ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Φαρμακοκινητικός και φαρμακοδυναμικός χαρακτηρισμός μιας μεταλλαγμένης μορφής της απολιποπρωτεΐνης Ε με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες Αγγελική Θ. Λαμπροπούλου Φαρμακοποιός Επιβλέπων καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος, Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας Πάτρα, 2012

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία παρουσιάστηκε επιτυχώς Από την Αγγελική Θ. Λαμπροπούλου Α.Μ την 24 η Σεπτεμβρίου 2012 Η τριμελής επιτροπή Κυπραίος Η. Κυριάκος (Επιβλέπων), Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήματος Ιατρικής, Σχολής Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Χαμπαίος Ιωάννης (Μέλος), Επίκουρος Καθηγητής Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας, Τμήματος Ιατρικής, Σχολής Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Παπαχρήστου Διονύσιος (Μέλος), Επίκουρος Καθηγητής Ανατομίας-Ιστολογίας- Εμβρυολογίας Τμήματος Ιατρικής, Σχολής Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η μεταπτυχιακή αυτή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά την περίοδο , στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Πρόκειται για μια μελέτη η οποία στοχεύει στον φαρμακοδυναμικό και φαρμακοκινητικό χαρακτηρισμό μιας μεταλλαγμένης μορφής της απολιποπρωτεϊνης Ε με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά, τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κύριο Κυπραίο Κυριάκο, για την άψογη συνεργασία που είχαμε και την ευκαιρία που μου έδωσε να δουλέψω ερευνητικά στο εργαστήριό του με ένα τόσο ενδιαφέρον και καινοτόμο θέμα. Τον ευχαριστώ επίσης, για την υπομονετική και γεμάτη κατανόηση καθοδήγησή του στα πρώτα μου βήματα στον χώρο της έρευνας, καθώς και για τη συνεχή ενθάρρυνσή του και τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις του. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κύριο Χαμπαίο Ιωάννη, Επίκουρο καθηγητή Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας και τον κύριο Παπαχρήστου Διονύσιο, Επίκουρο Καθηγητή Ανατομίας Ιστολογίας Εμβρυολογίας τόσο για την τιμή που μου έκαναν να συμμετάσχουν ως μέλη στην τριμελή μου επιτροπή, όσο και για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους μεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες του εργαστηρίου Φαρμακολογίας καθώς και των εργαστηρίων Βιοχημείας και Μικροβιολογίας για την ουσιαστική βοήθειά τους. 3

4 Φαρμακοκινητικός και φαρμακοδυναμικός χαρακτηρισμός μιας μεταλλαγμένης μορφής της απολιποπρωτεΐνης Ε με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες Αγγελική Θ. Λαμπροπούλου ΠΕΡΙΛΗΨΗ Φυσιολογικά επίπεδα της αγρίου τύπου απολιποπρωτεϊνης Ε ( apoe) στο πλάσμα διαμεσολαβούν στην κάθαρση των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών ενώ υψηλότερα επίπεδα από τα φυσιολογικά προκαλούν υπερτριγλυκεριδαιμία. Αυτή η ιδιότητα της αγρίου τύπου apoe μειώνει σημαντικά την θεραπευτική της αξία ως ένα πιθανό βιολογικό φάρμακο για την αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας. Πρόσφατα, έχει δημιουργηθεί και μελετηθεί μια μεταλλαγμένη μορφή της apoe, apoe4 [ L261A, W264A, F265A, L268A, V269A ] (apoe4mut1) με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Συγκεκριμένα, αυτή η μεταλλαγμένη μορφή μπορεί να φέρει τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης σε φυσιολογικές τιμές χωρίς να προκαλέσει υπερτριγλυκεριδαιμία ακόμα και όταν υπερεκφράζεται. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε φαρμακοδυναμική και φαρμακοκινητική ανάλυση της apoe4mut1 σε πειραματόζωα. Με γονιδιακή μεταφορά μέσω ιού σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στον LDL υποδοχέα (LDLr -/- ) και σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στην apoe (apoe -/- ), δείχθηκε οτι η δράση της apoe4mut1 ( μείωση της χοληστερόλης ) εξαρτάται από την έκφραση ενός λειτουργικού κλασσικού LDL υποδοχέα. Εφάπαξ έγχυση της apoe4mut1 συνδεδεμένης με λιποσώματα σε apoe -/- ποντίκια που ήταν σε δίαιτα δυτικού τύπου για 6 εβδομάδες αποκάλυψε οτι η εξωγενώς συντιθέμενη apoe4mut1 διατηρεί άθικτη την ικανότητά της να κανονικοποιεί τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης αυτών των ποντικιών με μια μέγιστη φαρμακολογική απόκριση που παρατηρείται σε μόλις 10 ώρες μετά την έγχυση. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός οτι τα επίπεδα χοληστερόλης του πλάσματος παρέμειναν σημαντικώς μειωμένα για τις επόμενες 24 ώρες μετά την έγχυση της apoe4mut1- λιποσώματα. Μετρήσεις συγκεντρώσεων της apoe έδειξαν οτι η apoe4mut1 στην μορφή των πρωτεολιποσωμάτων που 4

5 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχει χρόνο ημίσειας ζωής 15.8 h. Τα δεδομένα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα οτι η καθαρή apoe4mut1 μπορεί να αποτελέσει ένα νέο υποψήφιο φάρμακο για την άμεση αντιμετώπιση της υπερχοληστερολαιμίας σε άτομα που εκφράζουν έναν λειτουργικό LDL υποδοχέα. 5

6 Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of a recombinant apolipoprotein E variant apoe4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A] with improved biological properties Angeliki Th. Lampropoulou ABSTRACT Physiological levels of wild-type (wt) apolipoprotein E (apoe) in plasma mediate the clearance of cholesterol-rich atherogenic lipoprotein remnants while higher than normal plasma apoe concentrations fail to do so and trigger hypertriglyceridemia. This property of wt apoe reduces significantly its therapeutic value as a potential biological drug for dyslipidemia. Recently, we reported the generation of a recombinant apoe variant, apoe4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A] (apoe4mut1) with improved biological functions. Specifically, this variant can normalize high plasma cholesterol levels without triggering hypertriglyceridemia, even at supraphysiological levels of expression. In the present study we performed pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoe4mut1 in experimental mice. Using adenovirus-mediated gene transfer in LDL receptor deficient (LDLr -/- ) and apoe deficient (apoe -/- ) mice, we show that the cholesterol lowering potential of apoe4mut1 is dependent on the expression of a functional classical LDLr. Bolus infusion of apoe4mut1-containing proteoliposomes in apoe -/- mice fed western-type diet for 6 weeks indicated that exogenously synthesized apoe4mut1 maintains intact its ability to normalize the high cholesterol levels of these mice with a maximum pharmacological effect obtained at only 10 hours post-treatment. Interestingly, plasma cholesterol levels remained significantly reduced even 24 hours following intravenous infusion of apoe4mut1 proteoliposomes. Measurements of plasma apoe levels indicated that apoe4mut1 in the form of proteoliposomes used in the study has a halflife of 15.8 h. Our data suggest that purified apoe4mut1 may be an attractive new candidate for the acute correction of hypercholesterolemia in subjects expressing functional LDL receptor. 6

7 Πίνακας Περιεχομένων ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 4 ABSTRACT ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Χυλομικρά VLDL λιποπρωτεΐνες IDL λιποπρωτεΐνες LDL λιποπρωτεΐνες HDL λιποπρωτεΐνες Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Διατροφικά λιπίδια ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Απολιποπρωτεΐνη Ε ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΑΣΗ ΤΗΣ ΣΤΕΦΑΝΙΑΙΑΣ ΝΟΣΟΥ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΕΜΒΑΣΕΙΣ Δυσλιπιδαιμία και ανάπτυξη αθηρωματικής νόσου Υφιστάμενες φαρμακολογικές παρεμβάσεις ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ ΑΡΟΕ ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Απόψυξη κυττάρων

8 2.1.2 Τρυψινοποίηση και ανακαλλιέργεια κυττάρων Ψύξη κυττάρων ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΤΙΤΛΟΔΟΤΗΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΑΔΕΝΟΙΩΝ Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Επιμόλυνση τριπλών φλασκών με τους αδενοϊούς AdGFP, AdGFP-E4wt, AdGFP-E4mut Συλλογή των μολυσμένων με τους ιούς κυττάρων Καθαρισμός των αδενοϊών Τιτλοδότηση αδενοϊών IN VITRO ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΓΡΙΟΥ ΤΥΠΟΥ APOE4 ΚΑΙ ΤΗΣ APOE4mut1 ΣΕ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ HTB Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE Electrophoresis) Χρώση πρωτεϊνών ακινητοποιημένων σε ακρυλαμίδιο με coomassie stain Προσδιορισμός της αγρίου τύπου ApoE4 και της ApoE4mut1 με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης κατά Western (Western blotting) ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Χειρισμοί σε πειραματόζωα ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΜΕ ΥΠΕΡΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ ΔΙΑΒΑΘΜΙΣΜΕΝΗΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ ΔΙΑΠΙΔΥΣΗ (DIALYSIS) ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕ FPLC ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης Προσδιορισμός επιπέδων ελεύθερης χοληστερόλης Προσδιορισμός επιπέδων φωσφολιπιδίων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΜΕ ΣΥΝΔΕΣΗ ΕΝZΥΜΟΥ (ELISA)

9 2.10 ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ APOE4mut1 ΠΡΩΤΕΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η ΕΚΦΡΑΣΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ LDL R ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΟΥΜΕΝΗ ΑΠΟ ΤΗΝ APOE4mut1 ΚΑΘΑΡΣΗ ΤΩΝ ΑΘΗΡΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΗΣ APOE4mut1 ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ HTB-13 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ APOE4mut1-ΠΡΩΤΕΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΕΦΑΠΑΞ ΕΝΔΟΦΛΕΒΙΑ ΕΓΧΥΣΗ ΤΗΣ ΚΑΘΑΡΗΣ APOE4mut1 ΣΕ APOE -/- ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΠΟΥ ΤΡΕΦΟΝΤΑΙ ΜΕ ΔΙΑΙΤΑ ΔΥΤΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

10 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Η μεταφορά των λιπιδίων στην κυκλοφορία καθώς και η ανταλλαγή τους μεταξύ των ιστών επιτυγχάνεται με την οργάνωσή τους σε μακρομοριακά συσσωματώματα λιπιδίων και πρωτεϊνών με πολική επιφάνεια και υδρόφοβο πυρήνα. Τα πρωτεϊνικά συστατικά των λιποπρωτεϊνών ονομάζονται απολιποπρωτεΐνες. Οι λιποπρωτεΐνες δομικά αποτελούν σφαιρικά σωματίδια, που ο πυρήνας τους περιέχει υδρόφοβα λιπίδια, ενώ οι πρωτεΐνες διατάσσονται στην επιφάνειά τους [1], (Εικόνα 1.1). Τα πρωτεϊνικά στοιχεία αυτών των μακρομοριακών συσσωματωμάτων έχουν δύο ρόλους: διαλυτοποιούν τα υδρόφοβα λίπη και περιέχουν σήματα κυτταρικής στόχευσης. Οι λιποπρωτεΐνες είναι λοιπόν σταθερές κολλοειδείς μορφές χάρη στις οποίες μεταφέρονται στo αίμα τα αδιάλυτα υδρόφοβα λιπίδια. Οι διαφορές στη σύσταση των λιποπρωτεϊνών σε πρωτεΐνες και λιπίδια τις κάνει να διαφέρουν σε μέγεθος και πυκνότητα. Πιο συγκεκριμένα, η περιεκτικότητα σε λιπίδια είναι ανάλογη με το μέγεθος και αντιστρόφως ανάλογη με την πυκνότητα που χαρακτηρίζει τα σωματίδια των λιποπρωτεϊνών. Επίσης λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε λιπίδια έχουν μικρότερη πυκνότητα από τις άλλες πρωτεΐνες. Το γεγονός αυτό επιτρέπει τόσο το διαχωρισμό τους από τα υπόλοιπα μόρια όσο και μεταξύ τους με μεθόδους υπερφυγοκέντρησης και ηλεκτροφόρησης [1]. Εικόνα 1.1. Σχηματική αναπαράσταση της τυπικής δομής των λιποπρωτεϊνών. Με τις παραπάνω μεθόδους και σύμφωνα με την αυξανόμενη πυκνότητα ταξινομούνται ως εξής: χυλομικρά, λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας 10

11 (VLDL), λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL), λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL) Χυλομικρά Τα χυλομικρά είναι μεγαλομοριακά συμπλέγματα που αποτελούνται κατά 98% από λιπίδια. Περιέχουν κυρίως τριακυλογλυκερόλες (τριγλυκερίδια) και μικρές ποσότητες χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων. Η πυκνότητα τους είναι μικρότερη από 0.94g/mL διότι οι τριακυλογλυκερόλες απαρτίζουν το ~99% του περιεχομένου τους. Η απολιποπρωτεΐνη Β-48, μια μεγάλη πρωτεΐνη (240 kda), σχηματίζει ένα αμφίφιλο σφαιρικό κέλυφος, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη, γύρω από το λιποσφαίριο. Τα χυλομικρά διαμεσολαβούν στη μεταφορά των διατροφικών λιπιδίων από το έντερο προς τους περιφερικούς ιστούς. Στην κυκλοφορία μεταβολίζονται μερικώς από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση, που βρίσκεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών και ακολούθως καταβολίζονται από ηπατικές λιπάσες σε υπολείμματα χυλομικρών, που προσλαμβάνονται από το ήπαρ. Εάν ο μηχανισμός ηπατικής κάθαρσης είναι ανεπαρκής τότε τα κατάλοιπα αθροίζονται στο αίμα και εκδηλώνεται μια μορφή λιπιδικής διαταραχής, γνωστή ως Υπερλιποπρωτεϊναιμία Τύπου ΙΙΙ [1] VLDL λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας είναι μεγάλα σωμάτια με διάμετρο nm και η πυκνότητα κυμαίνεται στα επίπεδα g/ml. Η λιπιδική τους σύσταση τους είναι: 45-65% τριγλυκερίδια, 15-20% φωσφολιπίδια και 20-30% χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιημένη) [2]. Τα σωμάτια αυτά συντίθενται και εκκρίνονται από το ήπαρ κυρίως κατά την περίοδο νηστείας και η σύνθεσή τους εξαρτάται από τις ανάγκες των περιφερικών ιστών, στους οποίους και ανακατανέμονται [2]. Τα σωμάτια αυτά σταθεροποιούνται από δύο απολιποπρωτεΐνες: την απολιποπρωτεΐνη Β-100 και την απολιποπρωτεΐνη Ε IDL λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας προκύπτουν από τον καταβολισμό των VLDL. Η πυκνότητά τους κυμαίνεται στα επίπεδα g/ml. Η αύξηση της πυκνότητας οφείλεται στην υδρόλυση των τριγλυκεριδίων που υπάρχουν σε αφθονία στα VLDL. Τα σωμάτια αυτά που είναι πλούσια σε εστέρες χοληστερόλης, έχουν δύο 11

12 προορισμούς: Τα μισά από αυτά μεταφέρουν τα λιπίδια στο ήπαρ και σε άλλους περιφερικούς ιστούς για περαιτέρω επεξεργασία και τα άλλα μισά μετατρέπονται με την αφαίρεση περισσότερων τριακυλογλυκερολών σε λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας LDL [2] LDL λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας προκύπτουν από τον περαιτέρω καταβολισμό των IDL και αποτελούν τον κύριο φορέα χοληστερόλης στο αίμα. Αυτό το σωμάτιο λιποπρωτεΐνης έχει διάμετρο 22 nm και πυκνότητα που κυμαίνεται στα επίπεδα g/ml. Περιέχει έναν πυρήνα περίπου 1500 εστεροποιημένων μορίων χοληστερόλης. Αυτός ο εξαιρετικά υδρόφοβος πυρήνας περιβάλλεται από ένα κέλυφος από φωσφολιπίδια και μη εστεροποιημένη χοληστερόλη. Το κέλυφος περιέχει επίσης ένα μοναδικό αντίγραφο της απολιποπρωτεΐνης Β-100, το οποίο αναγνωρίζεται από τα κύτταρα-στόχους. Κύριος ρόλος των LDL είναι να μεταφέρουν χοληστερόλη από το ήπαρ στα κύτταρα των περιφερικών ιστών για την εξυπηρέτηση των βιοσυνθετικών αναγκών τους και να ρυθμίζουν τη de novo σύνθεση της χοληστερόλης αλλά και στεροειδών ορμονών σε αυτούς τους ιστούς HDL λιποπρωτεΐνες Η HDL είναι ένα μείγμα λιποπρωτεϊνών, των οποίων οι πυκνότητες ποικίλουν από 1,063 ως 1,21 g/ml [3]. Η λιπιδική σύστασή της είναι αυτή που καθορίζει το σχήμα της, το οποίο θα είναι σφαιρικό ή δισκοειδές και το οποίο ενδεχομένως επηρεάζει τη λειτουργικότητα του μορίου [4]. Η ώριμη σφαιρική HDL περιέχει 45-55% απολιποπρωτεΐνες, 26-32% φωσφολιπίδια, 15-20% εστεροποιημένη χοληστερόλη, 3-5% ελεύθερη χοληστερόλη, και περίπου 5% τριγλυκερίδια. Ποσοτικές και ποιοτικές διαφορές των λιπιδίων, των πρωτεϊνών και των ενζύμων των HDL έχουν ως αποτέλεσμα την ύπαρξη διαφόρων κλασμάτων που διαφέρουν στο σχήμα, στην πυκνότητα, στο μέγεθος και στο φορτίο. Με υπερφυγοκέντρηση διακρίνονται δύο κλάσματα HDL: οι HDL 2 με πυκνότητα 1,063 1,125 g/ml και οι HDL 3 με πυκνότητα 1,125 1,210 g/ml [5], (Πίνακας 1-1). 12

13 Ονομασία HDL 3 (αριθμός μορίων ανά σωματίδιο) HDL 2 (αριθμός μορίων ανά σωματίδιο) Φωσφολιπίδια Χοληστερόλη (ελεύθερη) Χοληστερόλη (εστέρες) Τριγλυκερίδια 9 18 ApoA-I 3 4 ApoA-IΙ 1 1 Πίνακας 1-1. Ποιοτική και ποσοτική σύσταση των HDL σωματιδίων. Στη συνέχεια τα σωματίδια της HDL διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους, με ηλεκτροφόρηση διαβάθμισης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες [6]. Η HDL 2 υποδιαιρείται σε δύο υποπληθυσμούς: HDL 2a (1,1 1,125 g/ml) και HDL 2b (1,063 1,1 g/ml). Με παρόμοιο τρόπο η HDL 3 υποδιαιρείται σε τρεις υποπληθυσμούς: HDL 3a (1,125 1,147 g/ml), HDL 3b (1,147 1,167 g/ml) και HDL 3c (1,167 1,21 g/ml). Όταν διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά σε πήκτωμα αγαρόζης, οι HDL 2 και οι HDL 3 μετακινούνται στη θέση της α-λιποπρωτεΐνης. Οι πρόδρομες μορφές της HDL στερούνται του κεντρικού πυρήνα και έχουν προ-β ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Τα προ-β HDL σωματίδια είναι είτε δισκοειδή σύμπλοκα της apoa-i με φωσφολιπίδια και ελεύθερη χοληστερόλη είτε μονομοριακή απολιπιδιωμένη apoa-i. Ένα ποσοστό 5-15% της apoa-i στο ανθρώπινο πλάσμα σχετίζεται με σωματίδια που παρουσιάζουν προ-β ηλεκτροφορητική κινητικότητα [7]. Με ηλεκτροφόρηση σε τζελ πολυακρυλαμιδίου, οι προ-β μορφές μπορούν να διαχωριστούν σε προ-β-1, προ-β-2 και προ-β-3. Υπάρχουν επίσης σωματίδια της HDL με μοναδική απολιποπρωτεΐνη την apoe ή την apoa-iv με γ ή προ-β κινητικότητα. 13

14 Τα ώριμα σφαιρικά σωματίδια τα οποία και αποτελούν την πλειοψηφία των HDL στο πλάσμα, παρουσιάζουν α ηλεκτροφορητική κινητικότητα και διακρίνονται σε α-1, α- 2, α-3 και α-4 [8]. Ένας μικρότερος υποπληθυσμός των α-hdl αποτελείται από μεγάλα σφαιρικά σωματίδια που περιέχουν apoe και φωσφολιπίδια. Η κύρια απολιποπρωτεΐνη της HDL είναι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i), η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση και στη λειτουργικότητα της HDL. Απουσία της apoa-i η κλασσική HDL δεν σχηματίζεται [9]. Επίσης ελλείμματα στο καρβοξυτελικό άκρο της αποτρέπουν τη λιπιδίωσή της γεγονός που παρεμποδίζει το πρώτο στάδιο βιογένεσης της HDL [10]. Η ώριμη πολυπεπτιδική αλυσίδα της apoa-i αποτελείται από 243 αμινοξέα. Περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες 22 και 11 αμινοξέων, οι οποίες είναι οργανωμένες σε αμφιπαθείς α-έλικες. Το υδρόφιλο τμήμα της έλικας αλληλεπιδρά με την υδατική φάση, ενώ το υδροφοβικό, μη πολικό λιπιδικό τμήμα βρίσκεται προς το εσωτερικό του μορίου. Η χαλαρή διάταξη των α- ελίκων επιτρέπει τη γρήγορη αλληλεπίδραση των εκτιθέμενων υδροφοβικών περιοχών της πρωτεΐνης με το λιπίδιο. Έχουν προταθεί δύο κύρια μοντέλα που περιγράφουν τους τρόπους πρόσδεσης της apoa-i στα δισκοειδή και σφαιρικά σωματίδια HDL. Όσον αφορά στο μοντέλο μορφής ζώνης (Εικόνα 1.2-Β), δύο μόρια apoα-ι προσδένονται γύρω από μια δισκοειδή διπλοστιβάδα 160 λιπιδίων, μέσω υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων [11]. Η apoa-i πραγματοποιεί τρεις πλήρεις στροφές σε κάθε 11 επαναλήψεις, δίνοντας έτσι λειτουργική σημασία στις επαναλαμβανόμενες αυτές αλληλουχίες. Όταν η χοληστερόλη εστεροποιείται, τα δισκοειδή σωματίδια μετατρέπονται σε σφαιρικά και η δομή της έλικας της apoa-i επαναρρυθμίζεται. Οι επικράτειες που εντοπίζονται στις έλικες της apoa-i φαίνεται ότι παίζουν καθοριστικό ρόλο στην πρόσδεση της με τα λιπίδια, με τα οποία συνδέονται με μη ομοιοπολικούς δεσμούς (Εικόνα 1.2-Γ). Τα σωματίδια αυτά έχουν περίπου 10 nm διάμετρο και αποτελούνται από έναν μη πολικό πυρήνα από τριγλυκερίδια και εστέρες χοληστερόλης περιβαλλόμενο από μονόστιβη επιφάνεια αμφιπαθών α-ελίκων και φωσφολιπιδίων [11]. Η πρόσδεση της apoa-i με τα λιπίδια ενεργοποιεί το ένζυμο λεκιθινο-χοληστερολοακυλοτρανσφεράση (LCAT) ώστε η δισκοειδής HDL να μετατραπεί τελικά σε σφαιρική. Η apoa-i τόσο στα δισκοειδή όσο και στα σφαιρικά σωματίδια αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα εκκαθαριστή (SR-BI), ο οποίος είναι γνωστός και ως ο 14

15 υποδοχέας της HDL. Μελέτες σε πειραματόζωα έχουν δείξει ότι η αλληλεπίδραση της apoa-i με τον SR-BI είναι σημαντική για την αθηροπροστατευτική δράση της HDL [3]. Η apoa-ii είναι η δεύτερη σε αφθονία απολιποπρωτεΐνη της HDL [10], αλλά ο φυσιολογικός της ρόλος δεν έχει ακόμα εξακριβωθεί. Ωστόσο, μαζί με την apoa-i είναι απαραίτητες για τη βιοσύνθεση της κλασσικής HDL. Εικόνα 1.2. Προτεινόμενα μοριακά μοντέλα για την apoa-i [11]. Η HDL περιέχει επίσης μια ποικιλία άλλων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των apoa-iv, apoc-i, apoc-ii, apoc-iii, apod, apoe, apoj, apol-i, apom, τρανσφερίνη, σερουλοπλασμίνη και ένζυμα [12]. Πρόσφατες μελέτες πρωτεομικής [13] ], έχουν συσχετίσει την απομονωμένη με υπερφυγοκέντρηση HDL με περισσότερες από 75 πρωτεΐνες. Η ύπαρξη αυτών των ξεχωριστών υποπληθυσμών των σωματιδίων είναι σε συνάρτηση με τους πολλαπλούς βιολογικούς ρόλους της HDL Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Στην τελευταία κατηγορία ανήκουν οι λιποπρωτεΐνες a, Lp(a). Πρόκειται για σωμάτια τύπου LDL που συνδέονται με την απολιποπρωτεΐνη a. Ο μηχανισμός καταβολισμού τους δεν είναι πλήρως εξακριβωμένος, αλλά έχει αποδειχτεί ότι συμμετέχει ο νεφρικός ιστός [14],[15]. Έχουν, επιπλέον, χαρακτηριστεί ως μόρια που προάγουν την αθηρωμάτωση, όταν τα επίπεδά τους υπερβαίνουν τα φυσιολογικά όρια [16]. 15

16 1.1.7 Διατροφικά λιπίδια Τα περισσότερα λιπίδια προσλαμβάνονται με τη μορφή τριακυλογλυκερολών (τριγλυκεριδίων) και χοληστερόλης μέσω της διατροφής. Τα τριγλυκερίδια απορροφώνται από το εντερικό επιθήλιο, αφού αποικοδομηθούν σε λιπαρά οξέα και η πέψη τους ξεκινά από τον στόμαχο με τις γαστρικές λιπάσες. Στον αυλό του λεπτού εντέρου ενσωματώνονται σε μικκύλια με τη βοήθεια των χολικών αλάτων, τα οποία είναι αμφιπαθή μόρια που συντίθενται στο ήπαρ και εκκρίνονται από τη χοληδόχο κύστη. Η διάταξη των τριγλυκεριδίων στην επιφάνεια των μικκυλίων διευκολύνει την πρόσβαση των παγκρεατικών λιπασών, ώστε αυτές να υδρολύσουν τους εστερικούς δεσμούς τους. Η πέψη τους σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και σε 2-μονοακυλογλυκερόλη επιτυγχάνεται με τη βοήθεια λιπασών και τα οποία στη συνέχεια μεταφέρονται στα εντερικά κύτταρα. Στα κύτταρα αυτά τα τριγλυκερίδια ανασυντίθενται και συσκευάζονται σε λιποπρωτεϊνικά σωματίδια μεταφοράς, τα χυλομικρά. Η χοληστερόλη στους ανθρώπους προέρχεται από δύο πηγές, είτε προσλαμβάνεται με τη διατροφή είτε συντίθεται ενδογενώς εκ νέου (de novo). Το μεγαλύτερο ποσοστό προέρχεται κυρίως από τη de novo σύνθεση της, αλλά γενικά διαφέρει από άνθρωπο σε άνθρωπο ανάλογα με τους γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες [17]. Μόνο το 50% της προσλαμβανόμενης χοληστερόλης απορροφάται από το έντερο, ενώ το υπόλοιπο αποβάλλεται από τον οργανισμό μέσω κοπράνων. Ομοίως με τα τριγλυκερίδια, η εξωγενής χοληστερόλη συνδέεται με τα μικκύλια στον εντερικό αυλό. Απαραίτητη προϋπόθεση για τη μικκυλιοποίησή της είναι να βρίσκεται σε μη εστεροποιημένη μορφή. Έπεται η πρόσληψή της από τα κύτταρα του εντέρου με μηχανισμό ο οποίος δεν είναι ακόμη πλήρως εξακριβωμένος. Στην όλη διαδικασία φαίνεται πως συμμετέχει ένας ενεργητικός μεταφορέας, καθώς και η παθητική διάχυση και μεταφορά [18]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι στην ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης διαμεσολαβούν ο μεταφορέας NPC1-L1 (Niemann-Pick C1 like 1) και οι πρωτεΐνες ABCG5 και ABCG8 (ATP-binding cassette ABCproteins). Στο εσωτερικό πλέον των κυττάρων του εντέρου η χοληστερόλη μετατρέπεται σε εστέρες με τη βοήθεια του ενζύμου ACAT2 (Acyl CoA cholesterol acyltransferase isoform-2) και με τη δομή αυτή μπορεί να εισέλθει στα νεοσυντιθέμενα χυλομικρά και να εκκριθεί στη λεμφική κυκλοφορία με τα υπόλοιπα λιπίδια [19], (Εικόνα 1.3). 16

17 Όταν υπάρχει ανάγκη για ενέργεια από τους περιφερικούς ιστούς τότε κινητοποιούνται οι αποθήκες λιπιδίων μέσα από μια διαδικασία τριών σταδίων. Αρχικά, οι τριακυλογλυκερόλες μετά από ενδοκυττάρια σηματοδότηση αποικοδομούνται και μεταφέρονται στους ιστούς που τις έχουν ανάγκη με τη μορφή λιπαρών οξέων και γλυκερόλης. Στη συνέχεια, τα λιπαρά οξέα ενεργοποιούνται και μεταφέρονται στα μιτοχόνδρια για οξείδωση [20]. Τέλος, τα λιπαρά οξέα καταβολίζονται σε μόρια του ακετυλο-συνενζύμου Α, που εισέρχονται στον κύκλο του κιτρικού οξέος. Σε περίοδο νηστείας τα επίπεδα των ελεύθερων λιπαρών οξέων αυξάνουν λόγω των εκκρινόμενων ορμονών - επινεφρίνη και γλυκαγόνη - που προάγουν τη λιπόλυση. Αντίθετα, η ινσουλίνη δρα ανασταλτικά στο μονοπάτι της λιπόλυσης [21]. Αυλός του εντέρου Μικρολάχνες Διατροφικά λιπίδια Μικύλλια Στεγανή σύνδεση Πυρήνας COPII κυστίδιο Λεμφαγγείο Χυλομικρά Εικόνα 1.3. Ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης από τα μικκύλια στο εντερικό κύτταρο και ο μηχανισμός απέκκρισής της με τη μορφή χυλομικρών [19]. Τα παραπάνω λιποπρωτεϊνικά σωματίδια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και η δράση τους συνοψίζεται σε τρία κυρίως μεταβολικά μονοπάτια. Η σύνθεση των χυλομικρών ξεκινάει από το έντερο, ενώ η βιογένεση της LDL και της HDL λαμβάνει χώρα στο 17

18 πλάσμα. Διάφορες πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένου των απολιποπρωτεϊνών, των ενζύμων του πλάσματος, των υποδοχέων των λιποπρωτεϊνών, των λιπιδικών πρωτεϊνικών μεταφορέων και των λιπιδικών μεταφορέων συμμετέχουν στα παραπάνω μεταβολικά μονοπάτια και συμβάλλουν στη λιπιδική ομοιόσταση. 1.2 ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Οι πρωτεΐνες που αποτελούν το περίβλημα των λιποπρωτεϊνών, οι απολιποπρωτεΐνες, συντίθενται στο ήπαρ κυρίως καθώς και στο επιθήλιο του λεπτού εντέρου. Οι κύριες κατηγορίες και οι πιο συχνά απαντώμενες είναι οι Α, Β, C, Ε και a. Εκτός από τη σύνδεσή τους με τα λιπίδια επιτελούν και περαιτέρω λειτουργίες. Η ικανότητά τους να δεσμεύουν λιπίδια οφείλεται στις αμφιπαθείς α-έλικες και στις β- επιφάνειες [22],[23]. Παρακάτω παρατίθενται ορισμένες από τις πιο σημαντικές απολιποπρωτεΐνες και οι ιδιότητες τους. Η ApoA-I αποτελεί δομική μονάδα της HDL και είναι υπεύθυνη για τη βιοσύνθεση της HDL, την ενεργοποίηση της LCAT και την αλληλεπίδραση των λιποπρωτεϊνών HDL με τους υποδοχείς SR-B1 [24],[25]. Λόγω των παραπάνω λειτουργιών θεωρείται ότι έχει αθηροπροστατευτική δράση. Οι πιο σημαντικές απολιποπρωτεΐνες της οικογένειας ApoΒ είναι οι Β-48 και Β-100. Συμμετέχουν στον καταβολισμό των λιποπρωτεϊνών LDL, VLDL και Lp(a). Ειδικότερα, η ApoB-48 συντίθεται στα κύτταρα του εντέρου και είναι απαραίτητη για τη δόμηση των χυλομικρών κατά την απορρόφηση των διατροφικών λιπιδίων μετά από κάθε γεύμα. Αντίθετα, η ApoB-100 συντίθεται στο ήπαρ και είναι απαραίτητη για τη σύνθεση και την απέκκριση των VLDL και αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη των LDL λιποπρωτεϊνών [26]. Η υποκατηγορία των ApoC συμβάλλει τόσο στη διαμόρφωση των LDL και VLDL όσο και των HDL. Η ApoC-I ενεργοποιεί την LCAT και αναστέλλει το ένζυμο CETP [27] ενώ η ApoC-IΙ ενεργοποιεί την LPL (Lipoprotein Lipase). Η δράση της προσφέρει μερική προστασία έναντι της αθηρωμάτωσης. Η ApoC-IΙΙ και η ApoC-IV προκαλούν σε περίπτωση υπερέκφρασής τους αύξηση των τριγλυκεριδίων του πλάσματος, ενώ πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η ApoC-III προάγει και τον de novo σχηματισμό HDL μέσω του ABCA1 [28]. 18

19 Η λιποπρωτεΐνη Lp(a) σχηματίζεται με την απολιποπρωτεΐνη Apo(a). H Apo(a) εντοπίζεται στο ενδοθήλιο των αγγείων και προκαλεί φλεγμονώδη και πολλαπλασιαστικά φαινόμενα. Τα υψηλά επίπεδά της στο πλάσμα έχουν συσχετιστεί με καρδιαγγειακά και θρομβωτικά νοσήματα [29]. Τέλος η απολιποπρωτεΐνη Ε (ApoE) αποτελεί τον κύριο προσδέτη των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών με τον LDLr και επάγει την ενεργή απομάκρυνσή τους από το πλάσμα. Ενεργοποιεί την LCAT και είναι απαραίτητη για την κάθαρση των λιποπρωτεϊνικών υπολειμμάτων. Έχει χαρακτηριστική αθηροπροστατευτική δράση. Μεταλλαγμένες μορφές της έχουν συσχετιστεί με την πρώιμη εκδήλωση της νόσου Alzheimer και η υπερέκφρασή της προκαλεί υπερτριγλυκεριδαιμία. Πρόκειται για μια ευρέως μελετηθείσα απολιποπρωτεΐνη με τελικό στόχο την θεραπεία διαταραχών των λιπιδίων στο αίμα [1] Απολιποπρωτεΐνη Ε Η απολιποπρωτεΐνη Ε είναι κύριο συστατικό των μορίων VLDL, IDL, HDL, των χυλομικρών και των υπολειμμάτων των χυλομικρών. Παίζει καθοριστικό ρόλο στην κάθαρση των λιποπρωτεϊνών αυτών από την κυκλοφορία, διότι αποτελεί το μεσολαβητικό μόριο- προσδέτη των LDL υποδοχέων και των υποδοχέων VLDL, ApoER2 και LRP-1 [30]-[34]. In vivo και in vitro μελέτες έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις στην απολιποπρωτεΐνη Ε που εμποδίζουν την πρόσδεση των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν την απολιποπρωτεΐνη Ε στον LDL υποδοχέα, συνδέονται με υψηλά επίπεδα χοληστερόλης στο πλάσμα και προκαλούν πρώιμη αθηροσκλήρωση σε ανθρώπους και πειραματόζωα [35],[36]. Η apoε εμπλέκεται επίσης στους μηχανισμούς αναρρόφησης χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς και είναι αθηροπροστατευτική [37]-[39]. Η apoε ρυθμίζει την μακροφαγική και τη Τ-λεμφοκυτταρική ανοσοποιητική απάντηση στο αθήρωμα. Στους ανθρώπους υπάρχουν τρία κοινά αλληλόμορφα σε ένα μόνο γενετικό τόπο τα οποία κωδικοποιούν την apoe. Αυτά τα αλληλόμορφα αναγνωρισμένα ως e2, e3, e4 δίνουν 3 ομόζυγους (E2/E2, E3/E3, E4/E4) και 3 ετερόζυγους (E3/E2, E4/E3, E4/E2) apoε φαινοτύπους [40],[41]. Αυτές οι τρεις διαφορετικές ανθρώπινες ισομορφές apoe4, apoe3, apoe2 είναι αποτέλεσμα μεταλλάξεων στα αμινοξικά κατάλοιπα 112 και 158. Συγκεκριμένα η apoe4 περιέχει Arg στη θέση 112 και Arg στη θέση 158. Η apoe3 περιέχει Cys στη θέση 112 και Arg στη θέση 158 και τέλος η apoe2 περιέχει 19

20 Cys στη θέση 112 και Cys στη θέση 158 [41]. Ο φαινότυπος Ε2/2 σχετίζεται με καρδιαγγειακά νοσήματα [42] και ο φαινότυπος Ε4/4 αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της νόσου Alzheimer [43]. Παρόμοια με την apoα-i και apoα-iv και μέσα από μελέτες κρυσταλλογραφίας έχει αποδειχτεί ότι η apo Ε αποτελείται από αλληλουχίες 11 και 22 αμινοξέων που σχηματίζουν αμφιπαθείς α-έλικες. Η δομή αυτή επιτρέπει την πρόσδεση της σε λιπίδια και τον μετέπειτα σχηματισμό λιποπρωτεϊνών. Η κρυσταλλογραφία με ακτίνες- Χ του αμινοτελικού κομματιού 22 KDa της apoe έδειξε ότι αυτή η περιοχή σχηματίζει ένα τετραελικοειδές δέμα (bundle) το οποίο σταθεροποιείται από υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και γέφυρες αλάτων [44]. Είναι πιθανό ότι διαταραχές στη λιπιδική ομοιόσταση [33] όπως επίσης και αλληλεπιδράσεις της apoe με άλλες εγκεφαλικές πρωτεΐνες, ίσως να συνεισφέρουν στο νευροεκφυλισμό που παρατηρείται στη νόσο Alzheimer [45]. Εικόνα 1.4. Η δομή της απολιποπρωτεΐνης Ε με τις κύριες λειτουργικές περιοχές της. Υποδοχείς της apoε Η δράση της apoe διαμεσολαβείται μέσω πολλαπλών υποδοχέων όπως είναι οι LDLr, LRP-1, ApoER2, VLDLr, SR-BI. 20

21 Ο LDLr είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη. Πρόκειται για τον βασικό υποδοχέα των LDL σωματιδίων. Μετά την πρόσδεσή τους γίνεται ενδοκυττάρωση του συμπλόκου υποδοχέα-ldl και στη συνέχεια ο υποδοχέας ανακυκλώνεται και επανέρχεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Η παραπάνω ενδοκυττάρωση προάγεται από τις απολιποπρωτεΐνες Β και Ε. Μεταλλάξεις στο γονίδιο του υποδοχέα οδηγούν σε διαταραχή των επιπέδων χοληστερόλης γνωστή ως Οικογενής Υπερχοληστερολαιμία Τύπου III. Ανάλογα με την μη έκφραση ή την έκφραση μη λειτουργικής πρωτεΐνης διαχωρίζεται η νόσος σε πέντε διαφορετικούς τύπους με την αντίστοιχη βαρύτητα. Ακόμη, διακρίνεται σε ομόζυγη ή ετερόζυγη ανάλογα με τον αριθμό των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων γονιδίων. Ο αριθμός των μεταλλάξεων που έχουν ως τώρα ταυτοποιηθεί ανέρχονται στις 1000 [46]. Tο πλήθος των υποδοχέων και άρα η πρόσληψη χοληστερόλης από τα κύτταρα ρυθμίζεται με αρνητική ανάδραση (negative feedback) μέσω ειδικών πυρηνικών πρωτεϊνών που επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων του LDLr. Το ρυθμιστικό αυτό σύστημα περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες SCAP (SREPB Cleavage Activating Protein) και SREBP (Sterol Regulatory Element-Binding Protein) οι οποίες βρίσκονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και είναι μεταξύ τους συνδεδεμένες. Όταν τα επίπεδα στερολών στο κύτταρο είναι χαμηλά η SCAP ενεργοποιεί άμεσα και έμμεσα την SREBΡ [9]. Το αμινοτελικό άκρο της δεύτερης μεταφέρεται στον πυρήνα του κυττάρου προσδένεται στο DNA στις θέσεις SRE (sterol response elements) και επηρεάζει την έκφραση τουλάχιστον 20 γονιδίων, ένα εκ των οποίων είναι το γονίδιο που εκφράζει τον LDLr [47]. Ο LRP-1 (LDLr Related Protein 1) είναι μια πρωτεΐνη-υποδοχέας με ποικίλες λειτουργίες. Ανήκει στην οικογένεια των LDLr υποδοχέων λόγω της εκτεταμένης ομολογίας του με τον LDLr. Αποτελείται από 4525 αμινοξέα και εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, τον εγκέφαλο και τους πνεύμονες. Έχει διαπιστωθεί ότι είναι απαραίτητη κατά την εμβρυογένεση, καθώς πειραματόζωα με γενετική έλλειψη του αντίστοιχου γονιδίου είναι θνησιγενή. Γενικά αποτελεί τον μεσολαβητή για την ενδοκυττάρωση ετερογενών ενώσεων όπως διάφορες πρωτεϊνάσες, αναστολείς πρωτεϊνασών ακόμη και βακτηριακές τοξίνες. Αναφορικά με τη δράση του στην καταβολισμό των λιπιδίων έχει σχεδόν επιβεβαιωθεί ότι έχει μια συμμετοχή στην κάθαρση των υπολειμμάτων χυλομικρών 21

22 καθώς και των LDL απουσία των LDLr [48]. Επιπλέον είναι γνωστό ότι η δράση του επάγεται με τη σύνδεση της απολιποπρωτεΐνης Ε και δείχνει εκλεκτικότητα ως προς τις ισομορφές apoe3 και apoe4, ενώ η apoe2 συνδέεται ελάχιστα. Με την παραπάνω σύνδεση διαμεσολαβείται εμμέσως και η εστεροποίηση της χοληστερόλης στα β- VLDL σωμάτια [49]. Τέλος, η απολιποπρωτεΐνη C δρα ανασταλτικά στη δράση του LRP-1 [50]. Ένας άλλος γνωστός συναγωνιστικός αναστολέας του υποδοχέα LRP-1 είναι η υποδοχεο-σχετιζόμενη πρωτεΐνη (Receptor Related Protein) RAP. Ο VLDLr, ο οποίος ανήκει επίσης στην οικογένεια των LDL υποδοχέων, παρουσιάζει ακόμη μεγαλύτερου βαθμού ομολογία με τον LDLr σε σχέση με τον LRP-1. Επιπρόσθετα, έχει χαρακτηριστικά μεγάλη ομοιότητα με τα αντίστοιχα γονίδια άλλων ειδών. Αποτελείται από πέντε υπομονάδες όπως και ο LDLr, αλλά εκφράζεται σε διαφορετικούς ιστούς. Συγκεκριμένα, εκφράζεται κυρίως στους ιστούς που συμμετέχουν στον ενεργό μεταβολισμό των λιπαρών οξέων όπως είναι η καρδιά, οι μύες και ο λιπώδης ιστός και ελάχιστα στο ήπαρ [51]. Έχει συνεργική δράση στην κάθαρση των VLDL και β-vldl, οι οποίοι περιέχουν την apoe. Αντίθετα, δε συνδέεται με λιποπρωτεΐνες που αποτελούνται από την apob-100. Σε πειραματικά μοντέλα με έλλειψη του γονιδίου που ήταν σε φυσιολογική δίαιτα (chow diet) καθώς και σε δίαιτα πλούσια σε λιπαρά παρατηρήθηκαν φυσιολογικά επίπεδα λιπιδίων στο πλάσμα, σε σχέση με τους άγριου τύπου μάρτυρες γεγονός που αποδεικνύει ότι δεν είναι απολύτως απαραίτητος στον μεταβολισμό της χοληστερόλης. Παρατηρήθηκε, όμως, μείωση του ΒΜΙ καθώς και του λιπώδους ιστού [52]. Νεότερες μελέτες έδειξαν ότι σε δίαιτα πλούσια σε λιπαρά τα VLDLr -/- πειραματόζωα εκδήλωσαν υπερτριγλυκεριδαιμία και παχυσαρκία [53]. Ο υποδοχέας ApoER2 ανήκει επίσης στην ίδια οικογένεια με τους παραπάνω υποδοχείς, εμφανίζοντας παρόμοιες δομικές ιδιότητες. Αντίστοιχα έχει υψηλή συγγένεια σύνδεσης με τις λιποπρωτεΐνες που περιέχουν την apoe, δηλαδή τα VLDL και β-vldl σωμάτια αλλά δε συνδέεται με την LDL. Εκφράζεται κυρίως στον εγκέφαλο και σε μικρότερο βαθμό στους όρχεις και στις ωοθήκες. Εικάζεται ότι συμμετέχει στην ομοιόσταση των λιπιδίων στον εγκέφαλο καθώς και στην ανάπτυξή του [1]. Μια επιπλέον σημαντική κατηγορία υποδοχέων στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν την apoe είναι οι υποδοχείς-ρακοσυλλέκτες της Β υποκατηγορίας. Σε αυτήν ανήκουν ο CD36 και ο SR-BI. 22

23 O CD36 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη και εκφράζεται σε ποικίλους ιστούς και κύτταρα, όπως σε μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα μικρών αγγείων, λιποκύτταρα, αιμοπετάλια και στους λείους μύες και στην καρδιά. Έχει σημαντική αθηροπροστατευτική δράση καθώς προσλαμβάνει τα οξειδωμένα LDL σωμάτια και ρυθμίζει τη φλεγμονώδη απάντηση. Συνδέεται επίσης και με τα HDL σωμάτια [54]. Ο SR-BI είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, που αποτελείται από 509 αμινοξέα. Εκφράζεται σε διάφορες θέσεις, αλλά ιδιαίτερη σημασία έχει η έκφραση του στα ηπατοκύτταρα επηρεάζοντας σημαντικά τον καταβολισμό της HDL. Αποτελεί θέση πρόσδεσης εκτός από τις λιποπρωτεΐνες και για διάφορα βιολογικά μόρια, όπως γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες, ιονισμένα μόρια αλλά και για ιϊκές πρωτεΐνες. Ο υποδοχέας αυτός παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια προς τα α-hdl σωμάτια, τα οποία είναι ιδιαίτερα πλούσια σε λιπίδια. Ωστόσο συνδέεται ελάχιστα με τα μικρότερα HDL με μικρότερο λιπιδικό φορτίο. Είναι προφανής η συμβολή του στην κάθαρση του πλάσματος από τη χοληστερόλη. Ειδικότερα η σύνδεση των παραπάνω λιποπρωτεϊνών οδηγεί σε εκλεκτική πρόσληψη από το κύτταρο μόνο του λιπιδικού περιεχομένου τους. Εκτός από την πρόσληψη λιπιδίων προάγει και την εκροή χοληστερόλης προς ιστούς που έχουν ανάγκες σε χοληστερόλη [55],[56]. Ρόλος της apoe στην ρύθμιση των επιπέδων της LDL και της HDL χοληστερόλης Η ΑpoE είναι απαραίτητος διαμεσολαβητής για την ενδοκυττάρια πρόσληψη των HDL και β-vldl σωματίων. Πρόκειται για έναν σημαντικό αθηροπροστατευτικό μηχανισμό διότι τα β-vldl έχουν χαρακτηριστεί ως αθηρογόνα σωματίδια λόγω της αθρόας αύξησης εστέρων χοληστερόλης που προκαλούν στα μακροφάγα [57]. Μπορεί, επιπλέον, να υποκαθιστά εν μέρει τη λειτουργία της ΑpoB. Οι ασθενείς με αβηταλιποπρωτεϊναιμία έχουν υψηλά επίπεδα HDL με ΑpoE, που είναι απαραίτητα για τη μεταφορά χοληστερόλης στα κύτταρα μέσω των υποδοχέων της ΑpoE, παρακάμπτωντας με τον τρόπο αυτό την έλλειψη της ΑpoB [58]. Επιπλέον, οι λιποπρωτεΐνες που περιέχουν την ΑpoE απομακρύνονται ταχύτερα από το πλάσμα λόγω της μεγαλύτερης συγγένειας της απολιποπρωτεΐνης με τους υποδοχείς LDLr και LRP-1 στα ηπατοκύτταρα. 23

24 1.3 ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΑΣΗ ΤΗΣ ΣΤΕΦΑΝΙΑΙΑΣ ΝΟΣΟΥ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΑΡΕΜΒΑΣΕΙΣ Δυσλιπιδαιμία και ανάπτυξη αθηρωματικής νόσου Η στεφανιαία νόσος είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου στις δυτικές κοινωνίες. Αυτή η νόσος επηρεάζει τους άντρες και τις γυναίκες εξίσου και υπολογίζονται περίπου θάνατοι ετησίως στις ΗΠΑ μόνο [59],[60],[61]. Η αθηροσκλήρωση είναι ένας πολύπλευρος συνδυασμός αλλαγών στον έσω χιτώνα των αρτηριών, που συνίσταται στην εστιακή συσσώρευση λιπιδίων και άλλων συστατικών του αίματος και τη δημιουργία ινώδους ιστού. Οι αλλαγές αυτές είναι το αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης των δομικών και μεταβολικών ιδιοτήτων του αρτηριακού τοιχώματος που εξαρτώνται από τη σύσταση του πλάσματος και την αιμοδυναμική κατάσταση του ατόμου. Η δε ανάπτυξη του ινώδους συνδετικού ιστού και η εναπόθεση αλάτων ασβεστίου στις αθηρωματικές πλάκες μπορεί να οδηγήσει σε αρτηριοσκλήρυνση, δηλαδή στη σκλήρυνση του αρτηριακού τοιχώματος. Αν και πολλαπλοί παράγοντες συνεισφέρουν στην αθηροσκλήρωση, η δυσλιπιδαιμία έχει απομονωθεί ως η κυριότερη αιτία της καρδιαγγειακής νόσου [61],[62],[63]. Συγκεκριμένα, η δυσαναλογία ανάμεσα σε αθηροπροστατευτικές και αθηρωματικές λιποπρωτεΐνες στο πλάσμα του αίματος είναι ένας από τους πιο σημαντικούς συντελεστές απέναντι στην αθηροσκλήρωση [64],[65]. Ειδικότερα, αυξημένα ποσά LDL χοληστερόλης και μειωμένα ποσά HDL χοληστερόλης βρέθηκαν ανεξάρτητα να αποτελούν κίνδυνο ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου [65]. Σε απόκριση πρόδρομων αθηρωματικών καταστάσεων όπως αυτών που προκαλούνται από τη δυσλιπιδαιμία, μονοκύτταρα δεσμεύονται σε μόρια προσκόλλησης στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων και μεταναστεύουν στο υποενδοθηλιακό χώρο, όπου εκεί διαφοροποιούνται προς μακροφάγα. Η επαγωγή των μορίων προσκόλλησης υποκινείται μέσω μιας προ-φλεγμονώδους διέγερσης [66]. Η επιστράτευση και η μετανάστευση των μονοκυττάρων (Εικόνα 1.5) μέσα στον υποενδοθηλιακό χώρο υποκινείται από την οξειδωμένη LDL [67], όπως επίσης και από έναν μονοκύτταρο χημειοτακτικό παράγοντα, MCP-1 ο οποίος δεσμεύεται στον MCP-1 υποδοχέα, τον CCR2 [68]. Αυτές οι πρωτεΐνες εκφράζονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα λεία μυϊκά κύτταρα και τα μονοκύτταρα/μακροφάγα και προκαλούν τη δυσλιπιδαιμία [69],[70]. Αυτά τα κύτταρα, διαμέσου των υποδοχέων 24

25 εκκαθαριστών SRAI, SRAII, KAI CD36 [70],[71],[72] και πιθανόν άλλους μηχανισμούς φορτώνονται με εστέρες χοληστερόλης, οι οποίοι αργότερα αποτίθενται στη θέση του τραύματος και συνεισφέρουν στην εξέλιξη της αθηροσκληρωτικής πλάκας [73]. LDL ΑΥΛΟΣ Τροποποιημένη LDL Προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες Ινώδες κολλαγόνο Ελαστίνη Οξειδωμένη LDL Υποδοχέας εκκαθαριστής Χημειοκίνες Αυξητικοί παράγοντες Σχηματισμός αφρωδών μακροφάγων Τροποποιημένο ΛΜΚ Διαιρούμενο ΛΜΚ ΥΠΟΒΛΕΝΝΟΓΟΝΙΟΣ ΧΙΤΩΝΑΣ Μεταναστεύοντα ΛΜΚ Λεία μυϊκά κύτταρα (ΛΜΚ) σε ηρεμία ΜΥΙΚΟΣ ΧΙΤΩΝΑΣ Εικόνα 1.5. Γεγονότα που οδηγούν στην αθηρογένεση. Το πρωταρχικό τραύμα που δημιουργείται από τα μακροφάγα καλείται λιπώδης γράμμωση και είναι αντιστρέψιμο τραύμα [73],[74]. Τα τραύματα ίσως αυξάνονται με την επιστράτευση επιπρόσθετων μονοκυττάρων και Τ-κυττάρων και τη μετανάστευση μέσα στην εσωτερική κυτταρική στοιβάδα. Μηνύματα που προέρχονται από τα άωρα κύτταρα αίματος όπως επίσης και από τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα υποκινούν την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων από το μέσο στην εσωτερική στοιβάδα, η οποία διεγείρεται και συνθέτει συστατικά της μεσοκυττάριας ουσίας όπως το κολλαγόνο και οι πρωτεογλυκάνες [73]. Όσο η ανάπτυξη των τραυμάτων προοδεύει μονοκύτταρα / μακροφάγα φορτωμένα με εστέρες χοληστερόλης και λεία μυϊκά κύτταρα στη πλάκα πεθαίνουν. Αυτό οδηγεί στη δημιουργία νεκρωτικού πυρήνα επενδυμένου με κρυστάλλους χοληστερόλης, μια κατάσταση η οποία χαρακτηρίζει τις προχωρημένες αθηρωματικές νόσους [75]. Η 25

26 επιφάνεια του τραύματος συχνά σχηματίζει ένα ινώδες κάλυμμα αποτελούμενο από λεία μυϊκά κύτταρα, συστατικά της εξωκυττάριας ύλης και περιοχές απασβέστωσης. Το ινώδες κάλυμμα παράγεται από τα λεία μυϊκά κύτταρα και σταθεροποιεί τη πλάκα. Στους ανθρώπους μια κλινική κατάσταση όπως το έμφραγμα του μυοκαρδίου, ίσως συμβαίνει από τη ρήξη των ασταθών πλακών, που είναι εμπλουτισμένες με γεμάτα από λιπίδια μακροφάγα και έχουν αδύναμα ινώδη καλύμματα, ή από ενδοπλακική αιμορραγία η οποία οδηγεί στην ανάπτυξη θρομβογενετικού γεγονότος το οποίο θα φράξει την αρτηρία [76],[77]. Αφρώδη κύτταρα Λιπώδης γράμμωση Ενδιάμεσο τραύμα Αθήρωμα Ινώδης πλάκα Προχωρημένο τραύμα/ρήξη πλάκας Ενδοθηλιακή δυσλειτουργία Από την 1 η δεκαετία Από την 3 η δεκαετία Από την 4 η δεκαετία Ανάπτυξη κυρίως από συσσώρευση λιπιδίων Λείος μυς κολλαγόνο Θρόμβωση αιμάτωμα Εικόνα 1.6. Χρονολογική εξέλιξη της αθηρωμάτωσης. Πιστεύεται ότι οι αθηρωματικές λιποπρωτεΐνες όπως οι LDL και τα υπολείμματα λιποπρωτεϊνών, υποκινούν την αθηροσκλήρωση και οι αντι-αθηρωματικές λιποπρωτεΐνες όπως οι HDL προστατεύουν από την αθηροσκλήρωση. Τις τελευταίες δεκαετίες, έχει αναγνωριστεί από την ιατρική κοινότητα ότι η HDL παίζει πρωταρχικό ρόλο στη μάχη ενάντια στην καρδιαγγειακή νόσο, κυρίως επειδή κατέχει πολλαπλές αθηροπροστατευτικές λειτουργίες που παρέχουν μια προστατευτική ασπίδα ενάντια στη στεφανιαία νόσο. Μια προγενέστερη θεωρία ήταν ότι η χαμηλή συγκέντρωση της HDL στο πλάσμα είναι ένας ισχυρός ανεξάρτητος παράγοντας πρόβλεψης της στεφανιαίας νόσου [78], όμως πρόσφατες μελέτες κατέληξαν πως πέρα από την ποσότητα και η ποιότητα της HDL προσδιορίζει την αθηροπροστατευτική της δράση [7]. 26

27 1.3.2 Υφιστάμενες φαρμακολογικές παρεμβάσεις Η θεραπεία των καρδιαγγειακών παθήσεων (Cardiovascular Diseases, CVD) βασίζεται στην πρωτoγενή και στη δευτερογενή πρόληψη και εξαρτάται από τους παράγοντες κινδύνου και το λιπιδαιμικό προφίλ του ασθενούς. Όσον αφορά στη φαρμακευτική αντιμετώπιση θα πρέπει να αντιμετωπιστούν οι πρωτοπαθείς αιτίες αρχικά εάν υφίστανται, όπως ο Σακχαρώδης Διαβήτης, η Υπερκορτιζολαιμία κα. Ακολούθως, συνεκτιμούνται οι παράγοντες κινδύνου και τα επίπεδα λιποπρωτεϊνών για την έναρξη διαιτητικής ή και φαρμακευτικής θεραπείας [79], (Πίνακας 1-2), (Πίνακας 1-3). National Cholesterol Υπόλοιπες πηγές Education Program Ηλικία ( >45 ετών για τους άντρες και μετά την εμμηνόπαυση για τις γυναίκες) Υπέρταση (ακόμη και αν χορηγείται αγωγή) Κάπνισμα Σακχαρώδης Διαβήτης Οικογενειακό ιστορικό καρδιαγγειακού επεισοδίου σε συγγενείς ( <55 έτη για τους άντρες και <65 για γυναίκες) HDL χοληστερόλη πλάσματος <35 mg/dl Lp(a) πλάσματος >20mg/dl Ομοκυστεΐνη πλάσματος >10 nmol/l ( >50 percentile) Μικρής πυκνότητας LDL σωμάτια Λόγος χοληστερόλης προς τα τριγλυκερίδια σε VLDL σωμάτια >0.3 (στο 90% των περιπτώσεων) ή >0.25 (στο 75%) Υψηλά επίπεδα ινωδογόνου, παραγόντων πήξης VIII και VII και του πλασμινογόνου Αντίσταση στην ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμία Κεντρικού τύπου παχυσαρκία Υψηλά επίπεδα C αντιδρώσας πρωτεΐνης Αυξημένα λευκά κύτταρα ή και αιματοκρίτης Έλλειψη αντιοξειδωτικών βιταμινών Λοίμωξη από χλαμύδια Πίνακας 1-2. Παράγοντες κινδύνου για CVD σύμφωνα με το National Cholesterol Education Program και άλλες πηγές [102]. Τα θεραπευτικά σκευάσματα που χρησιμοποιούνται μεχρι σήμερα στην κλινική πράξη στοχεύουν κυρίως στην ελάττωση της LDL χοληστερόλης και κατά δεύτερο λόγο στην αύξηση της HDL. Οι κατηγορίες φαρμάκων που συμβάλλουν στη 27

28 βελτίωση του λιπιδαιμικού προφίλ είναι οι φιμπράτες, οι ρητίνες, οι στατίνες, οι αναστολείς του μορίου-μεταφορέα NPC1-L1, όπως είναι η εζετιμίβη, και τέλος το νικοτινικό οξύ. Όρια έναρξης διαιτητικής θεραπείας Ολική Χοληστερόλη (mg/dl) LDL Χοληστερόλη (mg/dl) Όρια έναρξης φαρμακευτικής θεραπείας Ολική Χοληστερόλη (mg/dl) LDL Χοληστερόλη (mg/dl) 0 ή 1 παράγοντας κινδύνου για CVD >2 παράγοντες κινδύνου για CVD Διαγνωσμένη εκδήλωση CVD Πίνακας 1-3. Οριακές τιμές της ολικής και της LDL χοληστερόλης στο πλάσμα για την έναρξη διαιτητικής και φαρμακευτικής θεραπείας ανάλογα με την παρουσία παραγόντων κινδύνου για CVD και την ήδη εκδήλωση ή όχι της νόσου. Οι φιμπράτες είναι τα πιο αποτελεσματικά σκευάσματα για τη μείωση των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα. Ο μηχανισμός δράσης τους περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της μεταγραφής του υποδοχέα PPAR-α (Peroxisome-Proliferator- Activated Receptor α) και οδηγεί σε αυξημένη δράση της LPL. Επιπλέον, επάγουν την έκφραση των LDLr και ΑpoA-I γονιδίων ενώ καταστέλλουν την έκφραση της ΑpoC-II. Είναι ενδιαφέρον ότι μπορούν να προκαλέσουν μια ήπια αύξηση της HDL χωρίς να είναι απόλυτα επιβεβαιωμένο. Γενικά, βελτιώνουν τον κίνδυνο καρδιαγγειακών παθήσεων σε ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο [80]. Έχουν ένδειξη χορήγησης σε υψηλή υπερτριγλυκεριδαιμία, αυξημένα επίπεδα χυλομικρών, χαμηλά επίπεδα HDL καθώς και σε συνδυαστική υπερλιποπρωτεϊναιμία [79]. Οι ρητίνες δρουν δεσμεύοντας τα χολικά οξέα στο έντερο, αποτρέποντας έτσι την πρόσληψη των διατροφικών λιπιδίων και μειώνοντας τα επίπεδα της LDL στο πλάσμα. Η λήψη ρητινών συνοδεύεται από αύξηση των τριγλυκεριδίων. Λόγω των παραπάνω δράσεων χορηγούνται συνήθως συνεργικά σε ασθενείς με οικογενή 28

29 υπερχοληστερολαιμία ενώ αποφεύγεται η χορήγησή τους σε ασθενείς με υπερτριγλυκεριδαιμία. Οι στατίνες είναι δομικά μόρια ανάλογα με το μόριο HMG-CoA (Hydroxymethylglutaryl Coenzyme A), το οποίο αποτελεί πρόδρομη ένωση της χοληστερόλης. Προκαλεί συνεπώς ανταγωνιστική αναστολή του καταλυτικού ενζύμου HMG-CoA αναγωγάση και επακόλουθα αναστολή της ηπατικής σύνθεσης της χοληστερόλης και άρα ελάττωση των επιπέδων της LDL στα ηπατοκύτταρα. Η μείωση της ηπατικής χοληστερόλης έχει ως συνέπεια την αυξημένη μεταγραφή του γονιδίου του LDLr οδηγώντας σε αύξηση των υποδοχέων αυτών και ακόλουθα αυξημένη πρόσληψη των LDL σωματίων από την κυκλοφορία. Παράλληλα, προκαλείται αύξηση των επιπέδων της ApoB. Χορηγούνται σε ασθενείς με ετερόζυγη Οικογενή Υπερχοληστερολαιμία (FH) αλλά δεν έχουν αποτέλεσμα σε ομόζυγες περιπτώσεις της FH. Είναι το φάρμακο επιλογής για τις περισσότερες υπερχοληστερολαιμίες. Πολλαπλές μετα-αναλυτικές έρευνες έχουν καταλήξει σε αντιφατικά συμπεράσματα ως προς τα ακριβή ποσοστά μείωσης των αγγειακών επισοδίων. Σε γενικές γραμμές, όμως, είναι αποδεκτό ότι η χρήση στατινών έχει μειώσει τόσο τα στεφανιαία όσο και τα εγκεφαλικά περιστατικά καθώς και τη θνησιμότητα σε ασθενείς με διεγνωσμένη καρδιαγγειακή νόσο. Η χορήγησή τους με σκοπό την πρωτογενή πρόληψη συμβάλλει στην πρόληψη των εγκεφαλικών επεισοδίων και των σοβαρών στεφανιαίων επεισοδίων σε υψηλού κινδύνου ασθενείς αλλά δεν είναι σαφή τα οφέλη σε πληθυσμό χαμηλού κινδύνου [79],[81],[82]. Σύμφωνα με εκτεταμένες μετααναλυτικές μελέτες όπως οι ASCOT, CARDS και REVERSAL παρόλο που οι στατίνες επιτυγχάνουν δραματική μείωση της LDL σε φυσιολογικά επίπεδα σε ασθενείς με δυσλιπιδαιμίες, η χορήγησή τους διαπιστώθηκε ότι μειώνει τη σχετική επικινδυνότητα για εκδήλωση θανατηφόρου αγγειακού επεισοδίου μόνο στο 30% αυτών των ασθενών [83]. Οι παραπάνω περιορισμοί και το γεγονός ότι τα οφέλη από τις στατίνες δεν αφορούν όλες τις πληθυσμιακές ομάδες έχει ωθήσει την επιστημονική κοινότητα στη διερεύνηση διαφορετικών στόχων. Η HDL αποτελεί φαρμακολογικό στόχο με σκοπό την περαιτέρω μείωση των θανατηφόρων καρδιαγγειακών συμβαμμάτων. 29

30 Το νικοτινικό οξύ είναι το μοναδικό φαρμακευτικό σκεύασμα που κυκλοφορησε με αυτόν τον στόχο. Το νικοτινικό οξύ ήταν γνωστό για τη φαρμακευτική του δράση ήδη από το 1955, αλλά η χρήση του εγκαταλείφθηκε σύντομα λόγω των ανεπιθύμητων ενεργειών. Η δραστικότητά του εναπόκειται στην ικανότητά του να αναστέλλει την κινητοποίηση των λιπαρών οξέων από τους περιφερικούς ιστούς, μειώνοντας έτσι την ηπατική σύνθεση των τριγλυκεριδίων και την έκκκριση VLDL. Ιδιαίτερα σημαντική αύξηση προκαλεί στα επίπεδα της HDL η οποία είναι της τάξης του 30%. Οι ανεπιθύμητες δράσεις περιλαμβάνουν έντονες εξάψεις, γαστρεντερικές διαταραχές, επιπεφυκίτιδα και ενοχλήσεις από το ανώτερο αναπνευστικό, γεγονός που δυσχεραίνει τη χρήση νικοτινικού οξέος στην κλινική πράξη [79]. Η χρήση σκευασμάτων μακράς διάρκειας έχουν ελαχιστοποιήσει αισθητά τις παρενέργειες, ενώ η συγχορήγηση με στατίνη προκαλεί σημαντική βελτίωση στο δυσλιπιδαιμικό προφίλ των ασθενών. Οι μελέτες ως προς την αθηροπροστατευτική δράση της HDL έχουν πάρει διαφορετική τροπή μετά την ανακάλυψη της ΑpoA-I Milano. Βρέθηκε ότι μια ομάδα πληθυσμού με αυτή τη μετάλλαξη είχε πολύ χαμηλά επίπεδα HDL πλάσμματος, 7-14 mg/dl. Παρόλα αυτά η μετάλλαξη αυτή τους παρείχε περιέργως αθηροπροστασία [84]. Έτσι, οι μελέτες κατευθύνονται προς την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού δράσης της HDL και όχι στη μεμονωμένη προσπάθεια αύξησης των επιπέδων της. Επιπλέον, στο σχεδιασμό νέων φαρμακολογικών παρεμβάσεων θα πρέπει να ληφθούν υπόψη και ποιοτικά χαρακτηριστικά της HDL που την καθιστούν αθηροπροστατευτική. 1.4 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ ΑΡΟΕ Παρότι υπάρχουν πολλές φαρμακολογικές παρεμβάσεις για την αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας και επομένως της αθηροσκλήρωσης και της στεφανιαίας νόσου η θνησιμότητα από στεφανιαία νόσο εμφανίζει συνεχή αύξηση. Οι στατίνες αν και πολύ αποτελεσματικά φάρμακα στην μείωση της ολικής χοληστερόλης και κυρίως της LDL χοληστερόλης παρουσιάζουν ένα σημαντικό υπολειπόμενο ρίσκο. Συγκεκριμένα, ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών που λαμβάνουν στατίνες αν και βελτιώνονται ως προς τα επίπεδα χοληστερόλης, δεν προστατεύονται από οξύ 30

31 έμφραγμα του μυοκαρδίου και γενικότερα από απειλητικά για την ζωή καρδιαγγειακά συμβάμματα [85]. Έτσι,λοιπόν, τα παραπάνω δεδομένα, η διαπίστωση ότι η ApoE αποτελεί μόριοκλειδί στη ρύθμιση του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών και η επιβεβαίωση με τη χρήση πειραματικών μοντέλων οδήγησαν στην μελέτη της απολιποπρωτεΐνης ως θεραπευτικό μέσο. Η γονιδιακή έκφραση ανθρώπινης ApoE σε χαμηλά επίπεδα (2-5mg/dl) σε ApoE -/- ποντίκια προκαλεί μείωση των επιπέδων χοληστερόλης σε φυσιολογικά επίπεδα και υποστροφή των αθηρωματικών αλλοιώσεων. Υποστροφή της αθηρωμάτωσης παρατηρείται επίσης και σε LDLr -/- πειραματόζωα μετά από γονιδιακή έκφραση της ApoE, χωρίς να συνοδεύεται από αντίστοιχη βελτίωση της υπερχοληστερολαιμίας [86]. Παρά τα ενθαρρυντικά αυτά αποτελέσματα, η χορήγηση της φυσιολογικής ApoE (wt ApoE) συνοδεύεται από ορισμένα μειονεκτήματα που την καθιστούν ακατάλληλη για θεραπεία. Πρώτον, η έκφραση της ΑpoΕ σε αυξημένα επίπεδα όχι μόνο δε βελτιώνει το λιπιδαιμικό προφίλ των παραπάνω πειραματικών μοντέλων, αλλά επάγει και την εκδήλωση υπερτριγλυκεριδαιμίας [87]. Δεύτερον, σε μοντέλα ApoE -/- LDLr -/- δεν επιδρά θετικά η έκφραση ούτε της χαμηλής δόσης της ApoE [88]. Η μελέτη του μηχανισμού πρόκλησης υπερτριγλυκεριδαιμίας οδήγησε στην εντόπιση της περιοχής της απολιποπρωτεΐνης Ε η οποία οφείλεται για την παρενέργεια αυτή. Ο χαρακτηρισμός του καρβοξυτελικού άκρου της πρωτεϊνης ως υπεύθυνου για την αύξηση των τριγλυκεριδίων κατεύθυνε την έρευνα στη δημιουργία πρωτεϊνών με βελτιωμένες δράσεις [89]. Αρχικά, μελετήθηκαν οι δράσεις συντετμημένων μορφών (truncated) της ApoE, δηλαδή χορηγήθηκαν πρωτεΐνες μικρότερου μεγέθους με πρόωρη λήξη της σύνθεσης στο αμινοτελικό άκρο σε διάφορες θέσεις, συγκεκριμένα στα αμινοξέα 185, 202, 229, 259. Αν και δεν προκαλούσαν εκδήλωση υπερτριγλυκεριδαιμίας, οι μορφές αυτές δεν ήταν αποτελεσματικές σε ApoE -/- x LDLr -/- ποντίκια [90]. Σε συνέχεια των μελετών προς αυτή την κατεύθυνση κατασκευάστηκαν μεταλλαγμένες μορφές της ApoE. Όταν επιβεβαιώθηκε ότι η περιοχή της ApoE είναι υπεύθυνη για την υπερτριγλυκεριδαιμία, εντοπίστηκαν δύο υδρόφοβες περιοχές του καρβοξυτελικού 31

32 άκρου, η πρώτη μεταξύ 261 και 269 και η δεύτερη μεταξύ 276 και 283. Οι δοκιμαστικές μεταλλάξεις που έγινα αφορούσαν τα υδρόφοβα αμινοξέα των περιοχών αυτών και παρήγαγαν δύο μεταλλαγμένες μορφές, την ApoE4mut1 και την ApoE4mut2 αντίστοιχα. Οι εστιακές μεταλλάξεις της ApoE4mut1 έγιναν στις θέσεις 261, 264, 265, 268 και 269 ενώ της ApoE4mut2 στις θέσεις 276, 279, 280 και 283. Η αντικατάσταση όλων των αμινοξέων έγινε με το μη πολικό αμινοξύ αλανίνη. Σε μελέτες σε ApoE-/- ποντίκια διαπιστώθηκε η ικανότητα της ApoE4mut1 να μειώνει σε φυσιολογικά επίπεδα τη χοληστερόλη χωρίς να επάγει τριγλυκεριδαιμία ακόμη και όταν εκφράζεται σε αυξημένα επίπεδα. Αντίθετα, η ApoE4mut2 παρουσιάζει παρόμοιες αδυναμίες με τη wt ApoE και προκαλεί ήπια υπετριγλυκεριδαιμία όταν υπερεκφράζεται, ενώ δεν προάγει την κάθαρση του αίματος από τη χοληστερόλη [91],[92]. Εικόνα 1.7. Θέσεις μεταλλάξεων στις ApoE4mut1 και ApoE4mut2 και οι διαφορετικές επιδράσεις τους στα λιπίδια ApoE-/- ποντικιών μετά από χορήγησή τους. 32

33 Εικόνα 1.8. Δευτεροταγής δομή της ApoE4mut1. 33

34 1.5 ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Τις τελευταίες δεκαετίες, μια σειρά επιδημιολογικών καθώς και κλινικών μελετών απέδειξαν οτι η δυσλιπιδαιμία και συγκεκριμένα τα υψηλά επίπεδα LDL χοληστερόλης στο πλάσμα αποτελούν βασικό παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης και στεφανιαίας νόσου. Αν και οι στατίνες είναι φάρμακα ιδιαίτερα αποτελεσματικά στην αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας και εδικότερα στην μείωση των επιπέδων της LDL χοληστερόλης, ένα σημαντικό κλάσμα του πληθυσμού που λαμβάνει στατίνες εξακαλουθεί να διατρέχει αυξημένο κίνδυνο για θανατηφόρα καρδιαγγειακά συμβάμματα. Επιπλέον, οι στατίνες προσφέρουν μικρό όφελος σε ασθενείς με ομόζυγη οικογενή υπερχοληστερολαιμία. Στην προσπάθεια για αναζήτηση νεών φαρμάκων που θα μειώνουν αποτελεσματικά τον κίνδυνο θανατηφόρων καρδιαγγειακών συμβαμμάτων στο σύνολο των ασθενών, πρόσφατα, αποδείχθηκε οτι μια μεταλλαγμένη μορφή της απολιποπρωτεΐνης Ε, η ApoE4mut1 μπορεί να προάγει, παρουσία του LDL υποδοχέα, την μείωση των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης του πλάσματος χωρίς την εμφάνιση υπερτριγλυκεριδαιμίας. Στην παρούσα εργασία, στόχος ήταν να ελεγχθεί εαν η apoe4mut1 μπορεί να προάγει την κάθαρση λιποπρωτεϊνών μέσω υποδοχέων διαφορετικών από τον κλασσικό LDLr. Πέρα όμως από την φαρμακοδυναμική μελέτη, θεωρήθηκε σκόπιμο να πραγματοποιηθεί και φαρμακοκινητικός χαρακτηρισμός της ApoE4mut1 ούτως ώστε να τεθούν οι βάσεις για περαιτέρω μελέτη της μεταλλαγμένης αυτής μορφής ως βιοδραστική ουσία για τη θεραπεία υπερλιπιδαιμιών και κατ επέκταση διαφόρων καρδιαγγειακών συμβαμμάτων. 34

35 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Για την ανάπτυξη των αδενοϊών χρησιμοποιήθηκαν δύο κυτταρικές σειρές: τα 911 κύτταρα που προέρχονται από ανθρώπινο ιστό ρετινοβλαστώματος και τα κύτταρα HEK 293 (Human Embryonic Kidney). Και οι δύο κυτταρικές γραμμές είναι σταθερώς διαμολυσμένες με τα γονίδια Ε1 και Ε4 του αδενοϊού. Η επιλογή τους οφείλεται στο γεγονός ότι διαμολύνονται πολύ εύκολα με το γονιδίωμα των αδενοϊών και είναι ιδιαίτερα παραγωγικά στην ανάπτυξη νέων ιών. Τα 293 πλεονεκτούν σε σχέση με τα 911, καθώς σχηματίζουν πολυστιβάδες και παρέχουν τη δυνατότητα ανάπτυξης μεγάλων ποσοτήτων του αδενοϊού. Για την επιβεβαίωση της in vitro έκφρασης των αδενοϊών σε κυτταροκαλλιέργειες χρησιμοποιούνται ανθρώπινα HTB-13 κύτταρα αστροκυττώματος τα οποία προέρχονται από νεοπλασία του εγκεφάλου που εμφανίζεται σε ένα ιδιαίτερο είδος γλοιοκυττάρων, τα αστροκύτταρα. Η επιλογή τους βασίστηκε στο γεγονός ότι δεν εκφράζουν ενδογενείς απολιποπρωτεΐνες καθώς και τροποποιητικά ένζυμα των λιποπρωτεϊνών. Συνεπώς, βρίσκουν χρήσιμες εφαρμογές στην εκτίμηση της έκφρασης απολιποπρωτεϊνών και τροποποιητικών ενζύμων των λιποπρωτεϊνών μετά από μόλυνση με τους αντίστοιχους ανασυνδυασμένους αδενοϊούς. Όλοι οι χειρισμοί των κυττάρων έγιναν σε θάλαμο νηματικής ροής που έχει αποστειρωθεί με υπεριώδη ακτινοβολία, διάλυμα SDS 1%, και διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70%. Η ανάπτυξη των αδενοϊών γίνεται σε ειδικά σχεδιασμένο δωμάτιο κυτταροκαλλιεργειών το οποίο πληρεί τους κανονισμούς ασφαλείας. Υλικά Κρυοφυαλίδια 1 ml (greiner bio-one), σωλήνες (falcons) χωρητικότητας 15mL, 50 ml (greiner bio-one), ορολογικές πιπέτες χωρητικότητας 5 και 10 ml (greiner bioone), σύριγγες χωρητικότητας 5, 10, 20 και 50 ml, φίλτρα σύριγγας με οπές διαμέτρου 0,22 μm, φλάσκες καλλιέργειας. 35

36 Τύπος φλάσκας Εταιρία Έκταση (cm 2 ) Λειτουργική Χωρητικότητα (ml) Τ-25 Greiner bio-one Τ-75 Greiner bio-one Τ-175 Greiner bio-one Τ-175 τριπλές φλάσκες Nunc Πίνακας 2-1. Φλάσκες που χρησιμοποιούνται στις κυτταροκαλλιέργειες. Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα PBS 10Χ Συστατικά dd H 2 O NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Ποσότητες 800 ml 80 gr 2gr 14.4 gr 2.4gr Πίνακας 2-2. Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος PBS 10X. Τα συστατικά αναμειγνύονται με μαγνητική ανάδευση και το ph ρυθμίζεται στο 7.4 με την κατά στάγδην προσθήκη διαλύματος HCl 1M ή NaOH 1M. Ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1X Παρασκευάζεται από το PBS 10X με αραίωση 1:10 σε ddh 2 O. Επειδή το διάλυμα αυτό χρησιμοποιείται για τις πλύσεις των κυττάρων πρέπει να είναι απόλυτα καθαρό και αποστειρωμένο. Γι αυτό μετά την παρασκευή του διαλύματος σε ογκομετρικό κύλινδρο, το διάλυμα φιλτράρεται με φίλτρο 0,22μm. Το φιλτραρισμένο διάλυμα τοποθετείται σε καλά πλυμένα και αποστειρωμένα μπουκάλια. Κατόπιν ακολουθεί αποστείρωση σε αυτόκαυστο θερμοκρασίας 121 ο C για 20 λεπτά. Μετά το τέλος της 36

37 αποστείρωσης το διάλυμα αφήνεται να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου και κατόπιν φυλάσσεται στους 4 ο C. Θρεπτικό υλικό Leibovitz (L-15 medium) 10% FBS Συστατικά Ποσότητα Τελική συγκέντρωση L-15 medium (Lonza) 435 ml - FBS (Biosera) 50 ml 10% NEAA (Lonza) 5 ml 1% L-Glutamine (Lonza) 5 ml 1% Pen-Strep (Lonza) 5 ml 1% Πίνακας 2-3. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 10% FBS. Κάθε μπουκάλι θρεπτικού μέσου L-15 περιέχει 500 ml. Για την παρασκευή του θρεπτικού, αφαιρούνται 65 ml ώστε να υπάρχει χώρος για την προσθήκη των υπόλοιπων υλικών. Κατόπιν προστίθενται οι ενδεδειγμένες ποσότητες από τα υπόλοιπα υλικά σε μία σύριγγα των 50 ml και φιλτράρονται με ένα φίλτρο 0,22μm. Μετά από μια καλή ανακίνηση για την ομογενοποίηση του διαλύματος, το μπουκάλι με το θρεπτικό φυλάσσεται στους 4 ο C. Θρεπτικό υλικό Leibovitz χωρίς ορό Παρασκευάζεται όμοια με το παραπάνω παραλείποντας τον ορό FBS. Διάλυμα τρυψίνης 1Χ Συστατικά Trypsin-EDTA 10X (Lonza) PBS 1X Ποσότητες 5 ml 45 ml Πίνακας 2-4. Παρασκευή του διαλύματος τρυψίνης 1Χ. 37

38 Παρασκευάζεται σε σωλήνα των 50 ml και φυλάσσεται στους 4 ο C. Θρεπτικό υλικό Leibovitz 20% FBS Συστατικά Θρεπτικό Leibovitz FBS Ποσότητες 40 ml 10 ml Πίνακας 2-5. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 20% FBS. Το διάλυμα παρασκευάζεται σε σωλήνα των 50 ml και τα επιμέρους υλικά φιλτράρονται πριν προστεθούν. Κατόπιν το διάλυμα διατηρείται στο ψυγείο. Θρεπτικό υλικό Leibovitz 20% FBS-20% DMSO Συστατικά Θρεπτικό Leibovitz FBS DMSO Ποσότητες 30 ml 10 ml 10 ml Πίνακας 2-6. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 20% FBS-20% DMSO. Το διάλυμα παρασκευάζεται σε σωλήνα των 50 ml και τα επιμέρους υλικά φιλτράρονται πριν προστεθούν. Κατόπιν το διάλυμα διατηρείται στο ψυγείο Απόψυξη κυττάρων Για την απόψυξη κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν T-75 φλάσκες καλλιέργειας στις οποίες είχαν προστεθεί 15 ml θρεπτικό υλικό L-15 10% FBS. Επιλέχθηκε το 38

39 κρυοφυαλίδιο με την επιθυμητή σειρά κυττάρων και μεταφέρθηκε από τους -80 ºC όπου βρισκόταν αποθηκευμένο, σε υδατόλουτρο 37 ºC. Μετά την απόψυξη, το περιεχόμενο του κρυοφυαλιδίου (1 ml) αποχύθηκε στη φλάσκα η οποία στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε επωαστήρα θερμοκρασίας 37 ºC. Στον επωαστήρα δε χρησιμοποιείται παροχή CO 2, διότι το θρεπτικό έχει ρυθμισμένο ph λόγω των συστατικών του. Μετά από 24 h το θρεπτικό υλικό αφαιρέθηκε, και ο πυθμένας της φλάσκας όπου βρίσκονταν τα προσκολλημένα κύτταρα ξεπλύθηκε δύο φορές με 15 ml PBS 1Χ, ώστε να απομακρυνθούν τα νεκρά κύτταρα και το διμέθυλο σουλφοξείδιο (DMSO). Το DMSO χρησιμοποιείται ως κυτταροπροστατευτικός παράγοντας για την ψύξη και διατήρηση κυττάρων καθώς συμμετέχει στην κρυσταλλική δομή του νερού παρεμποδίζοντας το σχηματισμό αιχμηρών κρυστάλλων. Ωστόσο, σε θερμοκρασίες δωματίου είναι τοξικό γι αυτό και πρέπει να απομακρύνεται. Μετά τις δύο σειρές πλύσεων ακολούθησε νέα προσθήκη θρεπτικού υλικού. Το θρεπτικό υλικό ανανεωνόταν κάθε 2-3 μέρες ανάλογα με την πληρότητα των κυττάρων και την επιθυμητή τελική χρήση τους Τρυψινοποίηση και ανακαλλιέργεια κυττάρων Όταν τα κύτταρα κάλυπταν πλήρως την επιφάνεια της φλάσκας (πληρότητα %) το θρεπτικό υλικό απομακρυνόταν και ακολουθούσαν πλύσεις με PBS 1Χ, ώστε να απομακρυνθεί ο αναστολέας της τρυψίνης, που περιέχεται στα φυσικά συστατικά του ορού FBS. Μετά το πέρας των πλύσεων, γινόταν προσθήκη διαλύματος τρυψίνης 1Χ σε ποσότητες ανάλογες με το μέγεθος της καλλιεργητικής φλάσκας (0,5 ml σε φλάσκα Τ-25, 1 ml σε Τ-75 και 2 ml σε Τ-175). Οι φλάσκες τοποθετούνταν στον επωαστήρα για 5 λεπτά, ώστε το ένζυμο τρυψίνη να ενεργοποιηθεί και να υδρολύσει τις πρωτεΐνες του υποστρώματος των κυττάρων προκειμένου να αποκολληθούν από την επιφάνεια καθώς και μεταξύ τους. Κατόπιν, η φλάσκα απομακρυνόταν από τον επωαστήρα, και σε αυτό το σημείο τα κύτταρα φαίνονταν να έχουν αποκολληθεί από τα τοιχώματα της φλάσκας και να συμπαρασύρονται από το υγρό. Μερικά προσεκτικά χτυπήματα σε οριζόντια θέση βοηθούσαν τη μηχανική αποκόλλησή τους, σε περιοχές όπου η τρυψίνη δεν είχε μεγάλη αποτελεσματικότητα. Αμέσως μετά, ακολουθούσε προσθήκη θρεπτικού υλικού Leibovitz 10% FBS ώστε να ανασταλεί η δράση του ενζύμου. Σε όρθια θέση, γινόταν ανακίνηση με τη βοήθεια πιπέτας αναρροφώντας και εκρέοντας αρκετές φορές το θρεπτικό υλικό που περιείχε τα αποκολλημένα κύτταρα, ώστε να διαλυθούν 39

40 τα συσσωματώματα κυττάρων. Τέλος, συμπληρωνόταν επιπλέον θρεπτικό υλικό και οι φλάσκες τοποθετούνταν εκ νέου στον επωαστήρα Ψύξη κυττάρων Η διαδικασία αναφέρεται ενδεικτικά και προσαρμόζεται ανάλογα με τις ποσότητες κυττάρων που προορίζονται για φύλαξη. Για να ληφθούν τελικά 10 κρυοφιαλίδια με 1 ml κύτταρα το καθένα χρησιμοποιήθηκαν 2 φλάσκες Τ-175 οι οποίες βρίσκονταν σε επίπεδα πληρότητας της τάξης του %. Το θρεπτικό υλικό αφαιρέθηκε και οι φλάσκες ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS 1Χ. Κατόπιν ακολουθήθηκε η διαδικασία τρυψινοποίησης όπως και στην ανακαλλιέργεια. Συγκεκριμένα, προστέθηκαν 2 ml διαλύματος τρυψίνης σε κάθε φλάσκα και η διαδικασία διακόπηκε με 2 ml θρεπτικού υλικού Leibovitz 10% FBS. Με τον ίδιο τρόπο τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωληνάριο χωρητικότητας 50 ml και φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm στους 4 ºC για 10 λεπτά. Αποχύθηκε το υπερκείμενο, που περιείχε τοξικές μεταβολικές ενώσεις και νεκρά κύτταρα και προστέθηκε θρεπτικό υλικό Leibovitz 10% FBS. Με τη βοήθεια πιπέτας διαλυτοποιήθηκε το ίζημα και φυγοκεντρήθηκε και πάλι με τον ίδιο τρόπο. Ο στόχος των φυγοκεντρήσεων είναι να καθαριστούν όσο το δυνατό καλύτερα τα κύτταρα προς ψύξη. Τα σωληνάρια τοποθετήθηκαν στον πάγο. Στο τελικό ίζημα προστέθηκαν 5 ml διαλύματος 20% FBS και ακολούθησε καλή διαλυτοποίηση του ιζήματος. Στη συνέχεια προστέθηκαν αργά και στάγδην 5 ml διαλύματος 20% FBS- 20% DMSO, διότι η αντίδραση που προκύπτει είναι εξώθερμη και η απότομη ανάμειξη μπορεί να αυξήσει τη θερμοκρασία του θρεπτικού, με κίνδυνο την καταστροφή των κυττάρων. Το μίγμα αναδεύτηκε με πιπέτα και διανεμήθηκε από 1mL σε 10 κρυοφιαλίδια, τα οποία τοποθετήθηκαν στους -80 ºC. 2.2 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΤΙΤΛΟΔΟΤΗΣΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΑΔΕΝΟΙΩΝ Η κατασκευή ανασυνδυασμένων αδενοϊών που εκφράζουν τις πρωτεΐνες GFP, WT apoe4 και apoe4mut1 έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες ερευνητικές εργασίες. Ύστερα από μεγάλης κλίμακας μόλυνση ΗΕΚ-293 κυττάρων σε τριπλές φλάσκες, οι ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί καθαρίστηκαν μέσω δύο συνεχόμενων βημάτων υπερφυγοκέντρησης σε διαβάθμιση πυκνότητας CsCl. Στη συνέχεια ακολούθησε 40

41 διαπίδυση και τιτλοδότηση, από την οποία προέκυψαν τίτλοι της τάξης του 1-2 pfu/ml Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Στις τριπλές φλάσκες προστίθενται 90 ml από θρεπτικό υλικό L-15 10% FBS. Τα κύτταρα αφήνονται να μεγαλώσουν για 4 μέρες και όταν όλη η επιφάνεια των τριπλών φλασκών καλύπτεται από κύτταρα, γίνεται αλλαγή του θρεπτικού υλικού. Αυτή τη φορά το θρεπτικό υλικό που προστίθεται είναι θρεπτικό υλικό Leibovitz με θερμικά απενεργοποιημένο ορό αλόγου (Heat Inactivated Horse Serum - HIHS), το οποίο παρασκευάζεται ως εξής: Θρεπτικό υλικό Leibovitz 2% HIHS Αντιδραστήρια Ποσότητες Τελική συγκέντρωση Θρεπτικό υλικό Leibovitz 475 ml - HIHS 10 ml 2% NEAA 5 ml 1% L-Glut 5 ml 1% Pen-Strep 5 ml 1% Πίνακας 2-7. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 2% HIHS. Ο ορός του αλόγου υφίσταται θερμική απενεργοποίηση στους 65 ºC. Κατόπιν, ο ορός φιλτράρεται, ισομοιράζεται σε σωλήνες των 50 ml και φυλάσσεται στους -20 ºC Επιμόλυνση τριπλών φλασκών με τους αδενοϊούς AdGFP, AdGFP-E4wt, AdGFP-E4mut1 Πριν την επιμόλυνση των τριπλών φλασκών, πραγματοποιήθηκε επιμόλυνση καλλιεργειών 911 κυττάρων σε Τ-175 φλάσκες με τον εκάστοτε ιό. Για την ακρίβεια, για κάθε ιό χρησιμοποιήθηκε μια Τ-175 φλάσκα που ήταν πλήρης με 911 κύτταρα και στην οποία είχαν προστεθεί 30 ml θρεπτικού υλικού Leibovitz 2% HIHS. Εκεί 41

42 προστέθηκε μια ποσότητα 100 μl από το stock του κάθε αδενοϊού. Το στάδιο αυτό απαιτείται, ώστε ο ιός που βρισκόταν φυλαγμένος σε βαθειά κατάψυξη στους -80 ο C, να επανακτήσει την μολυσματικότητά του και να είναι απόλυτα λειτουργικός. Για τη μαζική παραγωγή των ανασυνδυασμένων αδενοϊών, χρησιμοποιήθηκαν 48 τριπλές φλάσκες (8 για κάθε ιό). Για τις οκτώ φλάσκες που αντιστοιχούσαν σε κάθε ιό, χρειάστηκαν 720 ml θρεπτικού υλικού Leibovitz 2% HIHS. Σε αυτή την ποσότητα προστέθηκαν 5 ml μολυσματικού υλικού που προέρχεται από τις μονές Τ- 175 φλάσκες με τα 911 κύτταρα και κατόπιν το μίγμα αυτό ισομοιράστηκε στις οκτώ φλάσκες. Ακολούθησε αναμονή 2-3 ημερών (48-72h), ώστε να παραχθούν μεγάλες ποσότητες αδενοϊού. Η φάση συλλογής του υλικού εκτιμήθηκε με βάση την έναρξη της κηλιδωτής αποκόλλησης των κυττάρων καθώς και την παρατήρηση φθορισμού των κυττάρων λόγω της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), που παράγεται από το γενετικό υλικό του ανασυνδυασμένου αδενοϊού. Στόχος ήταν η απομόνωση ακέραιων κυττάρων ΗΕΚ 293 που περιέχουν μεγάλες ποσότητες αδενοϊού στο κυτταρόπλασμα τους. Με απλή ανακίνηση των φλασκών τα μολυσμένα κύτταρα αποκολλώνται. Δεν απαιτείται χρήση τρυψίνης διότι λόγω της μόλυνσης τους τα κύτταρα αποκολλώνται εύκολα Συλλογή των μολυσμένων με τους ιούς κυττάρων 293 Σε πρώτη φάση, μετά την αποκόλληση των κυττάρων συλλέχθηκε το υπερκείμενο των τριπλών φλασκών σε σωλήνες των 50 ml. Στη συνέχεια οι σωλήνες φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις 1500 rpm και κατόπιν το υπερκείμενο απομακρύνθηκε με πιπέτα κρατώντας το ίζημα το οποίο περιέχει τα 293 κύτταρα μέσα στα οποία είναι εγκλωβισμένοι οι ιοί. Τέλος, η πελέτα (ίζημα) επαναδιαλυτοποιήθηκε σε 1 ml θρεπτικού υλικού Leibovitz χωρίς ορό ενώ οι σωλήνες ξεπλύθηκαν με ακόμη 1 ml θρεπτικού. Με αυτό τον τρόπο κύτταρα και ιοί εμπεριέχονταν σε 2 ml θρεπτικού υλικού. Στο σημείο αυτό η κυτταρική πελέτα μπορεί να διατηρηθεί στους -80 ºC, ώστε να συνεχιστεί η απομόνωση του ιού σε μελλοντικό χρόνο Καθαρισμός των αδενοϊών Υλικά 42

43 Διαυγή σωληνάρια φυγοκέντρησης (Ultra-Clear ultracentrifuge tubes, Beckman), ειδικά σωληνάρια (Quick Seal tubes, Beckman), σύριγγα των 5 ml, κασέτα διαπίδυσης (slide-a lyzer dialysis cassette, Pierce), κρυοφιαλίδια 1 ml (greiner bio-α), ποτήρια ζέσεως 1L, μαγνητικός αναδευτήρας, υπερφυγόκεντρος Beckman, κεφαλή υπερφυγοκέντρου SW-41 και Ti-75. Διαλύματα Θρεπτικό υλικό Leibovitz 2% HIHS Βλέπε παράγραφο Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA 1X (TE buffer 1X) Συστατικά Ποσότητες 1Μ Tris, ph ml 1 ml 0.5M EDTA ph 8 1mL ddh 2 O 494 ml Πίνακας 2-8. Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος TE 1X. Το διάλυμα φιλτράρεται με φίλτρο 0,22 μm και αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο θερμοκρασίας 121 ο C για 20 λεπτά. Διαλύματα CsCl για την υπερφυγοκέντρηση - CsCl διάλυμα-1 (Adenovirus purification solution 1): 610 g/l σε TE, ph CsCl διάλυμα-2 (Adenovirus purification solution 2): 277 g/l σε TE, ph CsCl διάλυμα-3 (Adenovirus purification solution 3): 450 g/l σε TE, ph 8.0 Διάλυμα TD 10X Συστατικά NaCl Τελική συγκέντρωση 1.37 M 43

44 Tris-HCl [ph 7.4] Na 2 HPO 4 KCl 250 mm 7.3 mm 50 mm Πίνακας 2-9. Παρασκευή του διαλύματος TD 10X. Τα αντιδραστήρια προστίθενται σε ddh 2 O, το pη ρυθμίζεται στο 7.8 και το διάλυμα φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 o C. Διάλυμα TD 1X Για διάλυμα TD 1Χ γίνεται αραίωση με dd H 2 O σε αναλογία 1:10. Ρυθμιστικό διάλυμα Ca 2+ /Mg 2+ (Ca 2+ /Mg 2+ buffer) 200Χ Συστατικά Τελική συγκέντρωση CaCl M MgCl 2 0.1M Πίνακας Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος Ca2+/Mg2+ 200Χ. Το διάλυμα φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 o C. Διάλυμα TD 1Χ με Ca 2+ /Mg 2+ Συστατικά dd H 2 O TD 10x Ca 2+ /Mg 2+ buffer 200x Τελική συγκέντρωση 70% v/v 10% v/v 0.5% v/v Πίνακας Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος TD 1Χ με Ca 2+ /Mg 2+. Το διάλυμα φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 o C. 44

45 Ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων (Salt buffer) 10Χ Συστατικά NaCl Na 2 HPO 4.2H 2 O KH 2 PO 4 Τελική συγκέντρωση 1.4 M 49 mm 15 mm Πίνακας Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος αλάτων 10Χ. Το ph ρυθμίζεται στο 7.8, το διάλυμα φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 o C. Ρυθμιστικό διάλυμα σουκρόζης (Sucrose buffer) 10Χ ή 50% w/v Προστίθεται 1kg σουκρόζης σε 2 L dd H 2 O. Το διάλυμα φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 o C. Ρυθμιστικό διάλυμα σουκρόζης (Sucrose buffer) 1Χ Συστατικά Salt buffer 10x Sucrose buffer 10x Τελική συγκέντρωση 10% v/v 10% v/v Πίνακας Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος σουκρόζης 1Χ. Το διάλυμα φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 o C. Πειραματική πορεία Αρχικά έγινε ψύξη των σωλήνων (50 ml) που περιείχαν τα κύτταρα και τους εγκλωβισμένους ιούς στους -80 ºC και απόψυξη στους 37ºC ούτως ώστε να λυθούν τα κύτταρα και να απελευθερωθεί ο ιός. Αυτή η διαδικασία πραγματοποιήθηκε τρεις φορές (κύκλοι ψύξης-απόψυξης/freeze-thaw cycles). Στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά, στους 4 ºC και στις 4000 rpm για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα των κυττάρων και οι ιοί να παραμείνουν στο υπερκείμενο. Έπειτα ακολουθήθηκε η διαδικασία διαβάθμισης πυκνότητας όπως φαίνεται στην (Εικόνα 45

46 2.1), χρησιμοποιώντας συνολικά 12 σωληνάκια φυγοκέντρησης (2 για κάθε ιό). Στα ειδικά διαυγή σωληνάρια φυγοκέντρησης που εφαρμόζουν στην κεφαλή SW-41 της υπερφυγοκέντρου Beckman, προστέθηκαν αρχικά 2 ml διαλύματος CsCl-Solution 1 και στη συνέχεια 4 ml διαλύματος CsCl-Solution 2. Επειδή το διάλυμα 2 είναι ελαφρύτερο από το διάλυμα 1, η προσθήκη του δεύτερου διαλύματος έγινε με αργό ρυθμό, ώστε να μην αναμιχθεί με το πρώτο και να διατηρηθεί η βαθμίδωση πυκνότητας. 30 ml 2% HIHS L-15 θρεπτικό μl stock ιού 90 ml 2% HIHS L-15 θρεπτικό + Μολυσματικό μέσο T-175 φλάσκα 911 κύτταρα 2-3 μέρες T-175 τριπλή φλάσκα 293 κύτταρα 2-3 μέρες -80 ο C Φυγοκέντρηση 1500rpm 4 ο C 10 Φυγοκέντρηση 4000rpm 4 ο C 10 3 κύκλοι ψύξης απόψυξης (-80 / +37 ο C) υπερκείμενο CsCl-διάλυμα 2 CsCl-διάλυμα 1 Φυγοκέντρηση rpm 15 ο C 2h Λήψη της ζώνης με σύριγγα ζώνη CsCl διάλυμα 3 Φυγοκέντρηση 55000rpm 15 ο C 16h Εικόνα 2.1. Σχηματική αναπαράσταση ανάπτυξης και απομόνωσης αδενοϊών. Η όλη διαδικασία της υπερφυγοκέντρησης γίνεται για να φιλτραριστούν μέσω της διαβάθμισης πυκνότητας οι αδενοϊοί από τα διάφορα υπολείμματα των κυττάρων. Στο τέλος προστέθηκε το πλούσιο σε αδενοϊούς υπερκείμενο που συλλέχθηκε από τα μολυσμένα HEK-293 κύτταρα και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 30,000 rpm στους 15 ºC για 2h. Μετά την υπερφυγοκέντρηση αναρροφήθηκε με σύριγγα η νεφελώδης ζώνη που σχηματίστηκε στη διαχωριστική επιφάνεια των δυο διαλυμάτων CsCl, και αντιστοιχεί στο γενετικό υλικό τόσο του ιού όσο και των κυττάρων. Για τον διαχωρισμό τους το υλικό μεταφέρθηκε σε νέο ειδικό σωληνάριο (Quick Seal tubes), όπου προστέθηκε διάλυμα CsCl-Solution 3 (Adenovirus solution 3), το οποίο 46

47 ξεχωρίζει το νεκρό από το ζωντανό ιό. Στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση με την κεφαλή Ti-75 στις 55,000 rpm στους 15 ºC για περίπου 16h. Εικόνα 2.2. Σχηματική απεικόνιση της απομόνωσης αδενοϊών. Την επόμενη μέρα μετά το πέρας της φυγοκέντρησης αναρροφήθηκε η κατώτερη νεφελώδης ζώνη που σχηματίστηκε (Εικόνα 2.2). Η ανώτερη ζώνη αποτελείται από άδεια ιϊκή κάψα, η οποία δεν πρέπει να αναμιχθεί με το γενετικό υλικό του αδενοϊού. Ακολούθως, το υλικό μεταφέρθηκε στην κασέτα διαπίδυσης η οποία και τοποθετήθηκε σε δοχείο με το ρυθμιστικό διάλυμα 1X TD με Ca 2+ /Mg 2+ στους 4ºC και υπό ανάδευση, ώστε να δημιουργηθεί υπότονο περιβάλλον ως προς το CsCl και να απομακρύνεται συνεχώς αυτό από την ημιπερατή μεμβράνη. Το διάλυμα αυτό ανανεώθηκε τουλάχιστον τρεις φορές και μετά από 16 ώρες να αντικαταστάθηκε με το διάλυμα TD 1Χ με Ca 2+ /Mg 2+ με ισοτονικό διάλυμα σουκρόζης (sucrose buffer 1Χ) για τρείς επιπλέον ώρες. Αμέσως μετά, το περιεχόμενο της κασέτας συλλέχθηκε σε Κρυοφυαλίδια, στο καθένα από τα οποία προστέθηκαν 100μL και τα οποία φυλάχθηκαν στους 80 ºC Τιτλοδότηση αδενοϊών Για την τιτλοδότηση των αδενοϊών υπάρχουν δύο εναλλακτικές μέθοδοι. Η πρώτη είναι με καταμέτρηση ιϊκών πλακών και η δεύτερη με φασματοφωτομετρία υπεριώδους φωτός. 47

48 Τιτλοδότηση αδενοϊών με καταμέτρηση πλακών Για τη διαδικασία αυτή απαιτείται ένα πιάτο 6 πηγαδιών (greiner bio-one) για τη τιτλοδότηση δύο αδενοϊών. Κατά συνέπεια, για την τιτλοδότηση των 6 ιών χρειάστηκαν 3 πιάτα. Κάθε πηγαδάκι του πιάτου πρέπει να είναι % πλήρες με 911 κύτταρα, γι αυτό και χρειάζεται μεγάλη ακρίβεια και προσοχή στο στρώσιμο των κυττάρων. Τα 911 κύτταρα προτιμώνται για την τιτλοδότηση καθώς σχηματίζουν μονοστιβάδες και έτσι είναι πιο εύκολη και ακριβής η καταμέτρηση των πλακών. Επιπλέον, απαιτούνται 6 σωληνάκια των 15 ml για κάθε ιό. Σε κάθε ένα απ αυτά τα 6 σωληνάκια προστίθεται 1 ml θρεπτικού υλικού L-15 free serum ή L-15 2% HIHS. Τα σωληνάκια ονομάζονται κατάλληλα με τους αριθμούς 2, 4, 6, 8, 9, 10 οι οποίοι υποδηλώνουν την τάξη του ιού στη συγκεκριμένη αραίωση (πχ. αν προκύψουν 5 πλάκες από το υλικό του falcon τον αριθμό 9, τότε ο ιός έχει μολυσματικότητα της τάξης των 5x10 9 pfu/ml). Αρχικά στο falcon με τον αριθμό 2 προστίθενται 20μL από τον ιό και γίνεται καλή ανάδευση σε vortex. Στη συνέχεια λαμβάνονται 10 μl από το μείγμα του σωλήνα 2 και μεταφέρονται στο σωλήνα 4. Ακολουθεί και πάλι καλή ανάδευση και λαμβάνονται άλλα 10 μl τα οποία μεταφέρονται στο σωλήνα 6 και με την ίδια διαδικασία μεταφέρονται στη συνέχεια 10 μl από το σωλήνα 6 στο σωλήνα 8. Σε αυτό το σημείο ο όγκος μεταφοράς από τον σωλήνα 8 στον σωλήνα 9 και από τον σωλήνα 9 στο σωλήνα 10 γίνεται 100 μl. Μεγάλη προσοχή πρέπει να δοθεί στην αλλαγή του tip ανάμεσα στις διαδοχικές αραιώσεις, ώστε να υπάρχει μεγάλη ακρίβεια. Όταν ετοιμαστούν οι αραιώσεις του ιού ακολουθεί αφαίρεση του θρεπτικού από τα 911 κύτταρα και δύο πλύσεις με PBS 1Χ. Για τη τιτλοδότηση του κάθε ιού χρησιμοποιούνται τελικά μόνο οι τρεις τελευταίες αραιώσεις (8, 9, 10). Έτσι, σε κάθε πιάτο η πάνω σειρά πηγαδιών χρησιμοποιείται για τον ένα αδενοϊό και η κάτω για τον άλλο. Στο καπάκι του πιάτου σημειώνεται πάνω από κάθε πηγάδι το όνομα του αδενοϊού και η συγκέντρωση (8, 9, 10). Σε κάθε πηγάδι προστίθενται 500 μl από τον αντίστοιχο σωλήνα. Γίνεται ανάδευση με κυκλικές κινήσεις ώστε να γίνει καλή διασπορά του ιού και στη συνέχεια τα πιάτα τοποθετούνται στον επωαστήρα στους 37 ο C. Ακολουθεί επώαση 20 λεπτών, με ανάδευση των πιάτων κάθε δύο λεπτά. 48

49 Κατόπιν ετοιμάζεται το θρεπτικό υλικό της επικάλυψης (Πίνακας 2-14). Επειδή σε κάθε πηγαδάκι τοποθετούνται 2 ml και κάθε πιάτο έχει 6 πηγαδάκια, χρειάζονται 12 ml. Όμως επειδή συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 3 πιάτα, χρειάστηκαν συνολικά 36 ml. Συστατικά 2Χ L-15 HIHS NEAA L-Glut Ποσότητες 13 ml 5 ml 1 ml 1 ml Το μίγμα τοποθετείται σε υδατόλουτρο ο C Κατόπιν προστίθεται το 2Χ Agar που βρίσκεται στην ίδια θερμοκρασία 2X Agar 20 ml Πίνακας Παρασκευή του θρεπτικού επικάλυψης για την τιτλοδότηση των αδενοϊών. Με το πέρας των 20 λεπτών της επώασης, απομακρύνονται τα 500 μl μολυσματικού θρεπτικού υλικού που είχαν τοποθετηθεί σε κάθε πηγαδάκι και προστίθενται στάγδην και με μεγάλη προσοχή 2 ml θρεπτικού επικάλυψης. Το άγαρ αφήνεται να πήξει για 3 με 5 λεπτά μέσα στην απαγωγό εστία, η οποία πρέπει να είναι απενεργοποιημένη, ώστε να μην αναταραχθεί η επιφάνεια του σχηματιζόμενου τζελ. Μόλις το τζελ πήξει, τα πιάτα τοποθετούνται τον επωαστήρα. Μετά από περίοδο 2 εβδομάδων τα πιάτα παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού για την ύπαρξη πλακών. Τα κύτταρα που είχαν μολυνθεί από τον ιό είχαν μολύνει και τα γειτονικά τους με αποτέλεσμα το ομοιογενές στρώμα των κυττάρων να διακόπτεται από κουκίδες κενών περιοχών που αντιστοιχούν σε νεκρά από τον ιό κύτταρα. Κάθε τέτοια κουκίδα θεωρείται μια πλάκα και ο συνολικός αριθμός των πλακών εκφράζει και τη μολυσματικότητα του ιού όπως προαναφέρθηκε. 49

50 Τιτλοδότηση αδενοϊών με φασματοφωτομέτρηση Για την τιτλοδότηση του διαλύματος του αδενοϊού χρησιμοποιήθηκε και η μέθοδος της φασματοφωτομέτρησης, ώστε να επιβεβαιωθούν οι τίτλοι που προέκυψαν από την προηγούμενη μέθοδο. Διαλύθηκαν 25 μl από το διάλυμα που προήλθε από τη διαπίδυση σε 475 μl sucrose buffer 1Χ και μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση στα 260 nm (OD 260 ). Η συγκέντρωση υπολογίζεται ως εξής. Σύνολο ιϊκών σωματιδίων = OD 260 x 20 x 5 x Όπου το 20 αντιστοιχεί στην αραίωση του ιϊκού διαλύματος (Dilution factor) και 5 x είναι το πλήθος των ιϊκών σωματιδίων που αντιστοιχεί στην απορρόφηση OD 260 = 1. Μόνο 1% των σωματιδίων αυτών αντιστοιχεί σε μολυσματικό ιό άρα ο πραγματικός τίτλος του ιού είναι: Τίτλος ιού (σε pfu/ml) = (OD 260 x 20 x 5 x 10 9 ) 2.3 IN VITRO ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΓΡΙΟΥ ΤΥΠΟΥ APOE4 ΚΑΙ ΤΗΣ APOE4mut1 ΣΕ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ HTB-13 Κύτταρα ΗΤΒ-13 καλλιεργήθηκαν σε πιάτα καλλιέργειας έξι πηγαδιών με θρεπτικό μέσο L-15 10% FBS μέχρι πληρότητας. Η πειραματική αυτή διαδικασία διαρκεί 5 μέρες και η πορεία της περιγράφεται ως εξής: Την 1 η μέρα τα κύτταρα της καλλιέργειας ξεπλένονται δυο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1Χ, για να απομακρυνθούν τα νεκρά κύτταρα και οι τοξικές ουσίες του μεταβολισμού τους. Στη συνέχεια προστίθενται 2 ml θρεπτικού υλικού L-15 serum free. Για τη διαδικασία αυτή απαιτείται θρεπτικό υλικό το οποίο δεν περιέχει ορό γιατί ο ορός περιέχει αντισώματα τα οποία δημιουργούν σύμπλοκα με τον ιό με αποτέλεσμα να μειώνουν την μολυσματική του ιδιότητα. Η μόλυνση των πλακιδίων έξι πηγαδιών πραγματοποιείται με τους ανασυνδυασμένους ιούς AdGFP, AdGFP- E4wt, AdGFP-E4. Υπό αυτές τις συνθήκες τα ΗΤΒ-13 κύτταρα εκκρίνουν την apoe σε μια απολιπιδιωμένη μορφή. Τη 2 η μέρα απομακρύνθηκε το μολυσματικό μέσο και τα κύτταρα πλύθηκαν δυο φορές με PBS 1Χ. Στη συνέχεια προστέθηκε στα κύτταρα θρεπτικό υλικό L-15 10% 50

51 FBS έτσι ώστε τα κύτταρα να λάβουν όλα τα απαραίτητα θρεπτικά υλικά για να ανακάμψουν από τη διαδικασία της μόλυνσης. Οι ενεργοί ιοί έχουν ήδη εισέλθει στα κύτταρα και δεν επηρεάζονται από τον ορό την ύπαρξη ορού στο κυτταρικό μέσο. Την 3 η μέρα απομακρύνθηκε και πάλι το θρεπτικό υλικό και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS 1Χ. Στη συνέχεια προστέθηκαν 2 ml L-15 serum free και τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στον επωαστήρα για 16h. Σε αυτή την περίπτωση το θρεπτικό L-15 serum free είναι απαραίτητο γιατί έτσι μειώνεται ο αριθμός των πρωτεϊνών που θα περιέχονται στα δείγματα της 4 ης και 5 ης μέρας και μπορεί να δημιουργήσουν «θόρυβο» στις μετέπειτα αναλύσεις. Την 4 η μέρα απομονώθηκαν 500 μl μολυσματικού μέσου τα οποία φυλάχθηκαν σε σωληνάκια τύπου eppendorf στους -80 ο C. Αυτή θεωρείται η πρώτη μέρα συλλογής. Το μέσο που συλλέχθηκε υπέστη μια ολονύχτια διαπίδυση σε ποτήρι ζέσεως που περιείχε νερό και βρισκόταν υπό μαγνητική ανάδευση, ώστε να απομακρυνθούν τα διάφορα άλατα του θρεπτικού υλικού. Αυτή η διαδικασία στοχεύει στην περαιτέρω ελαχιστοποίηση του «θορύβου» κατά την πραγματοποίηση του SDS-PAGE και του Western blotting. Την 5 η μέρα, που αποτελεί τη δεύτερη μέρα συλλογής, απομονώθηκαν τα υπόλοιπα 1500 μl μολυσματικού μέσου. Το μολυσματικό υλικό που συλλέχθηκε την 4 η και την 5 η μέρα κατόπιν της διαπίδυσης, υπέστη λυοφιλοποίηση σε συσκευή ξήρανσης υπό κενό αέρος (speedvac). Η λυοφιλοποίηση γίνεται προκειμένου τα δείγματα να συμπυκνωθούν και να προκύψει μεγαλύτερη συγκέντρωση πρωτεΐνης σε μικρότερο όγκο. Συγκεκριμένα, τα δείγματα τοποθετήθηκαν στο speedvac για 3-4 ώρες έως ότου απέμεινε μια λευκοκίτρινη σκόνη σε κάθε σωληνάκι. Σε αυτό το σημείο, προστέθηκαν 20μL ddh 2 O σε κάθε σωληνάκι και τα δείγματα ήταν έτοιμα για τις αναλύσεις με SDS-PAGE και του Western blotting Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE Electrophoresis) Για να δειχθεί ότι όλοι οι ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί που επρόκειτο να χρησιμοποιηθούν στα in vivo πειράματα εξέφραζαν τις αντίστοιχες πρωτεΐνες πραγματοποιήθηκε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια χρώση των πηκτωμάτων με χρώση coomassie για τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών ζωνών καθώς 51

52 και Western blotting. Η SDS-PAGE πραγματοποιήθηκε και στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα που προέκυψαν από τα πλάσματα των πειραματόζωων και ακολούθησε εντοπισμός των πρωτεϊνικών ζωνών με Western blotting. Αρχή της μεθόδου Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) κατατάσσεται στις τεχνικές διαχωρισμού πρωτεϊνικών μορίων σε κυτταρικά δείγματα ή δείγματα ιστών. Η αρχή λειτουργίας της βασίζεται στην μετανάστευση των ηλεκτρικά φορτισμένων πρωτεϊνών του δείγματος μέσω πηκτής πολυακρυλαμιδίου κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες αποδιατάσσονται παρουσία του ανιονικού απορρυπαντικού SDS και σχηματίζουν ένα ηλεκτραρνητικό σύμπλοκο SDS-πρωτεΐνης, το οποίο μεταναστεύει μέσα από την πορώδη πηκτή. Το SDS αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες με πρόσδεσή του στην πολυπεπτιδική αλυσίδα σε αναλογία μάζας SDS προς πρωτεΐνη 1,4:1. Συνεπώς, όλες οι πρωτεΐνες ανεξάρτητα από την αλληλουχία τους φορτίζονται αρνητικά και όσο πιο μεγάλη είναι η πρωτεΐνη τόσο μεγαλύτερο είναι το αρνητικό φορτίο. Ένας αναγωγικός παράγοντας (2 μερκαπτοαιθανόλη ή DTT-diothreitol) προστίθεται για τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών (S-S). Κάτω από αυτές τις συνθήκες οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν με ταχύτητα ανάλογη του μοριακού τους βάρους. Το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης υπολογίζεται σε σχέση με την ηλεκτροφορητική μετανάστευση πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους και η σχετική κινητικότητα μιας πρωτεΐνης είναι αντίστροφος ανάλογη του λογαρίθμου του μοριακού βάρους. Ο διαχωρισμός πρωτεϊνών σε πολυακρυλαμίδη χρησιμοποιείται για ποσοτική και ποιοτική ανάλυση ενός διαλύματος πρωτεϊνών καθώς και για τον προσδιορισμό μοριακού βάρους μιας πρωτεΐνης. Οι πηκτές ακρυλαμίδης σχηματίζονται με πολυμερισμό της ακρυλαμίδης με το αντιδραστήριο διασταύρωσης Ν,Ν μεθυλένο-δισ-ακρυλαμίδιο. Η αντίδραση πολυμερισμού διευκολύνεται από το υπερθειϊκό αμμώνιο (APS) που προκαλεί την δημιουργία ελευθέρων ριζών, και του καταλύτη N,N τετραμεθυλ-ενοαιθυλ-ενο-διαμίνη (TEMED) που καταλύει την μετάδοση ελευθέρων ριζών στο σύστημα πολυμερισμού. Η πυκνότητα της πηκτής εξαρτάται από το μέγεθος των πρωτεϊνών που πρόκειται να διαχωριστούν [93]. Για την δημιουργία της πηκτής απαιτούνται δύο ειδικές γυάλινες πλάκες και η πηκτή αποτελείται από δύο 52

53 πηκτώματα, το πήκτωμα διαχωρισμού (separating gel) που διαχωρίζει τις πρωτεΐνες και το πήκτωμα επιστοίβαξης (stacking gel) που είναι η πηκτή εναπόθεσης, ώστε όλες οι πρωτεΐνες να ξεκινήσουν από το ίδιο σημείο και να αυξηθεί η διακριτική ικανότητα διαχωρισμού. Υλικά Συσκευή κατακόρυφης ηλεκτροφόρησης (Biorad) και τροφοδοτικό σταθερής έντασης, glass plates with 1.5mm spacer (Biorad), short plates (Biorad), 20% (w/v) Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Tris-HCl 1.5M ph 8.8, Tris-HCl 1.5M ph 6.8, 30% (w/v) acrylamide/0.8% (w/v) bis-acrylamide, 20% (w/v) υπερθειϊκό αμμώνιο (ammonium persulfate, APS), N,N τετραμεθυλ-ενο-αιθυλ-ενο-διαμίνη (TEMED), διάλυμα ηλεκτροφόρησης-protein Running Buffer 10Χ, διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων-sample loading buffer (New England Biolabs), prestained protein marker KDa (New England Biolabs), Ισοπροπανόλη, Αιθανόλη, dd H 2 O. Διαλύματα Πήκτωμα επιστοίβαξης Συστατικά Ποσότητες Μίγμα ακρυλαμίδης 30% 1,7 ml Tris-HCl ph 6.8 1,25 ml ddh 2 O 6,8 ml 20% SDS 100 μl 10% APS 100 μl TEMED 10 μl Πίνακας Παρασκευή του πηκτώματος επιστοίβαξης της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης. 53

54 Πήκτωμα διαχωρισμού Συστατικά Ποσότητες Μίγμα ακρυλαμίδης 30% 20,0 ml Tris-HCl ph ,5 ml ddh 2 O 16,5 ml 20% SDS 500 μl 10% APS 500 μl TEMED 20 μl Πίνακας Παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης. Οι παραπάνω ποσότητες επαρκούν για την παρασκευή 4 πηκτωμάτων. Το TEMED δεν προστίθεται μαζί με τα υπόλοιπα διαλύματα αλλά στο τέλος, λίγο πριν προστεθεί το κάθε πήκτωμα στη συσκευή. Αμέσως μόλις προστεθεί το TEMED οι κινήσεις πρέπει να είναι πολύ γρήγορες καθώς ο πολυμερισμός έχει ξεκινήσει και επιταχύνεται. Διάλυμα ηλεκτροφόρησης 10Χ-Protein Running Buffer 10X Συστατικά Tris base Γλυκίνη SDS ddh 2 O Ποσότητες 30,3 g 144 g 10 g Μέχρι το 1L Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος ηλεκτροφόρησης 10Χ. Διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1Χ Γίνεται αραίωση από το διάλυμα ηλεκτροφόρησης 10Χ με ddh 2 O σε αναλογία 1:10. Πειραματική πορεία Οι γυάλινες πλάκες καθαρίστηκαν με SDS και αιθανόλη και τοποθετήθηκαν στη συσκευή προετοιμασίας της πηκτής. 54

55 Ανάμεσα στο κενό που δημιουργήθηκε από τα δύο τζαμάκια, προστέθηκε το μίγμα που θα αποτελούσε το πήκτωμα διαχωρισμού. Με τη χρήση πιπέτας προστέθηκε μιας μικρή ποσότητα ισοπροπανόλης ώστε να ευθυγραμμιστεί το υγρό και να απομακρυνθούν οι φυσαλίδες. Το πήκτωμα πολυμερίστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 15 περίπου λεπτά. Με διηθητικό χαρτί απομακρύνθηκε η ισοπροπανόλη. Το μίγμα που θα αποτελούσε το πήκτωμα επιστοίβαξης προστέθηκε πάνω από το πήκτωμα διαχωρισμού και αμέσως τοποθετήθηκε και η οδοντωτή κτένα με τις 12 εσοχές, ώστε να σχηματιστούν οι θέσεις για την τοποθέτηση των δειγμάτων. Οι πλάκες με τις πηκτές μεταφέρθηκαν στη συσκεύη ηλεκτροφόρησης η οποία ήταν πλήρης με ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης - Protein Running Buffer 1Χ. Το διάλυμα αυτό παρασκευάζεται με αραίωση του Protein Running Buffer 10Χ σε ddh 2 O. Σε αυτό σημείο έγινε η προετοιμασία των δειγμάτων. Όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη παράγραφο, μια συγκεκριμένη ποσότητα δείγματος υπέστη λυοφιλοποίηση και στη συνέχεια προσθήκη 20 μl ddh 2 O. Κατόπιν: Έγινε προσθήκη 5 μl Sample Loading Buffer. Με τη βοήθεια μιας βελόνας ανοίχθηκε μια τρύπα στο καπάκι κάθε eppendorf τα οποία τοποθετήθηκαν σε heat block 100 o C για 4 λεπτά ώστε να αποδιαταχτούν τα μόρια της πρωτεΐνης. Ακολούθησε μια ταχύτατη φυγοκέντρηση (spin down) ώστε να κατέβουν οι υδρατμοί από τα τοιχώματα στον πυθμένα του eppendorf. Αφαιρέθηκε η οδοντωτή χτένα από το πήκτωμα επιστοίβαξης και τα δείγματα φορτώθηκαν στα πηγαδάκια που έχουν σχηματιστεί. Στο πρώτο πηγαδάκι φορτώθηκαν 5 μl από τον μάρτυρα. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση στα 100 Volt για περίπου 90 λεπτά. 55

56 2.3.2 Χρώση πρωτεϊνών ακινητοποιημένων σε ακρυλαμίδιο με coomassie stain Αρχή της μεθόδου Με την μέθοδο αυτή μπορεί να διαπιστωθεί η ύπαρξη πρωτεϊνών στο δείγμα που διαχωρίστηκε προηγουμένως με την τεχνική της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη δημιουργία συμπλόκου κυανού χρώματος, μεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue R250. Διαλύματα Διάλυμα μονιμοποίησης/αποχρωματισμού (PAGE-fix/destain) Συστατικά Ποσότητες Περιεκτικότητα (% v/v) Μεθανόλη 400 ml 40 Οξικό οξύ (glacial) 70 ml 7 ddh 2 O 530 ml 53 Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος ηλεκτροφόρησης PAGE-fix/destain. Διάλυμα χρώσης Coomassie Συστατικά Διάλυμα PAGE-fix destain Coomassie brilliant blue R250 Ποσότητες 500 ml 1,25 g Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος χρώσης Coomassie. Πειραματική πορεία Με το τέλος της ηλεκτροφόρησης οι πλάκες αποσυνδέθηκαν από τις θέσεις στήριξής τους, απομακρύνθηκε το πήκτωμα επιστοίβαξης και οι πηκτές τοποθετήθηκαν σε δοχείο με διάλυμα page fix/destain. Έτσι αποφεύγεται η 56

57 διάλυση των πρωτεϊνών. Το δοχείο τοποθετήθηκε σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης για 20 λεπτά. Στο στάδιο αυτό καταβυθίζονται οι πρωτεΐνες. Το διάλυμα page fix/destain αποχύθηκε και προστέθηκε το διάλυμα coomassie stain για 20 λεπτά σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης. Η ποσότητα του διαλύματος είναι τόση ώστε να καλύπτονται πλήρως οι πηκτές. Κατόπιν αποχύθηκε το coomassie stain και προστέθηκε και πάλι page fix/destain για τουλάχιστον 2 ώρες, ώστε να απομακρυνθεί η μη δεσμευμένη με πρωτεΐνες χρωστική. Εάν χρειαστεί, επαναλαμβάνεται το βήμα του αποχρωματισμού μέχρι να αποχρωματιστεί πλήρως το πήκτωμα Προσδιορισμός της αγρίου τύπου ApoE4 και της ApoE4mut1 με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης κατά Western (Western blotting) Αρχή της μεθόδου Οι Towbin et al. το 1979 περιέγραψαν μία μέθοδο μεταφοράς πρωτεϊνών από πήκτωμα ακρυλαμίδης με SDS-PAGE σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος [94]. Έπειτα, με την προσθήκη ειδικών αντισωμάτων για συγκεκριμένη πρωτεΐνη, μπορεί να ανιχνευθεί η πρωτεΐνη αυτή. Καθώς οι πρωτεΐνες μεταφέρονται στην μεμβράνη, δεσμεύονται μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, διατηρώντας τις αντιγονικές τους ιδιότητες κι έτσι διευκολύνεται η αναγνώρισή τους από τα αντισώματα. Η μεμβράνη επωάζεται με το αντίσωμα έναντι της Fc περιοχής του πρώτου αντισώματος. Στο δεύτερο αντίσωμα βρίσκεται ομοιοπολικά συνδεδεμένο το ένζυμο της υπεροξειδάσης και με χημειοφωταύγεια λαμβάνεται σήμα στο σημείο που βρίσκεται η πρωτεΐνη ενδιαφέροντος. Υλικά Συσκευή και κασέτα μεταφοράς (Biorad), μεμβράνη μεταφοράς porablot PVDF membrane (Macherey-Nagel), ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1Χ, μεθανόλη (Merck), διηθητικό χαρτί Whatmann, blotting grade blocker-non-fat dry milk (Biorad), πρωτοταγές αντίσωμα Goat anti-apolipoprotein E,1mg/mL (Meridian Life Sciences), δευτεροταγές αντίσωμα Rabbit anti-goat IgG HRP (Abcarn), NP-40 Igepal 57

58 (Sigma), PBS 1Χ, ECL western blotting detection kit (Amersham Biosciences), διαλύματα photographic developer και fixer (Kodak), Kodak Film 13cm x 18cm. Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 10Χ Συστατικά Γλυκίνη Βάση Tris ddh2o Ποσότητες 144 g 20,2 g Μέχρι το 1L Πίνακας Παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς 10X. Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1Χ To ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1Χ, γίνεται με αραίωση 1:10 από το 10Χ. Δηλαδή για 1L χρειάζονται 100 ml ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 10Χ και 900 ml ddh 2 O. Blocking buffer 5% Συστατικά Blotting buffer milk PBS 1X Ποσότητες 10 g Μέχρι τα 200 ml Πίνακας Παρασκευή του blocking buffer 5%. Πρωτοταγές αντίσωμα, αραίωση 1:1000 Συστατικά Goat anti-apoe αντίσωμα Blocking buffer 5% Ποσότητες 10 μl 10 ml Πίνακας Παρασκευή του πρωτοταγούς αντισώματος για Western blotting. 58

59 Δευτεροταγές αντίσωμα, αραίωση 1:4000 Συστατικά Rabbit anti-goat αντίσωμα Blocking buffer 5% Ποσότητες 2,5 μl 10 ml Πίνακας Παρασκευή του δευτεροταγούς αντισώματος για Western blotting. Διάλυμα πλύσεων (wash buffer) Συστατικά NP-40 IGEPAL ddh 2 O Ποσότητες 5 ml 1L Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος πλύσεων για Western blotting. Πειραματική πορεία Πριν την μεταφορά: Η ηλεκτροφόρηση έγινε σύμφωνα με την παράγραφο Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης απομακρύνθηκε το πήκτωμα επιστοίβαξης και το πήκτωμα διαχωρισμού βυθίστηκε σε πυρέξ που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1Χ. Η μεμβράνη μεταφοράς καθώς και 6 κομμάτια διηθητικού χαρτιού κόπηκαν στις διαστάσεις του πηκτώματος και τα βυθίστηκαν μαζί με τα δύο σφουγγαράκια της κασέτας μεταφοράς στο πυρέξ που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1Χ. Προηγουμένως η μεμβράνη είχε ενεργοποιηθεί σε μικρή ποσότητα απόλυτης μεθανόλης. Στη συνέχεια από την κάθοδο προς την άνοδο της κασέτας μεταφοράς, στοιβάχτηκαν με τη σειρά τα ακόλουθα : Σφουγγαράκι - 3 κομμάτια διηθητικού χαρτιού - Πήκτωμα - Μεμβράνη PVDF - 3 κομμάτια διηθητικού χαρτιού - Σφουγγαράκι. Αφαιρέθηκαν τυχόν φυσαλίδες και η κασέτα μεταφοράς τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή η οποία περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1Χ. 59

60 Πραγματοποιήθηκε ηλεκτρομεταφορά με ηλεκτρικό ρεύμα σταθερής έντασης 30 Volt για ώρες στους 4 o C. Μετά την μεταφορά: Αφαιρέθηκαν οι μεμβράνες από την κασέτα μεταφοράς και τοποθετήθηκαν σε πλαστικό δοχείο που περιείχε 200 ml blotting milk 5% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πάνω σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης. Η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε σωλήνα των 50 ml που περιείχε 10 ml πρωτοταγούς αντισώματος. Αφέθηκε για επώαση με το αντίσωμα πάνω στο μηχάνημα κυκλικής ανάδευσης για 1 ώρα. Η μεμβράνη ξεπλύθηκε με 100 ml διάλυμα πλύσης για 15 λεπά. Επαναληψη δύο φορές. Η μεμβράνη επωάστηκε με το δευτεροταγές αντίσωμα για 1 ώρα πάνω στο μηχάνημα κυκλικής ανάδευσης. Ακολουθησαν 3 κύκλοι πλύσεων με το διάλυμα πλύσεων. Κατόπιν η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε δοχείο με PBS 1Χ. Εμφάνιση της μεμβράνης στο θάλαμο εμφάνισης 1. Σε 3 ξεχωριστές λεκάνες προστίθενται τα διαλύματα του developer, νερό βρύσης και το διάλυμα του fixer. 2. Προετοιμασία του διαλύματος ΕCL : Συστατικά Ποσότητες Luminol 1.25 mm ph 8.5 p-κουμαρικό οξύ 68 mm Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% 10 ml 10 μl 30 μl Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος ECL. 3. Η μεμβράνη επωάστηκε στο ΕCL για 1 λεπτό. 4. Αφαιρέθηκε η περίσσεια του διαλύματος και η μεμβράνη τοποθετήθηκε στην κασετίνα του φιλμ μεταξύ δύο διαφανειών. 5. Με κλειστό το φως, τοποθετήθηκε ένα κομμάτι φιλμ πάνω από την μεμβράνη. 60

61 6. Η κασετίνα έμεινε καλά κλεισμένη για 1 λεπτό (χρόνος εμφάνισης). 7. Κατόπιν το φίλμ απομακρύνεται από την κασετίνα και βυθίζεται στη λεκάνη με τον developer μέχρι να εμφανιστούν οι ζώνες. 8. Το φιλμ ξεπλύθηκε στη λεκάνη με το νερό και το τοποθετείται για μερικά δευτερόλεπτα στη λεκάνη με τον fixer. 9. Υστερα ξεπλένεται στη λεκάνη με το νερό και στη συνέχεια αφήνεται σε κατακόρυφη θέση για να στεγνώσει. 10. Τα βήματα 5-9 επαναλαμβάνονται, μέχρι να βρεθεί ο κατάλληλος χρόνος εμφάνισης. 2.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πειραματικά ποντίκια α) με έλλειψη -/- στον LDL R (LDL R ποντίκια), β) με έλλειψη στην απολιποπρωτεΐνη E (ApoE -/- ποντίκια), τα οποία προέρχονταν από την εταιρεία Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, Για την φαρμακοδυναμική μελέτη (LDL R -/- ποντίκια, ApoE -/- ποντίκια) Ποντίκια θηλυκού και αρσενικού γένους ηλικίας 3-4 μηνών χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων φυλάσσονταν σε ξεχωριστά κλουβιά, δηλαδή ένα πειραματόζωο ανά κλουβί. Η επιλογή τους έγινε μετά από σύγκριση των μετρήσεων αναφοράς (baseline measurements) των επιπέδων χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων, ώστε να επιτευχθεί μια αδρή κανονικοποίηση. Με αυτόν τον τρόπο εξασφαλίστηκε ομοιογένεια ανάμεσα στα μέλη της κάθε ομάδας. Αυτά τα πειραματόζωα (LDL -/- R ποντίκια) έλαβαν ενδοφλεβίως μέσω της ουραίας φλέβας μία δόση 5*10 8 pfu/ml από τον ιό ελέγχου AdGFP ή τους ιούς που εξέφραζαν την απολιποπρωτεΐνη Ε4 ή την ApoE4mut1. Κάθε ομάδα περιείχε 3-4 ποντίκια. Η δίαιτα που λάμβαναν πριν και κατά τη διάρκεια του πειράματος ήταν η τυπική, όχι υψηλή σε λιπαρά, δίαιτα- standard diet (1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG). Λήψη αίματος γινόταν καθημερινά για 5 ημέρες. Την 5 η μέρα συλλεγόταν το αίμα και τα ήπατα των ποντικών και στο τέλος τα ποντίκια θανατώνονταν. Οι πειραματικές μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις 61

62 οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και το Πρωτόκολλο προστασίας και ορθής μεταχείρισης των ζώων το οποίο έχει λάβει την έγκριση της επιτροπής πειραματόζωων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Για την φαρμακοκινητική μελέτη (ApoE -/- ποντίκια) Χρησιμοποιήθηκαν ApoE -/- ποντίκια θηλυκού και αρσενικού γένους ηλικίας 3-4 μηνών. Χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες 3-4 ποντικών : α) control ομάδα, β) ομάδα στην οποία χορηγήθηκαν DPPC λιποσώματα, γ) ομάδα στην οποία χορηγήθηκαν E4mut1/DPPC πρωτεολιποσώματα (1mg). Η δίαιτα που λάμβαναν πριν και κατά τη διάρκεια του πειράματος ήταν η υψηλή σε λιπαρά, western-type diet. Λήψη αίματος γινόταν κάθε 6 ώρες μέσα στη ίδια μέρα Χειρισμοί σε πειραματόζωα Για την φαρμακοδυναμική μελέτη (LDLR -/- ποντίκια) Η λήψη αίματος μετά τη χορήγηση του διαλύματος των αδενοϊών που εξέφραζαν είτε την ApoE4 είτε την ApoE4mut1 γινόταν καθημερινά για 5 ημέρες μετά από τετράωρη αποστέρηση τροφής. Αφού τα ποντίκια ακινητοποιούνταν σε ειδικές θήκες με νυστέρι γινόταν ένα μικρό κόψιμο στο άκρο της ουράς και με μαλάξεις συλλέγονταν περίπου μl αίμα σε ειδικά σωληνάρια που περιέχουν EDTA ως αντιπηκτικό παράγοντα (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany). Τις υπόλοιπες μέρες η συλλογή γινόταν με την ίδια διαδικασία απομακρύνοντας μόνο τον επουλωτικό ιστό χωρίς να αφαιρείται τμήμα της ουράς. Το αίμα αμέσως μετά τη λήψη ανακινούνταν ελαφρώς για να αναμιχθεί με το EDTA και εν συνεχεία διατηρούνταν σε πάγο. Την τελική ημέρα του πειράματος μετά τη συνήθη τετράωρη νηστεία τα ποντίκια αναισθητοποιούνταν σε κλειστό δοχείο με εμποτισμένο βαμβάκι από ισοφλουράνιο ή διαιθυλαιθέρα. Ακολούθως, περισσότερη ποσότητα αίματος, περίπου μL, απομονωνόταν από το μάτι με ενστάλαξη από τον περικογχικό φλεβικό κόλπο σε μεγαλύτερα σωληνάρια (Microtubes for pediatric blood collection, Sarstedt, D Numbrecht, Germany). Τα σωληνάρια φυλάσσονταν άμεσα σε πάγο. Στη συνέχεια, τα ναρκωμένα ποντίκια υποβάλλονταν σε ευθανασία με σπονδυλική μετατόπιση. Μετά τον ψεκασμό της κοιλιακής χώρας του θανατωμένου ποντικιού με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70%, αυτή ανοιγόταν με 62

63 χειρουργικό ψαλίδι. Στη συνέχεια με νυστέρι σχιζόταν προσεκτικά το περιτόναιο και το ήπαρ αφαιρούταν προσεκτικά, χωρίς να τραυματιστεί, αποκόβοντάς το από τα αγγεία και τους συνδέσμους που το συγκρατούν. Το ήπαρ ξεπλενόταν σε τρυβλίο με διάλυμα PBS 1Χ και κοβόταν σε 5 μικρότερα τμήματα, τα οποία ψύχονταν άμεσα σε παγωμένο λουτρό μεθανόλης και τα τοποθετούνταν σε κατάψυξη στους -80ºC για μελλοντική χρήση. Τέλος, μετά τη συλλογή αίματος από όλα τα πειραματόζωα ακολουθούσε φυγοκέντρηση στις 4,000 rpm για 15 λεπτά σε μίνι-φυγόκεντρο, ώστε να διαχωριστεί το πλάσμα από τα κυτταρικά στοιχεία του αίματος. Το πλάσμα συλλεγόταν σε eppendorf 1.5 ml και φυλασσόταν στους -20ºC για περαιτέρω επεξεργασίες. Για τα πειράματα γονιδιακής μεταφοράς, οι μολυσματικοί αδενοϊοί χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως μέσω του φλεβικού πλέγματος της ουράς με σύριγγα ινσουλίνης. Ο όγκος του χορηγούμενου διαλύματος ήταν 400 μl. Εικόνα 2.3. Ενδοφλέβια χορήγηση διαλύματος αδενοϊού σε ακινητοποιημένο ποντίκι μέσω του φλεβικού δικτύου της ουράς του. 2.5 ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΜΕ ΥΠΕΡΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ ΔΙΑΒΑΘΜΙΣΜΕΝΗΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ Αρχή της μεθόδου Ο διαχωρισμός των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με την μέθοδο της παρασκευαστικής υπερφυγοκέντρησης βασίζεται στις διαφορές που εμφανίζουν οι 63

64 λιποπρωτεΐνες ως προς την πυκνότητά τους. Οι διαφορές στο λιπιδικό περιεχόμενό τους έχει ως αποτέλεσμα σημαντικές διαφορές στη χημική σύσταση των λιποπρωτεϊνών και συνεπώς στην πυκνότητα τους. Έτσι επιτυγχάνεται η επίπλευσή τους σε διαφορετικές πυκνότητες αλατούχου διαλύματος KBr. Συνήθως για την κλασμάτωση των λιποπρωτεϊνών από ανθρώπινο πλάσμα χρησιμοποιείται διάλυμα κλίσης πυκνότητας βρωμιούχου καλίου (KBr, potassium bromide). Με το κρυσταλλικό KBr ρυθμίζεται αρχικά η πυκνότητα του πλάσματος ώστε να αυξηθεί πάνω από το 0.95 και κατά τη φυγοκέντρηση οι λιποπρωτεΐνες, που έχουν μικρότερη πυκνότητα από το πλάσμα, να ανέβουν και να επιπλέουν προς την κορυφή του σωλήνα. Τα κλάσματα των λιποπρωτεϊνών που κατά βάση διαχωρίζονται είναι αυτά των χυλομικρών, VLDL, LDL, και HDL. Τα χυλομικρά είναι παρόντα στην κυκλοφορία μόνο μετά από ένα πλούσιο σε λιπαρά γεύμα και γενικά είναι δύσκολος ο διαχωρισμός τους από το κλάσμα των VLDL. Ένας ακόμη λόγος που τα δύο αυτά κλάσματα δεν μπορούν να διαχωριστούν με την μέθοδο αυτή είναι ότι τόσο τα χυλομικρά όσο και οι VLDL έχουν πυκνότητα μικρότερη του Οι λιποπρωτεΐνες απομονώνονται στις αντίστοιχες πυκνότητες ως εξής: σε πυκνότητα εντοπίζονται οι VLDL και τα χυλομικρά. Σε πυκνότητες εντοπίζονται οι IDL και οι LDL. Σε πυκνότητες εντοπίζονται οι ΗDL. Τέλος, σε πυκνότητες άνω του 1.21 εντοπίζονται άλλες πρωτεΐνες του πλάσματος καθώς και ελεύθερες απολιποπρωτεΐνες. Υλικά Ψυχόμενη υπερφυγόκεντρος (Beckman), Κεφαλή υπερφυγοκέντρου SW40, Σωλήνες διαβάθμισης Ultra clear tubes (Beckman), SW40 ultracentrifugation rotor buckets (Beckman), σωληνάκια τύπου eppendorf των 1000 μl, Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler), PBS 1X, Potassium bromide - KBr (Fisher Chemical), 10% (w/v) Sodium Dodecyl Sulfate SDS, Διάλυμα αιθανόλης 70%, dd H 2 O. Πειραματική πορεία Οι σωλήνες διαβάθμισης πλένονται με 10% SDS για 20 λεπτά και κατόπιν ξεπλένονται με νερό βρύσης, ddh 2 O και τέλος 70% αιθανόλη. 64

65 Στη συνέχεια παρασκευάζονται τα κλάσματα διαφορετικής πυκνότητας KBr. Ο υπολογισμός της μάζας του KBr που απαιτείται για την επιθυμητή πυκνότητα στην οποία θα επιπλεύσει το κάθε κλάσμα λιποπρωτεϊνών γίνεται με τη βοήθεια του εξής τύπου: Vτελ x ( d 1 ) 1 ( 0,298 x d ) Όπου Vτελ : ο τελικός όγκος του κλάσματος, d : η πυκνότητα που πρέπει να έχει το πλάσμα Για μια ποσότητα 50 ml οι αναλογίες για κάθε διάλυμα είναι οι εξής: Διάλυμα πλάσματος πυκνότητας 1,23 g/ml: 0,145 g KBr σε 0,3 ml πλάσματος. Συμπληρώνω με ΡBS 1X ως τον ακριβή όγκο του 1 ml. Διάλυμα KBr, πυκνότητας 1,21 g/ml: 16,43 g KBr σε 33 ml PBS 1X. Συμπληρώνεται PBS 1X έως τον ακριβή όγκο των 50 ml. Διάλυμα KBr, πυκνότητας 1,063 g/ml: 4,61 g KBr σε 45 ml PBS 1X. Συμπληρώνεται PBS 1X έως τον ακριβή όγκο των 50 ml. Διάλυμα KBr, πυκνότητας 1,019 g/ml: 1,365 g KBr σε 48 ml PBS 1X. Συμπληρώνεται PBS 1X έως τον ακριβή όγκο των 50 ml. Αρχικά στο σωλήνα διαβάθμισης οποίο προστίθεται το 1 ml του διαλύματος πλάσματος. Αμέσως μετά, προστίθενται 2 ml KBr πυκνότητας 1.21 με προσοχή ώστε να μην ανακατευτούν οι φάσεις. Ομοίως, προστίθενται 5 ml KBr πυκνότητας πάνω από το προηγούμενο κλάσμα, πολύ προσεκτικά. Κατόπιν προστίθενται 1 ml από το επόμενο κλάσμα πυκνότητας Τέλος προστίθεται 1 ml διαλύματος PBS 1Χ. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 20 ώρες. Μετά το κλείσιμο της φυγοκέντρου, από κάθε σωλήνα απομονώνονται 10 κλάσματα του 1 ml. 65

66 2.6 ΔΙΑΠΙΔΥΣΗ (DIALYSIS) Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος της διαπίδυσης χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό μικρών μορίων από μεγάλα μακρομόρια μέσω μεμβράνης με εκλεκτική διαπερατότητα. Βρίσκει κυρίως εφαρμογή στον διαχωρισμό μορίων από διαλύματα τα οποία περιέχουν μεγάλη συγκέντρωση αλάτων. Το διάλυμα που πρόκειται να υποστεί διαπίδυση, τοποθετείται σε σωλήνα ο οποίος σφραγίζεται με την ειδική μεμβράνη διαπίδύσης και βυθίζεται σε δοχείο με συγκεκριμένο ρυθμιστικό διάλυμα. Τα μικρά διαλυτά μόρια έρχονται σε ισορροπία μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνης. Η κίνηση των μικρών διαλυτών μορίων, ακολουθείται από κίνηση του διαλύτη προς την αντίθετη κατεύθυνση. Οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται είναι ειδικά κατασκευασμένες ώστε οι πόροι που διαθέτουν να εμποδίζουν την μετακίνηση μορίων που υπερβαίνουν κάποιο συγκεκριμένο μοριακό βάρος. Το μέγεθος των πόρων της μεμβράνης θα πρέπει να είναι πολύ μικρότερο από το μακρομόριο ενδιαφέροντος. Υλικά Μεμβράνη διαπίδυσης (Medicell), Σωληνάκια disposable culture tubes (Fisher brand), Καπάκια Tainer top safety (Fisher brand), Ποτήρι ζέσεως 1000 ml, Μαγνητικός αναδευτήρας, dd H 2 O Διαλύματα Διάλυμα διαπίδυσης ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (EM dialysis buffer) ph 7.4 Αντιδραστήρια Οξικό αμμώνιο Ανθρακικό αμμώνιο Ποσότητες 18,6 g 4,98 g 0,5 M EDTA ph μl dd H2O Μέχρι το 1 L Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος διαπίδυσης ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. 66

67 Τα υλικά αναμειγνύονται υπό μαγνητική ανάδευση. Το ph ρυθμίζεται στο 7.4. Πειραματική πορεία Σημειώθηκαν 10 σωλήνες από το 1 έως το 10 για κάθε δείγμα. Μετά το πέρας της υπερφυγοκέντρησης συλλέχθηκαν τα κλάσματα του κάθε δείγματος, ανά 1 ml κάθε φορά. Σε ποτήρι ζέσεως που περιέχει ddh 2 O και μικρή ποσότητα σκόνης EDTA έγινε ο βρασμός της μεμβράνης διαπίδυσης. Κάθε σωλήνας καλύφθηκε με ένα κομμάτι της μεμβράνης διαπίδυσης χρησιμοποιώντας τα καπάκια Tainer top safety. Οι σωλήνες βυθίστηκαν ανάποδα σε ποτήρι ζέσεως που περιείχε το διάλυμα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας ώστε η μεμβράνη να βρίσκεται προς την πλευρά του διαλύματος. Το ποτήρι με τα δείγματα τοποθετήθηκε στους 4 ο C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα για 2 ώρες. Κατόπιν το διάλυμα ανανεώθηκε και τα δείγματα επανατοποθετήθηκαν στους 4 ο C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα για 24 ώρες. Συλλέχθηκαν 100 μl δείγματος σε σωληνάκια των 1,5 ml για να αναλυθούν με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Οι σωλήνες με το υπόλοιπο δείγμα καλύφθηκαν με νέα μεμβράνη και τοποθετήθηκαν στους 4 ο C για 24 ώρες υπό μαγνητική ανάδευση σε ποτήρι ζέσεως που περιείχε dd H 2 O. Τα κλάσματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια και φυλάχθηκαν στους 4 ο C. 2.7 ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕ FPLC Αρχή μεθόδου Η υγρή χρωματογραφία χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών ή άλλων πολυμερών από σύνθετα μίγματα. Το σύστημα Aktä Purifier (GE-Pharmacia) είναι ένα ολοκληρωμένο σύστημα FPLC για εργαστηριακής κλίμακας χρωματογραφικούς 67

68 διαχωρισμούς. Η κινητή φάση της χρωματογραφίας είναι υγρή, ενώ η σταθερή είναι συνήθως μια ρητίνη που αποτελείται από σφαιρίδια αγαρόζης που είναι χημικά συνδεδεμένα (cross-linked). Ως αποτέλεσμα των διαφορετικών συστατικών που προσδένονται ή διαχέονται μέσω της σταθερής φάσης, τα συστατικά του μίγματος διαχωρίζονται. Οι στήλες που χρησιμοποιούνται στην FPLC μπορούν να διαχωρίσουν τα μακρομόρια με βάση το μέγεθος, το φορτίο, την υδροφοβικότητα ή την συγγένεια (βιοαναγνώριση). Η FPLC είναι ένας τύπος υγρής χρωματογραφίας όπου η ταχύτητα του αντλούμενου διαλύτη ελέγχεται από μικροεπεξεργαστή, ώστε να διασφαλίζεται ο σταθερός ρυθμός ροής των διαλυτών. Πειραματική πορεία Για την κλασμάτωση των λιποπρωτεϊνών με FPLC χρωματογραφία χρειάστηκαν 20 μl πλάσματος από τα πειραματόζωα κάθε ομάδας. Αυτή η ποσότητα πλάσματος αραιώθηκε σε PBS 1X σε αναλογία 1:3. Κατόπιν 50 μl από κάθε δείγμα φορτώθηκαν σε μια Superpose 6 στήλη στο σύστημα Äkta Purifier FPLC (GE-Pharmacia). Τα κλάσματα εκλούσθηκαν με PBS. Συνολικά συλλέχθηκαν 25 κλάσματα όγκου 50 μl το καθένα για κάθε ομάδα πειραματόζωων. 2.8 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης Αρχή της μεθόδου Χρησιμοποιείται μέρος του πλάσματος από κάθε δείγμα ή μια συγκεκριμένη ποσότητα από τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα, προκειμένου να υπολογιστεί η συγκέντρωση της ολικής χοληστερόλης τους. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι η υδρόλυση των εστέρων χοληστερόλης με την εστεράση της χοληστερόλης (CE) σε χοληστερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα: CE Cholesterol Esters Cholesterol + Fatty Acids Στη συνέχεια οξειδώνεται η χοληστερόλη με την οξειδάση της χοληστερόλης (CO) και απελευθερώνεται Η 2 Ο 2 : 68

69 CO Cholesterol + O 2 Cholest-4-en-3-one + H 2 O 2 Τέλος, το Η 2 Ο 2 αντιδρά με το υδροξυ-βενζοϊκό οξύ (ΗΒΑ) και την 4-αμινοαντιπυρίνη μέσω της υπεροξειδάσης (POD) σχηματίζοντας τη χρωστική κινονιμίνη, που απορροφά φως και βάσει αυτής της απορρόφησης και συγκριτικά με την απορρόφηση των προτύπων γίνεται ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων. 2H 2 O 2 + HBA + 4-AAP POD Quinoneimine Dye + 4H 2 O Πειραματική πορεία Προετοιμάζονται τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του αρχικού πρότυπου διαλύματος Cholesterol E Standard Solution (Kit Wako: ) σε PBS 1Χ. Στις δύο τελευταίες σειρές της μικροπλάκας (96- well plate, Thermo Scientific Nunc) προστίθενται τα πρότυπα διαλύματα στα οποία συμπεριλαμβάνεται και το τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό PBS 1Χ και τα οποία χρησιμεύουν για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης. Σε κάθε πηγαδάκι στις επόμενες σειρές προστίθενται 20 μl από κάθε κλάσμα. Με την πολυπιπέτα προστίθενται 100 μl του χρωμογόνου αντιδραστηρίου Infinity (Thermo Electron). Η μικροπλάκα τοποθετείται σε ειδική μηχανή ανάδευσης μικροπλακών (micro plate shaker VWR) στις 450 rpm για 45 λεπτά. Κατόπιν ακολουθεί φωτομέτρηση στο ειδικό φασματοφωτόμετρο (microplate reader - BIO-RAD, Model 680) στα 490 nm Προσδιορισμός επιπέδων ελεύθερης χοληστερόλης Η χοληστερόλη στο αίμα είναι φυσιολογικά κατά 60-80% εστεροποιημένη με λιπαρά οξέα. Η εστεροποίηση είναι αποτέλεσμα της δράσης του ενζύμου LCAT του πλάσματος. Σε περιπτώσεις που η ελεύθερη (μη εστεροποιημένη) χοληστερόλη στο πλάσμα είναι υψηλή, αυτό υποδηλώνει προβλήματα στη διαδικασία εστεροποίησης και κατά συνέπεια στη δράση του ενζύμου. Αρχή της μεθόδου Η ελεύθερη χοληστερόλη αντιδρά με την οξειδάση της χοληστερόλης και παράγει υπεροξείδιο του υδρογόνου το οποίο με τη σειρά του αντιδρά με την ένωση DAOS 69

70 [N-ethyl-N-(2-hydroxy-3sulfopropyl)-3,5-domethoxyaniline] και την 4- αμινοαντιπυρίνη του χρωμογόνου διαλύματος του παράγοντας μια μπλε χρωστική. Πειραματική πορεία Για τη μέτρηση της ελεύθερης χοληστερόλης ακολουθείται ακριβώς η ίδια διαδικασία με αυτή της παραγράφου To πρότυπο διάλυμα είναι το Free Cholesterol E - Standard Solution, ενώ το χρωμογόνο διάλυμα είναι το Free Cholesterol E - Color Reagent (Kit Wako ). Mετά από τη φόρτωση 20 μl των δειγμάτων και των πρότυπων διαλυμάτων, ακολουθεί προσθήκη 75 μl από το χρωμογόνο διάλυμα. Και σ αυτή την περίπτωση η μικροπλάκα τοποθετείται στην μηχανή ανάδευσης στις 450 rpm για 45 λεπτά. Μετά το διάστημα της επώασης ακολουθεί φωτομέτρηση στα 655 nm Προσδιορισμός επιπέδων φωσφολιπιδίων Τα φωσφολιπίδια έχουν σημαντικό ρόλο στη σύνθεση των κυτταρικών μεμβρανών και στη γαλακτωματοποίηση και απορρόφηση των λιπών στο σώμα. Τα φωσφολιπίδια του ορού παράγονται στο ήπαρ όπου προσδένονται σε απολιποπρωτεΐνες γεγονός που τα κάνει διαλυτά στο πλάσμα. Αρχή της μεθόδου Όταν ένα δείγμα προστίθεται στο χρωμογόνο αντιδραστήριο, τα φωσφολιπίδια του διαλύματος (λεκιθίνη, λυσολεκιθίνη, σφιγγομυελίνη) υδρολύονται από τη φωσφολιπάση D και παράγουν χολίνη. Η χολίνη στη συνέχεια οξειδώνεται από την οξειδάση της χολίνης σε βεταΐνη και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου που παράγεται ωθεί την ένωση DAOS και την 4-αμινοαντιπυρίνη σε μια ποσοτική οξειδωτική συμπύκνωση που καταλύεται από την υπεροξειδάση (POD), παράγοντας κόκκινη χρωστική. Η ποσότητα των φωσφολιπιδίων στο δείγμα προσδιορίζεται μετρώντας φασματοφωτομετρικά την απορρόφηση στα 490 nm. Πειραματική πορεία Στη μέτρηση των επιπέδων των φωσφολιπιδίων ακολουθείται η ίδια διαδικασία με αυτή της παραγράφου Το πρότυπο διάλυμα φωσφολιπιδίων είναι το 70

71 Phospolipids C Standard Solution, ενώ το χρωμογόνο διάλυμα είναι το Phospholipids C - Color Reagent (Kit Wako ). Μία ποσότητα 20 μl από πρότυπα διαλύματα και δείγματα τοποθετείται στη μικροπλάκα και κατόπιν προστίθενται 75 μl από το χρωμογόνο διάλυμα. Ύστερα η μικροπλάκα τοποθετείται στην μηχανή ανάδευσης στις 450 rpm για 45 λεπτά. Μετά το διάστημα της επώασης ακολουθεί φωτομέτρηση στα 490 nm Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων Αρχή της μεθόδου Η μέτρηση των τριγλυκεριδίων έγινε με το Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100). Με το Kit αυτό μπορούν να προσδιοριστούν τα επίπεδα γλυκερόλης, ελεύθερων και ολικών τριγλυκεριδίων σε πλάσμα ή ορό. Τα τριγλυκερίδια, οι εστέρες λιπαρών οξέων και η γλυκερόλη είναι υδρόφοβα μόρια και η κυκλοφορία τους στο πλάσμα είναι εφικτή μόνο όταν προσδένονται με τις απολιποπρωτεΐνες. Για τον προσδιορισμό τους είναι απαραίτητη η υδρόλυση των τριγλυκεριδίων σε γλυκερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα και στη συνέχεια η ενζυμική μέτρηση της γλυκερόλης. Η διαδικασία περιλαμβάνει την ενζυμική υδρόλυση των τριγλυκεριδίων από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL). LPL Triglycerides Glycerol + Fatty acids Στη συνέχεια η γλυκερόλη φωσφορυλιώνεται από το ATP με τη βοήθεια της κινάσης της γλυκερόλης (GK) σε 1-φωσφορική γλυκερόλη (G-1-P) GK Glycerol + ATP G-1-P + ADP και οξειδώνεται σε φωσφορική διυδροξυακετόνη (DAP) με τη βοήθεια της οξειδάσης της φωσφορικής γλυκερόλης (GPO) και ταυτόχρονη απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ). GPO G-1-P + O 2 DAP + H 2 O 2 Στην τέταρτη και τελευταία αντίδραση καταλύεται η σύνδεση του Η 2 Ο 2 με την 4- αμινοαντιπυρίνη (4-AAP) και την νατριϊκή Ν-αιθυλο-Ν-(3-θειοπροπυλο)-m-ανισιδίνη 71

72 (ESPA) από την υπεροξειδάση (POD) και παράγεται η χρωστική κινονιμίνη, της οποίας η απορρόφηση μετράται βέλτιστα στα 540 nm. H 2 O AAP + ESPA POD Quinoneimine dye + H 2 O Πειραματική πορεία Στη μέτρηση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων ακολουθείται η ίδια διαδικασία με αυτή της παραγράφου Το πρότυπο διάλυμα φωσφολιπιδίων είναι το Glycerol Standard Solution 2,5 mg/ml, ενώ υπάρχουν δύο χρωμογόνα διαλύματα που χρησιμοποιούνται διαδοχικά, το Free glycerol reagent (αντιδραστήριο A) και το Triglyceride reagent (αντιδραστήριο B). Μία ποσότητα 7,5 μl από πρότυπα διαλύματα και δείγματα τοποθετείται στη μικροπλάκα και κατόπιν προστίθενται 100 μl από το αντιδραστήριο Α. Η μικροπλάκα τοποθετείται στην μηχανή ανάδευσης για 10 λεπτά.ύστερα πραγματοποιείται φωτομέτρηση στα 540 nm. Κατόπιν προστίθενται 30 μl από το αντιδραστήριο Β και η μικροπλάκα τοποθετείται στη μηχανή ανάδευσης για άλλα 45 λεπτά. Μετά το πέρας της επώασης ακολουθεί φωτομέτρηση στα 540 nm. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων γίνεται αφαιρώντας από τη δεύτερη μέτρηση, η οποία περιλαμβάνει τη γλυκερόλη που αποδεσμεύτηκε από τα τριγλυκερίδια, την πρώτη που αντιστοιχεί στην ελεύθερη γλυκερόλη. Η τιμή που προκύπτει αντιστοιχεί στα επίπεδα των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα. 2.9 ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΜΕ ΣΥΝΔΕΣΗ ΕΝZΥΜΟΥ (ELISA) Αρχή της μεθόδου H ELISA είναι μια βιοχημική μέθοδος, η οποία χρησιμοποιείται κυρίως στην ανοσολογία για να ανιχνεύσει τη παρουσία ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε ένα δείγμα. Στην ELISA μια άγνωστη ποσότητα του αντιγόνου ακινητοποιείται σε μια επιφάνεια και στη συνέχεια ένα ειδικό αντίσωμα απλώνεται σ αυτή την επιφάνεια ώστε να προστεθεί στο αντιγόνο. Αυτό το αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με ένα ένζυμο το οποίο με την προσθήκη ενός υποστρώματος μπορεί να παράξει μια χρωμογόνο ένωση. Η συγκέντρωση της χρωμογόνου ουσίας, μπορεί να μετρηθεί 72

73 φασματοφωτομετρικά και έτσι να υπολογιστεί και η συγκέντρωση της υπό εξέταση ουσίας. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε μια παραλλαγή της ELISA, η Sandwich ELISA. Σε αυτή την τεχνική, αρχικά ένα αντίσωμα ειδικό για το αντιγόνο ακινητοποιείται στην επιφάνεια. Κατόπιν, προστίθεται το αντιγόνο το οποίο προσδένεται από το αντίσωμα. Στο τέλος προστίθεται το δεύτερο αντίσωμα που είναι συνδεδεμένο με το ένζυμο και παράγει τη χρωμογόνο ένωση. Εικόνα 2.4. Αρχή της μεθόδου σάντουιτς ELISA. Διαλύματα Διάλυμα πρωτοταγούς αντισώματος Συστατικά Goat anti-human apoe αντίσωμα PBS 1X Ποσότητες 10 μl 10 ml Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος πρωτοταγούς αντισώματος για ELISA. Διάλυμα 10% Tween-20 Διαλύεται σκόνη Tween-20 (Merck) σε κατάλληλο όγκο ddh 2 O 73

74 Διάλυμα πλύσεων για ELISA - ELISA Wash buffer Συστατικά PBS 10X Ποσότητες 100 ml 10% Tween-20 5 ml ddh 2 O Μέχρι το 1L Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος πλύσεων για ELISA. Το διάλυμα πλύσεων καθώς και το 10% Tween-20 πρέπει να παρασκευάζονται τη μέρα που γίνεται το πείραμα, καθώς το Tween-20 είναι απορρυπαντικό και σχηματίζει συσσωματώματα. Εναλλακτικά, εάν δεν υπάρχει η δυνατότητα να παρασκευαστεί φρέσκο, θα πρέπει η απαραίτητη για το πείραμα ποσότητα να τεθεί υπό ανάδευση από την προηγούμενη μέρα, μέχρι τη στιγμή της χρήσης. Διάλυμα καζεΐνης - Casein Solution 2.5% (w/v) Η καζεΐνη (Merck) διαλύεται σε κατάλληλο όγκο dd H2Ο και προστίθεται πυκνό διάλυμα 10 Μ NaOH, ώστε το pη να γίνει 12 και αναδεύεται για 30 λεπτά. Στη συνέχεια ελαττώνεται σταδιακά το ph μέχρι το 7.6 και συμπληρώνεται με dd H2Ο. Διατηρείται στους -20 C. Normal Goat Serum (NGS, Sigma) Blocking buffer Συστατικά PBS 10X Casein solution 2.5% ddh 2 O Ποσότητες 100 ml 10 ml Μέχρι το 1 L Πίνακας Παρασκευή του blocking buffer για ELISA. To διάλυμα φιλτράρεται και διατηρείται στους 4 o C. 74

75 Διάλυμα δευτεροταγούς αντισώματος Αντιδραστήρια Blocking buffer Ποσότητες 10mL 10% Tween-20 50μL Normal Goat Serum 2-ταγές αντίσωμα goat antiapoe HRP 100μL 10μL Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος δευτεροταγούς αντισώματος για ELISA. Διάλυμα εμφάνισης ΤΜΒ για ELISA Αντιδραστήρια Sodium acetate anhydrous Citric acid ddh 2 O Ποσότητες 0,82 g 0,36 g 60 ml Κατόπιν προστίθενται 27 mg ΤΜΒ τα οποία έχουν προηγουμένως διαλυθεί σε 40 ml μεθανόλης Πίνακας Παρασκευή του διαλύματος εμφάνισης TMB για ELISA Το διάλυμα ισομοιράζεται σε δύο σωλήνες των 50 ml, οι οποίοι τυλίγονται με αλουμινόχαρτο καθώς το διάλυμα είναι φωτοευαίσθητο. Κατόπιν φυλάσσονται στους -4 o C. Πειραματική πορεία 75

76 Από το διάλυμα του πρωτοταγούς αντισώματος προστέθηκαν 100 μl του διαλύματος σε όλες τις θέσεις ενός πλακιδίου 96 θέσεων. Το πρωτοταγές αντίσωμα κολλάει στη βάση λόγω ηλεκτροστατικών δυνάμεων. Το πλακίδιο καλύπτεται με κολλητική ταινία και τοποθετείται στους 4ºC για 16 h. Την επόμενη μέρα αδειάζεται το περιεχόμενό του και γίνονται 5 κύκλοι πλύσεων με 100 μl wash buffer, ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια αντισώματος που δεν προσδέθηκε. Το πλακίδιο στεγνώνεται καλά και προστίθενται 150 μl blocking buffer, για να δεσμευτούν οι ουδέτερες θέσεις στο πλαστικό από την καζεΐνη που περιέχει το blocking buffer. Στη συνέχεια το πλακίδιο επωάζεται στους 37 ºC για 2 h. Ακολούθως απομακρύνεται το blocking buffer και προστίθενται 100 μl από τα αραιωμένα δείγματα. Οι αραιώσεις των δειγμάτων ήταν 1:100. Οι υπόλοιπες θέσεις καλύφθηκαν 100 μl blocking buffer. Το πλακίδιο επωάστηκε στους 4ºC για 16h. Στη συνέχεια, αφού έγιναν 5 κύκλοι πλύσεων με 100 μl wash buffer προστέθηκαν 100 μl διαλύματος δευτεροταγούς αντισώματος (goat anti-apoe HRP) και έγινε επώαση στους 37ºC για 2 ώρες. Έπειτα, ακολούθησαν πλύσεις πέντε φορές τουλάχιστον με wash buffer για να απομακρυνθεί το αδέσμευτο δευτεροταγές αντίσωμα. Το πλακίδιο στραγγίστηκε καλά για να φύγει η περίσσεια του wash buffer. Προστέθηκαν 100 μl TMB Elisa Developer και το πλακίδιο επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το TMB αποτέλεσε το υπόστρωμα για το ένζυμο HRP (horse radish peroxidase) και μετατράπηκε σε πράσινη χρωμογόνο ένωση. Η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 100 μl Η 2 SO4 1M το οποίο μετέτρεψε το χρώμα σε κίτρινο ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ Αρχή της μεθόδου Τα λιποσώματα ανήκουν στην κατηγορία των λιπιδικών κολλοειδών συστημάτων μεταφοράς και ελεγχόμενης αποδέσμευσης και αποτελούν σφαιρικές κλειστές δομές με μια ή περισσότερες ομόκεντρες λιπιδικές διπλοστοιβάδες. Σχηματίζονται αυθόρμητα κατά τη διασπορά αμφίφιλων μορίων (φωσφολιπιδίων) σε περίσσεια υδατικού μέσου, το οποίο και εγκλωβίζεται ανάμεσα από τις διπλοστοιβάδες. Παράλληλα στην επιφάνεια των λιποσωμάτων μπορούν να συνδεθούν αντισώματα (ανοσολιποσώματα), υποδοχείς ή άλλα μόρια, που τροποποιούν τις ιδιότητές τους 76

77 (π.χ. η απόκτηση αρνητικού ή θετικού φορτίου). Η ταυτόχρονη παρουσία δύο περιοχών στη δομή τους : α) μιας υδρόφιλης (ανάμεσα στις λιπιδικές διπλοστοιβάδες) και β) μιας υδρόφοβης (λιπιδικές διπλοστοιβάδες) τους επιτρέπει να εγκλωβίζουν λιπόφιλες αλλά και υδρόφιλες δραστικές ουσίες. Ανάλογα με τη λιπιδική τους σύσταση (επειδή ως λιπίδια χρησιμοποιούνται τα φωσφολιπίδια, αυτό που αλλάζει είναι η αλκοόλη με την οποία έχει εστεροποιηθεί το οξύ) διακρίνονται σε : α) σφιγγοφωσφολιπίδια, με αλκοόλη την σφιγγοσίνη, β) γλυκεροφωσφολιπίδια, με αλκοόλη την γλυκερόλη. Ανάλογα με την προέλευση τους διακρίνονται σε : α) φυσικά: χρήση φυσικών φωσφολιπιδίων π.χ λεκιθίνη αυγού (EggPC), β) συνθετικά: χρήση συνθετικών φωσφολιπιδίων π.χ διπαλμιτική φωσφατιδυλοχολίνη (DPPC). Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε κατασκευή λιποσωμάτων διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοχολίνης για τον καθαρισμό της apoe4mut1 για την χορήγησή της σε ApoE -/- ποντίκια (στα πλαίσια της φαρμακοκινητικής μελέτης). Πειραματική πορεία 4,75 ml διαλύματος POPC ( 120 mg POPC [ διακυλογλυκερόλη-φωσφολιπίδια] σε 6 ml διαλύτη χλωροφόρμιο-μεθανόλη [ 2:1] αναμείχθηκαν με 2,34 ml διαλύματος χοληστερόλης ( 12 mg σε 6 ml διαλύτη χλωροφόρμιο-μεθανόλη [ 2:1] ). Το μείγμα αφέθηκε για εξάτμιση του διαλύτη σε απαγωγό για 24h. Την επόμενη μέρα, πραγματοποιήθηκε επαναδιάλυση του ξηρού πλέον μείγματος λιπιδίων σε 2,5 ml 1X Salt buffer. Αφού έγινε ανάδευση για 1h στους 4ºC προστέθηκε 1,785 ml 1X Salt buffer και το μείγμα αφέθηκε για 1h επιπλέον στους 4ºC υπο ανάδευση. Σκόνη πρωτεϊνης E4mut1 ( συνολική ποσότητα: 3,8995 g ) επαναδιαλύθηκε σε 2,5 ml 1X Salt buffer ούτως ώστε να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση της E4mut1 4mg/ml. Στην συνέχεια, το διάλυμα πρωτεϊνης αναμείχθηκε με το μείγμα λιπιδίων για 1h στους 4ºC. Τέλος, πραγματοποιήθηκε διαπίδυση σε 1X Salt buffer για 24h. Το μείγμα E4mut1/DPPC φυλάχθηκε στους 4 ºC. 77

78 2.11 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ APOE4mut1 ΠΡΩΤΕΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Τα επίπεδα των λιποπρωτεϊνών στο πλάσμα χρησιμοποιούνται ως δείκτες για την εκτίμηση του κινδύνου ανάπτυξης στεφανιαίας καρδιακής νόσου. Οι σχέσεις δομής και λειτουργίας των λιποπρωτεϊνών μπορούν να αποσαφηνίσουν το ρόλο των λιποπρωτεϊνών στα καρδιαγγειακά νοσήματα. Η ετερογένεια των λιποπρωτεϊνών τόσο ως προς τη σύστασή τους, αλλά και ως προς το σχήμα τους μπορεί εύκολα να δειχθεί με τη μέθοδο της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας με αρνητική χρώση. Αρχή της μεθόδου Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης χρησιμοποιεί μια ηλεκτρονική δέσμη υψηλής τάσης για να δημιουργήσει μια εικόνα. Αποτελείται από τρία τμήματα: 1. Το σύστημα αντλιών χαμηλού κενού 2. Ηλεκτρονικές διατάξεις σταθεροποιημένης υψηλής τάσης και σταθεροποιημένων ρευμάτων για τους ηλεκτρομαγνητικούς φακούς και 3. Σύστημα ηλεκτρομαγνητικών φακών που περιλαμβάνει χώρο παρασκευάσματος, φωτογραφική μηχανή και φθορίζουσα εικόνα παρατήρησης Ηλεκτρόνια που εκπέμπονται θερμιονικά από ένα νήμα επιταχύνονται με τη βοήθεια της υψηλής τάσης και περνούν από τη σωληνοειδή άνοδο. Όσα από τα ηλεκτρόνια σκεδάζονται λίγο ή καθόλου από το παρασκεύασμα συνεχίζουν την πορεία τους μέσα από τα μαγνητικά πεδία των επόμενων φακών για να καταλήξουν στην οθόνη. Έτσι το τελικό είδωλο του παρασκευάσματος σχηματίζεται επάνω στην οθόνη αυτή και η μεγέθυνσή του καθορίζεται από τους ηλεκτρομαγνήτες. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης έχει τη δυνατότητα να δέχεται παρασκευάσματα προεπεξεργασμένα με πολλούς τρόπους, αρκεί το παρασκεύασμα να επιτρέπει τη διαφορική σκέδαση των ηλεκτρονίων. Στην περίπτωση εναιωρημάτων διαφόρων ευαίσθητων βιολογικών υλικών, όπως ιοί, βακτήρια, ινίδια, λιποπρωτεΐνες που το μέγεθός τους είναι μικρότερο από 500Ȧ, είναι απαραίτητη η χρήση της αρνητικής χρώσης. Η συγκεκριμένη τεχνική χρησιμοποιεί ένα ηλεκτρονιόπυκνο μόριο (ώστε να δημιουργεί εικόνα λόγω σκέδασης των ηλεκτρονίων) και να μην προκαλεί αλλοιώσεις στα υπό εξέταση βιολογικά υλικά. Χρησιμοποιήθηκαν διάφορες «χρωστικές» υπό τη μορφή διαλυμάτων και τελικά 78

79 επικράτησαν διαλύματα οξικού ουρανυλίου καθώς και διαλύματα φωσφοροβολφραμικού νατρίου (το ρόλο του βαρέος μετάλλου έχει το βολφράμιο με ατομικό αριθμό Ζ=74). Η τεχνική στηρίζεται στην προσρόφηση μορίων της χρωστικής μέσα σε κοιλότητες, αλλά και γύρω από τη δομή. Έτσι η πραγματική δομή σκιαγραφείται μετά τη σκέδαση των ηλεκτρονίων από το βαρύ μέταλλο και κατά συνέπεια η εικόνα είναι αρνητική. Η μέθοδος έχει διακριτικό όριο 2,5 nm, αφού τόσο περίπου είναι το μέγεθος των κρυστάλλων που σχηματίζει η χρωστική. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η παρατήρηση μακρομορίων, μεμβρανών, μικροοργανισμών και άλλων βιομορίων χωρίς τη διαδικασία της έγκλεισης και των τομών [95]. Πειραματική πορεία Όπως έχει αναφερθεί στην παράγραφο 2.6, τα πέντε πρώτα κλάσματα ( πυκνότητας ) της υπερφυγοκέντρησης υπέστησαν διαπίδυση σε ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε ιόντα οξικού και ανθρακικού αμμωνίου. Στο μίγμα των κλασμάτων έγινε χρώση με 2% φωσφοροβολφραμικό νάτριο. Για την παρατήρηση των πρωτεολιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκε το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης Philips CM-12 (Philips Electron Optics, Eindhoven, Netherlands). Οι ηλεκτρονιογραφίες ελήφθησαν σε μεγέθυνση x ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η σύγκριση των δεδομένων για τις ομάδες ποντικιών εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας την Τ-δοκιμή (T-test). Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση της μέσης τιμής. * υποδηλώνει p<0,05 και ** υποδηλώνει p<0,005. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με την χρήση του λογισμικού προγράμματος GraphPad prism. 79

80 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Η ΕΚΦΡΑΣΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΥ LDL R ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΟΥΜΕΝΗ ΑΠΟ ΤΗΝ APOE4mut1 ΚΑΘΑΡΣΗ ΤΩΝ ΑΘΗΡΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Για να προσδιοριστεί ο ρόλος του LDL r στην κάθαρση των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών που διαμεσολαβείται από την apoe4mut1, χρησιμοποιήθηκαν ομάδες LDL -/- r και apoe -/- ποντικιών στα οποία χορηγήθηκαν 5*10 8 pfu AdGFP (αδενοϊός ελέγχου), AdGFP-E4 και AdGFP-E4mut1. Σύμφωνα με προηγούμενες εκτενείς μελέτες, αυτή η δόση των αδενοϊών που εκφράζουν την wt apoe δεν επάγει υπερτριγλυκεριδαιμία σε apoe -/- -/- και σε LDL r ποντίκια [87], [88] ενώ επάγει τον -/- αποτελεσματικό καταβολισμό των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών στα LDL r ποντίκια. Την τέταρτη και πέμπτη μέρα μετά την μόλυνση, δείγματα πλάσματος -/- απομονώθηκαν και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης.τα LDL r ποντίκια είχαν ολική χοληστερόλη του πλάσματος σε επίπεδα της τάξης των 239±15 mg/dl στην αρχή του πειράματος. Η έκφραση της apoe4mut1 δεν είχε ως αποτέλεσμα κάποια σημαντική πτώση αυτών των επιπέδων. Τα ποντίκια τα οποία μολύνθηκαν με τον αδενοϊό AdGFP-E4mut1 είχαν παρόμοια επίπεδα ολικής χοληστερόλης πλάσματος με τα ποντίκια που μολύνθηκαν με τον αδενοϊό ελέγχου AdGFP την 4 η μέρα (293±26 mg/dl vs. 267±52 mg/dl αντίστοιχα, p>0,05) και την 5 η μέρα (278±35 mg/dl vs. 345±75 mg/dl αντίστοιχα, p>0,05) μετά την μόλυνση. Η έκφραση της wt apoe4 σε αυτά τα ποντίκια είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης πλάσματος (Εικόνα 3.1-Α) (520±28 mg/dl την 4 η μέρα και 511±19 mg/dl την 5 η μέρα) κάτι που συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες [88]. Δείγματα -/- πλάσματος από τα LDL r ποντίκια απομονώθηκαν την 5 η μέρα μετά την μόλυνση και υπέστησαν κλασματοποίηση σε βαθμίδωση πυκνότητας. Η ανάλυση αυτή έδειξε οτι η έκφραση της wt apoe4 οδήγησε σε μια περαιτέρω συσσώρευση των VLDL σωματιδίων, ενώ η apoe4mut1 προκάλεσε μια μέτρια αύξηση στα επίπεδα της HDL χοληστερόλης σε αυτά τα ποντίκια (Εικόνα 3.1-Β). Όσον αφορά τα apoe -/- ποντίκια, αυτά είχαν ολική χοληστερόλη του πλάσματος σε επίπεδα της τάξης των 417±17 mg/dl στην αρχή του πειράματος (Εικόνα 3.1-C). Η έκφραση των αδενοϊών (5*10 8 pfu) που εξέφραζαν είτε την wt apoe4 είτε την 80

81 Cholesterol (mg/dl) Cholesterol (mg/dl) Cholesterol (mg/dl) Cholesterol (mg/dl) apoe4mut1 προκάλεσε σημαντική μείωση των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης του πλάσματος σε αυτά τα ποντίκια την 4 η μέρα ((61±27 mg/dl vs. 100±20 mg/dl αντίστοιχα, p>0,05) και την 5 η μέρα (48±22 mg/dl vs. 75±15 mg/dl αντίστοιχα, p>0,05) μετά την μόλυνση (Εικόνα 3.1-C). Η χορήγηση παρόμοιας δόσης αδενοϊού ελέγχου AdGFP δεν άλλαξε τα υψηλά επίπεδα ολικής χοληστερόλης πλάσματος αυτών των ποντικών (Εικόνα 3.1-C). A LDLr -/- ApoE -/- C ** ** ** AdGFP 600 ** AdGFP-E4mut1 500 AdGFP-E4 400 ** B VLDL * IDL/LDL Days HDL * Fraction number * d>1.21 D Days ApoE -/- x LDLr -/ Days Εικόνα 3.1. Φαρμακοδυναμική μελέτη της apoe4mut1 σε πειραματικά μοντέλα ποντικών. A) Επίπεδα ολικής χοληστερόλης πλάσματος LDLr -/- ποντικιών στα οποία χορηγήθηκαν οι αδενοϊοί (5x10 8 pfu) AdGFP, AdGFP-E4wt, AdGFP-E4mut1, την 3 η,4 η και 5 η ημέρα μετά την μόλυνση. B) Κατανομή της χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα από το πλάσμα LDLr -/- ποντικιών που απομονώθηκε την 5 η ημέρα μετά την μόλυνση. Οι λιποπρωτεϊνες που αντιστοιχούν στο κάθε κλάσμα σημειώνονται. C) Επίπεδα ολικής χοληστερόλης πλάσματος apoe -/- ποντικιών στα οποία χορηγήθηκαν οι αδενοϊοί (5x10 8 pfu) AdGFP, AdGFP-E4wt, AdGFP-E4mut1, την 4 η και 5 η ημέρα μετά την μόλυνση. D) Επίπεδα ολικής χοληστερόλης πλάσματος ApoE -/- x LDLr -/- ποντικιών στα οποία χορηγήθηκαν οι αδενοϊοί (5x10 8 pfu) AdGFP, AdGFP-E4wt, AdGFP- E4mut1, την 4 η και 5 η ημέρα μετά την μόλυνση. 3.2 ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΗΣ APOE4mut1 ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ HTB-13 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ APOE4mut1- ΠΡΩΤΕΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ HTB-13 κύτταρα που δεν συνθέτουν ενδογενή ApoE μολύνθηκαν με τον ανασυνδυασμένο αδενοϊό AdGFP-E4mut1 σε θρεπτικό υλικό χωρίς ορό. Ανάλυση του μολυσματικού θρεπτικού υλικού των καλλιεργειών με western blotting επιβεβαίωσε οτι η ανασυνδυασμένη apoe4 εκκρίνεται αποτελεσματικά στο θρεπτικό 81

82 μέσο 24 ώρες μετά την μόλυνση ( Εικόνα 3.2-A). Το μολυσματικό θρεπτικό υλικό που περιείχε 1mg apoe4mut1 (προσδιορίστηκε με Elisa), στην συνέχεια, λυοφιλοποιήθηκε και επωάστηκε με διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Έπειτα, πραγματοποιήθηκε υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας KBr και τα πέντε πρώτα κλάσματα που περιείχαν την καθαρή apoe4mut1-πρωτεολιποσώματα (Εικόνα 3.2-B) συλλέχθηκαν και αναμείχθηκαν. Τέλος, με ηλεκτρονική μικροσκοπία επιβεβαιώθηκε οτι τα κλάσματα αυτά περιείχαν πρωτεολιποσώματα σε δισκοειδή μορφή (Εικόνα 3.2-C), όπως αναμενόταν. A MW (KDa) C1 C2 C3 C4 C ApoE4mut1 B MW (KDa) 46 Density: d> Fraction number: ApoE (mg/ml): ApoE4mut1 C Εικόνα 3.2. Παραγωγή και καθαρισμός των apoe4mut1-πρωτεολιποσωμάτων. A) Western blotting ανάλυση στο θρεπτικό μέσο από καλλιέργειες HTB-13 κυττάρων που μολύνθηκαν με τον αδενοϊό που εξέφραζε την apoe4mut1. HTB-13 κύτταρα που δεν εκφράζουν την ενδογενή apoe καλλιεργήθηκαν μέχρι κορεσμού σε Τ-175 φλάσκες και μολύνθηκαν με τον αδενοϊό AdGFP- E4mut1. 24 ώρες μετά την μόλυνση, οι καλλιέργειες πλύθηκαν με PBS και φρέσκο θρεπτικό υλικό χωρίς ορό προστέθηκε για επιπλέον 24 ώρες. Έπειτα, 20 ml του θρεπτικού μέσου από διάφορες φλάσκες (C1 εως C5) απομονώθηκαν και πραγματοποιήθηκε Western blotting ανάλυση. Το μοριακό βάρος των markers και η θέση της apoe4mut1 σημειώνονται. B) Western blotting σε κλάσματα διαφορετικών πυκνοτήτων μετά από υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση 82

83 πυκνότητας KBr για τον καθαρισμό των apoe4mut1-πρωτεολιποσωμάτων. Τα κλάσματα 1-5 αναμείχθηκαν και έπειτα πραγματοποιήθηκε EM ανάλυση. Οι τιμές της apoe δείχνουν την συγκέντρωση της apoe4mut1 σε κάθε κλάσμα (σε mg/dl) έπειτα από ποσοτικοποίηση με ELISA. Το gel είναι μια αντιπροσωπευτική εικόνα από τουλάχιστον δέκα διαφορετικές επαναλήψεις του πειράματος. C) EM ανάλυση μετά από αρνητική χρώση των apoe4mut1-πρωτεολιποσωμάτων των συγκεκριμένων κλασμάτων που αναμείχθηκαν. 3.3 ΕΦΑΠΑΞ ΕΝΔΟΦΛΕΒΙΑ ΕΓΧΥΣΗ ΤΗΣ ΚΑΘΑΡΗΣ APOE4mut1 ΣΕ APOE -/- ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΠΟΥ ΤΡΕΦΟΝΤΑΙ ΜΕ ΔΙΑΙΤΑ ΔΥΤΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ Το φαρμακολογικό αποτέλεσμα της καθαρής πρωτεϊνης apoe4mut1 στα υπολείμματα λιποπρωτεϊνών του πλάσματος εκτιμήθηκε με μια εφάπαξ έγχυση διαλύματος apoe4mut1-πρωτεολιποσωμάτων που περιείχε 1mg καθαρής apoe4mut1. Για αυτή την ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν apoe -/- ποντίκια που ήταν σε δίαιτα δυτικού τύπου για 12 εβδομάδες. Στην αρχή του πειράματος, τα ποντίκια είχαν ολική χοληστερόλη πλάσματος στα επίπεδα της τάξης των 420±63 mg/dl, η οποία αυξήθηκε σημαντικά, όπως αναμενόταν, σε επίπεδα της τάξης των 1076±368 mg/dl, μετά από δίαιτα δυτικού τύπου για 12 εβδομάδες. Εφάπαξ έγχυση της apoe4mut1 προκάλεσε αξιοσημείωτη μείωση στα επίπεδα ολικής χοληστερόλης του πλάσματος αυτών των ποντικών (509±147 mg/dl, p=0.001), σε 6 ώρες μετά την έγχυση (Εικόνα 3.3). Εικόνα 3.3 Επίδραση της εφάπαξ έγχυσης apoe4mut1-πρωτεολιποσωμάτων στα επίπεδα ολικής χοληστερόλης του πλάσματος apoe -/- ποντικιών που τρέφονταν με δίαιτα δυτικού τύπου για 12 εβδομάδες. Σχηματίστηκαν δύο ομάδες apoe -/- ποντικιών με οχτώ ποντίκια στην κάθε μια που τρέφονταν με δίαιτα δυτικού τύπου για 12 εβδομάδες. Ο αρχικός μέσος όρος των επιπέδων χοληστερόλης των δυο ομάδων την ημέρα 0 του πειράματος ήταν 420±63 mg/dl. Μετά από 12 83