλο στην εκτίμηση και την παρακολούθηση ασθενών με άσθμα, στην εκτίμηση ασθενών με χρόνιο βήχα και στη διαφορική διάγνωση του άσθματος από τη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (142). Όσον αφορά στο άσθμα, είναι χρήσιμος δείκτης για την παρακολούθηση της θεραπείας με εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή, καθώς όταν η θεραπεία ελέγχει επαρκώς το άσθμα, τότε αναμένεται να υπάρχει και μείωση στην τιμή του FeNO. Αντίθετα, εάν η θεραπεία δεν ελέγχει επαρκώς το άσθμα, τότε η τιμή του FeNO δε φαίνεται να σημειώνει μείωση. Επομένως, μπορεί να εξεταστεί το ενδεχόμενο για αύξηση της αγωγής (143) (144) (145). Για τη μέτρηση του μονοξειδίου του αζώτου στον εκπνεόμενο αέρα (FeNO) στα παιδιά της μελέτης χρησιμοποιήθηκε η συσκευή NOBreath (Bedfont, UK). Η δειγματοληψία έγινε με την προβλεπόμενη διαδικασία: ο ασθενής εισέπνεε βαθιά μέχρι το επίπεδο της ολικής πνευμονικής χωρητικότητας (Total Lung Capacity - TLC) και στη συνέχεια εξέπνεε αργά και σταθερά μέσα από τη συσκευή και για χρόνο 10 sec. Έτσι, έγινε δυνατή η μέτρηση του FeNO στον εκπνεόμενο αέρα (146).

80 80 Όλγα Κ. Λάγιου API Score Ο προγνωστικός δείκτης για το άσθμα (Asthma Predictive Index - API score) είναι ένας κλινικός δείκτης που εκτιμά την πιθανότητα ένας παιδιατρικός ασθενής να αναπτύξει άσθμα κατά την παιδική ηλικία. Χρησιμοποιείται κυρίως σε παιδιά και βρέφη μικρότερα των δύο ετών τα οποία εμφανίζουν επεισόδια συριγμού. Το σκορ αυτό έχει καλή ειδικότητα, αλλά μειωμένη ευαισθησία, επομένως δεν είναι αποδοτικό στο screening ασθενών που είναι πιθανό να αναπτύξουν άσθμα (147). Η εφαρμογή του δείκτη αφορά παιδιά κάτω των 3 ετών. Στον Πίνακας 4 παρουσιάζονται τα κριτήρια που λαμβάνονται υπόψη στο API score. Θετικός είναι ο δείκτης εάν ισχύει: Με αυστηρά κριτήρια: 3 επεισόδια συριγμού ανά έτος ΚΑΙ 1 από τα μείζονα κριτήρια Ή 2 από τα ελάσσονα κριτήρια Με χαλαρά κριτήρια: <3 επεισόδια συριγμού ανά έτος ΚΑΙ 1 από τα μείζονα κριτήρια Ή 2 από τα ελάσσονα κριτήρια Πίνακας 4. Κριτήρια εφαρμογής του API score. Μείζονα κριτήρια Γονιός με άσθμα Ασθενής με έκζεμα Ελάσσονα κριτήρια Ασθενής με αλλεργική ρινίτιδα Επεισόδια συριγμού που δε σχετίζονται με λοιμώξεις Ηωσινοφιλία ( 4% στο περιφερικό αίμα) Παιδιατρικοί ασθενείς που έχουν θετικό σκορ, μπορεί να θεραπευτούν με εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή ή/και βρογχοδιασταλτικά, καθώς είναι πιθανό τα επεισόδια συριγμού που εμφανίζουν να προοικονομούν την εμφάνιση άσθματος. Το 59% των παιδιών με θετικό δείκτη βάσει των χαλαρών κριτηρίων είχε τελικά άσθμα στη σχολική ηλικία (στην ηλικία των 15 ετών), ενώ το 76% των παιδιών με θετικό δείκτη βάσει των αυστηρών κριτηρίων είχε τελικά άσθμα στη σχολική ηλικία (στην ηλικία των 15 ετών) (148). Δειγματοληψία Exhaled Breathe Condensate (EBC) Η συλλογή του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα (Exhaled Breathe Condensate - EBC) έγινε με τη βοήθεια της συσκευής RTube (Respiratory Research, USA). Η συσκευή αυτή έχει σχεδιαστεί, ώστε να είναι

81 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 81 εύκολη η λήψη του δείγματος για χρήση σε κλινικές μελέτες. Η δειγματολήψια έγινε με τρόπο μη-επεμβατικό με τη φορητή συσκευή, η οποία είναι μιας χρήσης (Εικόνα 16). Συμπύκνωμα Βαλβίδα Επιστόμιο Εικόνα 16. Σχηματική απεικόνιση του RTube που χρησιμοποιήθηκε για τη συλλογή των δειγμάτων. Η διαδικασία συλλογής του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα (EBC) συνοψίζεται στα παρακάτω 2 βήματα. Βήμα 1: Συμπύκνωση του εκπνεόμενου αέρα μέσα στο σωλήνα. Κατά τη δειγματοληψία ο ασθενής αναπνέει 7-10 λεπτά μέσα από το επιστόμιο με ήρεμες αναπνοές, ενώ ο σωλήνας έχει φορά προς τα πάνω (κόκκινο βέλος με ένδειξη UP). Για να είναι πιο αποδοτική η συλλογή του συμπυκνώματος και για να δημιουργηθούν κατάλληλες συνθήκες για τη συμπύκνωση, γύρω από το σωλήνα τοποθετείται ένα ψυχόμενο κάλυμμα (θερμοκρασίας -4 ο C), το οποίο ήταν τοποθετημένο στο ψυγείο έως τη στιγμή της συλλογής. Η ενσωματωμένη βαλβίδα μονής ροής κατευθύνει τον αέρα μέσα στο σωλήνα, όπου ψύχεται και οι υδρατμοί επικάθονται στα τοιχώματά του από πολυπροπυλένιο. Αφού ο ασθενής αναπνεύσει για τον προβλεπόμενο χρόνο μέσα από τη συσκευή, αφαιρείται και απορρίπτεται το επιστόμιο. Συνήθως ο όγκος του συμπυκνώματος που λαμβάνεται είναι περίπου 100 μl/min στα παιδιά και 200 μl/min στους ενήλικες, ενώ αναπνέουν σε ηρεμία. Γενικά, 2 λεπτά αναπνοής μέσω από το σύστημα είναι αρκετά για να ληφθεί το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Ωστόσο, στη μελέτη μας ο χρόνος αναπνοής μέσα από το σύστημα ήταν 7-10 λεπτά, ώστε να υπάρχει το μέγιστο διαθέσιμο δείγμα για τις μετρήσεις μας. Βήμα 2: Χρήση του μεταλλικού εμβόλου και συλλογή δείματος. Στη συνέχεια, προκειμένου να γίνει η συλλογή του δείγματος μέσα από τη συσκευή, εισάγεται ένα αλουμινένιο έμβολο, το οποίο προωθεί τη βαλβίδα προς τα πάνω. Έτσι, οι συμπυκνωμένοι ατμοί στα τοιχώματα του πλαστικού σωλήνα πιέζονται προς τα πάνω και συγκεντρώνεται μία ποσότητα 0,5-1,5 ml συμπυκνώματος (EBC) στην πάνω άκρη του σωλήνα, τα οποία συλλέγονται με μία σύριγγα και αποθηκεύονται μέχρι να γίνει η τελική ανάλυση του δείγματος.

82 82 Όλγα Κ. Λάγιου Αποθήκευση δειγμάτων Τα δείγματα του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου άερα (EBC) που ελήφθησαν από το κάθε παιδί αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη στους -80 ο C και φυλάχθηκαν μέχρι να γίνει η ανάλυση. Δεν έγινε αναγραφή ονομάτων ασθενών επί των δειγμάτων, αλλά μόνο ο αναγνωριστικός κωδικός αριθμός για τον κάθε ασθενή στη μελέτη (ID ασθενούς). Οργανολογία NMR Τα NMR πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Μοριακής Προσομοίωσης και Φασματοσκοπίας NMR του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Το όργανο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Bruker Avance III HD. Οι μετρήσεις έγιναν σε συνθήκες θερμοκρασίας T=300K και καταγράφηκαν από τον Bruker Avance III HD φασματογράφο NMR στα 700MHz (Εικόνα 17). Το όργανο ήταν εξοπλισμένα με TCI cryoprobes ειδικά σχεδιασμένα για την ανίχνευση των πυρήνων του 1 H και του 13 C. Εικόνα 17. Σύστημα NMR Bruker Avance III HD στα 700MHz.

83 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 83 Μεθοδολογία NMR για τον προσδιορισμό μεταβολιτών στο EBC Για τον προσδιορισμό των μεταβολιτών στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα (EBC) αναπτύχθηκε αναλυτική μεθοδολογία με τη χρήση πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η μεθοδολογία περιελάμβανε τα παρακάτω στάδια: Προετοιμασία δείγματος Πειράματα NMR Επεξεργασία NMR φασμάτων Προετοιμασία δείγματος Τα δείγματα αφαιρέθηκαν από την κατάψυξη (-80 ο C), αποψύχθηκαν και έγινε προετοιμασία τους σε συνθήκες περιβάλλοντος (25 ο C). Για την εξασφάλιση της σταθερότητας του μαγνητικού πεδίου έγινε ανάμιξη 540 μl δείγματος με 60 μl D 2 O. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν 550 μl από το νέο διάλυμα σε σωλήνα 5mm του NMR. Πειράματα NMR Η συμπίεση του έντονου σήματος που προκύπτει από το συντονισμό των ατόμων 1 H του νερού επιτεύχθηκε με την τεχνική του προκορεσμού (presaturation), η οποία περιλαμβάνει την εφαρμογή ενός μακράς διάρκειας (sec) και χαμηλής ισχύος (Mw) παλμού ραδιοσυχνότητας ακολουθούμενου από έναν μη-εκλεκτικό παλμό ραδιοσυχνότητας 90 ο για τη διέγερση των επιθυμητών πυρήνων. Για τον ίδιο λόγο έγινε και χρήση της τεχνικής Watergate. Για τον προσδιορισμό των μεταβολιτών στο EBC έγινε χρήση των παρακάτω πειραμάτων NMR: 1D 1 H NMR o NOESY presat o Watergate W5 2D 1 H- 1 H NMR o J-resolution Αναλύθηκαν συνολικά 23 κλινικά δείγματα που προέρχονταν από συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα μετά από την κατάλληλη επεξεργασία που περιγράφηκε. Επιπλέον αναλύθηκαν 2 δείγματα με Water For Injection (WFI).

84 84 Όλγα Κ. Λάγιου Επεξεργασία NMR φασμάτων Η επεξεργασία των ακατέργαστων NMR δεδομένων έγινε με τη χρήση λογισμικού Bruker TopSpin 3:2 και AMIX-Viewer. Η επεξεργασία των αρχικών δεδομένων και ο μετασχηματισμός Fourier είναι απαραίτητα, ώστε τα φάσματα να είναι αναγνωρίσιμα από προγράμματα ανάλυσης φασμάτων. Επεξεργασία αποτελεσμάτων Η τελική επεξεργασία των μετρήσεων έγινε με γλώσσα προγραμματισμού R, χρησιμοποιώντας in house κώδικες (scripts). Στις πολυμεταβλητές στατιστικές τεχνικές χρησιμοποιήθηκαν η μέθοδος ανάλυσης των κύριων συνιστωσών (Principal Components Analysis - PCA) και η μέθοδος των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (Partial Least Squares - PLS). Επίσης, για τη μονομεταβλητή χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Kruskal Wallis, με επίπεδο σημαντικότητας p < 0,05. Τα δημογραφικά δεδομένα και τα στοιχεία από το λειτουργικό έλεγχο του αναπνευστικού αναλύθηκαν με SPSS v.24 (ΙΒΜ, USA). Για τη σύγκριση μέσων τιμών των συνεχών μεταβλητών χρησιμοποιήθηκε η στατιστική δοκιμασία t-test και όπου χρειαζόταν έγινε Analysis of Variance (ANOVA). Για τις μη-συνεχείς μεταβλητές χρησιμοποιήθηκε x 2 και δοκιμασία Fisher, όπου ήταν αναγκαίο.

85 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 85 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δημογραφικά στοιχεία Στη μελέτη εντάχθηκαν 23 παιδιά (17 αγόρια και 6 κορίτσια), ηλικίας μεταξύ 6-9 ετών, που εξετάστηκαν στο Παιδοπνευμονολογικό Τμήμα της Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών, στο χρονικό διάστημα από τον Ιούνιο του 2016 έως το Σεπτέμβριο του 2016 βάσει των κριτηρίων που έχουν αναφερθεί. Σε κάθε ένα από τα 23 παιδιά έγινε λήψη ιστορικού, λειτουργικός έλεγχος του αναπνευστικού βάσει του πρωτοκόλλου, που περιελάμβανε σπιρομέτρηση και μέτρηση εκπνεόμενου μονοξειδίου του αζώτου (FeNO), και συλλογή του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα (EBC). Στους παρακάτω πίνακες φαίνονται τα δημογραφικά στοιχεία, καθώς και στοιχεία σχετικά με σημαντικές παραμέτρους των ασθενών (αποτελέσματα σπιρομέτρησης, μέτρηση FeNO) (Πίνακας 5) (Πίνακας 6). Πίνακας 5. Δημογραφικά στοιχεία του υπό μελέτη πληθυσμού. Χαρακτηριστικό Τιμή (Mean±SD) Φύλο (Α/Κ) 17/6 Ηλικία (έτη) 8,04 ± 1,39 Ύψος (cm) 128,69 ± 11,36 Βάρος (kg) 28,52 ± 6,13 BMI (kg/m 2 ) 17,10 ± 2,44 Πίνακας 6. Σημαντικά χαρακτηριστικά από το λειτουργικό έλεγχο του αναπνευστικού του υπό μελέτη πληθυσμού. Χαρακτηριστικό Τιμή (Mean±SD) FEV 1 (l) 1,54 ± 0,34 FEV 1 (%) 98,86 ± 10,88 FVC (l) 1,72 ± 0,37 FVC (%) 92,5 ± 9,0 FEV 1/FVC 93,17 ± 9,23 FeNO (ppb) 30,15 ± 27,50 Ομάδες μελέτης Το σύνολο των 23 παιδιών χωρίστηκε σε δύο ομάδες μελέτης βάσει της ύπαρξης συριγμού μετά την ηλικία των 5 ετών. Έτσι δημιουργήθηκε η ομάδα

86 86 Όλγα Κ. Λάγιου των ασθενών (παρουσία συριγμού μετά τα 5 έτη) και η ομάδα ελέγχου (απουσία συριγμού μετά τα 5 έτη). Στον Πίνακας 7 φαίνονται τα βασικά χαρακτηριστικά των ατόμων στις δύο ομάδες. Πίνακας 7. Χαρακτηριστικά των δύο ομάδων της μελέτης. Χαρακτηριστικό Τιμή (Mean±SD) Απουσία Παρουσία p-value συριγμού (N=12) συριγμού (N=11) Φύλο (Α/Κ) 9/3 8/3 0,635 Ηλικία (έτη) 7,66 ± 1,37 8,45 ± 1,36 0,183 BMI (kg/m 2 ) 16,64 ± 2,08 17,60 ± 2,79 0,361 FEV 1 (l) 1,49 ± 0,39 1,60 ± 0,27 0,462 FEV 1 (%) 105,16 ± 9,93 92,00 ± 7,25 0,002 FVC (l) 1,61 ± 0,41 1,83 ± 0,29 0,163 FVC (%) 97,00 ± 9,93 89,00 ± 6,49 0,034 FEV 1/FVC 92,58 ± 5,07 87,45 ± 6,05 0,038 PEFR (l) 2,78 ± 0,70 3,28 ± 0,71 0,110 PEFR (%) 74,08 ± 8,96 72,54 ± 10,34 0,706 FeNO (ppb) 27,88 ± 35,17 32,20 ± 20,07 0,743 Τα παιδιά στις δύο ομάδες της μελέτης έχουν παρόμοιες ηλικίες, χαρακτηριστικό απαραίτητο για να προχωρήσουμε σε περαιτέρω συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων. Στην ομάδα των παιδιών με συριγμό (ασθενείς) η μέση ηλικία ήταν 8,4 έτη, ενώ στην ομάδα των παιδιών χωρίς συριγμό (ελέγχου) 7,6 έτη. Όσον αφορά στο δείκτη μάζας σώματος δεν παρατηρείται στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων με τους ασθενείς να έχουν 17,60 kg/m 2, ενώ τα παιδιά της ομάδας ελέγχου 16,64 kg/m 2 (p = 0,361). Συγκρίνοντας, τα σπιρομετρικά χαρακτηριστικά των δύο ομάδων, φαίνεται ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους ως προς την FEV1 με τιμές 92,00 vs 105,16 (p = 0,002), την FVC με τιμές 89,00 vs 97,00 (p = 0,034) και το λόγο FEV1/FVC με τιμές 87,45 vs 92,58 (p = 0,038). Φαίνεται, λοιπόν, ότι τα παιδιά στην ομάδα των ασθενών έχουν χαμηλότερες σπιρομετρικές τιμές συγκρινόμενα με τα παιδιά της ομάδας ελέγχου, όπως ήταν αναμενόμενο. Τέλος, όσον αφορά στη μέτρηση του μονοξειδίου του αζώτου (FeNO), δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων, μέση τιμή 32,20 ppb στους ασθενείς και 27,88 στους υγιείς (p = 0,743).

87 ΔΠΜΣ Ιατρική Χημεία 87 API Score Επίσης, έγινε εκτίμηση της δυνατότητας του API score να προβλέψει με ακρίβεια την πιθανότητα εμφάνισης συριγμού μετά την ηλικία των 5 ετών. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακας 8. Η ευαισθησία του API ήταν 36,4%, η ειδικότητα 66,7%, η θετική πιθανοφάνεια 1,09, η αρνητική πιθανοφάνεια 0,95 και η συνολική ακρίβεια 52,2%. Επομένως, το API score δε θα μπορούσε να προβλέψει την παρουσία συριγμού στα παιδιά της μελέτης μας. Πίνακας 8. Παιδιά με συριγμό και API score. Απουσία Παρουσία Σύνολο συριγμού συριγμού API αρνητικό API θετικό Σύνολο Επικύρωση της μεθόδου NMR Για να ελέγξουμε τη μετρητική ικανότητα του συστήματος NMR όσον αφορά το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα (EBC), αρχικά έγινε δοκιμή με δείγμα EBC που είχε ληφθεί από φυσιολoγικούς ενήλικες. Έτσι, επιβεβαιώθηκε η δυνατότητα να εισαχθεί και να μετρηθεί δείγμα EBC από το φασματογράφο NMR, και έπειτα ακολούθησαν οι μετρήσεις στα δείγματα EBC των παιδιών. Συνολικό φάσμα NMR Από τη συνολική επεξεργασία των δειγμάτων προέκυψαν τα ακόλουθα φάσματα NMR, τα οποία έχουν ταυτοποιηθεί στη φασματική περιοχή 4,90 έως 0,00 ppm (Εικόνα 18) (Εικόνα 19). Η διόρθωση πραγματοποιήθηκε ως προς τη απλή κορυφή του εσωτερικού προτύπου DSS (4,4-διμέθυλοl-4-σιλανοπεντανο- 1-σουλφονικό) στα 0,00 ppm.

88 88 Όλγα Κ. Λάγιου Εικόνα 18. 1D 1 H NMR NOESY φάσμα. * DSS, Black: wheezing (+), Blue: wheezing (-), Green: Adults, Red: water for injection Εικόνα 19. 1D 1 H NMR Watergate W5. * DSS, Black: wheezing (+), Blue: wheezing (-), Green: Adults, Red: water for injection Αποτελέσματα NMR για το EBC Μετά από την ανάλυση στο φασματογράφο NMR προκύπτει η ανίχνευση μεταβολιτών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Έπειτα έγινε