ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΣΜΖΜΑ ΦΑΡΜΑΚΔΤΣΗΚΖ. Μαξία Καπαζά. Βηνιφγνο

Transcript

1 ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΠΑΣΡΧΝ ΣΜΖΜΑ ΦΑΡΜΑΚΔΤΣΗΚΖ Μαξία Καπαζά Βηνιφγνο Αλάιπζε Γνληδηαθψλ Ρπζκηζηηθψλ Γηθηχσλ πνπ Δλέρνληαη ζηελ Δκβξπηθή Αλάπηπμε ηνπ Παγθξέαηνο ησλ Θειαζηηθψλ ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ ΠΑΣΡΑ 2011

2 Αθιεπώνεηαι ζε όζοςρ βοήθηζαν να θθάζυ υρ εδώ, ανέσθηκαν ηιρ παπαξενιέρ μος και πίζηεταν ζηην αξία ηος παπόνηορ πονήμαηορ και ανάμεζα ηοςρ ιδιαιηέπυρ ζηην οικογένεια μος και ηην πολςαγαπημένη μος Λία! ii

3 Αλάιπζε Γνληδηαθψλ Ρπζκηζηηθψλ Γηθηχσλ πνπ Δλέρνληαη ζηελ Δκβξπηθή Αλάπηπμε ηνπ Παγθξέαηνο ησλ Θειαζηηθψλ Τπφ Μαξίαο Γεσξγίνπ Καπαζά Σκήκα Φαξκαθεπηηθήο ρνιή Δπηζηεκψλ Τγείαο Παλεπηζηήκην Παηξψλ ΔΠΣΑΜΔΛΖ ΔΞΔΣΑΣΗΚΖ ΔΠΗΣΡΟΠΖ Γεσξγία σηεξνπνχινπ, Αλαπιεξψηξηα Καζεγήηξηα, Σκήκα Φαξκαθεπηηθήο, Παλεπηζηήκην Παηξψλ (Δπηβιέπνπζα) Εσή Λπγεξνχ, Αλαπιεξψηξηα Καζεγήηξηα, Σκήκα Ηαηξηθήο, Παλεπηζηήκην Παηξψλ (Μέινο Σξηκεινχο πκβνπιεπηηθήο Δπηηξνπήο) νθία Κνζζίδα, Δξεπλήηξηα Γ, Ίδξπκα Ηαηξνβηνινγηθψλ Δξεπλψλ ηεο Αθαδεκίαο Αζελψλ (Μέινο Σξηκεινχο πκβνπιεπηηθήο Δπηηξνπήο) Αληψλεο Γαβαιάο, Δξεπλεηήο Γ, Ίδξπκα Ηαηξνβηνινγηθψλ Δξεπλψλ ηεο Αθαδεκίαο Αζελψλ Νηθφιαο Εάγθξεο, Καζεγεηήο, Σκήκα Βηνινγίαο, Παλεπηζηήκην Παηξψλ Γεκήηξεο Θάλνο, Δξεπλεηήο Α, Γηεπζπληήο Κέληξνπ Βαζηθήο Έξεπλαο, Ίδξπκα Ηαηξνβηνινγηθψλ Δξεπλψλ ηεο Αθαδεκίαο Αζελψλ Παχινο Κιεπεηζάλεο, Δπίθνπξνο Καζεγεηήο, Σκήκα Φαξκαθεπηηθήο, Παλεπηζηήκην Παηξψλ

4 «Αν δελ ζηηπίξειρ ηο ένα ζος πόδι έξυ απ' ηη Γη, πνηέ ζος δελ ζα μποπέζειρ να ζηαζείο επάλσ ηηρ.» Οδςζζέαρ Ελύηηρ iv

5 v

6 ΤΝΣΜΖΔΗ ALDH1B1 ΑLdehyde DeHydrogenase 1 family, member B1 AP4 Activator Protein 4 APP Amyloid beta (A4) Precursor Protein ARM ARMadillo ARX Aristaless Related homeobox B-ACTIN Beta Actin BASH Bourne Again SHell BHLHB2 Βasic Helix-Loop-Helix domain containing, class B, 2 BLAST Basic Local Alignment Tool BLOSUM BLOck SUbstitution Matrix BMP Bone Morphogenetic Protein BP Base Pairs BRN2 (Pou3f2) BRaiN-specific homeobox/pou domain, class 3, transcription factor 2 ΒRN4 BRaiN-specific homeobox/pou domain protein 4 CDC42 Cell Division Cycle 42 homolog CREBBP CREB Binding Protein CS Core Similarity CTGF Connective Tissue Growth Factor CTNNB1 Β-CaΣeΝiΝ DCX DoubleCortin DE Definitive Endoderm ΔΒΚ Δκβξπηθά ΒιαζηνΚχηηαξα EST Expressed Sequence Tag(s) F2 Coagulation Factor II FGD4 FYVE, RhoGEF and PH Domain containing 4 FGF Fibroblast Growth Factor FGF10 Fibroblast Growth Factor 10 FGF4 Fibroblast Growth Factor 4 FZD2 FriZzleD homolog 2 Drosophila HBB1 HemogloΒin subunit Βeta 1 HDAC1 Ζistone DeACetylase 1 HNF1 Hepatocyte Nuclear Factor 1 HNF6 Hepatocyte Nuclear Factor 6 HUD HU antigen D ΗΑ1 Insulinoma Associated 1 ΗPA Ingenuity Pathway Analysis IGF Insulin-like Growth Factor ISL1 ISL LIM homeobox 1

7 LIF Leukemia Inhibitory Factor MAPK8 Μitogen- Αctivated Protein Kinase 8 MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis MS Matrix Similarity NEUROD1 NEUROgenic Differentiation 1 NFKB Nuclear Factor Kappa B NGN1 ΝeuroGeniN1 NGN1 NeuroGeniN 1 NGN2 NeuroGeniN 2 NGN3 NeuroGeniN3 NKX2.2 ΝΚ2 family of homeoproteins NR Non-Redundant PARD3 Par-3 PARtitioning Defective3 homolog C.elegans PARD6B Par-6 PARtitioning Defective 6 homolog C.elegans PAX4 PAired box gene 4 PDB Protein Data Bank PDX1 Pancreatic and Duodenal homeobox 1 PHYLIP PLYLogeny Inference Package PKC Protein Kinase C PTF1a Pancreas specific Transcription Factor, 1a P-value Probability value PWM Position Weight Matrix(ces) RGS4 Regulator of G-protein Signaling 4 RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SΖΖ Sonic HedgeHog ΣFBS Transcription Factor Binding Sites TNF Tumor Necrosis Factor TP53 Tumor Protein p53 TSS Transcription Start Site TSP1 ThromboSPondin1 UPGMA Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Averages VCL VinCuLin VWC Von Willebrand type C WISP1 WNT-Induced Secreted Protein 1 WNT Wingless oncogene analogs WΝΣ5 Wingless-related MMTV integration site 5 ΤΟ Τπνθαηάζηαην Oξνχ vii

8 ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ ΤΝΣΜΖΔΗ ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ... VIII ΔΤΡΔΣΖΡΗΟ ΠΗΝΑΚΧΝ... XI ΔΤΡΔΣΖΡΗΟ ΔΗΚΟΝΧΝ... XII 1 ΔΗΑΓΧΓΖ Γηεξεχλεζε Γνληδηαθψλ Ρπζκηζηηθψλ Γηθηχσλ πνπ Δκπιέθνληαη ζηελ Δκβξπνγέλεζε Μέζσ Βηνπιεξνθνξηθήο Αλαηνκία ηνπ Παγθξέαηνο - Παξαγσγή Ηλζνπιίλεο χγθξηζε ησλ Κπηηάξσλ ηνπ Παγθξέαηνο ησλ Θειαζηηθψλ κε Παξφκνηα Κχηηαξα Άιισλ Δμειηθηηθά Παιαηφηεξσλ Οξγαληζκψλ Μνξθνγέλεζε ηνπ Παγθξέαηνο ζην Αλαπηπζζφκελν Έκβξπν ησλ Θειαζηηθψλ Ρπζκηζηηθά Γίθηπα πνπ Καηεπζχλνπλ ηνλ ρεκαηηζκφ ηνπ Παγθξέαηνο. Ο Ρφινο ηνπ Μεηαγξαθηθνχ Παξάγνληα NGN Δκβξπïθά Βιαζηνθχηηαξα θαη Παξαγσγή Ηλζνπιίλεο κε Δπαγσγή ηνπ Παξάγνληα NGN Γνλίδηα Γλσζηνί - ηφρνη ηνπ NGN Ζ Ρχζκηζε ηεο Μεηαγξαθήο ζηνπο Δπθαξπσηηθνχο Οξγαληζκνχο Ζ Πεξηεθηηθφηεηα ζε GC Ννπθιενηίδηα ζε ρέζε κε ηε Λεηηνπξγηθφηεηα ησλ Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ Μέζνδνη Πξφβιεςεο Ρπζκηζηηθψλ ηνηρείσλ πγθξηηηθή Γνληδησκαηηθή θαη Αλάιπζε πλεθθξαδφκελσλ Γνληδίσλ: Μέζνδνη Πεξηνξηζκνχ ησλ Φεπδψο-Θεηηθψλ Απνηειεζκάησλ Οξζφινγα θαη Παξάινγα Γνλίδηα Απηνηειείο Γνκηθέο Πεξηνρέο Πξσηετλψλ Μέζνδνη Πξφβιεςεο Πξσηετληθψλ Αιιειεπηδξάζεσλ ΚΟΠΟ ΣΖ ΜΔΛΔΣΖ ΓΔΓΟΜΔΝΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ Γεληθά Δπηινγή ησλ Γνληδίσλ πξνο Αλάιπζε. Γεδνκέλα απφ Πεηξάκαηα Πξνζδηνξηζκνχ ηεο Γνληδηαθήο Έθθξαζεο κε Μηθξνζπζηνηρίεο DNA viii

9 3.1.2 Δπηβεβαίσζε ηεο Αιιαγήο Έθθξαζεο Δπηιεγκέλσλ Γνληδίσλ κε Αιπζηδσηή Αληίδξαζε Πνιπκεξάζεο πλνπηηθή Παξνπζίαζε ηεο In Silico Αλάιπζεο ησλ Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ ησλ Γνληδίσλ Δμφξπμε ηνηρείσλ απφ Γηεζλείο Βάζεηο Γεδνκέλσλ Αλεχξεζε Οξζνιφγσλ. Ο Αιγφξηζκνο BLAST ηνίρηζε Ννπθιενηηδηθψλ θαη Ακηλνμηθψλ Αιιεινπρηψλ Καηαζθεπή Φπινγελεηηθψλ Γέλδξσλ Πξφβιεςε Θέζεσλ Πξφζδεζεο Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ. O Αιγφξηζκνο MatInspector Δχξεζε πληεξεκέλσλ πκπιφθσλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ. Ο Αιγφξηζκνο FrameWorker Αλαδήηεζε Θέζεσλ Πξφζδεζεο Δπηιεγκέλσλ Μεηαγξαθηθψλ ζε Οιφθιεξν Γνληδίσκα κε ρεδηαζκφ Καηάιιεινπ Κψδηθα Απηνκαηνπνίεζε ηνπ Δληνπηζκνχ Ρπζκηζηηθψλ πκπιφθσλ κε Δηδηθνχο Κψδηθεο Δληνιψλ Αλαδήηεζε Γηαθνξψλ ζηα χκπινθα ησλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ κε ηελ Καηαζθεπή Δμεηδηθεπκέλεο Δθαξκνγήο Αλαδήηεζε πληεξεκέλσλ Πξνηχπσλ Ννπθιενηηδίσλ ζηηο Πεξηνρέο ησλ Ρπζκηζηηθψλ ηνηρείσλ Αλαιπζε ηεο Πεξηεθηηθφηεηαο ζε Βάζεηο GC ησλ Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ ηνπ DNA Γηεξεχλεζε ησλ Αιιειεπηδξάζεσλ Μεηαμχ ησλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ κε Υξήζε Γξάθσλ Αιιειεπηδξάζεσλ Πξνηππνπνίεζε κε Βάζε ηελ Οκνινγία. Σν Πξφγξακκα SWISS-MODEL Γηεξεχλεζε ησλ Αιιειεπηδξάζεσλ ησλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ κε Βάζε ηηο Σξηζδηάζηαηεο Γνκέο ηνπο. Σν Βηνυπνινγηζηηθφ Δξγαιείν PatchDock AΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΚΑΗ ΤΕΖΣΖΖ Δμέηαζε Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ Με πγθξηηηθή Γνληδησκαηηθή Πξψηε Φάζε Αλάιπζε Γνληδίσλ Γλσζηψλ ηφρσλ ηνπ NGN Γεχηεξε Φάζε Πξψην Μέξνο: Αλάιπζε ησλ πξξπζκηδφκελσλ Γνληδίσλ WISP1 & CTGF Γεχηεξν Μέξνο: Αλάιπζε ησλ Παξαιφγσλ ηνπ WNT Αλάιπζε Πηζαλψλ ηφρσλ ηνπ NGN Αλάιπζε Πιήξνπο Γνληδηψκαηνο ix

10 4.2 Αλάιπζε ησλ Cis Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ ησλ Γνληδίσλ Δμέηαζε ηνπ Δπηπέδνπ GC ησλ Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ Αλαδήηεζε Πξνηχπσλ Ννπθιενηηδίσλ ζηηο Δπηιεγκέλεο Πεξηνρέο ησλ Ρπζκηζηηθψλ πκπιφθσλ Καηαζθεπή Γνληδηαθνχ Ρπζκηζηηθνχ Γηθηχνπ Γηεξεχλεζε ησλ trans-trans Αιιειεπηδξάζεσλ ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ... I 8 ΠΔΡΗΛΖΦΖ... XXVII 9 ABSTRACT... XXX ΓΖΜΟΗΔΤΔΗ x

11 ΔΤΡΔΣΖΡΗΟ ΠΗΝΑΚΧΝ Πίλαθαο 1: Καλφλεο IUPAC γηα ηελ θαηαζθεπή ζπλαηλεηηθψλ αιιεινπρηψλ Πίλαθαο 2: Οη εθθηλεηέο θαη νη ζεξκνθξαζίεο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηηο RT-PCR αληηδξάζεηο Πίλαθαο 3: Πίλαθαο ζπρλφηεηαο γηα ηελ πξφβιεςε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ησλ παξαγφλησλ NGN1/ Πίλαθαο 4: Οηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ κπνξνχλ λα πξνζδεζνχλ ζε φια ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ IA1, PAX4, NKX2.2 θαη NEUROD1. Γίπια ζε θάζε νηθνγέλεηα ε ηηκή «p-value» δειψλεη ην βαζκφ αμηνπηζηίαο ηνπ απνηειέζκαηνο Πίλαθαο 5: Αιιαγή ησλ επηπέδσλ έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF, 48 ψξεο κεηά ηελ έθθξαζε ηνπ NGN3, φπσο απηά πξνέθπςαλ απφ αλάιπζε ησλ mrnas ησλ δχν γνληδίσλ κε κηθξνζπζηνηρίεο DNA (Serafimidis et., al., 2008) Πίλαθαο 6: Οη νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ εκθάληδαλ ζέζεηο πξφζδεζεο απφ θνηλνχ ζε φια ηα νξζφινγα απφ δέθα νξγαληζκνχο γηα ην γνλίδην WISP1 (αξηζηεξά) θαη γηα ην CTGF (δεμηά). Γίπια ζε θάζε νηθνγέλεηα ε ηηκή p-value εθθξάδεη ην βαζκφ αμηνπηζηίαο ηνπ απνηειέζκαηνο Πίλαθαο 7: Αιιαγή ηεο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ WNT5A θαη WNT5B φπσο αληρλεχζεθε απφ ηα επίπεδα mrna πνπ κεηξήζεθαλ 48 ψξεο κεηά απφ ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 (Serafimidis et al., 2008) Πίλαθαο 8: Οη ηηκέο p-value γηα ηηο έμη νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηνπ ζπληεξεκέλνπ ζπκπιφθνπ ζηα WNT5 γνλίδηα Πίλαθαο 9: Tα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ ζηελ παξνχζα θάζε, ε αιιαγή ηεο έθθξαζήο ηνπο 48h κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 θαη ν βηνινγηθφο ηνπο ξφινο (Serafimidis et al., 2008) Πίλαθαο 10: πλνπηηθφο ζρνιηαζκφο ηεο αιιαγήο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ απφ ηνλ NGN3 θαη ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ πνπ εκθάληζαλ ζην εχξνο ησλ νξζνιφγσλ πνπ εμεηάζηεθαλ γηα ην θαζέλα Πίλαθαο 11: Απνηειέζκαηα αλαγλψξηζεο ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ ζε επηιεγκέλα γνλίδηα-ζηφρνπο ηνπ NGN3 θαη ζην πιήξεο γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ xi

12 ΔΤΡΔΣΖΡΗΟ ΔΗΚΟΝΧΝ Δηθφλα 1: (Α) Αλαηνκία ηνπ παγθξέαηνο ελειίθνπ. (Β) Ο ξαρηαίνο θαη ν θνηιηαθφο ινβφο ηνπ παγθξέαηνο ζε αλζξψπηλν έκβξπν 36 εκεξψλ. (Slack, 1995) Δηθφλα 2: ηάδηα αλάπηπμεο ηνπ ξαρηαίνπ παγθξέαηνο ζε ηξσθηηθά. (Α) ην ζηάδην ησλ 15 ζσκηηψλ ε λσηνρνξδή ηπιίγεη ηνλ λεπξηθφ ζσιήλα θαη ην έληεξν. (Β) ην ζηάδην ησλ 20 ζσκηηψλ ε ξαρηαία ανξηή βξίζθεηαη κεηαμχ ηνπ εληέξνπ θαη ηεο λσηνρνξδήο. (Γ) ην ζηάδην ησλ 28 ζσκηηψλ ην κεζέγρπκα πεξηηπιίγεη νιφθιεξν ην έληεξν θαη έρεη πιένλ ζρεκαηηζηεί ν ξαρηαίνο παγθξεαηηθφο ινβφο. (Slack, 1995) Δηθφλα 3: ηαδηαθή δηαθνξνπνίεζε ησλ β-θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο (Servitja & Ferrer, 2004)...24 Δηθφλα 4: ηαδηαθή δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηαξηθψλ ηχπσλ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο απφ NGN3+ θχηηαξα (Gittes, 2009) Δηθφλα 5: Πξσηφθνιιν δηαθνξνπνίεζεο εκβξπηθψλ βιαζηνθπηηάξσλ πνληηθνχ πξνο ζσκαηίδηα κε ραξαθηήξα ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο (Serafimidis et al., 2008) Δηθφλα 6: Υαξαθηεξηζηηθά ζηνηρεία ξχζκηζεο ηεο κεηαγξαθήο ελφο επθαξπσηηθνχ γνληδίνπ (Κνζζίδα, 2008) Δηθφλα 7: Θέζε θαη ηξφπνο δξάζεο ππνθηλεηή, εληζρπηή, κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, ελεξγνπνηεηψλ, ζπλεξγνπνηεηψλ θαη θαηαζηνιέσλ (Κνζζίδα, 2008) Δηθφλα 8: πλαηλεηηθή αιιεινπρία γηα ηα πξφηππα πξφζδεζεο ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα NGN1 ζην DNA Δηθφλα 9: (A) Eπηθάλεηα Connolly. (B) Σερληθή Lenhoff Δηθφλα 10: ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ηεο in silico αλάιπζεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ Δηθφλα 11: Γηάγξακκα ξνήο πνπ πεξηγξάθεη ηε δηαδηθαζία ηνπ βέιηηζηνπ BLAST Δηθφλα 12: Σνπνινγία θαη ζηνηρεία ελφο θπινγελεηηθνχ δέλδξνπ Δηθφλα 13: Απνηειέζκαηα πηζαλψλ ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε κηα λνπθιενηηδηθή αιιεινπρία φπσο πξνέθπςαλ απφ ηνλ αιγνξίζκν ΜatInspector Δηθφλα 14: Ζ εθαξκνγή ΣFDetector Δηθφλα 15: Παξάδεηγκα απνηειεζκάησλ ηνπ αιγνξίζκνπ RepeatMasker Δηθφλα 16: Παξάδεηγκα εμφδνπ ηνπ πξνγξάκκαηνο MEME Δηθφλα 17: Παξάδεηγκα αξρείσλ εμφδνπ ηνπ πξνγξάκκαηνο EMBOSS ISOCHORE Δηθφλα 18: Κψδηθαο ζρεκάησλ θαη ζπκβνιηζκψλ ηνπ πξνγξάκκαηνο IPA (Δγρεηξίδην νδεγηψλ ρξήζεο ηνπ πξνγξάκκαηνο) Δηθφλα 19: Παξάδεηγκα απνηειεζκάησλ ηνπ πξνγξάκκαηνο PatchDock Δηθφλα 20: Οη κεηαβνιέο ηεο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ φπσο αληρλεχζεθαλ απφ ηα επίπεδα mrna πνπ κεηξήζεθαλ 12-48h κεηά ηελ επαγσγή ηνπ παξάγνληα NGN3. Παξάιιεια, ππνδεηθλχνληαη νη δψλεο πνπ αληηζηνηρνχλ ζηα mrnas ηνπ γνληδίνπ B-ACTIN (βαθηίλεο) πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε σο ζεηηθφο κάξηπξαο, θαζψο εθθξάδεηαη ζπλερψο ζε φια ηα θχηηαξα (Serafimidis et al., 2008) 84 xii

13 Δηθφλα 21: Γηαζπνξά θαη ζπληήξεζε ζε νξηζκέλα είδε ησλ αιιεινπρηψλ «E-boxes» φπνπ πξνζδέλεηαη ν παξάγνληαο NGN3 θαη ζηνίρηζή ηνπο κε ηηο πξνβιεπφκελεο απφ ην MatInspector αιιεινπρίεο γηα ην γνλίδην ΙΑ Δηθφλα 22: ηνηρίζεηο ησλ πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλσλ κε ηηο πξνβιεπφκελεο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο γηα ηα γνλίδηα (Α) PAX4, (B) NKX2.2 θαη (Γ) NEUROD Δηθφλα 23: χκπινθν-πξφηππν κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ φπσο αλαγλσξίζηεθε απφ ην πξφγξακκα FrameWorker ζε νξηζκέλα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ NEUROD1. ην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο ππνδεηθλχνληαη νη νηθνγέλεηεο ζηηο νπνίεο αλήθνπλ νη παξάγνληεο ηνπ πξνηχπνπ, ελψ ε θφθθηλε γξακκή ππνδειψλεη ην TSS ηνπ θάζε γνληδίνπ Δηθφλα 24: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ ΙΑ1 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Όπνπ ζπλεληνπίδνληαη νξηζκέλα κφλν κέιε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, ε πεξηνρή δειψλεηαη κε πιαίζην Δηθφλα 25: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ PΑΧ4 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο Δηθφλα 26: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ NEUROD1 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο Δηθφλα 27: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ NKX2.2 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Όπνπ ζπλεληνπίδνληαη νξηζκέλα κφλν κέιε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, ε πεξηνρή δειψλεηαη κε πιαίζην Δηθφλα 28: Απνηειέζκαηα ειεθηξνθφξεζεο ζε πήθησκα αγαξφδεο γηα ηα πξντφληα RT-PCR. (Α) ζε πιεζπζκφ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ θαη (Β) ζε επίπεδν ελφο θπηηάξνπ. Σα γνλίδηα WISP1 and CTGF θαηαζηάιζεθαλ απφ θνηλνχ κεηά απφ επαγσγή ηεο έθθξαζεο (+ngn3) ηνπ NGN3 ζηα θχηηαξα. Σα επίπεδα έθθξαζεο ηνπ γνληδίνπ B-ACTIN, πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε σο κάξηπξαο, ήηαλ ζηαζεξά (Kapasa et al., 2008) Δηθφλα 29: Σν πξφηππν PDX1-BRNF-NEUR φπσο αλαγλσξίζηεθε απφ ην πξφγξακκα FrameWorker γηα θάπνηα είδε νξγαληζκψλ ζηηο γνληδηαθέο πεξηνρέο Α) ηνπ WISP1 θαη Β) ηνπ CTGF. Ζ αλαζηξνθή ησλ ζρεκάησλ ζπκβνιίδεη πξφζδεζε ησλ αληηζηνίρσλ παξαγφλησλ ζηε ζπκπιεξσκαηηθή αιιεινπρία Δηθφλα 30: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίζηεθε ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο ζηα WISP1 (κπιε γξακκή) θαη CTGF (άζπξε γξακκή) νξζφινγα. Γίπια θαη αλάκεζα ζε θάζε δεχγνο γνληδίσλ αλαγξάθεηαη ν νξγαληζκφο πνπ αλήθνπλ (Kapasa et al., 2008) Δηθφλα 31: Φπινγελεηηθή δηαζπνξά ησλ νξζνιφγσλ πξσηετλψλ (A) WISP1 θαη (Β) CTGF Δηθφλα 32: Οη ζπληεξεκέλεο δνκηθέο πεξηνρέο ζην κφξην ηεο πξσηεΐλεο (Α) WISP1 θαη (Β) CTGF. Ζ δνκηθή πεξηνρή 1 νλνκάδεηαη IGF (Insulin-like Growth Factor)-binding domain, ε δνκηθή πεξηνρή 2 VWC (Von Willebrand type C domain), ε δνκηθή πεξηνρή 3 TSP1(ThromboSPondin- 1), θαη ε δνκηθή πεξηνρή 4 είλαη θαξβνμπηειηθή πεξηνρή πινχζηα ζε θαηάινηπα θπζηεΐλεο (Cysknot) (Kapasa et al., 2008) Δηθφλα 33: Σν θαλνληθφ κνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ ελεξγνπνηνχλ νη πξσηεΐλεο WNT (Alberts et al.; 2002) xiii

14 Δηθφλα 34: H θπινγελεηηθή δηαζπνξά ησλ WNT5 πξσηετλψλ απφ ηα είδε πνπ εμεηάζηεθαλ Δηθφλα 35: Οη ζπληεληθέο πεξηνρέο γηα ηα γνλίδηα (Α) WNT5A θαη (Β) WNT5B ησλ γλαζφζηνκσλ θαη (Γ) WNT5 ησλ αζπφλδπισλ θαη ησλ αγλάζσλ (Kapasa et al., 2010) Δηθφλα 36: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίζηεθε ην ζπληεξεκέλν ζχκπινθν ζηα WNT5 γνλίδηα ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ηνλ δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ παξνπζηάδνληαη κε ηε ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κε ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο (Kapasa et al., 2010) Δηθφλα 37: Έθθξαζε ησλ WNT5A θαη WNT5B γνληδίσλ ζηα θχηηαξα δηαθφξσλ ηχπσλ απφ ηζηνχο πγηψλ ελειίθσλ αλζξψπσλ. ηνλ άμνλα ρ αλαγξάθεηαη ην είδνο ηνπ ηζηνχ ηα θχηηαξα ηνπ νπνίνπ εμεηάζηεθαλ, ελψ ζηνλ άμνλα y ν βαζκφο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ (Kapasa et.al., 2010) Δηθφλα 38: Έθθξαζε ησλ WNT5A θαη WNT5B γνληδίσλ ζηα θχηηαξα δηαθφξσλ αλαπηπμηαθψλ ζηαδίσλ θαηά ηε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο ζε έκβξπα πνληηθψλ. Ο άμνλαο ρ ππνδειψλεη ηελ ειηθία ησλ θπηηάξσλ ζε εκέξεο κεηά ηε γνληκνπνίεζε (Δ), ελψ ν άμνλαο y ηνλ βαζκφ έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ (Kapasa et.al., 2010) Δηθφλα 39: Πξφηππα έθθξαζεο ησλ WNT5Α θαη WNT5Β (Α) ζε εκβξπηθά βιαζηνθχηηαξα θαη (Β) ζε δηαθνξνπνηεκέλα θχηηαξα απφ πνηθίινπο ηζηνχο πγηψλ ελειίθσλ αηφκσλ ηνπ νξγαληζκνχ Macaque. ηνλ άμνλα ρ αλαγξάθεηαη ν ηζηφο απφ ηνλ νπνίν απνκνλψζεθαλ ηα θχηηαξα πνπ εμεηάζηεθαλ, ελψ ζηνλ άμνλα y ν βαζκφο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ (Kapasa et al., 2010) Δηθφλα 40: Σα παξάινγα ηνπ γνληδίνπ WNT5 κε ην ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν, φπνπ εληνπίζηεθε, ην νπνίν ππνδειψλεηαη κε ην κηθξφ καχξν θνπηί. Παξάιιεια ππνδειψλεηαη κε γθξη θνπθίδα ν ελδερφκελνο δηπιαζηαζκφο ηνπ WNT5 θαηά ην δηαρσξηζκφ ησλ γλαζφζηνκσλ απφ ηα άγλαζα (Kapasa et al., 2010) Δηθφλα 41: Γνκηθέο ιεηηνπξγηθέο πεξηνρέο ζηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ WNT5Α θαη WNT5B ησλ νξγαληζκψλ M. musculus θαη D. rerio Δηθφλα 42: Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ απφ ηηο νηθνγέλεηεο NEUR, PDX1, BRNF, HNF1, HNF6 θαη LEFF, φπσο αλαγλσξίζηεθε ζηα γνλίδηα ηνπ πνληηθνχ. Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ζχκπινθν ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ηνλ δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ παξνπζηάδνληαη κε ηε ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κε ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο Δηθφλα 43: Γξαθηθή αλαπαξάζηαζε ηεο λνπθιενηηδηθήο ζχζηαζεο (%) ζε GC ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FGD4 (Α) απφ ηα ζειαζηηθά θαη (Β) απφ ηα θαηψηεξα ζπνλδπισηά Δηθφλα 44: Γξαθηθή αλαπαξάζηαζε ηεο λνπθιενηηδηθήο ζχζηαζεο (%) ζε GC ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FZD2 (Α) απφ ηα ζειαζηηθά θαη (Β) απφ ηα θαηψηεξα ζπνλδπισηά xiv

15 Δηθφλα 45: χγθξηζε ησλ επηπέδσλ GC ησλ επξχηεξσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ θαη ησλ πεξηνρψλ ησλ ζπκπιφθσλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FGD Δηθφλα 46: χγθξηζε ησλ επηπέδσλ GC ησλ επξχηεξσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ θαη ησλ πεξηνρψλ ησλ ζπκπιφθσλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FZD Δηθφλα 47: χγθξηζε ησλ επηπέδσλ GC ησλ επξχηεξσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ θαη ησλ πεξηνρψλ ησλ ζπκπιφθσλ γηα φια ηα γνλίδηα πνπ κειεηήζεθαλ απφ ηνλ νξγαληζκφ M. musculus Δηθφλα 48: πγθξηηηθά δηαγξάκκαηα ησλ επηπέδσλ GC ησλ ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ αλάκεζα ζηα θαηαζηειιφκελα θαη ηα επαγφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα Δηθφλα 49: Καηαλνκή ησλ νξζνιφγσλ ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ ζηηο ηζφρσξεο ησλ γνληδησκάησλ ησλ αληίζηνηρσλ νξγαληζκψλ Δηθφλα 50: Οξγάλσζε ησλ γνληδησκάησλ δηαθφξσλ νξγαληζκψλ ζε ηζφρσξεο (Costantini et al., Δηθφλα 51: ηνίρηζε ηεο γλσζηήο αιιεινπρίαο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 κε ηα πξφηππα πνπ εληνπίζηεθαλ ζηα γνλίδηα-γλσζηνχο ζηφρνπο ηνπ απφ θνηλνχ ζε φια ηα νξζφινγα ησλ ζειαζηηθψλ Δηθφλα 52: ηνίρηζε ηεο γλσζηήο αιιεινπρίαο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 κε ηα πξφηππα πνπ εληνπίζηεθαλ ζε επαγφκελα θαη θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ παξάγνληα NGN3 γνλίδηα Δηθφλα 53: (Α) ηνίρηζε ηεο ζπλαηλεηηθήο αιιεινπρίαο πξνηχπνπ πνπ εληνπίζηεθε ζε θαηαζηειιφκελα γνλίδηα κε ηελ γλσζηή αιιεινπρία πξφζδεζεο ηνπ ΑΡ4. (B) Σα γνλίδηα πνπ θέξνπλ απφ θνηλνχ ην πξφηππν πνπ πεξηέρεη ηελ ζέζε πξφζδεζεο ηνπ AP4 θαη ε ζρεηηθή ζέζε απηνχ ζηηο αιιεινπρίεο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ ηνπο Δηθφλα 54: (Α) Αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ πξσηετλψλ πνπ ζπγθξνηνχλ ην ζχκπινθν ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηεο παξνχζαο κειέηεο. (Β) Σα δχν δηαθξηηά πηζαλά ζχκπινθα παξαγφλησλ πνπ ειέγρνπλ: Η. ηελ επαγσγή θαη ΗΗ. ηελ θαηαζηνιή ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ. Σν ππφκλεκα, ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο, επεμεγεί ην ζπκβνιηζκφ ησλ αιιειεπηδξάζεσλ Δηθφλα 55: Αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ παξαγφλησλ ηνπ κεηαγξαθηθνχ ζπκπιφθνπ θαη ησλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ. ην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο επεμεγνχληαη ηα ζχκβνια ησλ αιιειεπηδξάζεσλ θαη ησλ ζπκκεηερφλησλ κνξίσλ Δηθφλα 56: (Α) To πξφηππν ηεο πξσηεΐλεο HDAC1. (Β) Αμηνιφγεζε ηνπ πξνηχπνπ κε ην πξφγξακκα ANOLEA Δηθφλα 57: Οη δνκηθέο πεξηνρέο ησλ θπξηφηεξσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ Δηθφλα 58: χγθξηζε ηεο δηεπζέηεζεο ζηνλ ρψξν δχν πξσηετληθψλ αιπζίδσλ απφ ην αξρείν PDB (απφδνζε κε ηε κνξθή α-ειίθσλ) θαη απφ ην αξρείν πνπ απέδσζε ην πξφγξακκα PatchDock (απφδνζε κε ηνλ ζρεδηαζκφ ησλ πιεπξηθψλ αιπζίδσλ ησλ ακηλνμέσλ) Δηθφλα 59: (A) Αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ παξαγφλησλ NGN3 (Γαιάδην) θαη CREBBP (Πξάζηλν). (B) Λεπηνκεξήο απφδνζε νξηζκέλσλ δεπγψλ αιιειεπηδξψλησλ ακηλνμέσλ ζην δηκεξέο Δηθφλα 60: Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ NGN3 (Κίηξηλν), HNF1 (Πξάζηλν) CREBBP (Κφθθηλν) θαη CTNNB1 (Μπιε) xv

16 Δηθφλα 61: (Α) Σν ζχκπινθν ησλ πξσηετλψλ CTNNB1 (Φνχμηα) θαη HDAC1 (Μσβ). (Β) Αιιειεπηδξψληα ακηλνμέα ζηα ζεκεία φπνπ νη δχν πξσηεΐλεο πξνζεγγίδνπλ ε κία ηελ άιιε Δηθφλα 62: (Α) Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ LEF1 (Μσβ) θαη ΑP4 (Κίηξηλν). (Β) Εεχγε αιιειεπηδξψλησλ ακηλνμέσλ Δηθφλα 63: (Α) Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ PDX1 (Γαιάδην) θαη LEF1 (Πξάζηλν). Β) Αιιειεπηδξάζεηο ακηλνμέσλ.157 xvi

17 1 ΔΗΑΓΧΓΖ 1.1 Γηεξεχλεζε Γνληδηαθψλ Ρπζκηζηηθψλ Γηθηχσλ πνπ Δκπιέθνληαη ζηελ Δκβξπνγέλεζε Μέζσ Βηνπιεξνθνξηθήο Ζ δηεξεχλεζε ησλ βηνινγηθψλ δηαδηθαζηψλ πνπ θαηεπζχλνπλ ηε ζσζηή αλάπηπμε ηνπ εκβξχνπ απνηειεί πεδίν εληαηηθήο έξεπλαο. Παξάιιεια, νινέλα θαη πεξηζζφηεξα γνληδηψκαηα νξγαληζκψλ πξνζδηνξίδνληαη θαη θαηαρσξνχληαη ζε δηεζλείο βάζεηο δεδνκέλσλ, ελψ γίλεηαη επξχηαηε εθαξκνγή ησλ κεζφδσλ πξνζδηνξηζκνχ ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο ζε επίπεδν νιφθιεξνπ γνληδηψκαηνο, κε ρξήζε π.ρ. κηθξνζπζηνηρηψλ DNA. ηε δηεπηθάλεηα απηψλ ησλ δχν πεδίσλ ε αλάπηπμε ζχγρξνλσλ εξγαιείσλ βηνπιεξνθνξηθήο παξέρεη ηε δπλαηφηεηα αλάιπζεο ελφο ηεξάζηηνπ φγθνπ δεδνκέλσλ απφ ηηο παξαπάλσ εξεπλεηηθέο δηαδηθαζίεο θαη δίλεη ην έλαπζκα γηα ηε δηεξεχλεζε πηζαλψλ ζχλζεησλ γνληδηαθψλ ξπζκηζηηθψλ δηθηχσλ. Ζ εκβξπνγέλεζε ζηα ζειαζηηθά είλαη κηα δηαδηθαζία ζπλερνχο θαζνξηζκνχ ηεο κνξθήο θαη ηεο ιεηηνπξγίαο ησλ θπηηάξσλ πνπ πξνέξρνληαη απφ ηηο ζπλερείο δηαηξέζεηο ησλ πνιπδχλακσλ αξρέγνλσλ θπηηάξσλ ηνπ εκβξχνπ. Σα πνιπδχλακα απηά θχηηαξα θαζνξίδνληαη πξνο θχηηαξα κε νινέλα θαη πεξηζζφηεξν πξνζδηνξηζκέλν αλαπηπμηαθφ δπλακηθφ έσο φηνπ πξνθχςνπλ θχηηαξα πιήξσο δηαθνξνπνηεκέλα θαη εμεηδηθεπκέλα λα επηηεινχλ ζπγθεθξηκέλνπο ξφινπο. Απηέο νη αλαπηπμηαθέο δηαδηθαζίεο επεξεάδνληαη απφ δηάθνξνπο επηγελεηηθνχο θαη πεξηβαιινληηθνχο παξάγνληεο, θπξίσο φκσο θαζνδεγνχληαη απφ κηα ζεηξά γνληδηαθψλ ξπζκηζηηθψλ δηθηχσλ πνπ ελεξγνπνηνχληαη ήδε απφ ηελ έλαξμε ηεο εκβξπνγέλεζεο (1, 2). απηά ηα δίθηπα, εμσθπηηαξηθά ζήκαηα ιεηηνπξγνχλ σο εξεζίζκαηα θαη ηα θχηηαξα απνθξίλνληαη θαηεπζχλνληαο επηιεθηηθά ηελ έθθξαζε ζπγθεθξηκέλσλ γνληδίσλ. Σα ζήκαηα πνπ δέρεηαη θάζε θχηηαξν απφ ην πεξηβάιινλ κεηαβηβάδνληαη ζηνλ ππξήλα, φπνπ κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο, ηζηνεηδηθά εθθξαδφκελνη, ειέγρνπλ ηε κεηαγξαθή ζπγθεθξηκέλσλ γνληδίσλ. Ζ κεηαγξαθή ειέγρεηαη απφ ηελ αιιειεπίδξαζε ησλ cis-ξπζκηζηηθψλ αιιεινπρηψλ ηνπ γνληδηψκαηνο κε πξσηεΐλεοκεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο (trans-ξπζκηζηηθά ζηνηρεία). Ζ εκβξπηθή αλάπηπμε ησλ ζειαζηηθψλ απνηειεί κηα δηαδηθαζία πςεινχ επηπέδνπ ζπληνληζκνχ κεηαμχ ησλ 17

18 πιεζπζκψλ ησλ θπηηάξσλ πνπ πξνζαλαηνιίδνληαη θαηάιιεια θαηά κήθνο ηνπ πξφζζην-νπίζζηνπ θαζψο θαη ηνπ ξαρηαίν-θνηιηαθνχ άμνλα ηνπ εκβξχνπ. Ο ζσζηφο πξνζαλαηνιηζκφο ησλ θπηηάξσλ είλαη πξνυπφζεζε ψζηε λα αθνινπζήζνπλ εμεηδηθεπκέλα αλαπηπμηαθά κνλνπάηηα πνπ ζα θαηαιήμνπλ ζηε δηαθνξνπνίεζε ησλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ πξνο ζπγθεθξηκέλνπο θπηηαξηθνχο ηχπνπο. Απηφ ζπκβαίλεη θαζψο ε αθξηβήο ζέζε πνπ ιακβάλνπλ ηα θχηηαξα θαηά κήθνο ησλ δχν αμφλσλ θαζνξίδεη θαη ην είδνο ησλ κνξίσλ-ζεκάησλ πνπ ζα ιακβάλνπλ ψζηε λα εθπνξεχνληαη κνλνπάηηα κεηαγσγήο ζήκαηνο. πλνςίδνληαο, ζα ιέγακε πσο έλα ζχλνιν εμσγελψλ κνξίσλ αιιειεπηδξά κε κηα πιεηάδα ελδνγελψλ θαη ην απνηέιεζκα απηψλ ησλ κνξηαθψλ αιιειεπηδξάζεσλ θαζνξίδεη ηελ ηχρε ησλ θπηηάξσλ ειέγρνληαο ηε κεηαγξαθή επηιεγκέλσλ γνληδίσλ ζε απηά (3). ην επίθεληξν ηεο έξεπλαο απηήο ηεο δηαηξηβήο βξίζθνληαη νη αιιεινπρίεο ξχζκηζεο ηεο κεηαγξαθήο εθείλσλ ησλ γνληδίσλ πνπ ζρεηίδνληαη κε ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηεο κνίξαο ησλ θπηηάξσλ. πλήζσο, νη αιιεινπρίεο πνπ απνηεινχλ ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, βξίζθνληαη αξθεηά καθξηά απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο θάζε γνληδίνπ (4, 5) θαη είλαη ζπρλά ζπληεξεκέλεο πεξηνρέο αθνχ ε εμειηθηηθή πίεζε πνπ ηνπο αζθείηαη είλαη κεγαιχηεξε ιφγσ ηνπ ζεκαληηθνχ ηνπο ξφινπ ζε ζρέζε κε ηηο ππφινηπεο πεξηνρέο ελφο γνληδηψκαηνο. Μέζα ινηπφλ απφ δηαδηθαζίεο πνπ πεξηιακβάλνπλ ζχγθξηζε γνληδησκάησλ ζε επξεία θιίκαθα (ζπγθξηηηθή γνληδησκαηηθή) είλαη δπλαηφ λα αλαγλσξηζηνχλ ηέηνηα ξπζκηζηηθά ζηνηρεία (6). Πξνο ηνχην ε κέζνδνο ηεο ζπγθξηηηθήο γνληδησκαηηθήο ζε ζπλδπαζκφ κε ηελ αλάπηπμε ελφο ζπλφινπ αιγνξίζκσλ γηα ηνλ εληνπηζκφ ζηνηρείσλ ξχζκηζεο ηεο κεηαγξαθήο απνηεινχλ ηε κεζνδνινγία πνιιψλ ζχγρξνλσλ κειεηψλ πνπ ζθνπεχνπλ λα δηεξεπλήζνπλ γνληδηαθά ξπζκηζηηθά δίθηπα πνπ εκπιέθνληαη ζηελ εκβξπνγέλεζε (7-12) Αλαηνκία ηνπ Παγθξέαηνο - Παξαγωγή Ιλζνπιίλεο Σν πάγθξεαο (κε νλνκαζία πνπ πξνέξρεηαη απφ ηηο ιέμεηο «παλ» θαη «θξέαο») απνηειεί δσηηθφ φξγαλν ηνπ πεπηηθνχ ζπζηήκαηνο. ηνλ άλζξσπν, ην πάγθξεαο είλαη έλα φξγαλν κήθνπο εθ. πνπ δπγίδεη πεξίπνπ γξακκάξηα. Μαθξνζθνπηθά δηαθξίλνπκε ηξεηο πεξηνρέο, ηελ θεθαιή, ην θπξίσο ζψκα θαη ηελ νπξά ηνπ παγθξέαηνο (Δηθφλα 1Α). Σν πάγθξεαο ζπγθνηλσλεί κε ην 18

19 δσδεθαδάθηπιν κέζσ ηνπ θχκαηνο ηνπ Vater (Δηθφλα 1Α). ε θπηηαξηθφ επίπεδν, ην φξγαλν απηφ απνηειείηαη απφ ηξία είδε θπηηαξηθψλ πιεζπζκψλ πνπ ζπληζηνχλ ηηο δχν δηαθξηηέο κνίξεο, ηελ ελδνθξηλή θαη ηελ εμσθξηλή, θαη ηνπο πφξνπο ηνπ παγθξέαηνο. Σα θχηηαξα ηεο πξψηεο κνίξαο εθθξίλνπλ νξκφλεο πνπ δηνρεηεχνληαη ζηελ θπθινθνξία ηνπ αίκαηνο, ελψ ηα θχηηαξα ηεο δεχηεξεο κνίξαο εθθξίλνπλ έλδπκα ζηνλ πεπηηθφ ζσιήλα. Ζ εμσθξηλήο κνίξα ηνπ παγθξέαηνο είλαη έλαο ινβηνεηδήο δηαθιαδηζκέλνο αδέλαο. Σα θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο απφ ηελ άιιε πιεπξά, νξγαλψλνληαη ζηα λεζίδηα ηνπ Langerhans, πνπ απνηεινχλ ζπκπαγείο ζθαηξηθνχο ζρεκαηηζκνχο ελζσκαησκέλνπο κέζα ζηνλ εμσθξηλή ηζηφ (13). Τπάξρνπλ πέληε ηχπνη ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ: Σα α-θχηηαξα πνπ εθθξίλνπλ γιπθαγφλε, ηα δ-θχηηαξα πνπ εθθξίλνπλ ζσκαηνζηαηίλε, ηα PP-θχηηαξα πνπ παξάγνπλ ην παγθξεαηηθφ πνιππεπηίδην, ηα ε-θχηηαξα πνπ παξάγνπλ ηε γθξειίλε (ghrelin) (14-16) θαη ηα β-θχηηαξα πνπ εθθξίλνπλ ηλζνπιίλε θαη κηα πξσηεΐλε αληαγσληζηή ηεο ηλζνπιίλεο, ηελ ακπιίλε. Σα ηειεπηαία απνηεινχλ ηελ πιεηνςεθία ησλ θπηηάξσλ ησλ λεζηδίσλ ηνπ παγθξέαηνο. Ζ ηλζνπιίλε είλαη κηα πξσηεΐλε απνηεινχκελε απφ δχν πνιππεπηηδηθέο αιπζίδεο πνπ ζπλδένληαη κε δχν δηζνπιθηδηθνχο δεζκνχο. Αξρηθά ζπληίζεηαη σο πξφδξνκν πεπηίδην θαη αθνχ απνθνπεί ην πεπηίδην ζήκα ηεο (signal peptide) αθνινπζεί πέςε ελφο ελδηακέζνπ πεπηηδίνπ (γ-πεπηίδην) θαη κεηαηξέπεηαη έηζη ζε ελεξγφ κφξην. Σα κφξηα ηεο ψξηκεο, ελεξγνπνηεκέλεο πιένλ, ηλζνπιίλεο απνζεθεχνληαη ζε εθθξηηηθά θπζηίδηα θαη απφ εθεί ε νξκφλε απειεπζεξψλεηαη επηιεθηηθά ζηελ θπθινθνξία ηνπ αίκαηνο αλάινγα κε ηα επίπεδα ηεο γιπθφδεο ζην αίκα (13). Δηθφλα 1: (Α) Αλαηνκία ηνπ παγθξέαηνο ελειίθνπ. (Β) Ο ξαρηαίνο θαη ν θνηιηαθφο ινβφο ηνπ παγθξέαηνο ζε αλζξψπηλν έκβξπν 36 εκεξψλ. (Slack, 1995). 19

20 1.2.2 ύγθξηζε ηωλ Κπηηάξωλ ηνπ Παγθξέαηνο ηωλ Θειαζηηθώλ κε Παξόκνηα Κύηηαξα Άιιωλ Δμειηθηηθά Παιαηόηεξωλ Οξγαληζκώλ Σν πάγθξεαο, φπσο ην πεξηγξάςακε, ππάξρεη ζε ζειαζηηθά, πηελά, εξπεηά θαη ακθίβηα. Οη νξγαληζκνί πνπ αλήθνπλ ζηηο παξαπάλσ θιάζεηο έρνπλ πάγθξεαο κε παξφκνηα αλαηνκία, ηζηνινγία θαη ηξφπν αλάπηπμεο (17). Αληηζέησο, ζε κεξηθά ςάξηα ηα θχηηαξα ησλ λεζηδίσλ ηνπ παγθξέαηνο βξίζθνληαη ζπγθεληξσκέλα ζε άιιεο αλαηνκηθά δηαθξηηέο πεξηνρέο θαη φρη ζην πάγθξεαο. Πην ζπγθεθξηκέλα, ζηνπο νζηετρζχεο αλαγλσξίδεηαη ε εμσθξηλήο κνίξα ηνπ παγθξέαηνο, αιιά ηα θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο βξίζθνληαη ζπγθεληξσκέλα ζε μερσξηζηνχο ζρεκαηηζκνχο πνπ ιέγνληαη ζσκάηηα Brockmann θαη εληνπίδνληαη δίπια ζην κεζεληέξην. ηνπο ρνλδξηρζχεο, απφ ηελ άιιε πιεπξά, ππάξρεη δηαθξηηφ εμσθξηλέο πάγθξεαο πνπ δηαζέηεη φκσο λεζίδηα πνπ παξάγνπλ ηλζνπιίλε (13). ηα θπινγελεηηθά παιαηφηεξα είδε νξγαληζκψλ πνπ αλήθνπλ ζηα άγλαζα ζπνλδπισηά, ππάξρνπλ θχηηαξα πνπ εθθξίλνπλ έλδπκα ζηνλ βιελλνγφλν ηνπ εληέξνπ. Δπηπιένλ, ηα άγλαζα δηαζέηνπλ έλα μερσξηζηφ φξγαλν πνπ εληνπίδεηαη ζην ζεκείν ζχλδεζεο ηνπ εληέξνπ κε ηνλ ρνιεδφρν πφξν. Σν φξγαλν απηφ θέξεη λεζίδηα θαη απνηειείηαη ζρεδφλ απνθιεηζηηθά απφ θχηηαξα πνπ παξάγνπλ ηλζνπιίλε. Με βάζε ηα πξνεγνχκελα ην άγλαζν Lamprey, ν κνλαδηθφο επηδψλ αληηπξφζσπνο ησλ αγλάζσλ κε πξνζδηνξηζκέλν γνληδίσκα, απνηειεί έλα ζαπκάζην πξφηππν ζρεηηθψλ κειεηψλ θαζψο δηαζέηεη θαη πάγθξεαο αιιά θαη θχηηαξα πνπ εθθξίλνπλ ηλζνπιίλε (18, 19). Σα αζπφλδπια, απφ ηελ άιιε πιεπξά, δελ δηαζέηνπλ φξγαλν πνπ λα κνηάδεη κε πάγθξεαο αιιά θέξνπλ θχηηαξα πνπ πεξηέρνπλ φινπο ή θάπνηνπο κφλν απφ ηνπο ηχπνπο ησλ νξκνλψλ ηνπ παγθξέαηνο. πγθεθξηκέλα, ζηα πξσηνζηφκηα αζπφλδπια, φπνπ αλήθεη θαη ην ζχλεζεο δσηθφ πξφηππν Drosoplila melanogaster δελ ππάξρεη δνκή πνπ λα κνηάδεη κε πάγθξεαο, ππάξρνπλ φκσο λεπξνελδoθξηλή θχηηαξα πνπ παξάγνπλ ηηο νξκφλεο πνπ εθθξίλνπλ ηα παγθξεαηηθά θχηηαξα ησλ ζειαζηηθψλ θαη βξίζθνληαη ζηνλ εγθέθαιν (13, 20-24). Όζνλ αθνξά ηα δεπηεξνζηφκηα αζπφλδπια, φπσο ε Ciona intestinalis, πνπ ζπρλά ρξεζηκνπνηείηαη σο πξφηππν ζε λεπξνελδνθξηλείο κειέηεο, αθνχ είλαη ν θπινγελεηηθά ζπγγελέζηεξνο νξγαληζκφο ησλ ζπνλδπισηψλ απφ φια ηα ρνξδσηά (25) δελ ππάξρεη δνκή πνπ λα κνηάδεη κε πάγθξεαο, ππάξρνπλ φκσο ελδνθξηλή θχηηαξα πνπ παξάγνπλ πξσηεΐλεο παξφκνηεο κε ηελ 20

21 ηλζνπιίλε ησλ παγθξεαηηθψλ θχηηαξσλ ησλ ζειαζηηθψλ (26). Σα θχηηαξα απηά εληνπίδνληαη ζην γαζηξεληεξηθφ ζσιήλα ησλ νξγαληζκψλ απηψλ (27) Μνξθνγέλεζε ηνπ Παγθξέαηνο ζην Αλαπηπζζόκελν Έκβξπν ηωλ Θειαζηηθώλ Σν πάγθξεαο θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε πξνθχπηεη απφ ην πξφζζην ηκήκα ηνπ πεπηηθνχ ζσιήλα θαη είλαη φξγαλν ελδνδεξκηθήο πξνέιεπζεο (28). Σα πξψηα κνξθνινγηθά δείγκαηα ζρεκαηηζκνχ ηνπ παγθξέαηνο ζην πξψηκν έκβξπν πξνθχπηνπλ σο πξνεμνρέο ηνπ επηζειίνπ ηνπ πεπηηθνχ ζσιήλα θαηά κήθνο ηνπ ξαρηνθνηιηαθνχ άμνλα ηνπ εκβξχνπ. Πην ζπγθεθξηκέλα, ην πάγθξεαο ζρεκαηίδεηαη απφ ην επηζειηαθφ ελδφδεξκα θαζψο ζπλελψλνληαη νη δχν δηαθξηηνί ινβσηνί ζρεκαηηζκνί, έλαο ζηελ θνηιηαθή θαη έλαο ζηελ ξαρηαία πεξηνρή ηνπ δσδεθαδάθηπινπ (Δηθφλα 1B). Ο θνηιηαθφο ινβφο ζρεκαηίδεη ην νπίζζην κέξνο ηεο θεθαιήο, ελψ ν ξαρηαίνο ην ππφινηπν ηκήκα ηνπ παγθξέαηνο. Ο θνηιηαθφο πφξνο ζπλελψλεηαη κε ην καθξηλφ ηκήκα ηνπ ξαρηαίνπ πφξνπ πξνθεηκέλνπ λα ζρεκαηίζνπλ ηνλ θχξην παγθξεαηηθφ πφξν (πφξν ηνπ Wirsung) θαη ην γεηηνληθφ ηκήκα ηνπ ξαρηαίνπ πφξνπ κεηαηξέπεηαη ζε έλα κηθξφ βνεζεηηθφ πφξν (πφξνο ηνπ Santorini) πνπ παξφια απηά δηαζέηεη απηφλνκν άλνηγκα πξνο ην δσδεθαδάθηπιν (13). Πην αλαιπηηθά, θαζψο ην έκβξπν βξίζθεηαη ζην ζηάδην ησλ ζσκηηψλ ην κεζέγρπκα πηέδεη γχξσ-γχξσ ην ξαρηαίν ηκήκα ηνπ πεπηηθνχ ζσιήλα θαη έηζη αξρίδεη λα ζρεκαηίδεηαη ν ξαρηαίνο παγθξεαηηθφο ινβφο (Δηθφλα 2Γ). Ο θνηιηαθφο ινβφο αξρίδεη λα εκθαλίδεηαη αξγφηεξα, ζην ζηάδην ησλ 30 ζσκηηψλ, κε ηελ ίδηα κνξθνγελεηηθή δηαδηθαζία (29). Καζψο δηακνξθψλνληαη νη δχν ινβνί, γξήγνξα ζρεκαηίδνπλ πνιιέο λέεο δηαθιαδψζεηο πνπ νδεγνχλ ζην ζρεκαηηζκφ κηαο ηδηαίηεξα δηαθιαδηζκέλεο δνκήο (13). Χζηφζν, ηα θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο κπνξνχλ λα αληρλεπζνχλ ζην αλαπηπζζφκελν πάγθξεαο απφ ηα πξψηα θηφιαο ζηάδηα θαζψο αξρίδνπλ λα δηαθνξνπνηνχληαη λσξίηεξα απφ απηά ηεο εμσθξηλνχο κνίξαο (30). Σα ελδνθξηλή θχηηαξα αξρηθά δηαθξίλνληαη σο δηαζθνξπηζκέλα απηφλνκα θχηηαξα, ζπρλά εγθνιπσκέλα ζηνπο πφξνπο. Αξγφηεξα, ηα θχηηαξα απηά ζρεκαηίδνπλ νξαηέο ζπλαζξνίζεηο θπηηάξσλ θαη θαηά ην ηέινο ηεο θπνθνξίαο έρνπλ ζρεκαηηζηεί ηα ηππηθά λεζίδηα. 21

22 Γίλνληαο κεγαιχηεξε έκθαζε ζηνπο κνξηαθνχο ξπζκηζηέο ηεο δηαθνξνπνίεζεο ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο κπνξνχκε λα πνχκε πσο ηα θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο αξρίδνπλ λα δηαθνξνπνηνχληαη απφ πξφδξνκνπο πιεζπζκνχο θπηηάξσλ ηεο εμσθξηλνχο κνίξαο (28) ππφ ηελ θαζνδήγεζε ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ NGN3 (NeuroGeniN3) θαη ISL1 (ISL LIM homeobox 1). Σo κεζέγρπκα ειέγρεη ρξνληθά ηε δηαθνξνπνίεζε πξφδξνκσλ θπηηάξσλ πξνο β-θχηηαξα, δξψληαο πξηλ απφ ηελ έθθξαζε ηεο NGN3 κέζσ δηαθπηηαξηθήο επηθνηλσλίαο θαη θαηφπηλ απηήο κέζσ εθθξηλφκελσλ δηαιπηψλ παξαγφλησλ (31). ηε ζπλέρεηα ηα θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο δηαθνξνπνηνχληαη πξνο ηνπο πιεζπζκνχο ησλ θπηηάξσλ α, β, δ, ε θαη PP, ελψ ζπρλά θαηά ηα πξψηα ζηάδηα ηεο δηαθνξνπνίεζεο παξαηεξείηαη ζπλέθθξαζε δηαθνξεηηθψλ νξκνλψλ απφ ην ίδην θχηηαξν (13). Καηά ηελ εκβξπνγέλεζε ησλ πνληηθψλ ηα πξψηα θχηηαξα πνπ παξάγνπλ ηλζνπιίλε θαη γιπθαγφλε εκθαλίδνληαη 9.5 κέξεο κεηά ηε γνληκνπνίεζε θαη γηα ηηο επφκελεο 2-3 κέξεο ηα θχηηαξα απηά εμαθνινπζνχλ λα εθθξάδνπλ θαη ηηο δχν νξκφλεο (13). Δηθφλα 2: ηάδηα αλάπηπμεο ηνπ ξαρηαίνπ παγθξέαηνο ζε ηξσθηηθά. (Α) ην ζηάδην ησλ 15 ζσκηηψλ ε λσηνρνξδή ηπιίγεη ηνλ λεπξηθφ ζσιήλα θαη ην έληεξν. (Β) ην ζηάδην ησλ 20 ζσκηηψλ ε ξαρηαία ανξηή βξίζθεηαη κεηαμχ ηνπ εληέξνπ θαη ηεο λσηνρνξδήο. (Γ) ην ζηάδην ησλ 28 ζσκηηψλ ην κεζέγρπκα πεξηηπιίγεη νιφθιεξν ην έληεξν θαη έρεη πιένλ ζρεκαηηζηεί ν ξαρηαίνο παγθξεαηηθφο ινβφο. (Slack, 1995). 22

23 1.3 Ρπζκηζηηθά Γίθηπα πνπ Καηεπζχλνπλ ηνλ ρεκαηηζκφ ηνπ Παγθξέαηνο. Ο Ρφινο ηνπ Μεηαγξαθηθνχ Παξάγνληα NGN3 Όπσο πξναλαθέξζεθε, ην πάγθξεαο πξνθχπηεη απφ ην ελδφδεξκα (DE-Definitive Endoderm germ layer) ηνπ εκβξχνπ, πνπ δηακνξθψλεηαη ζην ζηάδην ηεο γαζηξηδίσζεο ζηελ πξσηνγελή γξακκή (32). Σν βιαζηηθφ απηφ δέξκα (DE) αξρηθά απνηειείηαη απφ έλα επίπεδν ζηξψκα θπηηάξσλ πνπ πηπρψλεηαη πξνθεηκέλνπ λα ζρεκαηίζεη ηνλ πεπηηθφ ζσιήλα. Όια ηα θχηηαξα πνπ πξννξίδνληαη λα ζρεκαηίζνπλ ηα φξγαλα ελδνδεξκηθήο πξνέιεπζεο θαζνξίδνληαη θαηά κήθνο ηνπ πεπηηθνχ ζσιήλα αλάινγα κε ηελ αθξηβή ηνπο ζέζε ζηνλ πξνζζηνπίζζην θαη ην ξαρηαηνθνηιηαθφ άμνλα ηνπ εκβξχνπ. Ο ζσζηφο πξνζαλαηνιηζκφο ηνπο ζ απηφ ην ζχζηεκα αμφλσλ είλαη απαξαίηεηνο πξνθεηκέλνπ λα εηζαρζνχλ ζην θαηάιιειν κνλνπάηη δηαθνξνπνίεζεο θαηά ηε δηάξθεηα ηεο εκβξπνγέλεζεο. Πην ζπγθεθξηκέλα, ζήκαηα κνξθνγελεηηθψλ παξαγφλησλ, φπσο είλαη ν απμεηηθφο παξάγνληαο ησλ ηλνβιαζηψλ FGF (Fibroblast Growth Factor) θαη ε πξσηεΐλε BMP (Bone Morphogenetic Protein) πνπ εθπέκπνληαη απφ ην πξφζζην ηκήκα ηνπ πεπηηθνχ ζσιήλα (foregut) πξνεηνηκάδνπλ ην έδαθνο πξνθεηκέλνπ λα δξάζεη ην ξεηηλνïθφ νμχ ζε ζπλδπαζκφ κε ηνλ κεηαγξαθηθφ παξάγνληα HNF1b (Hepatocyte Nuclear Factor 1 beta), ψζηε λα ζρεκαηηζηεί ζσζηά ην πάγθξεαο (33). Σν ξεηηλνïθφ νμχ θαη ε BMP πνπ εθθξίλνληαη απφ ηνπο γεηηνληθνχο ηζηνχο (32, 34) (Δηθφλα 2) ζε ζπλδπαζκφ κε ηελ αλαζηνιή ηνπ κνλνπαηηνχ κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ θαζνδεγεί ε πξσηεΐλε SΖΖ (Sonic HedgeHog) (35), θαζνξίδνπλ ηελ πεξηνρή ησλ αξρέγνλσλ θπηηάξσλ ηνπ εκβξπηθνχ ελδνδέξκαηνο πνπ πξννξίδνληαη λα ζρεκαηίζνπλ ην πάγθξεαο. Δπίζεο, ε αξρηθή ελεξγνπνίεζε ηνπ κνλνπαηηνχ κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ θαζνδεγνχλ νη πξσηεΐλεο κέιε ηεο νηθνγέλεηαο WNT (Wingless oncogene analogs) είλαη ζεκαληηθή γηα ηε δεκηνπξγία ηνπ ελδνδέξκαηνο. ηε ζπλέρεηα ε αλαζηνιή ηνπ WNT θαζνδεγνχκελνπ κνλνπαηηνχ θαζνξίδεη ηελ πεξαηηέξσ δηαθνξνπνίεζε ηνπ ελδνδέξκαηνο θαη ηελ ηζηνεηδηθή έθθξαζε γνληδίσλ, ελψ ε κεηέπεηηα επαλελεξγνπνίεζε ηνπ κνλνπαηηνχ απηνχ εληζρχεη ηε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο απφ ην ελδφδεξκα (36). Σν ξεηηλνïθφ νμχ ζην κεζέγρπκα έρεη επίζεο δεηρζεί φηη επάγεη ην ελδφδεξκα λα δηαθνξνπνηεζεί πξνο θχηηαξα ηθαλά λα παξάγνπλ ηλζνπιίλε (37). ηελ Δηθφλα 3 απνδίδεηαη ζρεκαηηθά ν ζηαδηαθφο θαζνξηζκφο ησλ β-θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο θαηά ηελ 23

24 εκβξπνγέλεζε θαη ππνδειψλεηαη ε δξάζε ησλ αληίζηνηρσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ-θαζνδεγεηψλ. Δηθφλα 3: ηαδηαθή δηαθνξνπνίεζε ησλ β-θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο (Servitja & Ferrer, 2004). ε γεληθέο γξακκέο ε δηαδηθαζία κνξθνγέλεζεο ηνπ παγθξέαηνο (Δηθφλεο 2 & 3) επεξεάδεηαη απφ ηα θχηηαξα ηεο ξαρηαίαο ανξηήο ηνπ εκβξχνπ πνπ ππνβνεζνχλ ηελ έθθξαζε ηνπ παξάγνληα PDX1 (Pancreatic and Duodenal homeobox 1 (38). Όινη νη θπηηαξηθνί πιεζπζκνί πνπ πξφθεηηαη λα ζρεκαηίζνπλ ηηο δηάθνξεο θαηεγνξίεο θπηηάξσλ ηφζν ηεο ελδνθξηλνχο, φζν θαη ηεο εμσθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο πξνέξρνληαη απφ πξφδξνκα πνιπδχλακα θχηηαξα πνπ εθθξάδνπλ απηφλ ηνλ κεηαγξαθηθφ παξάγνληα θαζψο θαη ηνλ PTF1a (Pancreas specific Transcription Factor, 1a) (39, 40). Ο παξάγνληαο PTF1a ζεσξείηαη σο ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο δείθηεο ησλ θπηηάξσλ ηνπ πξφζζηνπ πεπηηθνχ ζσιήλα πνπ πξφθεηηαη λα ζρεκαηίζνπλ ην πάγθξεαο (41). ηε ζπλέρεηα, μεθηλάεη έλα κνλνπάηη δηαθνξνπνίεζεο πνπ θαζνδεγείηαη απφ έλα δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ηνπ PDX1 θαη άιισλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ νη νπνίνη ηειηθά ζπληνλίδνπλ έλα πξφγξακκα γνληδηαθήο ξχζκηζεο (42). Κχξην ξφιν παίδεη ε αιιειεπίδξαζε ηνπ PDX1 κε ηνλ PTF1a πνπ καδί θαη κε άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο ζρεκαηίδνπλ έλα κεηαγξαθηθφ ζχκπινθν, θαζνξηζηηθφ γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ησλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο, πνπ δξα ήδε απφ ην ζηάδην ζρεκαηηζκνχ ησλ παγθξεαηηθψλ ινβψλ (Δηθφλα 3) (43, 44). Αξγφηεξα ζηα 24

25 ψξηκα β-θχηηαξα ε SΖΖ επάγεη ηελ έθθξαζε ηνπ PDX1, ν νπνίνο δηαηεξεί ηνλ θαηλφηππν ησλ β-θπηηάξσλ ελεξγνπνηψληαο γνλίδηα εηδηθά γηα ηα β-θχηηαξα θαη κεηαμχ απηψλ ην γνλίδην πνπ θσδηθνπνηεί ηελ ηλζνπιίλε (45, 46). Δπίζεο, ν παξάγνληαο ISL1 είλαη θαζνξηζηηθφο γηα ηε δηαθνξνπνίεζε ηνπ ξαρηαίνπ παγθξεαηηθνχ επηζειίνπ ζε ελδνθξηλή θχηηαξα θαη ζε κεηέπεηηα ζηάδηα κνξθνγέλεζεο ηνπ παγθξέαηνο γηα ην ζρεκαηηζκφ ηνπ ξαρηαίνπ ινβνχ ηνπ νξγάλνπ (30, 47). Μεηαμχ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ θαζνξίδνπλ ην ζρεκαηηζκφ ηνπ παγθξέαηνο, πξσηεχνληα ξφιν παίδεη ν παξάγνληαο NGN3. Ο NGN3 εθθξάδεηαη ζε κηα νκάδα πξφδξνκσλ θπηηάξσλ πνπ εκθαλίδνληαη ρξνληθά πεξίπνπ ζην ζηάδην ζρεκαηηζκνχ ησλ πφξσλ ηνπ παγθξέαηνο θαη δίλεη ην ελαξθηήξην ιάθηηζκα γηα ην πξφγξακκα δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ ησλ λεζηδίσλ (39, 42, 48-50). O παξάγνληαο NGN3 θαζνξίδεη ηα πξφδξνκα ελδνθξηλή παγθξεαηηθά θχηηαξα πξνθεηκέλνπ λα ζρεκαηηζηνχλ νη δηάθνξνη ηχπνη θπηηάξσλ ησλ λεζηδίσλ (39, 42, 49, 51). ηε ζπλέρεηα θαη ζπγθεθξηκέλα ζηα β-θχηηαξα ν NGN3 ελεξγνπνηεί ηελ έθθξαζε άιισλ παξαγφλησλ φπσο πρ. ηνπ NEUROD1 (NEUROgenic Differentiation 1), πνπ κε ηε ζεηξά ηνπ ξπζκίδεη ηε κεηαγξαθή ηνπ γνληδίνπ ηεο ηλζνπιίλεο θαη άιισλ γνληδίσλ εηδηθψλ γηα ηα β-θχηηαξα (52). ηελ Δηθφλα 4 ππνδεηθλχεηαη έλα πηζαλφ κνλνπάηη δηαθνξνπνίεζεο ησλ πξφδξνκσλ ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ πξνο ηνπο δηάθνξνπο θπηηαξηθνχο ηχπνπο ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο. Σα θχηηαξα πνπ εθθξάδνπλ ΝGN3 ππφ ηελ επίδξαζε ησλ παξαγφλησλ ARX (Aristaless Related homeobox) θαη PAX4 (PAired box gene 4) θαη ίζσο θαη άιισλ αγλψζησλ, επί ηνπ παξφληνο, κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ δεζκεχνληαη λα αθνινπζήζνπλ ηελ β/δ ή ηελ α/pp θπηηαξηθή ζεηξά. Σα β/δ θχηηαξα αξρηθά εθθξάδνπλ θαη ηλζνπιίλε θαη γιπθαγφλε θαη ζηε ζπλέρεηα δηαθνξνπνηνχληαη ζε δηαθξηηνχο πιεζπζκνχο β θαη δ θπηηάξσλ. Όπσο θαίλεηαη θαη ζηελ Δηθφλα 4 ν PAX4 επλνεί ηε δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ πξνο ηε β/δ ζεηξά θαη απφ απηήλ ηε ζεηξά, ηα θχηηαξα πνπ ζπλερίδνπλ λα εθθξάδνπλ ηνλ PAX4 κεηαηξέπνληαη ζε β θχηηαξα, ελψ απηά πνπ παχνπλ λα ηνλ εθθξάδνπλ δηαθνξνπνηνχληαη πξνο δ θχηηαξα. Καζψο ηα ελδνθξηλή θχηηαξα δηαθνξνπνηνχληαη πξνο ηε ζεηξά ησλ β-θπηηάξσλ, ν παξάγνληαο PDX1 εθθξάδεηαη πάιη θαη θαζνδεγεί ηε δηαθνξνπνίεζε, φπσο θαίλεηαη θαη ζηελ Δηθφλα 3 (53, 54). 25

26 ηελ Δηθφλα 3, θαίλεηαη φηη πξνθεηκέλνπ ηα θχηηαξα λα δηαθνξνπνηεζνχλ πξνο θχηηαξα πνπ εθθξάδνπλ ηλζνπιίλε ρξεηάδνληαη θαη νη παξάγνληεο HNF1 (Hepatic Nuclear Factor 1) θαη HNF6 (Hepatic Nuclear Factor 6). O HNF6 εθθξάδεηαη θαηά ηα πξψηα ζηάδηα ηεο αλάπηπμεο ηνπ παγθξεαηηθνχ επηζειίνπ θαη ελεξγνπνηεί ηνλ HNF1, έηζη ψζηε λα μεθηλήζεη ν ζρεκαηηζκφο ησλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο ζην επηζήιην ηνπ νξγάλνπ (55). Δπίζεο θαζνξηζηηθή είλαη θαη ε ζπκβνιή ηνπ παξάγνληα ΒRN4 (BRaiN-specific homeobox/pou domain protein 4), ν νπνίνο πξνζδέλεηαη θαη ελεξγνπνηεί ην γνλίδην ηεο γιπθαγφλεο (56). Ζ έθθξαζε ηνπ παξάγνληα απηνχ πεξηνξίδεηαη ζηα πξφδξνκα θχηηαξα ηεο α ζεηξάο (57, 58) θαη ζπλερίδεη λα εθθξάδεηαη ζηα ψξηκα α-θχηηαξα θαη ζε ιίγα PPθχηηαξα. Χζηφζν, δε ζεσξείηαη απαξαίηεηνο γηα ηνλ ζρεκαηηζκφ ησλ α-θπηηάξσλ (58), ελψ κπνξεί λα πξνθαιέζεη ηελ έθθξαζε γιπθαγφλεο ζε θχηηαξα ηεο β-ζεηξάο (42). Ζ γιπθαγφλε κε ηε ζεηξά ηεο ζεκαηνδνηεί ηελ έλαξμε ηεο δηαθνξνπνίεζεο θπηηάξσλ πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα (59). Δηθφλα 4: ηαδηαθή δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηαξηθψλ ηχπσλ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο απφ NGN3+ θχηηαξα (Gittes, 2009). 26

27 1.4 Δκβξπïθά Βιαζηνθχηηαξα θαη Παξαγσγή Ηλζνπιίλεο κε Δπαγσγή ηνπ Παξάγνληα NGN3 Όπσο πξναλαθέξζεθε, ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο NGN3 είλαη ν θχξηνο θαζνξηζηήο πνπ απαηηείηαη γηα ηελ αλάπηπμε φισλ ησλ ηχπσλ ησλ ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο (49, 51). πγθεθξηκέλα, ε ηζηνεηδηθή έθθξαζε ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα NGN3 θαζνξίδεη κηα νκάδα πξφδξνκσλ θπηηάξσλ ηνπ εκβξχνπ πξνο ελδνθξηλή θχηηαξα ηνπ παγθξέαηνο κε έλαλ ηξφπν πνπ είλαη απηφλνκνο γηα θάζε θχηηαξν (39, 49). Υαξαθηεξηζηηθφ είλαη ην γεγνλφο φηη ζε in vivo πεηξάκαηα φπνπ ζπλέβεη έθηνπε έθθξαζε ηνπ παξάγνληα NGN3 θαηά ηε δηάξθεηα αλάπηπμεο ηνπ πεπηηθνχ ζσιήλα ζπλέβεη αληίζηνηρε επέθηαζε ηνπ πιεζπζκνχ ησλ θπηηάξσλ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο (50, 60). Δπηπιένλ, ππάξρνπλ πεηξακαηηθέο ελδείμεηο φηη ελψ ζε λεζίδηα πνπ αλαιχζεθαλ απφ παγθεαηνκέο ηα επίπεδα έθθξαζεο ηνπ ΝGN3 είλαη πςειά, δελ ζπκβαίλεη κεηάθξαζε ηνπ mrna ζε πξσηεΐλε ιφγσ κεηα-κεηαγξαθηθήο θαηαζηνιήο απφ micro RNAs (61). Οη κειέηεο απηέο ππνδεηθλχνπλ ην δπλακηθφ πνπ δηαζέηεη ν παξάγνληαο NGN3 λα θηλεηνπνηεί θαη λα θαηεπζχλεη γνληδηαθά ξπζκηζηηθά δίθηπα πνπ ζρεηίδνληαη κε ηνλ θαζνξηζκφ ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο. Παξφια απηά κέρξη ζήκεξα ηα γνλίδηα-άκεζνη ζηφρνη ηνπ NGN3 θαζψο θαη ηα επξχηεξα γνληδηαθά ξπζκηζηηθά δίθηπα πνπ θαηεπζχλεη απηφο ν παξάγνληαο παξακέλνπλ ζε κεγάιν βαζκφ άγλσζηα θαη αδηεξεχλεηα. Πξνθεηκέλνπ λα δηεξεπλεζνχλ πεξαηηέξσ απηά ηα δίθηπα έρνπλ ζρεδηαζηεί πεηξάκαηα θαηεπζπλφκελεο δηαθνξνπνίεζεο εκβξπηθψλ βιαζηνθπηηάξσλ κέζσ επηιεθηηθήο επαγσγήο ηνπ παξάγνληα NGN3 (62). Σα εκβξπηθά βιαζηνθχηηαξα (ΔΒΚ-Δκβξπηθά ΒιαζηνΚχηηαξα) είλαη θχηηαξα πνπ πξνέξρνληαη απφ ηελ εζσηεξηθή θπηηαξηθή κάδα ησλ βιαζηνθχζηεσλ ησλ εκβξχσλ ησλ ζπνλδπισηψλ. Δίλαη ηθαλά λα δηαθνξνπνηεζνχλ ζε φινπο ηνπο ηζηνχο ηνπ εκβξχνπ θαη δηαηεξνχλ απηή ηελ ηδηφηεηα καθξνρξφληα αθφκε θαη ζε θαιιηέξγεηεο. Δπηπιένλ, έρνπλ ηελ ηθαλφηεηα λα αληαπνθξίλνληαη θαηάιιεια ζε ζήκαηα φπσο απηά πνπ κεηαδίδνληαη θαηά ηε δηάξθεηα ηεο εκβξπηθήο αλάπηπμεο, ψζηε λα δηαθνξνπνηεζνχλ ζε έλα εχξνο εμεηδηθεπκέλσλ θπηηάξσλ, ζπκπεξηιακβαλνκέλσλ θαη ησλ θπηηάξσλ ησλ παγθξεαηηθψλ λεζηδίσλ (63). ηελ Δηθφλα 5 παξνπζηάδνληαη αλαιπηηθά ηα ζηάδηα πνπ κεζνιάβεζαλ πξνθεηκέλνπ 27

28 ΔΒΚ πνληηθνχ λα δηαθνξνπνηεζνχλ πξνο ζσκαηίδηα κε ραξαθηήξα ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο (62). Δηθφλα 5: Πξσηφθνιιν δηαθνξνπνίεζεο εκβξπηθψλ βιαζηνθπηηάξσλ πνληηθνχ πξνο ζσκαηίδηα κε ραξαθηήξα ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο (Serafimidis et al., 2008). Σν πξσηφθνιιν πνπ αθνινπζήζεθε πξνζνκνηάδεη κε ηε ζηαδηαθή δηαθνξνπνίεζε βιαζηνθπηηάξσλ ζε παγθξεαηηθά λεζίδηα θαηά ηελ εκβξπηθή αλάπηπμε (62). χκθσλα κε απηφ, ηα θχηηαξα δηαθνξνπνηήζεθαλ αξρηθά πξνο θχηηαξα ηνπ ελδνδέξκαηνο ρξεζηκνπνηψληαο πςειή ζπγθέληξσζε Αθηηβίλεο Α. Ζ νπζία απηή επάγεη ην ζρεκαηηζκφ ελδνδέξκαηνο ζην πξψηκν έκβξπν (64). Δπίζεο ρξεζηκνπνηήζεθε ΤΟ (Τπνθαηάζηαην Οξνχ) φπνπ, εθηφο απφ ηνπο απαηηνχκελνπο απμεηηθνχο παξάγνληεο πεξηέρνληαλ θαη ν παξάγνληαο FGF4 (Fibroblast Growth Factor 4), ν νπνίνο νδεγεί πεξαηηέξσ ηα θχηηαξα πξνο ηελ θαηεχζπλζε ηνπ ελδνδέξκαηνο θαη πην ζπγθεθξηκέλα πξνο ζρεκαηηζκφ παγθξέαηνο (65). ε απηφ ην ζηάδην έγηλε επαγσγή ηνπ ραξαθηήξα ησλ πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ ρξεζηκνπνηψληαο ξεηηλντθφ νμχ πνπ, φπσο πξναλαθέξζεθε, είλαη αλαγθαίν γηα ηε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο (66, 67). Δπίζεο, ζην ζηάδην απηφ ρξεζηκνπνηήζεθε θαη θπθινπακίλε πξνθεηκέλνπ λα θαηαζηαιεί ε ζεκαηνδφηεζε απφ ηελ SHH (68), θαζψο θαη απφ ηνλ παξάγνληα FGF10 (Fibroblast Growth Factor 10) θαη ηελ πξσηεΐλε BMP4, ψζηε λα επλνεζεί ν πνιιαπιαζηαζκφο ησλ πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ (69, 70). απηφ ην ζηάδην, πιένλ, έγηλε ε επαγσγή ηεο έθθξαζεο ησλ παξαγφλησλ PDX1 θαη PTF1a ησλ νπνίσλ ε ζπλέθθξαζε νξίδεη ηελ πεξηνρή ηνπ κειινληηθνχ παγθξέαηνο (71). ηε ζπλέρεηα, ζ απηά ηα θχηηαξα έγηλε έθθξαζε ηνπ NGN3 κε ηελ βνήζεηα θαηάιιεινπ θνξέα θαη έπεηηα απφ θαηάιιειε ηξνπνπνίεζε, ψζηε λα επηηξέπεηαη ε επηιεθηηθή επαγσγή ηνπ NGN3. Ζ επαγσγή έθθξαζεο ηνπ NGN3 ζην ζπγθεθξηκέλν ζηάδην δηαθνξνπνίεζεο, ελίζρπζε ηε κεηαηξνπή ησλ ΔΒΚ ζε ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα κε ηθαλφηεηα απφθξηζεο ζηε γιπθφδε. Αληίζεηα, ζε θχηηαξα πνπ δελ είραλ εθηεζεί ζηα 28

29 κνξθνγελεηηθά ζήκαηα ησλ πξνεγνχκελσλ ζηαδίσλ, ε επαγσγή ηνπ NGN3 δελ ελεξγνπνίεζε ηα γνλίδηα-ζηφρνπο. ηε ζπλέρεηα, κε κηθξνζπζηνηρίεο DNA εμεηάζηεθε ην κεηαγξαθηθφ πξνθίι ησλ θπηηάξσλ φπνπ επάρζεθε ε έθθξαζε ηνπ NGN3 ηα νπνία δηαθνξνπνηήζεθαλ πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα κε απφθξηζε ζηε γιπθφδε. Σα θχηηαξα απηά πξνζνκνηάδνπλ κε απηά πνπ βξίζθνληαη ζηα λεζίδηα ηνπ παγθξέαηνο θαη πνπ ζην θπζηνινγηθά αλαπηπζζφκελν έκβξπν ζα πξννξίδνληαλ κε πεξαηηέξσ δηαθνξνπνίεζε λα δψζνπλ ηα β-θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ νξγάλνπ. Μέζα απφ απηήλ ηελ πξνζέγγηζε αλαδεηήζεθαλ πηζαλά γνλίδηα-ζηφρνη ηνπ NGN3 κε βάζε ηελ επαγσγή ή ηελ θαηαζηνιή ηνπο κεηά απφ ηελ έθθξαζε ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ παξάγνληα. Σα γνλίδηα απηά αλαιχζεθαλ βηνυπνινγηζηηθά πξνθεηκέλνπ λα ραξηνγξαθεζνχλ νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ηνπο θαη λα δηαιεπθαλζνχλ ηα ζχλζεηα ξπζκηζηηθά δίθηπα πνπ πηζαλφλ ειέγρεη ν NGN Γνλίδηα Γλσζηνί - ηφρνη ηνπ NGN3 Ζ αλάιπζε ησλ δεδνκέλσλ ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ ππέδεημε έλα ζχλνιν γνληδίσλ ησλ νπνίσλ ηα επίπεδα έθθξαζεο άιιαμαλ ζεκαληηθά κεηά απφ επαγσγή ηνπ παξάγνληα NGN3. Μεηαμχ απηψλ μερψξηζαλ ηα γνλίδηα IA1 (Insulinoma Associated 1), PAX4 (Paired box gene 4), NEUROD1 (NEUROgenic Differentiation 1) θαη NKX2.2 (ΝΚ2 family of homeoproteins), γηα ηα νπνία πξνεγνχκελεο εξγαζίεο ππνδείθλπαλ ηελ πξφζδεζε ηνπ NGN3 ζηηο αιιεινπρίεο ηνπο θαη ηελ επαθφινπζε επαγσγή ηεο κεηαγξαθήο ηνπο. Δπίζεο έρεη πεξηγξαθεί ν ξφινο πνπ δηαδξακαηίδνπλ ηα γνλίδηα IA1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2 ζηε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο. Κξίλεηαη επνκέλσο, ζθφπηκν λα παξαηεζνχλ νξηζκέλα ζηνηρεία απφ ηελ βηβιηνγξαθία γηα ηα παξαπάλσ γνλίδηα. ΙΑ1 Ζ έθθξαζή ηνπ ΙΑ1 θξίλεηαη απαξαίηεηε γηα ηε δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο θαη ειέγρεηαη απφ ηελ πξφζδεζε ηνπ NGN3 ζηνλ ππνθηλεηή ηνπ γνληδίνπ (72). Δπηπξνζζέησο ν NGN3 καδί κε ηνλ ΗΑ1 ζε ελήιηθα παγθξεαηηθά θχηηαξα πξνθαινχλ ηελ έθθξαζε ησλ PAX4 θαη NKX2.2 κε ηειηθή θαηάιεμε ηνλ ζρεκαηηζκφ ησλ β-θπηηάξσλ (73). ηελ ζέζε bp (base pairsδεχγε βάζεσλ) αλνδηθά ηνπ ζεκείνπ έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο-tss (Transcription Start Site) ηνπ αλζξψπηλνπ ΙΑ1 πξνζδέλνληαη νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο 29

30 NEUROD1 θαη E47 σο ζχκπινθν. Γεληθά ε πξφζδεζε ησλ παξαγφλησλ NEUROD1 θαη NGN3 γίλεηαη ζε ζπγθεθξηκέλεο αιιεινπρίεο πνπ είλαη γλσζηέο σο «E-boxes» (74). PAX4 Ο παξάγνληαο PAX4 δξα ζηα πξψηκα ζηάδηα ηεο αλάπηπμεο ησλ θπηηάξσλ ησλ λεζηδίσλ πξνσζψληαο ηελ πεξαηηέξσ δηαθνξνπνίεζή ηνπο πξνο β θαη δ θχηηαξα (75). Ζ έθθξαζε ηνπ PAX4 παίξλεη ηηο κεγαιχηεξεο ηηκέο ηεο θαηά ην απνθνξχθσκα ηνπ ζρεκαηηζκνχ ησλ β-θπηηάξσλ, ελψ αξρίδεη λα θζίλεη κφιηο ηα ηειεπηαία έρνπλ πηα ζρεκαηηζηεί θαη σξηκάζεη. Διέγρεηαη δε απφ κηα ξπζκηζηηθή πεξηνρή πνπ πεξηιακβάλεη ζέζεηο πξφζδεζεο γηα ηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο PDX1, HNF1 & NGN3, νη νπνίνη δξνπλ ζπλεξγηθά κε άιινπο παξάγνληεο (76). ΝΚΧ2.2 Ο παξάγνληαο ΝΚΥ2.2 απαηηείηαη γηα ηελ ηειηθή δηαθνξνπνίεζε ησλ β-θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο θαη γηα ηελ παξαγσγή ηλζνπιίλεο απφ απηά. Ζ πξφζδεζε ηνπ NGN3 ή θαη ηνπ NEUROD1 καδί κε άιινπο παξάγνληεο, πνπ δελ είλαη αθφκε γλσζηoί, ξπζκίδνπλ ηελ έθθξαζε ηνπ ΝΚΧ2.2 ζηνπο πιεζπζκνχο ησλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ ηεο ελδνθξηλνχο ζεηξάο, ελψ ζην ψξηκν πιένλ πάγθξεαο ν ΝΚΥ2.2 εθθξάδεηαη κφλν ζηα β, δ, θαη ΡΡ θχηηαξα κε ηε βνήζεηα κηαο άιιεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο, φπνπ πξνζδέλνληαη άιινη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο (77). NEUROD1 O NEUROD1 παίδεη ξφιν ζηελ επηβίσζε ησλ δηαθνξνπνηεκέλσλ ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ θαη ζην ζσζηφ ζρεκαηηζκφ ησλ λεζηδίσλ ηνπ παγθξέαηνο, ελψ ελεξγνπνηεί θαη ηελ παξαγσγή ηλζνπιίλεο ζηα β-θχηηαξα (75, 78). ε κηα ξπζκηζηηθή πεξηνρή ηνπ γνληδίνπ NEUROD1 ηνπ πνληηθνχ, κεηαμχ 231bp θαη 1000bp αλνδηθά ηνπ TSS, πξνζδέλεηαη ν παξάγνληαο NGN3 καδί κε ηνλ Δ47 θαη καδί κε άιινπο, άγλσζηνπο πξνο ην παξφλ, παξάγνληεο ειέγρνπλ ηελ ηζηνεηδηθή ελεξγνπνίεζε ηνπ γνληδίνπ ζηα πξνγνληθά θχηηαξα ηνπ παγθξέαηνο θαη δηαηεξνχλ ηελ έθθξαζή ηνπ ζηα δηαθνξνπνηεκέλα ελδνθξηλή θχηηαξα (52). 30

31 1.6 Ζ Ρχζκηζε ηεο Μεηαγξαθήο ζηνπο Δπθαξπσηηθνχο Οξγαληζκνχο Απφ ηα παξαπάλσ είλαη θαλεξφ πσο ε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο αιιά θαη φισλ ησλ ππνινίπσλ νξγάλσλ ζην πξψηκν έκβξπν είλαη απνηέιεζκα κηαο αθνινπζίαο πιήξσο ελνξρεζηξσκέλσλ δηαδηθαζηψλ. Οη δηαδηθαζίεο απηέο θαηεπζχλνληαη απφ γνλίδηα πνπ εθθξάδνληαη κφλν ζε ζπγθεθξηκέλεο θαηεγνξίεο θπηηάξσλ, ζε νξηζκέλα ζηάδηα αλάπηπμεο ηνπ νξγαληζκνχ ή θάησ απφ εηδηθέο ζπλζήθεο. Σν βαζηθφηεξν επίπεδν ξχζκηζεο ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο είλαη ην κεηαγξαθηθφ (79) θαη θπξίσο ην ζηάδην έλαξμεο ηεο δηαδηθαζίαο ηεο κεηαγξαθήο (79). ηνπο επθαξπσηηθνχο νξγαληζκνχο, ε κεηαγξαθή θάζε γνληδίνπ ειέγρεηαη μερσξηζηά απφ ηελ αιιειεπίδξαζε εηδηθψλ πξσηετλψλ-κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, πνπ αλαθέξνληαη ζπλήζσο σο trans ξπζκηζηηθά ζηνηρεία, κε ξπζκηζηηθέο αιιεινπρίεο DNA πνπ ζπλήζσο αλαθέξνληαη σο cis ξπζκηζηηθά ζηνηρεία. Οη ξπζκηζηηθέο απηέο αιιεινπρίεο DNA θαηαηάζζνληαη ζε δχν θαηεγνξίεο, ηνπο ππνθηλεηέο θαη ηνπο εληζρπηέο θαη απνηεινχληαη απφ κηθξέο λνπθιενηηδηθέο αιιεινπρίεο ζηηο νπνίεο πξνζδέλνληαη γεληθνί θαη εηδηθνί κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο. Ζ πξφζδεζε ησλ εηδηθψλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ θξίλεηαη αλαγθαία γηα ηελ έλαξμε ηεο κεηαγξαθήο ησλ ηζηνεηδηθά εθθξαδφκελσλ γνληδίσλ (79). Ζ ζέζε ησλ ππνθηλεηψλ ζε ζρέζε κε ην TSS ζπλήζσο δε μεπεξλά ηελ απφζηαζε ησλ 1000bp απφ απηφ θαη κπνξεί λα είλαη είηε πξνο ην 5 άθξν ηνπ, είηε πξνο ην 3 άθξν, είηε θαη θαζνδηθά ηνπ ζεκείνπ απηνχ κέζα ζηελ κεηαγξαθφκελε αθνινπζία, αθφκε θαη κέζα ζε εζψληα (79). Απφ ηελ άιιε πιεπξά νη ξπζκηζηηθέο αθνινπζίεο πνπ αλαθέξνληαη σο εληζρπηέο ειέγρνπλ ηελ έληαζε θαη ην ξπζκφ ηεο κεηαγξαθήο θαη βξίζθνληαη ζε πνηθίιεο απνζηάζεηο ζε ζρέζε κε ην TSS, νη νπνίεο κπνξεί λα θπκαίλνληαη απφ κεξηθέο εθαηνληάδεο έσο κεξηθέο ρηιηάδεο βάζεηο λνπθιενηηδίσλ. Δπηπιένλ, ν έιεγρνο πνπ αζθνχλ ζηε κεηαγξαθή νη εληζρπηέο δελ εμαξηάηαη απφ ηνλ πξνζαλαηνιηζκφ ηεο αιιεινπρίαο ηνπο (79), θάηη πνπ ζπάληα παξαηεξείηαη γηα ηνπο ππνθηλεηέο ησλ γνληδίσλ (79). Οη αιιεινπρίεο ησλ εληζρπηψλ, ζε ζχγθξηζε κε απηέο ησλ ππνθηλεηψλ, δελ είλαη ηφζν θαιά ζπληεξεκέλεο φζνλ αθνξά ηελ αθνινπζία ησλ λνπθιενηηδίσλ θαη ηε ζρεηηθή ζέζε απηψλ σο πξνο ην TSS, ελψ είλαη δπλαηφλ λα βξεζνχλ αθνινπζίεο εληζρπηψλ θαη θαζνδηθά ηνπ ζεκείνπ TSS. Δθηφο φκσο απφ ηηο παξαπάλσ δηαθνξέο, ππάξρνπλ κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πνπ πξνζδέλνληαη 31

32 ζε αιιεινπρίεο πνπ ππάξρνπλ απφ θνηλνχ ηφζν ζε ππνθηλεηέο, φζν θαη ζε εληζρπηέο. Γεληθά ινηπφλ δελ είλαη πάληνηε εχθνιε ε δηάθξηζε ησλ ξπζκηζηηθψλ αθνινπζηψλ ζε ππνθηλεηέο θαη εληζρπηέο. Αμίδεη επίζεο λα ζεκεησζεί πσο ππάξρνπλ θαη πεξηπηψζεηο φπνπ νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πξψηα αιιειεπηδξνχλ κεηαμχ ηνπο ή κε ηελ RNA πνιπκεξάζε θαη θαηφπηλ πξνζδέλνληαη ζηηο αιιεινπρίεο ηνπ DNA. ηελ Δηθφλα 6 δίδεηαη ζρεκαηηθά ε ζρεηηθή ζέζε θαη νη αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ πην ραξαθηεξηζηηθψλ ζηνηρείσλ ξχζκηζεο ηεο κεηαγξαθήο ελφο επθαξπσηηθνχ γνληδίνπ. ηελ εηθφλα απηή θαίλεηαη πσο ζηα επθαξπσηηθά θχηηαξα νη RNA πνιπκεξάζεο δελ πξνζδέλνληαη ζηελ πεξηνρή ηνπ ππνθηλεηή ησλ γνληδίσλ αλ δελ κεζνιαβήζνπλ νη γεληθνί παξάγνληεο κεηαγξαθήο, ψζηε λα ζρεκαηηζηεί ην ιεγφκελν ζχκπινθν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο. Δηθφλα 6: Υαξαθηεξηζηηθά ζηνηρεία ξχζκηζεο ηεο κεηαγξαθήο ελφο επθαξπσηηθνχ γνληδίνπ (Κνζζίδα, 2008). ηηο πεξηνρέο ησλ εληζρπηψλ πξνζδέλνληαη επίζεο κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο θαη κε ηελ πξφζδεζή ηνπο ιεηηνπξγνχλ είηε εληζρχνληαο ην ξπζκφ ηεο κεηαγξαθήο, νπφηε θαη νλνκάδνληαη ελεξγνπνηεηέο, είηε θαηαζηέιινληαο ηε κεηαγξαθή νπφηε νλνκάδνληαη απνζησπεηέο. Απηφ επηηπγράλεηαη κε ην λα δηεπθνιχλνπλ ηε ζπρλφηεηα πξφζδεζεο ηνπ ζπκπιφθνπ έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο ζηνλ ππνθηλεηή ή λα παξεκπνδίδνπλ ηελ πξφζδεζε απηή αληίζηνηρα. Αμίδεη λα αλαθεξζεί θαη ε πεξίπησζε ησλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ πνπ ραξαθηεξίδνληαη σο κνλσηέο ησλ νπνίσλ ν ξφινο είλαη λα παξεκπνδίδνπλ ηελ έλαξμε ηεο κεηαγξαθήο ελφο γνληδίνπ απφ ππνθηλεηέο γεηηνληθψλ γνληδίσλ (79). εκαληηθφ ξφιν δηαδξακαηίδνπλ θαη νη ιεγφκελνη ζπλελεξγνπνηεηέο, νη νπνίνη αιιειεπηδξψληαο κε άιια trans ξπζκηζηηθά ζηνηρεία, θέξλνπλ ζε εγγχηεξε ζέζε δηάθνξνπο ελεξγνπνηεηέο δηεπθνιχλνληαο 32

33 έηζη ηελ αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ηνπο (79). Όπσο θαη νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο έηζη θαη νη ελεξγνπνηεηέο δηαθξίλνληαη ζε γεληθνχο (79), πνπ εληζρχνπλ ηελ κεηαγξαθή ησλ ζπλερψο κεηαγξαθφκελσλ γνληδίσλ (housekeeping genes) θαη ζε εηδηθνχο, πνπ βξίζθνληαη κφλν θάησ απφ ζπγθεθξηκέλεο ρσξηθέο, ρξνληθέο θαη ηζηνεηδηθέο ζπλζήθεο θαη πξνσζνχλ ηε κεηαγξαθή γνληδίσλ εηδηθά ζε απηέο ηηο ζπλζήθεο. ηελ Δηθφλα 7 παξνπζηάδεηαη ζρεκαηηθά ε ζέζε θαη ν ηξφπνο ιεηηνπξγίαο ηνπ ππνθηλεηή θαη ηνπ εληζρπηή ελφο γνληδίνπ κέζσ αιιειεπηδξάζεσλ κε κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο, ελεξγνπνηεηέο, ζπλελεξγνπνηεηέο θαη θαηαζηνιείο. Δηθφλα 7: Θέζε θαη ηξφπνο δξάζεο ππνθηλεηή, εληζρπηή, κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, ελεξγνπνηεηψλ, ζπλεξγνπνηεηψλ θαη θαηαζηνιέσλ (Κνζζίδα, 2008). 1.7 Ζ Πεξηεθηηθφηεηα ζε GC Ννπθιενηίδηα ζε ρέζε κε ηε Λεηηνπξγηθφηεηα ησλ Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ Ζ ξχζκηζε ηεο κεηαγξαθήο ησλ γνληδίσλ ειέγρεηαη φκσο θαη απφ άιινπο παξάγνληεο, φπσο είλαη ηα επίπεδα κεζπιίσζεο ηνπ DNA. πγθεθξηκέλα ζηα ζειαζηηθά νη γνληδηαθέο πεξηνρέο πνπ παξνπζηάδνπλ εληνλφηεξε κεζπιίσζε έρνπλ ζπλδπαζηεί κε κε κεηαγξαθφκελεο κνλάδεο. Γηα ην ιφγν απηφ εληνπίδνληαη ζπρλφηεξα ζην 5 άθξν ηεο αιιεινπρίαο ησλ εθθξαδφκελσλ γνληδίσλ νη ιεγφκελεο λεζίδεο CpG. Πξφθεηηαη γηα πεξηνρέο bp φπνπ ην δηλνπθιενηίδην CpG εκθαλίδεηαη ζπρλά αιιά δελ είλαη κεζπιησκέλν (79). Ζ παξνπζία ηνπο ζην 5 άθξν ηεο αιιεινπρίαο ησλ γνληδίσλ ρξεζηκνπνηείηαη θαη γηα ηελ πξφβιεςε ησλ ππνθηλεηψλ ζε ζπνλδπισηνχο νξγαληζκνχο (79). Δπίζεο έρεη βξεζεί φηη κε κεζπιησκέλεο ξπζκηζηηθέο αιιεινπρίεο ιεηηνπξγνχλ σο κνλσηέο παξεκπνδίδνληαο ηελ δξάζε ησλ εληζρπηψλ κε απνηέιεζκα ηελ θαηαζηνιή ηεο κεηαγξαθήο ησλ 33

34 γνληδίσλ (80). Δπνκέλσο ε κεζπιίσζε ησλ αιιεινπρηψλ απηψλ ειέγρεη ηελ έθθξαζε ησλ γνληδίσλ. 1.8 Μέζνδνη Πξφβιεςεο Ρπζκηζηηθψλ ηνηρείσλ Ζ αλαδήηεζε πεξηνρψλ κε ξπζκηζηηθφ ξφιν ζηα γνληδηψκαηα ησλ νξγαληζκψλ κε ηε βνήζεηα ηεο βηνπιεξνθνξηθήο βξίζθεηαη ζην επίθεληξν πνιιψλ εξεπλεηηθψλ πξνζεγγίζεσλ. Καηά ηα ηειεπηαία ρξφληα νη δηάθνξεο κεζνδνινγίεο πνπ έρνπλ αλαπηπρζεί γηα ηνλ ζθνπφ απηφ έρνπλ επηθεληξσζεί πεξηζζφηεξν ζηελ ηαπηνπνίεζε ησλ ππνθηλεηψλ. Κάπνηεο απφ ηηο κεζφδνπο κπνξνχλ λα αλαγλσξίδνπλ ζπληεξεκέλα πξφηππα λνπθιενηηδίσλ ζηνπο ππνθηλεηέο, π.ρ. ηα ιεγφκελα θνπηηά ΣΑΣΑ θαη CAAT, ρξεζηκνπνηψληαο ηερλνινγίεο αλαγλψξηζεο πξνηχπσλ, φπσο λεπξσληθά δίθηπα θαη γελεηηθνχο αιγνξίζκνπο (81) θαζψο θαη κε ρξήζε κεηξψσλ δχγηζεο ζέζεο (PWM-Position Weight Matrices) (82). Κάπνηεο άιιεο κεζνδνινγίεο βαζίδνληαη ζηελ θαηεγνξηνπνίεζε ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ ζε ππνθηλεηέο θαη κε κε βάζε ηηο δηαθνξέο ηνπο σο πξνο ην λνπθιενηηδηθφ πεξηερφκελν (79). Πην πξφζθαηα ε παξνπζία ησλ λεζίδσλ CpG, απνηέιεζε ηζρπξφ εξγαιείν γηα ηνλ εληνπηζκφ πεξηνρψλ πνπ κπνξεί λα πεξηέρνπλ ππνθηλεηέο (79). Χζηφζν, πνιινί ππνθηλεηέο δελ έρνπλ λεζίδεο CpG ή θνπηηά ΣΑΣΑ ή θάπνηα απφ ηα γλσζηά πξφηππα. ε απηέο ηηο πεξηπηψζεηο ε ρξήζε δεδνκέλσλ κεηαγξαθήο (mrnas/cdnas) κπνξεί λα ππνδείμεη ηελ αθξηβή ζέζε ηνπ ππνθηλεηή (79). Πνιιά γλσζηά κεηάγξαθα έρνπλ ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηελ άκεζε ζηνίρηζε ησλ mrnas θαη cdnas κε ην γνληδίσκα (79). Δληνχηνηο, ζηελ πεξίπησζε πνπ αλαδεηνχληαη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο πνπ δελ είλαη ππνθηλεηέο, ε ζρεηηθή ζέζε, ε απφζηαζε απφ ην TSS θαη ν πξνζαλαηνιηζκφο ησλ πξνηχπσλ πνπ ηπρφλ θέξνπλ πνηθίινπλ πάξα πνιχ. Έηζη, ζηελ πεξίπησζε ησλ αιιεινπρηψλ πνπ δξνπλ σο εληζρπηέο ε ζπληήξεζε ηφζν κέζα ζην ίδην ην γνληδίσκα ελφο νξγαληζκνχ, φζν θαη κεηαμχ δηαθνξεηηθψλ νξγαληζκψλ είλαη ζρεηηθά ρακειή (83). Γεληθά απηά ηα cis ξπζκηζηηθά ζηνηρεία είλαη πεξηζζφηεξν θξπκκέλα κέζα ζηα γνληδηψκαηα θαη δηαζθνξπηζκέλα ζε πνηθίιεο απνζηάζεηο αλνδηθά θαη θαζνδηθά ηνπ TSS ησλ γνληδίσλ ησλ νπνίσλ ξπζκίδνπλ ηε κεηαγξαθή (5). Παξφια απηά έρνπλ παξαηεξεζεί εληζρπηέο κε δχν δηαθξηηέο δνκέο. Τπάξρνπλ ινηπφλ εληζρπηέο πνπ πξνζδέλνπλ κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο κε δηαθνξεηηθφ 34

35 πξνζαλαηνιηζκφ θαη απνζηάζεηο πνπ πνηθίινπλ κεηαμχ ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο (84) θαη εληζρπηέο φπνπ νη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ πξνζειθχνπλ εκθαλίδνπλ πςεινχ επηπέδνπ νξγάλσζε ζε απζηεξά ζπγθεθξηκέλε ζεηξά. χκθσλα κε ηηο πξνεγνχκελεο παξαηεξήζεηο κπνξνχκε λα βαζηζηνχκε ζηελ ππνινγηζηηθή πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πξνθεηκέλνπ λα αληρλεχζνπκε ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο κε ξφιν εληζρπηή. Οη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο είλαη πξσηεΐλεο (trans ξπζκηζηηθά ζηνηρεία) πνπ είηε αηνκηθά, είηε ζπλεξγαδφκελνη κε άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο πξνζδέλνληαη εηδηθά ζε κηθξέο λνπθιενηηδηθέο αιιεινπρίεο (5-25bp) θαη ειέγρνπλ ηελ επαγσγή ή θαηαζηνιή ηεο κεηαγξαθήο ελφο γνληδίνπ. Οη ππνινγηζηηθέο κέζνδνη εληνπηζκνχ ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε αιιεινπρίεο DNA (trans-cis αιιειεπηδξάζεηο) ζηεξίδνληαη ζηε ρξήζε ζπλαηλεηηθψλ αιιεινπρηψλ (IUPAC consensus sequences) ή ζηε ρξήζε PWM. Μηα ζπλαηλεηηθή αθνινπζία είλαη έλαο ηξφπνο αλαπαξάζηαζεο ησλ απνηειεζκάησλ κηαο πνιιαπιήο ζηνίρηζεο αθνινπζηψλ, κε ηελ νπνία πξνζδηνξίδνληαη ηα παξφκνηα ιεηηνπξγηθά πξφηππα κηαο αθνινπζίαο. Οη θαλφλεο πνπ αθνινπζνχληαη γηα ηελ θαηαζθεπή κηαο ζπλαηλεηηθήο αθνινπζίαο παξνπζηάδνληαη ζηνλ Πίλαθα 1, ελψ ζηελ Δηθφλα 8 παξνπζηάδεηαη ε ζπλαηλεηηθή αιιεινπρία πνπ πεξηγξάθεη ηηο ζέζεηο πξφζδεζεο ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα NGN1 (ΝeuroGeniN1). Πίλαθαο 1: Καλφλεο IUPAC γηα ηελ θαηαζθεπή ζπλαηλεηηθψλ αιιεινπρηψλ. 35

36 Δηθφλα 8: πλαηλεηηθή αιιεινπρία γηα ηα πξφηππα πξφζδεζεο ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα NGN1 ζην DNA. Ζ ρξήζε ζπλαηλεηηθψλ αθνινπζηψλ γηα ηελ ηαπηνπνίεζε εληζρπηψλ ζηέθεηαη κε επηηπρία γηα πνιχ ζπληεξεκέλεο αιιεινπρίεο-ζηφρνπο. Πνιιέο θνξέο φκσο νη ίδηνη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πξνζδέλνληαη ζε αξθεηά δηαθνξεηηθέο αιιεινπρίεο DNA, νπφηε ε ρξήζε ζπλαηλεηηθψλ αιιεινπρηψλ δε βνεζά ζηνλ εληνπηζκφ ηνπο. Δλαιιαθηηθά, ινηπφλ γηα ηελ πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ ηα κεηξψα δχγηζεο ζέζεο (PWM) (79). Πξνθεηκέλνπ λα θαηαζθεπαζηεί έλα PWM, ρξεζηκνπνηνχληαη νη πεηξακαηηθά επηβεβαησκέλεο ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Δίλαη σζηφζν γλσζηφ πσο απηά ηα trans ξπζκηζηηθά ζηνηρεία επηδεηθλχνπλ κεγάιε εηδίθεπζε σο πξνο ηηο cis αιιεινπρίεο φπνπ πξνζδέλνληαη. Οη ηειεπηαίεο θπκαίλνληαη ζε κέγεζνο απφ 5 έσο 25 bp. Απηέο νη πεηξακαηηθά επηβεβαησκέλεο αιιεινπρίεοζέζεηο πξφζδεζεο ζηνηρίδνληαη, νπφηε πξνθχπηεη έλαο πίλαθαο πνπ πεξηγξάθεη ηε ζπρλφηεηα εχξεζεο θαζελφο απφ ηα ηέζζεξα δηαζέζηκα λνπθιενηίδηα ζε θάζε ζέζε ηεο αιιεινπρίαο πξφζδεζεο. Ο πίλαθαο ινηπφλ απηφο πεξηγξάθεη ηνλ αξηζκφ ησλ λνπθιενηηδίσλ πνπ παξαηεξήζεθαλ ζε θάζε λνπθιενηηδηθή ζέζε κέζα ζηελ επξχηεξε πεξηνρή πξφζδεζεο ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα. Κάζε πίλαθαο βαζκνινγείηαη κε βάζε ηελ εθηίκεζε ηεο ζπγγέλεηαο πξφζδεζεο ηνπ εθάζηνηε νιηγνλνπθιενηηδίνπ πνπ ειέγρεηαη ζηελ αληίζηνηρε πξσηεΐλε-κεηαγξαθηθφ παξάγνληα πνπ καο ελδηαθέξεη (79). Ζ βαζκνινγία πξνθχπηεη θαζψο θάζε κηα ζέζε ηνπ πίλαθα ηηκάηαη κε βάζε ηελ εθηίκεζε ηεο ζπγγέλεηαο πξφζδεζεο ηεο θάζε βάζεο ζε κηα ζπγθεθξηκέλε ζέζε ηεο πξσηεΐλεο. Μφλνλ νιηγνλνπθιενηίδηα κε 36

37 βαζκνινγία πάλσ απφ θάπνην θαηψθιη ζεσξείηαη φηη πξνζδέλνληαη επηηπρψο, έρνπλ δειαδή ηθαλνπνηεηηθή ζπγγέλεηα πξφζδεζεο ζηελ πξσηεΐλε. Ζ αμηνπηζηία ηνπ πίλαθα εμαξηάηαη απφ ην ζχλνιν ησλ γλσζηψλ αιιεινπρηψλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θαη απφ ηελ αθξίβεηα ηεο πνιιαπιήο ζηνίρηζεο πνπ πξαγκαηνπνηήζεθε γηα ην ζθνπφ απηφ (79). ηε ζπλέρεηα ν πίλαθαο απηφο δίλεη γέλεζε ζε έλα PWM (79) κεηαηξέπνληαο ηηο ήδε εμνκαιπκέλεο ηηκέο ζε ινγαξηζκηθή θιίκαθα. Αμίδεη λα ζεκεησζεί πσο κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πνπ πξνζδέλνληαη ζε λνπθιενηηδηθέο αιιεινπρίεο κε κεγάιν πνζνζηφ νκνηφηεηαο κπνξεί λα έρνπλ έλα θνηλφ PWM. Κάηη ηέηνην ηζρχεη ζηελ πεξίπησζε ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ NGN1 θαη NGN3 (NGN1/3), φπνπ ηα βήκαηα γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ θνηλνχ PWM αλαιχνληαη ζην θεθάιαην «Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη». Αθνινχζσο, θαηαζθεπάδεηαη θαη κηα ζπλαηλεηηθή αιιεινπρία πνπ πεξηγξάθεη ηηο αλακελφκελεο πηζαλέο παξαιιαγέο ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ελφο κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα. Πξφθεηηαη γηα κηα γξαθηθή απεηθφληζε κε βάζε ηελ πιεξνθνξία θάζε ζηήιεο ηνπ PWM. Σν κέγεζνο θαη ε παξνπζία ησλ γξακκάησλ ζρεηίδεηαη κε ηε ζπρλφηεηα ηνπ αληίζηνηρνπ λνπθιενηηδίνπ ζε θάζε ζέζε ηεο ζηήιεο (Δηθφλα 8). Σα δηαζέζηκα PWM πνπ ραξαθηεξίδνπλ θάζε κεηαγξαθηθφ παξάγνληα (ή θάζε νηθνγέλεηα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ) κπνξνχλ λα ρξεζηκνπνηεζνχλ απφ δηάθνξνπο αιγφξηζκνπο γηα ηελ αλαδήηεζε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ κέζα ζηηο πιήξεηο αιιεινπρίεο γνληδησκάησλ. Δπηπιένλ αμίδεη λα ζεκεησζεί φηη κηα ζέζε πξφζδεζεο φπσο πξνβιέπεηαη απφ βηνυπνινγηζηηθέο πξνζεγγίζεηο κπνξεί ζηελ πξαγκαηηθφηεηα λα είλαη κε ιεηηνπξγηθή. Απηφ ζπκβαίλεη φηαλ ε δνκή ηεο ρξσκαηίλεο θαη ε θαηάζηαζε κεζπιίσζεο ηνπ DNA κεηψλνπλ ηε ζπγγέλεηα πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζηελ αιιεινπρία απηή. ε κηα επηπιένλ πξνζέγγηζε κείσζεο ηέηνησλ ςεπδψο ζεηηθψλ απνηειεζκάησλ, αλαδεηνχκε θνηλέο ζέζεηο πξφζδεζεο δχν ή πεξηζζφηεξσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Αλαδεηνχκε έηζη κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο πνπ ζρεκαηίδνπλ ζχκπινθα ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ. ε έλα επφκελν βήκα απηήο ηεο πξνζέγγηζεο κπνξνχκε λα αλαδεηήζνπκε ηα ζπγθεθξηκέλα ξπζκηζηηθά ζχκπινθα ζε έλα ζχλνιν ζρεηηδφκελσλ γνληδηαθψλ αθνινπζηψλ, είηε νξζνιφγσλ, δειαδή γνλίδηα πνπ έρνπλ πξνέιζεη απφ έλα θνηλφ πξφγνλν, είηε γνληδίσλ πνπ ππφθεηληαη ζε θνηλή ξχζκηζε. Με απηφλ ηνλ ηξφπν κπνξνχκε λα είκαζηε ζίγνπξνη γηα ηε ιεηηνπξγηθφηεηα ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο πνπ 37

38 πξνβιέπνπκε (79). Παξέρεηαη παξάιιεια ε δπλαηφηεηα αλαδήηεζεο ζχλζεησλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ κε ρξήζε θίιηξσλ πνπ πεξηιακβάλνπλ επηινγή ζπγθεθξηκέλσλ ηχπσλ θπηηάξσλ ή εηδηθψλ κεηαβνιηθψλ θαη αλαπηπμηαθψλ κνλνπαηηψλ. 1.9 πγθξηηηθή Γνληδησκαηηθή θαη Αλάιπζε πλεθθξαδφκελσλ Γνληδίσλ: Μέζνδνη Πεξηνξηζκνχ ησλ Φεπδψο-Θεηηθψλ Απνηειεζκάησλ Ζ εθαξκνγή αιγνξίζκσλ γηα ηελ πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ παξνπζηάδεη ζπρλά έλα κεγάιν αξηζκφ ςεπδψο ζεηηθψλ απνηειεζκάησλ. ε κηα πξνζπάζεηα εμάιεηςεο, ή έζησ πεξηνξηζκνχ ησλ ηειεπηαίσλ, επηιέγνπκε έλα ζχλνιν γνληδίσλ πξνο αλάιπζε κε θνηλέο παξακέηξνπο αληί γηα κεκνλσκέλε αλάιπζε ηνπ θάζε γνληδίνπ ρσξηζηά. Σν ζχλνιν ησλ γνληδηαθψλ αθνινπζηψλ πνπ θαηαηίζεληαη πξνο αλάιπζε κπνξεί λα αθνξά νξζφινγα γνλίδηα. απηήλ ηελ πεξίπησζε ε αλαγλψξηζε νξζφινγσλ γνληδίσλ απνηειεί ην πξψην θαη πην θξίζηκν ζηάδην ηεο εξεπλεηηθήο δηαδηθαζίαο πνπ ζπρλά αλαθέξεηαη κε ηνλ φξν «ζπγθξηηηθή γνληδησκαηηθή». Ζ δηαδηθαζία πνπ αθνινπζείηαη ζπλνςίδεηαη ζηελ εχξεζε ξπζκηζηηθψλ αιιεινπρηψλ πνπ είλαη ιεηηνπξγηθέο, αλαδεηψληαο ζπληεξεκέλεο αθνινπζίεο κέζα ζε ζχλνια νξζφινγσλ γνληδίσλ. Ζ ηδέα ηεο φιεο πξνζέγγηζεο βαζίδεηαη ζην γεγνλφο πσο νη γνληδηαθέο πεξηνρέο πνπ έρνπλ πεηξακαηηθά απνδεδεηγκέλν ξπζκηζηηθφ ξφιν είλαη ζπλήζσο ζπληεξεκέλεο εμειηθηηθά (79). Έηζη νη πεξηνρέο DNA πνπ απνηεινχλ ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ είλαη θαιχηεξα ζπληεξεκέλεο ζε ζρέζε κε ηηο ππφινηπεο κε ιεηηνπξγηθέο πεξηνρέο ελφο γνληδηψκαηνο, αθνχ ε εμειηθηηθή πίεζε πνπ αζθείηαη ζ απηέο είλαη κεγαιχηεξε ιφγσ ηνπ ζεκαληηθνχ ιεηηνπξγηθνχ ηνπο ξφινπ (9, 85-87). Σέηνηεο ζπληεξεκέλεο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο κπνξεί λα εθηείλνληαη ζε κήθνο εθαηνληάδσλ βάζεσλ λνπθιενηηδίσλ θαη λα εκθαλίδνπλ νκνηφηεηα πεξίπνπ 80% ζπγθξηλφκελεο κε παξφκνηεο αιιεινπρίεο απφ εμειηθηηθά θαηψηεξα ζπνλδπισηά (88, 89). Έλαο ελαιιαθηηθφο ηξφπνο πεξηνξηζκνχ ησλ ςεπδψο ζεηηθψλ απνηειεζκάησλ είλαη ε απφ θνηλνχ αλάιπζε γνληδίσλ πνπ απφ πεηξάκαηα ειέγρνπ ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο (π.ρ. πεηξάκαηα κηθξνζπζηνηρηψλ) θαίλεηαη λα παξνπζηάδνπλ θνηλφ πξφηππν έθθξαζεο. Γηα ηέηνηα ζπλεθθξαδφκελα (ή ζπγθαηαζηειιφκελα) γνλίδηα είλαη ινγηθφ λα ππνηίζεηαη θαη έλα θνηλφ πιαίζην 38

39 ξχζκηζεο θαη λα αλακέλεηαη ε αλεχξεζε θνηλψλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ κέζα απφ ηελ ππνινγηζηηθή αλάιπζε (79) Οξζφινγα θαη Παξάινγα Γνλίδηα Σν πξψην βήκα γηα ηελ εθαξκνγή ηεο ζπγθξηηηθήο γνληδησκαηηθήο είλαη ε δηεξεχλεζε ησλ εμειηθηηθψλ θαη ιεηηνπξγηθψλ ζρέζεσλ κεηαμχ ησλ γνληδίσλ πνπ πξφθεηηαη λα κειεηεζνχλ. Απηφ κπνξεί λα γίλεη ζπγθξίλνληαο ην βαζκφ νκνηφηεηαο ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ ή ησλ αληίζηνηρσλ ακηλνμηθψλ αθνινπζηψλ πνπ ηηο θσδηθνπνηνχλ ψζηε λα εμαρζνχλ ζπκπεξάζκαηα ηφζν γηα ηελ εμειηθηηθή ηζηνξία ηνπο, φζν θαη γηα ηε βηνρεκηθή ηνπο ιεηηνπξγία. Οη αιιεινπρίεο πνπ έρνπλ πξνέιζεη απφ κηα θνηλή πξνγνληθή αθνινπζία κέζσ γνληδηαθψλ δηπιαζηαζκψλ νλνκάδνληαη νκφινγεο. Δηδηθέο πεξηπηψζεηο νκνινγίαο απνηεινχλ ε νξζνινγία θαη ε παξαινγία γνληδίσλ. Οξζφινγα ιέγνληαη ηα γνλίδηα πνπ πξνέξρνληαη απφ έλα πξνγνληθφ γνλίδην αλαθεξφκελν ζηνλ ηειεπηαίν θνηλφ πξφγνλν ησλ εηδψλ κε ηα νπνία είλαη ζπλδεδεκέλα θαη ζπλδπάδνληαη κε ζπκβάληα εηδνγέλεζεο. Σα νξζφινγα γνλίδηα κεξηθέο θνξέο παξνπζηάδνπλ κεγάιε νκνηφηεηα ζε επίπεδν αθνινπζίαο θαη ζπρλά έρνπλ θνηλή ιεηηνπξγία. Απφ ηελ άιιε πιεπξά ηα παξάινγα γνλίδηα έρνπλ πξνθχςεη απφ γνληδηαθφ δηπιαζηαζκφ ελφο πξνγνληθνχ γνληδίνπ, ην νπνίν δηπιαζηάζηεθε ζε έλα είδνο θαη χζηεξα απέθιηλε (90, 91). Ο νξηζκφο ηφζν ησλ νξζνιφγσλ φζν θαη ησλ παξαιφγσλ γνληδίσλ δελ πεξηέρεη θακηά πιεξνθνξία ζρεηηθά κε ηε ιεηηνπξγία ηνπο. Χζηφζν, έρεη παξαηεξεζεί φηη νξζφινγεο πξσηεΐλεο δηαθνξεηηθψλ νξγαληζκψλ ζπλήζσο κνηξάδνληαη παξφκνηεο ιεηηνπξγίεο ηδηαίηεξα αλ ε εμειηθηηθή απφζηαζε ησλ νξγαληζκψλ δελ είλαη κεγάιε (92) ζε αληίζεζε κε ηηο πξσηεΐλεο ησλ παξαιφγσλ γνληδίσλ πνπ ζπλήζσο δηαθνξνπνηνχληαη ιεηηνπξγηθά ζε ζρέζε κε ην πξνγνληθφ γνλίδην (93). Χο ελδεηθηηθφ παξάδεηγκα παξαιφγσλ γνληδίσλ αλαθέξνληαη ηα γνλίδηα ηεο α θαη β αηκνζθαηξίλεο ζηνλ άλζξσπν, ελψ σο παξάδεηγκα νξζνιφγσλ γνληδίσλ κπνξνχλ λα αλαθεξζνχλ ηα γνλίδηα ηεο β αηκνζθαηξίλεο ζηνλ άλζξσπν θαη ηνλ πνληηθφ. 39

40 1.11 Απηνηειείο Γνκηθέο Πεξηνρέο Πξσηετλψλ Μειέηεο ζηεξενδνκψλ πξσηετλψλ κε θξπζηαιινγξαθία αθηίλσλ-υ, έδεημαλ φηη πνιιέο πξσηεΐλεο απνηεινχληαη απφ δηαθξηηά ζθαηξηθά ζρήκαηα, ζπλδεδεκέλα ζρεηηθά ραιαξά κεηαμχ ηνπο. Απηά νλνκάζηεθαλ δνκηθέο απηνηειείο πεξηνρέο. Σα δνκηθά απηνηειή ζηνηρεία ηαμηλνκνχληαη ζε πέληε θαηεγνξίεο: α, β, α/β, α+β θαη γ. Παξαηεξήζεθε επίζεο φηη πεξηνρέο πνπ ζρεηίδνληαη κε ηε ιεηηνπξγηθφηεηα κηαο πξσηεΐλεο, φπσο πρ. ελεξγά θέληξα ελδχκσλ, πεξηνρέο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζην DNA ή πεξηνρέο δηκεξηζκνχ πξσηετλψλ (ιεηηνπξγηθά απηνηειή ζηνηρεία), βξίζθνληαη ζπρλά κεηαμχ ηέηνησλ δνκηθψλ απηνηειψλ πεξηνρψλ. Σα δνκηθά απηνηειή ζηνηρεία ζεσξνχληαη απζχπαξθηεο κνλάδεο, ιεηηνπξγηθά δηαθξηηέο πνπ δηπιψλνληαη αλεμάξηεηα απφ ην ππφινηπν πξσηετληθφ κφξην. Πξνθχπηνπλ δε ζπλήζσο απφ ζπλερφκελα ηκήκαηα ηεο πνιππεπηηδηθήο αιπζίδαο. Δπνκέλσο, κηα δνκηθή ιεηηνπξγηθή πεξηνρή κπνξεί λα απνηειείηαη απφ νξηζκέλεο γεηηνληθέο πάλσ ζηελ πνιππεπηηδηθή αιπζίδα δεπηεξνηαγείο ή αθφκα θαη ππεξδεπηεξνηαγείο δνκέο (94). Ζ αλαγλψξηζε ηέηνησλ δνκηθψλ ιεηηνπξγηθψλ κνλάδσλ κέζα ζηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ κπνξεί λα απνηειέζεη κέζo πξφβιεςεο ηεο ιεηηνπξγίαο ηνπο θαη θαη επέθηαζε λα ρξεζηκνπνηεζεί γηα ηελ πξφβιεςε ησλ αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ηνπο αιιά θαη κε άιια βηνκφξηα φπσο π.ρ. κε ην DNA Μέζνδνη Πξφβιεςεο Πξσηετληθψλ Αιιειεπηδξάζεσλ Οη πξσηετληθέο αιιειεπηδξάζεηο κπνξνχλ λα δηαθξηζνχλ ζε δηάθνξνπο ηχπνπο (79). H πην ζεκαληηθή δηάθξηζε κεηαμχ απηψλ αθνξά ζην αλ αιιειεπηδξψληαο νη πξσηεΐλεο ζρεκαηίδνπλ παξνδηθά ή κφληκα ζχκπινθα. ηελ πξψηε πεξίπησζε νη αιιειεπηδξάζεηο ραξαθηεξίδνληαη σο αζζελείο, ρσξίο απηφ λα ζεκαίλεη πσο δελ ππάξρεη εμεηδίθεπζε κεηαμχ ησλ αιιειεπηδξψλησλ κνξίσλ. ηε δεχηεξε πεξίπησζε νη αιιειεπηδξάζεηο ραξαθηεξίδνληαη σο ηζρπξέο θαη κάιηζηα είλαη εμειηθηηθά πεξηζζφηεξν ζπληεξεκέλεο ζε ζρέζε κε ηηο αιιειεπηδξάζεηο πξφζθαηξσλ ζπκπιφθσλ (79). Δπηπιένλ, νη πξσηεΐλεο πνπ ζρεκαηίδνπλ ζηαζεξά ζχκπινθα έρνπλ ηελ ηάζε λα ζπλεθθξάδνληαη ζε κεγαιχηεξν βαζκφ ζε ζρέζε κε απηέο πνπ ζρεκαηίδνπλ πξφζθαηξα ζχκπινθα. ην αλζξψπηλν γνληδίσκα θπξηαξρνχλ νη αιιειεπηδξάζεηο πνπ ζρεκαηίδνπλ πξφζθαηξα ζχκπινθα (79). Δηδηθά ζηελ πεξίπησζε ησλ 40

41 κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ νη δνκέο ηνπο ραξαθηεξίδνληαη απφ πεξηνρέο κε ελδνγελή δνκηθή αζηάζεηα, νπφηε κπνξνχλ λα πάξνπλ πνιιέο δηακνξθψζεηο πνπ αιιάδνπλ δηαξθψο (79). Έηζη, νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο ζπλήζσο ζπκκεηέρνπλ ζε αιιειεπηδξάζεηο πνπ ραξαθηεξίδνληαη απφ πςειή εμεηδίθεπζε θαη ηαπηφρξνλα ρακειή ζπγγέλεηα κεηαμχ ησλ αιιειεπηδξψλησλ επηθαλεηψλ. Οη αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ πξσηετληθψλ κνξίσλ κπνξνχλ λα δηεξεπλεζνχλ in silico κε δηάθνξεο πξνζεγγίζεηο. Οη πην ζπλήζεηο θαη αμηφπηζηεο κέζνδνη ππνινγηζηηθήο δηεξεχλεζεο ησλ πξσηετληθψλ αιιειεπηδξάζεσλ είλαη ε αλαδήηεζε θξπζηαιιηθψλ δνκψλ πξσηετλψλ ή ε πξνηππνπνίεζε κε βάζε ηελ νκνινγία ησλ πξσηετληθψλ κνξίσλ θαη ε πνζνηηθνπνίεζε ζηε ζπλέρεηα ησλ πηζαλψλ αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ηνπο θαζψο θαη ε άληιεζε πιεξνθνξηψλ κέζα απφ ηελ αλάιπζε ησλ πξσηετληθψλ γξάθσλ (79). Πην ζπγθεθξηκέλα, ππάξρνπλ πξνγξάκκαηα πξφβιεςεο ησλ δνκηθψλ αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ κνξίσλ. Σα πξνγξάκκαηα απηά ρξεζηκνπνηνχλ ηε κέζνδν πνπ νλνκάδεηαη αγθπξνβφιεζε (docking), φπνπ κε βάζε ηηο ηξηζδηάζηαηεο δηακνξθψζεηο ησλ κνξίσλ ππνινγίδνληαη νη ζεξκνδπλακηθέο παξάκεηξνη πνπ επλννχλ ή φρη κηα λέα δηακφξθσζε απηψλ ζην ρψξν κεηά απφ αιιειεπίδξαζε ησλ επηκέξνπο πεξηνρψλ ηνπο. Ζ φιε ηδέα ζηεξίδεηαη ζην γεγνλφο πσο αλ κηα δηακφξθσζε ιφγσ αιιειεπηδξάζεσλ είλαη ζεξκνδπλακηθά εθηθηή θαη επλντθή θαηά πξνηίκεζε, ηφηε είλαη πηζαλφ λα πθίζηαηαη ζηελ πξαγκαηηθφηεηα. εκεησηένλ, φηη ηα πξσηετληθά κφξηα έρνπλ ηελ ηάζε λα δηαηάζζνληαη ζηνλ ρψξν κε ηξφπν ψζηε λα θαηαλαιψλεηαη ε ιηγφηεξε δπλαηή ελέξγεηα, ελψ ε ελέξγεηα δηακφξθσζεο θαζνξίδεηαη απφ ηηο επηκέξνπο αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ θαηαινίπσλ ησλ επηθαλεηψλ πνπ αιιειεπηδξνχλ. Όηαλ, ινηπφλ, ππάξρνπλ δηαζέζηκεο ηξηζδηάζηαηεο δνκέο βηνκνξίσλ θαη αλαδεηείηαη ν πην πηζαλφο ηξφπνο αιιειεπίδξαζήο ηνπο ρξεζηκνπνηείηαη ε κέζνδνο ηεο αγθπξνβφιεζεο (docking). Mε ηε κέζνδν απηή κπνξεί λα δηαπηζησζεί αλ δχν επηθάλεηεο είλαη δπλαηφλ λα αιιειεπηδξάζνπλ θαη αλ λαη κε πνηνλ πξνζαλαηνιηζκφ ζηνλ ρψξν επηηπγράλεηαη ηαπηφρξνλα ε βέιηηζηε αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ησλ κνξίσλ θαη ε ειάρηζηε ελέξγεηα ηνπ ζπκπιφθνπ πνπ ζρεκαηίδνπλ. Πξφθεηηαη γηα κηα πνιχ ρξήζηκε κέζνδν πνπ βξίζθεη εθαξκνγή ζηε δηεξεχλεζε ησλ αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ πξσηετλψλ πνπ εκπιέθνληαη ζε πνιιά βηνρεκηθά, κεηαβνιηθά θαη αλαπηπμηαθά κνλνπάηηα, ελψ ρξεζηκνπνηείηαη επξχηαηα ζην ζρεδηαζκφ θαξκάθσλ θαη ζηε κειέηε ηεο αιιειεπίδξαζήο ηνπο κε κφξηα-ζηφρνπο. 41

42 Σα πξνγξάκκαηα πνπ εθηεινχλ ηελ αγθπξνβφιεζε δέρνληαη σο είζνδν ηηο δνκέο ησλ βηνκνξίσλ ησλ νπνίσλ νη αιιειεπηδξάζεηο πξφθεηηαη λα ειεγρζνχλ. Δπίζεο ζπρλά παξέρεηαη θαη ε δπλαηφηεηα λα πξνζδηνξηζηνχλ εθ πξννηκίνπ νη πεξηνρέο ησλ βηνκνξίσλ πνπ πξφθεηηαη λα ειεγρζνχλ γηα ηπρφλ αιιειεπηδξάζεηο. ηελ πξάμε, θαηά ηελ εθαξκνγή ηέηνησλ πξνγξακκάησλ πξφβιεςεο ππάξρεη έλαο ηεξάζηηνο αξηζκφο πηζαλψλ κνξηαθψλ ζηεξενδηακνξθψζεσλ ιφγσ αιιειεπίδξαζεο πνπ πξνθχπηεη απφ ηνπο επίζεο πνιινχο βαζκνχο ειεπζεξίαο ησλ επηκέξνπο αηφκσλ ησλ κνξίσλ πνπ ειέγρνληαη. Τπάξρνπλ δχν βαζηθέο θαηεγνξίεο αγθπξνβφιεζεο: ε αγθπξνβφιεζε πξσηεΐλεοπξνζδέηε θαη ε αγθπξνβφιεζε κεηαμχ πξσηετλψλ. ηε δεχηεξε πεξίπησζε θαη ηα δχν κφξηα ζεσξνχληαη άθακπηα θαη ππάξρνπλ έμη βαζκνί ειεπζεξίαο. ε θάζε πεξίπησζε πάλησο ρξεηάδεηαη λα ππάξρεη επαξθήο αλαπαξάζηαζε ηεο επηθάλεηαο αιιειεπίδξαζεο θαη αλαγλψξηζε ησλ πεξηνρψλ πνπ ελδέρεηαη λα αιιειεπηδξνχλ. Ζ αλαπαξάζηαζε ησλ επηθαλεηψλ γίλεηαη κε δηάθνξνπο ηξφπνπο φπσο π.ρ. ηξηζδηάζηαην πιέγκα, επηθάλεηα Connolly, ηερληθή Lenhoff θ.α. Γηα παξάδεηγκα αλ θάζε άηνκν ηνπ κνξίνπ αλαπαξαζηαζεί σο ζθαίξα κε αθηίλα Van der Waals, κε θχιηζε κνξίνπ αληρλεπηή ζηελ επηθάλεηα ηεο πξνθχπηεη ε επηθάλεηα Connolly (Δηθφλα 9A), ελψ κπνξνχκε λα ππνινγίζνπκε κηα ζπκπιεξσκαηηθή επηθάλεηα πξνο ηελ επηθάλεηα Connolly θαη λα έρνπκε έηζη ηηο πηζαλέο ζέζεηο ησλ αηφκσλ ηνπ πξνζδέηε θαηά ηελ ηερληθή Lenhoff (Δηθφλα 9B). Δηθφλα 9: (A) Eπηθάλεηα Connolly. (B) Σερληθή Lenhoff. ηε ζπλέρεηα, θαη ζε θάζε πεξίπησζε, επηδηψθεηαη ην βέιηηζην ηαίξηαζκα ησλ επηθαλεηψλ απηψλ κέζα απφ δηαδηθαζίεο αιιαγήο ηεο ζεζεο ζην ρψξν ησλ αηφκσλ ησλ κνξίσλ πνπ εμεηάδνληαη, ψζηε λα κεγηζηνπνηείηαη ε αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ηνπο, ηθαλνπνηψληαο παξάιιεια θαη ηνπο ηνπηθνχο γεσκεηξηθνχο αιιά θαη ηνπο γεληθφηεξνπο ελεξγεηαθνχο πεξηνξηζκνχο. Πην απιά, πξέπεη ηα δχν κφξηα λα 42

43 έρνπλ ζπκπιεξσκαηηθέο επηθάλεηεο θαη ν πξνζαλαηνιηζκφο ηνπο ζην ρψξν λα είλαη ηέηνηνο, ψζηε ε ειεχζεξε ελέξγεηα ηνπ ζπκπιφθνπ πνπ ζρεκαηίδεηαη λα ειαρηζηνπνηείηαη (95). Ο ππνινγηζκφο ηνπ πξνζαλαηνιηζκνχ ησλ κνξίσλ ζπκβάιιεη ζηελ πξφβιεςε ηεο ηζρχνο ησλ αιιειεπηδξάζεσλ (96). ηελ πεξίπησζε πνπ ε ηξηζδηάζηαηε δνκή κηαο πξσηεΐλεο δελ έρεη πξνζδηνξηζζεί πεηξακαηηθά, κπνξεί λα πξαγκαηνπνηεζεί πξνηππνπνίεζε κε βάζε ηελ νκνινγία θαη λα πξνβιεθζεί κε κεγάιε αθξίβεηα ε ζηεξενδνκή ηεο. Πξνο ηνχην, απαξαίηεηε πξνυπφζεζε είλαη λα ππάξρεη δηαζέζηκε θξπζηαιινγξαθηθά πξνζδηνξηζκέλε δνκή κηαο άιιεο πξσηεΐλεο κε αιιεινπρία πνπ λα επηδεηθλχεη νκνηφηεηα κεγαιχηεξε απφ θάπνην θαηψθιη σο πξνο ηελ αιιεινπρία ηεο πξσηεΐλεο πνπ πξφθεηηαη λα πξνηππνπνηεζεί. Σα πξνγξάκκαηα πξνηππνπνίεζεο κε βάζε ηελ νκνινγία, δέρνληαη σο είζνδν ηηο αιιεινπρίεο ησλ δχν πξσηετλψλ θαη ηε δνκή ηεο κηαο απ απηέο (δνκή νδεγφο) θαη παξάγνπλ σο έμνδν ηελ επηζπκεηή δνκή κε πιήξεηο ζπληεηαγκέλεο γηα ηελ θχξηα θαη ηηο πιεπξηθέο αιπζίδεο ησλ ακηλνμέσλ ηεο. Σν θαηψθιη ηνπ πνζνζηνχ νκνηφηεηαο πνπ πξέπεη λα εκθαλίδνπλ νη δχν πξσηεΐλεο, ψζηε λα εμαζθαιίδεηαη ε νξζή πξνηππνπνίεζε, είλαη 30%, ελψ ην κήθνο ησλ δχν πξσηετλψλ πξέπεη λα μεπεξλά ηα 80 θαηάινηπα. Μφλνλ ππφ απηέο ηηο ζπλζήθεο κπνξνχκε λα ζεσξήζνπκε πσο νη πξσηεΐλεο δηπιψλνπλ ζηνλ ρψξν κε παξφκνην ηξφπν θαη λα πξνρσξήζνπκε έηζη ζε πξνηππνπνίεζε κε αμηφπηζηα απνηειέζκαηα (97). Αμίδεη λα ζεκεησζεί πσο ε ρξήζε πεξηνξηζκψλ φζνλ αθνξά ηηο ζηεξενδηακνξθψζεηο πνπ κπνξεί λα ιάβνπλ ηα άηνκα ηνπ πξνηχπνπ, θαηαιήγεη ζηε δεκηνπξγία κηαο ηξηζδηάζηαηεο δνκήο πνπ δελ είλαη απιφ αληίγξαθν ηεο δνκήο νδεγνχ. Τπάξρνπλ, ινηπφλ, ηνπηθνί πεξηνξηζκνί πνπ βαζίδνληαη ζηηο νκνινγίεο ησλ πξσηετλψλ, ελψ ζπκπιεξσκαηηθνί πεξηνξηζκνί πνπ αθνξνχλ ζηηο ζηεξενρεκηθέο απαηηήζεηο δηακνξθψλνπλ έλα ελεξγεηαθφ πεδίν κέζα ζην νπνίν πξέπεη λα έγθεηηαη ζπλνιηθά θαη φρη κφλν ηνπηθά ε δνκή ηνπ πξνηχπνπ (98). Γηεξεχλεζε ησλ πξσηετληθψλ αιιειεπηδξάζεσλ κπνξεί σζηφζν λα γίλεη θαη ρσξίο λα ιεθζνχλ ππ φςηλ νη δνκέο ησλ πξσηετλψλ, κέζσ επεμεξγαζίαο ησλ πιεξνθνξηψλ πνπ πεξηέρνληαη ζε πξσηετληθνχο γξάθνπο. ηελ πεξίπησζε απηή δηεξεπλψληαη νη πξσηετληθέο αιιειεπηδξάζεηο ελζσκαηψλνληαο πιεξνθνξία απφ πξνυπάξρνληα πεηξακαηηθά δεδνκέλα. απηνχο ηνπο γξάθνπο ππάξρνπλ θφκβνη πνπ αλαπαξηζηνχλ πξσηεΐλεο θαη βέιε πνπ ππνδειψλνπλ άκεζεο θπζηθέο αιιειεπηδξάζεηο. Σν πιήζνο ησλ βειψλ πνπ εθάπηνληαη ζε έλαλ θφκβν ελφο 43

44 γξάθνπ αθνινπζεί ηελ δηαζπνξά power-law. Aπηφ ζηελ νπζία ζεκαίλεη πσο ιίγνη θφκβνη έρνπλ πνιιέο αιιειεπηδξάζεηο θαη νη πεξηζζφηεξνη έρνπλ ιίγεο αιιειεπηδξάζεηο. Έηζη αλ θάπνηεο πξσηεΐλεο απαιεηθνχλ, ην δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ δελ αιιάδεη ζεκαληηθά, θάηη πνπ αληαλαθιά ηε ζηαζεξφηεηα ησλ νξγαληζκψλ πνπ αθφκε θαη αλ ράζνπλ θάπνηεο απφ ηηο πξσηεΐλεο ηνπο εμαθνινπζνχλ λα επηηεινχλ ηηο αληίζηνηρεο ιεηηνπξγίεο κέζσ ελαιιαθηηθψλ βηνρεκηθψλ θαη κνξηαθψλ κνλνπαηηψλ. Δπίζεο έρεη παξαηεξεζεί πσο παξφκνηεο πξσηεΐλεο βξίζθνληαη ζε γεηηνληθά ζεκεία ζηνπο πξσηετληθνχο γξάθνπο θαη αιιειεπηδξνχλ κεηαμχ ηνπο (79). ηελ πεξίπησζε ησλ γνληδηαθψλ ξπζκηζηηθψλ δηθηχσλ νη θφκβνη ππνδειψλνπλ κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο θαη ηα βέιε ηελ θαηεχζπλζε ξχζκηζεο ηεο κεηαγξαθήο. H εχξεζε εμειηθηηθά ζπληεξεκέλσλ ξπζκηζηηθψλ δηθηχσλ δηεπθνιχλεη ηε κειέηε ησλ πξσηετληθψλ αιιειεπηδξάζεσλ κε ρξήζε νξζνιφγσλ πξσηετλψλ. Έηζη ε δεκηνπξγία πξσηετληθψλ δηθηχσλ γηα δηάθνξνπο νξγαληζκνχο έρεη βνεζήζεη ζηελ πξφβιεςε αιιειεπηδξάζεσλ ζε άιινπο νξγαληζκνχο. Με απηφλ ηνλ ηξφπν κπνξνχκε λα πξνβιέςνπκε πξσηετληθέο αιιειεπηδξάζεηο ζε νξγαληζκνχο πνπ δελ έρνπλ κειεηεζεί δηεμνδηθά αμηνπνηψληαο ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα απφ θαιά κειεηεκέλνπο πξφηππνπο νξγαληζκνχο (79). 44

45 2 ΚΟΠΟ ΣΖ ΜΔΛΔΣΖ Βαζηθφο ζηφρνο ηεο παξνχζαο δηαηξηβήο ήηαλ ε δηεξεχλεζε ησλ ζχλζεησλ γνληδηαθψλ ξπζκηζηηθψλ δηθηχσλ πνπ εκπιέθνληαη ζηελ εκβξπηθή αλάπηπμε ησλ ζειαζηηθψλ. Πην ζπγθεθξηκέλα, ην ελδηαθέξνλ εζηηάδεηαη ζηε δηαιεχθαλζε ηνπ κνλνπαηηνχ δηαθνξνπνίεζεο πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ πξνο ελδνθξηλή θχηηαξα παγθξέαηνο ηθαλά λα παξάγνπλ ηλζνπιίλε. Πξσηεχνληα ξφιν ζ απηφ ην πξφγξακκα δηαθνξνπνίεζεο έρεη ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο NGN3 (39, 49). Ζ επηιεθηηθή ρσξνρξνληθά επαγσγή ηνπ NGN3 ζε ζπγθεθξηκέλνπο πιεζπζκνχο πξνδξφκσλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο επάγεη ηελ έθθξαζε κηαο ζεηξάο άιισλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ ζπλεξγαδφκελνη κε ηνλ NGN3 ειέγρνπλ ηελ έθθξαζε επηιεγκέλσλ γνληδίσλ ζηα θχηηαξα-ζηφρνπο. Έηζη, νινθιεξψλεηαη ε δηαθνξνπνίεζε ησλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ πξνο ηνπο δηάθνξνπο θπηηαξηθνχο ηχπνπο ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο. Με βάζε πξνεγνχκελα πεηξάκαηα θαηεπζπλφκελεο δηαθνξνπνίεζεο εκβξπηθψλ βιαζηνθπηηάξσλ πνληηθνχ κέζσ επηιεθηηθήο επαγσγήο ηνπ NGN3 (62) επηιέρζεθε κηα νκάδα γνληδίσλ πνπ αιιειεπηδξνχλ ηφζν κεηαμχ ηνπο φζν θαη κε ηνλ NGN3 πξνθεηκέλνπ λα πεξαησζεί ην ελ ιφγσ πξφγξακκα δηαθνξνπνίεζεο. Ο NGN3 θαη κηα νκάδα πξσηετλψλ (trans ξπζκηζηηθά ζηνηρεία) αιιειεπηδξνχλ κεηαμχ ηνπο αιιά θαη κε εηδηθέο πεξηνρέο πξφζδεζεο ζην DNA (cis ξπζκηζηηθά ζηνηρεία) θαη ζπγθξνηνχλ έλα ξπζκηζηηθφ δίθηπν. Αληηθείκελν κειέηεο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο απνηέιεζαλ ηφζν νη αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ θαη ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ηνπο ζην DNA (trans-cis αιιειεπηδξάζεηο), φζν θαη νη αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ηνπ NGN3 θαη ησλ άιισλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ (trans-trans αιιειεπηδξάζεηο). Μέζα απφ ηε ρξήζε ήδε δηαζέζηκσλ βηνπιεξνθνξηθψλ εξγαιείσλ αιιά θαη αλαπηχζζνληαο θαηάιιεια πξνζαξκνζκέλνπο θψδηθεο αλαιχζεθαλ νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο κηαο νκάδαο γνληδίσλ πνπ ειέγρνληαη απφ θνηλνχ απφ ηνλ NGΝ3 (ζπλεπαγφκελα ή ζπγθαηαζηειιφκελα γνλίδηα) ρξεζηκνπνηψληαο ηε κέζνδν ηεο ζπγθξηηηθήο γνληδησκαηηθήο. Με απηήλ ηελ πξνζέγγηζε έγηλε πξνζπάζεηα λα αλαθαιπθζνχλ εμειηθηηθά ζπληεξεκέλεο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ζηα γνληδηψκαηα δηαθφξσλ νξγαληζκψλ πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο θαη αληηπξνζσπεχνπλ ηε θπινγελεηηθή απφζηαζε απφ ηα ςάξηα σο ηνλ άλζξσπν (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο) 45

46 ζηεξηδφκελνη ζηελ ηδέα πσο ν ξπζκηζηηθφο ξφινο ησλ πεξηνρψλ απηψλ ηηο θαζηζηά ζεκαληηθέο θαη επνκέλσο ιηγφηεξν επηδεθηηθέο ζε αιιαγέο θαηά ηελ πνξεία ηεο εμέιημεο ζε ζρέζε κε άιιεο πεξηνρέο ησλ γνληδησκάησλ (9, 85-87). Γηαζέηνληαο ινηπφλ σο ζχλνια πξνο αλάιπζε γνλίδηα πνπ θαίλεηαη λα ξπζκίδνληαη απφ θνηλνχ απφ ηνλ NGN3 θαη ζπιιέγνληαο γηα θαζέλα απφ απηά ηα νξζφινγά ηνπο ζε δέθα νξγαληζκνχο πνπ θαηαλάκνληαη ζηελ εμειηθηηθή δηαδξνκή ςάξηα-άλζξσπνο (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο) αλαδεηήζεθαλ ζέζεηο πξφζδεζεο γηα κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο πνπ θαίλεηαη λα εκπιέθνληαη ζηελ εκβπνγελεηηθή δηαδηθαζία ζρεκαηηζκνχ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο. ηε ζπλέρεηα, πξνζδηνξίζζεθαλ ζχκπινθα ηέηνησλ ζέζεσλ, φπνπ κηα νκάδα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πξνζδελφηαλ ζε κηα εμειηθηηθά ζπληεξεκέλε πεξηνρή ηνπ DNA. Παξάιιεια ειέγρζεθε ε πηζαλφηεηα ηπραίαο εχξεζεο κηαο ηέηνηαο πεξηνρήο ζ έλα πιήξεο γνληδίσκα. Πξνθεηκέλνπ λα κειεηεζεί ν φγθνο ησλ δεδνκέλσλ ηεο παξνχζαο εξγαζίαο θαηαζθεπάζηεθε ε πιαηθφξκα TFDetector. Ζ εθαξκνγή TFDetector, πνπ κπνξεί λα εθηειεζζεί εχθνια ζε θάζε ππνινγηζηή, ζπγρσλεχεη ηα δεδνκέλα ησλ επηκέξνπο αλαιχζεσλ, ηα επεμεξγάδεηαη εληαία θαη παξνπζηάδεη επνπηηθά ηα απνηειέζκαηα ζε κηα θνηλή έμνδν, δηεπθνιχλνληαο ηελ φιε δηαδηθαζία θαη αλνίγνληαο ην δξφκν γηα παξφκνηεο αλαιχζεηο. Δπίζεο αλαιχζεθε ε πεξηεθηηθφηεηα ζε GC λνπθιενηίδηα θαη αλαδεηήζεθαλ ζπληεξεκέλα πξφηππα εληφο ησλ ζπγθεθξηκέλσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ πνπ ηαπηνπνηήζεθαλ. Σέινο, δηεξεπλήζεθαλ νη trans-trans αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ηνπ παξάγνληα NGN3 θαη ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ησλ νηθνγελεηψλ HNF1, HNF6, PDX1, BRNF, LEFF θαη AP4R πνπ θαίλεηαη λα πξνζδέλνληαη σο ζχκπινθν ζηηο ζπγθεθξηκέλεο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο. Ζ πξνζέγγηζε θαηέιεμε ζηελ θαηαζθεπή ελφο ξπζκηζηηθνχ δηθηχνπ πνπ πηζαλφηαηα ειέγρεη ηε δηαθνξνπνίεζε εκβξπηθψλ βιαζηνθπηηάξσλ πξνο θχηηαξα πνπ πξνζνκνηάδνπλ ζηα β-θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο. 46

47 3 ΓΔΓΟΜΔΝΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ 3.1 Γεληθά Δπηινγή ηωλ Γνληδίωλ πξνο Αλάιπζε. Γεδνκέλα από Πεηξάκαηα Πξνζδηνξηζκνύ ηεο Γνληδηαθήο Έθθξαζεο κε Μηθξνζπζηνηρίεο DNA Ζ δηεξεχλεζε ηνπ κνλνπαηηνχ πνπ θαζνδεγεί ν NGN3 θαη θαηαιήγεη ζηε δηαθνξνπνίεζε ΔΒΚ απφ πνληηθφ πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα, έγηλε κειεηψληαο ηα γνλίδηα-ζηφρνπο ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ παξάγνληα. Ζ επηινγή ησλ ζπγθεθξηκέλσλ γνληδίσλ έγηλε απφ δεδνκέλα κειέηεο ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο κέζσ κηθξνζπζηνηρηψλ DNA. Πην αλαιπηηθά ΔΒΚ ππέζηεζαλ θαηεπζπλφκελε δηαθνξνπνίεζε πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα κέζσ επηιεθηηθήο επαγσγήο ηνπ NGN3 (62) ζχκθσλα κε ην πξσηφθνιιν πνπ παξνπζηάδεηαη αλαιπηηθά ζηελ Δηθφλα 5. ηε ζπλέρεηα ζηα θχηηαξα απηά έγηλε κειέηε ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο κε κηθξνζπζηνηρίεο DNA. Σα δεδνκέλα απηψλ ησλ αλαιχζεσλ θαηέδεημαλ φηη ηα γνλίδηα πνπ απνηεινχλ πεηξακαηηθά επηβεβαησκέλνπο ζηφρνπο ηνπ NGN3 άιιαμαλ ηελ έθθξαζή ηνπο κέζα ζε ρξφλν σξψλ κεηά απφ ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 (62). Οη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ απηψλ απνηέιεζαλ αληηθείκελν ππνινγηζηηθήο αλάιπζεο κε ζηφρν ηελ επηβεβαίσζε ησλ γλσζηψλ ζέζεσλ θαη ησλ αιιεινπρηψλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3. Δπηπιένλ ηα δεδνκέλα ησλ ίδησλ κηθξνζπζηνηρηψλ ππέδεημαλ θαη έλα ζχλνιν γνληδίσλ ησλ νπνίσλ ηα επίπεδα έθθξαζεο άιιαμαλ ζεκαληηθά κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3. Σα γνλίδηα απηά 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 έδεηρλαλ είηε απμεκέλα είηε κεησκέλα επίπεδα έθθξαζεο, γεγνλφο πνπ ππνδειψλεη ηνλ άκεζν ή έκκεζν έιεγρν ηεο κεηαγξαθήο ηνπο απφ απηφλ ην κεηαγξαθηθφ παξάγνληα θαη γηαπηφ επηιέρζεθαλ λα αλαιπζνχλ ζηα πιαίζηα ηεο παξνχζαο βηνπιεξνθνξηθήο κειέηεο Δπηβεβαίωζε ηεο Αιιαγήο Έθθξαζεο Δπηιεγκέλωλ Γνληδίωλ κε Αιπζηδωηή Αληίδξαζε Πνιπκεξάζεο Πξνθεηκέλνπ λα επηβεβαησζεί ε ζπγθαηαζηνιή ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF κεηά απφ ηελ επαγσγή ηνπ NGN3, έγηλε απνκφλσζε νιηθνχ RNA θαη αιπζηδσηή αληίδξαζε πνιπκεξάζεο κε ρξήζε αληίζηξνθεο κεηαγξαθάζεο, RT-PCR 47

48 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) ζε πιεζπζκφ πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ αιιά θαη αλίρλεπζε mrna ζε επίπεδν ελφο θπηηάξνπ. Αθνινχζεζε ειεθηξνθφξεζε ησλ πξντφλησλ ησλ αληηδξάζεσλ PCR ζε πήθησκα αγαξφδεο φπνπ ζπγθξίζεθαλ ηα επίπεδα mrna γηα ηα γνλίδηα WISP1 θαη CTGF αλάκεζα ζηα θχηηαξα φπνπ είρε επαρζεί ν NGN3 θαη ζηα θχηηαξα πνπ δελ είρε επαρζεί. ε θάζε πεξίπησζε ρξεζηκνπνηήζεθαλ ηα επίπεδα mrna ηνπ ζπλερψο εθθξαδφκελνπ γνληδίνπ B-ACTIN (Beta Actin) σο κάξηπξεο. Πην ζπγθεθξηκέλα, ρξεζηκνπνηήζεθαλ θχηηαξα πνπ είραλ δηαθνξνπνηεζεί πξνο εκβξπηθά ζσκάηηα κεηά απφ επηιεθηηθή επαγσγή ηνπ NGN3 (62). ηα θχηηαξα απηά έγηλε θαηεξγαζία θαη απνκφλσζε νιηθνχ RNA ρξεζηκνπνηψληαο ην RNeasy kit (Qiagen) ζχκθσλα κε ηηο νδεγίεο ηνπ θαηαζθεπαζηή. ηε ζπλέρεηα αθνινχζεζε πέςε κε δεζνμπξηβνλνπθιεάζε (DNase Promega) πξνθεηκέλνπ λα γίλεη απνκάθξπλζε ηνπ DNA. Αθνινχζεζε κεηαηξνπή ηνπ RNA ζε cdna κε ρξήζε αληίζηξνθεο κεηαγξαθάζεο (Superscript II reverse transcriptase Invitrogen) θαη ηπραίσλ εθθηλεηψλ. Ζ ζχλζεζε ηνπ cdna έγηλε κε θχθινπο ζηηο αθφινπζεο ζπλζήθεο: απνδηάηαμε ζηνπο 94 C γηα 30s, αλφπηεζε ζηνπο C γηα 60s θαη πνιπκεξηζκφο ζηνπο 72 C γηα 60s. Γηα ηηο RT-PCR αληηδξάζεηο ζε επίπεδν ελφο θπηηάξνπ, ηα θχηηαξα απνκνλψζεθαλ ζε κηθξνρεηξηζηή κε ηε βνήζεηα κηθξνπηπέηαο θαη κεηαθέξζεθαλ ζε 20κl εηδηθνχ ξπζκηζηηθνχ δηαιχκαηνο πξηλ απνζεθεπηνχλ ζε μεξφ πάγν. Γηα ηελ απνκφλσζε RNA θαη ηε ζχλζεζε cdna ρξεζηκνπνηήζεθε ην ΟneStep RT-PCR Kit (Qiagen) αθνινπζψληαο ηηο νδεγίεο ηνπ θαηαζθεπαζηή. ηε ζπλέρεηα ην πεξηερφκελν θάζε ζσιήλα Eppendorf κνηξάζηεθε ζηα δχν θαη αθνινχζεζε αληίζηξνθε κεηαγξαθή θαη ζηε ζπλέρεηα 40 θχθινη αιπζηδσηήο αληίδξαζεο πνιπκεξάζεο (PCR) ρξεζηκνπνηψληαο εηδηθνχο εθθηλεηέο γηα ηα γνλίδηα WISP1 θαη NGN3 ζην κηζφ δείγκα απφ θάζε θχηηαξν θαη γηα ηα γνλίδηα CTGF θαη NGN3 ζην ππφινηπν κηζφ. Όινη νη εθθηλεηέο ζρεδηάζηεθαλ ζηα ζεκεία έλσζεο εζσλίσλ-εμσλίσλ κε ηε βνήζεηα ηνπ ινγηζκηθνχ MacVector (99). Ζ εμνκάιπλζε ησλ ζπλζεθψλ ησλ PCR έγηλε ρξεζηκνπνηψληαο νιηθφ RNA απφ έκβξπν πνληηθνχ ζην ζηάδην 10.5 εκεξψλ κεηά ηε ζχιιεςε (dpc). Οη εθθηλεηέο, λνεκαηηθνί (forward) θαη αληηλνεκαηηθνί (reverse) θαη νη ζεξκνθξαζίεο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηηο PCR ηνπ θάζε γνληδίνπ δίλνληαη ζηνλ Πίλαθα 2. 48

49 Πίλαθαο 2: Οη εθθηλεηέο θαη νη ζεξκνθξαζίεο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηηο RT- PCR αληηδξάζεηο. Σα πξντφληα ησλ PCR αληηδξάζεσλ αλαιχζεθαλ πεξαηηέξσ κε ειεθηξνθφξεζε ζε πήθησκα αγαξφδεο πξνθεηκέλνπ λα ζπγθξηζνχλ ηα επίπεδα mrna γηα ηα δχν γνλίδηα ζε θχηηαξα φπνπ είρε πξνεγεζεί επαγσγή ηεο έθθξαζεο ηνπ NGN3 ζε ζρέζε κε θχηηαξα φπνπ ν NGN3 δελ είρε εθθξαζηεί. Παξάιιεια ηα επίπεδα mrna ηνπ ζπλερψο εθθξαδφκελνπ γνληδίνπ B-ACTIN εμεηάζηεθαλ σο κάξηπξεο πλνπηηθή Παξνπζίαζε ηεο In Silico Αλάιπζεο ηωλ Ρπζκηζηηθώλ Πεξηνρώλ ηωλ Γνληδίωλ Οη ξπζκηζηηθέο αιιεινπρίεο ησλ γνληδίσλ πνπ επηιέρζεθαλ κε βάζε ηα απνηειέζκαηα ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ αλαιχζεθαλ ζε ηξεηο θάζεηο. ηελ πξψηε θάζε αλαιχζεθαλ ηα γνλίδηα IA1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2, πνπ απνηεινχλ γλσζηνχο, απφ πξνεγνχκελεο κειέηεο, ζηφρνπο ηνπ NGN3, ησλ νπνίσλ ε έθθξαζε έδεημε λα απμάλεηαη ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 (62). ηα γνλίδηα απηά αλαδεηήζεθαλ νη γλσζηέο ζέζεηο θαζψο θαη νη αιιεινπρίεο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 ζην DNA θαη ζπγθξίζεθαλ κε ηα ζρεηηθά πεηξακαηηθά δεδνκέλα πνπ έρνπλ δεκνζηεπζεί. Με ηελ επηβεβαίσζε ησλ πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλσλ ζέζεσλ θαη αιιεινπρηψλ πξφζδεζεο θαζνξίζηεθαλ νη παξάκεηξνη θαη ηα θαηψθιηα ηεο κεζφδνπ πνπ πξέπεη λα ρξεζηκνπνηνχληαη ψζηε λα ιακβάλνληαη αμηφπηζηα απνηειέζκαηα. ην δεχηεξν ζηάδην αλαιχζεθαλ δχν ζπγθαηαζηειιφκελα γνλίδηα απφ ηνλ NGN3. Πξφθεηηαη γηα ηα γνλίδηα WISP1 θαη CTGF ησλ νπνίσλ ε έθθξαζε 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 κεηψζεθε ζεκαληηθά (62). Έγηλε, ινηπφλ, πξνζπάζεηα λα εμεγεζεί ε απφ θνηλνχ ξχζκηζε ηεο έθθξαζεο ησλ δχν γνληδίσλ απφ ηνλ NGN3. 49

50 Με ζηφρν λα εηζαρζνχλ κηα ζεηξά απφ θίιηξα ζηε κέζνδν πνπ εθαξκφζηεθε αλαιχζεθε θαη ην γνλίδην WNT5. Σν WNT5 έρεη ζε πνιιά είδε νξγαληζκψλ δχν παξάινγα, εθ ησλ νπνίσλ, κε βάζε ηα δεδνκέλα κηθξνζπζηνηρηψλ απφ πνληηθφ, κφλνλ ην έλα αιιάδεη ηα επίπεδα κεηαγξαθήο ηνπ ππφ ηελ επίδξαζε ηνπ NGN3. Δπηπξνζζέησο, πξνεγνχκελεο εξγαζίεο έρνπλ θαηαδείμεη πεηξακαηηθά πσο δηαθνξεηηθά παξάινγα απηνχ ηνπ γνληδίνπ δηαδξακαηίδνπλ ηνλ ίδην ξφιν θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο ζε δηαθνξεηηθνχο νξγαληζκνχο πξφηππα. Έηζη ζηα WNT5 γνλίδηα αλαδεηήζεθαλ ξπζκηζηηθά ζηνηρεία θαη έγηλε πξνζπάζεηα ζπζρεηηζκνχ ηεο παξνπζίαο ηνπο κε ην βηνινγηθφ ξφιν ηνπ αληίζηνηρνπ παξαιφγνπ θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε. Με άιια ιφγηα έγηλε ιεηηνπξγηθή ζχλδεζε ηνπ εληνπηζκνχ κηαο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο, φπνπ o NGN3 πξνζδέλεηαη απφ θνηλνχ καδί κε ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ HNF1, HNF6, PDX1, BRNF θαη LEFF, κε ηε ζπκκεηνρή ηνπ ζρεηηθνχ γνληδίνπ ζηε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο. ηελ ηξίηε θάζε αλαιχζεθαλ ηα γνλίδηα πνπ, ζχκθσλα κε ηα δεδνκέλα ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ, είηε επάγνληαη είηε θαηαζηέιινληαη ζεκαληηθά 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 (62). Σα ζπγθεθξηκέλα γνλίδηα ζεσξνχληαη επνκέλσο πηζαλνί, σζηφζν φκσο κε επηβεβαησκέλνη πεηξακαηηθά, ζηφρνη ηνπ NGN3. ηα γνλίδηα απηά αλαδεηήζεθαλ επίζεο θνηλά ξπζκηζηηθά ζηνηρεία, ελψ παξάιιεια δηεξεπλήζεθαλ νη δηαθνξέο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ αλάκεζα ζηα επαγφκελα θαη ζηα θαηαζηειιφκελα γνλίδηα. ηηο ηξεηο απηέο θάζεηο ε δηαδηθαζία αλάιπζεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ήηαλ θνηλή γηα φια ηα γνληδηαθά ζχλνια θαη ππνδεηθλχεηαη ζρεκαηηθά ζηελ Δηθφλα 10. Όπσο θαίλεηαη ζηελ Δηθφλα 10, ην πξψην βήκα ηεο in silico δηαδηθαζίαο ήηαλ ε αλαδήηεζε ησλ νξζνιφγσλ γηα ην θάζε γνλίδην, ησλ νπνίσλ ζηε ζπλέρεηα ζπιιέρζεθαλ νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο. Σα νξζφινγα αλαδεηήζεθαλ ζε κηα πιεηάδα νξγαληζκψλ πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο θαη πνπ ε εκβξπηθή ηνπο αλάπηπμε γίλεηαη κέζα απφ παξφκνηεο δηαδηθαζίεο κε απηέο ησλ ζειαζηηθψλ. Σα θπινγελεηηθά παιαηφηεξα είδε ζπνλδπισηψλ πνπ πιεξνχλ απηά ηα θξηηήξηα αλήθνπλ ζηελ νκνηαμία ησλ ςαξηψλ. Ο αξηζκφο ησλ εηδψλ, ησλ νπνίσλ αλαιχζεθαλ ηα νξζφινγα πεξηνξίζηεθε ζηα δέθα, εθηφο απφ θάπνηεο πεξηπηψζεηο νξγαληζκψλ πνπ εκθάληδαλ ηδηαίηεξν ελδηαθέξνλ γηα θάπνηα γνλίδηα θαη αλαιχζεθαλ επηπξνζζέησο. Οη επηζηεκνληθή θαη θνηλή νλνκαζία ησλ εηδψλ γηα ηα νπνία αλαγλσξίζηεθαλ νξζφινγα παξαηίζεληαη ζηνλ Πίλαθα 1 ηνπ Παξαηήκαηνο. Γηα ηα ππφινηπα είδε, παξφιν πνπ βξέζεθαλ νξζφινγα, δελ αλαιχζεθαλ νη ξπζκηζηηθέο 50

51 πεξηνρέο ηνπο θαζψο επηδείθλπαλ πεξηζζφηεξν απφ 90% νκνηφηεηα κεηαμχ ηνπο ζε ηνπιάρηζηνλ 75% ηνπ κήθνπο ηεο κηθξφηεξεο αθνινπζίαο κε θίλδπλν ε πξνζζήθε ηνπο ζην ζχλνιν ησλ αθνινπζηψλ πξνο αλάιπζε λα δηαηάξαζζε ηελ αμηνπηζηία ησλ απνηειεζκάησλ. Οη γνληδηαθέο πεξηνρέο πνπ ζπιιέρζεθαλ θαη αλαιχζεθαλ εθηείλνληαλ ζε θάζε πεξίπησζε bp αλνδηθά ηνπ TSS έσο θαη bp θαζνδηθά απηνχ, φπνπ θαη αλαδεηήζεθαλ πηζαλέο ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ (ΣFBS-Transcription Factor Binding Sites). ηε ζπλέρεηα επηιέρζεθαλ κφλν νη ΣFBS πνπ ήηαλ θνηλέο ζε φια ηα νξζφινγα θάζε γνληδίνπ. Ζ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ αθνινπζηψλ έγηλε ζηνλ δηθηπαθφ ηφπν ηεο Genomatix Database (100), φπνπ αλαδεηήζεθαλ θαη ζχλνια απφ TFBS πεξηζζφηεξσλ ησλ δχν κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Σέηνηα ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζηελ παξνχζα εξγαζία αλαθέξνληαη θαη σο «πξφηππα». Γηα ηελ αλαδήηεζε ησλ ζπκπιφθσλ ζέζακε σο θξηηήξην ηελ ζπληήξεζε ζε φζν ην δπλαηφλ πεξηζζφηεξεο νξζφινγεο αθνινπζίεο θάζε γνληδίνπ. Δπίζεο, ιακβάλνληαο ππ φςηλ ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα πνπ ππνδεηθλχνπλ ηα γνλίδηα ηεο πξψηεο θάζεο σο άκεζνπο ζηφρνπο ηνπ NGN3, ηα πξφηππα πνπ αλαδεηήζεθαλ επηιέρζεθαλ κε πξφζζεηε απαίηεζε ην ζπλεληνπηζκφ ελφο ηνπιάρηζηνλ απφ ηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο NGN1 ή NGN3 (NGN1/3) καδί κε άιινπο παξάγνληεο. Oη παξάγνληεο NGN1 θαη NGN3 αλήθνπλ ζηελ νηθνγέλεηα NEUR θαη έρνπλ θνηλφ PWM ζηελ πιαηθφξκα ησλ αλαιχζεσλ, έηζη ψζηε φηαλ ην πξφγξακκα θάλεη ηελ πξφβιεςε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζήο ηνπο δε δηαθξίλεη ηηο ζέζεηο αλαθνξηθά κε ην αλ πξνζδέλνπλ ηνλ έλαλ ή ηνλ άιινλ παξάγνληα. Αλάκεζα ζηα πξφηππα πνπ πξνέθπςαλ επηιέρζεθε ην πξφηππν κε ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ PDX1- BRNF-NEUR, πνπ παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 10. Ζ επηινγή ηνπ πξνηχπνπ PDX1-BRNF-NEUR έγηλε ιφγσ ηεο κεγάιεο βηνινγηθήο ζεκαζίαο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ ην απαξηίδνπλ γηα ηηο δηαδηθαζίεο δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο, αιιά θαη ιφγσ ηεο πςειήο ζπληήξεζήο ηνπ ζε πνιιά νξζφινγα φισλ ησλ γνληδίσλ ησλ πξψησλ δχν θάζεσλ. Σν πξφηππν απηφ απνηειείηαη απφ ηξεηο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο εθ ησλ νπνίσλ ν έλαο είλαη ν NGN1/3, πνπ ηέζεθε σο πξναπαίηεζε. Έρνληαο πιένλ επηιέμεη ην πξφηππν PDX1-BRNF-NEUR έγηλε αλαδήηεζή ηνπ ζηα νξζφινγα φισλ ησλ γνληδίσλ πξνο αλάιπζε. ηε ζπλέρεηα αλαδεηήζεθαλ TFBS θαη πξφζζεησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, πέξα απφ ηνπο ηξεηο ηνπ 51

52 αξρηθνχ ζπκπιφθνπ, πνπ βξίζθνληαλ πιεζίνλ ηεο πεξηνρή ηνπ πξνηχπνπ γηα φια ηα γνλίδηα ηεο παξνχζαο εξγαζίαο. Δηθφλα 10: ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ηεο in silico αλάιπζεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ. 52

53 3.2 Δμφξπμε ηνηρείσλ απφ Γηεζλείο Βάζεηο Γεδνκέλσλ Ζ αλεχξεζε ησλ πξσηετληθψλ δνκψλ έγηλε ζηελ πξσηνγελή βάζε PDB (Protein Data Bank) (101). Ζ PDB πεξηιακβάλεη φιεο ηηο πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλεο κε θξπζηαιινγξαθία πεξίζιαζεο αθηίλσλ Υ ή κε θαζκαηνζθνπία NMR, ηξηζδηάζηαηεο δνκέο πξσηετλψλ, λνπθιετθψλ νμέσλ, πδαηαλζξάθσλ θαη πνηθίισλ άιισλ ζπκπιφθσλ. Ζ αλαγλψξηζε ησλ επηκέξνπο δνκηθψλ πεξηνρψλ ησλ πξσηετλψλ έγηλε ζηελ PFAM (102) θαη ζηε βάζε δεδνκέλσλ ExPASy, φπνπ κε ην εξγαιείν-prosite (103) γίλεηαη ε θαηάηαμε κηαο πξσηεΐλεο ζε κία νηθνγέλεηα κε βάζε ηηο επηκέξνπο δνκηθέο πεξηνρέο ηνπ κνξίνπ ηεο. Δπηθνπξηθά γηα θάπνηεο πξσηεΐλεο ε αλαδήηεζε δνκηθψλ πεξηνρψλ έγηλε θαη κε ην εξγαιείν ExPASy SMART (104). Οη αλαδεηήζεηο ησλ νξζνιφγσλ θαη ε εμαγσγή ησλ γνληδηαθψλ πεξηνρψλ πνπ αλαιχζεθαλ έγηλαλ ζηνπο ηζηνηφπνπο ησλ βάζεσλ δεδνκέλσλ NCBI (105) θαη Ensembl (106). ηε δεχηεξε βάζε δεδνκέλσλ έγηλε θαη ε αλαδήηεζε ησλ ζπληεληψλ. Όπνπ ρξεηάζηεθε λα γίλεη δηεξεχλεζε ησλ πνιπκνξθηζκψλ ηνπ ελφο θαηαινίπνπ ζηηο αθνινπζίεο καο, έγηλε κε ηνλ θαηάιιειν ηχπν ηνπ αιγφξηζκνπ BLAST (Basic Local Alignment Tool) (107). Γηα ηηο πεξηπηψζεηο ησλ γνληδίσλ πνπ δηεξεπλήζεθε ην πξφηππν έθθξαζήο ηνπο ρξεζηκνπνηήζεθαλ δεδνκέλα γνληδηαθήο έθθξαζεο απφ ηνπο ηζηνηφπνπο ησλ βάζεσλ δεδνκέλσλ GeneCards V3 (108) θαη GEO (109). 3.3 Αλεχξεζε Οξζνιφγσλ. Ο Αιγφξηζκνο BLAST ηελ παξνχζα εξγαζία ρξεζηκνπνηήζεθε ην πξφγξακκα BLAST κέζα απ ηνπο δηθηπαθνχο ηφπνπο ησλ βάζεσλ NCBI (105) θαη Ensembl (106) πξνθεηκέλνπ λα αλαδεηεζνχλ ηα νξζφινγα ησλ πξνο αλάιπζε γνληδίσλ κε ηελ κέζνδν ηνπ βέιηηζηνπ BLAST (110, 111). To ινγηζκηθφ BLAST απνηειεί κηα κέζνδν εχξεζεο νκνηνηήησλ κεηαμχ αθνινπζηψλ. Πην ζπγθεθξηκέλα, ν αιγφξηζκνο δέρεηαη σο είζνδν κηα αιιεινπρία (επεξψηεζε) απφ ην ρξήζηε θαη ηε ζπγθξίλεη κε ην ζχλνιν ησλ αιιεινπρηψλ κηαο νιφθιεξεο βάζεο δεδνκέλσλ. Ζ ζχγθξηζε γίλεηαη κε ηνπηθή ζηνίρηζε ηεο αιιεινπρίαο-επεξψηεζεο κε φιεο ηηο αιιεινπρίεο κηαο βάζεο δεδνκέλσλ θαη ηα απνηειέζκαηα ησλ ζηνηρίζεσλ πξνβάιινληαη σο έμνδνο. Βαζηθή αξρή ιεηηνπξγίαο ηνπ αιγνξίζκνπ απνηειεί ε εχξεζε ελφο αξηζκνχ βέιηηζησλ ζηνηρίζεσλ κηθξψλ 53

54 πεξηνρψλ ησλ αιιεινπρηψλ φπνπ ε βαζκνινγία ηνπο είλαη κεγαιχηεξε απφ κηα πξνθαζνξηζκέλε ηηκή (θαηψθιη). Οη πεξηνρέο απηέο έρνπλ ηππηθφ κήθνο ηξηψλ θαηαινίπσλ γηα πξσηετληθέο θαη 28 θαηαινίπσλ γηα λνπθιενηηδηθέο αιιεινπρίεο θαη ζεσξνχληαη ηδαληθά ζεκεία έλαξμεο πεξαηηέξσ ζηνηρίζεσλ ησλ γεηηνληθψλ ηνπο πεξηνρψλ θαη πξνο ηηο δχν θαηεπζχλζεηο κε ζηφρν λέεο ζηνηρίζεηο κε θαιχηεξε βαζκνινγία. Οη αιιεινπρίεο εηζφδνπ θαη εμφδνπ ηνπ αιγνξίζκνπ BLAST βξίζθνληαη ζηε κνξθή Fasta ή Raw Format. Σα απνηειέζκαηα εμφδνπ αμηνινγνχληαη κε βάζε δχν παξακέηξνπο: αθελφο ην βαζκφ νκνηφηεηαο ησλ αιιεινπρηψλ-απνηειεζκάησλ κε ηελ αιιεινπρία-επεξψηεκα θαη αθεηέξνπ ηελ πηζαλφηεηα ε νκνηφηεηα απηή λα έρεη πξνθχςεη ηπραία. Απηή ε ηειεπηαία εθθξάδεηαη κε ηελ παξάκεηξν P-value (Probability value) φπσο πξνθχπηεη απφ ηνλ ηχπν p = 1 - e -E. Σν Δ (Exact value) ππνινγίδεηαη ζπλαξηήζεη ηεο νκνηφηεηαο ησλ δχν αιιεινπρηψλ (επεξψηεκα θαη απνηέιεζκα) θαη ηνπ αξηζκνχ ησλ θαηαινίπσλ (κήθνο αιιεινπρηψλ) ζχκθσλα κε ηνλ ηχπν E = Kmn e -ls, φπνπ l, K = Karlin Altschul ζηαζεξέο, m, n = ηα κήθε ησλ αιιεινπρηψλ θαη S ε βαζκνινγία (Score) ηεο ζηνίρηζεο, φπσο ππνινγίδεηαη απφ ηνλ αξηζκφ ησλ φκνησλ θαη ηαπηφζεκσλ θαηαινίπσλ θαζψο θαη ηνλ αξηζκφ ησλ θαηαινίπσλ πνπ δε ζηνηρίδνληαη θαιά ή αθήλνπλ θελά ζηε ζηνίρηζε (79). Πξνθεηκέλνπ λα αλαγλσξηζηνχλ ηα νξζφινγα γηα θάζε γνλίδην πνπ κειεηήζεθε ρξεζηκνπνηήζεθε σο αιιεινπρία-επεξψηεκα ε πξσηεΐλε ηνπ πνληηθνχ (M. Musculus), ε νπνία θαη ζπγθξίζεθε θάζε θνξά έλαληη φισλ ησλ θαηαρσξεκέλσλ πξσηετλψλ (BLASTP) απφ ηνλ νξγαληζκφ φπνπ αλαδεηήζεθε ην νξζφινγν γνλίδην. ηε ζπλέρεηα, ε πξσηετληθή αιιεινπρία ηνπ νξγαληζκνχ απηνχ κε ηε κεγαιχηεξε νκνηφηεηα σο πξνο ηελ πξσηεΐλε-επεξψηεκα ζπγθξίζεθε αληίζηξνθα (rblastp) κε ηηο θαηαρσξεκέλεο πξσηεΐλεο ηνπ πνληηθνχ. Δθφζνλ νη δχν αληίζηξνθεο δηαδηθαζίεο BLASTP θαη rblastp ππέδεημαλ κνλνζήκαληε νκνηφηεηα κεηαμχ ησλ δχν πξσηετλψλ, νη δχν πξσηεΐλεο ραξαθηεξίζηεθαλ νξζφινγεο κε ηε ινγηθή φηη νκνηάδνπλ κεηαμχ ηνπο θαη κφλν κεηαμχ ηνπο. Ζ φιε δηαδηθαζία ππνδεηθλχεηαη ζρεκαηηθά ζηελ Δηθφλα 11. ε θάζε αλαδήηεζε επηιέρζεθε ν νξγαληζκφο ηνπ νπνίνπ ην νξζφινγν αλαδεηήζεθε. Οη ππφινηπεο παξάκεηξνη ηνπ πξνγξάκκαηνο BLAST παξέκελαλ ζηηο πξνεπηιεγκέλεο ηηκέο ζρεηηθά κε ην επηηξεπηφ Δ-value, ην κέγεζνο ηεο αξρηθήο ηνπηθήο ζηνίρηζεο (Word size) θαη ηνλ πίλαθα αληηθαηάζηαζεο γηα ζηνίρηζε πξσηετληθψλ αιιεινπρηψλ (π.ρ. BLOSUM -BLOck SUbstitution Matrix- 62) (79). 54

55 Ζ κέζνδνο πνπ πεξηγξάθεθε νλνκάδεηαη κέζνδνο ηνπ αληίζηξνθνπ βέιηηζηνπ BLAST. ε πεξηπηψζεηο φπνπ ν ηχπνο BLASTP δελ έδσζε ηθαλνπνηεηηθά απνηειέζκαηα, έγηλε ρξήζε άιισλ ηχπσλ BLAST φπσο BLASTΝ, tblastν θαη BLASTX. Πξφθεηηαη απιά γηα παξαιιαγέο ηνπ ίδηνπ αιγνξίζκνπ πνπ δηαθέξνπλ σο πξνο ην είδνο ησλ αιιεινπρηψλ πνπ ζπγθξίλνληαη. Έηζη ελψ κε ην BLASTP ε αιιεινπρία-επεξψηεκα θαη νη αιιεινπρίεο ηεο βάζεο δεδνκέλσλ κε ηηο νπνίεο ζπγθξίλνληαη είλαη ακηλνμηθέο, ζηελ πεξίπησζε ηνπ BLASTN είλαη λνπθιενηηδηθέο. Με ηνλ ηχπν tblastn ε πξσηεΐλε επεξψηεκα ζπγθξίλεηαη κε κηα βάζε δεδνκέλσλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ πνπ πξνεγνπκέλσο έρνπλ κεηαθξαζηεί. Σέινο κε ην πξφγξακκα BLASTX ε λνπθιενηηδηθή αιιεινπρία-επεξψηεκα κεηαθξάδεηαη απηφκαηα ζηα έμη δπλαηά πιαίζηα αλάγλσζεο θαη ζπγθξίλεηαη κε ηηο ακηλνμηθέο αιιεινπρίεο κηαο βάζεο δεδνκέλσλ (79). ηελ εξγαζία απηή αλεμάξηεηα απφ ηνλ ηχπν ηνπ BLAST πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε, ζε θάζε πεξίπησζε ε αιιεινπρία-επεξψηεκα ζπγθξίζεθε κε ηηο αιιεινπρίεο πνπ ππήξραλ ζηελ βάζε δεδνκέλσλ NR (Non-Redundant), πνπ πεξηέρεη φιεο ηηο αιιεινπρίεο ηεο βάζεο δεδνκέλσλ GenBank θαη είλαη απαιιαγκέλε απφ ηηο φπνηεο πηζαλέο επηθαιχςεηο κεηαμχ ησλ αιιεινπρηψλ. Δλαιιαθηηθά, πξνθεηκέλνπ λα πεξηνξηζηεί ν αξηζκφο ησλ απνηειεζκάησλ ηνπ αιγνξίζκνπ, νη αλαδεηήζεηο γίλνληαη ρξεζηκνπνηψληαο ηελ βάζε refseq φπνπ πεξηιακβάλνληαη κφλν νη θσδηθνπνηνχζεο πεξηνρέο ησλ γνληδησκάησλ. Απφ ηελ άιιε πιεπξά ε βάζε EST (Expressed Sequence Tags) πεξηέρεη κφλν κεξηθέο αιιεινπρίεο πνπ αληηζηνηρνχλ ζε mrna εθθξαδφκελσλ γνληδίσλ, ελψ ε Swissprot πεξηέρεη κφλν πξσηετληθέο αθνινπζίεο ζπλνδεπφκελεο απφ πιήξε ζρνιηαζκφ σο πξνο ηε ιεηηνπξγία ηνπο, ηηο ζπληεξεκέλεο πεξηνρέο ηνπο θαη ηηο κεηακεηαθξαζηηθέο ηξνπνπνηήζεηο ηνπο (79). 55

56 Δηθφλα 11: Γηάγξακκα ξνήο πνπ πεξηγξάθεη ηε δηαδηθαζία ηνπ βέιηηζηνπ BLAST. 3.4 ηνίρηζε Ννπθιενηηδηθψλ θαη Ακηλνμηθψλ Αιιεινπρηψλ ηελ παξνχζα εξγαζία, έγηλαλ κε ζηνηρίζεηο, πνιιαπιέο θαη θαηά δεχγε, ζπγθξίζεηο κεηαμχ αιιεινπρηψλ πξνθεηκέλνπ λα εμεηαζηεί ν βαζκφο νκνηφηεηαο, λα απνθαιπθζεί ε πηζαλή νκνινγία ηνπο, λα αλαδεηεζνχλ δνκηθέο ιεηηνπξγηθέο πεξηνρέο ή θαη λα δηεξεπλεζνχλ νη θπινγελεηηθέο ηνπο ζρέζεηο. ε θάζε πεξίπησζε κέζσ ηεο ζηνίρηζεο ησλ αιιεινπρηψλ επηδηψρζεθε λα απνθαιπθζεί ε πίεζε ηεο κνξηαθήο εμέιημεο πάλσ ζηηο αιιεινπρίεο πνπ ζπγθξίζεθαλ. Οη φπνηεο αιιαγέο ζηα θαηάινηπα ηεο θνηλήο πξνγνληθήο αιιεινπρίαο αληηζηνηρνχζαλ ζε θαθνδεπγαξσκέλα θαηάινηπα θαηά ηε ζηνίρηζε ή αθφκε θαη ζε θαηάινηπα πνπ δελ ζηνηρίδνληαλ καδί θαη άθελαλ θελφ κεηαμχ ηνπο. Σα θελά ηνπνζεηνχληαλ ζε κηα ζηνίρηζε κε ζηφρν ηε βέιηηζηε ζηνίρηζε ησλ γεηηνληθψλ πεξηνρψλ. Κάζε ζηνίρηζε βαζκνινγήζεθε κε βάζε ηα θελά αιιά θαη ηα θαθνδεπγαξσκέλα θαηάινηπα ρξεζηκνπνηψληαο έλα πξνθαζνξηζκέλν ζχζηεκα βαζκνλφκεζεο. Καηά ηε ζηνίρηζε 56

57 νη αθνινπζίεο κε κεγάιε νκνηφηεηα κεηαμχ ηνπο ζηαζκίδνληαλ θαη ηνπνζεηνχληαλ θελά επηιεθηηθά ζηηο ζέζεηο ησλ θαηαινίπσλ πνπ δελ κπνξνχζαλ λα ζηνηρηζηνχλ. Σν πξφγξακκα ζηνίρηζεο αλέζεηε βαζκηαίεο πνηλέο θελψλ. Γηα παξάδεηγκα έλα θελφ απνκνλσκέλν δερφηαλ πςειφηεξε πνηλή ζε ζρέζε κε έλα άιιν πνπ βξηζθφηαλ δίπια ζε θάπνην άιιν θελφ. Πξαγκαηνπνηήζεθαλ ηνπηθέο (local) θαη νιηθέο (global) ζηνηρίζεηο. ηελ πξψηε πεξίπησζε επηιέγνληαλ νη ππνπεξηνρέο ησλ αιιεινπρηψλ πνπ ζηνηρίδνληαλ ζηηο νπνίεο εκθαληδφηαλ κεγαιχηεξε νκνηφηεηα θαηαινίπσλ θαη ε ζηνίρηζε γηλφηαλ γχξσ απφ απηά ηα θέληξα. ηελ πεξίπησζε ηεο νιηθήο ζηνίρηζεο νη αιιεινπρίεο ζηνηρίδνληαλ ζε φιν ηνπο ην κήθνο ακεξφιεπηα θαη ζηφρνο ήηαλ ε απνθάιπςε ηεο ζπλνιηθήο νκνηφηεηαο ησλ αιιεινπρηψλ. Ζ ηνπηθή ζηνίρηζε θάλεθε ηδηαίηεξα ρξήζηκε γηα ηε ζχγθξηζε αιιεινπρηψλ δηαθνξεηηθνχ κήθνπο ή αιιεινπρηψλ πνπ έρνπλ απνθιίλεη εμειηθηηθά ζεκαληηθά ή αθφκε θαη γηα ηελ απνθάιπςε δνκηθψλ ιεηηνπξγηθψλ πεξηνρψλ. Ζ νιηθή ζηνίρηζε βαζίδεηαη ζηνλ αιγφξηζκν Needleman-Wunsch (79), ν νπνίνο γεληθφηεξα ρξεζηκνπνηεί έλαλ πίλαθα βαζκνινγηψλ γηα φιεο ηηο δπλαηέο επηκέξνπο ζηνηρίζεηο ησλ αιιεινπρηψλ. Απφ ηελ άιιε πιεπξά ε ηνπηθή ζηνίρηζε ζηεξίδεηαη ζηνλ αιγφξηζκν Smith-Waterman (79). Δπεηδή άιινηε ε ηνπηθή θαη άιινηε ε νιηθή ζηνίρηζε είλαη θαηαιιειφηεξεο ψζηε λα απνδψζνπλ ηελ νκνηφηεηα ησλ αιιεινπρηψλ, έρνπλ αλαπηπρζεί αιγφξηζκνη δπλακηθνχ πξνγξακκαηηζκνχ, νη νπνίνη αλαδεηνχλ ηε καζεκαηηθά βέιηηζηε ιχζε ηνπ πξνβιήκαηνο ζηνίρηζεο δχν αιιεινπρηψλ γηα ζπγθεθξηκέλν ζχζηεκα βαζκνλφκεζεο. Ο αιγφξηζκνο BLAST πνπ αλαιχζεθε πξνεγνπκέλσο απνηειεί επξεηηθφ αιγφξηζκν πνπ, ζπζηάδνληαο έλα κέξνο ηεο επαηζζεζίαο ελφο αιγφξηζκνπ δπλακηθνχ πξνγξακκαηηζκνχ, επηηαρχλεη ηε δηαδηθαζία εχξεζεο ιχζεο πεξηνξηδφκελνο ζε θάπνηεο κφλν πεξηνρέο ηνπ πίλαθα δπλακηθνχ πξνγξακκαηηζκνχ, φπνπ αλακέλνληαη νη πςειφηεξεο βαζκνινγίεο ηεο ζηνίρηζεο. Έηζη ινηπφλ ν αιγφξηζκνο BLAST πξαγκαηνπνηεί ηαρχηαηε ζηνίρηζε αιιεινπρηψλ βαζηδφκελνο ζηελ εχξεζε κηθξψλ πεξηνρψλ νκνηφηεηαο ηηο νπνίεο επεθηείλεη κε ρξήζε δπλακηθνχ πξνγξακκαηηζκνχ (79). ηελ παξνχζα εξγαζία νη ζηνηρίζεηο πξαγκαηνπνηήζεθαλ κε ηα ινγηζκηθά παθέηα CLUSTALW (112) θαη Muscle3.6 (113) θαη ε παξνπζίαζε ηεο ζηνίρηζεο θάζε θνξά έγηλε κε ηε βνήζεηα ηνπ πξνγξάκκαηνο Bioedit (114). 57

58 3.5 Καηαζθεπή Φπινγελεηηθψλ Γέλδξσλ Ζ θπινγελεηηθή αλάιπζε απνηειεί κέζν δηεξεχλεζεο ηεο εμειηθηηθήο πνξείαο ησλ γνληδησκάησλ. Υξεζηκνπνηείηαη ζηελ εμειηθηηθή βηνινγία, ζε επηδεκηνινγηθέο κειέηεο θαη κειέηεο βηνπνηθηιφηεηαο θαζψο επίζεο θαη ζε κειέηεο θαξκαθνινγίαο. ηελ παξνχζα εξγαζία ε θπινγελεηηθή αλάιπζε ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ εληάρζεθε ζηε γεληθή παξαδνρή πσο νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδησκάησλ εκθαλίδνληαη γεληθά πην ζπληεξεκέλεο εμειηθηηθά απφ ηηο ππφινηπεο ιφγσ ηεο ιεηηνπξγηθήο ηνπο ζεκαζίαο. Ζ δηεμαρζείζα αλάιπζε ζηεξίρζεθε ζηηο πνιιαπιέο ζηνηρίζεηο ηφζν ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ φζν θαη ησλ ακηλνμηθψλ αιιεινπρηψλ πνπ θσδηθνπνηνχληαη απφ απηά θαη ζηελ θαηαζθεπή ησλ ζρεηηθψλ θπινγελεηηθψλ δέλδξσλ. Μέζσ κηαο πνιιαπιήο ζηνίρηζεο κπνξεί θαλείο λα ζπκπεξάλεη ηελ εμειηθηηθή ηζηνξία ησλ αθνινπζηψλ απφ ηνλ αξηζκφ θαη ηηο ζέζεηο ησλ θαηαινίπσλ πνπ εκθαλίδνληαη αιιαγκέλα ιφγσ κεηαιιάμεσλ. Δπίζεο κπνξεί λα ζπκπεξάλεη ηηο πεξηνρέο ησλ αιιεινπρηψλ πνπ επηηεινχλ ζεκαληηθφ ξφιν θαη σο εθ ηνχηνπ είλαη ιηγφηεξν επηδεθηηθέο ζε κεηαιιάμεηο. Σα πξφηππα αληηθαηάζηαζεο ησλ θαηαινίπσλ ζηηο αθνινπζίεο επεξεάδνπλ ζεκαληηθά ηελ θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέλδξσλ. ηεξίδνληαη δε ζηελ ππφζεζε πσο ε εμέιημε είλαη κηα ηπραία δηαδηθαζία πνπ πεξηιακβάλεη κεηαπηψζεηο θαη κεηαζηξνθέο λνπθιενηηδίσλ θαη αληηθαηαζηάζεηο ακηλνμέσλ ζηηο αθνινπζίεο. Ο ξπζκφο αληηθαηάζηαζεο ησλ θαηαινίπσλ εκθαλίδεηαη σο πίλαθαο 4Υ4 ζηελ πεξίπησζε ησλ λνπθενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ θαη σο πίλαθαο 20Υ20 ζηελ πεξίπησζε ησλ ακηλνμηθψλ αιιεινπρηψλ. Τπάξρνπλ ηα εμήο πξφηππα ξπζκψλ αληηθαηάζηαζεο λνπθιενηηδίσλ: ην πξφηππν Jukes Cantor, ην πξφηππν ΖΚΤ θαη ε δηφξζσζε Kimura (79). ηελ παξνχζα εξγαζία ρξεζηκνπνηήζεθε ην ηειεπηαίν πξφηππν γηα ηηο ζηνηρίζεηο ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ. χκθσλα κε απηφ ε απφζηαζε ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ ππνινγίδεηαη κε βάζε ηελ ππφζεζε πσο θαηά ηελ εμειηθηηθή δηαδηθαζία έρνπλ ζπκβεί πεξηζζφηεξεο απφ κία αληηθαηαζηάζεηο ζε πνιιέο ζέζεηο π. ρ. ζε κία ζέζε μεθηλψληαο απφ C κπνξνχκε λα θαηαιήμνπκε ζε Σ σο εμήο: C G A T. Όζνλ αθνξά ηα πξφηππα ησλ ξπζκψλ αληηθαηάζηαζεο ησλ ακηλνμηθψλ θαηαινίπσλ, απφ ηα δηαζέζηκα PAM, JTT θαη BLOSUM ρξεζηκνπνηήζεθε ην ηειεπηαίν ζε δηάθνξεο παξαιιαγέο απηνχ. Οη πίλαθεο BLOSUM (BLOck SUbstitution Matrix) ππνινγίδνπλ ην ξπζκφ αληηθαηάζηαζεο ησλ ακηλνμηθψλ θαηαινίπσλ κε βάζε εκπεηξηθά απνδεδεηγκέλεο πηζαλφηεηεο 58

59 αληηθαηάζηαζεο. Ο πίλαθαο BLOSUM45 γηα παξάδεηγκα πξνθχπηεη απφ ηηο αληηθαηαζηάζεηο κεηαμχ ακηλνμηθψλ αιιεινπρηψλ πνπ επηδεηθλχνπλ 45% ηαπηφηεηα, ελψ ν πίλαθαο BLOSUM80 κεηαμχ αιιεινπρηψλ πνπ εκθαλίδνπλ 80% ηαπηφηεηα. Όζν πην κεγάινο είλαη ν αξηζκφο ηνπ πίλαθα ηφζν πην ζπληεξεκέλεο ζα είλαη νη δνκηθέο πεξηνρέο πνπ ζα απνθαιχςεη. Βάζεη ηεο πνιιαπιήο ζηνίρηζεο κε ην θαηάιιειν πξφγξακκα θπινγελεηηθήο αλάιπζεο θαηαζθεπάζηεθε ην θπινγελεηηθφ δέλδξν πνπ αλαπαξηζηά ηηο εμειηθηηθέο ζρέζεηο ησλ αιιεινπρηψλ πνπ ζπγθξίλνληαη. Ο ηξφπνο δηακφξθσζεο ελφο δέλδξνπ νλνκάδεηαη ηνπνινγία θαη κπνξεί λα μεθηλάεη απφ κηα θνηλή ξίδα ή φρη. Ζ ξίδα ζ έλα θπινγελεηηθφ δέλδξν αλαπαξηζηά έλαλ πηζαλφ θνηλφ πξφγνλν απφ ηνλ νπνίν πξνήιζαλ φιεο νη ηαμηλνκηθέο κνλάδεο (taxa) πνπ πεξηιακβάλεη ην δέλδξν. Αληηζέησο ηα δέλδξα ρσξίο ξίδα απιά εμεηάδνπλ ηηο ζρέζεηο κεηαμχ ησλ taxa πνπ πεξηιακβάλνπλ. ηελ παξνχζα εξγαζία θαηαζθεπάζηεθαλ δέλδξα ρσξίο ξίδα θαζψο δελ αλαδεηήζεθαλ θνηλνί πξφγνλνη γηα ηηο αθνινπζίεο πνπ αλαιχζεθαλ παξά κφλν νη ξπζκνί αιιαγήο ηνπο θαη ν βαζκφο ζπληήξεζήο ηνπο. Έλα θπινγελεηηθφ δέλδξν απνηειείηαη απφ ηα θχιια, πνπ αλαπαξηζηνχλ ηα taxa. Δπίζεο δηαζέηεη βξαρίνλεο πνπ είλαη ζηελ νπζία νη γξακκέο ηνπ δέλδξνπ, ελψ ηα ζεκεία φπνπ ελψλνληαη νη βξαρίνλεο θαινχληαη θφκβνη. Οη εζσηεξηθνί θφκβνη αληηπξνζσπεχνπλ ηνπο πην πξφζθαηνπο θνηλνχο πξνγφλνπο ησλ ηαμηλνκηθψλ κνλάδσλ ελψ νη ηεξκαηηθνί θφκβνη αληηπξνζσπεχνπλ ηα θχιια ηνπ δέλδξνπ. Οη θιάδνη ησλ δέλδξσλ πεξηιακβάλνπλ έλαλ θφκβν θαη φιεο ηηο ηαμηλνκηθέο κνλάδεο πνπ πξνθχπηνπλ απφ απηφλ. Όια ηα παξαπάλσ αλαπαξίζηαληαη ζρεκαηηθά ζηελ Δηθφλα 12. Δηθφλα 12: Σνπνινγία θαη ζηνηρεία ελφο θπινγελεηηθνχ δέλδξνπ. 59

60 Σα θπινγελεηηθά δέλδξα κπνξεί λα είλαη είηε θιαδνγξάκκαηα είηε θπινγξάκκαηα. Ζ δηαθνξά αλάκεζά ηνπο είλαη πσο ελψ ζηα θιαδνγξάκκαηα ζεκαζία έρεη ε ζρεηηθή ζέζε ησλ βξαρηφλσλ ηνπ δέλδξνπ θαη φρη ην κήθνο ηνπο, ζηα θπινγξάκκαηα ηα κήθε ησλ βξαρηφλσλ έρνπλ εμειηθηηθή ζεκαζία. ηελ παξνχζα εξγαζία θαηαζθεπάζηεθαλ θπξίσο θιαδνγξάκκαηα κε ην πξφγξακκα θπινγεληηθήο αλάιπζεο PHYLIP (PLYlogeny Inference Package) (115), ην νπνίν παξέρεη ηε δπλαηφηεηα θαηαζθεπήο θπινγελεηηθψλ δέλδξσλ κε δηάθνξεο κεζφδνπο. ε γεληθέο γξακκέο νη κέζνδνη πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηελ θαηαζθεπή δέλδξσλ δηαθξίλνληαη ζε κεζφδνπο κέηξεζεο απνζηάζεσλ θαη ζε επξεηηθέο κεζφδνπο. Οη πξψηεο ππνινγίδνπλ ηηο απνζηάζεηο φισλ ησλ δπλαηψλ δεπγψλ ζην ζχλνιν ησλ αθνινπζηψλ πνπ ζπγθξίλνληαη θαη ζηε ζπλέρεηα κε βάζε απηέο ηηο απνζηάζεηο ηαμηλνκνχληαη ζε ζχλνια νη ζπγθξηλφκελεο αθνινπζίεο θαη ηνπνζεηνχληαη αληίζηνηρα ζε έλα δέλδξν. Οη δεχηεξεο αλαδεηνχλ δέλδξα πνπ βειηηζηνπνηνχλ ηελ πξνζαξκνγή ησλ δεδνκέλσλ ζε έλα δέλδξν φπνπ ε ζέζε θάζε ραξαθηήξα απνηειεί ζπλάξηεζε ησλ ζέζεσλ θαη ησλ άιισλ ραξαθηήξσλ. ηελ πξψηε θαηεγνξία κεζφδσλ αλήθνπλ νη «κέζνδνο έλσζεο ησλ γεηηφλσλ» (Neighbor Joining) (116), ε κέζνδνο UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Averages), ε κέζνδνο ησλ ειαρίζησλ ηεηξαγψλσλ (Least Squares) θαη ε κέζνδνο ηεο ειάρηζηεο εμέιημεο (Minimum Evolution). ηε δεχηεξε θαηεγνξία αλήθνπλ νη κέζνδνη «κεγίζηεο νηθνλνκίαο» (Maximun Parsimony), θαη «κεγίζηεο πηζαλνθάλεηαο» (Maximum Likelihood) (79). ηελ παξνχζα δηαηξηβή γηα ηελ θαηαζθεπή θπινγελεηηθψλ δέλδξσλ ρξεζηκνπνηήζεθε ε κέζνδνο Neighbor Joining (116), φπνπ ε θαηαζθεπή ηνπ δέλδξνπ μεθηλάεη κε έλα «δέλδξν-αζηέξη» ζην νπνίν φιεο νη ηαμηλνκηθέο κνλάδεο ζπλδένληαη κε έλαλ εζσηεξηθφ θφκβν θαη ζηε ζπλέρεηα ην πην γεηηνληθφ δεχγνο κνλάδσλ ζπλδέεηαη ζ έλαλ δηαθνξεηηθφ θφκβν. Ζ δηαδηθαζία απηή επαλαιακβάλεηαη έσο φηνπ ην «δέλδξν αζηέξη» κεηαηξαπεί ζε έλα δέλδξν κε θαλνληθή ηνπνινγία. Δπίζεο νξηζκέλα δέλδξα θαηαζθεπάζηεθαλ κε ηε κέζνδν UPGMA, φπνπ ηα δεχγε αθνινπζηψλ πνπ επηδεηθλχνπλ ηε κεγαιχηεξε νκνηφηεηα ηνπνζεηνχληαη αξρηθά καδί θαη δηαδνρηθά πξνζηίζεληαη ηα ππφινηπα ζηνηρεία ζε λένπο βξαρίνλεο πνπ ελψλνληαη ζην κέζν ηνπ βξαρίνλα ησλ ελσκέλσλ δεπγψλ. Ζ φιε κέζνδνο ζηεξίδεηαη ζηελ παξαδνρή πσο ε εμειηθηηθή πνξεία αθνινπζεί ηνλ ίδην ξπζκφ ζε φινπο ηνπο βξαρίνλεο ηνπ δέλδξνπ. Σέινο ρξεζηκνπνηήζεθε ζε θάπνηεο πεξηπηψζεηο θαη ε επξεηηθή κέζνδνο Maximum Likelihood, ζχκθσλα κε 60

61 ηελ νπνία θαηά ηελ θαηαζθεπή ηνπ θπινγελεηηθνχ δέλδξνπ αμηνινγψληαο θάζε δπλαηή ηνπνινγία αλαδεηείηαη ε πην πηζαλή εμειηθηηθή πνξεία δηακέζνπ ηεο νπνίαο πξνέθπςαλ ηα δεδνκέλα πνπ πεξηέρεη ην δέλδξν. ε θάζε πεξίπησζε ηα δέλδξα πνπ θαηαζθεπάζηεθαλ, αμηνινγήζεθαλ κε ηε δηαδηθαζία Bootstrap (117). Καηά ηε δηαδηθαζία απηή κε ηπραία δεηγκαηνιεςία απφ ην ζχλνιν ησλ δεδνκέλσλ ηνπ δέλδξνπ δεκηνπξγνχληαη ςεπδνζχλνια δεδνκέλσλ κε βάζε ηα νπνία θαηαζθεπάδνληαη λέα δέλδξα. Δπεηδή ε δεηγκαηνιεςία είλαη ηπραία θάπνηα ζηνηρεία ηνπ δέλδξνπ κπνξεί λα επηιεγνχλ πεξηζζφηεξεο θνξέο γηα ηελ θαηαζθεπή ςεπδνζπλφισλ θαη θάπνηα ιηγφηεξεο. ην ηέινο ηεο δηαδηθαζίαο ππνινγίδεηαη πφζεο θνξέο έλαο βξαρίνλαο εκθαλίδεηαη ζην δέλδξν θαη απηφο ν αξηζκφο ησλ επαλαιήςεσλ είλαη ε ηηκή Bootstrap. Γεληθά ηηκέο Bootstrap πάλσ απφ 70% ζπλήζσο είλαη αξθεηά ηθαλνπνηεηηθέο αθνχ είλαη ζπλδεδεκέλεο κε πηζαλφηεηα κεγαιχηεξε ηνπ 95% ν βξαρίνλαο λα είλαη ζσζηά ηνπνζεηεκέλνο. Σα θπινγελεηηθά δέλδξα πνπ πξνέθπςαλ απφ ηα δεδνκέλα ησλ ζηνηρίζεσλ πήξαλ ηελ ηειηθή ηνπο κνξθή κε ηα πξνγξάκκαηα Treeview (118) θαη MEGA version 4.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (119). 3.6 Πξφβιεςε Θέζεσλ Πξφζδεζεο Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ. O Αιγφξηζκνο MatInspector Ζ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ ζηελ παξνχζα εξγαζία έγηλε κε πξφβιεςε ζηηο πεξηνρέο απηέο ζπγθεθξηκέλσλ αιιεινπρηψλ πνπ απνηεινχλ ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Οη ηειεπηαίνη κπνξεί λα πξνζδέλνληαη είηε αηνκηθά είηε θαηά νκάδεο ζε εηδηθέο ζέζεηο θαη λα επηθέξνπλ ηελ έθθξαζε ή ηελ θαηαζηνιή ελφο γνληδίνπ. Ζ πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο πξσηετλψλ ζε DNA γίλεηαη θπξίσο κε ρξήζε ζπλαηλεηηθψλ αιιεινπρηψλ ή κε ρξήζε κεηξψσλ δχγηζεο ζέζεο (PWM-Position Weight Matrices). Ζ βαζκνινγία θάζε PWM πνπ ρξεζηκνπνηείηαη πξνθχπηεη θαζψο θάζε κηα ζέζε ηνπ πίλαθα ηηκάηαη εθηηκψληαο ηελ νκνηφηεηα θάζε βάζεο ηεο αιιεινπρίαο πξνο αλάιπζε κε κηα ζπγθεθξηκέλε ζέζε ηνπ πίλαθα. Απνηειεί δε κέηξν ηεο ζπγγέλεηαο πξφζδεζεο ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα ζηελ αληίζηνηρε αιιεινπρία λνπθιενηηδίσλ. Μφλν λνπθιενηηδηθέο αιιεινπρίεο κε βαζκνινγία πάλσ απφ θάπνην θαηψθιη ζεσξείηαη φηη πξνζδέλνληαη επηηπρψο ζηελ πξσηεΐλε (έρνπλ ηθαλνπνηεηηθή ζπγγέλεηα πξφζδεζεο). Αμίδεη λα ζεκεησζεί πψο φηαλ δχν ή 61

62 πεξηζζφηεξνη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πξνζδέλνληαη ζε παξφκνηεο αιιεινπρίεο, νη ηειεπηαίεο κπνξνχλ λα ζηνηρηζηνχλ απφ θνηλνχ θαη λα πξνθχςεη έλα θνηλφ PWM γηα ηελ πξφβιεςε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζήο ηνπο (βι. Δηζαγσγή). Οη παξάγνληεο απηνί νκαδνπνηνχληαη ζε κηα νηθνγέλεηα. O Πίλαθαο 3 απνηειεί ηνλ πίλαθα ζπρλφηεηαο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε γηα ηελ θαηαζθεπή ηνπ αληίζηνηρνπ PWM θαη ηελ πξφβιεςε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ NGN1 θαη NGN3 πνπ αλήθνπλ απφ θνηλνχ ζηελ νηθνγέλεηα NEUR. Πίλαθαο 3: Πίλαθαο ζπρλφηεηαο γηα ηελ πξφβιεςε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ησλ παξαγφλησλ NGN1/3. Σα PWM ρξεζηκνπνηνχληαη απφ δηαθφξνπο αιγφξηζκνπο γηα ηελ πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζηελ πεξίπησζε πνπ νη ηειεπηαίνη παξνπζηάδνπλ ελαιιαθηηθέο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο. ηελ παξνχζα εξγαζία έγηλε ρξήζε ησλ PWM πνπ πεξηέρνληαλ ζηελ πιαηθφξκα Genomatix Database (100) κε ηε βνήζεηα ηνπ αιγνξίζκνπ MatInspector κε ζηφρν ηελ πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ (TFBS). Χζηφζν κέζα ζηελ πιαηθφξκα Genomatix ν ρξήζηεο κπνξεί λα θαηαζθεπάζεη λέα PWM. O αιγφξηζκνο ΜatInspector ρξεζηκνπνηεί έλα PWM γηα θάζε κηα νηθνγέλεηα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Οη ηηκέο πνπ ζπλνδεχνπλ ηηο πξνβιεπφκελεο απφ ηνλ αιγφξηζκν TFBS αθνξνχλ ζηελ νκνηφηεηα νιφθιεξνπ ηνπ κήθνπο ηεο αιιεινπρίαο πνπ αλαιχεηαη κε ηελ αιιεινπρία πνπ επηιεθηηθά πξνζδέλεη ν παξάγνληαο, φπσο απηή πξνθχπηεη απφ ην PWM, (νκνηφηεηα κεηξψνπ-ms-matrix similarity), αιιά θαη ζηελ 62

63 νκνηφηεηα ησλ ηεζζάξσλ θεληξηθψλ λνπθιενηηδίσλ απφ νιφθιεξε ηελ αιιεινπρία πξφζδεζεο. Σα ηέζζεξα απηά λνπθιενηίδηα απνηεινχλ ηνλ «ππξήλα» ηεο πεξηνρήο πξφζδεζεο νπφηε ε ηειεπηαία νκνηφηεηα νλνκάδεηαη νκνηφηεηα ππξήλα (cs-core similarity). Δπίζεο θάζε TFBS πνπ πξνβιέπεη ν αιγφξηζκνο ζπλνδεχεηαη θαη απφ ηελ πηζαλφηεηα ε πξφβιεςε απηήο ηεο ζέζεο λα είλαη ηπραία. Ζ ηειεπηαία εθθξάδεηαη κε ηελ παξάκεηξν p-value, ε νπνία πξνθχπηεη απφ ππνινγηζκνχο πνπ ιακβάλνπλ ππ φςηλ ηνπο ηφζν ην κήθνο ησλ αιιεινπρηψλ πνπ θαηαηίζεληαη πξνο αλάιπζε φζν θαη ηνλ αξηζκφ ησλ πξνβιεπφκελσλ ζέζεσλ πξφζδεζεο γηα θάζε κηα νηθνγέλεηα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Μηθξφηεξεο ηηκέο p-value αληηζηνηρνχλ ζε πεξηζζφηεξν αμηφπηζηεο ζέζεηο πξφζδεζεο. ηελ Δηθφλα 13 θαίλνληαη ηα απνηειέζκαηα πξφβιεςεο ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε κηα αιιεινπρία κε ηε ρξήζε ηνπ αιγφξηζκνπ MatInspector. ηελ παξνχζα εξγαζία ρξεζηκνπνηήζεθαλ φια ηα PWM απφ ηηο βηβιηνζήθεο 6.3/7.1 ηνπ πξνγξάκκαηνο. Σα απνηειέζκαηα ηνπ Matinspector επηιέρζεθαλ ζέηνληαο σο θαηψθιηα: core similarity (cs) 0.75 θαη matrix similarity (ms) ηηο πξνεπηιεγκέλεο απφ ην πξφγξακκα ηηκέο. Χο ηηκή p-value δε γηα ηελ θαηάηαμε ησλ πξνβιεπφκελσλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ζε αμηφπηζηεο θαη κε ρξεζηκνπνηήζεθε ε ηηκή 2*10-2. Δηθφλα 13: Απνηειέζκαηα πηζαλψλ ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε κηα λνπθιενηηδηθή αιιεινπρία φπσο πξνέθπςαλ απφ ηνλ αιγνξίζκν ΜatInspector. 63

64 3.7 Δχξεζε πληεξεκέλσλ πκπιφθσλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ. Ο Αιγφξηζκνο FrameWorker H πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ κέζσ απιήο εθαξκνγήο αιγνξίζκσλ φπσο ν MatInspector πνπ πεξηγξάθεθε είλαη αξθεηά εχθνιε. Χζηφζν, νδεγεί ζ έλα ζχλνιν απνηειεζκάησλ, κέξνο ηνπ νπνίνπ είλαη ςεπδψο ζεηηθά. Δθηφο απφ ηε ζπλεμέηαζε νξζνιφγσλ γνληδίσλ θαη ζπξξπζκηδφκελσλ γνληδίσλ, ζε κηα επηπιένλ πξνζπάζεηα κείσζεο ησλ ςεπδψο ζεηηθψλ απνηειεζκάησλ, κπνξνχλ λα αλαδεηεζνχλ θνηλέο ζέζεηο πξφζδεζεο δχν ή πεξηζζφηεξσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζην ίδην γνλίδην. Γηεξεπλάηαη δειαδή ε πξφζδεζε κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ θαηά ζχκπινθα. ηε ζπλέρεηα, κπνξεί θαλείο λα αλαδεηήζεη ηα ζπγθεθξηκέλα ξπζκηζηηθά ζχκπινθα ζε έλα ζχλνιν ζπλεμεηαδφκελσλ γνληδηαθψλ αθνινπζηψλ, είηε νξζνιφγσλ, είηε γνληδίσλ πνπ ππφθεηληαη ζε θνηλή ξχζκηζε. ηελ παξνχζα δηαηξηβή, αλαδεηήζεθαλ ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε γνλίδηα πνπ ζπξξπζκίδνληαλ θαηά ηελ εκβξπïθή αλάπηπμε ηνπ παγθξέαηνο θαη ζε ζχλνια νξζνιφγσλ απηψλ ησλ γνληδίσλ. Γηα ηελ αλαδήηεζε ηέηνησλ ζπληεξεκέλσλ ζπκπιφθσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ρξεζηκνπνηήζεθε ν αιγφξηζκνο FrameWorker κέζα ζηελ πιαηθφξκα Genomatix Database. Ο ζπγθεθξηκέλνο αιγφξηζκνο ηξνθνδνηείηαη απφ ηα απνηειέζκαηα ηνπ MatInspector πνπ πεξηιακβάλνπλ ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ θαη κε παξακέηξνπο πνπ ξπζκίδνληαη απφ ην ρξήζηε, αλαδεηά δχν ή πεξηζζφηεξεο ζέζεηο πξφζδεζεο ζε ζηελή γεηηλίαζε κέζα ζηηο αιιεινπρίεο εηζφδνπ ηνπ πξνγξάκκαηνο. Ο ρξήζηεο απαηηείηαη απιψο λα επηιέμεη ην εχξνο ηεο πεξηνρήο πνπ επηζπκεί λα εληνπίδεηαη ην ζχκπινθν, ηελ ειάρηζηε θαη κέγηζηε επηηξεπφκελε απφζηαζε κεηαμχ ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, λα επηηξέςεη ή λα απνθιείζεη αιιεινεπηθαιχςεηο ηπρφλ επαλαιακβαλφκελσλ ζπκπιφθσλ θαη λα επηιέμεη ηελ ελαιιαθηηθή ή ηελ ππνρξεσηηθή παξνπζία δηαθφξσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζηα ζχκπινθα απηά. Αθφκε κπνξεί λα ξπζκίζεη ην κέγηζην θαη ειάρηζην αξηζκφ παξαγφλησλ πνπ επηζπκεί λα πεξηιακβάλνπλ ηα ζχκπινθα πνπ ζα αλαγλσξίζεη ην πξφγξακκα, θαζψο θαη λα επηιέμεη ην ζχλνιν ησλ αιιεινπρηψλ πνπ ζέιεη λα εκθαλίδνπλ ην ζπγθεθξηκέλν ζχκπινθν. Δπίζεο, κπνξεί λα θηιηξάξεη ηα ζχκπινθα πνπ πξνθχπηνπλ θαη ην είδνο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ πεξηιακβάλνπλ θαη λα ξπζκίζεη ηε 64

65 κέγηζηε επηηξεπφκελε ηηκή p-value κε ηελ νπνία ζπλνδεχνληαη ζε κηα πξνζπάζεηα αχμεζεο ηεο αμηνπηζηίαο ησλ απνηειεζκάησλ. Ζ ηηκή p-value, φπσο θαη ζηελ πεξίπησζε ησλ απνηειεζκάησλ ηνπ πξνγξάκκαηνο MatInspector, είλαη ελδεηθηηθή ηνπ βαζκνχ ηπραίαο πξφβιεςεο ησλ απνηειεζκάησλ. ηελ πεξίπησζε ησλ ζπκπιφθσλ πνπ πξνβιέπεη ην FrameWorker νη ηηκέο p-value αληηζηνηρνχλ ζηελ πηζαλφηεηα ηπραίαο ζπλεχξεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηνπ θάζε ζπκπιφθνπ ζηηο ζπγθεθξηκέλεο απνζηάζεηο θαη ζηνλ εθάζηνηε αξηζκφ αθνινπζηψλ. Σα θξηηήξηα αλαδήηεζεο ζπκπιφθσλ δηακνξθψζεθαλ ζηαδηαθά κέζα απφ ηελ αλάιπζε ησλ γνληδίσλ-γλσζηψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3 (IA1, PAX4, NEUROD1, NKX2.2) θαη αλαιχνληαο νινέλα θαη κεγαιχηεξν αξηζκφ γνληδίσλ. Aξρηθά αλαδεηήζεθαλ ζε αθνινπζίεο νξζνιφγσλ (κήθνπο 3500 bp 1 ), γηα ηα γνλίδηαγλσζηνχο ζηφρνπο ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ λα πεξηιακβάλνπλ νπσζδήπνηε ην γλσζηφ ξπζκηζηή ηνπο (NGN3) θαζψο θαη άιινπο παξάγνληεο κε ζπκκεηνρή ζην ζρεκαηηζκφ ησλ πξφδξνκσλ ελδνθξηλψλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ. Δπνκέλσο παξάγνληεο φπσο ν PDX1 θαη ν BRN4 (ηεο νηθνγέλεηαο BRNF) αλαδεηήζεθαλ ζε κηα πεξηνρή κέγηζηνπ εχξνπο 500 bp καδί κε ηνλ NGN3 ζε φζν ην δπλαηφλ πεξηζζφηεξα νξζφινγα γηα θάζε γνλίδην. Ζ κηθξφηεξε απφζηαζε κεηαμχ ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ζην ζχκπινθν ξπζκίζηεθε ζηα 5 bp. Χο ζέζεηο πξφζδεζεο-«άγθπξεο» γηα ηελ αλαγλψξηζε ησλ ζπκπιφθσλ ρξεζηκνπνηήζεθαλ απηέο ησλ NGN1/3 φπνπ ην cs ήηαλ κέγηζην (=1,0) θαη ην ms κεγαιχηεξν ή ίζν απφ ηελ ηηκή 0,92. Οη ηηκέο απηέο επηιέρζεθαλ σο θαηψθιηα, θαζψο κε ηηο δεδνκέλεο ηηκέο ε αλάιπζε ησλ γνληδίσλ-γλσζηψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3 επηβεβαίσζε ηηο πεηξακαηηθά γλσζηέο ζέζεηο πξφζδεζεο ηνπ NGN3. Έλαο άιινο ιφγνο πνπ νδήγεζε ζηελ επηινγή απηψλ ησλ παξακέηξσλ ήηαλ θαη ην γεγνλφο φηη απφ φιε ηελ νηθνγέλεηα NEUR, ζέζεηο πξφζδεζεο ζπγθεθξηκέλα γηα ηνπο παξάγνληεο NGN1/3 πξνβιέπνληαλ κφλνλ φηαλ ην ms ήηαλ κεγαιχηεξν ή ίζν κε 0,92, ελψ ηηκέο ms κηθξφηεξεο ηνπ 0,92 αληηζηνηρνχζαλ ζε ζέζεηο πξφζδεζεο γηα ηνλ παξάγνληα NEUROD1. Με βάζε ηηο παξαπάλσ πξνυπνζέζεηο θαη κε δηαδηθαζίεο πνπ ππνδεηθλχνληαη ζρεκαηηθά ζηελ Δηθφλα 10 πξνέθπςε ε εχξεζε ηνπ βαζηθνχ ζπκπιφθνπ-πξνηχπνπ κε ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ PDX1- BRNF-NEUR (Δηθφλα 10). Με δεδνκέλε ηε κεγάιε ζπληήξεζε ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ ζπκπιφθνπ θαη ηελ αλαγλψξηζε παξφκνησλ πξνηχπσλ κε πνηθίινπο 1 Λφγσ πεξηνξηζκψλ ηνπ πξνγξάκκαηνο 65

66 ζπλδπαζκνχο απφ ελδηαθέξνληεο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο ζε πνιιέο αθνινπζίεο γνληδίσλ, δηεπξχλζεθε ε πεξηνρή αλαδήηεζεο ψζηε ην κέγηζην εχξνο ηεο λα θηάζεη ηα 1000 bp. 3.8 Αλαδήηεζε Θέζεσλ Πξφζδεζεο Δπηιεγκέλσλ Μεηαγξαθηθψλ ζε Οιφθιεξν Γνληδίσκα κε ρεδηαζκφ Καηάιιεινπ Κψδηθα Με ζηφρν ηνλ εληνπηζκφ ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ησλ ζπγθεθξηκέλσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, πνπ εκθαλίδνληαλ θαηά ζχκπινθα ζηα ξπζκηδφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα, ζε πιήξεο γνληδίσκα εμήρζεθαλ φιεο νη αιιεινπρίεο ηνπ γνληδηψκαηνο ηνπ πνληηθνχ απφ ηε βάζε δεδνκέλσλ Ensembl (120). Ζ επηινγή ηνπ νξγαληζκνχ απηνχ έγηλε κε ην ζθεπηηθφ πσο ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ πξνέξρνληαλ απφ θχηηαξα πνληηθνχ. Παξάιιεια, επηιέρζεθαλ ηα θαηάιιεια PWM πνπ ρξεζηκνπνηνχζε ν αιγφξηζκνο MatInspector γηα ηνπο παξάγνληεο, πνπ έδεηρλαλ λα εκθαλίδνληαη ζε ζπληεξεκέλα ζχκπινθα ζε πνιιά γνλίδηα. Με ηα παξαπάλσ ηξνθνδνηήζεθε έλα θαηάιιεια ζρεδηαζκέλν πξφγξακκα εχξεζεο πηζαλψλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ησλ πξνεπηιεγκέλσλ παξαγφλησλ πνπ ιεηηνπξγεί ζηελ ίδηα ινγηθή κε ηνλ αιγφξηζκν MatInspector. Ο θψδηθαο πνπ ππνζηεξίδεη ην πξφγξακκα απηφ παξαηίζεηαη ζην Παξάξηεκα (Κψδηθαο 1) θαη ζρεδηάζηεθε ζε γιψζζα πξνγξακκαηηζκνχ Bash (Bourne Again SHell). Πξφθεηηαη γηα έλα πνιχ ρξήζηκν δηαδξαζηηθφ θινηφ (interactive shell) αιιά θαη δηεξκελέα παξάιιεια γηα αληίζηνηρα ζελάξηα θινηνχ (shell scripts), ηα νπνία είλαη αιιεινπρίεο εληνιψλ, πνπ ζπκίδνπλ πνιχ γιψζζεο πξνγξακκαηηζκνχ φπσο ε C θαη πεξηιακβάλνπλ θχθινπο δηεξγαζηψλ ( loops π.ρ for, while), εθηέιεζε δηεξγαζηψλ ππφ φξνπο (π.ρ. if, case), αλάζεζε θαη απνηίκεζε κεηαβιεηψλ, νξηζκφ ζπλαξηήζεσλ θαη άιια. Δίζνδν ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ πξνγξάκκαηνο απνηέιεζαλ νη αιιεινπρίεο ηνπ γνληδηψκαηνο ηνπ πνληηθνχ πνπ ήηαλ θαηαρσξεκέλεο ζε δηαθνξεηηθά αξρεία κε βάζε ηα ρξσκνζψκαηα θαη ηα PWM γηα ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ NEUR, HNF1, HNF6, PDX1, BRNF, LEFF θαη AP4R, πνπ είραλ πξνεπηιεγεί. Ο θψδηθαο πνπ αλαπηχρζεθε έθαλε ρξήζε απηψλ ησλ PWM θαη κε βάζε παξακέηξνπο-θαηψθιηα πνπ ξπζκίδνληαλ απφ ην ρξήζηε αλαγλψξηζε πηζαλέο ζέζεηο πξφζδεζεο. Ο ρεηξηζκφο θαη ε 66

67 εθηέιεζε ηνπ θψδηθα πξαγκαηνπνηήζεθαλ ζε πεξηβάιινλ Linux κέζα ζην παξάζπξν εληνιψλ-ηεξκαηηθφ κε κε απηφκαην ηξφπν. Πην αλαιπηηθά, θαηά ηελ εθηέιεζε ηνπ πξνγξάκκαηνο, κέζα ζην ηεξκαηηθφ δεηήζεθε απφ ηνλ ρξήζηε λα θαζνξηζηνχλ νη παξάκεηξνη εθαξκνγήο ηνπ θψδηθα. Πην ζπγθεθξηκέλα ν ρξήζηεο έπξεπε λα πξνζδηνξίζεη ζε πνην αξρείν αιιεινπρηψλ ήζειε λα γίλεη ε αλαδήηεζε, γηα πνηα PWM θαη κε πνηα θαηψθιηα βαζκνινγίαο απηψλ (ms), ψζηε λα αλαγλσξηζηνχλ νη πηζαλέο ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ αληίζηνηρσλ παξαγφλησλ. Σα απνηειέζκαηα εθαξκνγήο ηνπ αιγνξίζκνπ απνζεθεχζεθαλ απφ ην πξφγξακκα απηφκαηα ζε αξρεία ηχπνπ «txt», πνπ πεξηείραλ πιεξνθνξίεο γηα ην κεηαγξαθηθφ παξάγνληα πνπ πξνζδέζεθε ζε θάζε ζέζε, γηα ηελ αθξηβή ζέζε πξφζδεζήο ηνπ πάλσ ζηελ εηζεξρφκελε αιιεινπρία θαη γηα ηε ζπγγέλεηα πξφζδεζεο. Ζ ζπγγέλεηα πξφζδεζεο εθθξάζηεθε κε ηελ ηηκή ms, πνπ πξναλαθέξζεθε θαη πνπ ζε θάζε πεξίπησζε ήηαλ κεγαιχηεξε ή ίζε κε ηελ αληίζηνηρε ηηκή-θαηψθιη πνπ έζεηε ν ρξήζηεο θαηά ηνλ θαζνξηζκφ ησλ παξακέηξσλ εθαξκνγήο ηνπ πξνγξάκκαηνο ζην παξάζπξν ησλ εληνιψλ. Οη ηηκέο ησλ θαησθιίσλ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ήηαλ νη ίδηεο κε απηέο πνπ ηέζεθαλ σο θαηψθιηα θαηά ηελ εθαξκνγή ηνπ MatInspector (βι. παξ. 3.6). ηελ νπζία δειαδή έγηλε κηα πξνζπάζεηα απνκίκεζεο ηνπ MatInspector ψζηε λα πξνθχςεη έλαο αιγφξηζκνο πξνζαξκνζκέλνο ζηηο απαηηήζεηο κηαο ζηνρεπκέλεο αλαδήηεζεο ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ζπγθεθξηκέλσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζην πιήξεο γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ. Κάηη ηέηνην δελ ζα κπνξνχζε λα πινπνηεζεί κε ηελ εθαξκνγή ηνπ MatInspector, ιφγσ ελδνγελνχο αδπλακίαο ηνπ πξνγξάκκαηνο λα απνθέξεη απνηειέζκαηα γηα ηφζν κεγάιν φγθν δεδνκέλσλ, φπσο νη αιιεινπρίεο ελφο πιήξνπο γνληδηψκαηνο. Ζ ελαιιαθηηθή πξνζέγγηζε κε δηαρσξηζκφ ηνπ πιήξνπο γνληδηψκαηνο ζε επηκέξνπο κηθξφηεξεο αιιεινπρίεο θαη ε αθφινπζε εθαξκνγή ηνπ MatInspector ζα ήηαλ εμαηξεηηθά ρξνλνβφξα θαη ζα αιινίσλε ηα απνηειέζκαηα, είηε κε απψιεηα πηζαλψλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ζε ζεκεία θνπήο ησλ αιιεινπρηψλ, είηε κε αιιεινεπηθάιπςε απνηειεζκάησλ ζε πεξίπησζε επαλαιήςεσλ ησλ ζέζεσλ απηψλ. Σα απνηειέζκαηα εθαξκνγήο ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ θψδηθα, κεηά απφ επεμεξγαζία κε ινγηζκηθά πνπ πεξηγξάθνληαη ζηηο δχν επφκελεο παξαγξάθνπο (3.9 θαη 3.10) απέδσζαλ ζπγθεθξηκέλα ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ δηεζπαξκέλα ζε πιήξεο γνληδίσκα. Απηά ηα δεδνκέλα ζπλεθηηκήζεθαλ κε ηα απνηειέζκαηα αλεχξεζεο ησλ ίδησλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ ζηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ κεκνλσκέλα θαηά ηηο ηξεηο 67

68 θάζεηο ηεο παξνχζαο εξγαζίαο. Αθνινχζεζε ζηαηηζηηθή αλάιπζε κε ηε κέζνδν ηεο γξακκηθήο παιηλδξφκεζεο (121) ψζηε λα εθηηκεζεί θαηά πφζν ήηαλ ηπραία ή ζηαηηζηηθά ζεκαληηθή ε εχξεζε θάζε ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ ζηα γνλίδηα πηζαλνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3. Eπίζεο κε ηελ ίδηα κέζνδν (121) δεκηνπξγήζεθε έλα πξφηππν πξφβιεςεο ηνπ αξηζκνχ ησλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ πνπ αλακέλνληαλ λα πξνθχςνπλ ηπραία ζηηο αθνινπζίεο πνπ αλαιχζεθαλ αλάινγα κε ην ζχλνιν ησλ λνπθιενηηδίσλ πνπ εμεηάδνληαλ θαηά πεξίπησζε. 3.9 Απηνκαηνπνίεζε ηνπ Δληνπηζκνχ Ρπζκηζηηθψλ πκπιφθσλ κε Δηδηθνχο Κψδηθεο Δληνιψλ Έρνληαο εληνπίζεη ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζπληεξεκέλα ζε πνιιά γνλίδηα θαη πξνθεηκέλνπ λα απηνκαηνπνηεζεί ε δηαδηθαζία αλαγλψξηζεο ησλ ζπκπιφθσλ αλάκεζα ζε απνηειέζκαηα πνπ πξνθχπηνπλ απφ ηελ αλάιπζε ελφο πιήξνπο γνληδηψκαηνο αλαπηχρζεθαλ δχν θψδηθεο γηα ηελ εχξεζε ησλ ζπγθεθξηκέλσλ ζπκπιφθσλ (Κψδηθεο 2 θαη 3 ηνπ Παξαξηήκαηνο). Οη θψδηθεο ζρεδηάζηεθαλ ρξεζηκνπνηψληαο ηε γιψζζα πξνγξακκαηηζκνχ C++, ψζηε λα δέρνληαη σο είζνδν ηηο πηζαλέο ζέζεηο πξφζδεζεο φισλ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε νπνηαδήπνηε αιιεινπρία DNΑ. Σν αξρείν ηξνθνδνζίαο ησλ θσδίθσλ κεηαηξάπεθε ζε πίλαθα ηξηψλ ζηειψλ ψζηε λα αλαγλσξίδεηαη απφ ηε C++. Καηά ηνλ νξηζκφ ηνπ πίλαθα εηζφδνπ ζε θάζε θψδηθα δειψζεθαλ ηξεηο ζηήιεο: ηελ πξψηε ζηήιε δειψζεθε ην φλνκα ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα. ηε δεχηεξε δειψζεθε κε έλαλ αθέξαην αξηζκφ ε ζέζε πξφζδεζεο ηνπ θάζε παξάγνληα μεθηλψληαο ηε κέηξεζε απφ ην πξψην λνπθιενηίδην ηεο αιιεινπρίαο πνπ εκθάληδε ηηο αλαιπφκελεο ζέζεηο πξφζδεζεο. Σέινο, ζηελ ηξίηε ζηήιε ππνδειψζεθε κε έλα δεθαδηθφ αξηζκφ ε νκνηφηεηα ηνπ PWM ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ παξάγνληα κε ηελ αιιεινπρία ζηελ νπνία πξνζδελφηαλ θαηά πξφβιεςε, ζηελ νπζία, δειαδή, ήηαλ ε βαζκνιφγεζε ηεο ζέζεο πξφζδεζεο (ms). Αθνχ νξίζηεθαλ νη ζηήιεο ηνπ πίλαθα εηζφδνπ, επηθαιέζηεθαλ νη αληίζηνηρεο βηβιηνζήθεο ηεο C++, ψζηε λα αλαγλσξίδεηαη ν πίλαθαο σο είζνδνο θαη λα επηηεινχληαη νη ππνινγηζκνί πνπ πξνζηάδεη ν θάζε θψδηθαο. Μέζα ζηε γξακκή εληνιψλ ηνπ θάζε θψδηθα δεηήζεθε λα αλαγλσξηζηνχλ απφ ηα δεδνκέλα ηνπ πίλαθα εηζφδνπ κφλνλ νη ζέζεηο πξφζδεζεο φπνπ ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο NGN1/3 ή ην δεχγνο παξαγφλησλ NGN1/3 θαη NEUROD1 πξνζδελφηαλ ζηελ αλαιπφκελε αιιεινπρία κε βαζκνινγία 68

69 (ms) κεγαιχηεξε απφ 0,92, ε νπνία επηιέρζεθε σο θαηψθιη αμηνπηζηίαο ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο NGN1/3 γηα ηνπο ιφγνπο πνπ πξναλαθέξζεθαλ ζηελ παξάγξαθν 3.7. ηε ζπλέρεηα ηεο γξακκήο εληνιψλ ηνπ θάζε θψδηθα δεηήζεθε κε βάζε απηέο ηηο ζέζεηο πξφζδεζεο λα θαηακεηξεζνχλ ηα απνηειέζκαηα ζε απφζηαζε 500 bp εθαηέξσζελ ηεο θάζε ζέζεο-άγθπξαο θαη λα εληνπηζηνχλ ζέζεηο πξφζδεζεο θαη γηα ηνπο ππφινηπνπο πξνεπηιεγκέλνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο. ηελ πεξίπησζε πνπ φινη νη πξνεπηιεγκέλνη παξάγνληεο εληνπίδνληαλ γχξσ απφ κηα αμηφπηζηε ζέζε πξφζδεζεο NGN1/3, εκθαληδφηαλ σο απνηέιεζκα ε ζέζε, φπνπ εληνπηδφηαλ ην ζχκπινθν. Ο πξψηνο θψδηθαο (Κψδηθαο 2 Παξαξηήκαηνο) εληφπηδε ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ ηηο νηθνγέλεηεο NEUR-PDX1-HNF1-HNF6-BRNF θαη LEFF, ελψ ν δεχηεξνο (Κψδηθαο 3 Παξαξηήκαηνο) ζχκπινθα παξαγφλησλ ησλ πξνεγνχκελσλ νηθνγελεηψλ καδί κε ηνλ παξάγνληα AP4. Σα επηκέξνπο ζχκπινθα θαηακεηξήζεθαλ θαη δηαρσξίζηεθαλ κεηαμχ ηνπο ζηα αξρεία εμφδνπ. Με ηελ εθαξκνγή απηψλ ησλ θσδίθσλ αλαγλσξίζηεθαλ ηαρχηαηα ν αξηζκφο θαη νη ζρεηηθέο ζέζεηο πξνεπηιεγκέλσλ ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ ζε αιιεινπρίεο DNA νπνηνπδήπνηε κήθνπο Αλαδήηεζε Γηαθνξψλ ζηα χκπινθα ησλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ κε ηελ Καηαζθεπή Δμεηδηθεπκέλεο Δθαξκνγήο Με δεδνκέλε ηελ αλεχξεζε ζπκπιφθσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζπληεξεκέλσλ ζην εχξνο ησλ νξζνιφγσλ ηφζν ζηα επαγφκελα φζν θαη ζηα θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα θαη ηνλ εληνπηζκφ παξφκνησλ ζπκπιφθσλ ζε δηάθνξεο ζέζεηο κέζα ζην γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ αλαδεηήζεθαλ ηπρφλ δηαθνξέο αλάκεζα ζηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο πνπ εληνπίδνληαλ θαηά πεξίπησζε ζηα ζχκπινθα. ηελ νπζία, έγηλε κηα πξνζπάζεηα δηαθνξνπνίεζεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ θαη αλαδεηήζεθαλ παξάγνληεο πνπ είηε σο ζπγθαηαζηνιείο είηε σο ζπλελεξγνπνηεηέο ελφο ή πεξηζζνηέξσλ παξαγφλησλ ηνπ βαζηθνχ ζπκπιφθνπ είραλ ηελ ηθαλφηεηα λα κεηαβάιινπλ ηε ιεηηνπξγία ηεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο ηνπ γνληδίνπ φπνπ εληνπίδνληαλ. Πξνθεηκέλνπ λα 2 Οη δχν θψδηθεο κπνξνχλ λα εθηειεζηνχλ ζε νπνηνδήπνηε πεξηβάιινλ (Windows, Linux ή Unix) κεηά απφ πξνεγθαηάζηαζε θαηάιιεινπ κεηαγισηηηζηή (Compiller). 69

70 δηεξεπλεζνχλ πξνο απηήλ ηελ θαηεχζπλζε ηα απνηειέζκαηα απφ ηελ αλάιπζε ησλ γνληδίσλ ησλ ηξηψλ θάζεσλ αιιά θαη ηα απνηειέζκαηα αλάιπζεο ηνπ πιήξνπο γνληδηψκαηνο, θαηαζθεπάζηεθε κηα εθαξκνγή ηθαλή λα εθηειεζηεί ηνπηθά ζε νπνηνλδήπνηε ππνινγηζηή θαη ζε νπνηνδήπνηε πεξηβάιινλ. Ζ εθαξκνγή απηή αλαπηχρζεθε ζε γιψζζα πξνγξακκαηηζκνχ JAVA κε ηε βνήζεηα ηνπ πεξηβάιινληνο πξνγξακκαηηζκνχ NetΒeans 6.9 θαη νλνκάζηεθε TFDetector. 3 Ζ ζπγθεθξηκέλε εθαξκνγή δερφηαλ σο είζνδν αξρεία πνπ πεξηέγξαθαλ πηζαλέο ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε αιιεινπρίεο DNA. Με ηε βνήζεηα θαηάιιεισλ εληνιψλ αλαγλσξίζηεθαλ ζηα αξρεία εηζφδνπ νη ζέζεηο πξφζδεζεο πξνεπηιεγκέλσλ παξαγφλησλ κε βαζκνινγία πάλσ απφ έλα θαηψθιη, θαζνξηδφκελν απφ ην ρξήζηε. ηε ζπλέρεηα αλαδεηήζεθαλ ζε κηα πεξηνρή ηεο νπνίαο ην εχξνο θαζνξίζηεθε επίζεο απφ ην ρξήζηε, νη ζέζεηο πξφζδεζεο θαη γηα άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο. Σα απνηειέζκαηα εθηέιεζεο ησλ εληνιψλ εκθαλίζηεθαλ ζηελ νζφλε εμφδνπ ηεο εθαξκνγήο (Δηθφλα 14). Όπσο θαίλεηαη ζηελ Δηθφλα 14 ε εθαξκνγή έδσζε ζην ρξήζηε ηε δπλαηφηεηα λα εηζαγάγεη ην αξρείν πξνο επεμεξγαζία θαη ζηε ζπλέρεηα λα επηιέμεη ηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο γηα ηνπο νπνίνπο επηζπκνχζε λα γίλεη ε αλαδήηεζε ζπκπιφθσλ. Μεηά ηελ εθηέιεζε ηνπ πξνγξάκκαηνο, ηα απνηειέζκαηα-έμνδνο εκθαλίδνληαλ ζηελ νζφλε. Γηα ηηο αλάγθεο ηεο παξνχζαο δηαηξηβήο ην πξφγξακκα ξπζκίζηεθε ψζηε λα αλαδεηά σο «άγθπξεο» ηηο ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ παξαγφλησλ NGN1/3 θαη NGN1/3+NEUROD1 πνπ είραλ ηηκέο ms 0,92. ηε ζπλέρεηα δηεξεπλνχζε ηνλ ζπλεληνπηζκφ, ζε πεξηνρή κέγηζηνπ εχξνπο 500 bp εθαηέξσζελ απηψλ ησλ «αγθπξψλ», ζέζεσλ πξφζδεζεο θαη γηα άιινπο παξάγνληεο πνπ κέρξη ηψξα είραλ αλεπξεζεί ζε ζπληεξεκέλα ζχκπινθα (HNF1, HNF6, PDX1, BRN4, LEF1 θαη AP4). Με απηήλ ηελ εθαξκνγή έγηλε δπλαηφ λα δηαπηζησζεί ε χπαξμε ζπκπιφθσλ απνηεινχκελσλ απφ ηνπο παξάγνληεο πνπ θάζε θνξά επηιέγνληαλ, ε αθξηβήο ζέζε απηψλ ζηελ αιιεινπρία εηζφδνπ θαη ιεπηνκέξεηεο γηα ηηο ζρεηηθέο ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ παξαγφλησλ πνπ ηα ζπληζηνχζαλ. Με ηε βνήζεηα, ινηπφλ, απηήο ηεο εθαξκνγήο έγηλε ηαρχηαηα ε δηεξεχλεζε ηπρφλ δηαθνξψλ ζηα ξπζκηζηηθά ζηνηρεία ησλ επαγφκελσλ ζε ζρέζε κε ηα θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα 3 Ο θψδηθαο πνπ ππνζηήξημε ηελ εθαξκνγή TFDetector παξαηίζεηαη ζην Παξάξηεκα (Κψδηθαο 4). 70

71 θαη αλαγλσξίζηεθαλ επνπηηθά επηιεγκέλα ζχκπινθα ζε νιφθιεξν ην γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ. Δηθφλα 14: Ζ εθαξκνγή ΣFDetector Αλαδήηεζε πληεξεκέλσλ Πξνηχπσλ Ννπθιενηηδίσλ ζηηο Πεξηνρέο ησλ Ρπζκηζηηθψλ ηνηρείσλ πρλά έρνπλ εληνπηζηεί αιιεινπρίεο πνπ κνηξάδνληαη θνηλφ ξφιν ρσξίο λα παξνπζηάδνπλ νκνηφηεηα ζε φιν ηνπο ην εχξνο παξά κφλν ζε κηθξά ηκήκαηά ηνπο ηα νπνία κπνξεί λα βξίζθνληαη δηαζθνξπηζκέλα αλάκεζα ζε αλφκνηα ηκήκαηα πνηθίινπ κήθνπο. Με απηήλ ηε ινγηθή νη πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ φπνπ εληνπίζηεθαλ ζπληεξεκέλα ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απνκνλψζεθαλ πξνθεηκέλνπ λα αλαδεηεζνχλ ηπρφλ θνηλά πξφηππα DNA, δειαδή ζχλνια λνπθιενηηδίσλ (ή θαη ακηλνμέσλ ζηελ πεξίπησζε ησλ πξσηετλψλ), ηα νπνία παξαηεξνχληαη κε κεγάιε ζπρλφηεηα ζε έλα ζχλνιν αιιεινπρηψλ. Έλα ζχλνιν αιιεινπρηψλ πνπ πεξηέρεη έλα πξφηππν νλνκάδεηαη «κπιφθ». Πξφθεηηαη γηα κηθξφηεξα ηκήκαηα ησλ ππφ εμέηαζε αιιεινπρηψλ πνπ πεξηέρνπλ ην πξφηππν θαη έρνπλ ζηνηρεζεί έηζη ψζηε λα κελ πεξηέρνπλ θελά. Γεδνκέλνπ φηη κηα αιιεινπρία κπνξεί λα εκθαλίδεη πεξηζζφηεξα απφ έλα πξφηππα, ην ζχλνιν απηψλ απνηεινχλ ην απνηχπσκα ηεο αιιεινπρίαο. Σα πξφηππα απηά, πνπ γηα ηελ πεξίπησζε ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ πνπ κειεηήζεθαλ εδψ, δε κπνξεί παξά λα απνηεινχλ ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, κπνξνχλ λα αλαιπζνχλ κε ηε βνήζεηα ζχγρξνλσλ αιγνξίζκσλ. Πνιιέο θνξέο ε πξνζέγγηζε εληνπηζκνχ πξνηχπσλ είλαη δηηηή. Έηζη απφ ηε κηα πιεπξά κπνξνχλ λα εληνπηζηνχλ πξφηππα ζε αλεμάξηεηεο αιιεινπρίεο εθηηκψληαο ηελ νκνηφηεηα ησλ αιιεινπρηψλ απηψλ κε πξνεπηιεγκέλα πξφηππα φπσο είλαη ηα PWM, πνπ πξναλαθέξζεθαλ. Απηφ γίλεηαη ζπλήζσο φηαλ 71

72 ζέιεη θαλείο λα εληνπίζεη πξφηππα-ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ (ινγηθή εθαξκνγήο ηνπ αιγνξίζκνπ MatInspector). Απφ ηελ άιιε πιεπξά είλαη δπλαηφλ λα αλαδεηεζνχλ γεληθά θπινγελεηηθά ζπληεξεκέλα πξφηππα ζε έλα ζχλνιν ζηνηρηζκέλσλ αιιεινπρηψλ. ηελ παξνχζα αλάιπζε εθαξκφζηεθε θαη ε δεχηεξε πξνζέγγηζε ζπκπιεξσκαηηθά πξνο ηελ πξψηε, έρνληαο πξνεπηιέμεη ηηο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ φπνπ εκθαλίδνληαλ ζπληεξεκέλα ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Αξρηθά, απνκνλψζεθαλ νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ φπνπ εληνπίζηεθαλ ζχκπινθα παξαγφλησλ. ηε ζπλέρεηα, επηδηψρζεθε ε αθαίξεζε ηπρφλ ζνξχβνπ απφ ην ζχλνιν ησλ επηιεγκέλσλ αιιεινπρηψλ. Απηφ θξίζεθε αλαγθαίν θαζψο ζπρλά πεξηνρέο επαλαιακβαλφκελνπ DNA, απφ κεηαζεηά ζηνηρεία, ή ελδνγελείο πεξηνρέο ρακειήο πνιππινθφηεηαο, κπνξεί λα εκπνδίζνπλ ηνλ εληνπηζκφ ιεηηνπξγηθψλ πξνηχπσλ. Ο θαζαξηζκφο ησλ αιιεινπρηψλ απφ ηέηνηεο πεξηνρέο έγηλε κε ρξήζε ηνπ εηδηθά ζρεδηαζκέλνπ γηα ην ζθνπφ απηφ πξνγξάκκαηνο RepeatMasker (122). ηε θφξκα εηζφδνπ ηνπ RepeatMasker ν ρξήζηεο εηζάγεη ηηο αιιεινπρίεο απφ ηηο νπνίεο ζέιεη λα αθαηξέζεη ην ζφξπβν θαη σο έμνδν ιακβάλεη ζηελ νζφλε ηα απνηειέζκαηα ηεο αλάιπζεο φπσο θαίλνληαη ζηελ Δηθφλα 15. Σν πξφγξακκα ινηπφλ κπνξεί λα αλαγλσξίζεη πεξηνρέο ρακειήο πνιππινθφηεηαο κέζα ζηηο αιιεινπρίεο εηζφδνπ θαη λα ηηο θαηαηάμεη πεξαηηέξσ ζε θαηεγνξίεο. Δηθφλα 15: Παξάδεηγκα απνηειεζκάησλ ηνπ αιγνξίζκνπ RepeatMasker. 72

73 Αθνινχζσο, ζηηο πξνεπηιεγκέλεο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ έγηλε ε αλαδήηεζε πξνηχπσλ κε ην πξφγξακκα MEME (123), ην νπνίν αλαδεηά πξφηππα ζε αιιεινπρίεο βαζηδφκελν ζηε κέζνδν ηεο κεγίζηεο πηζαλφηεηαο. ηε θφξκα ηνπ MEME ν ρξήζηεο πξέπεη λα επηιέμεη ηηο παξακέηξνπο εθαξκνγήο ηνπ πξνγξάκκαηνο πνπ αθνξνχλ ζην ειάρηζην θαη ζην κέγηζην κήθνο ηνπ πξνηχπνπ πνπ αλαδεηά, ζηε ζπρλφηεηα εκθάληζεο ζε θάζε αιιεινπρία, ζηνλ αξηζκφ ησλ ελαιιαθηηθψλ πξνηχπσλ πνπ αλακέλνληαη ζε θάζε αιιεινπρία θαη ζηνλ αξηζκφ ησλ αιιεινπρηψλ πνπ ελδηαθέξεηαη λα εκθαλίδνπλ ζπληεξεκέλν ην θάζε πξφηππν. Ζ αμηνπηζηία ησλ απνηειεζκάησλ κπνξεί λα εθηηκεζεί κε βάζε ηηο ηηκέο E-value πνπ ζπλνδεχνπλ ηα απνηειέζκαηα. Μηθξέο ηηκέο E-value ζπλνδεχνπλ ζπλήζσο πξφηππα κε κηθξή πηζαλφηεηα λα έρνπλ εληνπηζηεί ηπραία ζην ππφ κειέηε ζχλνιν αιιεινπρηψλ. Άιια θξηηήξηα ζεκαληηθφηεηαο ησλ απνηειεζκάησλ απνηεινχλ ε θπινγελεηηθή ζπληήξεζε ελφο πξνηχπνπ ζε έλα ζχλνιν αιιεινπρηψλ θαη ν ζπζρεηηζκφο ηνπ κε θάπνηα βηνινγηθή ιεηηνπξγία (79). Σέινο, έγηλε πξνζπάζεηα λα δηακνξθσζεί έλα θνηλφ απνηχπσκα γηα θάζε ζχλνιν πξνεπηιεγκέλσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ αλαιπφκελσλ γνληδίσλ. Πην ζπγθεθξηκέλα, νη πξνο αλάιπζε αιιεινπρίεο δηαθξίζεθαλ ζε δχν νκάδεο αλάινγα κε ην αλ ηα γνλίδηα απφ ηα νπνία πξνέθπςαλ ήηαλ επαγφκελα ή θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ NGN3. ηε ζπλέρεηα ζπγθξίζεθαλ ηα απνηππψκαηα πνπ έδσζαλ ηα ζχλνια νξζνιφγσλ ησλ δχν απηψλ νκάδσλ γνληδίσλ. Οη παξάκεηξνη πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηνλ εληνπηζκφ ησλ πξνηχπσλ κε ηε βνήζεηα ηνπ MEME ήηαλ ην κήθνο ηνπ πξνηχπνπ λα θπκαίλεηαη κεηαμχ ησλ 5 (ην ειάρηζην κέγεζνο ηεο αιιεινπρίαο πξφζδεζεο ελφο κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα) θαη ησλ 300bp (ην κέγηζην φξην ηνπ πξνγξάκκαηνο). Χζηφζν, δελ ηέζεθε πεξηνξηζκφο ζηνλ αξηζκφ ησλ ελαιιαθηηθψλ πξνηχπσλ πνπ αλακελφληαλ ζε θάζε αιιεινπρία, νχηε ζηελ αλάγλσζε ηεο αιιεινπρίαο κε ζπγθεθξηκέλν πξνζαλαηνιηζκφ, έηζη ψζηε λα εληνπηζηνχλ πξφηππα κε πξνζαλαηνιηζκφ 5' 3' αιιά θαη 3' 5'. Σέινο θαηά ηελ εθηίκεζε ηεο αμηνπηζηίαο ησλ απνηειεζκάησλ επηιέρζεθε ε παξνπζίαζε πξνηχπσλ κε ηηκέο E-value κηθξφηεξεο ησλ e- 25, θαζψο ηα αλακελφκελα πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλα πξφηππα πξφζδεζεο ηνπ NGN3 ζηα γνλίδηα γλσζηνχο ζηφρνπο ηνπ ζπλνδεχνληαλ απφ ηηκέο E-value ηεο ηάμεο e- 24. ηελ Δηθφλα 16 παξνπζηάδεηαη ε έμνδνο ηνπ πξνγξάκκαηνο MEME, φπνπ θαίλεηαη ε ζπλαηλεηηθή αιιεινπρία ελφο πξνηχπνπ θαη ην κπινθ ησλ αιιεινπρηψλ πνπ ην 73

74 θέξνπλ ππνδεηθλχνληαο παξάιιεια ηε ζρεηηθή ζέζε θαη ηνλ πξνζαλαηνιηζκφ ηνπ πξνηχπνπ ζηηο αιιεινπρίεο. Δηθφλα 16: Παξάδεηγκα εμφδνπ ηνπ πξνγξάκκαηνο MEME Αλαιπζε ηεο Πεξηεθηηθφηεηαο ζε Βάζεηο GC ησλ Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ ηνπ DNA Δθηφο απφ θαηαζθεπή ησλ απνηππσκάησλ επηιεθηηθά γηα ηηο πεξηνρέο φπνπ εληνπίζηεθαλ ηα ζχκπινθα ησλ παξαγφλησλ, νη πιήξεηο αιιεινπρίεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ ειέγρζεθαλ σο πξνο ηελ πεξηεθηηθφηεηά ηνπο ζε GC λνπθιενηίδηα πξνθεηκέλνπ λα ειεγρεί ε ιεηηνπξγηθφηεηα ηνπο (79, 80). Πην ζπγθεθξηκέλα, νη πεξηνρέο bp αλνδηθά ηνπ TSS έσο θαη 500bp θαζνδηθά ηνπ TSS ησλ γνληδίσλ απνηέιεζαλ είζνδν γηα ην πξφγξακκα EMBOSS ISOCHORE (124). Με ην ζπγθεθξηκέλν πξφγξακκα αλαιχζεθε ε θαηαλνκή ησλ GC λνπθιενηηδίσλ θαη ππνινγίζηεθε ε πεξηεθηηθφηεηα ζε GC λνπθιενηίδηα θαηά κήθνο ηεο θάζε αιιεινπρίαο. Χο έμνδν ην ζπγθεθξηκέλν πξφγξακκα πξνέβαιε έλαλ πίλαθα ηηκψλ θαζψο θαη έλα γξάθεκα φπνπ απνδηδφηαλ ε % πεξηεθηηθφηεηα 74

75 ζε GC θαηά κήθνο ηεο αιιεινπρίαο εηζφδνπ (Δηθφλα 17). Καηά ηελ εθαξκνγή ηνπ πξνγξάκκαηνο ξπζκίζηεθαλ νη παξάκεηξνη πνπ αθνξνχζαλ ζην κήθνο ηεο αιιεινπρίαο πνπ ζηαδηαθά ππνιφγηδε ν αιγφξηζκνο, σο πξνο ηελ πεξηεθηηθφηεηα ζε GC (window size: 400 bp) θαη ζηνλ αξηζκφ ησλ λνπθιενηηδηψλ πνπ κεζνιαβνχζαλ κεηαμχ ησλ «παξαζχξσλ» πνπ εμέηαδε (Shift increment default=1 bp). Δηθφλα 17: Παξάδεηγκα αξρείσλ εμφδνπ ηνπ πξνγξάκκαηνο EMBOSS ISOCHORE. Δπηπξνζζέησο εμεηάζηεθαλ νη ηζφρσξεο φπνπ άλεθαλ ηα γνλίδηα πνπ κειεηήζεθαλ. Με ηελ έλλνηα ηζφρσξα ελλννχκε κηα επξχηεξε πεξηνρή ηνπ γνληδηψκαηνο πνπ ραξαθηεξίδεηαη απφ πςειή πεξηεθηηθφηεηα ζε GC λνπθιενηίδηα νκνηφκνξθα θαηαλεκεκέλα ζην εχξνο ηεο. Πξφθεηηαη ζπλήζσο γηα πεξηνρέο DNA κε πςειφηεξε ζε ζρέζε κε ηηο ππφινηπεο ζεξκνθξαζία απνδηάηαμεο, φπνπ ζπλήζσο εληνπίδνληαη εθθξαδφκελεο αιιεινπρίεο ηνπ γνληδηψκαηνο. Με βάζε ηελ πεξηεθηηθφηεηα ζε GC λνπθιενηίδηα δηαθξίλνπκε 4 ηχπνπο ηζφρσξσλ ζηα γνληδηψκαηα ησλ νξγαληζκψλ: Σηο ηζφρσξεο L1 θαη L2 κε ρακειή πεξηεθηηθφηεηα ζε GC< 40% πνπ θέξνπλ κηθξν ζρεηηθά αξηζκφ γνληδίσλ 75

76 Σελ ηζνρψξα H1 κε GC πεξηεθηηθφηεηα ~ 47% Σελ ηζνρψξα H2 κε GC πεξηεθηηθφηεηα ~52% Σελ ηζνρψξα H3 πνπ εκθαλίδεη ηελ πςειφηεξε πεξηεθηηθφηεηα ζε GC > 52% θαη θέξεη ηνλ κεγαιχηεξν αξηζκφ γνληδίσλ (125). Με βάζε πξνεγνχκελεο εξγαζίεο ( ) ηαπηνπνηήζεθαλ νη ηζφρσξεο φπνπ αλήθνπλ ηα γνλίδηα πνπ κειεηήζεθαλ Γηεξεχλεζε ησλ Αιιειεπηδξάζεσλ Μεηαμχ ησλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ κε Υξήζε Γξάθσλ Αιιειεπηδξάζεσλ Μηα πξψηε δηεξεχλεζε ησλ πηζαλψλ αιιειεπηδξάζεσλ ζηηο νπνίεο ζπκκεηείραλ νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πνπ εληνπίζηεθαλ ζηα ζπληεξεκέλα ζχκπινθα έγηλε κε ην ζρεδηαζκφ θαη ηελ αλάιπζε γξάθσλ (δηθηχσλ) αιιειεπηδξάζεσλ, κε ρξήζε ησλ πξνγξακκάησλ ηεο πιαηθφξκαο ΗPA (Ingenuity Pathway Analysis), (130). Σν IPA παξέρεη ηε δπλαηφηεηα εζηίαζεο ζηα βηνινγηθά ζπζηήκαηα θαη άληιεζεο πιεξνθνξηψλ γηα ηηο ρεκηθέο θαη κνξηαθέο αιιειεπηδξάζεηο ζηηο νπνίεο εκπιέθνληαη ηα ππφ κειέηε βηνκφξηα. Δίλαη ρηηζκέλν πάλσ ζε κηα ηεξάζηηα βάζε πεηξακαηηθψλ δεδνκέλσλ, πνπ ζηεξίδεηαη ζε εθαηνληάδεο ρηιηάδεο επηζηεκνληθά άξζξα, βηβιία, θαζψο θαη ζε άιιεο βάζεηο δεδνκέλσλ. Λεηηνπξγεί σο πχιε εηζφδνπ γηα κηα πιεζψξα βηνινγηθψλ θαη ρεκηθψλ κνξίσλ θαζψο θαη πεηξακαηηθψλ δεδνκέλσλ, φπσο δεδνκέλσλ απφ κηθξνζπζηνηρίεο. Σν πξφγξακκα επηηξέπεη ζην ρξήζηε λα δηεξεπλήζεη ηηο αιιειεπηδξάζεηο ρεκηθψλ κνξίσλ, γνληδίσλ θαη πξσηετλψλ, παξέρνληαο ηνπ παξάιιεια ηε δπλαηφηεηα ζρεδηαζκνχ κνξηαθψλ κνλνπαηηψλ αλάινγα κε ηηο αλάγθεο ηεο θάζε κειέηεο. Γηα ηελ εμαγσγή ζπκπεξαζκάησλ, ην IPA παξέρεη πξφζζεηεο πιεξνθνξίεο γηα ηα γνλίδηα θαη ηελ ηζηνεηδηθή έθθξαζή ηνπο. Πην ζπγθεθξηκέλα ππάξρνπλ ηξεηο ηξφπνη γηα λα μεθηλήζεη θαλείο λα εξγάδεηαη κε ην IPA : Ξεθηλψληαο κε κηα ζεξαπεπηηθή πεξηνρή, αζζέλεηα ή ιεηηνπξγία γηα επηπιένλ έξεπλα, κειέηε ή πεηξακαηηθφ ζρεδηαζκφ. Ξεθηλψληαο κε κηα κεγάιε βάζε δεδνκέλσλ, φπσο δεδνκέλα κηθξνζπζηνηρηψλ. 76

77 Ξεθηλψληαο κε έλα κηθξφ αξηζκφ γνληδίσλ ή ρεκηθψλ ζηνηρείσλ (1-300) πνπ ελδηαθέξνπλ ηνλ εξεπλεηή θαηά πεξίπησζε. Ζ δηαδηθαζία απηή κπνξεί λα ζπκπεξηιάβεη θάξκαθα ή γνλίδηα απφ θάπνηα πξνεγνχκελε αλάιπζε. Σα εξγαιεία πνπ πεξηιακβάλεη ε πιαηθφξκα ηνπ IPA πξνζθέξνπλ ζην ρξήζηε ζεηξά απφ δπλαηφηεηεο. Ξεθηλψληαο ινηπφλ κπνξεί θαλείο λα επηιέμεη αλ ζα δηεμάγεη κηα θεληξηθή αλάιπζε (core analysis) πνπ ζα πεξηιακβάλεη ηα βηνκφξηα ηεο επηινγήο ηνπ θαη ζα εμεηάζεη πσο απηά εκπιέθνληαη ζε βηνινγηθά κνλνπάηηα θαη ξπζκηζηηθά δίθηπα. Δλαιιαθηηθά, κπνξεί θάπνηνο λα εμεηάζεη αιιαγέο ησλ βηνκνξίσλ ηνπ ζε δηαθνξεηηθέο πεηξακαηηθέο ζπλζήθεο ζπζρεηίδνληάο ηηο κε βηνινγηθέο δηαδηθαζίεο (core comparison analysis). πλήζσο, ην δεχηεξν είδνο αλάιπζεο δηεμάγεηαη ζπκπιεξσκαηηθά πξνο ην πξψην. ε θάζε αλάιπζε πάλησο ην ζχζηεκα παξέρεη πιεξνθνξίεο ζρεηηθά κε ην είδνο ησλ ζρέζεσλ πνπ ζπλδένπλ κεηαμχ ηνπο ηα βηνκφξηα, ην βηνινγηθφ ηνπο ξφιν θαη ηε ζπκκεηνρή ηνπο ζε θπζηνινγηθέο θαη παζνινγηθέο δηαδηθαζίεο θαζψο θαη ηα ππφινηπα βηνκφξηα πνπ ζπκκεηέρνπλ ζην ίδην κνλνπάηη. ηελ Δηθφλα 18 ππνδειψλεηαη ν θψδηθαο ησλ ζρεκάησλ θαη ησλ γξακκάησλ πνπ ρξεζηκνπνηνχληαη γηα λα πεξηγξάςνπλ ηνπο ηχπνπο ησλ αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ησλ κειψλ ελφο δηθηχνπ θαη ηελ θαηάηαμε ηνπο ζε νκάδεο βηνκνξίσλ. Δηθφλα 18: Κψδηθαο ζρεκάησλ θαη ζπκβνιηζκψλ ηνπ πξνγξάκκαηνο IPA (Δγρεηξίδην νδεγηψλ ρξήζεο ηνπ πξνγξάκκαηνο). 77

78 Δπηπιένλ, ζηελ πιαηθφξκα ηνπ IPA ν ρξήζηεο κπνξεί λα αλαδεηήζεη ηνλ ππνθπηηαξηθφ εληνπηζκφ ησλ βηνκνξίσλ ελφο δηθηχνπ αιιειεπηδξάζεσλ, λα επηιέμεη ζπγθεθξηκέλα ηκήκαηα ελφο δηθηχνπ θαη λα ηα εηζάγεη αθνινχζσο σο δεδνκέλα γηα κηα λέα αλάιπζε ή λα απνθφςεη ηκήκαηα ηνπ δηθηχνπ ή ηέινο λα πξνζζέζεη λέα βηνκφξηα ζην ππάξρνλ ζρήκα ησλ αιιειεπηδξάζεσλ. Μέζα ζηελ πιαηθφξκα ηνπ IPA ν ρξήζηεο κπνξεί λα εηζάγεη ή λα επηιέμεη ην ζχλνιν ησλ δεδνκέλσλ πνπ ζέιεη λα αλαιχζεη θαη ζηε ζπλέρεηα λα εμεηάζεη ηπρφλ αιιειεπηδξάζεηο κε ηα κφξηα ελφο άιινπ ζπλφινπ εηζφδνπ πνπ είηε θαζνξίδεηαη απφ απηφλ, είηε επηιέγεηαη απφ ηα δεδνκέλα ηνπ IPA ή αθφκε θαη λα αλαδεηήζεη γλσζηέο αιιειεπηδξάζεηο κε νπνηνδήπνηε άιιν βηνκφξην. ε απηέο ηηο αλαδεηήζεηο ηα απνηειέζκαηα κπνξνχλ λα θηιηξαξηζηνχλ κε πνηθίινπο ηξφπνπο, φπσο είλαη ην είδνο ησλ αιιειεπηδξάζεσλ πνπ επηζπκεί λα αλαδεηήζεη ν ρξήζηεο, ηελ θαηάηαμε ησλ βηνινγηθψλ δηαδηθαζηψλ φπνπ αλήθεη ην δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ ηεο εμφδνπ, ηνλ ηζηφ ή ην είδνο ησλ θπηηάξσλ απφ ηα νπνία έρνπλ πξνθχςεη ηα δεδνκέλα εηζφδνπ (φπσο δεδνκέλα έθθξαζεο κηθξνζπζηνηρηψλ απφ β-θχηηαξα παγθξέαηνο) θ.α. ην δίθηπν ησλ αιιειεπηδξάζεσλ γίλεηαη δηάθξηζε απηψλ ζε άκεζεο θαη έκκεζεο. Ζ πξψηε θαηεγνξία αλαθέξεηαη ζε θπζηθέο επαθέο κεηαμχ κνξίσλ, ελψ ε δεχηεξε θαηεγνξία πεξηγξάθεη αιιειεπηδξάζεηο κνξίσλ φπνπ έλαο ή πεξηζζφηεξνη ελδηάκεζνη κεζνιαβνχλ ψζηε δχν αξρηθά κφξηα λα εκθαλίζνπλ θάπνηα αιιειεπίδξαζε ζρέζε κεηαμχ ηνπο. Οη έκκεζεο αιιειεπηδξάζεηο κπνξνχλ λα απνθιεηζηνχλ εθ πξννηκίνπ απφ ηα απνηειέζκαηα θαη επηζπκία ηνπ ρξήζηε. ηελ παξνχζα εξγαζία ην ζχζηεκα IPA ρξεζηκνπνηήζεθε γηα λα δηαπηζησζνχλ ηπρφλ θπζηθέο αιιειεπηδξάζεηο (επαθέο) κεηαμχ ησλ πξσηετλψλκεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ εληνπίδνληαλ ζε ζπληεξεκέλα ζχκπινθα κέζα ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ. έλα επφκελν επίπεδν αλάιπζεο αλαδεηήζεθε ε ζπκκεηνρή απηψλ θαη ησλ γνληδίσλ πνπ πηζαλφηαηα ξπζκίδνπλ ζε έλα γεληθφηεξν ξπζκηζηηθφ δίθηπν πνπ ζηφρν έρεη ηελ θαηεπζπλφκελε δηαθνξνπνίεζε ησλ βιαζηνθπηηάξσλ ηνπ πνληηθνχ πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα. ' έλα πξψην επίπεδν αλάιπζεο (core analysis) έγηλε ρξήζε ησλ βάζεσλ δεδνκέλσλ πνπ έρνπλ ελζσκαησζεί ζην IPA θαη πνπ πεξηέρνπλ πιεξνθνξίεο γηα πεηξακαηηθά επηβεβαησκέλεο θπζηθέο αιιειεπηδξάζεηο βηνκνξίσλ εηζάγνληαο απιά ηα νλφκαηα ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ησλ ζπκπιφθσλ. ηε ζπλέρεηα εμεηάζηεθαλ νη αιιειεπηδξάζεηο ησλ γνληδίσλ-γλσζηψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3 κε ηα 78

79 κέιε ηνπ ζπλφινπ απηνχ. πκπιεξσκαηηθά πξνο ηελ πξψηε αθνινχζεζε κηα δεχηεξε αλάιπζε (core comparison analysis) πην εθηεηακέλε θαη πην επηθεληξσκέλε ζην κνλνπάηη δηαθνξνπνίεζεο πνπ θαζνδεγεί ν NGN3. Πην αλαιπηηθά, δεκηνπξγήζεθαλ αξρεία εηζφδνπ πξνο αλάιπζε απφ ηηο αιιαγέο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ 12, 24 θαη 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 ζχκθσλα κε ηα δεδνκέλα ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ (62). Έγηλαλ κάιηζηα δηαθξηηέο αλαιχζεηο γηα θάζε ζχλνιν κεηξήζεσλ ζηηο 12, 24 θαη 48 ψξεο θαη μερσξηζηά γηα ηα επαγφκελα θαη ηα θαηαζηειιφκελα γνλίδηα. Δπίζεο έγηλε κηα επηπιένλ αλάιπζε φισλ ησλ γνληδίσλ-πηζαλψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3, επαγφκελσλ θαη θαηαζηειιφκελσλ, κε βάζε ηελ αιιαγή ηεο έθθξαζήο ηνπο 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3. Αθνινχζεζε ζχγθξηζε ησλ απνηειεζκάησλ ησλ επηκέξνπο αλαιχζεσλ κε ηελ εηδηθή επηινγή (Compare Data) πνπ δηαζέηεη ην πξφγξακκα. ην δίθηπν ησλ αιιειεπηδξάζεσλ πνπ πξνέθπςε απφ ηε δεχηεξε πξνζέγγηζε αλαδεηήζεθαλ ηκήκαηα πνπ δηαπιέθνληαλ κε ην δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ ηεο πξψηεο θαη επηιέρζεθαλ φζα είραλ ζρέζε κε ηελ θπηηαξηθή δηαθνξνπνίεζε ησλ ηλζνπιηλνπαξαγσγψλ θπηηάξσλ θαη πεξηιάκβαλαλ ηα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ ζ' απηήλ ηελ εξγαζία. ε θάζε πεξίπησζε ηα απνηειέζκαηα ηνπ IPA ζπλνδεχνληαλ απφ ηηκέο p-value ελδεηθηηθέο ηνπ βαζκνχ ζεκαληηθφηεηαο απηψλ. Απφ ηα απνηειέζκαηα πνπ πξνέθπςαλ, έγηλαλ απνδεθηέο κφλνλ νη αιιειεπηδξάζεηο κε ηηκέο p-value κηθξφηεξεο απφ 5*10-2. Ζ ηειεπηαία ηηκή ρξεζηκνπνηήζεθε σο θαηψθιη αμηνπηζηίαο ζχκθσλα κε ηηο ππνδείμεηο ηνπ θαηαζθεπαζηή ηνπ πξνγξάκκαηνο Πξνηππνπνίεζε κε Βάζε ηελ Οκνινγία. Σν Πξφγξακκα SWISS-MODEL Μεηά απφ αλαδήηεζε πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλσλ δνκψλ ζηε βάζε PDB γηα ηνπο πξνεπηιεγκέλνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο, δηαπηζηψζεθε πσο νη θξπζηαιιηθέο δνκέο ησλ παξαγφλησλ NGN1/3 δελ είραλ επηιπζεί. Χζηφζν, είρε πξνζδηνξηζηεί ε ζηεξενδνκή ηνπ παξάγνληα NEUROD1 ζε ζχκπινθν κε ην DNA, νπφηε έγηλε ζεσξεηηθή πξφβιεςε ηεο ηξηζδηάζηαηεο δηακφξθσζεο ησλ NGN1/3 κε ην DNA κε βάζε ηελ νκνινγία ησλ πξσηετλψλ NEUROD1 θαη NGN1/3 θαη κε νδεγφ ηε ζηεξενδηακφξθσζε ηνπ ζπκπιφθνπ ηνπ NEUROD1 κε ην DNA. Ζ ίδηα δηαδηθαζία, πνπ αλαθέξεηαη σο πξνηππνπνίεζε κε βάζε ηελ νκνινγία, 79

80 αθνινπζήζεθε θαη γηα άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο γηα ηνπο νπνίνπο δελ ππήξραλ πξνζδηνξηζκέλεο κε θξπζηαιινγξαθία δνκέο. Αλαιπηηθφηεξα ε δηαδηθαζία ηεο πξνηππνπνίεζεο κε βάζε ηελ νκνινγία αθνινχζεζε ηα εμήο βήκαηα: Πξνζδηνξηζκφο ηεο αθνινπζίαο, ηεο νπνίαο ε δνκή επξφθεηην λα πξνηππνπνηεζεί. Δχξεζε ηεο πξσηεΐλεο γηα ηελ νπνία ππήξρε δηαζέζηκε πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλε δνκή-νδεγφο θαη έιεγρνο αλ ε αθνινπζία ηεο επηδείθλπε ηθαλνπνηεηηθή νκνηφηεηα κε ηελ αθνινπζία πνπ ζα πξνηππνπνηνχληαλ (ιακβάλνληαο ππ φςηλ θαη ην κήθνο ησλ ζπγθξηλφκελσλ αιιεινπρηψλ). Καηαζθεπή ηνπ πξνηχπνπ κε ην πξφγξακκα SWISS-MODEL (131), εηζάγνληαο ηε δνκή-νδεγφ θαη ηελ αιιεινπρία πξνο πξνηππνπνίεζε. Μεηά απφ ζηνίρηζε ησλ αθνινπζηψλ ηεο δνκήο πξνηχπνπ θαη απηήο πξνο πξνηππνπνίεζε, πξνέθππηε ε πηζαλφηεξε ηξηζδηάζηαηε δνκή πξφηππν. Σειηθή αμηνιφγεζε ηνπ πξνηχπνπ. To πξφγξακκα SWISS-MODEL κέζσ κηαο ζεηξάο απφ επηκέξνπο εξγαιεία, φπσο ην πξφγξακκα ANOLEA, αμηνινγνχζε ηελ αμηνπηζηία ησλ πξνηχπσλ. Με ην πξφγξακκα ANOLEA έγηλαλ ελεξγεηαθνί ππνινγηζκνί γηα φια ηα ακηλνμέα ηεο αιιεινπρίαο θάζε δνκήο πξνηχπνπ θαη θαηαζθεπάζηεθαλ γξαθήκαηα, φπνπ αξλεηηθέο ηηκέο ελέξγεηαο δήισλαλ επηζπκεηφ ελεξγεηαθά πεξηβάιινλ, ελψ ζεηηθέο ηηκέο αληηζηνηρνχζαλ ζε ακηλνμέα κε κε απνδεθηή ελεξγεηαθά δηεπζέηεζε ζην ρψξν. Γηα ηηο πεξηπηψζεηο ησλ πξσηετλψλ φπνπ ηα πξφηππα πνπ θαηαζθεπάζηεθαλ κε ηηο παξαπάλσ δηαδηθαζίεο δελ θξίζεθαλ ηθαλνπνηεηηθά αλαδεηήζεθαλ έηνηκα πξφηππα ζηελ βάζε ModBase (132). 80

81 3.15 Γηεξεχλεζε ησλ Αιιειεπηδξάζεσλ ησλ Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ κε Βάζε ηηο Σξηζδηάζηαηεο Γνκέο ηνπο. Σν Βηνυπνινγηζηηθφ Δξγαιείν PatchDock Γηαζέηνληαο ηξηζδηάζηαηεο δνκέο γηα αξθεηνχο πξνεπηιεγκέλνπο παξάγνληεο ειέγζεθε θαη δνκηθά ην ελδερφκελν αιιειεπίδξαζεο ηνπο κε ηελ βνήζεηα ηνπ πξνγξάκκαηνο PatchDock (133). Πξφθεηηαη γηα έλα εμεηδηθεπκέλν ινγηζκηθφ παθέην πνπ δηεξεπλά ηηο ηξηζδηάζηαηεο δηακνξθψζεηο κηθξψλ ή κεγάισλ κνξίσλ ππνινγίδνληαο ην ελδερφκελν αιιειεπίδξαζεο κεηαμχ ηνπο. Σν πξφγξακκα δέρεηαη σο είζνδν ηηο δνκέο ησλ πξσηετλψλ ή κηαο πξσηεΐλεο θαη ελφο κηθξφηεξνπ ππφ κειέηε κνξίνπ θαη δηεξεπλά ηελ ηξηζδηάζηαηε δηακφξθσζή ηνπο αλαδεηψληαο κνξηαθή ζπκπιεξσκαηηθφηεηα κε ζηφρν λα εληνπίζεη πεξηνρέο πνπ κπνξνχλ λα αιιειεπηδξάζνπλ. Έηζη είλαη δπλαηφλ λα αλαγλσξηζηνχλ γεσκεηξηθέο αιιειεπηδξάζεηο ηνπ ηχπνπ αληηγφλν-αληίζσκα αιιά θαη κηθξά ζηεξηθά ζπκπιέγκαηα. Καηφπηλ ππνινγίδνληαη φιεο νη δπλαηέο δηακνξθψζεηο πνπ κπνξεί λα ιάβνπλ ηα αιιειεπηδξψληα κφξηα, γίλνληαη νη θαηάιιεινη κεηαζρεκαηηζκνί θαη πξνβάιιεηαη ε πην πηζαλή δηεπζέηεζε ζην ρψξν. Πην ζπγθεθξηκέλα ην πξφγξακκα θαηαζθεπάδεη γηα θάζε κφξην κηα επηθάλεηα κνξηαθψλ αιιειεπηδξάζεσλ θαηά Conolly (Δηθφλα 9Α) ηελ νπνία ππνδηαηξεί ζε θνηιφηεηεο, αχιαθεο θαη επίπεδα ηκήκαηα. ηε ζπλέρεηα αλαδεηά πηζαλέο ζρέζεηο ζπκπιεξσκαηηθφηεηαο αλάκεζά ζηηο επηθάλεηεο ησλ κνξίσλ θαη πξαγκαηνπνηεί ηνπο ζρεηηθνχο κεηαζρεκαηηζκνχο ησλ αηφκσλ ζηα κφξηα. Κάζε κεηαζρεκαηηζκφο ζπλνδεχεηαη απφ βαζκνινγία, πνπ ππνινγίδεηαη κε βάζε ηφζν ην γεσκεηξηθφ ηαίξηαζκα ησλ κνξίσλ, φζν θαη ηελ ελεξγεηαθή θαηάζηαζε ησλ επηκέξνπο αηφκσλ ηνπο. ηε θφξκα εηζφδνπ ν ρξήζηεο εηζάγεη αξρεία PDB πνπ αθνξνχλ ζε πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλεο δνκέο ή ζε δνκέο πνπ έρνπλ πξνθχςεη απφ πξνηππνπνίεζε κε βάζε ηελ νκνινγία γηα ηηο νπνίεο ζέιεη λα πξαγκαηνπνηεζεί αλαδήηεζε αιιειεπηδξάζεσλ θαη πηζαλή δηεπζέηεζε ζην ρψξν. Χο έμνδν ην πξφγξακκα απνδίδεη έλα αξρείν PDB πνπ αληηζηνηρεί ζηε βέιηηζηε δηακφξθσζε πνπ πξνθχπηεη απφ ηε δηεξεχλεζε ησλ αιιειεπηδξάζεσλ θαη ηνπο κεηαζρεκαηηζκνχο ησλ δχν ππφ δηεξεχλεζε δνκψλ. Δπίζεο παξέρεηαη θαη έλαο ζπλνδεπηηθφο πίλαθαο ιεπηνκεξεηψλ πνπ αθνξνχλ ζηα δχν αιιειεπηδξψληα κφξηα. Όπσο θαίλεηαη ζηελ Δηθφλα 19, ε πξψηε ζηήιε δειψλεη ηε βαζκνινγία ηνπ αξρείνπ εμφδνπ κε βάζε ηε γεσκεηξηθή ζπκπιεξσκαηηθφηεηα, ε δεχηεξε ηελ 81

82 ελεξγεηαθή βαζκνινγία, ε ηξίηε ηελ έθηαζε ησλ αιιειεπηδξψλησλ επηθαλεηψλ θαη ηέινο ε ηέηαξηε παξέρεη πιεξνθνξίεο ζρεηηθά κε ηνπο αδξνχο κεηαζρεκαηηζκνχο πνπ νδήγεζαλ ζηελ ζπγθεθξηκέλε δηεπζέηεζε. Σν ζρεηηθφ αξρείν PDB κπνξεί λα εηζαρζεί ζε πξφγξακκα κνξηαθψλ γξαθηθψλ θαη λα παξαηεξεζεί ή λα ηξνπνπνηεζεί θαηά ην επηζπκεηφ απφ ην ρξήζηε. ηελ παξνχζα εξγαζία νη δνκέο ησλ παξαγφλησλ, πνπ πξνβιέθζεθε λα ζπκκεηέρνπλ ζε ζχκπινθα, ειέγρζεθαλ κε ην PatchDock γηα λα δηαπηζησζεί αλ αιιειεπηδξνχλ κε ην πξνηχπν ηνπ NGN3 κε ην DNA αιιά θαη κεηαμχ ηνπο. ηε ζπλέρεηα φζνη απφ απηνχο δηαπηζηψζεθε πσο ζρεκαηίδνπλ ζχκπινθα ειέγζεθαλ πεξαηηέξσ σο πξνο ηελ δπλαηφηεηα ζρεκαηηζκνχ ππεξκνξηαθψλ ζπκπιφθσλ θαη κε ηνπο ππφινηπνπο παξάγνληεο κε ηε ρξήζε ηνπ ίδηνπ πξνγξάκκαηνο. Με άιια ιφγηα, ηα αξρεία εμφδνπ ηνπ PatchDock απνηέιεζαλ αξρεία εηζφδνπ λέσλ αλαδεηήζεσλ πξνθεηκέλνπ λα δηεξεπλεζεί ε πηζαλφηεηα ζρεκαηηζκνχ κεγαιχηεξσλ ζπκπιφθσλ. Δδψ αμίδεη λα ζεκεησζεί πσο νη επαθέο ζην αξρείν εμφδνπ απνθαζίζηεθαλ, γηα δεπγάξηα πξσηετληθψλ αιπζίδσλ φπνπ ε κεηαμχ ησλ πιεπξηθψλ νκάδσλ ησλ ακηλνμέσλ απφζηαζε κεηξήζεθε κηθξφηεξε ησλ 4Å, ηηκή πνπ αληηζηνηρεί ζηε κεγαιχηεξε αθηίλα αιιειεπίδξαζεο αλάκεζα ζε φια ηα είδε δηακνξηαθψλ αιιειεπίδξαζεσλ. Έηζη, ιακβάλνληαο ππ φςηλ ηηο θπζηθνρεκηθέο ηδηφηεηεο ησλ ακηλνμέσλ, φπσο δηακνξθψλνληαλ θπξίσο απφ ηηο πιεπξηθέο νκάδεο ηνπο, ππνινγίζηεθαλ νη πηζαλέο αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ πεξηνρψλ κε αληίζηνηρεο ηδηφηεηεο. Δληνπίζηεθαλ π.ρ. πεξηνρέο πνπ αιιειεπηδξνχζαλ κέζσ δεζκψλ πδξνγφλνπ ή αιιειεπηδξάζεηο πδξφθνβσλ πεξηνρψλ. Ζ παξαηήξεζε θαη επεμεξγαζία ησλ αξρείσλ εμφδνπ θαζψο θαη ε δεκηνπξγία ησλ εηθφλσλ ηεο παξνχζαο εξγαζίαο έγηλε κε ην πξφγξακκα κνξηαθψλ γξαθηθψλ PyMol (134). Δηθφλα 19: Παξάδεηγκα απνηειεζκάησλ ηνπ πξνγξάκκαηνο PatchDock. 82

83 4 AΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ ΚΑΗ ΤΕΖΣΖΖ 4.1 Δμέηαζε Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ Με πγθξηηηθή Γνληδησκαηηθή ηελ παξνχζα δηαηξηβή, αλαιχζεθαλ νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο επηιεγκέλσλ γνληδίσλ σο πξνο ηελ χπαξμε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ κε ζηφρν ηνλ εληνπηζκφ ιεηηνπξγηθψλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ. Ζ δηαδηθαζία πνπ αθνινπζήζεθε ζηεξίρζεθε ζηε ζπγθξηηηθή γνληδησκαηηθή μεθηλψληαο κε ηε ζπιινγή ησλ νξζνιφγσλ γνληδηαθψλ πεξηνρψλ θαη ηελ πεξαηηέξσ αλάιπζή ηνπο φπσο ήδε πεξηγξάθεθε (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) θαη ζπλνπηηθά παξνπζηάζηεθε ζηελ Δηθφλα 10. Ζ αλεχξεζε ησλ νξζνιφγσλ έγηλε κε ηε κέζνδν ηνπ βέιηηζηνπ BLAST θαη ε αλαδήηεζε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ θαη ησλ ζπκπιφθσλ απηψλ έγηλε κέζα απφ ηελ πιαηθφξκα Genomatix Database φπσο πεξηγξάθεθε (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). πκπιεξσκαηηθά αλαγλσξίζηεθαλ ζε θάζε πεξίπησζε νη ζπληεληθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ κέζα απφ ηε βάζε δεδνκέλσλ Ensembl πξνθεηκέλνπ λα δηεξεπλεζεί ν βαζκφο ζπληήξεζεο ησλ γνληδηαθψλ πεξηνρψλ θαη λα επηβεβαησζεί ε νξζφινγε ζρέζε απηψλ. Δπηπξνζζέησο, δεδνκέλα απφ πεηξάκαηα κειέηεο ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο ζπιιέρζεθαλ θαη αλαιχζεθαλ πξνθεηκέλνπ λα δηεξεπλεζεί ε έθθξαζε ησλ ππφ κειέηε γνληδίσλ ζηηο αλαπηπμηαθέο ζπλζήθεο πνπ αθνξνχλ ζηε δηαθνξνπνίεζε ησλ ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο. Σέινο, ε αλαγλψξηζε ησλ δνκηθψλ ιεηηνπξγηθψλ πεξηνρψλ ζηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ ζε πνιιέο πεξηπηψζεηο έδσζε ζηνηρεία ζρεηηθά κε ην ξφιν ησλ αληηζηνίρσλ γνληδίσλ. Όπσο πξναλαθέξζεθε, νη παξαπάλσ αλαιχζεηο (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) έγηλαλ ζε ηξεηο θάζεηο, ελψ αθνινχζεζε θαη αλάιπζε ηνπ πιήξνπο γνληδηψκαηνο ηνπ πνληηθνχ πξνθεηκέλνπ λα εθηηκεζεί ε ζηαηηζηηθή ζεκαληηθφηεηα ησλ απνηειεζκάησλ. ηελ πξψηε θάζε αλαιχζεθαλ ηα γνλίδηα IA1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2, πνπ απνηεινχλ πεηξακαηηθά επηβεβαησκέλνπο ζηφρνπο ηνπ NGN3, ελψ ζηε δεχηεξε εμεηάζηεθαλ ηα ζπγθαηαζηειιφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα WISP1 θαη CTGF θαη ηα παξάινγα ηνπ γνληδίνπ WNT5. Έρνληαο πιένλ απνθαζίζεη ηηο παξακέηξνπο ηεο ρξεζηκνπνηνχκελεο κεζφδνπ, ψζηε λα ιακβάλνληαη αμηφπηζηα απνηειέζκαηα, ε ίδηα κέζνδνο εθαξκφζηεθε θαη ζηελ ηξίηε θάζε γηα ηελ αλάιπζε γνληδίσλ-πηζαλψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3. 83

84 4.1.1 Πξώηε Φάζε Αλάιπζε Γνληδίωλ Γλωζηώλ ηόρωλ ηνπ NGN3 Πξνϋπάξρνπζα γλώζε Σα γνλίδηα ΙΑ1, PΑΧ4, NEUROD1 θαη NKX2.2 θσδηθνπνηνχλ κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο (75, 78, 135) θαη απνηεινχλ γλσζηνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3. Οη ζέζεηο, φπσο θαη νη αιιεινπρίεο πξφζδεζεο ηνπ NGN3, πνπ είλαη γλσζηέο κε ηνλ φξν «Eboxes», έρνπλ πξνζδηνξηζηεί πεηξακαηηθά (52, 72-74, 77, ). Δπηπιένλ, δεδνκέλα πεηξακάησλ κειέηεο ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο (62), πνπ ζπλνπηηθά παξνπζηάδνληαη ζηελ Δηθφλα 20, ππνδεηθλχνπλ πσο κεηαμχ 12 έσο θαη 48 σξψλ (h) κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 κεηαβάιιεηαη ε έθθξαζε ησλ ηεζζάξσλ απηψλ γνληδίσλ. Δηθφλα 20: Οη κεηαβνιέο ηεο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ φπσο αληρλεχζεθαλ απφ ηα επίπεδα mrna πνπ κεηξήζεθαλ 12-48h κεηά ηελ επαγσγή ηνπ παξάγνληα NGN3. Παξάιιεια, ππνδεηθλχνληαη νη δψλεο πνπ αληηζηνηρνχλ ζηα mrnas ηνπ γνληδίνπ B-ACTIN (β-αθηίλεο) πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε σο ζεηηθφο κάξηπξαο, θαζψο εθθξάδεηαη ζπλερψο ζε φια ηα θχηηαξα. (Serafimidis et al., 2008). ηόρνο-ρέδην εξγαζίαο Με βάζε ηελ πξνυπάξρνπζα γλψζε έγηλε πξνζπάζεηα λα επηβεβαησζνχλ νη γλσζηέο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο ηνπ παξάγνληα NGN3 ζηα ηέζζεξα απηά γνλίδηα γηα ηα είδε πνπ αλαθέξνληαλ ζηηο πεηξακαηηθέο κειέηεο θαη λα δηεξεπλεζεί ν βαζκφο ζπληήξεζήο ηνπο θαη ζε άιινπο νξγαληζκνχο πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο. ε έλα επφκελν επίπεδν έγηλε γεληθφηεξε δηεξεχλεζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ παξαπάλσ γνληδίσλ γηα ζέζεηο πξφζδεζεο θαη άιισλ παξαγφλησλ. 84

85 Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα Δθαξκφδνληαο ηε δηαδηθαζία πνπ πεξηγξάθεθε αλαιπηηθά (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) αλαδεηήζεθαλ πξψηα ηα νξζφινγα ησλ παξαπάλσ γνληδίσλ ζε δέθα νξγαληζκνχο (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο) πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο θαη θαηαλέκνληαη νκνηφκνξθα ζηε θπινγελεηηθή απφζηαζε απφ ηα ςάξηα σο ηνλ άλζξσπν. ηηο αιιεινπρίεο ησλ γνληδίσλ απηψλ έγηλε πξφβιεςε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3. Μέζα απφ ηελ αλάιπζε απηή επηβεβαηψζεθαλ νη γλσζηέο ζέζεηο θαη ηα πξφηππα πξφζδεζεο ηνπ NGN3 ζηα γνλίδηα-ζηφρνπο. Πην αλαιπηηθά, νη αιιεινπρίεο πνπ ην πξφγξακκα MatInspector ηεο Genomatix (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) πξνέβιεπε σο πηζαλέο ζέζεηο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 είηε ηαπηίδνληαλ κε ηηο ήδε γλσζηέο απφ πεηξακαηηθέο κειέηεο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο, είηε ζε θάπνηεο πεξηπηψζεηο δηέθεξαλ ζε 1 ή 2 θαηάινηπα 4. ηελ Eηθφλα 21 ππνδεηθλχνληαη νη γλσζηέο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο («E-boxes») ηνπ NGN3 ζην γνλίδην ΙΑ1 νη νπνίεο ηαπηίδνληαλ κε ηηο πξνβιεπφκελεο. ηελ ίδηα εηθφλα θαίλεηαη πσο ηα E-boxes βξέζεθαλ εμειηθηηθά ζπληεξεκέλα θαη ζπλέπηπηαλ κε ηηο πξνβιεπφκελεο ζέζεηο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 θαη ζε άιινπο νξγαληζκνχο εθηφο ηνπ αλζξψπνπ, γηα ην γνλίδην ηνπ νπνίνπ ππήξραλ πεηξακαηηθά δεδνκέλα. Δηθφλα 21: Γηαζπνξά θαη ζπληήξεζε ζε νξηζκέλα είδε ησλ αιιεινπρηψλ «Eboxes» φπνπ πξνζδέλεηαη ν παξάγνληαο NGN3 θαη ζηνίρηζή ηνπο κε ηηο πξνβιεπφκελεο απφ ην MatInspector αιιεινπρίεο γηα ην γνλίδην ΙΑ1. 4 = Σν κέζν κήθνο ησλ αιιεινπρηψλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3 είλαη 12 λνπθιενηίδηα, νπφηε ε νκνηφηεηα 10/12 αλάγεηαη ζε νκνηφηεηα ηεο ηάμεο ηνπ 83%. 85

86 Δπηβεβαίσζε ησλ γλσζηψλ πξνηχπσλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3 έγηλε θαη γηα ηα γνλίδηα PAX4, NKX2.2 θαη NEUROD1 ηνπ πνληηθνχ νη ζηνηρίζεηο ησλ νπνίσλ κε ηα πξνβιεπφκελα πξφηππα παξνπζηάδνληαη ζηηο Δηθφλεο 22Α, Β θαη Γ αληίζηνηρα. ηηο εηθφλεο απηέο θαίλεηαη αθφκε πσο γηα γνλίδηα πνπ ππήξραλ πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλα πξφηππα πξφζδεζεο θαη γηα άιινπο παξάγνληεο, εθηφο ηνπ NGN3, (φπσο π.ρ. γηα ηνλ HNF1) έγηλε επίζεο ζχγθξηζε κε ηα πξνβιεπφκελα απφ ην MatInspector. Δπηπξνζζέησο, νη πξναλαθεξζείζεο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο εληνπίζηεθαλ ζε ζέζεηο, ζε ζρέζε κε ην TSS ηνπ θάζε γνληδίνπ, πνπ είραλ αλαθεξζεί ζε πξνεγνχκελεο πεηξακαηηθέο εξγαζίεο. Oη ζρεηηθέο ζέζεηο ησλ παξαπάλσ αιιεινπρηψλ σο πξνο ην TSS ηνπ θάζε γνληδίνπ θαη ησλ νξζνιφγσλ ηνπ θαίλνληαη ζηηο Δηθφλεο Δηθφλα 22: ηνηρίζεηο ησλ πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλσλ κε ηηο πξνβιεπφκελεο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο γηα ηα γνλίδηα (Α) PAX4, (B) NKX2.2 θαη (Γ) NEUROD1. 86

87 ηε ζπλέρεηα αλαδεηήζεθαλ νη ζέζεηο πξφζδεζεο θαη άιισλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ γεηηληάδνπλ κε απηέο ηνπ NGN3 θαη πνπ εκθαλίδνληαλ ζπληεξεκέλεο ζε ζχλνια νξζνιφγσλ ησλ παξαπάλσ γνληδίσλ. Πην αλαιπηηθά, ζηηο γνληδηαθέο πεξηνρέο, πνπ εθηείλνληαλ bp αλνδηθά ηνπ TSS έσο θαη 500bp θαζνδηθά απηνχ αλαδεηήζεθαλ θνηλέο ζέζεηο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζε φια ηα νξζφινγα απφ δέθα πεξίπνπ πξνεπηιεγκέλα είδε νξγαληζκψλ (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο). ηνλ Πίλαθα 4 παξνπζηάδνληαη φιεο νη νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ κνηξάδνληαλ ζέζεηο πξφζδεζεο ζε φια ηα νξζφινγα θαη ησλ ηεζζάξσλ γνληδίσλ. Πίλαθαο 4: Οηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ κπνξνχλ λα πξνζδεζνχλ ζε φια ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ IA1, PAX4, NKX2.2 θαη NEUROD1. Γίπια ζε θάζε νηθνγέλεηα ε ηηκή «p-value» δειψλεη ην βαζκφ αμηνπηζηίαο ηνπ απνηειέζκαηνο. Καηφπηλ δηεξεπλήζεθε ε χπαξμε πεξηνρψλ φπνπ εληνπίδνληαλ ζχκπινθα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ δηαηεξνχληαλ εμειηθηηθά. Θέηνληαο, σο ζεκεία αλαθνξάο, ηηο ζέζεηο πξφζδεζεο ηνπ NGN3, πνπ ήηαλ θαη πεηξακαηηθά επηβεβαησκέλεο, βξέζεθαλ λα ζπλεληνπίδνληαη ζε ζηελή γεηηλίαζε κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο κε ζεκαληηθφ αλαπηπμηαθφ ξφιν. Έηζη, κεηαμχ ησλ άιισλ επηιέρζεθε έλα πηζαλφ ζχκπινθν-πξφηππν πνπ πεξηέρεη έλα κέινο απφ ηελ νηθνγέλεηα 87

88 NEUR 5, θαζψο θαη άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο πνπ ζρεηίδνληαλ κε ηηο δηαδηθαζίεο αλάπηπμεο ηνπ παγθξέαηνο. ηε ζπλέρεηα, αλαδεηήζεθε ην πξνεπηιεγκέλν πξφηππν ζηα νξζφινγα ησλ ηεζζάξσλ γνληδίσλ. ηελ Δηθφλα 23 θαίλεηαη ελδεηθηηθά ην πξφηππν φπσο αλαγλσξίζηεθε απφ ην πξφγξακκα FrameWorker ηεο Genomatix (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) ζε νξηζκέλα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ NEUROD1. ην πξφηππν απηφ πνπ εκθαλίζηεθε ζπληεξεκέλν ζε αξθεηά είδε, νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο NGN1/3 πξνζδέλνληαλ ζηελ ίδηα πεξηνρή κε παξάγνληεο απφ ηηο νηθνγέλεηεο PDX1 θαη BRNF. Δηθφλα 23: χκπινθν-πξφηππν κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ φπσο αλαγλσξίζηεθε απφ ην πξφγξακκα FrameWorker ζε νξηζκέλα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ NEUROD1. ην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο ππνδεηθλχνληαη νη νηθνγέλεηεο ζηηο νπνίεο αλήθνπλ νη παξάγνληεο ηνπ πξνηχπνπ, ελψ ε θφθθηλε γξακκή ππνδειψλεη ην TSS ηνπ θάζε γνληδίνπ. Μέζα ζην πξφηππν απηφ γηα θάπνηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ PAX4 εθηφο απφ ηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο απφ ηηο νηθνγέλεηεο PDX1, BRNF θαη NEUR πεξηιακβάλνληαλ θαη νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο HNF1 θαη HNF6 πνπ αλήθνπλ ζηηο νκψλπκεο νηθνγέλεηεο θαη πνπ ζχκθσλα κε ηε βηβιηνγξαθία (76) πξνζδέλνληαη θαη ξπζκίδνπλ ην ελ ιφγσ γνλίδην. Έηζη, αλαδεηήζεθαλ ζηελ πεξηνρή πνπ εθηεηλφηαλ 500bp εθαηέξσζελ ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3 ηνπ πξνηχπνπ ζηα νξζφινγα θαη ησλ ηεζζάξσλ γνληδίσλ ηα κέιε απηψλ ησλ 5 ηελ νηθνγέλεηα NEUR αλήθνπλ νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο NGN1/3 θαη NEUROD1. 88

89 νηθνγελεηψλ θαζψο θαη άιινη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο. Αλαγλσξίζηεθε έηζη έλα ζχκπινθν ζπληεξεκέλν ζηα νξζφινγα θαη ησλ ηεζζάξσλ γνληδίσλ, φπνπ κέιε απφ ηηο πξναλαθεξζείζεο νηθνγέλεηεο αιιά θαη απφ ηελ νηθνγέλεηα LEFF πξνζδέλνληαλ ζε κηα πεξηνρή κεγίζηνπ κήθνπο πεξίπνπ 1000bp. ηηο Δηθφλεο παξνπζηάδεηαη ην ζχκπινθν απηφ γηα ηα γνλίδηα ΙΑ1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2 αληίζηνηρα. Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίζηεθε ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ηνλ δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο θάζε εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηε ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θνηλφ ππφκλεκα ζην θάησ κέξνο ησλ Δηθφλσλ ηηο εηθφλεο απηέο θαίλεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν αθέξαην ζε φιν ην εχξνο ησλ νξζνιφγσλ, γηα ηα γνλίδηα ΙΑ1, PAX4 θαη NEUROD1, ελψ γηα ην γνλίδην NKX2.2 θάπνηνη παξάγνληεο ηνπ ζηνηρείνπ απνπζηάδνπλ ζηα ζειαζηηθά. Δηθφλα 24: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ ΙΑ1 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Όπνπ ζπλεληνπίδνληαη νξηζκέλα κφλν κέιε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, ε πεξηνρή δειψλεηαη κε πιαίζην. 89

90 Δηθφλα 25: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ PΑΧ4 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Δηθφλα 26: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ NEUROD1 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. 90

91 Δηθφλα 27: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ NKX2.2 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Όπνπ ζπλεληνπίδνληαη νξηζκέλα κφλν κέιε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, ε πεξηνρή δειψλεηαη κε πιαίζην. Yπφκλεκα Δηθφλσλ πλνςίδνληαο ηα απνηειέζκαηα ησλ Δηθφλσλ 24-27, δηαπηζηψλεηαη πσο ζηα γνλίδηα ΙΑ1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2 βξέζεθαλ ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ζπληεξεκέλεο ζε έλα ηθαλνπνηεηηθφ ζχλνιν νξγαληζκψλ (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο) πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο. Αλαιπηηθφηεξα, εληνπίζηεθαλ κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο απφ έμη νηθνγέλεηεο, ζε φια ζρεδφλ ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ, ζε κηα πεξηνρή εχξνπο bp. Μνλαδηθή εμαίξεζε απνηέιεζε ε πεξίπησζε ησλ γνληδίσλ ΙΑ1 απφ ηνλ νζηετρζχ Tetraodon (Σ. nigrovirides), φπνπ ν παξάγνληαο HNF1 ζην έλα απφ ηα ηξία γνλίδηα δελ εκθαλίζηεθε θαζφινπ θαη ζην άιιν ε ζρεηηθή ζέζε πξφζδεζεο εληνπίζηεθε καθξηά απφ ηελ πεξηνρή ηνπ ζπκπιφθνπ. Σν ηξίην απφ ηα νξζφινγα ηνπ ίδηνπ ςαξηνχ δελ εκθάληζε θαζφινπ ζέζε πξφζδεζεο γηα ηνπο παξάγνληεο NGN1/3 θαη NEUROD1. 91

92 Δπηπιένλ, ζην ςάξη Zebrafish ην έλα απφ ηα δχν νξζφινγα δελ είρε ηελ ηθαλφηεηα πξφζδεζεο ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα NGN3 αιιά δηαηεξνχζε αθφκε ηελ ηθαλφηεηα πξφζδεζεο ηνπ παξάγνληα NEUROD1 πνπ δηαζέηεη ρακειφηεξε ζπγγέλεηα πξφζδεζεο ζε ζρέζε κε ηνλ NGN3 (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). Αμίδεη λα ζρνιηαζηεί πσο ην ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν, ζηελ πεξίπησζε ηνπ γνληδίνπ NKX2.2 δε βξέζεθε ζπληεξεκέλν ζε ηφζν κεγάιν βαζκφ ζε ζρέζε κε ηα ππφινηπα ηξία γνλίδηα. πγθεθξηκέλα ζηα ζειαζηηθά νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ HNF6, HNF1 θαη PDX1 ζε θάπνηεο πεξηπηψζεηο είραλ ηηο ζέζεηο πξφζδεζήο ηνπο καθξηά απφ απηέο ησλ ππνινίπσλ κειψλ ηνπ ζηνηρείνπ. ηελ πεξίπησζε δε ηνπ πνληηθνχ ε πεξηνρή αλαδήηεζεο ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ επεθηάζεθε πέξα απφ ηηο 4000bp, αλνδηθά ηνπ TSS. Έηζη, απμάλνληαο ην εχξνο ηεο πεξηνρήο πνπ ειέγρζεθε, εληνπίζηεθε θαη in silico ε κνλαδηθή ζέζε πξφζδεζεο ηνπ NGN3, πνπ έρεη πεξηγξαθεί απφ ηα πεηξάκαηα πξνεγνχκελσλ εξγαζηψλ (77). Απηή ε ζέζε έθεξε, πιεζίνλ ηεο, ζέζεηο πξφζδεζεο θαη γηα ηνπο άιινπο πξναλαθεξζέληεο παξάγνληεο, ζπγθξνηψληαο έλα ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ζε απφζηαζε bp αλνδηθά ηνπ TSS ηνπ γνληδίνπ. πδήηεζε Απηφ ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν επηιέρζεθε θαη παξνπζηάζηεθε ιφγσ ηεο κεγάιεο βηνινγηθήο ζεκαζίαο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ πεξηείρε φζνλ αθνξά ηηο δηαδηθαζίεο δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο. Έλα άιιν θξηηήξην επηινγήο ηνπ ζπκπιφθνπ απηνχ απνηέιεζε ε πςειή ζπληήξεζή ηνπ ζηελ πιεηνςεθία ησλ νξζνιφγσλ γηα φια ηα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ. Σν ζχκπινθν απηφ ζπγθξνηνχζαλ κέιε απφ έμη νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ εθ' ησλ νπνίσλ ε κία ήηαλ ε NEUR, θαηφπηλ πξναπαηηήζεσο, θαη νη ππφινηπεο ήηαλ νη PDX1, HNF1, HNF6, BRNF θαη LEFF. Ζ νηθνγέλεηα PDX1 αληηπξνζσπεχεηαη απ ηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο PDX1 θαη ISL1, νη νπνίνη ξπζκίδνπλ ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ ηεο ηλζνπιίλεο θαη ηελ αλάπηπμε ησλ θπηηάξσλ ησλ λεζηδίσλ ( ). Απφ ηελ άιιε πιεπξά νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο BRN2, BRN3, BRN4 θαη BRN5 αλήθνπλ ζηελ επξχηεξε νηθνγέλεηα BRNF θαη εκπιέθνληαη ζηελ εκβξπνγέλεζε ησλ ζειαζηηθψλ. Πην ζπγθεθξηκέλα, ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο BRN4 θαζνδεγεί ηα θχηηαξα ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο πξνο ηελ θαηεχζπλζε ησλ θπηηάξσλ πνπ 92

93 παξάγνπλ γιπθαγφλε (58, 142). Οη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο HNF1 θαη HNF6, πνπ αληηπξνζσπεχνπλ ηηο νκψλπκεο νηθνγέλεηεο, είλαη γλσζηνί ελεξγνπνηεηέο ηεο κεηαγξαθήο ησλ γνληδίσλ πνπ εθθξάδνληαη εηδηθά ζην πεπηηθφ ζχζηεκα (136,139, 143). ηελ ίδηα πεξηνρή πξνζδέλεηαη θαη ν κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο LEF1, απφ ηελ νηθνγέλεηα LEFF, o νπνίνο εκπιέθεηαη ζην κνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ θαζνδεγνχλ νη πξσηεΐλεο WNT (144,145), ην νπνίν παίδεη θαζνξηζηηθφ ξφιν γηα ηε θπζηνινγηθή αλάπηπμε ηνπ παγθξεαηηθνχ επηζειίνπ θαηά ηα φςηκα ζηάδηα ηεο νξγαλνγέλεζεο ζην έκβξπν (146). Παξφιν πνπ ε ζεηξά εκθάληζεο ησλ επηκέξνπο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ζην ζχκπινθν δελ ήηαλ απζηεξά ε ίδηα γηα φια ηα νξζφινγα θαη γηα ηα ηέζζεξα γνλίδηα, ν ζπλεληνπηζκφο ηνπο δελ θξίζεθε ηπραίνο. Σν γεγνλφο φηη ην ζχκπινθν απηφ εκθαληδφηαλ ζπληεξεκέλν αθφκε θαη ζε θπινγελεηηθά απνκαθξπζκέλα είδε, ππνδεηθλχεη ηε ιεηηνπξγηθή ηνπ ζεκαζία σο ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν απηψλ ησλ γνληδίσλ. Γεδνκέλνπ φηη ε ξπζκηζηηθή απηή αθνινπζία εληνπίζηεθε αξθεηά καθξηά απφ ην TSS ζε πνιιά απφ ηα νξζφινγα πνπ εμεηάζηεθαλ, εθηηκάηαη πσο δελ πξφθεηηαη γηα ππνθηλεηή παξά κάιινλ γηα αθνινπζία κε ξφιν εληζρπηή ησλ γνληδίσλ ζε θάζε πεξίπησζε. Ζ απνπζία νξηζκέλσλ παξαγφλησλ απφ ην ελ' ιφγσ ζχκπινθν ζε θάπνηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ ίζσο λα ζρεηίδεηαη κε ην φηη ηα γνλίδηα απηά δξνπλ ζε θάπνην ζηάδην θαηά ηελ πνξεία ζρεκαηηζκνχ ησλ β- θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο, φπνπ νη ππφινηπνη παξάγνληεο δελ είλαη απαξαίηεηνη (75, 147). πλνςίδνληαο, απφ ηελ αλάιπζε απηήο ηεο θάζεο πξνέθπςε ε επηβεβαίσζε ησλ πεηξακαηηθψλ απνηειεζκάησλ ε νπνία πξνζέδσζε ηελ δεηνχκελε αμηνπηζηία ζηε δεδνκέλε in silico κεζνδνινγία θαη δηακφξθσζε ηηο επηκέξνπο παξακέηξνπο απηήο ψζηε λα εθαξκνζηεί θαη ζηηο επφκελεο θάζεηο. Παξάιιεια κέζα απφ ηελ αλάιπζε ησλ γνληδίσλ IA1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2 αλαδείρζεθε έλα ζπληεξεκέλν ζχκπινθν κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, πνπ πηζαλφηαηα ζρεηίδεηαη κε ηελ απφ θνηλνχ ξχζκηζε θαη ζπκκεηνρή ησλ γνληδίσλ απηψλ ζηηο εκβξπνγελεηηθέο δηαδηθαζίεο αλάπηπμεο ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο. 93

94 4.1.2 Γεύηεξε Φάζε Πξώην Μέξνο: Αλάιπζε ηωλ πξξπζκηδόκελωλ Γνληδίωλ WISP1 & CTGF Πξνϋπάξρνπζα γλώζε Σα γνλίδηα WISP1 (WNT-Induced Secreted Protein 1) θαη CTGF (Connective Tissue Growth Factor) θσδηθνπνηνχλ εθθξηλφκελεο πξσηεΐλεο ηεο εμσθπηηάξηαο χιεο πνπ αλήθνπλ ζηελ ίδηα νηθνγέλεηα απμεηηθψλ παξαγφλησλ θαη παίξλνπλ κέξνο ζε πνιιέο αλαπηπμηαθέο θαη νγθνγελεηηθέο δηαδηθαζίεο ( ). Ζ έθθξαζή ηνπο επάγεηαη απφ ην κνλνπάηη ηεο β-θαηελίλεο πνπ θαζνδεγνχλ νη WΝΣ πξσηεΐλεο (150, 153). Δπίζεο, πεηξακαηηθά δεδνκέλα, απφ κηθξνζπζηνηρίεο (62), ηα νπνία ζπλνςίδνληαη ζηνλ Πίλαθα 5, ππνδεηθλχνπλ πσο ηα γνλίδηα WISP1 θαη CTGF θαηαζηέιινληαη απφ θνηλνχ 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηεο έθθξαζεο ηνπ NGN3. Γνλίδην Αιιαγή Έθθξαζεο CTGF WISP Πίλαθαο 5: Αιιαγή ησλ επηπέδσλ έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF, 48 ψξεο κεηά ηελ έθθξαζε ηνπ NGN3, φπσο απηά πξνέθπςαλ απφ αλάιπζε ησλ mrnas ησλ δχν γνληδίσλ κε κηθξνζπζηνηρίεο DNA (Serafimidis et., al., 2008). ηόρνο - ρέδην εξγαζίαο Με πεηξακαηηθά δεδνκέλα πνπ ππνδείθλπαλ ηελ ζπξξχζκηζε ησλ δχν γνληδίσλ απφ ηνλ NGN3, βαζηθφο ζηφρνο ηεο αλάιπζεο απηήο ήηαλ πξσηίζησο ε επηβεβαίσζε ηεο ζπγθαηαζηνιήο ηνπο, κεηά απφ επαγσγή ηνπ NGN3, κε RT-PCR θαη ζηε ζπλέρεηα ε αλαδήηεζε ζέζεσλ πξφζδεζεο γηα ηνλ NGN3, ψζηε λα εμεγεζεί ε κεηαγξαθηθή ξχζκηζε ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF απφ ηνλ NGN3. Αθνινχζσο, αλαδεηήζεθαλ πξφζζεηνη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πνπ, ζπγθξνηψληαο πηζαλά ζχκπινθα κε ηνλ NGN3, λα ζρεκαηίδνπλ έλα ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν πνπ λα ειέγρεη ηελ απφ θνηλνχ έθθξαζε ησλ παξαπάλσ γνληδίσλ. 94

95 Δπηπιένλ, έγηλε αλαγλψξηζε δνκηθψλ πεξηνρψλ ζηα πξντφληα ησλ δχν γνληδίσλ ψζηε λα πξνθχςνπλ πξφζζεηεο πιεξνθνξίεο γηα ηνλ ξφιν ηνπο. Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα i) RΤ-PCR Ανάλςζη Υξεζηκνπνηήζεθαλ πξφδξνκα παγθξεαηηθά θχηηαξα πνληηθνχ πνπ είραλ πξνέιζεη απφ εκβξπηθά βιαζηνθχηηαξα κεηά απφ επηιεθηηθή επαγσγή ηνπ NGN3 φηαλ ε δηαθνξνπνίεζε ηνπο είρε θηάζεη ζην επίπεδν ηνπ παγθξεαηηθνχ ελδνδέξκαηνο (62). απηά ηα θχηηαξα, θαζψο θαη ζε θχηηαξα ηεο ίδηαο ζεηξάο ρσξίο λα έρεη πξνεγεζεί ε επαγσγή ηνπ NGN3, έγηλε απνκφλσζε νιηθνχ RNA. ε πιεζπζκνχο ησλ θπηηάξσλ απηψλ αιιά θαη ζε επηιεγκέλα κεκνλσκέλα θχηηαξα έγηλε αλίρλεπζε ησλ mrna ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF ζε ζρέζε κε ην mrna ηνπ γνληδίνπ NGN3 κε RT-PCR αληηδξάζεηο. Σα πξντφληα ησλ αληηδξάζεσλ ειεθηξνθνξήζεθαλ αθνινχζσο ζε πήθησκα αγαξφδεο (154). ηελ Δηθφλα 28Α θαίλνληαη ηα απνηειέζκαηα ησλ RT-PCR αληηδξάζεσλ ζην ζχλνιν ησλ θπηηάξσλ πνπ εμέθξαδαλ ή φρη ην NGN3. ηελ Δηθφλα 28Β θαίλνληαη ηα ίδηα απνηειέζκαηα γηα θαζέλα απφ ηα θχηηαξα πνπ εμεηάζηεθαλ (RT-PCR αληηδξάζεηο ζε επίπεδν ελφο θπηηάξνπ). ηελ εηθφλα απηή θαίλεηαη πσο ζηελ πιεηνλφηεηα ησλ θπηηάξσλ πνπ εμεηάζηεθαλ (12 θχηηαξα) φηαλ επαγφηαλ ην NGN3, ηα mrnas ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF δελ αληρλεχνληαλ (αρλέο δψλεο ζην πήθησκα). Αληίζεηα, ζηα θχηηαξα φπνπ δελ επαγφηαλ ην NGN3, νη δψλεο πνπ αληηζηνηρνχζαλ ζηα mrnas ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF θαίλνληαλ έληνλεο ζην πήθησκα. Σα ίδηα απνηειέζκαηα δείρλεη θαη ε ειεθηξνθφξεζε ηεο Δηθφλαο 28Α, απφ ηηο RT-PCR αληηδξάζεηο ζην ζχλνιν ησλ θπηηάξσλ. ε θάζε πήθησκα νη δψλεο πνπ αληηζηνηρνχζαλ ζηα επίπεδα mrna ηνπ γνληδίνπ ηεο B-ACTIN (β-αθηίλεο), πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ σο κάξηπξεο, παξέκελαλ ακεηάβιεηεο αλεμάξηεηα απφ ηελ επαγσγή ή φρη ηεο έθθξαζεο ηνπ NGN3. Όπσο ήηαλ αλακελφκελν, ην γνλίδην B- ACTIN εθθξάδεηαη ζπλερψο θαη αλεμάξηεηα απφ ηνλ NGN3. 95

96 Δηθφλα 28: Απνηειέζκαηα ειεθηξνθφξεζεο ζε πήθησκα αγαξφδεο γηα ηα πξντφληα RT-PCR. (Α) ζε πιεζπζκφ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ θαη (Β) ζε επίπεδν ελφο θπηηάξνπ. Σα γνλίδηα WISP1 and CTGF θαηαζηάιζεθαλ απφ θνηλνχ κεηά απφ επαγσγή ηεο έθθξαζεο (+ngn3) ηνπ NGN3 ζηα θχηηαξα. Σα επίπεδα έθθξαζεο ηνπ γνληδίνπ B-ACTIN, πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε σο κάξηπξαο, ήηαλ ζηαζεξά (Kapasa et al., 2008). ii) In Silico ανάλςζη Αθνινπζήζεθε ε δηαδηθαζία ηεο πξψηεο θάζεο πνπ αλαθέξεηαη ζηελ αλαγλψξηζε ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ, αλαδεηψληαο ζπληεξεκέλεο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ κέζα ζε ζχλνια νξζφινγσλ πεξηνρψλ γηα ηα δχν γνλίδηα. Οη γνληδηαθέο πεξηνρέο, 4000bp αλνδηθά ηνπ TSS έσο θαη 500bp θαζνδηθά απηνχ, γηα ηα νξζφινγα ηνπ WISP1 θαη ηνπ CTGF απφ ηα επηιεγκέλα δέθα είδε νξγαληζκψλ (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο) ζπιιέρζεθαλ θαη ππνβιήζεθαλ ζε πξφβιεςε ζέζεσλ πξφζδεζεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ κε ην MatInspector. ηε ζπλέρεηα δεηήζεθαλ λα παξνπζηαζηνχλ κφλν νη ζέζεηο πξφζδεζεο πνπ ήηαλ θνηλέο θαη ζηηο δέθα νξζφινγεο πεξηνρέο γηα ηα δχν γνλίδηα. ηνλ Πίλαθα 6 παξνπζηάδνληαη απηέο νη νηθνγέλεηεο παξαγφλησλ γηα ηα γνλίδηα WISP1 θαη CTGF θαη νη ηηκέο p-value, πνπ εθθξάδνπλ ηελ αμηνπηζηία ησλ απνηειεζκάησλ. Δίλαη θαλεξφ πσο ηα δχν γνλίδηα έθεξαλ ζέζεηο πξφζδεζεο γηα νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ σο επί ην πιείζηνλ θνηλέο. Ζ νηθνγέλεηα NEUR, φπνπ αλήθεη ν NGN3, ραξαθηεξηδφηαλ απφ πνιχ ρακειή θαη θαηά ζπλέπεηα ηθαλνπνηεηηθή ηηκή p-value ζε ζρέζε κε ην θαηψθιη πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). Πην αλαιπηηθά, ζπγθξίλνληαο ηα απνηειέζκαηα ηνπ Πίλαθα 6 κε απηά ηνπ Πίλαθα 4 δηαθξίλεηαη πσο θαη νη έμη νηθνγέλεηεο παξαγφλησλ (ζθηαζκέλνη ζηνλ Πίλαθα 6), πνπ βξέζεθαλ σο ζπληεξεκέλν ζχκπινθν ζηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ γλσζηψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3, πξνζδέλνληαλ επίζεο απφ θνηλνχ ζε φια ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF. 96

97 WISP1 CTGF WISP1 CTGF TF FAMILY P-VALUE TF FAMILY P-VALUE TF FAMILY P-VALUE TF FAMILY P-VALUE MITF 1,547 e-7 THAP 3,211 e-9 EBOX 0,001 NFKB 0,001 SATB 6,188 e-7 CSEN 4,810 e-8 RORA 0,002 ZFHX 0,001 SREB 7,302 e-7 E4FF 8,259 e-7 AP1R 0,002 GKLFZBPF 0,001 PAX8 3,112 e-6 CIZF 2,168 e-6 NFAT 0,002 ZBPF 0,001 BRAC 4,264 e-6 PAX8 3,112 e-6 HOMF 0,002 RORA 0,002 PAX3 4,725 e-6 PAX3 4,725 e-6 MZF1 0,002 AP1R 0,002 COMP 1,036 E-5 BARB 6,183 e-6 GREF 0,002 NFAT 0,002 CHRF 1,329 e-5 COMP 1,036 e-5 HOXC 0,004 EKLF 0,002 LHXF 1,695 e-5 PLZF 1,070 e-5 EGRF O,005 HOMF 0,002 HMTB 2,631 e-5 CHRF 1,329 e-5 RUSH 0,007 MZF1 0,002 PAX2 2,949 e-5 AP1F 1,371 e-5 E2FF 0,008 GREF 0,002 CDXF 3,590 e-5 FAST 2,277 e-5 STAT 0,008 CDXC 0,004 GFI1 3,590 e-5 HMTB 2,631 e-5 IRFF 0,011 EGRF 0,005 NEUR 3,590 e-5 INSM1 2,631 e-5 CAAT 0,011 RUSH 0,007 RREB 3,590 e-5 TEAF 2,708 e-5 SP1F 0,012 E2FF 0,008 AHRR 4,598 e-5 CDXF 3,590 e-5 AP4R 0,015 STAT 0,008 HAML 5,403 e-5 GFI1 3,590 e-5 PARF 0,017 IRFF 0,011 CP2F 7,218 e-5 NEUR 3,590 e-5 HEAT 0,017 CAAT 0,011 YY1F 7,799 e-5 HAML 5,403 e-5 BRNF 0,018 SP1F 0,012 NF1F 8,189 e-5 RBPF 5,684 e-5 MYBL 0,021 AP4R 0,015 PRDF 1,490 e-4 CP2F 7,218 e-5 PAX6 0,022 PARF 0,017 HNF6 1,982 e-4 GLIF 1,139 e-4 OCT1 0,023 HEAT 0,017 TALE 2,029 e-4 PRDF 1,490 e-4 MYT1 0,025 BRNF 0,018 CEBP 2,677 e-4 HNF6 1,982 e-4 CLOX 0,027 MYBL 0,021 HESF 2,801 e-4 TALE 2,029 e-4 TBPF 0,038 PAX6 0,022 PBXC 2,801 e-4 HESF 2,801 e-4 SORY 0,042 OCT1 0,023 HOXH 2,805 e-4 PBXC 2,801 e-4 GATA 0,046 MYT1 0,025 XBBF 3,828 e-4 HDXH 2,865 e-4 FKHD 0,075 CLOX 0,027 HNF1 3,912 e-4 PAX5 3,663 e-4 EVI1 0,085 TBPF 0,038 IKRS 4,087 e-4 XBBF 3,828 e-4 CREB 0,099 SORY 0,042 PDX1 4,177 e-4 HNF1 3,912 e-4 NR2F 0,132 GATA 0,046 MEF2 4,269 e-4 IKRS 4,087 e-4 NKXH 0,183 FKHD 0,075 P53F 5,181 e-4 PDX1 4,177 e-4 RXRF 0,185 EVI1 0,085 LEFF 6,396 e-4 MEF2 4,269 e-4 HOXF 0,224 CREB 0,099 SNAP 7,243 e-4 P53F 5,181 e-4 NR2F 0,132 PERO 8,358 e-4 LEFF 6,396 e-4 NKXH 0,183 MOKF 8,529 e-4 MAZF 7,243 e-4 RXRF 0,185 SRFF 8,703 e-4 SNAP 7,243 e-4 HOXF 0,224 NFKB 0,001 PERO 8,358 e-4 ZFXH 0,001 SRFF 8,703 e-4 Πίλαθαο 6: Οη νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ εκθάληδαλ ζέζεηο πξφζδεζεο απφ θνηλνχ ζε φια ηα νξζφινγα απφ δέθα νξγαληζκνχο γηα ην γνλίδην WISP1 (αξηζηεξά) θαη γηα ην CTGF (δεμηά). Γίπια ζε θάζε νηθνγέλεηα ε ηηκή p-value εθθξάδεη ην βαζκφ αμηνπηζηίαο ηνπ απνηειέζκαηνο. 97

98 Με βάζε απηά ηα απνηειέζκαηα θαη ζπλεθηηκψληαο πεηξακαηηθά δεδνκέλα, πνπ ππνδείθλπαλ ηα δχν απηά γνλίδηα σο πηζαλνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3 (62), αθνινπζήζεθαλ ηα ίδηα βήκαηα κε ηελ αλάιπζε ηεο πξψηεο θάζεο ψζηε λα δηεξεπλεζεί ε χπαξμε εμειηθηηθά ζπληεξεκέλσλ πεξηνρψλ φπνπ εληνπίδνληαλ ζχκπινθα (πξφηππα) ηνπ παξάγνληα NGN3 κε άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο. Θέηνληαο, σο ζεκεία αλαθνξάο, ηηο ζέζεηο πξφζδεζεο ηνπ παξάγνληα NGN3 θαη δηεξεπλψληαο εθαηέξσζελ ηεο θάζε ζέζεο θαη γηα άιινπο παξάγνληεο, αλαγλσξίζηεθαλ δηάθνξα πξφηππα κε πνηθίιν βαζκφ ζπληήξεζεο ζε πεξηνρέο κεγίζηνπ εχξνπο 500bp. Καηά ηελ αμηνιφγεζε ησλ πξνηχπσλ πνπ πξνέθπςαλ ζπλεμεηάζηεθαλ νη παξάγνληεο πνπ ηα απνηεινχζαλ, κε θξηηήξην ην βηνινγηθφ ηνπο ξφιν. Δπίζεο ν βαζκφο ζπληήξεζεο θαζελφο πξνηχπνπ ζηα νξζφινγα ηνπ θάζε γνληδίνπ επηδεηήζεθε λα είλαη ν κέγηζηνο δπλαηφο. ηελ Δηθφλα 29A παξνπζηάδεηαη ην πξφηππν απφ ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ PDX1, BRNF θαη NEUR, φπσο αλαγλσξίζηεθε απφ ην πξφγξακκα FrameWorker ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ WISP1. Σν ζπγθεθξηκέλν πξφηππν μερψξηζε κεηαμχ ησλ άιισλ ιφγσ ηνπ ελδηαθέξνληνο αλαπηπμηαθνχ ξφινπ ησλ παξαγφλησλ ηνπ θαη ιφγσ ηεο πςειήο ζπληήξεζήο ηνπ. Κπξίσο φκσο επηιέρζεθε θαζψο πεξηιακβάλεη κέιε απφ ηηο πξναλαθεξζείζεο νηθνγέλεηεο παξαγφλησλ (Πίλαθεο 4 θαη 6) θαη επεηδή είρε αλαγλσξηζηεί θαη ζηα γνλίδηα γλσζηνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3 (Δηθφλα 23). ηε ζπλέρεηα, ην ζπγθεθξηκέλν πξφηππν αλαδεηήζεθε θαη ζηα αληίζηνηρα CTGF νξζφινγα. Σα απνηειέζκαηα ηεο ηειεπηαίαο αλαδήηεζεο θαίλνληαη ζηελ Δηθφλα 29Β. πγθξίλνληαο ηηο Δηθφλεο 23 θαη 29 δηαθξίλεηαη πσο ην πξφηππν PDX1-BRNF-NEUR, αλαδείρζεθε ζπληεξεκέλν θαη ζηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF. Μέζα ζην πξφηππν, γηα θάπνηα είδε νξγαληζκψλ, εθηφο απφ κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο απφ ηηο νηθνγέλεηεο PDX1, BRNF θαη NEUR πεξηιακβάλνληαλ θαη νη HNF1 θαη HNF6, πνπ αλήθνπλ ζηηο νκψλπκεο νηθνγέλεηεο θαη πνπ βξέζεθαλ ζην ζπληεξεκέλν ζχκπινθν θαηά ηελ αλάιπζε ησλ γνληδίσλ-γλσζηψλ ζηφρσλ. Έηζη, κε επίθεληξν ηηο πεξηνρέο φπνπ εληνπίζηεθαλ απηά ηα πξφηππα ηφζν γηα ηηο WISP1, φζν θαη γηα ηηο CTGF νξζφινγεο αθνινπζίεο αλαδεηήζεθαλ νη ζέζεηο πξφζδεζεο απηψλ αιιά θαη άιισλ παξαγφλησλ ζε ζηελή γεηηλίαζε δηεπξχλνληαο ιίγν ηηο πεξηνρέο ησλ πξνηχπσλ. Αλαγλσξίζηεθε έηζη κηα γνληδηαθή πεξηνρή ζπληεξεκέλε ζε φιεο ηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ηνπ WISP1 θαη ηνπ CTGF γνληδίνπ απφ ηνπο δέθα επηιεγκέλνπο νξγαληζκνχο (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο), ζηελ νπνία 98

99 κέιε απφ ηηο νηθνγέλεηεο παξαγφλησλ NEUR-PDX1-HNF1-HNF6-BRNF-LEFF πξνζδέλνληαλ ζε κηα πεξηνρή κήθνπο bp. Μφλν ηα γνλίδηα απφ ην είδνο M. mulatta (Macaque) απνηέιεζαλ εμαίξεζε, θαζψο ε ίδηα πεξηνρή εθηεηλφηαλ ζε κεγαιχηεξν εχξνο. Σν ζπληεξεκέλν ζχκπινθν κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ θαη ε ζρεηηθή ηνπ ζέζε ζπγθξηηηθά κε ην TSS (έληνλν άζπξν βέινο) ηνπ θάζε γνληδίνπ αλαπαξηζηψληαη ζηελ Eηθφλα 30. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηε ζεηξά εκθάληζήο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζρεηηθέο κεηαμχ ηνπο απνζηάζεηο παξνπζηάδνληαη ππφ θιίκαθα. Δηθφλα 29: Σν πξφηππν PDX1-BRNF-NEUR φπσο αλαγλσξίζηεθε απφ ην πξφγξακκα FrameWorker γηα θάπνηα είδε νξγαληζκψλ ζηηο γνληδηαθέο πεξηνρέο Α) ηνπ WISP1 θαη Β) ηνπ CTGF. Ζ αλαζηξνθή ησλ ζρεκάησλ ζπκβνιίδεη πξφζδεζε ησλ αληηζηνίρσλ παξαγφλησλ ζηε ζπκπιεξσκαηηθή αιιεινπρία. 99

100 Δηθφλα 30: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίζηεθε ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο ζηα WISP1 (κπιε γξακκή) θαη CTGF (άζπξε γξακκή) νξζφινγα. Γίπια θαη αλάκεζα ζε θάζε δεχγνο γνληδίσλ αλαγξάθεηαη ν νξγαληζκφο πνπ αλήθνπλ. (Kapasa et al., 2008). 100

101 Ο εληνπηζκφο ηνπ ίδηνπ ζπκπιφθνπ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηφζν ζηα γνλίδηα IA1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2 φζν θαη ζηα WISP1 θαη CTGF θαη κάιηζηα ζε φια ηα νξζφινγα απηψλ απφ ηα δέθα πξνεπηιεγκέλα είδε είρε σο απνηέιεζκα απφ ην ζχλνιν ησλ νηθνγελεηψλ ηνπ Πίλαθα 6 ζην επίθεληξν λα βξεζνχλ νη νηθνγέλεηεο NEUR, PDX1, HNF1, HNF6, LEFF θαη BRNF. Σν γεγνλφο φηη κέιε ηεο ηειεπηαίαο νηθνγέλεηαο βξίζθνληαλ ζηαζεξά κέζα ζηα πξφηππα ζε φια ηα γνλίδηα πνπ εμεηάζηεθαλ σο ηψξα έζεζε σο θαηψθιη αμηνπηζηίαο γηα ην p-value ησλ νηθνγελεηψλ ηελ ηηκή 2*10-2. ηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ πνπ εληνπίζηεθε ζηα νξζφινγα ησλ WIPS1 θαη CTGF βξέζεθαλ επίζεο ζέζεηο πξφζδεζεο γηα κέιε ησλ νηθνγελεηψλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ HOXF, OCT1 θαη AP4R. Μεηά ηε ζπιινγή ησλ WIPS1 θαη CTGF πξσηετλψλ, έγηλε ζηνίρηζε κε ην πξφγξακκα Muscle3.6 θαη αθνινχζσο θαηαζθεπάζηεθαλ θπινγελεηηθά δέλδξα κε ηε κέζνδν Neighbor Joining (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). ηα θιαδνγξάκκαηα ησλ Δηθφλσλ 31Α & Β, πνπ θαηαζθεπάζηεθαλ κε ην Treeview, αλαπαξίζηαηαη ε θπινγελεηηθή δηαζπνξά ησλ WISP1 θαη CTGF αληίζηνηρα. πγθξίλνληαο ηα δχν θιαδνγξάκκαηα δηαπηζηψλεηαη πσο παξνπζηάδνπλ θαηά βάζε θνηλή ηνπνινγία, ππνδειψλνληαο θαη θνηλή θπινγελεηηθή δηαζπνξά γηα ηα γνλίδηα WISP1 θαη CTGF. Παξάιιεια ε αλαδήηεζε ησλ δνκηθψλ πεξηνρψλ ησλ πξσηετλψλ WISP1 θαη CTGF ζηελ PFAM έδσζε ηα απνηειέζκαηα πνπ αλαπαξίζηαληαη ζηηο Eηθφλεο 32Α θαη 32Β. πγθξίλνληαο ηηο Eηθφλεο 32Α θαη 32Β θαίλεηαη φηη παξφιν πνπ ε πξσηεΐλε CTGF είλαη κηθξφηεξε απφ ηελ WISP1, 348 θαη 367 θαηάινηπα αληίζηνηρα, νη ηέζζεξεηο δνκηθέο πεξηνρέο ηαπηνπνηήζεθαλ θαη ζηηο δχν πξσηεΐλεο. 101

102 Δηθφλα 31: Φπινγελεηηθή δηαζπνξά ησλ νξζνιφγσλ πξσηετλψλ (A) WISP1 θαη (Β) CTGF. 102

103 Δηθφλα 32: Οη ζπληεξεκέλεο δνκηθέο πεξηνρέο ζην κφξην ηεο πξσηεΐλεο (Α) WISP1 θαη (Β) CTGF. Ζ δνκηθή πεξηνρή 1 νλνκάδεηαη IGF (Insulin-like Growth Factor)-binding domain, ε δνκηθή πεξηνρή 2 VWC (Von Willebrand type C domain), ε δνκηθή πεξηνρή 3 TSP1(ThromboSPondin-1), θαη ε δνκηθή πεξηνρή 4 είλαη θαξβνμπηειηθή πεξηνρή πινχζηα ζε θαηάινηπα θπζηεΐλεο (Cys-knot) (Kapasa et al., 2008). πδήηεζε Σα απνηειέζκαηα απηά αλέδεημαλ φρη κφλν ηελ θνηλή θπινγελεηηθή δηαζπνξά ησλ WISP1 θαη CTGF αιιά θαη ηελ χπαξμε κηαο ζπληεξεκέλεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο, φπσο πξνέθπςε απφ ηε ζπγθξηηηθή αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ νξζνιφγσλ ηνπο. Πξφθεηηαη γηα ηελ πεξηνρή φπνπ ν NGN3 ζπλεληνπίζηεθε κε άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο, νη νπνίνη παίδνπλ ζεκαληηθνχο ξφινπο ζηηο δηαδηθαζίεο ηεο εκβξπηθήο αλάπηπμεο ηνπ παγθξέαηνο. Οη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο απφ ηηο νηθνγέλεηεο PDX1, HNF1, HNF6, BRNF θαη LEFF, πνπ καδί κε ηνλ NGN3 ζπγθξνηνχζαλ ζχκπινθν, έρνπλ κεγάιε αλαπηπμηαθή ζεκαζία θαζψο εκπιέθνληαη ζε δηαδηθαζίεο δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο. Δπίζεο, αμίδεη λα ζεκεησζεί πσο ν ζπλεληνπηζκφο ηνπο ζε κηα πεξηνρή πνπ εκθαληδφηαλ ζπληεξεκέλε ζε φιεο ηηο νξζφινγεο πεξηνρέο γηα ηα γνλίδηα WIPS1 θαη CTGF, φπσο θαη γηα ηα γνλίδηα IA1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2 νδεγεί ζην ζπκπέξαζκα πσο πξφθεηηαη πηζαλφηαηα γηα θάπνην ζπληεξεκέλν εληζρπηή, αθνχ γηα ηα πεξηζζφηεξα γνλίδηα εληνπίζηεθε καθξηά απφ ην TSS ησλ γνληδίσλ. Ζ κεγάιε ιεηηνπξγηθή ζεκαζία απηνχ ηνπ εληζρπηή νδήγεζε ζηε ζπληήξεζή ηνπ κεηαμχ ησλ εηδψλ. Παξάιιεια ε θνηλή κεηαγξαθηθή ξχζκηζε ησλ γνληδίσλ WIPS1 θαη CTGF απφ ηνλ NGN3 απνδίδεηαη ζηελ παξνπζία ηνπ εληζρπηή θαη ζηα δχν απηά γνλίδηα (Δηθφλα 30). Απφ ηελ άιιε πιεπξά ν ζπλεληνπηζκφο ζην πξνεγνχκελν ζχκπινθν θαη θάπνησλ παξαγφλησλ απφ ηηο νηθνγέλεηεο HOXF, OCT1 θαη AP4R ζηα γνλίδηα WIPS1 θαη CTGF θξίζεθε ελδηαθέξσλ, αθνχ νξηζκέλα κέιε ησλ δχν πξψησλ 103

104 νηθνγελεηψλ ελδέρεηαη λα ζπκκεηέρνπλ γεληθφηεξα ζηελ εκβξπνγελεηηθή δηαδηθαζία ( ). Ζ ηξίηε δε νηθνγέλεηα πεξηιακβάλεη κφλν ηνλ παξάγνληα AP4 (Activator Protein 4), ν νπνίνο έρεη βξεζεί λα πξνζδέλεηαη ζε κηα αιιεινπρία κε ξφιν εληζρπηή, πνπ θαζνξίδεη ηα επίπεδα κεηαγξαθήο πνιιψλ εμσθξηλψλ γνληδίσλ ηνπ παγθξέαηνο θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε ( ). Χζηφζν ε επηιεθηηθή παξνπζία ησλ παξαγφλησλ απφ ηηο ηειεπηαίεο ηξεηο νηθνγέλεηεο ζηα θαηαζηειιφκελα WIPS1 θαη CTGF θαη φρη ζηα επαγφκελα γνλίδηα IA1, PAX4, NEUROD1 θαη NKX2.2 απαηηεί πεξαηηέξσ δηεξεχλεζε. Δπίζεο ηα απνηειέζκαηα απφ ηελ αλαδήηεζε ζπληεξεκέλσλ δνκηθψλ πεξηνρψλ έδεημαλ πσο νη πξσηεΐλεο WISP1 θαη CTGF κνηξάδνληαη ζε κεγάιν βαζκφ παξφκνηνπο ξφινπο θαη ζπκκεηέρνπλ ζε θνηλέο βηνινγηθέο δηαδηθαζίεο. Πξάγκαηη ε θνηλή ξχζκηζε ησλ δχν γνληδίσλ απφ ην κνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ ελεξγνπνηνχλ νη πξσηεΐλεο WNT (150, 153, 159) επηβεβαηψλεηαη απφ ηελ παξνπζία ηνπ παξάγνληα LEF1 ζην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν. Ο ηειεπηαίνο παξάγνληαο, φπσο πξναλαθέξζεθε, δηαδξακαηίδεη θπξίαξρν ξφιν ζην ζπγθεθξηκέλν κνλνπάηη (144, 145). πλνςίδνληαο, ε θνηλή θπινγελεηηθή πνξεία απηψλ ησλ δχν γνληδίσλ δηθαηνινγεί ηε δηαηήξεζε ησλ ηεζζάξσλ δηαθξηηψλ δνκηθψλ πεξηνρψλ ζηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ ηνπο θαη επεθηείλεηαη θαη ζε θνηλέο ξπζκηζηηθέο αθνινπζίεο, νη νπνίεο εμεγνχλ θαη ηελ απφ θνηλνχ ξχζκηζε ηνπο απφ ηνλ NGN3, ζχκθσλα κε ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα (62). Έηζη ηα δεδνκέλα απφ πεηξάκαηα κε ρξήζε κηθξνζπζηνηρηψλ DNA (62), θαζψο θαη κε RT-PCR αληηδξάζεηο (154) πνπ ππνδείθλπαλ ηελ απφ θνηλνχ ξχζκηζε ησλ γνληδίσλ CTGF θαη WISP1 απφ ηνλ NGN3 επηβεβαηψζεθαλ θαη in silico Γεύηεξν Μέξνο: Αλάιπζε ηωλ Παξαιόγωλ ηνπ WNT5 Πξνϋπάξρνπζα γλώζε Φπινγελεηηθέο αλαιχζεηο ππνδείθλπαλ πσο ην γνλίδην WΝΣ5 (WiNgless-relaTed MMTV integration site 5) δηπιαζηάζηεθε θαηά ηνλ δηαρσξηζκφ ησλ γλαζφζηνκσλ απφ ηα άγλαζα ζπνλδπισηά (160, 161). Πξάγκαηη ζηα γλαζφζηνκα βξίζθνπκε δχν παξάινγα ηνπ γνληδίνπ (WNT5A θαη WNT5B), ελψ ζηα άγλαζα ζπνλδπισηά 104

105 (Petromyzon marinus) θαη ζηα πξσηνζηφκηα (Drosophila melanogaster) θαη δεπηεξνζηφκηα αζπφλδπια (Ciona intestinalis) κφλν έλα. Πεηξάκαηα δηεξεχλεζεο ηνπ ξφινπ ηνπ WNT5 ζε είδε κε δχν παξάινγα, θαη ζπγθεθξηκέλα ζηνλ πνληηθφ, έδεημαλ φηη κφλν ην WNT5A έρεη ηελ ηθαλφηεηα λα θαηεπζχλεη ηε κεηαλάζηεπζε ησλ θπηηάξσλ πνπ παξάγνπλ ηλζνπιίλε θαηά ηηο δηαδηθαζίεο πνπ νδεγνχλ ζηελ αλάπηπμε ηoπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο (147, 162). Δπίζεο, κεηξήζεηο ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο κε κηθξνζπζηνηρίεο, νη νπνίεο ζπλνςίδνληαη ζηνλ Πίλαθα 7, απνθάιπςαλ πσο ην WNT5A εκθαλίδεη δηαθνξνπνηεκέλα επίπεδα έθθξαζεο κεηά απφ ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 ζε πξφδξνκα παγθξεαηηθά θχηηαξα πνληηθνχ, ελψ ην WNT5B δελ επεξεάδεηαη (49, 62). Γνλίδην Αιιαγή Έθθξαζεο WNT5A WNT5B Πίλαθαο 7: Αιιαγή ηεο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ WNT5A θαη WNT5B φπσο αληρλεχζεθε απφ ηα επίπεδα mrna πνπ κεηξήζεθαλ 48 ψξεο κεηά απφ ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 (Serafimidis et al., 2008). Δπηπξνζζέησο, κειέηεο δηεξεχλεζεο ηνπ ξφινπ ηνπ WNT5 ζην ςάξη Zebrafish έδεημαλ πσο ην ZfWNT5 δείρλεη ίδην πξφηππν έθθξαζεο κε ην WNT5A ηνπ πνληηθνχ ( ). Αληηζέησο, κειέηεο ζχγθξηζεο ακηλνμηθψλ αθνινπζηψλ ππέδεημαλ κεγαιχηεξε νκνηφηεηα ηεο αθνινπζίαο ηνπ κε απηή ηνπ WNT5Β ηνπ πνληηθνχ (167). Χζηφζν ε δηαηήξεζε ηνπ WNT5 αληηγξάθνπ κεηά ην δηπιαζηαζκφ θαίλεηαη πσο έρεη ιεηηνπξγηθή ζεκαζία, αθνχ ζε νξηζκέλα είδε θαη ηα δχν γνλίδηα ιεηηνπξγνχλ ζπλεξγηθά θαη αληαγσληζηηθά ζε έλα ξπζκηζηηθφ δίθηπν ειέγρνληαο ην θαλνληθφ θαη ηα κε θαλνληθά κνλνπάηηα πνπ θαζνδεγνχλ νη πξσηεΐλεο WNT, ηα νπνία κε ηε ζεηξά ηνπο ειέγρνπλ θαίξηεο βηνινγηθέο δηαδηθαζίεο (168). ηελ Δηθφλα 33 παξηζηάλεηαη ζρεκαηηθά ην θαλνληθφ κνλνπάηη πνπ ελεξγνπνηνχλ νη πξσηεΐλεο WNT. Χζηφζν ππάξρνπλ θαη ηα κε θαλνληθά WNT κνλνπάηηα πνπ δε ζρεηίδνληαη κε ηελ απνδφκεζε ηεο β-θαηελίλεο αιιά κε ηελ αιιαγή ηεο ελδνθπηηάξηαο ζπγθέληξσζεο ησλ ηφλησλ αζβεζηίνπ (Ca +2 ) θαη ηελ πνιηθφηεηα ηνπ θπηηάξνπ (169). 105

106 Δηθφλα 33: Σν θαλνληθφ κνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ ελεξγνπνηνχλ νη πξσηεΐλεο WNT (Alberts et al., 2002). ηόρνο - ρέδην εξγαζίαο Έρνληαο σο θχξην ζηφρν ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηνπ WNT5 παξαιφγνπ απφ θάζε νξγαληζκφ πνπ ζπκκεηέρεη ζην ξπζκηζηηθφ δίθηπν ηνπ NGN3 έγηλε αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ ηνπο πεξηνρψλ. Πξνο ηνχην εθαξκφζηεθε ε πξνεγνχκελε κεζνδνινγία κε ηηο θαζνξηζκέλεο πιένλ παξακέηξνπο ζηα γνλίδηα WNT5Α θαη WNT5Β δηεξεπλψληαο ηελ χπαξμε ζέζεσλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3 αιιά θαη νιφθιεξνπ ηνπ ζπκπιφθνπ ησλ παξαγφλησλ, πνπ πξναλαθέξζεθαλ, ζηα νξζφινγα ησλ WNT5 γνληδίσλ. Γηα ηηο αλάγθεο ηεο παξνχζαο αλάιπζεο ζηνπο νξγαληζκνχο πνπ κειεηήζεθαλ ζπκπεξηιήθζε θαη ν νξγαληζκφο Petromyzon marinus (Lamprey), ν κνλαδηθφο αληηπξφζσπνο ησλ αγλάζσλ κε πιήξσο πξνζδηνξηζκέλν γνληδίσκα, πνπ δηαζέηεη πάγθξεαο. Χο αξλεηηθνί κάξηπξεο 106

107 κειεηήζεθαλ ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ B-ACTIN θαη HBB1 (HemogloΒin subunit Βeta 1-β ζθαηξίλε) πνπ δε ραξαθηεξίδνληαη απφ εηδηθή έθθξαζε θαηά ηελ αλάπηπμε ηνπ παγθξέαηνο. Απψηεξνο ζηφρνο ηεο παξνχζαο αλάιπζεο ήηαλ λα δηεξεπλεζεί ε χπαξμε ελφο ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ πνπ λα ζρεηίδεηαη κε ηελ επηιεθηηθή επαγσγή θαη ζπκκεηνρή ηνπ εθάζηνηε παξαιφγνπ ζην ξπζκηζηηθφ κνλνπάηη πνπ θαζνδεγεί ν NGN3. Πξνθεηκέλνπ λα εθηηκεζεί ε ζπκκεηνρή ζηελ αλάπηπμε ηνπ παγθξέαηνο δηαθνξεηηθνχ WNT5 γνληδίνπ γηα θάζε νξγαληζκφ έγηλε επηπιένλ εθηεηακέλε κειέηε δεδνκέλσλ έθθξαζεο απηψλ ζε δηάθνξεο θπηηαξηθέο ζεηξέο. Δπηπξνζζέησο, εμεηάδνληαο ην βαζκφ ζπληήξεζεο ησλ γνληδηαθψλ πεξηνρψλ αλαδεηήζεθαλ νη ζπληεληθέο πεξηνρέο ησλ WNT5A θαη WNT5B. Σέινο, έγηλε πξνζπάζεηα δηεξεχλεζεο ηνπ ξφινπ ησλ WNT5 παξαιφγσλ κέζσ αλαδήηεζεο ζπληεξεκέλσλ δνκηθψλ πεξηνρψλ ζηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ πνπ θσδηθνπνηνχλ. Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα Αξρηθά αλαδεηήζεθαλ ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ WNT5Α θαη WNT5Β ζε νξγαληζκνχο πνπ εθπξνζσπνχλ ηα πξσηνζηφκηα (Drosophila melanogaster) θαη ηα δεπηεξνζηφκηα αζπφλδπια (Ciona intestinalis), ηα άγλαζα ζπνλδπισηά (Petromyzon marinus) θαη ηα γλαζφζηνκα ζπνλδπισηά (Πίλαθαο 1 Παξαξηήκαηνο). ηελ Δηθφλα 34 θαίλεηαη ε θπινγελεηηθή δηαζπνξά ησλ WNT5 πξσηετλψλ απφ ηα είδε πνπ εμεηάζηεθαλ. ην θιαδφγξακκα ηεο Δηθφλαο 34, πνπ πξνέθπςε κεηά απφ ζηνίρηζε ησλ WNT5 πξσηετλψλ, θαίλεηαη πσο νη αιιεινπρίεο απφ ηνπο νξγαληζκνχο Ciona, Drosophila θαη Petromyzon εληνπίζηεθαλ ζε δηαθνξεηηθνχο θιάδνπο ζε ζρέζε κε ηηο WΝΣ5Α θαη WΝΣ5Β πξσηεΐλεο ησλ γλαζνζηνκάησλ πνπ νκαδνπνηήζεθαλ. 107

108 Δηθφλα 34: H θπινγελεηηθή δηαζπνξά ησλ WNT5 πξσηετλψλ απφ ηα είδε πνπ εμεηάζηεθαλ. ηηο Δηθφλεο 35Α θαη 35Β παξνπζηάδνληαη νη ζπληεληθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ WNT5A θαη WNT5B αληίζηνηρα, ελψ νη ζπληεληθέο πεξηνρέο γηα ηα κνλαδηθά WNT5 γνλίδηα ησλ νξγαληζκψλ Lamprey (P. marinus), Ciona (C. intestinalis), θαη Drosophila (D. melanogaster) παξνπζηάδνληαη ζηελ Δηθφλα 35Γ. 108

109 Δηθφλα 35: Οη ζπληεληθέο πεξηνρέο γηα ηα γνλίδηα (Α) WNT5A θαη (Β) WNT5B ησλ γλαζφζηνκσλ θαη (Γ) WNT5 ησλ αζπφλδπισλ θαη ησλ αγλάζσλ (Kapasa et al., 2010). Απφ ηηο παξαπάλσ ζπληέληεο δηαπηζηψλεηαη πσο νη πεξηνρέο πιεζίνλ ησλ WNT5 γνληδίσλ εκθαλίδνληαλ ζπληεξεκέλεο ζην ζχλνιν ηνπο, ελψ κφλν ζε νξηζκέλα είδε είραλ ιάβεη ρψξα κηθξήο έθηαζεο αλαζηξνθέο. Πην ζπγθεθξηκέλα, ην γνλίδην WΝΣ5Α πεξηζηνηρηδφηαλ απφ ηα γνλίδηα ERC2 θαη CACNA2D3, δηαηεξψληαο ην LTRM1 πιεζίνλ ηνπ. Απφ ηελ άιιε πιεπξά, ην γνλίδην WNT5B πιαηζησλφηαλ απφ ηα ADIPOR2 θαη FBXL14, έρνληαο ην ERC1 πνιχ θνληά ζην FBXL14 γηα ηελ πιεηνςεθία ησλ νξγαληζκψλ. ρνιηάδνληαο ηηο ζπληεληθέο πεξηνρέο γηα ην έλα κφλν WNT5 γνλίδην ηoπ 109

110 νξγαληζκνχ Lamprey, ηα γνλίδηα CACNA2D3 θαη ADIPOR2 βξίζθνληαλ πξνο ηελ ίδηα πιεπξά ηνπ WNT5, ελψ ηα πξναλαθεξζέληα γνλίδηα βξέζεθαλ λα πιαηζηψλνπλ αληίζηνηρα ηα WNT5A θαη WNT5B ησλ γλαζφζηνκσλ. Δπηπιένλ ηα γνλίδηα ERC1, ERC2 θαη FBXL14 πνπ πιαηζίσλαλ ηα WNT5A θαη WNT5B ησλ γλαζφζηνκσλ αλαγλσξίζηεθαλ πιεζίνλ ηνπ κνλαδηθνχ WNT5 ζηα αζπφλδπια Ciona θαη Fruitfly (Drosophila melanogaster) αληίζηνηρα. Απφ ηελ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ WNT5 γνληδίσλ εμαηξέζεθαλ ηα αζπφλδπια (Ciona θαη Fruitfly) θαζψο δε δηαζέηνπλ πάγθξεαο, ελψ γηα ηα ππφινηπα είδε αθνινπζήζεθε ε ίδηα αθξηβψο δηαδηθαζία πνπ εθαξκφζηεθε θαη ζηελ πξψηε θάζε. Λακβάλνληαο ππ' φςηλ ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα (62) πνπ ππνδείθλπαλ ηε ξχζκηζε κφλν ηνπ WNT5A ηνπ πνληηθνχ απφ ηνλ NGN3, αξρηθά αλαδεηήζεθαλ νη ζέζεηο πξφζδεζεο ηνπ παξάγνληα απηνχ ζηα δχν WNT5 γνλίδηα ηνπ νξγαληζκνχ. Πξάγκαηη, ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο 4000bp αλνδηθά ηνπ TSS έσο 500bp θαζνδηθά απηνχ, ν NGN3 εκθάληδε κφλν κία ζέζε πξφζδεζεο ζην γνλίδην WNT5B, έλαληη πέληε ζέζεσλ ζην WNT5A. Αθνινχζεζε πην εθηεηακέλε αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ φισλ ησλ WNT5 γνληδίσλ κε ζηφρν ηελ αλεχξεζε ηνπ ζπκπιφθνπ κε ηνπο παξάγνληεο απφ ηηο έμη νηθνγέλεηεο, πνπ εληνπίζηεθε ζηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ-γλσζηψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3, αιιά θαη ζηα νξζφινγα ησλ ζπγθαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF. ηνλ Πίλαθα 8 παξνπζηάδνληαη νη ηηκέο p-value γηα ηηο νηθνγέλεηεο ζηηο νπνίεο αλήθνπλ νη παξάγνληεο ηνπ ζπκπιφθνπ, φπσο πξνέθπςαλ θαηά ηελ αλάιπζε ησλ WNT5 παξαιφγσλ. ηνλ Πίλαθα 8 θαίλεηαη πσο νη ηηκέο p-value θαη ησλ έμη νηθνγελεηψλ βξίζθνληαλ θάησ απφ ην ειάρηζην θαηψθιη (2*10-2 ), φπσο απηφ δηακνξθψζεθε πξνεγνπκέλσο θαη έηζη ε πξφβιεςε ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο απηψλ ζεσξήζεθε αμηφπηζηε. Oηθνγέλεηα Μεηαγξαθηθψλ Παξαγφλησλ p-value LEFF NEUR PDX HNF HNF BRNF Πίλαθαο 8: Οη ηηκέο p-value γηα ηηο έμη νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηνπ ζπληεξεκέλνπ ζπκπιφθνπ ζηα WNT5 γνλίδηα. 110

111 Πξάγκαηη κε ρξήζε θίιηξσλ γηα ηα απνηειέζκαηα ησλ θνηλψλ ζέζεσλ πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ θαη κε ηε δηαδηθαζία πνπ ήδε πεξηγξάςακε αλαγλσξίζηεθε ην ζχκπινθν κε ηνπο παξάγνληεο απφ ηηο πξναλαθεξζείζεο έμη νηθνγέλεηεο ζε νξηζκέλα απφ ηα WNT5 γνλίδηα ην νπνίν παξνπζηάδεηαη ζηελ Δηθφλα 36. Δηθφλα 36: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίζηεθε ην ζπληεξεκέλν ζχκπινθν ζηα WNT5 γνλίδηα ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ηνλ δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ παξνπζηάδνληαη κε ηε ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κε ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο (Kapasa et al., 2010). ηελ Δηθφλα 36 θαίλεηαη πσο ην ζχκπινθν ησλ έμη παξαγφλησλ εληνπίζηεθε ζπληεξεκέλν ζε έλα ηνπιάρηζηνλ WNT5 γνλίδην ζε φινπο ηνπο νξγαληζκνχο πνπ κειεηήζεθαλ. Γηα νξηζκέλα θαηψηεξα γλαζφζηνκα, σζηφζν βξέζεθε θαη ζηα δχν WNT5 παξάινγα, ελψ ζην ςάξη Zebrafish, γηα πξψηε θνξά ζηελ εμειηθηηθή 111

112 θιίκαθα, ην ζχκπινθν ράζεθε ζην έλα απφ ηα δχν γνλίδηα. ηελ ίδηα εηθφλα θαίλεηαη επίζεο πσο ζε ζηελά ζπγγεληθά είδε, φπσο ζηνλ άλζξσπν, ηνλ πνληηθφ θαη ηνλ πίζεθν (Macaque), ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν εληνπίζηεθε ζε δηαθνξεηηθά WNT5 γνλίδηα. Πξνθεηκέλνπ λα δηεξεπλεζεί απηή ε παξάδνμε αιιαγή έγηλε αλάιπζε ησλ δεδνκέλσλ έθθξαζεο ησλ WNT5 γνληδίσλ ζ απηά ηα είδε νξγαληζκψλ απφ δηάθνξεο θπηηαξηθέο ζεηξέο θαη ππφ πνηθίιεο ζπλζήθεο. Πην ζπγθεθξηκέλα εμήρζεθαλ ηα πξφηππα έθθξαζεο ησλ WNT5 ζε δηαθνξνπνηεκέλα θχηηαξα πνηθίισλ ηχπσλ ζηνλ άλζξσπν θαη ζε θχηηαξα δηαθφξσλ αλαπηπμηαθψλ ζηαδίσλ, θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο, ζηνλ πνληηθφ (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). Σα απνηειέζκαηα θαίλνληαη ζηηο Δηθφλεο 37 θαη 38. Πην αλαιπηηθά, ζηελ Δηθφλα 37 θαίλεηαη πσο ηα δχν WNT5 γνλίδηα επηδείθλπαλ παξφκνηα πξφηππα έθθξαζεο ζηα δηαθνξνπνηεκέλα θχηηαξα φισλ ησλ ηζηψλ. Δηθφλα 37: Έθθξαζε ησλ WNT5A θαη WNT5B γνληδίσλ ζηα θχηηαξα δηαθφξσλ ηχπσλ απφ ηζηνχο πγηψλ ελειίθσλ αλζξψπσλ. ηνλ άμνλα ρ αλαγξάθεηαη ην είδνο ηνπ ηζηνχ ηα θχηηαξα ηνπ νπνίνπ εμεηάζηεθαλ, ελψ ζηνλ άμνλα y ν βαζκφο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ (Kapasa et.al., 2010). 112

113 Δηθφλα 38: Έθθξαζε ησλ WNT5A θαη WNT5B γνληδίσλ ζηα θχηηαξα δηαθφξσλ αλαπηπμηαθψλ ζηαδίσλ θαηά ηε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο ζε έκβξπα πνληηθψλ. Ο άμνλαο ρ ππνδειψλεη ηελ ειηθία ησλ θπηηάξσλ ζε εκέξεο κεηά ηε γνληκνπνίεζε (Δ), ελψ ν άμνλαο y ηνλ βαζκφ έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ (Kapasa et.al., 2010). Απφ ηελ άιιε πιεπξά, ε κειέηε ηεο έθθξαζεο ησλ WΝΣ5 θαηά ηελ δηαθνξνπνίεζε πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ πνληηθνχ κεηαμχ ησλ εκεξψλ 12.5 θαη 16.5, θαηέδεημε κεγαιχηεξε έθθξαζε ηνπ WNT5Α (θνξέα ηνπ ζπκπιφθνπ) κέρξη ην ζηάδην ησλ 13.5 εκεξψλ, ελψ θαηά ηελ 14.5 εκέξα, νπφηε πιένλ έρνπλ ζρεκαηηζηεί νη ινβνί ηνπ παγθξέαηνο (13), ηα δχν γνλίδηα εθθξάδνληαλ εμίζνπ. ηε ζπλέρεηα (θαη κέρξη ηελ εκέξα 16.5), ην WNT5Α κείσζε ηελ έθθξαζή ηνπ πέθηνληαο ζε επίπεδα ρακειφηεξα απφ ην WNT5Β. Σα απνηειέζκαηα αλάιπζεο ηεο έθθξαζεο ησλ WΝΣ5 παξαιφγσλ ηνπ νξγαληζκνχ Macaque ζε εκβξπηθά βιαζηνθχηηαξα θαη ζε ήδε δηαθνξνπνηεκέλα θχηηαξα απφ πνηθίινπο ηζηνχο παξνπζηάδνληαη ζηηο Δηθφλεο 39Α θαη 39Β αληίζηνηρα. 113

114 Δηθφλα 39: Πξφηππα έθθξαζεο ησλ WNT5Α θαη WNT5Β (Α) ζε εκβξπηθά βιαζηνθχηηαξα θαη (Β) ζε δηαθνξνπνηεκέλα θχηηαξα απφ πνηθίινπο ηζηνχο πγηψλ ελειίθσλ αηφκσλ ηνπ νξγαληζκνχ Macaque. ηνλ άμνλα ρ αλαγξάθεηαη ν ηζηφο απφ ηνλ νπνίν απνκνλψζεθαλ ηα θχηηαξα πνπ εμεηάζηεθαλ, ελψ ζηνλ άμνλα y ν βαζκφο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ (Kapasa et al., 2010). Απφ ηελ ζπλεμέηαζε ησλ Δηθφλσλ 39Α θαη 39Β εμάγεηαη ην ζπκπέξαζκα πσο ην WNT5Α (θνξέαο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ) εθθξάδεηαη ζηαζεξά θαη ζπλερψο ζε αληίζεζε κε ην WNT5Β. Σα παξάινγα ηνπ γνληδίνπ WNT5 πνπ αλαιχζεθαλ σο πξνο ηελ χπαξμε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ θαη ε ππφζεζε δηπιαζηαζκνχ ηνπο θαηά ηελ εμέιημε αλαπαξίζηαληαη ζηελ Δηθφλα

115 Δηθφλα 40: Σα παξάινγα ηνπ γνληδίνπ WNT5 κε ην ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν, φπνπ εληνπίζηεθε, ην νπνίν ππνδειψλεηαη κε ην κηθξφ καχξν θνπηί. Παξάιιεια ππνδειψλεηαη κε γθξη θνπθίδα ν ελδερφκελνο δηπιαζηαζκφο ηνπ WNT5 θαηά ην δηαρσξηζκφ ησλ γλαζφζηνκσλ απφ ηα άγλαζα (Kapasa et al., 2010). Πξνθεηκέλνπ λα ειεγρζεί πεξαηηέξσ ε επαηζζεζία ηεο κεζφδνπ πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε αλαιχζεθαλ κε ηελ ίδηα δηαδηθαζία νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο γηα ηα νξζφινγα απφ ηνπο ίδηνπο νξγαληζκνχο γηα δχν γνλίδηα-αξλεηηθνχο κάξηπξεο. Πξφθεηηαη γηα ην γνλίδην B-ACTIN (β-αθηίλε) πνπ εθθξάδεηαη ζπλερψο θαη ζε θάζε είδνο θπηηάξνπ (170) θαη γηα ην γνλίδην HBB1 (β-ζθαηξίλε) ην νπνίν ελεξγνπνηείηαη ζε ζρεηηθά πξνρσξεκέλν ζηάδην ηεο εκβξπνγέλεζεο θαη ζπλερίδεη λα εθθξάδεηαη ζηνλ κπειφ ησλ νζηψλ ησλ ελειίθσλ (171, 172). Ο νξγαληζκφο Lamprey εμαηξέζεθε απφ ηελ αλάιπζε ηνπ HBB1 αθνχ δε δηαζέηεη αληίζηνηρν γνλίδην. Οη αλαιχζεηο ησλ γνληδίσλ απηψλ θαηέιεμαλ ζηνλ κε εληνπηζκφ ηνπ ζπκπιφθνπ ησλ πξνεπηιεγκέλσλ παξαγφλησλ ζηα νξζφινγά ηνπο κε κνλαδηθή εμαίξεζε ην γνλίδην ηεο B-ACTIN απφ ηνλ νξγαληζκφ Εebrafish, φπνπ νη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ έμη παξαγφλησλ ζπλεληνπίδνληαλ ζε κηα πεξηνρή δηπιάζηνπ σζηφζν κήθνπο ζε 115

116 ζρέζε κε ηελ αληίζηνηρε ξπζκηζηηθή πεξηνρή ηνπ WNT5B ηνπ ίδηνπ νξγαληζκνχ (173). Οη θσδηθνί πξφζβαζεο ησλ νξζνιφγσλ ησλ δχν γνληδίσλ παξαηίζεληαη ζηνπο Πίλαθεο 2 θαη 3 ηνπ παξαξηήκαηνο απηήο ηεο εξγαζίαο. Πξνθεηκέλνπ λα δηεξεπλεζεί ε ιεηηνπξγηθή αλαγθαηφηεηα δηαηήξεζεο θαη ησλ δχν γνληδίσλ ζηα αλψηεξα γλαζφζηνκα αλαδεηήζεθαλ νη δνκηθέο ιεηηνπξγηθέο πεξηνρέο ζηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ WΝΣ5 ηνπ πνληηθνχ (M. musculus) θαη ηνπ ηρζχνο Zebrafish (D. rerio), νη νπνίεο αλαπαξίζηαληαη ζηελ Eηθφλα 41. Δηθφλα 41: Γνκηθέο ιεηηνπξγηθέο πεξηνρέο ζηα κφξηα ησλ πξσηετλψλ WNT5Α θαη WNT5B ησλ νξγαληζκψλ M. musculus θαη D. rerio. Όπσο θαίλεηαη ζηελ παξαπάλσ εηθφλα νη δχν πξσηεΐλεο θέξνπλ ηηο ίδηεο δνκηθέο ιεηηνπξγηθέο πεξηνρέο πεξίπνπ ζηηο ίδηεο ζέζεηο ησλ κνξίσλ ηνπο. Πην αλαιπηηθά, ε πεξηνρή WNT1 εληνπίζηεθε κεηαμχ ησλ θαηαινίπσλ θαη ζηηο πξσηεΐλεο WNT5A θαη WNT5B ηνπ πνληηθνχ θαη κεηαμχ ησλ θαηαινίπσλ, θαη ζηηο αληίζηνηρεο πξσηεΐλεο ηνπ ηρζχνο Zebrafish. πδήηεζε Σα απνηειέζκαηα ηεο θπινγελεηηθήο αλάιπζεο επηβεβαίσζαλ ην δηπιαζηαζκφ ηνπ γνληδίνπ WNT5 θαηά ηνλ δηαρσξηζκφ ησλ γλαζφζηνκσλ ζπνλδπισηψλ απφ ηα άγλαζα, πξηλ πεξίπνπ 560 εθ. ρξφληα (160, 161). Ζ αλάιπζε ησλ ζπληεληψλ έδεημε πσο ν δηπιαζηαζκφο ηνπ γνληδίνπ ζπκπεξηέιαβε θαη ηε γεηηνληθή πεξηνρή, ε νπνία ζηε ζπλέρεηα ππέζηε ρξσκνζσκηθή κεηαηφπηζε. 116

117 Απηφ ην ηειεπηαίν ζπκπέξαζκα εμήρζε θαη απφ ηελ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ WNT5, φπνπ θάλεθε πσο ν δηπιαζηαζκφο ηνπ γνληδίνπ ζπκπεξηέιαβε θαη ηε ξπζκηζηηθή ηνπ πεξηνρή. ηελ πεξηνρή απηή βξέζεθε κηα νκάδα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ γλσζηήο ζπκκεηνρήο ζηε δηαδηθαζία κνξθνγέλεζεο ηνπ παγθξέαηνο, πνπ πηζαλφηαηα πξνζδέλνπλ θαη ξπζκίδνπλ ηελ έθθξαζε ηνπ WNT5. Με δεδνκέλν φηη ην WNT5 αλήθεη ζηελ WNT νηθνγέλεηα, ε παξνπζία ηνπ LEF1, πνπ δηακεζνιαβεί θαη ειέγρεη ην κνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ ελεξγνπνηνχλ νη WNT πξσηεΐλεο (174) ζην ζπληεξεκέλν ζχκπινθν θξίζεθε αμηνζεκείσηε. Φαίλεηαη πσο ε κεγάιε ιεηηνπξγηθή ζεκαζία ηεο πεξηνρήο φπνπ εληνπίζηεθε ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν είρε σο απνηέιεζκα λα δερζεί εμειηθηηθή πίεζε, ψζηε λα κελ αιιάμνπλ νη αιιεινπρίεο πξφζδεζεο ησλ παξαγφλησλ ζε απηήλ. Καηά ηελ πνξεία σζηφζν ηεο εμέιημεο δηαηεξήζεθαλ κφλνλ νη θσδηθέο πεξηνρέο ησλ πξντφλησλ ηνπ γνληδηαθνχ δηπιαζηαζκνχ, ελψ νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ζε θάπνηα WNT5 γνλίδηα άιιαμαλ ηφζν πνιχ θαη σο απνηέιεζκα απηά έραζαλ ηελ ηθαλφηεηα πξφζδεζεο ησλ έμη παξαγφλησλ. Δπηπξνζζέησο, κε ηε ρξνλνιφγεζε ηνπ δηπιαζηαζκνχ ηνπ WNT5 θαηά ηελ πεξίνδν δηαρσξηζκνχ ησλ γλαζφζηνκσλ ςαξηψλ απφ ηα άγλαζα (160, 161), δηθαηνινγήζεθε ε δηαηήξεζε ηεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο ζηα αληίγξαθα ηνπ WNT5 ζε κεξηθά γλαζφζηνκα ςάξηα. Χζηφζν ε απψιεηα ηνπ ελφο ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ θαίλεηαη λα ζπλέβε γηα πξψηε θνξά ζηνλ νζηετρζχ Εebrafish, γηα ηνλ νπνίν παξφκνηα θαηλφκελα ζεσξνχληαη ζπλεζηζκέλα (175, 176). Ίζσο, ινηπφλ, ζηηο αλαπηπμηαθέο δηαδηθαζίεο πνπ νδεγνχλ ζην ζρεκαηηζκφ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο ζπκκεηέρεη έλα ηνπιάρηζηνλ απφ ηα δχν WNT5 γνλίδηα ζε θάζε νξγαληζκφ. Πξάγκαηη, ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα γηα ηνλ πνληηθφ θαη ηνλ νζηετρζχ Zebrafish ελίζρπαλ ηε ζπζρέηηζε ηεο παξνπζίαο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ ζηα WNT5A θαη WNT5B αληίζηνηρα κε ηε ζπκκεηνρή ησλ γνληδίσλ απηψλ ζηε δηαδηθαζία ζρεκαηηζκνχ ηνπ παγθξέαηνο ζην έκβξπφ ηνπο (162, 167). Απφ ηελ άιιε πιεπξά ε δηαηήξεζε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ κφλν ζην WNT5B ηνπ αλζξψπνπ δηθαηνινγεί ην γεγνλφο φηη ην ζπγθεθξηκέλν γνλίδην θαη φρη ην παξάινγφ ηνπ ζρεηίδεηαη κε ηελ εκθάληζε δηαβήηε ηχπνπ 2 ζηνλ άλζξσπν (177). Δπηπιένλ, γηα ηελ πεξίπησζε ηνπ πνληηθνχ ε παξνπζία ηεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο κφλν ζην WNT5A ζπκθσλεί κε ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα πνπ ππνδεηθλχνπλ φηη κφλν απηφ ην παξάινγν ξπζκίδεηαη απφ ηνλ NGN3 (62). πκπεξαζκαηηθά, ε παξνπζία ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, κε ηνπο έμη παξάγνληεο, ζε έλα WNT5 ζπλδέζεθε κε ηε 117

118 ζπκκεηνρή απηνχ ηνπ γνληδίνπ ζηηο αλαπηπμηαθέο δηαδηθαζίεο ζρεκαηηζκνχ ηνπ ελδνθξηλνχο παγθξέαηνο. Απηφ ελδπλακψζεθε θαη απφ ηελ απνπζία ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ απφ γνλίδηα ησλ νπνίσλ ε έθθξαζε είλαη αλεμάξηεηε απφ ηελ εκβξπνγελεηηθή δηαδηθαζία ηνπ παγθξέαηνο, είηε πξφθεηηαη γηα ζπλερψο εθθξαδφκελα γνλίδηα (β-αθηίλε), είηε γηα κε εθθξαδφκελα γνλίδηα (β-ζθαηξίλε). Δπίζεο, ελδεηθηηθή ηνπ ξφινπ ηεο ξπζκηζηηθήο αιιεινπρίαο ήηαλ θαη ε αλεχξεζή ηεο ζηνλ νξγαληζκφ Lamprey, θαζψο απηφο δηαζέηεη πάγθξεαο θαη θχηηαξα πνπ παξάγνπλ ηλζνπιίλε. πλνςίδνληαο ηα απνηειέζκαηα αλάιπζεο ηεο έθθξαζεο ησλ WΝΣ5Α θαη WΝΣ5Β, ζε άλζξσπν, πνληηθφ θαη πίζεθν (Macaque), απνδείρζεθε ε αλαγθαηφηεηα δηαηήξεζεο θαη ησλ δχν γνληδίσλ ζηνλ ελήιηθα νξγαληζκφ φπσο θαη ε ζχλδεζε ηεο παξνπζίαο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ ζην WNT5Α κε ηε ζπκκεηνρή απηνχ ζηελ εκβξπηθή αλάπηπμε ηνπ παγθξέαηνο ηνπ πνληηθνχ. Πξάγκαηη ζχκθσλα κε ηε βηβιηνγξαθία (162), ην WNT5Α πνπ θέξεη θαη ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν (173), θαζνδεγεί ηε κεηαλάζηεπζε ησλ πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ, ψζηε λα ζρεκαηηζηνχλ ηα λεζίδηα ηνπ παγθξέαηνο ησλ πνληηθψλ. Ζ ηειεπηαία δηαδηθαζία εθηηκάηαη πσο ζπκβαίλεη θαηά ηε δηάξθεηα ησλ εκεξψλ φπνπ έρνπκε εληνλφηεξε έθθξαζε ηνπ WNT5Α (13, 42). Παξάιιεια, απφ ηα απνηειέζκαηα απηά ππνδειψλεηαη θαη ε ιεηηνπξγηθή ζεκαζία ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ εληφο ηνπ WΝΣ5Α γνληδίνπ ηνπ πηζήθνπ. Απφ ηα απνηειέζκαηα αλαδήηεζεο δνκηθψλ ιεηηνπξγηθψλ πεξηνρψλ ε παξνπζία ηεο WΝΣ1 πεξηνρήο ζηηο WNT5 πξσηεΐλεο βξέζεθε λα είλαη ζπλπθαζκέλε κε ηνλ ξφιν ησλ γνληδίσλ απηψλ ζηε κεηαλάζηεπζε ησλ θπηηάξσλ θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε, ψζηε λα ζρεκαηηζηεί ζσζηά ην πάγθξεαο, κέζσ αληαγσληζηηθνχ ειέγρνπ ζην θαλνληθφ θαη κε θαλνληθφ κνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ δηακεζνιαβνχλ νη WNT πξσηεΐλεο ( ). Με ηε κεζφδν πνπ αθνινπζήζεθε γηα ηελ ππνινγηζηηθή αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ WNT5 επηβεβαηψζεθαλ ηα πεηξακαηηθά δεδνκέλα πνπ αλαθέξνπλ πσο δηαθνξεηηθά WNT5 παξάινγα ζε δηαθνξεηηθνχο νξγαληζκνχο κνηξάδνληαη ηνλ ίδην αλαπηπμηαθφ ξφιν. Απηφ ελίζρπζε ηελ αμηνπηζηία ηεο κεζφδνπ απηήο, ψζηε λα εθαξκνζηεί θαη ζε ζχλνια γνληδίσλ γηα ηα νπνία δελ ππήξραλ πεηξακαηηθά δεδνκέλα ζρεηηθά κε ην βηνινγηθφ ξφιν θαη ηνλ ηξφπν ξχζκηζήο ηνπο. 118

119 4.1.3 Αλάιπζε Πηζαλώλ ηόρωλ ηνπ NGN3 Πξνϋπάξρνπζα γλώζε ηελ ηξίηε θάζε ζην επίθεληξν ηεο αλάιπζεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ βξέζεθαλ γνλίδηα πνπ απνηεινχλ πηζαλνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3 (Πίλαθαο 9). Πξφθεηηαη γηα γνλίδηα ζηα νπνία απνδίδνληαη δηαθνξεηηθέο ιεηηνπξγίεο, ησλ νπνίσλ φκσο ε έθθξαζε, ζχκθσλα κε πεηξακαηηθά δεδνκέλα (62), είηε επαγφηαλ είηε θαηαζηειιφηαλ απφ ηελ επαγσγή ηνπ NGN3; θχξηνπ θαζνδεγεηή δηαθνξνπνίεζεο ησλ β-θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο (30, 49). Δπίζεο, αλαιχζεθαλ ηα γνλίδηα ALDH1B1 θαη BHLHB2 (Πίλαθαο 9), γηα ηα νπνία πξφζθαηεο αλαθνξέο (182, 183) έδεηρλαλ πσο ε έθθξαζή ηνπο επεξεάδεηαη απφ ηνλ παξάγνληα NGN3 θαη θαίλεηαη λα ζπκκεηέρνπλ ζην ζρεκαηηζκφ ηνπ παγθξέαηνο ζην πξψηκν έκβξπν πνληηθνχ. Σα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ ζηελ παξνχζα θάζε, ε αιιαγή ηεο έθθξαζήο ηνπο 48 ψξεο (h) κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 θαη ν βηνινγηθφο ξφινο πνπ ηνπο απνδίδεηαη παξνπζηάδνληαη ζηνλ Πίλαθα 9. ηόρνο - ρέδην εξγαζίαο Ζ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ ηνπ Πίλαθα 9, έγηλε πξνθεηκέλνπ λα εμεγεζεί ε αιιαγή έθθξαζήο ηνπο σο απνηέιεζκα ξχζκηζεο απφ ηνλ NGN3 θαη λα δηεξεπλεζεί ην επξχηεξν ξπζκηζηηθφ δίθηπν πνπ ειέγρεηαη απφ ηνλ NGN3. Πξνο ηνχην έγηλε αλαδήηεζε ζέζεσλ πξφζδεζεο γηα ηνλ παξάγνληα NGN3 θαη ζηε ζπλέρεηα αλαδήηεζε ηνπ ζπληεξεκέλνπ ζπκπιφθνπ (πνπ ηαπηνπνηήζεθε ζηα γνλίδηα ηεο πξψηεο θαη δεχηεξεο θάζεο), αθνχ ζχκθσλα κε ηα σο ηψξα απνηειέζκαηα ε εχξεζε ηνπ ζπκπιφθνπ κε ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ NEUR, PDX1, BRNF, HNF1, HNF6 θαη LEFF ζεσξήζεθε ελδεηθηηθή γηα ηε ζπκκεηνρή ηνπ εθάζηνηε γνληδίνπ ζηηο δηαδηθαζίεο δηαθνξνπνίεζεο, πνπ θαζνδεγνχληαη απφ ηνλ NGN3. Παξάιιεια, εμεηάζηεθε ε πξφζδεζε πξφζζεησλ παξαγφλησλ ή ε απνπζία θάπνησλ απφ ην ελ' ιφγσ ζπκπιφθν ζηα επαγφκελα ζε ζχγθξηζε κε ηα θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα. 119

120 Γνλίδην Δπαγσγή (+) Καηαζηνιή(-) Βηνινγηθφο Ρφινο DCX (DoubleCortin) Κπηηαξνζθειεηηθέο θαη κεκβξαληθέο αιιαγέο FGD4 (FYVE, RhoGEF and PH Domain containing 4) Μηθξέο GTP-πξνζδέλνπζεο πξσηεΐλεο - ξπζκηζηέο RGS4 (Regulator of G-protein Signaling 4) Μηθξέο GTP-πξνζδέλνπζεο πξσηεΐλεο - ξπζκηζηέο HUD (Hu antigen D) Πξφζδεζε RNA ALDH1B1 (ΑLdehyde DeHydrogenase 1 family, member B1) + Μεηαβνιηθέο δηαδηθαζίεο BHLHB2 (Βasic Helix-Loop- Helix domain containing, class B, 2) CDC42 (Cell Division Cycle 42 homolog) _ Μεηαβνιηθέο δηαδηθαζίεο Μνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο κέζσ ηληεγθξηλψλ PARD3 (PaR-3 partitioning Defective3 homolog C.elegans) Μνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο κέζσ ηληεγθξηλψλ PARD6B (PaR-6 partitioning Defective 6homolog C.elegans) Μνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο κέζσ ηληεγθξηλψλ VCL (VinCuLin) Μνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο κέζσ ηληεγθξηλψλ FZD2 (FriZzleD homolog 2 Drosophila) Μνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο WΝΣ Πίλαθαο 9: Tα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ ζηελ παξνχζα θάζε, ε αιιαγή ηεο έθθξαζήο ηνπο 48h κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 θαη ν βηνινγηθφο ηνπο ξφινο (Serafimidis et al., 2008). 120

121 Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα Ζ in silico κεζνδνινγία πνπ πξναλαθέξζεθε (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) εθαξκφζηεθε, κε ηηο παξακέηξνπο πνπ έρνπλ ήδε δηακνξθσζεί, ζηελ αλάιπζε ησλ νξζνιφγσλ ησλ γνληδίσλ ηνπ Πίλαθα 9. Καηά ηελ αλάιπζε απηψλ ησλ γνληδίσλ αλαγλσξίζηεθε ην ζχκπινθν κε ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ NEUR, PDX1, BRNF, HNF1, HNF6 θαη LEFF ζπληεξεκέλν γηα φια ηα γνλίδηα ζηελ πιεηνςεθία ησλ νξζνιφγσλ ηνπο. ηηο Δηθφλεο 1-11 ηνπ Παξαξηήκαηνο αλαπαξίζηαληαη νη ζπληεξεκέλεο πεξηνρέο, φπνπ εληνπίζηεθε ην ζχκπινθν γηα ηα γνλίδηα ηνπ Πίλαθα 9, φπσο αλαγλσξίζηεθαλ ζηα νξζφινγα απηψλ πνπ θαιχπηνπλ ηελ εμειηθηηθή απφζηαζε απφ ηα ςάξηα (εμειηθηηθά παιαηφηεξα είδε πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο) σο ηα ζειαζηηθά. Οη έμη νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ (ΝΔUR, PDX1, BRNF, HNF1, HNF6 θαη LEFF) θαίλεηαη πσο έρνπλ ζέζεηο πξφζδεζεο κέζα ζε πεξηνρέο εχξνπο, ζηελ πιεηνςεθία ησλ πεξηπηψζεσλ, ίζν κε bp. ηελ Δηθφλα 42 παξνπζηάδεηαη ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν φπσο αλαγλσξίζηεθε γηα ηα γνλίδηα ηνπ Πίλαθα 9 απφ ηνλ νξγαληζκφ M. musculus. Σα γνλίδηα απηά, ε επαγσγή ή θαηαζηνιή ηνπο ππφ ηελ επίδξαζε ηνπ NGN3 θαη ν ζρνιηαζκφο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ πνπ εκθάληζαλ θαίλνληαη ζπλνπηηθά ζηνλ Πίλαθα 10. Γνλίδην Αιιαγή Έθθξαζεο ρνιηαζκφο Ρπζκηζηηθνχ ηνηρείνπ DCX + Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν PARD3 + Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν FGD4 + Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν CDC42 + Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν ALDH1B1 + Μεξηθψο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν HUD + Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν RGS4 + Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν BHLHB2 - Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν FZD2 - Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν PARD6B - Μεξηθψο ζπληεξεκέλν VCL - Πιήξσο ζπληεξεκέλν ζηνηρείν Πίλαθαο 10: πλνπηηθφο ζρνιηαζκφο ηεο αιιαγήο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ απφ ηνλ NGN3 θαη ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ πνπ εκθάληζαλ ζην εχξνο ησλ νξζνιφγσλ πνπ εμεηάζηεθαλ γηα ην θαζέλα. 121

122 Δηθφλα 42: Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ απφ ηηο νηθνγέλεηεο NEUR, PDX1, BRNF, HNF1, HNF6 θαη LEFF, φπσο αλαγλσξίζηεθε ζηα γνλίδηα ηνπ πνληηθνχ. Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ζχκπινθν ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ηνλ δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ παξνπζηάδνληαη κε ηε ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κε ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο. ρεδφλ φια ηα γνλίδηα ηνπ Πίλαθα 10 βξέζεθαλ λα δηαζέηνπλ ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν, φπνπ πξνζδέλνληαλ κέιε απφ ηηο 6 πξναλαθεξζείζεο νηθνγέλεηεο κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, ζπληεξεκέλν ζε φια ηα νξζφινγα πνπ αλαιχζεθαλ. Δμαίξεζε απνηέιεζε ην γνλίδην ALDH1B1, ζην νπνίν ην ζχκπινθν βξέζεθε ζπληεξεκέλν κέρξη ηελ εμειηθηηθή βαζκίδα ησλ ακθηβίσλ (βάηξαρνο). Δπίζεο ην PARD6B, πνπ θαηαζηέιιεηαη ηζρπξφηαηα κεηά απφ επαγσγή ηνπ NGN3, 122

123 παξνπζίαζε ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ιηγφηεξν ζπληεξεκέλν, αθνχ απηφ δελ εληνπίζηεθε ζε φια ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ. Πην ζπγθεθξηκέλα ζηα πην απνκαθξπζκέλα εμειηθηηθά είδε, φπσο π.ρ. ζηα πηελά (φξληζα) θαη ζηνπο νζηετρζείο (Zebrafish, Fugu) ζην ζχκπινθν ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηε ζέζε ηνπ NGN3 ππνθαζηζηνχζε ν παξάγνληαο NEUROD1, πνπ δηαζέηεη ρακειφηεξε ζπγγέλεηα πξφζδεζεο ζε ζρέζε κε ηνλ NGN3 (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη παξ 3.7). Ζ παξνπζία παξαγφλησλ απφ ηηο νηθνγέλεηεο HOXF, OCT1 θαη AP4R πνπ ζπλεληνπίδνληαλ κέζα ζην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ησλ ζπγθαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ WISP1 θαη CTGF δηαπηζηψζεθε θαη γηα ηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο νξηζκέλσλ γνληδίσλ ηνπ Πίλαθα 10. Παξάιιεια, ζε νξηζκέλα γνλίδηα κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ζπκπιφθνπ βξίζθνληαλ θαη κέιε ησλ νηθνγελεηψλ CLOX, LHXF, FKHD, NKXH, HOXF θαη SORY. ε κηα πξνζπάζεηα δηεξεχλεζεο ηνπ ξφινπ ησλ παξαγφλησλ απφ ηηο νηθνγέλεηεο απηέο ζε ζρέζε κε ηελ αιιαγή ηεο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ, δηεξεπλήζεθαλ νη ζέζεηο πξφζδεζεο πνπ εκθάληδαλ ηα γνλίδηα ηνπ Πίλαθα 10 καδί κε απηέο ησλ WISP1 θαη CTGF κε ηε ρξήζε ηεο εθαξκνγήο TFDetector (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) σο πξνο ηηο πηζαλέο δηαθνξνπνηήζεηο ηνπο. Γηαπηζηψζεθε έηζη πσο ηα κέιε ησλ νηθνγελεηψλ CLOX, LHXF, FKHD, NKXH, HOXF, OCT1 θαη SORY αλεπξίζθνληαλ πεξηζηαζηαθά θαη φρη κφλν κέζα ζηηο πεξηνρέο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ φισλ ησλ γνληδίσλ. Οη παξάγνληεο απφ ηηο ηειεπηαίεο νηθνγέλεηεο ινηπφλ εκθάληδαλ γεληθφηεξα πνιιέο ζέζεηο πξφζδεζεο κέζα ζηηο ξπζκηζηηθέο αθνινπζίεο ησλ γνληδίσλ ρσξίο ζαθή πξνηίκεζε ζρεκαηηζκνχ ζπκπιφθσλ. Αληηζέησο, ν παξάγνληαο AP4, ην κνλαδηθφ κέινο ηεο νηθνγέλεηαο AP4R, παξνπζηαδφηαλ επηιεθηηθά ζηα ξπζκηζηηθά ζχκπινθα ησλ γνληδίσλ πνπ θαηαζηέιινληαλ απφ ηνλ NGN3. Παξάιιεια, ειέγρζεθαλ νη ηηκέο p-value γηα ηνπο παξάγνληεο ησλ παξαπάλσ νηθνγελεηψλ θαη δηαπηζηψζεθε πσο κφλν ε νηθνγέλεηα AP4R ζπλνδεπφηαλ απφ ηηκή p-value ρακειφηεξε απφ ηελ ηηκή ηεο νηθνγέλεηαο BRNF, πνπ ηέζεθε σο θαηψθιη αμηνπηζηίαο. πδήηεζε Μέζα απφ ηελ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ απηήο ηεο θάζεο δηαπηζηψζεθε ε αλεχξεζε ηνπ ζπκπιφθνπ απφ ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ 123

124 NEUR, PDX1, BRNF, HNF1, HNF6 θαη LEFF ζπληεξεκέλνπ ζην εχξνο ησλ νξζνιφγσλ ηνπο απφ ηα ςάξηα σο ηα ζειαζηηθά. Παξά ηνλ εληνπηζκφ ησλ επηκέξνπο παξαγφλησλ κε δηαθνξεηηθή ζεηξά κέζα ζην ζχκπινθν θαη ηηο πνηθίιεο απνζηάζεηο ησλ πεξηνρψλ ηνπ ζπκπιφθνπ απφ ην TSS ηνπ θάζε γνληδίνπ, ε ζηαζεξή αλεχξεζε απηνχ ζηα γνλίδηα γλσζηνχο αιιά θαη πηζαλνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3 θαζηζηά ζεκαληηθή ηελ παξνπζία ηνπ ζπκπιφθνπ γηα ηε ξχζκηζε ηεο έθθξαζεο απηψλ ησλ γνληδίσλ. Πξάγκαηη, έρεη δηαπηζησζεί πσο ηα ξπζκηζηηθά ζηνηρεία ηεο κεηαγξαθήο εληνπίδνληαη ηφζν πιεζίνλ ηνπ TSS ηνπ γνληδίνπ πνπ ειέγρνπλ, φζν θαη ζε πνηθίιεο απνζηάζεηο πέξαλ απηνχ (176). Παξάιιεια, ε πςεινχ βαζκνχ ζπληήξεζε ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ ζπκπιφθνπ ζε φινπο ηνπο νξγαληζκνχο πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο θαη ζε γνλίδηα πνπ ηα δεδνκέλα άιισλ εξγαζηψλ (62, 75, 147, 162, 167) έρνπλ θαηαδείμεη φηη εκπιέθνληαη ζην κνλνπάηη δηαθνξνπνίεζεο ησλ β-θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο, ππνδειψλεη ηε ιεηηνπξγηθή ζεκαζία ηνπ ζπκπιφθνπ ζ απηήλ ηε δηαδηθαζία. Γεδνκέλνπ φηη ην ζπγθεθξηκέλν κνλνπάηη δηαθνξνπνίεζεο θαζνδεγείηαη απφ ηνλ NGN3 (49) θαη ζπλεθηηκψληαο φηη φινη νη παξάγνληεο ηνπ ζπκπιφθνπ έρνπλ εμαθξηβσκέλε ζπκκεηνρή ζηηο εκβξπνγελεηηθέο δηαδηθαζίεο ηνπ παγθξέαηνο (58, 75, 136, 139, 141, 142, 143, 159) κπνξεί λα εμαρζεί ην ζπκπέξαζκα πσο φια ηα γνλίδηα πνπ κέρξη ηψξα εμεηάζηεθαλ ζπκκεηέρνπλ απφ θνηλνχ ζε έλα ξπζκηζηηθφ δίθηπν κε θεληξηθφ ξπζκηζηή ηνλ NGN3. Πηζαλφηαηα ε πξφζδεζε ηνπ NGN3 ζε ζπλεξγαζία κε ηνπο άιινπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο ηνπ ζπκπιφθνπ ειέγρεη θαηά πεξίπησζε ηελ επαγσγή ή ηελ θαηαζηνιή ησλ παξαπάλσ γνληδίσλ. Παξάιιεια ε επηιεθηηθή παξνπζία ηνπ AP4 ζην ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ NGN3-PDX1-HNF1-HNF6- BRN4-LEF1 κφλν ζηα θαηαζηειιφκελα γνλίδηα απφ ηνλ NGN3 θαίλεηαη φηη πξνθαιεί ηελ επηιεθηηθή θαηαζηνιή ηνπο. Απηφ ην ηειεπηαίν ζπκπέξαζκα εμάγεηαη παξάιιεια θαη απφ ηα δεδνκέλα πξνεγνχκελσλ εξγαζηψλ πνπ έρνπλ ππνδείμεη ην πξφηππν πξφζδεζεο ηνπ AP4 ζπληεξεκέλν κφλν ζε γνλίδηα πνπ εθθξάδνληαη ζηελ εμσθξηλή κνίξα ηνπ παγθξέαηνο (157), ελψ παξφκνηεο αιιεινπρίεο κε ηηο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο ηνπ AP4 έρνπλ εληνπηζηεί ζηα πεξηζζφηεξα γνλίδηα πνπ ζρεηίδνληαη κε ην πάγθξεαο (158). Πην αλαιπηηθά ην πξφηππν πξφζδεζεο ηνπ AP4 εκπεξηέρεηαη ζε κηα αιιεινπρία κε ξφιν εληζρπηή πνπ ειέγρεη ηε κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ απηψλ (157). Απνκέλεη ινηπφλ λα δηαπηζησζεί ε ζηαηηζηηθή ζεκαληηθφηεηα εληνπηζκνχ ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ ζπκπιφθνπ (κε θαη ρσξίο ηνλ AP4) κέζσ ηεο αλαδήηεζεο απηνχ ζε επίπεδν γνληδηψκαηνο. 124

125 4.1.4 Αλάιπζε Πιήξνπο Γνληδηώκαηνο Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα Με αλάιπζε γνληδίσλ πνπ είηε επάγνληαλ είηε θαηαζηέιινληαλ κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 (62) απνθαιχθζεθε ε παξνπζία ελφο ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ απφ ηνπο παξάγνληεο NGN3-PDX1-HNF1-HNF6-BRN4 θαη LEF1 ζην ζχλνιν ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ. Δπίζεο, ζε νξηζκέλα απφ απηά, πνπ παξεπηπηφλησο έδεηρλαλ λα θαηαζηέιινληαη απφ ηνλ NGN3, δηαπηζηψζεθε ζην παξαπάλσ ζχκπινθν επηπιένλ ε παξνπζία ηνπ παξάγνληα AP4. Πξνθεηκέλνπ λα εθηηκεζεί ε ζηαηηζηηθή ζεκαληηθφηεηα ησλ δχν παξαπάλσ ζπκπιφθσλ (κε θαη ρσξίο ηνλ παξάγνληα AP4), αλαιχζεθε νιφθιεξν ην γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ κε ηνλ ηξφπν πνπ πεξηγξάθεθε (βι. Γεδνκέλα θαη Mέζνδνη). Αξρηθά αλαδεηήζεθαλ ζε νιφθιεξν ην γνληδίσκα ζέζεηο πξφζδεζεο γηα ηνπο πξναλαθεξζέληεο επηά παξάγνληεο κε ηνλ Κψδηθα 1 ηνπ Παξαξηήκαηνο. Απηέο νη ζέζεηο πξφζδεζεο ζηε ζπλέρεηα αλαιχζεθαλ κε ηνπο εηδηθά ζρεδηαζκέλνπο Κψδηθεο 2 θαη 3 ηνπ Παξαξηήκαηνο θαη ηελ πιαηθφξκα TFDetector. Έηζη έγηλε πξφβιεςε εληνπηζκνχ ησλ δχν ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ (κε θαη ρσξίο ηνλ παξάγνληα AP4), ζην πιήξεο γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ κε ηηο ίδηεο παξακέηξνπο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ θαηά ηελ αλάιπζε ησλ κεκνλσκέλσλ γνληδίσλ ηεο παξνχζαο εξγαζίαο. Ο Πίλαθαο 11 παξνπζηάδεη ηα απνηειέζκαηα ησλ αλαιχζεσλ απηψλ. Αλάιπζε Ννπθιενηίδηα χκπινθα κε AP4 χκπινθα ρσξίο AP4 Γνληδίσκα Δπηιεγκέλα Γνλίδηα Πίλαθαο 11: Απνηειέζκαηα αλαγλψξηζεο ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ ζε επηιεγκέλα γνλίδηα-ζηφρνπο ηνπ NGN3 θαη ζην πιήξεο γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ. Σα απνηειέζκαηα απφ ηελ αλάιπζε πιήξνπο γνληδηψκαηνο ζπλεθηηκήζεθαλ κε ηα απνηειέζκαηα εληνπηζκνχ ησλ δχν δηαθξηηψλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ ζηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ, γλσζηψλ θαη πηζαλψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3. Λακβάλνληαο 125

126 ππ φςηλ φηη ην κέγεζνο ηεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο γηα θαζέλα απφ ηα επηιεγκέλα γνλίδηα ήηαλ 4500bp ππνινγίζηεθε ην ζχλνιν ησλ λνπθιενηηδίσλ πνπ ειέγρζεθαλ. ην ζχλνιν ησλ επηιεγκέλσλ γνληδίσλ δελ ζπλππνινγίζηεθαλ ηα γνλίδηααξλεηηθνί κάξηπξεο (B-ACTIN θαη HBB1) θαζψο θαη ηα παξάινγα ηνπ γνληδίνπ WNT5. Αθνινχζσο έγηλε πξφβιεςε ηνπ εληνπηζκνχ ησλ δχν ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ κε βάζε ην κέγεζνο ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ πνπ εμεηάζηεθαλ ζηελ πεξίπησζε ησλ επηιεγκέλσλ γνληδίσλ-ζηφρσλ θαη ζηελ πεξίπησζε αλάιπζεο ηνπ πιήξνπο γνληδηψκαηνο ηνπ πνληηθνχ. Πην ζπγθεθξηκέλα, γηα λα ειεγρζεί ε ζεκαζία εληνπηζκνχ ησλ δχν ζπκπιφθσλ, έγηλε ζπζρέηηζε ηνπ αξηζκνχ ησλ λνπθιενηηδίσλ πνπ ζπγθξνηνχζαλ ηηο αιιεινπρίεο πνπ αλαιχζεθαλ ζε θάζε πεξίπησζε θαη ηνπ αξηζκνχ ησλ ζπκπιφθσλ πνπ εληνπίζηεθαλ. Γεδνκέλνπ φηη ηα απνηειέζκαηα αθνινπζνχζαλ ηελ θαλνληθή θαηαλνκή εθαξκφζηεθε ε ζπζρέηηζε Pearson. Δπηδηψθνληαο ζπζρέηηζε δχν πνζνηηθψλ κεηαβιεηψλ (αξηζκφο λνπθιενηηδίσλ-αξηζκφο ζπκπιφθσλ) ρξεζηκνπνηήζεθε ε κέζνδνο ηεο γξακκηθήο παιηλδξφκεζεο (121), ηα απνηειέζκαηα ηεο νπνίαο παξνπζηάδνληαη ζηνλ Πίλαθα 12, φπνπ ππνδεηθλχνληαη ε πξνγλσζηηθή ηθαλφηεηα ησλ παξαπάλσ πξνηχπσλ ζπζρέηηζεο θαη νη εμηζψζεηο πξφβιεςεο ηνπ αξηζκνχ ησλ δχν δηαθξηηψλ ζπκπιφθσλ κε βάζε ηνλ αξηζκφ ησλ λνπθιενηηδίσλ πνπ εμεηάδνληαλ θαηά πεξίπησζε. Πξφθεηηαη γηα δχν ηζρπξά πξνγλσζηηθά πξφηππα ζπζρέηηζεο κε πξνγλσζηηθή ηθαλφηεηα 89,3% θαη 96,8% γηα ηα ζχκπινθα κε θαη ρσξίο ηνλ AP4 αληίζηνηρα. Με άιια ιφγηα ην 89,3 θαη ην 96,8% ησλ ζπκπιφθσλ κε θαη ρσξίο ηνλ AP4 αληίζηνηρα πξνβιέπνληαη κε βάζε ηηο εμηζψζεηο ηνπ Πίλαθα 12. Πξνγλσζηηθή αμία πξνηχπνπ (Adjusted R Square) πζρέηηζε Δμίζσζε Πξφβιεςεο p-value 0,893 χκπινθα AP4- Nνπθιενηίδηα (N) ΑP4=2,556E -7 * Ν 0,0001 0,968 χκπινθα ρσξίο AP4- Nνπθιενηίδηα (N) NOAP4=3,290E-5* Ν 0,0001 Πίλαθαο 12: πζρέηηζε ηνπ αξηζκνχ ησλ ζπκπιφθσλ κε θαη ρσξίο ηνλ AP4 κε ηνλ αξηζκφ ησλ λνπθιενηηδίσλ πνπ εμεηάδνληαη. 126

127 Αληηθαζηζηψληαο ζηηο ζρέζεηο ππνινγηζκνχ ησλ ζπκπιφθσλ κε θαη ρσξίο ηνλ AP4 ηνλ αξηζκφ 4.500, θαζψο απηφ ήηαλ ην κέγεζνο ζε λνπθιενηίδηα ηεο ξπζκηζηηθήο αιιεινπρίαο θαζελφο απφ ηα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ, ππνινγίδεηαη πσο ζε θάζε κηα ηέηνηα αιιεινπρία αληηζηνηρνχλ 0,0011 ζχκπινθα κε AP4 θαη 0,148 ζχκπινθα ρσξίο απηφλ. Δπίζεο αληηθαζηζηψληαο ηνλ αξηζκφ , πνπ ήηαλ ν ζπλνιηθφο αξηζκφο ησλ λνπθιενηηδίσλ φισλ ησλ επηιεγκέλσλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ, ππνινγίδνληαη 26,65 ζχκπινθα ρσξίο ηνλ AP4. Σν ηειεπηαίν ζχκπινθν ινηπφλ αλακελφηαλ λα εληνπηζηεί 27 θαη φρη 180 θνξέο, πνπ παξνπζηάζηεθε ζην ζχλνιν ησλ επηιεγκέλσλ γνληδίσλ. Απφ ηε εμίζσζε πξφβιεςεο ησλ ζπκπιφθσλ κε AP4 ππνινγίδνληαη λα αλεβξεζνχλ 0,2 ζχκπινθα ζην ζχλνιν ησλ αιιεινπρηψλ πνπ εμεηάζηεθαλ έλαληη ησλ 60 ηέηνησλ ζπκπιφθσλ πνπ πξαγκαηηθά εληνπίζηεθαλ. Σν γεγνλφο φηη ηα ζπγθεθξηκέλα ζχκπινθα βξέζεθαλ ζηνλ πιεζπζκφ ησλ επηιεγκέλσλ γνληδίσλ πνιχ ζπρλφηεξα απφ φηη αλακελφηαλ είλαη ελδεηθηηθφ ηεο ιεηηνπξγηθήο ηνπο ζεκαζίαο. Οη ηηκέο 2,556E -7 θαη 3,290E -5 απνηεινχλ ηνπο ζπληειεζηέο γξακκηθήο ζπζρέηηζεο ησλ ζπκπιφθσλ κε θαη ρσξίο AP4, αληίζηνηρα, κε ην κήθνο ζε λνπθιενηίδηα ησλ αιιεινπρηψλ πνπ εμεηάζηεθαλ. Οη ζρεηηθά ρακειέο ηηκέο θαη ησλ δχν ζπληειεζηψλ ζπζρέηηζεο ππνδειψλνπλ πσο ηα ζχκπινθα δελ έρνπλ απφιπηα γξακκηθή ζρέζε κε ην κέγεζνο ησλ αιιεινπρηψλ φπνπ εληνπίζηεθαλ. Απηφ κε άιια ιφγηα ζεκαίλεη πσο δελ αλακέλνληαλ πεξηζζφηεξα ζχκπινθα κε θαη ρσξίο ηνλ AP4 απμάλνληαο ην κέγεζνο ησλ αιιεινπρηψλ πνπ εμεηάδνληαλ ή αιιηψο φηη ηα ζχκπινθα απηά δελ εληνπίζζεθαλ ρσξίο ζπγθεθξηκέλε πξνηίκεζε αλά ηαθηφ αξηζκφ λνπθιενηηδίσλ. Αμίδεη ηέινο λα αλαθεξζεί πσο ε αμηνπηζηία ησλ παξαπάλσ αλαιχζεσλ θαη ππνινγηζκψλ θξίζεθε ηθαλνπνηεηηθή αθνχ νη αληίζηνηρεο ηηκέο p-value ήηαλ κηθξφηεξεο απφ ηελ ηηκή 0,05. πδήηεζε Απφ ηελ αλάιπζε φισλ ησλ πεξηνρψλ ηνπ γνληδηψκαηνο ηνπ πνληηθνχ θάλεθε πσο ν εληνπηζκφο ησλ ζπκπιφθσλ, κε θαη ρσξίο ηνλ ΑP4, παξνπζηάδεη ελδηαθέξνλ αθνχ ηα δχν ζχκπινθα δελ εκθαλίδνληαλ ηπραία ζηνλ πιεζπζκφ ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ επηιεθηηθά, κε βάζε ηε ζπκκεηνρή ηνπο ζην ξπζκηζηηθφ δίθηπν ηνπ NGN3. πγθξηηηθά δειαδή κε ηνλ αξηζκφ ησλ αλακελφκελσλ θαηά ηχρε ζπκπιφθσλ θαη ηα δχν ξπζκηζηηθά ζχκπινθα βξέζεθαλ πνιχ πεξηζζφηεξεο θνξέο 127

128 ζην δείγκα ησλ γνληδίσλ-ζηφρσλ ηνπ NGN3. Απηφ ην ηειεπηαίν ππνδειψλεη ηε ιεηηνπξγηθή ηνπο ζεκαζία. Απνδείρζεθε δε πσο ην ζχκπινθν κε ηνλ AP4 φρη απιά δελ εληνπίζηεθε ηπραία ζηηο αιιεινπρίεο ησλ εμεηαζζέλησλ γνληδίσλ, αιιά επηπιένλ εληνπίζηεθε εηδηθά ζηηο αιιεινπρίεο ησλ γνληδίσλ πνπ θαηαζηέιινληαη απφ ηνλ NGN3. Σν ίδην ζχκπινθν εληνπίζηεθε ζην γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ κε πνιχ κηθξφηεξε ζπρλφηεηα ζε ζρέζε κε ην ζχκπινθν ρσξίο ηνλ AP4. Μπνξνχκε, ινηπφλ, λα ππνζέζνπκε κηα ζεκαληηθή ιεηηνπξγηθή αμία ηεο παξνπζίαο ηνπ παξάγνληα AP4 ζην ζπγθεθξηκέλν ζχκπινθν πνπ ίζσο είλαη ηθαλή λα κεηαηξέςεη έλα ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν (ζχκπινθν ρσξίο ηνλ AP4) ζε εηδηθφ θαζηαζηνιέα ζπγθεθξηκέλσλ γνληδίσλ. 4.2 Αλάιπζε ησλ Cis Ρπζκηζηηθψλ Πεξηνρψλ ησλ Γνληδίσλ Δμέηαζε ηνπ Δπηπέδνπ GC ηωλ Ρπζκηζηηθώλ Πεξηνρώλ Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα Ζ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ κε ην EMBOSS Isochore (124) επέηξεςε ηνλ ραξαθηεξηζκφ, σο πξνο ην επίπεδν ζε GC ηφζν ηεο επξχηεξεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο ηνπ θάζε γνληδίνπ, φζν θαη ηεο ζπγθεθξηκέλεο πεξηνρήο φπνπ εληνπίζηεθε ην ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν. ηηο Δηθφλεο 43 θαη 44 αλαπαξίζηαληαη γξαθηθά νη θακπχιεο πνπ απνδίδνπλ ηα επίπεδα ζε GC (%) ησλ πεξηνρψλ πνπ εθηεηλφηαλ bp αλνδηθά ηνπ TSS θάζε γνληδίνπ έσο 500bp θαζνδηθά απηνχ γηα ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ FGD4 θαη FZD2 αληίζηνηρα. Καη ζηηο δχν πεξηπηψζεηο νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ, είηε απηά επάγνληαλ (FGD4), είηε θαηαζηέιινληαλ (FZD2), απφ ηνλ NGN3 θξίζεθαλ ζρεηηθά πησρέο (< 45%) ζε GC λνπθιενηίδηα. Πην ελδηαθέξνλ θαίλεηαη φκσο ην γεγνλφο φηη ζηα ζεκεία ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ φπνπ εληνπίζηεθε ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ην επίπεδν GC ήηαλ, ζηελ πιεηνςεθία ησλ πεξηπηψζεσλ πνπ εμεηάζηεθαλ, αθφκε πην ρακειφ. Σα ζεκεία απηά ππνδειψλνληαη ζε θάζε θακπχιε νξζνιφγνπ κε κηα θνπθίδα (Δηθφλεο 43, 44). Δπηπξνζζέησο, ν ππνινγηζκφο ηεο θαηά κέζν φξν πεξηεθηηθφηεηαο ζε GC ηφζν ηεο επξχηεξεο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο, φζν θαη ηεο επηκέξνπο πεξηνρήο ηνπ ζπκπιφθνπ γηα ηα νξζφινγα φισλ ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ απέδσζε 128

129 δηαγξάκκαηα φπσο απηά ησλ Δηθφλσλ 45 θαη 46 γηα ηα γνλίδηα FGD4 θαη FZD2 αληίζηνηρα θαη ησλ ίδησλ πεξηνρψλ γηα φια ηα γνλίδηα πνπ εμεηάζηεθαλ απφ ηνλ πνληηθφ (M. musculus) ηεο Δηθφλαο 47. Δηθφλα 43: Γξαθηθή αλαπαξάζηαζε ηεο λνπθιενηηδηθήο ζχζηαζεο (%) ζε GC ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FGD4 (Α) απφ ηα ζειαζηηθά θαη (Β) απφ ηα θαηψηεξα ζπνλδπισηά. 129

130 Δηθφλα 44: Γξαθηθή αλαπαξάζηαζε ηεο λνπθιενηηδηθήο ζχζηαζεο (%) ζε GC ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FZD2 (Α) απφ ηα ζειαζηηθά θαη (Β) απφ ηα θαηψηεξα ζπνλδπισηά. 130

131 Δηθφλα 45: χγθξηζε ησλ επηπέδσλ GC ησλ επξχηεξσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ θαη ησλ πεξηνρψλ ησλ ζπκπιφθσλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FGD4. Δηθφλα 46: χγθξηζε ησλ επηπέδσλ GC ησλ επξχηεξσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ θαη ησλ πεξηνρψλ ησλ ζπκπιφθσλ γηα ηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FZD2. 131

132 Δηθφλα 47: χγθξηζε ησλ επηπέδσλ GC ησλ επξχηεξσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ θαη ησλ πεξηνρψλ ησλ ζπκπιφθσλ γηα φια ηα γνλίδηα πνπ κειεηήζεθαλ απφ ηνλ νξγαληζκφ M. musculus. Απφ ηηο κεηξήζεηο απηέο ππνινγίζηεθε πσο θαηά κέζν φξν ε πεξηεθηηθφηεηα ζε GC ησλ επξχηεξσλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ δελ μεπεξλνχζε ην 45%, ελψ ε πεξηεθηηθφηεηα ζε GC ησλ πεξηνρψλ ησλ ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ θπκαηλφηαλ αθφκε ρακειφηεξα, ζην 43% πεξίπνπ. Μάιηζηα φζν παιαηφηεξνο θπινγελεηηθά ήηαλ ν νξγαληζκφο πνπ έθεξε ην νξζφινγν γνλίδην ηφζν πην πησρή ζε GC ήηαλ ε ξπζκηζηηθή πεξηνρή ηνπ θαη ε ππνπεξηνρή απηήο, φπνπ εληνπίζηεθε ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν. Δπίζεο θαηαζθεπάζηεθε ζπγθξηηηθφ γξάθεκα ησλ επηπέδσλ GC ησλ πεξηνρψλ φπνπ εληνπίζηεθαλ ηα ξπζκηζηηθά ζχκπινθα γηα ηα νξζφινγα ησλ επαγφκελσλ έλαληη απηψλ ησλ θαηαζηειιφκελσλ, απφ ηνλ NGN3, γνληδίσλ ην νπνίν θαη θαίλεηαη ζηελ Δηθφλα 48. Απφ ηελ ηειεπηαία εηθφλα εμάγεηαη ην ζπκπέξαζκα πσο ηα επίπεδα GC ησλ ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ δελ εκθαλίδνπλ δηαθνξέο αλάκεζα ζηα επαγφκελα θαη ηα θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα. 132

133 Δηθφλα 48: πγθξηηηθά δηαγξάκκαηα ησλ επηπέδσλ GC ησλ ξπζκηζηηθψλ ζπκπιφθσλ αλάκεζα ζηα θαηαζηειιφκελα θαη ηα επαγφκελα απφ ηνλ NGN3 γνλίδηα. Παξάιιεια έγηλε αλαδήηεζε ησλ ηζφρσξσλ ζηα γνληδηψκαηα ησλ νξγαληζκψλ, φπνπ εληνπίδνληαη ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ. Ζ θαηαλνκή ησλ γνληδίσλ ζε ηζφρσξεο απνδίδεηαη γξαθηθά ζηελ Δηθφλα 49, φπνπ θαίλεηαη πσο ζηελ πιεηνςεθία ηνπο ηα νξζνιφγα εληνπίδνληαλ ζηηο ηζφρσξεο H1 θαη L2, πνπ ζχκθσλα κε ηε βηβιηνγξαθία ζεσξνχληαη ζρεηηθά πησρέο ζε GC λνπθιενηίδηα (184). Δηθφλα 49: Καηαλνκή ησλ νξζνιφγσλ ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ ζηηο ηζφρσξεο ησλ γνληδησκάησλ ησλ αληίζηνηρσλ νξγαληζκψλ. 133

134 πδήηεζε Ζ θαηαλνκή ησλ νξζνιφγσλ ζηηο ηζφρσξεο ησλ γνληδησκάησλ (Δηθφλα 49) αθνινπζεί ηελ ηππηθή θαηαλνκή ησλ ηζφρσξσλ ζηα γνληδηψκαηα ησλ νξγαληζκψλ, φπνπ ηα ζεξκφαηκα ζειαζηηθά έρνπλ γεληθφηεξα πην πνιιέο ηζφρσξεο πινχζηεο ζε GC ζε ζρέζε κε ηα ςπρξφαηκα (Δηθφλα 50). ηελ ηειεπηαία εηθφλα θαίλεηαη, επίζεο, πσο νη νζηετρζείο Tetraodon θαη Stickleback έρνπλ ηα πην πινχζηα ζε GC γνληδηψκαηα απφ φια ηα ςάξηα (126). Απφ ηε ζχγθξηζε ησλ Δηθφλσλ 49 θαη 50 εμάγεηαη ην ζπκπέξαζκα πσο ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ θαηαλέκνληαη ζε ηζφρσξεο πησρέο ζε GC. Δπίζεο, θαίλεηαη πσο φζν πην ιίγεο ηζφρσξεο πινχζηεο ζε GC είρε ν νξγαληζκφο, ηφζν πην πησρή ζε GC ηζφρσξα έθεξε ην νξζφινγν ζην γνληδίσκά ηνπ. Ο εληνπηζκφο ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ ζε ηζφρσξεο ρακεινχ επηπέδνπ GC ζπλάδεη (185) κε ηε ζπκκεηνρή ηνπο ζε αλαπηπμηαθέο δηαδηαθαζίεο, αθνχ ζηελ πιεηνςεθία ηνπο θσδηθνπνηνχλ ηζηνεηδηθά εθθξαδφκελνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο θαη θαζνξηζηέο ηεο κνίξαο ησλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ (Πίλαθαο 9). Σν γεγνλφο φηη νη ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ απηψλ ήηαλ πησρέο ζε GC, θαηλφκελν πνπ γηλφηαλ εληνλφηεξν ζηηο ππνπεξηνρέο φπνπ εληνπηδφηαλ ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν, είλαη γεγνλφο πνπ έρεη θαηαγξαθεί γεληθφηεξα γηα ηηο ξπζκηζηηθέο αιιεινπρίεο ησλ γνληδίσλ κε ηέηνηνπο ξφινπο (186) θαη δειψλεη ηε κεγάιε ιεηηνπξγηθή ζεκαζία ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ, ε νπνία νδήγεζε ζηελ εμειηθηηθή ζπληήξεζε ηεο ππνπεξηνρήο. Σν ξπζκηζηηθφ απηφ ζηνηρείν εμππεξεηεί ηελ επηιεθηηθή έθθξαζε φισλ ησλ εμεηαζζέλησλ γνληδίσλ, πνπ κνηξάδνληαη ζεκαληηθνχο ξφινπο θαηά ηελ αλάπηπμε ηνπ εκβξχνπ, ψζηε ζηελ νπζία λα κελ ππνζηνχλ εμειηθηηθά θακία πξφθιεζε γηα αιιαγή ηνπ GC επηπέδνπ ηνπο, ηελ ίδηα ψξα πνπ άιια γνλίδηα κε δηαθνξεηηθέο ιεηηνπξγίεο ελδερνκέλσο λα κεηαηνπίζηεθαλ ζε πεξηνρέο πην πινχζηεο ζε GC (187). Μάιηζηα ε εμειηθηηθή ζπληήξεζε ησλ πεξηνρψλ ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ ζε ζπλδπαζκφ κε ην ρακειφ ηνπο επίπεδν ζε GC απνηεινχλ ζπρλά ζπλπθαζκέλα γεγνλφηα (186). 134

135 Δηθφλα 50: Οξγάλσζε ησλ γνληδησκάησλ δηαθφξσλ νξγαληζκψλ ζε ηζφρσξεο (Costantini et al., Αλαδήηεζε Πξνηύπωλ Ννπθιενηηδίωλ ζηηο Δπηιεγκέλεο Πεξηνρέο ηωλ Ρπζκηζηηθώλ πκπιόθωλ Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα ε κηα πξνζπάζεηα εληνπηζκνχ ζπγθεθξηκέλσλ πξνηχπσλ λνπθιενηηδηψλ ζηηο αιιεινπρίεο DNA φπνπ βξέζεθε ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν, έγηλε αλάιπζε κε ην πξφγξακκα ΜΔΜΔ (123). Οη παξάκεηξνη ησλ αλαιχζεσλ (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη) επέηξεςαλ ηνλ εληνπηζκφ πξνηχπσλ κε πξνζαλαηνιηζκφ 5 3 αιιά θαη 3 5 κήθνπο θαηάιιεινπ ψζηε λα ελδέρεηαη λα απνηεινχλ ζέζεηο πξφζδεζεο ελφο ή πεξηζζνηέξσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Οη αιιεινπρίεο εμεηάζηεθαλ θαηά δηαθφξνπο ζπλδπαζκνχο ψζηε λα απνθαιπθζνχλ ηπρφλ νκνηφηεηεο θαη δηαθνξέο αλάκεζα ζηα επαγφκελα θαη ηα θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ 135

136 NGN3 γνλίδηα. Αξρηθά έγηλε θαηάζεζε ησλ αιιεινπρηψλ ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ γηα φια ηα γνλίδηα πνπ απνηεινχλ γλσζηνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3. Σα απνηειέζκαηα πνπ πξνέθπςαλ επηβεβαίσζαλ ηελ παξνπζία ησλ γλσζηψλ πξνηχπσλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3 ζηα παξαπάλσ γνλίδηα. ηελ Δηθφλα 51 παξνπζηάδνληαη ζε ζηνίρηζε ηα πξφηππα πνπ εληφπηζε ην ΜΔΜΔ ζηηο αιιεινπρίεο ησλ γνληδίσλ PAX4 θαη NEUROD1 κε ηηο πεηξακαηηθά επηβεβαησκέλεο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 ζηα ίδηα γνλίδηα. Δηθφλα 51: ηνίρηζε ηεο γλσζηήο αιιεινπρίαο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 κε ηα πξφηππα πνπ εληνπίζηεθαλ ζηα γνλίδηα-γλσζηνχο ζηφρνπο ηνπ απφ θνηλνχ ζε φια ηα νξζφινγα ησλ ζειαζηηθψλ. Με βάζε ηα παξαπάλσ απνηειέζκαηα, φπνπ ε κεγαιχηεξε ηηκή E-value γηα ηα ηειεπηαία πξφηππα ήηαλ ηεο ηάμεο ησλ e -24, ην θαηψθιη αμηνπηζηίαο γηα ηα πξφηππα πνπ εληνπίζηεθαλ απφ ην MEME θαζνξίζηεθε ζε ηηκέο E-value ηεο ηάμεο ησλ e -25. Αθνινχζεζε αλάιπζε ησλ γνληδίσλ πηζαλψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3 πνπ, ζχκθσλα κε ηα δεδνκέλα ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ (62), επάγνληαλ ή θαηαζηέιινληαλ απφ ηνλ NGN3. Σα απνηειέζκαηα ηεο αλάιπζεο θαηέδεημαλ ηελ παξνπζία ηνπ γλσζηνχ πξνηχπνπ πξφζδεζεο ηνπ NGN3 ηφζν ζηα γνλίδηα πνπ επάγνληαλ, φζν θαη ζ' απηά πνπ θαηαζηέιινληαλ απφ ηνλ NGN3. ηελ Δηθφλα 52 θαίλνληαη νη ζηνηρίζεηο ησλ γλσζηψλ αιιεινπρηψλ πξφζδεζεο ηνπ NGN3 κε 136

137 νξηζκέλα απφ ηα πξφηππα πνπ εληνπίζηεθαλ ηφζν ζε επαγφκελα (FGD4), φζν θαη ζε θαηαζηειιφκελα γνλίδηα (BHLHB2, VCL, PARD6B). Δηθφλα 52: ηνίρηζε ηεο γλσζηήο αιιεινπρίαο πξφζδεζεο ηνπ NGN3 κε ηα πξφηππα πνπ εληνπίζηεθαλ ζε επαγφκελα θαη θαηαζηειιφκελα απφ ηνλ παξάγνληα NGN3 γνλίδηα. Χζηφζν απφ ηελ αλάιπζε ησλ γνληδίσλ πηζαλψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3 δε δηαπηζηψζεθε θάπνην άιιν πξφηππν θνηλφ ζηελ πιεηνςεθία ησλ επαγφκελσλ θαη ησλ θαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ. Σν γεγνλφο απηφ νδεγεί ζην ζπκπέξαζκα πσο νη αιιεινπρίεο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, πνπ εληνπίζηεθε ζηα επαγφκελα θαη ζηα θαηαζηειιφκελα γνλίδηα, ήηαλ αξθεηά εηεξνγελείο ζε επίπεδν λνπθιενηηδίσλ. Αθνινχζεζε μερσξηζηή αλάιπζε ησλ επαγφκελσλ απφ ηε κηα θαη ησλ θαηαζηειιφκελσλ απφ ηελ άιιε γνληδίσλ κε ηηο ίδηεο παξακέηξνπο. Σα απνηειέζκαηα απηψλ ησλ αλαιχζεσλ ππέδεημαλ πνιχ κεγάιε εηεξνγέλεηα αλάκεζα ζηηο αιιεινπρίεο ησλ επαγφκελσλ γνληδίσλ θαζψο ε αλάιπζή ηνπο απέδσζε δχν πξφηππα ζπληεξεκέλα κφλν κεηαμχ ησλ νξζνιφγσλ ηνπ ίδηνπ γνληδίνπ απφ ηα ζειαζηηθά. Ζ αλάιπζε ησλ θαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ ππέδεημε ηξία πξφηππα, εθ' ησλ νπνίσλ ηα δχν θξίζεθαλ ελδηαθέξνληα θαζψο εκθαλίδνληαλ ζπληεξεκέλα ζε ηέζζεξα απφ ηα έμη ζχλνια νξζνιφγσλ (ηέζζεξα θαηαζηειιφκελα γνλίδηα ηνπ Πίλαθα 9 θαη γνλίδηα WISP1 θαη CTGF) πνπ θαηαηέζεθαλ πξνο αλάιπζε. Πεξαηηέξσ αλάιπζε ησλ δχν απηψλ πξνηχπσλ 137

138 αλέδεημε ηελ παξνπζία εληφο απηψλ, αιιεινπρηψλ πνπ εκθάληδαλ κεγάιε νκνηφηεηα κε ηελ πεηξακαηηθά πξνζδηνξηζκέλε αιιεινπρία πξφζδεζεο ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα AP4 (157). ηελ Δηθφλα 53Α παξνπζηάδεηαη ε ζηνίρηζε ηεο γλσζηήο αιιεινπρίαο πξφζδεζεο ηνπ AP4 κε ηε ζπλαηλεηηθή αιιεινπρία, πνπ πξνέθπςε απφ ηηο επηκέξνπο αιιεινπρίεο ησλ πξνηχπσλ, πνπ εληνπίζηεθαλ ζηα νξζφινγα ησλ θαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ. ηελ Δηθφλα 53Β ππνδεηθλχεηαη ην ζχλνιν ησλ γνληδίσλ πνπ εκθαλίδνπλ ην ζπγθεθξηκέλν πξφηππν θαη παξνπζηάδνληαη νη ζρεηηθέο ηνπ ζέζεηο εληφο ησλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ ησλ γνληδίσλ. Δηθφλα 53: (Α) ηνίρηζε ηεο ζπλαηλεηηθήο αιιεινπρίαο πξνηχπνπ πνπ εληνπίζηεθε ζε θαηαζηειιφκελα γνλίδηα κε ηελ γλσζηή αιιεινπρία πξφζδεζεο ηνπ ΑΡ4. (B) Σα γνλίδηα πνπ θέξνπλ απφ θνηλνχ ην πξφηππν πνπ πεξηέρεη ηελ ζέζε πξφζδεζεο ηνπ AP4 θαη ε ζρεηηθή ζέζε απηνχ ζηηο αιιεινπρίεο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ ηνπο. πδήηεζε Απφ ηα απνηειέζκαηα ηεο παξνχζαο αλάιπζεο δηεμάγεηαη ην ζπκπέξαζκα πσο νη πεξηνρέο, φπνπ εληνπίζηεθε ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν κε ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ NEUR, PDX1, HNF1, HNF6, BRNF θαη LEFF ραξαθηεξίδνληαλ απφ κεγάιε εηεξνγέλεηα ζε επίπεδν λνπθιενηηδηθήο αιιεινπρίαο, παξφιν πνπ 138

139 εκθάληδαλ απφ θνηλνχ ζέζεηο πξφζδεζεο γηα ηνπο παξαπάλσ παξάγνληεο ζε ζηελή εγγχηεηα θαη πνπ παξνπζίαδαλ εμειηθηηθή ζπληήξεζε ησλ ελ' ιφγσ ζέζεσλ ζε φια ηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ. Σν γεγνλφο απηφ κπνξεί λα εμεγεζεί αλ ιεθζνχλ ππ' φςηλ νη ελαιιαθηηθέο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο πνπ εκθαλίδεη ν θάζε κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο θαη ππνινγηζζνχλ νη ελαιιαθηηθνί ζπλδπαζκνί ησλ αιιεινπρηψλ απηψλ κε δηαθνξεηηθή ζεηξά εκθάληζεο ζηηο πεξηνρέο ησλ ζπκπιφθσλ. Δπίζεο ελδηαθέξνλ παξνπζηάδεη ν επηιεθηηθφο εληνπηζκφο ηνπ πξνηχπνπ πξφζδεζεο ηνπ παξάγνληα AP4 ζηηο αιιεινπρίεο ησλ ζπκπιφθσλ ησλ θαηαζηειιφκελσλ κφλν γνληδίσλ. Φαίλεηαη, δειαδή, πσο ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν πνπ ζπγθξνηείηαη απφ ηνπο παξάγνληεο ησλ νηθνγελεηψλ NEUR, PDX1, HNF1, HNF6, BRNF θαη LEFF εκθαλίδεηαη γεληθά ζε κηα πιεηάδα γνληδίσλ πνπ εκπιέθνληαη ζηελ εκβξπνγέλεζε, ελψ ε παξνπζία θαηά πεξίπησζε ηνπ παξάγνληα AP4 ζην ζχκπινθν είλαη ηθαλή θαη αλαγθαία λα πξνζδψζεη εμεηδίθεπζε ζην ζπγθεθξηκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν θάλνληαο ην λα ιεηηνπξγεί επηιεθηηθά σο θαηαζηνιέαο ζε νξηζκέλα γνλίδηα. Με άιια ιφγηα, ηα ζπγθεθξηκέλα γνλίδηα ππφ ηελ επίδξαζε βαζηθά ηνπ NGN3 αιιά θαη ησλ άιισλ παξαγφλησλ ηνπ ζπκπιφθνπ θαηαζηέιινληαη ζε πεξίπησζε παξνπζίαο ηνπ AP4 ζην ζχκπινθν. 139

140 4.3 Καηαζθεπή Γνληδηαθνχ Ρπζκηζηηθνχ Γηθηχνπ Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα Έγηλε πξνζπάζεηα λα ελνπνηεζνχλ ηα απνηειέζκαηα ησλ επηκέξνπο θάζεσλ κειέηεο ψζηε καδί κε ηελ πξνυπάξρνπζα βηβιηνγξαθηθή γλψζε λα πξνθχςεη έλα δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ πνπ λα ζπλδέεηαη κε ηε δηαδηθαζία δηαθνξνπνίεζεο ησλ εκβξπηθψλ βιαζηνθπηηάξσλ ηνπ πνληηθνχ πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα. Ζ θαηαζθεπή ηνπ δηθηχνπ έγηλε κε ην πξφγξακκα ΗPA (130). ε κηα πξψηε, θεληξηθή αλάιπζε, (core analysis) έγηλε αλαδήηεζε φισλ ησλ γλσζηψλ απφ ηε βηβιηνγξαθία αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ ζπγθξνηνχζαλ ην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν πνπ πεξηγξάθεθε. Δπίζεο δηεξεπλήζεθαλ νη αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ παξαγφλησλ απηψλ, θαη θπξίσο ηνπ παξάγνληα NGN3, κε ηα γνλίδηα-γλσζηνχο ζηφρνπο ηνπ (IA1, PAX4, NEUROD1, θαη NKX2.2). Με απηήλ ηελ αλάιπζε ειέγρζεθαλ νη αιιειεπηδξάζεηο πνπ ππνδείθλπε ην πξφγξακκα ζε ζρέζε κε ηηο γλσζηέο απφ ηε βηβιηνγξαθία (52, 72-74, 77, 136). ε κηα δεχηεξε πξνζέγγηζε, εηζήρζεθαλ ζηελ πιαηθφξκα ηνπ πξνγξάκκαηνο δεδνκέλα πνπ αληηζηνηρνχζαλ ζηηο αιιαγέο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ 12, 24 θαη 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3 (62). Αθνινχζεζαλ δηαθξηηέο αλαιχζεηο γηα θάζε ζχλνιν δεδνκέλσλ αιιαγήο έθθξαζεο θαη μερσξηζηά γηα ηα επαγφκελα θαη ηα θαηαζηειιφκελα γνλίδηα. Δπίζεο, έγηλε αλάιπζε φισλ ησλ γνληδίσλ πηζαλψλ-ζηφρσλ ηνπ NGN3, επαγφκελσλ θαη θαηαζηειιφκελσλ, κε βάζε ηελ αιιαγή ηεο έθθξαζήο ηνπο 48 ψξεο κεηά ηελ επαγσγή ηνπ NGN3. Με ζπγθξηηηθή αμηνιφγεζε ησλ επηκέξνπο δηθηχσλ αιιειεπηδξάζεσλ απφ ηηο πξναλαθεξζείζεο αλαιχζεηο πξνέθπςε ην ζχκπινθν παξαγφλησλ πνπ απνηεινχζαλ ηα trans ζηνηρεία ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ πνπ πεξηγξάθεθε (Δηθφλεο 54 Α θαη 54 Β) θαζψο θαη ην ξπζκηζηηθφ δίθηπν ηεο Δηθφλαο 55 πνπ παξηζηάλεη ηηο αιιειεπηδξάζεηο φισλ ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ, γλσζηψλ θαη πηζαλψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3, κε ηα κέιε ηνπ κεηαγξαθηθνχ ζπκπιφθνπ. ηνλ Πίλαθα 13 παξαηίζεληαη πιεξνθνξίεο γηα ηα ελδηάκεζα κφξηα πνπ ζπκκεηέρνπλ ζην δίθηπν απηφ. 140

141 Μφξην Πιήξεο φλνκα Βηνινγηθφο Ρφινο NGN2 NeuroGeniN 2 NGN1 NeuroGeniN 1 APP Amyloid beta (A4) Precursor Protein BRN2 POU domain, class 3, (POU3F2) transcription Factor 2 NFKB Nuclear Factor Kappa B TP53 Tumor Protein p53 Coagulation Factor II F2 (thrombin) LIF Leukemia Inhibitory Factor Ρχζκηζε κεηαγξαθήο θαη αλάπηπμεο λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο. Ρχζκηζε κεηαγξαθήο θαη αλάπηπμεο λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο. Κπηηαξηθφο ππνδνρέαο θαη πξφδξνκν κφξην δηακεκβξαληθήο πξσηεΐλεο. Πέπηεηαη θπζηνινγηθά δίλνληαο κηθξφηεξα πεπηίδηα πνπ πξνσζνχλ ηελ κεηαγξαθή. πκκεηνρή ζηελ αλάπηπμε ηνπ λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο. Ρχζκηζε κεηαγξαθήο θαη αλάπηπμεο λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο. Πξσηετληθφ ζχκπιεγκα. Ρχζκηζε κεηαγξαθήο θαη έιεγρνο απφπησζεο. Πξντφλ νγθνγνληδίνπ. Έιεγρνο θπηηαξηθνχ θχθινπ, απφπησζεο, επηδηφξζσζεο DNA, θπηηαξηθήο γήξαλζεο θαη κεηαβνιηζκνχ. Ηθαλφηεηα πξφζδεζεο ζην DNA θαη επαγσγή κεηαγξαθήο. Έιεγρνο αλάπηπμεο λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο. Παξάγνληαο πνπ κε πξσηεφιπζε δίλεη ηε ζξνκβίλε. Ρχζκηζε πήμεο αίκαηνο, αηκάησζεο εκβξχνπ θαη λενγλνχ. Γξάζε Απμεηηθνχ παξάγνληα. Πξφζδεζε πξσηετλψλ θαη πξσηεφιπζε. Ρχζκηζε δηαθνξνπνίεζεο λεπξηθψλ θπηηάξσλ. Κπηηαξνθίλε. πκκεηνρή ζηελ δηαθνξνπνίεζε ησλ λεπξηθψλ θπηηάξσλ θαη ζηελ νξγαλνγέλεζε ησλ πνιπθχηηαξσλ νξγαληζκψλ. TNF MAPK8 PKC Tumor Necrosis Factor Μitogen-Activated Protein Kinase 8 Protein kinase C Ρχζκηζε θπηηαξηθνχ θχθινπ. πκκεηνρή ζε θπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ, απφπησζε θαη δηαθνξνπνίεζε. Φσζθνξπιίσζε πξσηετλψλ ζηφρσλ. πκκεηνρή ζε πνιιά θπηηαξηθά κνλνπάηηα. Φσζθνξπιίσζε πξσηετλψλ ζηφρσλ. πκκεηνρή ζε πνιιά θπηηαξηθά κνλνπάηηα. Πίλαθαο 13: Πιεξνθνξίεο ζρεηηθά κε ηα ελδηάκεζα κφξηα ηνπ δηθηχνπ αιιειεπηδξάζεσλ ηεο Δηθφλαο

142 Δηθφλα 54: (Α) Αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ πξσηετλψλ πνπ ζπγθξνηνχλ ην ζχκπινθν ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηεο παξνχζαο κειέηεο. (Β) Σα δχν δηαθξηηά πηζαλά ζχκπινθα παξαγφλησλ πνπ ειέγρνπλ: Η. ηελ επαγσγή θαη ΗΗ. ηελ θαηαζηνιή ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ. Σν ππφκλεκα, ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο, επεμεγεί ην ζπκβνιηζκφ ησλ αιιειεπηδξάζεσλ. ρεηηθά κε ηε ζπγθξφηεζε ηνπ ζπκπιφθνπ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, φπσο αλαπαξίζηαηαη ζηελ Δηθφλα 54, ν παξάγνληαο NGN3 ζπλδέεηαη κε ηνλ παξάγνληα HNF1, ν νπνίνο κε ηε ζεηξά ηνπ αιιειεπηδξά κε ηηο πξσηεΐλεο CTNNB1(Β-CaΣeΝiΝ) θαη CREBBP (CREB Binding Protein). Οη δχν ηειεπηαίεο 142

143 πξσηεΐλεο απνηεινχλ γεληθνχο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο θαη θαίλεηαη πσο ζπλδεφκελεο ιεηηνπξγνχλ σο ελδηάκεζα πξσηετληθά κφξηα γηα ηε ζπγθξφηεζε ηνπ κεηαγξαθηθνχ ζπκπιφθνπ (105, 136, ). Πην αλαιπηηθά, ε CTNNB1 ξπζκίδεηαη απφ ην θαλνληθφ κνλνπάηη πνπ θαζνδεγνχλ νη WNT πξσηεΐλεο, νπφηε κε ηελ ειεγρφκελε πξσηεφιπζε απηήο ζην θπηηαξφπιαζκα ξπζκίδεηαη ε πνζφηεηα πνπ παξακέλεη θαη αθνινπζεί κεηαθνξά απηήο ζηνλ ππξήλα ηνπ θπηηάξνπ. Δθεί ε CTNNB1 πξνζδέλεη δηάθνξνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο θαη καδί κε απηνχο ξπζκίδεη ηε κεηαγξαθή πιεηάδαο γνληδίσλ. Απφ ηελ άιιε πιεπξά, ε CREBBP παίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ εκβξπηθή αλάπηπμε θαζψο δξα ζαλ ζπλελεξγνπνηεηήο πνιιψλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. Δπηπιένλ ε CREBBP εκθαλίδεη δξάζε αθεηπινκεηαθνξάζεο αθεηπιηψλνληαο ηζηφλεο θαη κε ηζηφλεο, ειέγρνληαο έηζη κέζσ ησλ ηνπηθψλ αλαδηαηάμεσλ ηεο ρξσκαηίλεο, κε έλαλ αθφκε ηξφπν ηε κεηαγξαθή (105, 146, 188). ην ζπγθεθξηκέλν ζχκπινθν ε CREBBP ρξεζηκνπνηείηαη σο ελδηάκεζν κφξην γηα ηελ πξφζδεζε ζε απηφ ησλ παξαγφλησλ NGN3 θαη HNF6, θαζψο ζπλδέεηαη καδί ηνπο (188, 195, 196). Ο παξάγνληαο HNF6 πξνζδέλεηαη ζην ζχκπινθν κέζσ πξσηετληθψλ αιιειεπηδξάζεσλ κε ηελ CREBBP θαη ηελ FOXA2, ηεο νπνίαο επηπιένλ απμάλεη ηελ ελεξγφηεηα σο πξσηεΐλε-ξπζκηζηή ηεο κεηαγξαθήο (195, 197). Δδψ πξέπεη λα αλαθεξζεί πσο ε FOXA2, πνπ επίζεο πξνζδέλεηαη ζηνλ NGN3, είλαη κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο πνπ ειέγρεη πνιιά γνλίδηα πνπ ζπκκεηέρνπλ ζηε δηαθνξνπνίεζε ηνπ παγθξέαηνο θαη παξάιιεια αιιειεπηδξά κε ηε ρξσκαηίλε (198). Δπηζηξέθνληαο ζηελ CTNNB1 δηαπηζηψλεηαη ε πξφζδεζή ηεο ζηελ πξσηεΐλε LEF1 θαη ηελ HDAC1 (Ζistone DeACetylase 1). Ζ HDAC1 αιιειεπηδξψληαο κε ηε LEF1 κεηψλεη ηελ ηθαλφηεηα πξφζδεζήο ηεο LEF1 ζηε CTNNB1, ελψ πξνζδελφκελε ζηνπο παξάγνληεο PDX1 θαη AP4 εμεγεί ηελ παξνπζία απηψλ ησλ πξσηετλψλ ζην κεηαγξαθηθφ ζχκπινθν πνπ έρεη ήδε πεξηγξαθεί (199, 200). Αμίδεη επίζεο λα αλαθεξζεί πσο ε παξνπζία ηεο HDAC1 ζην ζχκπινθν ξπζκίδεη ην κεηαγξαθηθφ ξφιν ηεο LEF1 (199, 201, 202), ε νπνία κε ηε ζεηξά ηεο ειέγρεη ηελ κεηαγξαθή ηνπ γνληδίνπ ΒRN2 πξνο ζχλζεζε πξσηεΐλεο πνπ αθνινχζσο ζπγθξνηεί δηκεξέο κε ηελ πξσηεΐλε BRN4 θαη θαζνδεγεί ηελ παξαγσγή γιπθαγφλεο απφ ηα θχηηαξα ( ). Οη ηειεπηαίεο αιιειεπηδξάζεηο αλαπαξίζηαληαη ζηελ Δηθφλα 55 καδί κε ηηο ππφινηπεο ζρέζεηο κεηαμχ ησλ παξαγφλησλ ηνπ κεηαγξαθηθνχ ζπκπιφθνπ κε ηα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ. Πξάγκαηη ζην θάησ αξηζηεξά κέξνο ηεο Δηθφλαο 55 θαίλεηαη πψο ν NGN3 ειέγρεη 143

144 ηε κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ-γλσζηψλ ζηφρσλ ηνπ. Ο NGN3 επάγεη ηελ έθθξαζε ησλ γνληδίσλ NGN1, NKX2.2 θαη NEUROD1, ελψ καδί κε ηνλ παξάγνληα HNF1 είλαη απαξαίηεηνη γηα ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ PAX4 (73, 136, 206, 207). Ο NEUROD1 κε ηε ζεηξά ηνπ ξπζκίδεη ηελ έθθξαζε ηνπ ΙΑ1, ε πξσηεΐλε ηνπ νπνίνπ καδί κε ηνλ NEUROD1 θαη ζε ζπλεξγαζία κε ηνλ παξάγνληα PDX1 απμάλεη ηα επίπεδα έθθξαζεο ηνπ NGN3 (207). Ο NEUROD1 παξάιιεια απμάλεη ηα επίπεδα έθθξαζεο ησλ PAX4, DCX θαη NKX2.2 γνληδίσλ (73, 206, 208). O NKX2.2 πξνζδέλεηαη θαη ξπζκίδεη ηελ έθθξαζε ηνπ PAX4, ελψ παξάιιεια απμάλεη ηελ ελεξγφηεηα ησλ πξσηετλψλ NGΝ1 θαη NGΝ2 (209, 210). Ζ πξσηεΐλε NGN2 κε ηε ζεηξά ηεο θξίλεηαη απαξαίηεηε γηα ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ NKX2.2 θαζψο θαη γηα ηελ έθθξαζε θαη ελεξγνπνίεζε ηεο πξσηεΐλεο DCX (208, ). Οη πξσηεΐλεο NGN3 θαη NKX2.2 παίδνπλ θπξίαξρν ξφιν θαηά ηε δηαθνξνπνίεζε ησλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα επάγνληαο ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ ηεο ηλζνπιίλεο (Insulin) (73, 206). Ζ πξσηεΐλε APP ζπγθεληξψλεηαη κε ηελ παξνπζία ηλζνπιίλεο ζηα θχηηαξα (213) θαη αθνινχζσο ζπκκεηέρεη ζηε ξχζκηζε ηεο ελεξγφηεηαο ηνπ ζπκπιφθνπ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ πεξηγξάθεθε, ξπζκίδνληαο ηελ πνζφηεηα β- θαηελίλεο πνπ θηάλεη ζηνλ ππξήλα θαη πξνζδέλεηαη ζην ζχκπινθν (214). Δπηπξνζζέησο δξα απμάλνληαο ηα επίπεδα έθθξαζεο ηνπ γνληδίνπ HUD (215), ην νπνίν επάγεηαη. ηε ξχζκηζε ηεο πνζφηεηαο β-θαηελίλεο πνπ θηάλεη ζηνλ ππξήλα ζπκκεηέρεη θαη ε πξσηεΐλε WNT5Α (179), ε νπνία εθθξαδφκελε νδεγεί ηα θχηηαξα πξνο ηελ παξαγσγή ηλζνπιίλεο (216) θαη απμάλεη ηελ ελεξγφηεηα ηεο CDC42 πξσηεΐλεο (217). Ζ WNT5Α πξσηεΐλε ζπκκεηέρεη ζην κε θαλνληθφ κνλνπάηη κεηαγσγήο ζήκαηνο πνπ θαζνδεγνχλ νη WNT πξσηεΐλεο, απνηξέπνληαο έηζη ηελ πξσηεφιπζε ηεο β-θαηελίλεο θαηά ην θαλνληθφ WNT κνλνπάηη θαη απμάλνληαο παξάιιεια ηα επίπεδα ηφλησλ αζβεζηίνπ (Ca +2 ) ζηνλ ελδνθπηηάξην ρψξν (162). Σν ηειεπηαίν απηφ γεγνλφο ζπλδέεηαη κε ηελ ηθαλφηεηα ησλ θπηηάξσλ λα εθθξίλνπλ ηλζνπιίλε (218). Δπηπιένλ, ε παξνπζία ηφλησλ αζβεζηίνπ ζηνλ ελδνθπηηάξην ρψξν ζπλδέεηαη κε ηελ απειεπζέξσζε νιετθνχ νμένο, ην νπνίν κε ηε ζεηξά ηνπ επάγεη ηελ έθθξηζε γιπθαγφλεο απφ ηα θχηηαξα (219, 220). Σα επίπεδα ηφλησλ αζβεζηίνπ ειέγρεη επίζεο θαη ε πξσηεΐλε πνπ θσδηθνπνηείηαη απφ ην γνλίδην FZD2 πνπ αιιειεπηδξά κε ηε WNT5 θαη θαηαζηέιιεηαη πξνθεηκέλνπ λα δηαηεξεζεί ε ελδνθπηηάξηα ζπγθέληξσζε αζβεζηίνπ ζηα επηζπκεηά επίπεδα (221, 222). Ζ θαηαζηνιή ηεο έθθξαζεο ηνπ FZD2 ειέγρεηαη απφ ηα απμεκέλα επίπεδα 144

145 ππεξνμεηδίνπ ηνπ πδξνγφλνπ ηα νπνία ζρεηίδνληαη κε ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ ηεο ηλζνπιίλεο ζηα θχηηαξα (223, 224). Δπηπξνζζέησο, ε θαηαζηνιή ηεο έθθξαζεο ηεο FZD2 είλαη ζε απφιπηε ζπκθσλία κε ηελ θαηαζηνιή έθθξαζεο ηεο VCL, αθνχ νη δχν απηέο πξσηεΐλεο ζπγθξνηνχλ ζχκπινθν (225). Ζ απελεξγνπνίεζε επίζεο ηεο πξσηεΐλεο VCL είλαη ζπλδεδεκέλε κε ηελ έθθξαζε ηλζνπιίλεο απφ ηα θχηηαξα, ελψ ε θαηαζηνιή ηνπ VCL γνληδίνπ θαίλεηαη λα ειέγρεηαη απφ ηνλ παξάγνληα TNF θαη λα επεξεάδεηαη απφ ην ξεηηλντθφ νμχ ( ). Σν ηειεπηαίν ρξεζηκνπνηήζεθε ζην πξσηφθνιιν δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ (62), ζηα νπνία έγηλε ν έιεγρνο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ ηεο παξνχζαο εξγαζίαο θαη θαίλεηαη λα δηαδξακαηίδεη θπξίαξρν ξφιν ζην δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ πνπ θαζνδεγεί ηα θχηηαξα ψζηε λα παξάμνπλ ηλζνπιίλε. Απφ ην ξεηηλντθφ νμχ θαίλεηαη λα επάγεηαη θαη ε έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ CDC42, ε πξσηεΐλε ηνπ νπνίνπ ελεξγνπνηεί θαη εληζρχεη ηελ έθθξηζε ηλζνπιίλεο απφ ηα θχηηαξα, ελψ παξάιιεια ελεξγνπνηψληαο ηελ θηλάζε MAPK8 πξνθαιεί δξαζηηθή κείσζε ηεο έθθξαζεο ηνπ παξάγνληα TNF ( ). Ζ απνπζία ηνπ ηειεπηαίνπ δηθαηνινγεί, επνκέλσο, ηελ θαηαζηνιή ησλ γνληδίσλ VCL θαη WISP1, αθνχ παξνπζία ηνπ ηα γνλίδηα απηά επάγνληαη (233, 234). Δπηπιένλ, σο ζπλελεξγνπνηεηήο ηνπ γνληδίνπ CTGF, ν TNF πνπ απνπζηάδεη, εμεγεί ηελ θαηαζηνιή ηνπ ελ' ιφγσ γνληδίνπ (235). Δπηζηξέθνληαο ζηελ πξσηεΐλε CDC42, πνπ επίζεο επάγεηαη απφ ην ξεηηλντθφ νμχ (236), κπνξεί λα αλαθεξζεί πσο απνηειεί κφξην θιεηδί ζην ξπζκηζηηθφ δίθηπν ηεο Δηθφλαο 55 αθνχ επηπιένλ δηθαηνινγεί ηηο αιιαγέο έθθξαζεο ησλ γνληδίσλ PARD3, PARD6B θαη ALDH1B1. Ζ απμεκέλε δξάζε ηεο CDC42 ζπλδέεηαη κε ηελ ηθαλφηεηα έθθξηζεο ηλζνπιίλεο απφ ηα θχηηαξα θαη παξάιιεια απμάλεη ηελ δξαζηηθφηεηα ηεο MAPK8 ζπλεηζθέξνληαο έηζη ζηελ απνπζία δξάζεο ηνπ TNF πνπ πξναλαθέξζεθε ( ). Με δεηνχκελν ηελ απμεκέλε ελεξγφηεηα ηεο CDC42, δηθαηνινγείηαη θαη ε επαγσγή έθθξαζεο ηεο πξσηεΐλεο πνπ θσδηθνπνηείηαη απφ ην γνλίδην FGD4, πνπ κέζσ αιιειεπίδξαζεο ελεξγνπνηεί ηελ CDC42 ελψ ηαπηφρξνλα απνηειεί ηθαλφ θαη αλαγθαίν ελεξγνπνηεηή ηεο ΜΑPK8 (233). Δλεξγνπνηεηήο ηεο ΜΑPK8 είλαη θαη ε ζξνκβίλε (F2) πνπ κε ηε ζεηξά ηεο ελεξγνπνηεί ηα ζπκπιέγκαηα ηνπ παξάγνληα NFKB, γεγνλφο ζπκβαηφ κε θαηαζηάζεηο παξαγσγήο ηλζνπιίλεο απφ ηα θχηηαξα ( ). Σα ζπκπιέγκαηα απηά ππφ ηελ θαζνδήγεζε ηεο F2 επάγνπλ ηε κεηαγξαθή ηνπ γνληδίνπ ΑLDH1B1 (237). Ζ παξνπζία ηνπ κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα AP4 ζην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ησλ θαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ, φπσο 145

146 π.ρ. ηνπ PARD6B ελεξγνπνηεί ηελ πξσηεΐλε TP53, ε νπνία ειέγρεη θαη ζπγθεθξηκέλα θαηαζηέιιεη ηελ έθθξαζε ηνπ παξαπάλσ γνληδίνπ (238, 239). Παξάιιεια ε ελεξγνπνίεζε ηεο TP53 επάγεη ηελ έθθξαζε ηνπ LIF πνπ αθνινχζσο απμάλεη ηελ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ RGS4 (240, 241). Δηθφλα 55: Αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ παξαγφλησλ ηνπ κεηαγξαθηθνχ ζπκπιφθνπ θαη ησλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ. ην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο επεμεγνχληαη ηα ζχκβνια ησλ αιιειεπηδξάζεσλ θαη ησλ ζπκκεηερφλησλ κνξίσλ. 146

147 πδήηεζε ην ζχκπινθν ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πνπ πεξηγξάθεθε ζα κπνξνχζε λα δηαθξηζεί κηα θεληξηθή πεξηνρή απφ ηνπο παξάγνληεο NGN3-HNF1-CREBBP θαη HNF6, πνπ πξνζειθχεη ηελ πξσηεΐλε FOXA2 θαη εληζρχεη ηελ ηθαλφηεηά ηεο λα ειέγρεη ηε κεηαγξαθή πνιιψλ γνληδίσλ ξπζκηζηψλ ηεο δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο (188, ). Απφ ηελ άιιε πιεπξά ζην κεηαγξαθηθφ ζχκπινθν, κέζσ ηεο CTNNB1, πξνζδέλνληαη ε LEF1 θαη ε HDAC1, ελψ παξάιιεια ειέγρνληαη (απφ ηελ HDAC1) ηα επίπεδα αθεηπιίσζεο ησλ πξσηετλψλ ηεο ρξσκαηίλεο πνπ ειέγρνπλ ηελ κεηαγξαθή. Οη παξάγνληεο PDX1 θαη ΑP4 πξνζδέλνληαη ζην ζχκπινθν κέζσ ηεο HDAC1 θαη ίζσο επεξεάδνπλ ηε ηθαλφηεηα πξφζδεζεο ησλ πξναλαθεξζέλησλ κνξίσλ ζηε CTNNB1 ( ). Αλ εδψ ιεθζεί ππ' φςηλ ε επηιεθηηθή παξνπζία ησλ πξνηχπσλ πξφζδεζεο ηνπ παξάγνληα AP4 ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο κφλν ησλ θαηαζηειιφκελσλ απφ ηνλ NGN3 γνληδίσλ, ίζσο κπνξεί λα ππνζηεξηρζεί ε ππφζεζε πσο ν παξάγνληαο απηφο εληζρχεη ηε δξάζε ηεο HDAC1, νπφηε ιφγσ απναθεηπιίσζεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ ελ' ιφγσ γνληδίσλ θαη ηεο κεηάπησζεο ηεο ρξσκαηίλεο ζε πην ζπκπαγή δνκή θαηαζηέιιεηαη ε κεηαγξαθή. Μεηαμχ ησλ θαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ ελδηαθέξνλ παξνπζηάδεη ην γνλίδην PARD6B. Πξάγκαηη, κε ηελ θαηαζηνιή ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ γνληδίνπ δηαηαξάζζνληαη ηα πξσηετληθά ζχκπινθα πνπ ζπγθξνηεί ε πξσηεΐλε PARD6B. Σα ζχκπινθα απηά γεληθά απνηεινχλ θαζνδεγεηέο ηεο θπηηαξηθήο κεηαλάζηεπζεο θαη ηνπ θπηηαξηθνχ πξνζαλαηνιηζκνχ θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε, ψζηε λα ζρεκαηηζηνχλ ζσζηά ηα δηάθνξα φξγαλα (242). Έηζη, ελψ ζε δηαθνξνπνηεκέλα λεπξηθά θχηηαξα ζπγθξνηνχληαη ζχκπινθα κεηαμχ ησλ πξσηετλψλ PARD3, PARD6B θαη CDC42 ππφ ηελ θαζνδήγεζε ηεο CDC42, (243) ζηα θχηηαξα ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ ηχπνπ δελ ζπγθξνηνχληαη παξφκνηα ζχκπινθα αθνχ δελ εθθξάδεηαη ε πξσηεΐλε PARD6B. Ίζσο, έηζη, λα επεξεάδεηαη ε κεηαλάζηεπζε απηψλ ησλ θπηηάξσλ. Δπίζεο γηα ην γνλίδην BHLHB2 έρεη δεηρζεί πξνζθάησο πσο ε ξχζκηζε ηεο έθθξαζήο ηνπ εμαξηάηαη απφ ην ξεηηλντθφ νμχ θαη είλαη θαζνξηζηηθή γηα ηε δηαθνξνπνίεζε ησλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ. Πην ζπγθεθξηκέλα, ην BHLHB2 εθθξάδεηαη ζε αξρηθά ζηάδηα θαιιηέξγεηαο πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ ζειαζηηθψλ κεηά απφ πξνζζήθε ξεηηλντθνχ νμένο ζην κέζν θαιιηέξγεηαο (183). Δπηπιένλ ε ξχζκηζε ηεο έθθξαζεο ηνπ γνληδίνπ CTGF είλαη ζεκαληηθή γηα ηε ζσζηή κνξθνγέλεζε ησλ λεζηδίσλ ηνπ παγθξέαηνο θαη ηε δηαθνξνπνίεζε ησλ 147

148 δηαθφξσλ θπηηαξηθψλ ηχπσλ ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ νξγάλνπ ζηηο ζσζηέο αλαινγίεο. πγθεθξηκέλα ην CTGF εθθξάδεηαη έληνλα ζην επηζήιην ησλ παγθξεαηηθψλ ινβψλ θαη ζε κηθξφηεξν βαζκφ θαηά ηε δηαθνξνπνίεζε ησλ θπηηάξσλ πνπ παξάγνπλ ηλζνπιίλε. Χζηφζν, κεηά ηε γέλλεζε, ζηα ήδε δηαθνξνπνηεκέλα β-θχηηαξα ε έθθξαζε ηνπ CTGF θαηαζηέιιεηαη. Φαίλεηαη πσο ην CTGF ειέγρεη ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ ησλ β-θπηηάξσλ θαηά ηε δηαθνξνπνίεζή ηνπο θαζψο έιιεηςε ηνπ γνληδίνπ νδεγεί ζε κείσζε ηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ ησλ θπηηάξσλ απηψλ. (244). ρεηηθά κε ηα επαγφκελα, ζχκθσλα κε ηα δεδνκέλα ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ (62) γνλίδηα, πξφζθαηεο αλαθνξέο ππέδεημαλ ηε ζπκκεηνρή ηνπο ζηε κνξθνγέλεζε ηνπ παγθξέαηνο θαη ζηε δηαθνξνπνίεζε ησλ β-θπηηάξσλ ηνπ νξγάλνπ. Αλαιπηηθά, γηα ην γνλίδην ALDH1B1 πξνζθάησο δείρζεθε αχμεζε ηεο έθθξαζήο ηνπ θαηά ηε δηαθνξνπνίεζε ησλ πξφδξνκσλ παγθξεαηηθψλ θπηηάξσλ ππφ ηελ επίδξαζε ηνπ NGN3. Έληνλε έθθξαζε ηνπ ALDH1B1 ζεκεηψζεθε θαη ζηνπο αλαπηπζζφκελνπο ζε έκβξπα πνληηθψλ παγθξεαηηθνχο ινβνχο. Ζ έθθξαζε ηνπ γνληδίνπ ALDH1B1 εμαξηάηαη απφ ηνλ παξάγνληα PDX1 θαη αθνξά ηα πξφδξνκα θχηηαξα ηφζν ηεο ελδνθξηλνχο, φζν θαη ηεο εμσθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο (182). Δπηπιένλ γηα ην γνλίδην CDC42 έρεη δεηρζεί φηη ειέγρεη ηνλ θαζνξηζκφ ηεο ηχρεο ησλ πνιπδχλακσλ πξφδξνκσλ θπηηάξσλ ζην πξψηκν έκβξπν δεκηνπξγψληαο ην θαηάιιειν κηθξνπεξηβάιινλ. Πην ζπγθεθξηκέλα ην CDC42 ειέγρεη ην ζσζηφ ζρεκαηηζκφ θαη ηε ιεηηνπξγία ηνπ εθθξηηηθνχ δηθηχνπ ησλ πφξσλ ηνπ παγθξέαηνο δεκηνπξγψληαο κηθξνχο δηαχινπο θαη δηαηεξψληαο ηελ πνιηθφηεηα ησλ θπηηάξσλ (245). Δπηπξνζζέησο, γηα ην γνλίδην RGS4 έγηλε πξφζθαηα γλσζηφ φηη εθθξάδεηαη ππφ ηνλ έιεγρν ηνπ NGN3 ζε πξφδξνκα ελδνθξηλή θχηηαξα ηνπ νζηετζρχνο Zebrafish (Danio rerio) θαη ηνπ πνληηθνχ, φπσο θαη ζε θχηηαξα ηνπ παγθξεαηηθνχ επηζειίνπ ζε έκβξπα πνληηθνχ. Απψιεηα ηνπ γνληδίνπ RGS4 νδεγεί ζε δηαηαξαρή ηεο κεηαλάζηεπζεο ησλ ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ ζε πξψηκα έκβξπα ηνπ νζηετζρχνο Zebrafish θαη ηνπ πνληηθνχ, ψζηε λα κε ζρεκαηηζηνχλ ζσζηά ηα λεζίδηα ηνπ παγθξέαηνο. Δμάγεηαη ινηπφλ ην ζπκπέξαζκα πσο ν παξάγνληαο NGN3 επάγεη ηελ έθθξαζε ηνπ RGS4 ζε πξφδξνκα παγθξεαηηθά θχηηαξα ειέγρνληαο έηζη ηελ θαηεπζπλφκελε κεηαλάζηεπζή ηνπο ψζηε λα ζρεκαηηζζνχλ ηειηθά ηα λεζίδηα ηνπ παγθξέαηνο (246). πκπεξαζκαηηθά, ηα πξναλαθεξζέληα γνλίδηα ζπκκεηέρνπλ ζην ξπζκηζηηθφ δίθηπν πνπ θαζνδεγεί ν NGN3. 148

149 Γεληθφηεξα, θαίλεηαη πσο ηα θχηηαξα πθίζηαληαη έλα ζχλνιν πξνγξακκαηηζκέλσλ αιιαγψλ πξνθεηκέλνπ λα δηαθνξνπνηεζνχλ ζηαδηαθά πξνο ελδφδεξκα θαη ζηε ζπλέρεηα πξνο πξφδξνκα παγθξεαηηθά θχηηαξα ηθαλά λα παξάγνπλ ηλζνπιίλε. Δπηπιένλ, θαηά ηα πξψηα ζηάδηα δηαθνξνπνίεζεο ησλ ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο ε ηθαλφηεηα παξαγσγήο ηλζνπιίλεο ζπλππάξρεη κε ηελ ηθαλφηεηα παξαγσγήο γιπθαγφλεο, θαζψο νη δχν νξκφλεο ζπλεθθξάδνληαη (13). ηαδηαθά, φκσο ην κνλνπάηη πνπ νδεγεί ζηελ γιπθαγφλε ζβήλεη θαη έδαθνο θεξδίδεη απηφ πνπ ππνζηεξίδεη ηελ παξαγσγή ηλζνπιίλεο. ην παξαπάλσ δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ ζπκκεηέρνπλ άιινηε ζπλαγσληζηηθά θαη άιινηε αληαγσληζηηθά δηάθνξα επηκέξνπο κνλνπάηηα φπσο γηα παξάδεηγκα ην θαλνληθφ θαη ηα κε θαλνληθά κνλνπάηηα πνπ δηακεζνιαβνχληαη απφ ηηο πξσηεΐλεο WNT. 149

150 4.4 Γηεξεχλεζε ησλ trans-trans Αιιειεπηδξάζεσλ Γηαδηθαζία - Απνηειέζκαηα Δπηπξνζζέησο κειεηήζεθαλ νη αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ ηνπ πηζαλνχ ζπκπιφθνπ ηεο Δηθφλαο 54. Πην ζπγθεθξηκέλα, δηεξεπλήζεθαλ νη κεηαμχ ηνπο δηεπζεηήζεηο θαη αιιειεπηδξάζεηο ζην ρψξν θαη ειέγζεθαλ δηαθνξεηηθά ελδερφκελα ζπγθξφηεζεο επηκέξνπο ζπκπιφθσλ. Αξρηθφ βήκα ηεο δηαδηθαζίαο απνηέιεζε ε αλαδήηεζε ησλ θξπζηαιιηθψλ δνκψλ ησλ πξσηετλψλ ζηελ PDB (101). Αμίδεη λα ζεκεησζεί πσο νη πεξηζζφηεξνη απφ ηνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ δε βξέζεθαλ θξπζηαιισκέλνη ζε φιν ηνπο ην εχξνο. Γηαζέζηκεο ηξηζδηάζηαηεο δνκέο βξέζεθαλ κφλν γηα επηκέξνπο δνκηθέο πεξηνρέο ησλ κνξίσλ ηνπο. Δπηπιένλ γηα νξηζκέλνπο απφ απηνχο δε βξέζεθαλ θαζφινπ ηξηζδηάζηαηεο δνκέο (π.ρ. NGN3, HDAC1, AP4 θαη FOXA2). Γηα ηελ πεξίπησζε ησλ ηειεπηαίσλ πξσηετλψλ θαηαζθεπάζζεθαλ πξφηππα ηξηζδηάζηαησλ δνκψλ. Με ηελ ηερληθή ηεο πξνηππνπνίεζεο κε βάζε ηελ νκνινγία θαη κε ην πξφγξακκα SWISS-MODEL (131) πξνέθπςαλ πξφηππα ηξηζδηάζηαησλ δνκψλ ηα νπνία θαη αμηνινγήζεθαλ σο πξνο ηελ αμηνπηζηία ηνπο (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). Δηδηθφηεξα γηα ηελ πεξίπησζε ησλ πξσηετλψλ φπνπ ε αμηνπηζηία ησλ πξνηχπσλ πνπ πξνέθπςαλ δελ ήηαλ ηθαλνπνηεηηθή, αλαδεηήζεθαλ έηνηκα πξφηππα ζηελ βάζε δεδνκέλσλ ModBase (132). ηελ Δηθφλα 56Α θαίλεηαη ε ηξηζδηάζηαηε δηακφξθσζε ηεο πξσηεΐλεο HDAC1 ζχκθσλα κε ην πξφηππν πνπ θαηαζθεπάζζεθε κε ην πξφγξακκα SWISS-MODEL θαη ζηελ Δηθφλα 56Β αθνινπζεί ε αμηνιφγεζε ηνπ κε ην πξφγξακκα ΑΝΟLEA (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). Οη πξάζηλεο ελδείμεηο ζην δηάγξακκα βεβαηψλνπλ ηηο αξλεηηθέο ηηκέο ελέξγεηαο θαη δειψλνπλ επλντθφ ελεξγεηαθφ πεξηβάιινλ, νπφηε αλ ε δηεπζέηεζε ηεο πιεηνςεθίαο ησλ ακηλνμέσλ ζην ρψξν θξίλεηαη ηθαλνπνηεηηθή, ην πξφηππν γίλεηαη απνδεθηφ. Απφ ηελ εθηίκεζε ηνπ δηαγξάκκαηνο γίλεηαη θαλεξφ πσο κφλν ηα ακηλνμέα δχν ζέζεσλ απφ ηα 400 πεξίπνπ ηνπ κνξίνπ πνπ πξνηππνπνηήζεθαλ εκθάληζαλ ηηκέο πιεζίνλ ηνπ κεδελφο, ελψ φια ηα ππφινηπα ζπλνδεχνληαλ απφ αξλεηηθέο ηηκέο ελέξγεηαο, νπφηε θαη ην πξφηππν θξίζεθε αμηφπηζην. 150

151 A) Δηθφλα 56: (Α) To πξφηππν ηεο πξσηεΐλεο HDAC1. (Β) Αμηνιφγεζε ηνπ πξνηχπνπ κε ην πξφγξακκα ANOLEA. 151

152 ηε ζπλέρεηα αλαδεηήζεθαλ νη δνκηθέο πεξηνρέο ησλ πξσηετλψλ ηνπ πηζαλνχ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ (βι. Γεδνκέλα θαη Μέζνδνη). ηελ Δηθφλα 57 απνδίδνληαη ζρεκαηηθά νη δνκηθέο πεξηνρέο νξηζκέλσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, πνπ βξέζεθαλ λα ζπγθξνηνχλ επηκέξνπο ζχκπινθα (Δηθφλεο 59-63) κέζα ζην επξχηεξν ππεξκνξηαθφ ζχκπινθν ηεο Δηθφλαο 54. Δηθφλα 57: Οη δνκηθέο πεξηνρέο ησλ θπξηφηεξσλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ. ηε ζπλέρεηα, κε ρξήζε ηνπ πξνγξάκκαηνο PatchDock έγηλε δηεξεχλεζε δηαθφξσλ ππνζέζεσλ αιιειεπίδξαζεο ησλ παξαπάλσ παξαγφλησλ πξνο ζρεκαηηζκφ ζπκπιφθσλ. Αξρηθά νξίζηεθαλ σο μερσξηζηά αξρεία εηζφδνπ νη πξσηετληθέο αιπζίδεο ελφο θξπζηαιισκέλνπ δηκεξνχο. Aθνινχζσο, ζπγθξίζεθαλ νη ζπληεηαγκέλεο ηνπ ζπκπιφθνπ πνπ απέδσζε ην πξφγξακκα (αξρείν εμφδνπ) κε ην αληίζηνηρν πξσηφηππν αξρείν PDB (θξπζηαιιηθή δνκή). ηελ Δηθφλα 58 θαίλεηαη ε ππέξζεζε ζηνλ ρψξν ησλ δνκψλ, απφ ηελ νπνία δηαπηζηψλεηαη ε απφιπηε ηαχηηζή ηνπο. 152

153 Δηθφλα 58: χγθξηζε ηεο δηεπζέηεζεο ζηνλ ρψξν δχν πξσηετληθψλ αιπζίδσλ απφ ην αξρείν PDB (απφδνζε κε ηε κνξθή α-ειίθσλ) θαη απφ ην αξρείν πνπ απέδσζε ην πξφγξακκα PatchDock (απφδνζε κε ηνλ ζρεδηαζκφ ησλ πιεπξηθψλ αιπζίδσλ ησλ ακηλνμέσλ). Μεηά ηελ επηηπρή αμηνιφγεζε ηνπ πξνγξάκκαηνο έγηλε εθηεηακέλε εθαξκνγή ηνπ γηα λα δηεξεπλεζνχλ πνιιαπιέο ππνζέζεηο ελαιιαθηηθψλ ηξηζδηάζηαησλ δηεπζεηήζεσλ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ πξνο ζρεκαηηζκφ ζπκπιφθσλ. ηελ Δηθφλα 59A θαίλεηαη ε αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ CREBBP θαη NGN3. Δζηηάδνληαο ζηα ζεκεία ησλ αιιειεπηδξάζεσλ ζηελ Δηθφλα 59Β παξνπζηάδνληαη νη αιιειεπηδξάζεηο ησλ ακηλνμέσλ 1771, 1772, 1795, 1819 θαη 1822 ηεο TAZ2 ( , Δηθφλα 57) δνκηθήο πεξηνρήο ηνπ κνξίνπ ηνπ CREBBP κε ηα ακηλνμέα 91, 94, 95, 98 θαη 102 ηεο πεξηνρήο έιηθαο ζειηάο έιηθαο (HLH) ηνπ NGN3. Σα ακηλνμέα πνπ ζπκκεηέρνπλ ζηελ αιιειεπίδξαζε παξνπζηάδνληαη κε ηηο πιεπξηθέο ηνπο αιπζίδεο ελψ ππνδεηθλχνληαη ελδεηθηηθά νξηζκέλα ζεκεία ζπλδέζεσο απηψλ θαη νη ζρεηηθέο κεηαμχ ηoπο απνζηάζεηο. Αμίδεη λα ζρνιηαζζεί πσο ε πιεηνςεθία ησλ δεζκψλ πνπ ζρεκαηίδνληαη κεηαμχ ησλ πξναλαθεξζέλησλ ακηλνμέσλ αλήθνπλ ζηελ θαηεγνξία ησλ δεζκψλ πδξνγφλνπ κε εχξνο Ǻ κε εμαίξεζε ην δεχγνο ησλ 153

154 ακηλνμέσλ ΑLA102-VAL1819 πνπ ζπγθξαηνχληαη κεηαμχ ηνπο ζε κηα απφζηαζε πεξίπνπ 4Ǻ ιφγσ πδξφθνβσλ αιιειεπηδξάζεσλ ησλ πιεπξηθψλ ηνπο νκάδσλ. Δηθφλα 59: (A) Αιιειεπηδξάζεηο κεηαμχ ησλ παξαγφλησλ NGN3 (Γαιάδην) θαη CREBBP (Πξάζηλν). (B) Λεπηνκεξήο απφδνζε νξηζκέλσλ δεπγψλ αιιειεπηδξψλησλ ακηλνμέσλ ζην δηκεξέο. Φαίλεηαη πσο ην πξνεγνχκελν δηκεξέο αιιειεπηδξά κε ηνπο παξάγνληεο CTNNB1 (β-θαηελίλε1) θαη HNF1 ζρεκαηίδνληαο ην ππεξκνξηαθφ ζχκπινθν ηεο Δηθφλαο 60. ηελ Δηθφλα 60 δηαπηζηψλεηαη ε αιιειεπίδξαζε κεηαμχ ησλ πξσηετλψλ CREBBP θαη CTNNB1 θαη ε πξφζδεζε ζην ζχκπινθφ ηνπο ησλ παξαγφλησλ NGN3 θαη HNF1. Oη ηειεπηαίνη παξάγνληεο αιιειεπηδξνχλ θαη κεηαμχ ηνπο θαη ζπγθεθξηκέλα ηα ακηλνμέα ηεο ακηλνηειηθήο πεξηνρήο ηνπ HNF1 κε ηα ακηλνμέα ζην θέληξν ηεο πεξηνρήο HLH ηνπ NGN3. ην ζχκπινθν ηεο Δηθφλαο 60 ππνδεηθλχνληαη ζρεκαηηζκέλα ππφ ηελ κνξθή ζθαηξψλ κε αθηίλα Van der Waals ηα ακηλνμέα πνπ βξίζθνληαη ζηα ζεκεία ησλ αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ησλ πξσηετληθψλ αιπζίδσλ. Πξάγκαηη θαίλεηαη πσο ακηλνμέα πνπ εζηηάδνληαη ζην κέζν θαη πξνο ην ακηλνηειηθφ άθξν ηνπ HNF1, αιιειεπηδξνχλ κε απηά ηνπ ακηλνηειηθνχ άθξνπ ηνπ κνξίνπ ηεο CREBBP θαζψο θαη κε δηάθνξεο δνκηθέο πεξηνρέο δαθηχισλ ςεπδαξγχξνπ (ZF) πνπ θείηνληαη ζε κεγάιν εχξνο ηνπ κνξίνπ 154

155 ηεο CREBBP. Ζ CREBBP επίζεο κέζσ ακηλνμέσλ πνπ βξίζθνληαη ζηηο πεξηνρέο ησλ ζειηψλ ηνπ κνξίνπ ηεο αιιειεπηδξά κε ηα ακηλνμέα ησλ ΑRM (ARMadillo) επαλαιακβαλφκελσλ δνκηθψλ πεξηνρψλ ζην θαξβνμπηειηθφ άθξν ηνπ κνξίνπ ηεο CTNNB1. Δηθφλα 60: Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ NGN3 (Κίηξηλν), HNF1 (Πξάζηλν) CREBBP (Κφθθηλν) θαη CTNNB1 (Μπιε). ηελ Δηθφλα 61Α παξνπζηάδεηαη ην ζχκπινθν ησλ πξσηετλψλ CTNNB1 θαη HDAC1, φπνπ ε πξψηε αιιειεπηδξά κέζσ ηεο ακηλνηειηθήο ηεο πεξηνρήο κε ηα ακηλνμέα ησλ ζέζεσλ 10, 18, 49, 52, 58, 70, 78, 80, 105, 128 θαη 129 ηεο δεχηεξεο. ηελ Δηθφλα 61Β παξνπζηάδνληαη εζηηαζκέλα ηα ζεκεία ησλ αιιειεπηδξάζεσλ ησλ πξναλαθεξζέλησλ θαηαινίπσλ. 155

156 Δηθφλα 61: (Α) Σν ζχκπινθν ησλ πξσηετλψλ CTNNB1 (Φνχμηα) θαη HDAC1 (Μσβ). (Β) Αιιειεπηδξψληα ακηλνμέα ζηα ζεκεία φπνπ νη δχν πξσηεΐλεο πξνζεγγίδνπλ ε κία ηελ άιιε. ηελ Δηθφλα 62Α παξνπζηάδεηαη ην ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ LEF1 θαη ΑP4. Σα ακηλνμέα 16, 17, 45, 47, 48 ηνπ LEF1 αιιειεπηδξνχλ κε ηα ακηλνμέα 92, 93, 100, 103 θαη 104 ηνπ AP4 θαη ππνδεηθλχνληαη κε ηηο πιεπξηθέο ηνπο αιπζίδεο ζηελ Δηθφλα 62Α. ηελ Δηθφλα 62Β παξνπζηάδνληαη ελδεηθηηθά ην δεχγνο αιιειεπηδξψλησλ ακηλνμέσλ ΑLA93-MET17 πνπ ζπγθξαηνχληαη κεηαμχ ηνπο κέζσ πδξφθνβσλ αιιειεπηδξάζεσλ θαη ην δεχγνο LYS103-GLU47 ηα άηνκα ησλ νπνίσλ ζπγθξαηνχληαη κε δεζκφ πδξνγφλνπ. ηελ Δηθφλα 63A παξνπζηάδεηαη ην ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ PDX1 θαη LEF1 φπνπ ππνδεηθλχνληαη κε ηηο πιεπξηθέο ηνπο αιπζίδεο ηα ακηλνμέα ησλ ζέζεσλ 1, 16, 19, 59 θαη 62 ζηελ πξσηετληθή αιπζίδα ηνπ LEF1 πνπ αιιειεπηδξνχλ αληηζηνίρσο κε ηα ακηλνμέα ησλ ζέζεσλ 23, 24, 57 θαη 58 ηνπ PDX1. ηελ πιεηνςεθία ηνπο ηα πξνεγνχκελα ακηλνμέα ζπλδένληαη κεηαμχ ηνπο κε δεζκνχο πδξνγφλνπ νξηζκέλνη απφ ηνπο νπνίνπο παξνπζηάδνληαη κε ιεπηνκέξεηα ζηελ Δηθφλα 63Β, φπνπ ππνδεηθλχνληαη κε καχξεο θνπθθίδεο. Δμαίξεζε απνηεινχλ ηα δεπγάξηα GLU16-LYS24 θαη GLU59-LYS57 πνπ ζπλδένληαη κε δεζκνχο άιαηνο (θάησ αξηζηεξά Δηθφλα 63Β). 156

157 Δηθφλα 62: (Α) Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ LEF1 (Μσβ) θαη ΑP4 (Κίηξηλν). (Β) Εεχγε αιιειεπηδξψλησλ ακηλνμέσλ. Δηθφλα 63: (Α) Σν ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ PDX1 (Γαιάδην) θαη LEF1 (Πξάζηλν). (Β) Αιιειεπηδξάζεηο ακηλνμέσλ. 157

158 πδήηεζε Σα ζχκπινθα ησλ Δηθφλσλ 62 θαη 63 πεξηγξάθνληαη γηα πξψηε θνξά ζηελ παξνχζα εξγαζία. Χζηφζν, έρεη δηαπηζησζεί (201) ε ζπγθξφηεζε ηνπ ζπκπιφθνπ HDAC1/LEF1 θαζψο θαη ηνπ ζπκπιφθνπ CTNNB1/LEF1, ηα νπνία έρεη δεηρζεί φηη θαηαζηέιινπλ θαη επάγνπλ, αληίζηνηρα, ηα γνλίδηα πνπ εμαξηψληαη κεηαγξαθηθά απφ ηνλ παξάγνληα LEF1. χκθσλα κε πξνεγνχκελεο κειέηεο ε πξφζδεζε ησλ κνξίσλ ηνπ LEF1 κπνξεί λα γίλεη είηε απφ ηελ CTNNB1 είηε απφ ηελ απναθεηπιάζε HDAC1 (201). Θεσξείηαη κάιηζηα φηη ζε θαζέλα απφ ηα δχν πξναλαθεξζέληα ζχκπινθα πξνζδέλνπλ θαη άιινη παξάγνληεο πνπ δξνπλ ζπλεξγηθά επάγνληαο ή θαηαζηέιινληαο, αληίζηνηρα, ηε κεηαγξαθή. Πην αλαιπηηθά, ε απναθεηπιάζε HDAC1 καδί κε θάπνηνλ ζπγθαηαζηνιέα πξνζδέλεηαη ζηνλ LEF1 απναθεηπιηψλνληαο ηε ρξσκαηίλε, ε νπνία απνθηά πην ζπκπαγή δνκή, ελψ ηαπηφρξνλα κεηψλεη ηελ ηθαλφηεηα ηνπ LEF1 λα επάγεη ηε κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ πνπ ειέγρεη (201). Απφ ηελ Δηθφλα 62 κπνξεί λα δηαπηζησζεί πσο έλαο ππνςήθηνο ζπγθαηαζηνιέαο πνπ ίζσο λα εληνπίδεηαη ζην ζχκπινθν, πνπ θαηαζηέιιεη ηε κεηαγξαθή είλαη ν AP4. Δπίζεο ππνδεηθλχεηαη ε πηζαλή πξφζδεζε κηαο πξσηεΐλεο κε δξάζε αθεηπινκεηαθνξάζεο ζην ζχκπινθν CTNNB1/LEF1 (201). To ηειεπηαίν ζχκπινθν απνζπά ηνλ LEF1 απφ ηνλ HDAC1 θαη ηνλ νδεγεί ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ θαηάιιεισλ γνληδίσλ φπνπ, αθεηπιηψλνληαο ηνπηθά ηε ρξσκαηίλε, ηελ κεηαηξέπεη ζε πην ραιαξή κνξθή δίλνληαο έηζη ψζεζε ζηελ έλαξμε ηεο κεηαγξαθήο. Αλ ζπλδπαζηεί ε πιεξνθνξία ησλ Δηθφλσλ 60 θαη 61, φπνπ ε CTNNB1 κπνξεί θαη πξνζδέλεηαη κε δηαθνξεηηθέο πεξηνρέο ηνπ κνξίνπ ηεο ζηηο πξσηεΐλεο HDAC1 θαη CREBBP, θαη ηνληζζεί φηη ε δεχηεξε απνηειεί πξσηεΐλε κε δξάζε αθεηπινκεηαθνξάζεο (188) κπνξεί λα ππνηεζεί πσο ε πξσηεΐλε πνπ πξνζδέλεηαη ζην ζχκπινθν CTNNB1/LEF1 θαη επάγεη ηε κεηαγξαθή είλαη ε CREBBP. H CREBBP φκσο κε ηε ζεηξά ηεο ζπγθξνηεί ζχκπινθν κε ηνπο παξάγνληεο ΖΝF1 θαη NGN3, νπφηε φινη απηνί νη παξάγνληεο ζπλεπηθνπξνχλ ζηελ επαγσγή ζπγθεθξηκέλσλ γνληδίσλ. Φαίλεηαη ινηπφλ πσο ν γεληθφο κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο CTNNB1 κπνξεί λα ζπκκεηέρεη άιινηε ζε ζχκπινθα πνπ επάγνπλ ηε κεηαγξαθή θαη άιινηε ζε ζχκπινθα πνπ ηελ θαηαζηέιινπλ φπσο απηφ ηεο Δηθφλαο 61. Αμίδεη ηέινο λα αλαθεξζεί πσο, ελψ ε πξφζδεζε ηεο CTNNB1 ζηελ HDAC1 ήηαλ ήδε γλσζηή απφ πξνεγνχκελεο εξγαζίεο (201), νη αθξηβείο πεξηνρέο ησλ κνξίσλ πνπ αιιειεπηδξνχλ ππνδεηθλχνληαη γηα πξψηε θνξά ζηελ παξνχζα δηαηξηβή. Δπηπιένλ, παξάγνληεο 158

159 φπσο ν PDX1, γηα ηνλ νπνίν βξέζεθαλ πξφηππα πξφζδεζεο ζηα γνλίδηα ηεο παξνχζαο εξγαζίαο, ζπλδένληαη κε ηελ πξσηεΐλε LEF1 ειέγρνληαο πηζαλφηεηα ηε δξάζε ηεο σο ξπζκηζηή ηεο κεηαγξαθήο. Δπίζεο είλαη πηζαλφ νη κεηαγξαθηθνί παξάγνληεο πνπ ζπκκεηέρνπλ ζην ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν ηεο Δηθφλαο 54 λα ζρεκαηίδνπλ κεηαμχ ηνπο ππεξκνξηαθά ζχκπινθα κε πεξηζζφηεξα κέιε απφ απηά πνπ ππνδεηθλχνληαη ζηηο Δηθφλεο Μπνξεί, δειαδή, λα ζρεκαηίδεηαη ελδερνκέλσο ζχκπινθν πνπ λα πεξηιακβάλεη ηνπο παξάγνληεο HDAC1-LEF1- AP4-PDX1 ή κπνξεί ζην ζχκπινθν ηεο Δηθφλαο 60 λα πξνζδέλνληαη επηπιένλ νη παξάγνληεο HNF6 θαη FOXA2. H έιιεηςε ηξηζδηάζηαησλ θξπζηαιιηθψλ δνκψλ γηα φινπο ηνπο πξναλαθεξζέληεο παξάγνληεο ζε φιν ηνπο ην εχξνο θαζηζηά αδχλαηε ηε δηεξεχλεζε ζρεκαηηζκνχ ηέηνησλ ζπκπιφθσλ. Σέινο, ν πξνζδηνξηζκφο ηεο δηεπζέηεζεο ζηνλ ρψξν ππεξκνξηαθψλ ζπκπιφθσλ κε πνιιά κέιε κε ηε κέζνδν πνπ πεξηγξάθεθε πξνζζέηεη κεγάιν βαζκφ αβεβαηφηεηαο ζηα απνηειέζκαηα θαη ζπλεπψο κεηψλεη ηελ αμηνπηζηία ηνπο γη απηφ θαη δελ παξνπζηάζζεθαλ. 159

160 5 ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ ηελ παξνχζα εξγαζία έγηλε αλάιπζε επηιεγκέλσλ γνληδίσλ πνπ απνηεινχλ γλσζηνχο θαη πηζαλνχο ζηφρνπο ηνπ NGN3 (62, 75, 147, 162, 167). Μέζα απφ ηελ αλάιπζε ησλ ξπζκηζηηθψλ ηνπο πεξηνρψλ πξνέθπςε κηα πεξηνρή πνπ πεξηιάκβαλε ζέζεηο πξφζδεζεο γηα έμη κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο. Οη παξάγνληεο απηνί αλήθνπλ ζηηο νηθνγέλεηεο NEUR, PDX1, HNF1, HNF6, BRNF θαη LEFF θαη εκπιέθνληαη ζηηο εκβξπνγελεηηθέο δηαδηθαζίεο δηαθνξνπνίεζεο ησλ θπηηάξσλ ηεο ελδνθξηλνχο κνίξαο ηνπ παγθξέαηνο (58, 75, 136, 139, 141, 142, 143, 159). Παξά ηε δηαθνξεηηθή ζεηξά εκθάληζεο ησλ ζέζεσλ πξφζδεζεο απηψλ ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ, ε ξπζκηζηηθή απηή πεξηνρή βξέζεθε ζπληεξεκέλε ζε δέθα ηνπιάρηζηνλ νξζφινγα, απφ θάζε γνλίδην πνπ κειεηήζεθε, ζην εχξνο ηεο εμειηθηηθήο δηαδξνκήο ςάξηα-ζειαζηηθά. Ζ ζπληήξεζε ηεο ζπγθεθξηκέλεο πεξηνρήο αθφκε θαη ζηα πην απνκαθξπζκέλα θπινγελεηηθά είδε πνπ δηαζέηνπλ πάγθξεαο (ςάξηα), ππνδεηθλχεη ηε ιεηηνπξγηθή ηεο ζεκαζία σο ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν απηψλ ησλ γνληδίσλ θαη γεληθφηεξα ηε ζπκκεηνρή ησλ γνληδίσλ απηψλ ζηε δηαδηθαζία ζρεκαηηζκνχ ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ νξγάλνπ. Σν ηειεπηαίν ζπκπέξαζκα ελδπλακψλεηαη θαη απφ ηελ απνπζία απηνχ ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ απφ γνλίδηα ησλ νπνίσλ ε έθθξαζε δελ είλαη ζπλπθαζκέλε κε ηε δηαθνξνπνίεζε ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο, είηε πξφθεηηαη γηα ζπλερψο εθθξαδφκελα (B-ACTIN), είηε γηα κε εθθξαδφκελα ζην ζπγθεθξηκέλν αλαπηπμηαθφ ζηάδην (HBB1) γνλίδηα. Αληίζεηα ε ζπγθεθξηκέλε ξπζκηζηηθή πεξηνρή εληνπίζηεθε ζε γνλίδηα πνπ ζπξξπζκίδνληαη θάησ απφ δεδνκέλεο πεηξακαηηθέο ζπλζήθεο (62, 154), φπσο επίζεο θαη ζε ζπγθεθξηκέλα WNT5 γνλίδηα θαη φρη ζε φια (154). πλδπάδνληαο δε ηα δεδνκέλα άιισλ εξγαζηψλ γηα ηα γνλίδηα WNT5A θαη WNT5B απφ ηνλ πνληηθφ θαη ηνλ νζηετρζχ Zebrafish (162, 167) κε ην γεγνλφο ηεο επηιεθηηθήο παξνπζίαο ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ ζε απηά θαη φρη ζηα παξάινγά ηνπο (154) κπνξεί λα ππνδεηρζεί ε ζεκαζία ηνπ ελ ιφγσ ζηνηρείνπ ζηελ θαηάιιειε ξχζκηζε απηψλ ησλ γνληδίσλ ψζηε λα ζρεκαηηζηεί ζσζηά ην πάγθξεαο ζην έκβξπν. Πξνζζέηνληαο ζην ππφβαζξν θαη πεηξακαηηθά δεδνκέλα πνπ ππνδείθλπαλ κφλν ην WNT5A λα ξπζκίδεηαη απφ ηνλ NGN3 (62) κπνξεί λα ππνηεζεί ε χπαξμε ελφο επξχηεξνπ ξπζκηζηηθνχ δηθηχνπ πνπ θαζνδεγείηαη απφ ηνλ ηειεπηαίν παξάγνληα ζην νπνίν 160

161 ζπκκεηέρνπλ θαη άιινη κεηαγξαθηθνί ξπζκηζηέο πνπ βξέζεθαλ λα πξνζδέλνπλ ζηελ ζπληεξεκέλε πεξηνρή. Γεδνκέλνπ φηη ε ξπζκηζηηθή απηή αθνινπζία εληνπίζηεθε αξθεηά καθξηά απφ ην TSS ζηελ πιεηνςεθία ησλ νξζνιφγσλ πνπ αλαιχζεθαλ, εθηηκάηαη πσο πξφθεηηαη γηα αθνινπζία κε ξφιν εληζρπηή ησλ γνληδίσλ απηψλ (176). Σν ηειεπηαίν ζπκπέξαζκα ελδπλακψλεηαη θαη απφ ηε κηθξή πεξηεθηηθφηεηα ηεο πεξηνρήο απηήο ζε GC λνπθιενηίδηα, θάηη πνπ δελ ηζρχεη γεληθφηεξα γηα ηνπο ππνθηλεηέο (79). Γηαπηζηψζεθε ινηπφλ ε ζηαζεξή αλεχξεζε κηαο ξπζκηζηηθήο πεξηνρήο ζε έλα ζχλνιν ζπξξπζκηδφκελσλ (επαγφκελσλ ή θαηαζηειιφκελσλ) γνληδίσλ κε θχξην ξπζκηζηή ηνλ παξάγνληα NGN3 (62). Τπήξμε, σζηφζν, θαη έλα ζεκείν δηαθνξνπνίεζεο ησλ ξπζκηζηηθψλ πεξηνρψλ ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ αλάκεζα ζηα επαγφκελα θαη ηα θαηαζηειιφκελα γνλίδηα. Πην ζπγθεθξηκέλα, ηα δεχηεξα έθεξαλ ζηε ζπληεξεκέλε ξπζκηζηηθή πεξηνρή ηνπο επηπιένλ πξφηππα πξφζδεζεο θαη γηα ηνλ παξάγνληα AP4. Αλ απηφ ην απνηέιεζκα ζπλδπαζηεί κε ηα δεδνκέλα πξνεγνχκελσλ εξγαζηψλ πνπ θαηαδεηθλχνπλ ηα πξφηππα πξφζδεζεο ηνπ AP4 δηαηεξεκέλα κφλν ζε γνλίδηα πνπ ζρεηίδνληαη κε ην πάγθξεαο (157, 158) θαη κάιηζηα κέζα ζε κηα αιιεινπρία κε ξφιν εληζρπηή κπνξεί λα δηαπηζησζεί ε ιεηηνπξγηθή ζεκαζία ηεο πξφζδεζεο ηνπ ζπγθεθξηκέλνπ παξάγνληα ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ θαηαζηειιφκελσλ γνληδίσλ. Δμάγεηαη, ινηπφλ, ην ζπκπέξαζκα πσο ε επηιεθηηθή πξφζδεζε ηνπ AP4 ζην ζχκπινθν ησλ παξαγφλησλ NGN3-PDX1-HNF1-HNF6-BRN4-LEF1, πνπ πξνζδέλνληαη ζηε ξπζκηζηηθή πεξηνρή, κπνξεί λα κεηαβάιιεη ηε ιεηηνπξγία ηεο ζε θαηαζηνιέα επηιεγκέλσλ γνληδίσλ. Πξαγκαηηθά, αλαδεηψληαο ζπκπιέγκαηα ζέζεσλ πξφζδεζεο γηα φινπο ηνπο παξαπάλσ παξάγνληεο ζηηο αιιεινπρίεο ελφο πιήξνπο γνληδηψκαηνο θάλεθε πσο ππήξραλ ζχκπινθα δχν εηδψλ, απηά φπνπ απνπζίαδε ν AP4 θαη απηά πνπ ηνλ ζπκπεξηιάκβαλαλ. Σα δεχηεξα παξνπζηάδνληαλ πνιχ ιηγφηεξν ζπρλά κέζα ζην γνληδίσκα θαη επνκέλσο ν εληνπηζκφο ηνπο θξίζεθε πεξηζζφηεξν ελδηαθέξσλ. Έηζη ελψ απνδείρζεθε κε ζηαηηζηηθή αλάιπζε πσο θαη ηα δχν ζχκπινθα δελ εληνπίζηεθαλ ηπραία ζηηο ξπζκηζηηθέο αθνινπζίεο ησλ γνληδίσλ ζηφρσλ ηνπ NGN3, ε παξνπζία ηνπ AP4 θαίλεηαη πσο ζπλδπαδφηαλ επηιεθηηθά κε γνλίδηα πνπ ζηηο ζπγθεθξηκέλεο ζπλζήθεο (62) θαηαζηέιινληαλ απφ ηνλ NGN3. Με απηά ηα δεδνκέλα κπνξεί λα ππνζηεξηρζεί ε ππφζεζε πσο ζην ζχλνιν ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ εληνπίζηεθε έλα ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν κε ξφιν εληζρπηή, ην νπνίν ζε πεξίπησζε πνπ θέξεη, επηπιένλ, αιιεινπρία πξφζδεζεο γηα ηνλ παξάγνληα AP4 απνηειεί 161

162 πηζαλφηαηα έλαλ επηιεθηηθά εκθαληδφκελν ζε ζπγθεθξηκέλα γνλίδηα θαηαζηνιέα. Απηφ ην ηειεπηαίν πξνέθπςε θαη κέζα απφ ηελ αλάιπζε ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ ησλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ. Πξάγκαηη, παξφηη νη ηειεπηαίεο εκθάληδαλ κεγάιε εηεξνγέλεηα, ζηα ξπζκηζηηθά ζηνηρεία ησλ θαηαζηειιφκελσλ απφ ηνλ NGN3 γνληδίσλ εκθαλίδνληαλ επηιεθηηθά ηα πξφηππα πξφζδεζεο ηνπ παξάγνληα AP4. Οη δηαθνξέο σζηφζν ησλ πεξηνρψλ απηψλ ζε επίπεδν λνπθιενηηδηθήο αιιεινπρίαο κπνξεί λα απνδνζνχλ ζηηο ελαιιαθηηθέο αιιεινπρίεο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ NEUR, PDX1, HNF1, HNF6, BRN4 θαη LEF1 αιιά θαη ζηνπο ελαιιαθηηθνχο ζπλδπαζκνχο ηνπο κε δηαθνξεηηθή ζεηξά εκθάληζεο. Δπηπξνζζέησο, ε ζπλεμέηαζε ησλ επηπέδσλ GC ησλ γνληδίσλ πνπ αλαιχζεθαλ απνηέιεζε εληζρπηηθφ ζηνηρείν ηεο ζπκκεηνρήο ηνπο ζε αλαπηπμηαθέο δηαδηθαζίεο θαζψο βξέζεθαλ λα αλήθνπλ ζε ηζφρσξεο ρακεινχ επηπέδνπ GC (185). Ζ επηπιένλ πηψζε ησλ επηπέδσλ GC ζηηο πεξηνρέο ησλ ξπζκηζηηθψλ ζηνηρείσλ ησλ γνληδίσλ ζπλάδεη κε ην γεληθφηεξν GC πξνθίι ησλ αιιεινπρηψλ ελφο γνληδηψκαηνο κε ξπζκηζηηθφ ξφιν θαηά ηελ εκβξπνγέλεζε (186). Τπνδειψζεθε έηζη ε ιεηηνπξγηθή αμία ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζπκπιφθνπ, ε νπνία θαη νδήγεζε ζηελ εμειηθηηθή ζπληήξεζε ηνπ. Με δεδνκέλε ηε ζπκκεηνρή ησλ γνληδίσλ πνπ κειεηήζεθαλ ζε έλα ξπζκηζηηθφ δίθηπν, πνπ θαζνδεγεί ν NGN3, δηεξεπλήζεθε ην επξχηεξν δίθηπν αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ησλ γνληδίσλ-ζηφρσλ ηνπ NGN3 αιιά θαη ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ νη νπνίνη, βξέζεθε φηη πξνζδέλνληαη ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ηνπο. Φαίλεηαη, ινηπφλ, πσο oη πξσηεΐλεο ησλ έμη νηθνγελεηψλ (NEUR, PDX1, HNF1, HNF6, BRNF θαη LEFF) πνπ πξνζδέλνληαη ζηηο πεξηνρέο απηέο ζπλεξγάδνληαη κε γεληθνχο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο φπσο είλαη νη HDAC1, CREBBP θαη CTNNB1 πξνθεηκέλνπ λα ζπγθξνηήζνπλ έλα ελαιιαθηηθφ ξπζκηζηηθφ ζχκπινθν πνπ επηιεθηηθά άιινηε επάγεη θαη άιινηε θαηαζηέιιεη ηε κεηαγξαθή. πλεθηηκψληαο ηα απνηειέζκαηα ηεο αλάιπζεο ησλ δνκηθψλ αιιειεπηδξάζεσλ κεηαμχ ησλ πξσηετλψλ απηψλ κπνξεί λα δνζεί πεξηζζφηεξν βάξνο ζηηο πξσηεΐλεο HDAC1 θαη CREBBP, πνπ εθδειψλνληαο δξάζε απναθεηπιάζεο θαη αθεηπινκεηαθνξάζεο αληίζηνηρα ειέγρνπλ ηα επίπεδα αθεηπιίσζεο ησλ ηζηνλψλ θαη ξπζκίδνπλ έηζη ηε κεηαγξαθηθή ελεξγφηεηα ησλ πεξηνρψλ φπνπ πξνζδέλνληαη. Όπσο θαηέδεημε ε δηεξεχλεζε ησλ αιιειεπηδξάζεσλ ηνπο κε ηνπο ππφινηπνπο κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο πνπ κπνξνχλ λα πξνζδεζνχλ ζην ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν, ε CREBBP ζπγθξνηεί ζχκπινθν κε ηνλ NGN3, ηνλ HNF1 θαη ηνλ 162

163 CTNNB1 απμάλνληαο ηα επίπεδα αθεηπιίσζεο ηεο ρξσκαηίλεο θαη επάγνληαο έηζη ηε κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπγθεθξηκέλν ζχκπινθν. ην ζχκπινθν απηφ ελδέρεηαη λα πξνζδέλνληαη θαη νη παξάγνληεο HNF6 θαη FOXA2, κηα ππφζεζε πνπ δελ έγηλε δπλαηφ λα δηεξεπλεζεί, θαζψο νη δχν ηειεπηαίνη παξάγνληεο δελ έρνπλ θξπζηαιισζεί ζε φιν ηνπο ην εχξνο. Ο CTNNB1 επηπιένλ κπνξεί λα πξνζδεζεί ζηνλ παξάγνληα LEF1, νπφηε πξνθχπηεη έλα δηκεξέο πνπ έρεη ζπλδπαζηεί γεληθφηεξα κε ηελ επαγσγή ηεο κεηαγξαθήο ησλ γνληδίσλ πνπ εμαξηψληαη απφ ηνλ LEF1. Ζ πξφζδεζε φκσο ηνπ ηειεπηαίνπ γίλεηαη θαη απφ ηελ απναθεηπιάζε HDAC1, ε νπνία φηαλ ζπλδέεηαη κε ηνλ LEF1 θαηαζηέιιεη ηε κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ πνπ ξπζκίδνληαη απ' απηφλ. Ο παξάγνληαο LEF1 επνκέλσο, πνπ βξέζεθε λα πξνζδέλεηαη ζε φια ηα γνλίδηα πνπ αλαιχζεθαλ θαζψο θαη ζε κηα πιεηάδα ζέζεσλ κέζα ζε φιν ην γνληδίσκα ηνπ πνληηθνχ, κπνξεί λα ζπγθξνηήζεη ελαιιαθηηθά ξπζκηζηηθά ζχκπινθα πνπ άιινηε επάγνπλ θαη άιινηε θαηαζηέιινπλ ηε κεηαγξαθή ησλ γνληδίσλ πνπ ν ζπγθεθξηκέλνο παξάγνληαο ειέγρεη (201). Έλα πηζαλφ ζχκπινθν επαγσγήο ηεο κεηαγξαθήο ησλ γνληδίσλ απηψλ πξνθχπηεη κέζα απφ ηελ αιιειεπίδξαζή ηνπ LEF1 κε ηνπο παξάγνληεο HNF1, NGN3, CTNNB1 θαη CREBBP. Αμίδεη εδψ λα ηνληζζεί ε δξάζε ησλ γεληθψλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ CTNNB1 θαη CREBBP φπνπ ν πξψηνο δξα θπξίσο σο δηαζπλδέηεο πξσηετλψλ ζην ζχκπινθν πνπ πξναλαθέξζεθε, ελψ ν δεχηεξνο ειέγρεη επηπιένλ θαη ηα επίπεδα αθεηπιίσζεο ηεο ρξσκαηίλεο άξα θαη ηε κεηαγξαθηθή ελεξγφηεηα ησλ ζρεηηθψλ πεξηνρψλ (188). Δπηπξνζζέησο, ν παξάγνληαο LEF1 βξέζεθε λα αιιειεπηδξά θαη κε ηνλ PDX1, γεγνλφο πνπ δηθαηνινγεί ηνλ ζπλεληνπηζκφ ησλ πξνηχπσλ πξφζδεζεο ησλ δχν πξσηετλψλ ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ πνπ εμεηάζηεθαλ. Αλ, απφ ηελ άιιε πιεπξά, ε LEF1 πξνζδεζεί ζηελ απναθεηπιάζε HDAC1 ηα επίπεδα αθεηπιίσζεο ησλ ηζηνλψλ κεηψλνληαη νπφηε θαη ε ρξσκαηίλε κεηαβαίλεη ζε κηα πην ζπκπαγή κνξθή θαη ε κεηαγξαθή θαηαζηέιιεηαη. Tελ πξφζδεζε ηνπ HDAC1 επηιεθηηθά ζηνλ LEF1 ψζηε λα ξπζκίζεη ηα γνλίδηα πνπ πξέπεη λα θαηαζηαινχλ ίζσο λα θαηεπζχλεη ν παξάγνληαο ΑP4 πνπ βξίζθεηαη ήδε ζηηο ξπζκηζηηθέο πεξηνρέο ησλ γνληδίσλ απηψλ θαη απνπζηάδεη απφ ηα γνλίδηα πνπ επάγνληαη. Ζ απφδνζε ζηνλ ΑP4 ξφιν ζπγθαηαζηνιέα ππνζηεξίδεηαη θαη απφ ην γεγνλφο φηη ν παξάγνληαο απηφο ζπγθξνηεί ζχκπινθν κε ηνλ LEF1 (Δηθφλα 62). 163

164 ε θάζε πεξίπησζε κε ηελ επηιεθηηθή επαγσγή ζπγθεθξηκέλσλ γνληδίσλ θαη ηελ θαηαζηνιή άιισλ ηα θχηηαξα δηαθνξνπνηνχληαη ζηαδηαθά πξνο ελδφδεξκα. έλα επφκελν ζηάδην δηαθνξνπνίεζεο αξρίδνπλ λα απνθηνχλ πεξηζζφηεξν ηα ραξαθηεξηζηηθά ησλ πξφδξνκσλ ελδνθξηλψλ θπηηάξσλ ηνπ παγθξέαηνο έσο φηνπ ηειηθά δηαθνξνπνηεζνχλ πξνο ηλζνπιηλνπαξαγσγά θχηηαξα. ηα πξψηκα ζηάδηα δηαθνξνπνίεζεο ηνπο ηα ελδνθξηλή παγθξεαηηθά θχηηαξα ζπλδπάδνπλ ηελ ηθαλφηεηα παξαγσγήο ηλζνπιίλεο κε ηελ ηθαλφηεηα παξαγσγήο γιπθαγφλεο, θαζψο νη δχν νξκφλεο ζπλεθθξάδνληαη (13). ηε ζπλέρεηα, φκσο, θαη θαζψο ε δηαθνξνπνίεζή ηνπο πξνρσξά δηαηεξνχλ ηελ ηθαλφηεηα παξαγσγήο κφλν ηεο πξψηεο νξκφλεο. Σα γνλίδηα πνπ βξίζθνληαη θάησ απφ ηνλ θαζνδεγεηηθφ ξφιν ησλ παξαγφλησλ πνπ πξναλαθέξζεθαλ κε απαξρή ηνλ NGN3 ξπζκίδνπλ κηα ζεηξά απφ ελδνθπηηαξηθέο αιιαγέο ζηηο νπνίεο ζπκκεηέρνπλ άιινηε ζπλαγσληζηηθά θαη άιινηε αληαγσληζηηθά δηάθνξα επηκέξνπο κνλνπάηηα κε θπξηφηεξα ην θαλνληθφ θαη ηα κε θαλνληθά κνλνπάηηα πνπ θαζνδεγνχλ νη WNT πξσηεΐλεο. Σα ηειεπηαία απνηεινχλ γλσζηνχο ξπζκηζηέο ηνπ ζρεκαηηζκνχ ηνπ παγθξέαηνο θαηά ηελ δηάξθεηα ηεο νξγαλνγέλεζεο ζην πξψηκν έκβξπν (146). ηα κνλνπάηηα απηά, εμάιινπ, εκπιέθεηαη θαη ν παξάγνληαο LEF1 ζην ξφιν ηνπ νπνίνπ έγηλε εθηελήο αλαθνξά. 164

165 6 ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ 1. Carroll, S. B., Grenier, J. K., and Weatherbee, S. D From DNA to Diversity: Molecular Genetics and the Evolution of Animal Design. Boston, MA: Blackwell Science. 2. Davidson, E. H Genomic Regulatory Systems (1st ed.). San Diego: Academic. 3. Halfon, M. S., and A. M. Michelson Exploring genetic regulatory networks in metazoan development: methods and models. Physiol Genomics 10: Kleinjan, D. A., and V. van Heyningen Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. Am J Hum Genet 76: Davidson, E. H The regulatory genome: Gene regulatory networks in development and evolution. Academic Press, San Diego. 6. Ureta-Vidal, A., Ettwiller, L. and E. Birney Comparative genomics: genome-wide analysis in metazoan eukaryotes, Nat Rev Genet 4: Wasserman, W. W., M. Palumbo, W. Thompson, J. W. Fickett, and C. E. Lawrence Human-mouse genome comparisons to locate regulatory sites. Nat Genet 26: Nobrega, M. A., and L. A. Pennacchio Comparative genomic analysis as a tool for biological discovery. J Physiol 554: Thomas, J. W., J. W. Touchman, R. W. Blakesley, G. G. Bouffard, S. M. Beckstrom-Sternberg, E. H. Margulies, M. Blanchette, A. C. Siepel, P. J. Thomas, J. C. McDowell, B. Maskeri, N. F. Hansen, M. S. Schwartz, R. J. Weber, W. J. Kent, D. Karolchik, T. C. Bruen, R. Bevan, D. J. Cutler, S. Schwartz, L. Elnitski, J. R. Idol, A. B. Prasad, S. Q. Lee-Lin, V. V. Maduro, T. J. Summers, M. E. Portnoy, N. L. Dietrich, N. Akhter, K. Ayele, B. Benjamin, K. Cariaga, C. P. Brinkley, S. Y. Brooks, S. Granite, X. Guan, J. Gupta, P. Haghighi, S. L. Ho, M. C. Huang, E. Karlins, P. L. Laric, R. Legaspi, M. J. Lim, Q. L. Maduro, C. A. Masiello, S. D. Mastrian, J. C. McCloskey, R. Pearson, S. Stantripop, E. E. Tiongson, J. T. Tran, C. Tsurgeon, J. L. Vogt, M. A. Walker, K. D. Wetherby, L. S. Wiggins, A. C. Young, L. H. Zhang, K. Osoegawa, B. Zhu, B. Zhao, C. L. Shu, P. J. De Jong, C. E. Lawrence, A. F. Smit, A. 165

166 Chakravarti, D. Haussler, P. Green, W. Miller, and E. D. Green Comparative analyses of multi-species sequences from targeted genomic regions. Nature 424: Liu, Y., X. S. Liu, L. Wei, R. B. Altman, and S. Batzoglou Eukaryotic regulatory element conservation analysis and identification using comparative genomics. Genome Res 14: Xie, X., J. Lu, E. J. Kulbokas, T. R. Golub, V. Mootha, K. Lindblad-Toh, E. S. Lander, and M. Kellis Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3' UTRs by comparison of several mammals. Nature 434: Boffelli, D., J. McAuliffe, D. Ovcharenko, K. D. Lewis, I. Ovcharenko, L. Pachter, and E. M. Rubin Phylogenetic shadowing of primate sequences to find functional regions of the human genome. Science 299: Slack, J. M Developmental biology of the pancreas. Development 121: Heller, R. S., M. Jenny, P. Collombat, A. Mansouri, C. Tomasetto, O. D. Madsen, G. Mellitzer, G. Gradwohl, and P. Serup Genetic determinants of pancreatic epsilon-cell development. Dev Biol 286: Prado, C. L., A. E. Pugh-Bernard, L. Elghazi, B. Sosa-Pineda, and L. Sussel Ghrelin cells replace insulin-producing beta cells in two mouse models of pancreas development. Proc Natl Acad Sci U S A 101: Wierup, N., H. Svensson, H. Mulder, and F. Sundler The ghrelin cell: a novel developmentally regulated islet cell in the human pancreas. Regul Pept 107: Falkmer, S Comparative morphology of pancreatic islets in animals. In The Diabetic Pancreas 2nd edition. (ed. Volk, B. W. and Arquilla, E. R.), pp New York: Plenum. 18. Elliott, W. M., and J. H. Youson Development of the adult endocrine pancreas during metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. II. Electron microscopy and immunocytochemistry. Anat Rec 237: Plisetskaya, E. M., H. G. Pollock, W. M. Elliott, J. H. Youson, and P. C. Andrews Isolation and structure of lamprey (Petromyzon marinus) insulin. Gen Comp Endocrinol 69:

167 20. Brogiolo, W., H. Stocker, T. Ikeya, F. Rintelen, R. Fernandez, and E. Hafen An evolutionarily conserved function of the Drosophila insulin receptor and insulin-like peptides in growth control. Curr Biol 11: Ikeya, T., M. Galic, P. Belawat, K. Nairz, and E. Hafen Nutrientdependent expression of insulin-like peptides from neuroendocrine cells in the CNS contributes to growth regulation in Drosophila. Curr Biol 12: Li, W., S. G. Kennedy, and G. Ruvkun daf-28 encodes a C. elegans insulin superfamily member that is regulated by environmental cues and acts in the DAF-2 signaling pathway. Genes Dev 17: Karpac, J., J. Hull-Thompson, M. Falleur, and H. Jasper JNK signaling in insulin-producing cells is required for adaptive responses to stress in Drosophila. Aging Cell 8: Kim, J., H. Bang, S. Ko, I. Jung, H. Hong, and J. Kim-Ha Drosophila ia2 modulates secretion of insulin-like peptide. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 151: Delsuc, F., H. Brinkmann, D. Chourrout, and H. Philippe Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature 439: Sherwood, N. M., J. A. Tello, and G. J. Roch Neuroendocrinology of protochordates: insights from Ciona genomics. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 144: Reinecke, M., D. Betzler, K. Drakenberg, S. Falkmer, and V. R. Sara Occurrence of members of the insulin superfamily in central nervous system and digestive tract of protochordates. Histochemistry 99: Carlson, B. M Human embryology and developmental biology. St. Louis: Mosby. pp Spooner, B. S., B. T. Walther, and W. J. Rutter The development of the dorsal and ventral mammalian pancreas in vivo and in vitro. J Cell Biol 47: Habener, J. F A perspective on pancreatic stem/progenitor cells. Pediatr Diabetes 5 Suppl 2: Duvillie, B., M. Attali, A. Bounacer, P. Ravassard, A. Basmaciogullari, and R. Scharfmann The mesenchyme controls the timing of pancreatic beta-cell differentiation. Diabetes 55:

168 32. Wells, J. M., and D. A. Melton Vertebrate endoderm development. Annu Rev Cell Dev Biol 15: Lokmane, L., C. Haumaitre, P. Garcia-Villalba, I. Anselme, S. Schneider- Maunoury, and S. Cereghini Crucial role of vhnf1 in vertebrate hepatic specification. Development 135: Kumar, M., and D. Melton Pancreas specification: a budding question. Curr Opin Genet Dev 13: Hebrok, M., S. K. Kim, and D. A. Melton Notochord repression of endodermal Sonic hedgehog permits pancreas development. Genes Dev 12: McLin, V. A., S. A. Rankin, and A. M. Zorn Repression of Wnt/betacatenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and pancreas development. Development 134: Stafford, D., R. J. White, M. D. Kinkel, A. Linville, T. F. Schilling, and V. E. Prince Retinoids signal directly to zebrafish endoderm to specify insulinexpressing beta-cells. Development 133: Lammert, E., O. Cleaver, and D. Melton Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science 294: Gu, G., J. Dubauskaite, and D. A. Melton Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development 129: Afelik, S., Y. Chen, and T. Pieler Combined ectopic expression of Pdx1 and Ptf1a/p48 results in the stable conversion of posterior endoderm into endocrine and exocrine pancreatic tissue. Genes Dev 20: Asayesh, A., J. Sharpe, R. P. Watson, J. Hecksher-Sorensen, N. D. Hastie, R. E. Hill, and U. Ahlgren Spleen versus pancreas: strict control of organ interrelationship revealed by analyses of Bapx1-/- mice. Genes Dev 20: Gittes, G. K Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol 326: Swift, G. H., Y. Liu, S. D. Rose, L. J. Bischof, S. Steelman, A. M. Buchberg, C. V. Wright, and R. J. MacDonald An endocrine-exocrine switch in the activity of the pancreatic homeodomain protein PDX1 through formation of a trimeric complex with PBX1b and MRG1 (MEIS2). Mol Cell Biol 18:

169 44. Peers, B., S. Sharma, T. Johnson, M. Kamps, and M. Montminy The pancreatic islet factor STF-1 binds cooperatively with Pbx to a regulatory element in the somatostatin promoter: importance of the FPWMK motif and of the homeodomain. Mol Cell Biol 15: Thomas, M. K., J. H. Lee, N. Rastalsky, and J. F. Habener Hedgehog signaling regulation of homeodomain protein islet duodenum homeobox-1 expression in pancreatic beta-cells. Endocrinology 142: Ahlgren, U., J. Jonsson, L. Jonsson, K. Simu, and H. Edlund beta-cellspecific inactivation of the mouse Ipf1/Pdx1 gene results in loss of the beta-cell phenotype and maturity onset diabetes. Genes Dev 12: Ahlgren, U., S. L. Pfaff, T. M. Jessell, T. Edlund, and H. Edlund Independent requirement for ISL1 in formation of pancreatic mesenchyme and islet cells. Nature 385: Apelqvist, A., H. Li, L. Sommer, P. Beatus, D. J. Anderson, T. Honjo, M. Hrabe de Angelis, U. Lendahl, and H. Edlund Notch signalling controls pancreatic cell differentiation. Nature 400: Gradwohl, G., A. Dierich, M. LeMeur, and F. Guillemot neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A 97: Schwitzgebel, V. M., D. W. Scheel, J. R. Conners, J. Kalamaras, J. E. Lee, D. J. Anderson, L. Sussel, J. D. Johnson, and M. S. German Expression of neurogenin3 reveals an islet cell precursor population in the pancreas. Development 127: Schwitzgebel, V. M Programming of the pancreas. Mol Cell Endocrinol 185: Huang, H. P., M. Liu, H. M. El-Hodiri, K. Chu, M. Jamrich, and M. J. Tsai Regulation of the pancreatic islet-specific gene BETA2 (neurod) by neurogenin 3. Mol Cell Biol 20: MacFarlane, W. M., M. L. Read, M. Gilligan, I. Bujalska, and K. Docherty Glucose modulates the binding activity of the beta-cell transcription factor IUF1 in a phosphorylation-dependent manner. Biochem J 303 (Pt 2): Marshak, S., H. Totary, E. Cerasi, and D. Melloul Purification of the betacell glucose-sensitive factor that transactivates the insulin gene differentially in normal and transformed islet cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93:

170 55. Maestro, M. A., S. F. Boj, R. F. Luco, C. E. Pierreux, J. Cabedo, J. M. Servitja, M. S. German, G. G. Rousseau, F. P. Lemaigre, and J. Ferrer Hnf6 and Tcf2 (MODY5) are linked in a gene network operating in a precursor cell domain of the embryonic pancreas. Hum Mol Genet 12: Hussain, M. A., J. Lee, C. P. Miller, and J. F. Habener POU domain transcription factor brain 4 confers pancreatic alpha-cell-specific expression of the proglucagon gene through interaction with a novel proximal promoter G1 element. Mol Cell Biol 17: Jensen, J., R. S. Heller, T. Funder-Nielsen, E. E. Pedersen, C. Lindsell, G. Weinmaster, O. D. Madsen, and P. Serup Independent development of pancreatic alpha- and beta-cells from neurogenin3-expressing precursors: a role for the notch pathway in repression of premature differentiation. Diabetes 49: Heller, R. S., D. A. Stoffers, A. Liu, A. Schedl, E. B. Crenshaw, 3rd, O. D. Madsen, and P. Serup The role of Brn4/Pou3f4 and Pax6 in forming the pancreatic glucagon cell identity. Dev Biol 268: Prasadan, K., E. Daume, B. Preuett, T. Spilde, A. Bhatia, H. Kobayashi, M. Hembree, P. Manna, and G. K. Gittes Glucagon is required for early insulin-positive differentiation in the developing mouse pancreas. Diabetes 51: Grapin-Botton, A., A. R. Majithia, and D. A. Melton Key events of pancreas formation are triggered in gut endoderm by ectopic expression of pancreatic regulatory genes. Genes Dev 15: Joglekar, M. V., V. S. Parekh, S. Mehta, R. R. Bhonde, and A. A. Hardikar MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal posttranscriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol 311: Serafimidis, I., I. Rakatzi, V. Episkopou, M. Gouti, and A. Gavalas Novel effectors of directed and Ngn3-mediated differentiation of mouse embryonic stem cells into endocrine pancreas progenitors. Stem Cells 26: Keller, G Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev 19: Matzuk, M. M., T. R. Kumar, A. Vassalli, J. R. Bickenbach, D. R. Roop, R. Jaenisch, and A. Bradley Functional analysis of activins during mammalian development. Nature 374:

171 65. Dessimoz, J., R. Opoka, J. J. Kordich, A. Grapin-Botton, and J. M. Wells FGF signaling is necessary for establishing gut tube domains along the anterior-posterior axis in vivo. Mech Dev 123: Stafford, D., and V. E. Prince Retinoic acid signaling is required for a critical early step in zebrafish pancreatic development. Curr Biol 12: Martin, M., J. Gallego-Llamas, V. Ribes, M. Kedinger, K. Niederreither, P. Chambon, P. Dolle, and G. Gradwohl Dorsal pancreas agenesis in retinoic acid-deficient Raldh2 mutant mice. Dev Biol 284: Hebrok, M., S. K. Kim, and D. A. Melton Notochord repression of endodermal Sonic hedgehog permits pancreas development. Genes Dev 12: Hart, A., S. Papadopoulou, and H. Edlund Fgf10 maintains notch activation, stimulates proliferation, and blocks differentiation of pancreatic epithelial cells. Dev Dyn 228: Hua, H., Y. Q. Zhang, S. Dabernat, M. Kritzik, D. Dietz, L. Sterling, and N. Sarvetnick BMP4 regulates pancreatic progenitor cell expansion through Id2. J Biol Chem 281: Kawaguchi, Y., B. Cooper, M. Gannon, M. Ray, R. J. MacDonald, and C. V. Wright The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nat Genet 32: Mellitzer, G., S. Bonne, R. F. Luco, M. Van De Casteele, N. Lenne-Samuel, P. Collombat, A. Mansouri, J. Lee, M. Lan, D. Pipeleers, F. C. Nielsen, J. Ferrer, G. Gradwohl, and H. Heimberg IA1 is NGN3-dependent and essential for differentiation of the endocrine pancreas. EMBO J 25: Heremans, Y., M. Van De Casteele, P. in't Veld, G. Gradwohl, P. Serup, O. Madsen, D. Pipeleers, and H. Heimberg Recapitulation of embryonic neuroendocrine differentiation in adult human pancreatic duct cells expressing neurogenin 3. J Cell Biol 159: Breslin, M. B., M. Zhu, and M. S. Lan NeuroD1/E47 regulates the E-box element of a novel zinc finger transcription factor, IA-1, in developing nervous system. J Biol Chem 278: Servitja, J. M., and J. Ferrer Transcriptional networks controlling pancreatic development and beta cell function. Diabetologia 47:

172 76. Smith, S. B., H. C. Ee, J. R. Conners, and M. S. German Pairedhomeodomain transcription factor PAX4 acts as a transcriptional repressor in early pancreatic development. Mol Cell Biol 19: Watada, H Neurogenin 3 is a key transcription factor for differentiation of the endocrine pancreas. Endocr J 51: Naya, F. J., C. M. Stellrecht, and M. J. Tsai Tissue-specific regulation of the insulin gene by a novel basic helix-loop-helix transcription factor. Genes Dev 9: Κνζζίδα, Βηνπιεξνθνξηθή. Γπλαηφηεηεο θαη πξννπηηθέο. Ίδξπκα ηαηξνβηνινγηθψλ εξεπλψλ Αθαδεκίαο Αζελψλ. 80. Πακπαιάθεο, Γ Γηδαθηνξηθή δηαηξηβή. Πάλεπηζηήκην Παηξψλ. 81. Knudsen, S Promoter2.0: for the recognition of PolII promoter sequences. Bioinformatics 15: Prestridge, D. S Predicting Pol II promoter sequences using transcription factor binding sites. J Mol Biol 249: Rastegar, S., I. Hess, T. Dickmeis, J. C. Nicod, R. Ertzer, Y. Hadzhiev, W. G. Thies, G. Scherer, and U. Strahle The words of the regulatory code are arranged in a variable manner in highly conserved enhancers. Dev Biol 318: Arnosti, D. N., and M. M. Kulkarni Transcriptional enhancers: Intelligent enhanceosomes or flexible billboards? J Cell Biochem 94: Aparicio, S., A. Morrison, A. Gould, J. Gilthorpe, C. Chaudhuri, P. Rigby, R. Krumlauf, and S. Brenner Detecting conserved regulatory elements with the model genome of the Japanese puffer fish, Fugu rubripes. Proc Natl Acad Sci U S A 92: Elgar, G Identification and analysis of cis-regulatory elements in development using comparative genomics with the pufferfish, Fugu rubripes. Semin Cell Dev Biol 15: Hardison, R. C Conserved noncoding sequences are reliable guides to regulatory elements. Trends Genet 16: Bejerano, G., M. Pheasant, I. Makunin, S. Stephen, W. J. Kent, J. S. Mattick, and D. Haussler Ultraconserved elements in the human genome. Science 304:

173 89. Venkatesh, B., E. F. Kirkness, Y. H. Loh, A. L. Halpern, A. P. Lee, J. Johnson, N. Dandona, L. D. Viswanathan, A. Tay, J. C. Venter, R. L. Strausberg, and S. Brenner Ancient noncoding elements conserved in the human genome. Science 314: Ponting, C.P Genes and homology, Curr. Biol. 14:R Koonin, E. V Orthologs, paralogs, and evolutionary genomics. Annu Rev Genet 39: Fitch, W Systematic Zoology 19: Li, W.H. and D. Graur Fundamentals of Molecular Evolution. Ed. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., USA. 94. Υακφδξαθαο, Θέκαηα Μνξηαθήο Βηνθπζηθήο. Παλεπηζηήκην Αζελψλ. Αζήλα. 95. Halperin, I., B. Ma, H. Wolfson, and R. Nussinov Principles of docking: An overview of search algorithms and a guide to scoring functions. Proteins 47: Smith, G. R., and M. J. Sternberg Prediction of protein-protein interactions by docking methods. Curr Opin Struct Biol 12: Baldi, P and S. Brunek Bioinformatics: The Machine Learning Approach (Second Edition), USA, MIT Press. 98. Gibas, C and P. Jambeck Developing Bioinformatics Computer Skills, USA, O'Reilly & Associates. 99. Mac Vector: Genomatix Database: PDB: PFAM: 103: Expasy Prosite: 104: 105: NCBI DATABASE: 106: ENSEMBL DATABASE: 107: BLAST for SNPs: GeneCards V3 ( GEO database (Gene Expression Omnibus; 173

174 110. Ye, J., S. McGinnis, and T. L. Madden BLAST: improvements for better sequence analysis. Nucleic Acids Res 34:W Wall, D. P., H. B. Fraser, and A. E. Hirsh Detecting putative orthologs. Bioinformatics 19: Larkin, M. A., G. Blackshields, N. P. Brown, R. Chenna, P. A. McGettigan, H. McWilliam, F. Valentin, I. M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J. D. Thompson, T. J. Gibson, and D. G. Higgins Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23: Edgar, R. C MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics 5: Tippmann, H. F Analysis for free: comparing programs for sequence analysis. Brief Bioinform 5: Felsenstein J PHYLIP, Phylogeny Inference Package version Saitou, N., and M. Nei The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 4: Felsenstein J Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution, 39: Page, R. D TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appl Biosci 12: Kumar, S., M. Nei, J. Dudley, and K. Tamura MEGA: a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Brief Bioinform 9: ftp://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/mus_musculus/dna Macaya, G., J. P. Thiery, and G. Bernardi An approach to the organization of eukaryotic genomes at a macromolecular level. J Mol Biol 108: Costantini, M., R. Cammarano, and G. Bernardi The evolution of isochore patterns in vertebrate genomes. BMC Genomics 10: Costantini, M., F. Auletta, and G. Bernardi Isochore patterns and gene distributions in fish genomes. Genomics 90:

175 128. Costantini, M., M. Di Filippo, F. Auletta, and G. Bernardi Isochore pattern and gene distribution in the chicken genome. Gene 400: Costantini, M., O. Clay, F. Auletta, and G. Bernardi An isochore map of human chromosomes. Genome Res 16: Schneidman-Duhovny, D., Y. Inbar, R. Nussinov, and H. J. Wolfson PatchDock and SymmDock: servers for rigid and symmetric docking. Nucleic Acids Res 33:W Goto, Y., M. G. De Silva, A. Toscani, B. S. Prabhakar, A. L. Notkins, and M. S. Lan A novel human insulinoma-associated cdna, IA-1, encodes a protein with "zinc-finger" DNA-binding motifs. J Biol Chem 267: Smith, S. B., R. Gasa, H. Watada, J. Wang, S. C. Griffen, and M. S. German Neurogenin3 and hepatic nuclear factor 1 cooperate in activating pancreatic expression of Pax4. J Biol Chem 278: Collombat, P., A. Mansouri, J. Hecksher-Sorensen, P. Serup, J. Krull, G. Gradwohl, and P. Gruss Opposing actions of Arx and Pax4 in endocrine pancreas development. Genes Dev 17: Collombat, P., J. Hecksher-Sorensen, V. Broccoli, J. Krull, I. Ponte, T. Mundiger, J. Smith, P. Gruss, P. Serup, and A. Mansouri The simultaneous loss of Arx and Pax4 genes promotes a somatostatin-producing cell fate specification at the expense of the alpha- and beta-cell lineages in the mouse endocrine pancreas. Development 132: Wilding, L., and M. Gannon The role of pdx1 and HNF6 in proliferation and differentiation of endocrine precursors. Diabetes Metab Res Rev 20: Iype, T., J. Francis, J. C. Garmey, J. C. Schisler, R. Nesher, G. C. Weir, T. C. Becker, C. B. Newgard, S. C. Griffen, and R. G. Mirmira Mechanism of insulin gene regulation by the pancreatic transcription factor Pdx-1: application of pre-mrna analysis and chromatin immunoprecipitation to assess formation of functional transcriptional complexes. J Biol Chem 280: Miyatsuka, T., H. Kaneto, Y. Kajimoto, S. Hirota, Y. Arakawa, Y. Fujitani, Y. Umayahara, H. Watada, Y. Yamasaki, M. A. Magnuson, J. Miyazaki, and M. 175

176 Hori Ectopically expressed PDX-1 in liver initiates endocrine and exocrine pancreas differentiation but causes dysmorphogenesis. Biochem Biophys Res Commun 310: Hussain, M. A., C. P. Miller, and J. F. Habener Brn-4 transcription factor expression targeted to the early developing mouse pancreas induces ectopic glucagon gene expression in insulin-producing beta cells. J Biol Chem 277: Poll, A. V., C. E. Pierreux, L. Lokmane, C. Haumaitre, Y. Achouri, P. Jacquemin, G. G. Rousseau, S. Cereghini, and F. P. Lemaigre A vhnf1/tcf2-hnf6 cascade regulates the transcription factor network that controls generation of pancreatic precursor cells. Diabetes 55: Huber, O., R. Korn, J. McLaughlin, M. Ohsugi, B. G. Herrmann, and R. Kemler Nuclear localization of beta-catenin by interaction with transcription factor LEF-1. Mech Dev 59: Brugmann, S. A., L. H. Goodnough, A. Gregorieff, P. Leucht, D. ten Berge, C. Fuerer, H. Clevers, R. Nusse, and J. A. Helms Wnt signaling mediates regional specification in the vertebrate face. Development 134: Heiser, P. W., J. Lau, M. M. Taketo, P. L. Herrera, and M. Hebrok Stabilization of beta-catenin impacts pancreas growth. Development 133: Heller, R. S., D. S. Dichmann, J. Jensen, C. Miller, G. Wong, O. D. Madsen, and P. Serup Expression patterns of Wnts, Frizzleds, sfrps, and misexpression in transgenic mice suggesting a role for Wnts in pancreas and foregut pattern formation. Dev Dyn 225: Moussad, E. E., and D. R. Brigstock Connective tissue growth factor: what's in a name? Mol Genet Metab 71: Brigstock, D. R., R. Goldschmeding, K. I. Katsube, S. C. Lam, L. F. Lau, K. Lyons, C. Naus, B. Perbal, B. Riser, M. Takigawa, and H. Yeger Proposal for a unified CCN nomenclature. Mol Pathol 56: Xu, L., R. B. Corcoran, J. W. Welsh, D. Pennica, and A. J. Levine WISP-1 is a Wnt-1- and beta-catenin-responsive oncogene. Genes Dev 14: Sharpe, C., N. Lawrence, and A. Martinez Arias Wnt signalling: a theme with nuclear variations. Bioessays 23:

177 152. Brigstock, D. R The CCN family: a new stimulus package. J Endocrinol 178: Kanaan, R. A., M. Aldwaik, and O. A. Al-Hanbali The role of connective tissue growth factor in skeletal growth and development. Med Sci Monit 12:RA Kapasa, M., I. Serafimidis, A. Gavalas, and S. Kossida Identification of phylogenetically conserved enhancer elements implicated in pancreas development in the WISP1 and CTGF orthologs. Genomics 92: Schonemann, M. D., A. K. Ryan, L. Erkman, R. J. McEvilly, J. Bermingham,and M. G. Rosenfeld POU domain factors in neural development. Adv Exp Med Biol 449: Grillet, N., V. Dubreuil, H. D. Dufour, and J. F. Brunet Dynamic expression of RGS4 in the developing nervous system and regulation by the neural type-specific transcription factor Phox2b. J Neurosci 23: Nelson, C., L. P. Shen, A. Meister, E. Fodor, and W. J. Rutter Pan: a transcriptional regulator that binds chymotrypsin, insulin, and AP-4 enhancer motifs. Genes Dev 4: Boulet, A. M., C. R. Erwin, and W. J. Rutter Cell-specific enhancers in the rat exocrine pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A 83: Polakis, P Wnt signaling and cancer. Genes Dev 14: Sidow, A Diversification of the Wnt gene family on the ancestral lineage of vertebrates. Proc Natl Acad Sci U S A 89: Kumar, S., and S. B. Hedges A molecular timescale for vertebrate evolution. Nature 392: Kim, H. J., J. R. Schleiffarth, J. Jessurun, S. Sumanas, A. Petryk, S. Lin, and S. C. Ekker Wnt5 signaling in vertebrate pancreas development. BMC Biol 3: Gavin, B. J., J. A. McMahon, and A. P. McMahon Expression of multiple novel Wnt-1/int-1-related genes during fetal and adult mouse development. Genes Dev 4: Dealy, C. N., A. Roth, D. Ferrari, A. M. Brown, and R. A. Kosher Wnt- 5a and Wnt-7a are expressed in the developing chick limb bud in a manner suggesting roles in pattern formation along the proximodistal and dorsoventral axes. Mech Dev 43:

178 165. Moon, R. T., R. M. Campbell, J. L. Christian, L. L. McGrew, J. Shih, and S. Fraser Xwnt-5A: a maternal Wnt that affects morphogenetic movements after overexpression in embryos of Xenopus laevis. Development 119: Parr, B. A., M. J. Shea, G. Vassileva, and A. P. McMahon Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development 119: Blader, P., U. Strähle and P. W. Ingham Three Wnt genes expressed in a wide variety of tissues during development of the zebrafish, Danio rerio: developmental and evolutionary perspectives. Dev Genes Evol 206: Kafri, R., M. Levy, and Y. Pilpel The regulatory utilization of genetic redundancy through responsive backup circuits. Proc Natl Acad Sci U S A 103: Welters, H. J., and R. N. Kulkarni Wnt signaling: relevance to beta-cell biology and diabetes. Trends Endocrinol Metab 19: Kouadjo, K. E., Y. Nishida, J. F. Cadrin-Girard, M. Yoshioka, and J. St- Amand Housekeeping and tissue-specific genes in mouse tissues. BMC Genomics 8: Ross, J., S. Bottardi, V. Bourgoin, A. Wollenschlaeger, E. Drobetsky, M. Trudel, and E. Milot Differential requirement of a distal regulatory region for pre-initiation complex formation at globin gene promoters. Nucleic Acids Res 37: Strouboulis, J., N. Dillon, and F. Grosveld Developmental regulation of a complete 70-kb human beta-globin locus in transgenic mice. Genes Dev 6: Kapasa, M., S. Arhondakis, and S. Kossida. Phylogenetic and regulatory region analysis of Wnt5 genes reveals conservation of a regulatory module with putative implication in pancreas development. Biol Direct 5: van Genderen, C., R. M. Okamura, I. Farinas, R. G. Quo, T. G. Parslow, L. Bruhn, and R. Grosschedl Development of several organs that require inductive epithelial-mesenchymal interactions is impaired in LEF-1-deficient mice. Genes Dev 8: Woolfe, A., and G. Elgar Comparative genomics using Fugu reveals insights into regulatory subfunctionalization. Genome Biol 8:R

179 176. Kikuta, H., D. Fredman, S. Rinkwitz, B. Lenhard, and T. S. Becker Retroviral enhancer detection insertions in zebrafish combined with comparative genomics reveal genomic regulatory blocks - a fundamental feature of vertebrate genomes. Genome Biol 8 Suppl 1:S Kanazawa, A., S. Tsukada, A. Sekine, T. Tsunoda, A. Takahashi, A. Kashiwagi, Y. Tanaka, T. Babazono, M. Matsuda, K. Kaku, Y. Iwamoto, R. Kawamori, R. Kikkawa, Y. Nakamura, and S. Maeda Association of the gene encoding wingless-type mammary tumor virus integration-site family member 5B (WNT5B) with type 2 diabetes. Am J Hum Genet 75: Westfall, T. A., R. Brimeyer, J. Twedt, J. Gladon, A. Olberding, M. Furutani- Seiki, and D. C. Slusarski Wnt-5/pipetail functions in vertebrate axis formation as a negative regulator of Wnt/beta-catenin activity. J Cell Biol 162: Topol, L., X. Jiang, H. Choi, L. Garrett-Beal, P. J. Carolan, and Y. Yang Wnt-5a inhibits the canonical Wnt pathway by promoting GSK-3- independent beta-catenin degradation. J Cell Biol 162: Kafri, R., M. Levy, and Y. Pilpel The regulatory utilization of genetic redundancy through responsive backup circuits. Proc Natl Acad Sci U S A 103: Slusarski, D. C., J. Yang-Snyder, W. B. Busa, and R. T. Moon Modulation of embryonic intracellular Ca2+ signaling by Wnt-5A. Dev Biol 182: Ioannou, M. and A. Gavalas Manuscript under preparation Ostrom, M., K. A. Loffler, S. Edfalk, L. Selander, U. Dahl, C. Ricordi, J. Jeon, M. Correa-Medina, J. Diez, and H. Edlund Retinoic acid promotes the generation of pancreatic endocrine progenitor cells and their further differentiation into beta-cells. PLoS One 3:e Bernardi G Structural and evolutionary genomics. Natural selection in genome evolution. Elsevier. Edited by Giorgio Bernardi Holmquist, G. P Chromosome bands, their chromatin flavors, and their functional features. Am J Hum Genet 51: Flickinger, R. A Transcriptional frequency and cell determination. J Theor Biol 232:

180 187. Robins, H., and W. H. Press Human micrornas target a functionally distinct population of genes with AT-rich 3' UTRs. Proc Natl Acad Sci U S A 102: Vojtek, A. B., J. Taylor, S. L. DeRuiter, J. Y. Yu, C. Figueroa, R. P. Kwok, and D. L. Turner Akt regulates basic helix-loop-helix transcription factorcoactivator complex formation and activity during neuronal differentiation. Mol Cell Biol 23: Miyagishi, M., R. Fujii, M. Hatta, E. Yoshida, N. Araya, A. Nagafuchi, S. Ishihara, T. Nakajima, and A. Fukamizu Regulation of Lef-mediated transcription and p53-dependent pathway by associating beta-catenin with CBP/p300. J Biol Chem 275: Taurin, S., N. Sandbo, Y. Qin, D. Browning, and N. O. Dulin Phosphorylation of beta-catenin by cyclic AMP-dependent protein kinase. J Biol Chem 281: Takemaru, K. I., and R. T. Moon The transcriptional coactivator CBP interacts with beta-catenin to activate gene expression. J Cell Biol 149: Labalette, C., C. A. Renard, C. Neuveut, M. A. Buendia, and Y. Wei Interaction and functional cooperation between the LIM protein FHL2, CBP/p300, and beta-catenin. Mol Cell Biol 24: Sustmann, C., H. Flach, H. Ebert, Q. Eastman, and R. Grosschedl Cell-type-specific function of BCL9 involves a transcriptional activation domain that synergizes with beta-catenin. Mol Cell Biol 28: Evans, P. M., X. Chen, W. Zhang, and C. Liu. KLF4 interacts with betacatenin/tcf4 and blocks p300/cbp recruitment by beta-catenin. Mol Cell Biol 30: Rausa, F. M., 3rd, D. E. Hughes, and R. H. Costa Stability of the hepatocyte nuclear factor 6 transcription factor requires acetylation by the CREBbinding protein coactivator. J Biol Chem 279: Lannoy, V. J., A. Rodolosse, C. E. Pierreux, G. G. Rousseau, and F. P. Lemaigre Transcriptional stimulation by hepatocyte nuclear factor-6. Target-specific recruitment of either CREB-binding protein (CBP) or p300/cbpassociated factor (p/caf). J Biol Chem 275:

181 197. Rausa, F. M., Y. Tan, and R. H. Costa Association between hepatocyte nuclear factor 6 (HNF-6) and FoxA2 DNA binding domains stimulates FoxA2 transcriptional activity but inhibits HNF-6 DNA binding. Mol Cell Biol 23: Watada, H., D. W. Scheel, J. Leung, and M. S. German Distinct gene expression programs function in progenitor and mature islet cells. J Biol Chem 278: Imai, K., and T. Okamoto Transcriptional repression of human immunodeficiency virus type 1 by AP-4. J Biol Chem 281: Mosley, A. L., and S. Ozcan The pancreatic duodenal homeobox-1 protein (Pdx-1) interacts with histone deacetylases Hdac-1 and Hdac-2 on low levels of glucose. J Biol Chem 279: Billin, A. N., H. Thirlwell, and D. E. Ayer Beta-catenin-histone deacetylase interactions regulate the transition of LEF1 from a transcriptional repressor to an activator. Mol Cell Biol 20: Ku, W. C., S. K. Chiu, Y. J. Chen, H. H. Huang, and W. G. Wu Complementary quantitative proteomics reveals that transcription factor AP-4 mediates E-box-dependent complex formation for transcriptional repression of HDM2. Mol Cell Proteomics 8: Goodall, J., S. Martinozzi, T. J. Dexter, D. Champeval, S. Carreira, L. Larue, and C. R. Goding Brn-2 expression controls melanoma proliferation and is directly regulated by beta-catenin. Mol Cell Biol 24: Malik, K. F., H. Jaffe, J. Brady, and W. S. Young, 3rd The class III POU factor Brn-4 interacts with other class III POU factors and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U. Brain Res Mol Brain Res 45: Wang, H., P. Maechler, B. Ritz-Laser, K. A. Hagenfeldt, H. Ishihara, J. Philippe, and C. B. Wollheim Pdx1 level defines pancreatic gene expression pattern and cell lineage differentiation. J Biol Chem 276: Gasa, R., C. Mrejen, N. Leachman, M. Otten, M. Barnes, J. Wang, S. Chakrabarti, R. Mirmira, and M. German Proendocrine genes coordinate the pancreatic islet differentiation program in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 101: Zhang, T., H. Wang, N. A. Saunee, M. B. Breslin, and M. S. Lan. Insulinomaassociated antigen-1 zinc-finger transcription factor promotes pancreatic duct cell trans-differentiation. Endocrinology 151:

182 208. Ge, W., F. He, K. J. Kim, B. Blanchi, V. Coskun, L. Nguyen, X. Wu, J. Zhao, J. I. Heng, K. Martinowich, J. Tao, H. Wu, D. Castro, M. M. Sobeih, G. Corfas, J. G. Gleeson, M. E. Greenberg, F. Guillemot, and Y. E. Sun Coupling of cell migration with neurogenesis by proneural bhlh factors. Proc Natl Acad Sci U S A 103: Cissell, M. A., L. Zhao, L. Sussel, E. Henderson, and R. Stein Transcription factor occupancy of the insulin gene in vivo. Evidence for direct regulation by Nkx2.2. J Biol Chem 278: Sugimori, M., M. Nagao, N. Bertrand, C. M. Parras, F. Guillemot, and M. Nakafuku Combinatorial actions of patterning and HLH transcription factors in the spatiotemporal control of neurogenesis and gliogenesis in the developing spinal cord. Development 134: Ayala, R., T. Shu, and L. H. Tsai Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell 128: Scardigli, R., C. Schuurmans, G. Gradwohl, and F. Guillemot Crossregulation between Neurogenin2 and pathways specifying neuronal identity in the spinal cord. Neuron 31: Gasparini, L., G. K. Gouras, R. Wang, R. S. Gross, M. F. Beal, P. Greengard, and H. Xu Stimulation of beta-amyloid precursor protein trafficking by insulin reduces intraneuronal beta-amyloid and requires mitogen-activated protein kinase signaling. J Neurosci 21: Chen, Y., and A. M. Bodles Amyloid precursor protein modulates betacatenin degradation. J Neuroinflammation 4: Parachikova, A., and C. W. Cotman Reduced CXCL12/CXCR4 results in impaired learning and is downregulated in a mouse model of Alzheimer disease. Neurobiol Dis 28: Fujino, T., H. Asaba, M. J. Kang, Y. Ikeda, H. Sone, S. Takada, D. H. Kim, R. X. Ioka, M. Ono, H. Tomoyori, M. Okubo, T. Murase, A. Kamataki, J. Yamamoto, K. Magoori, S. Takahashi, Y. Miyamoto, H. Oishi, M. Nose, M. Okazaki, S. Usui, K. Imaizumi, M. Yanagisawa, J. Sakai, and T. T. Yamamoto Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) is essential for normal cholesterol metabolism and glucose-induced insulin secretion. Proc Natl Acad Sci U S A 100:

183 217. Dejmek, J., A. Safholm, C. Kamp Nielsen, T. Andersson, and K. Leandersson Wnt-5a/Ca2+-induced NFAT activity is counteracted by Wnt- 5a/Yes-Cdc42-casein kinase 1alpha signaling in human mammary epithelial cells. Mol Cell Biol 26: Deeney, J. T., J. Gromada, M. Hoy, H. L. Olsen, C. J. Rhodes, M. Prentki, P. O. Berggren, and B. E. Corkey Acute stimulation with long chain acyl-coa enhances exocytosis in insulin-secreting cells (HIT T-15 and NMRI beta-cells). J Biol Chem 275: Haastrup, A., C. A. Gadegbeku, D. Zhang, Y. V. Mukhin, E. L. Greene, A. A. Jaffa, and B. M. Egan Lipids stimulate the production of 6-ketoprostaglandin f(1alpha) in human dorsal hand veins. Hypertension 38: Fujiwara, K., F. Maekawa, K. Dezaki, M. Nakata, T. Yashiro, and T. Yada Oleic acid glucose-independently stimulates glucagon secretion by increasing cytoplasmic Ca2+ via endoplasmic reticulum Ca2+ release and Ca2+ influx in the rat islet alpha-cells. Endocrinology 148: Ahumada-Sempoal, M. A., S. J. Serrano-Guzman, and N. Ruiz-Garcia [Abundance, population structure and growth of the Atrina maura (Bivalvia: Pinnidae) in a tropical lagoon of the Mexican Pacific coast ]. Rev Biol Trop 50: Yavropoulou, M. P., and J. G. Yovos The role of the Wnt signaling pathway in osteoblast commitment and differentiation. Hormones (Athens) 6: Desaint, S., S. Luriau, J. C. Aude, G. Rousselet, and M. B. Toledano Mammalian antioxidant defenses are not inducible by H 2 O 2. J Biol Chem 279: Kaneto, H., Y. Kajimoto, Y. Fujitani, T. Matsuoka, K. Sakamoto, M. Matsuhisa, Y. Yamasaki, and M. Hori Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia 42: Wiggan, O., and P. A. Hamel Pax3 regulates morphogenetic cell behavior in vitro coincident with activation of a PCP/non-canonical Wnt-signaling cascade. J Cell Sci 115:

184 226. Kruger, M., I. Kratchmarova, B. Blagoev, Y. H. Tseng, C. R. Kahn, and M. Mann Dissection of the insulin signaling pathway via quantitative phosphoproteomics. Proc Natl Acad Sci U S A 105: Motomura, K., M. Ohata, M. Satre, and H. Tsukamoto Destabilization of TNF-alpha mrna by retinoic acid in hepatic macrophages: implications for alcoholic liver disease. Am J Physiol Endocrinol Metab 281:E Banno, T., A. Gazel, and M. Blumenberg Effects of tumor necrosis factor-alpha (TNF alpha) in epidermal keratinocytes revealed using global transcriptional profiling. J Biol Chem 279: Kim, H. J., and R. Lotan Identification of retinoid-modulated proteins in squamous carcinoma cells using high-throughput immunoblotting. Cancer Res 64: Daniel, S., M. Noda, R. A. Cerione, and G. W. Sharp A link between Cdc42 and syntaxin is involved in mastoparan-stimulated insulin release. Biochemistry 41: Zheng, C., J. Xiang, T. Hunter, and A. Lin The JNKK2-JNK1 fusion protein acts as a constitutively active c-jun kinase that stimulates c-jun transcription activity. J Biol Chem 274: Minamino, T., T. Yujiri, P. J. Papst, E. D. Chan, G. L. Johnson, and N. Terada MEKK1 suppresses oxidative stress-induced apoptosis of embryonic stem cell-derived cardiac myocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 96: Umikawa, M., H. Obaishi, H. Nakanishi, K. Satoh-Horikawa, K. Takahashi, I. Hotta, Y. Matsuura, and Y. Takai Association of frabin with the actin cytoskeleton is essential for microspike formation through activation of Cdc42 small G protein. J Biol Chem 274: Malcolm, K. C., J. C. Chambard, D. Grall, J. Pouyssegur, and E. van Obberghen-Schilling Independent activation of endogenous p21-activated protein kinase-3 (PAK3) and JNK by thrombin in CCL39 fibroblasts. J Cell Physiol 185: Ryu, J., K. J. Min, T. Y. Rhim, T. H. Kim, H. Pyo, B. Jin, S. U. Kim, I. Jou, S. S. Kim, and E. H. Joe Prothrombin kringle-2 activates cultured rat brain microglia. J Immunol 168: Dandona, P., A. Aljada, P. Mohanty, H. Ghanim, W. Hamouda, E. Assian, and S. Ahmad Insulin inhibits intranuclear nuclear factor kappab and stimulates 184

185 IkappaB in mononuclear cells in obese subjects: evidence for an anti-inflammatory effect? J Clin Endocrinol Metab 86: Minami, T., M. Miura, W. C. Aird, and T. Kodama Thrombin-induced autoinhibitory factor, Down syndrome critical region-1, attenuates NFATdependent vascular cell adhesion molecule-1 expression and inflammation in the endothelium. J Biol Chem 281: Huang, Q., A. Raya, P. DeJesus, S. H. Chao, K. C. Quon, J. S. Caldwell, S. K. Chanda, J. C. Izpisua-Belmonte, and P. G. Schultz Identification of p53 regulators by genome-wide functional analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 101: Liu, T., C. Laurell, G. Selivanova, J. Lundeberg, P. Nilsson, and K. G. Wiman Hypoxia induces p53-dependent transactivation and Fas/CD95-dependent apoptosis. Cell Death Differ 14: Amundson, S. A., K. T. Do, L. Vinikoor, C. A. Koch-Paiz, M. L. Bittner, J. M. Trent, P. Meltzer, and A. J. Fornace, Jr Stress-specific signatures: expression profiling of p53 wild-type and -null human cells. Oncogene 24: Abbud, R. A., R. Kelleher, and S. Melmed Cell-specific pituitary gene expression profiles after treatment with leukemia inhibitory factor reveal novel modulators for proopiomelanocortin expression. Endocrinology 145: Munson, C., J. Huisken, N. Bit-Avragim, T. Kuo, P. D. Dong, E. A. Ober, H. Verkade, S. Abdelilah-Seyfried, and D. Y. Stainier Regulation of neurocoel morphogenesis by Pard6 gamma b. Dev Biol 324: Solecki, D. J., E. E. Govek, and M. E. Hatten mpar6 alpha controls neuronal migration. J Neurosci 26: Crawford, L. A., M. A. Guney, Y. A. Oh, R. A. Deyoung, D. M. Valenzuela, A. J. Murphy, G. D. Yancopoulos, K. M. Lyons, D. R. Brigstock, A. Economides, and M. Gannon Connective tissue growth factor (CTGF) inactivation leads to defects in islet cell lineage allocation and beta-cell proliferation during embryogenesis. Mol Endocrinol 23: Kesavan, G., F. W. Sand, T. U. Greiner, J. K. Johansson, S. Kobberup, X. Wu, C. Brakebusch, and H. Semb Cdc42-mediated tubulogenesis controls cell specification. Cell 139:

186 246. Serafimidis, I., S. Heximer, D. Beis and A. Gavalas GPCR signaling and S1P play a phylogenetically conserved role in endocrine pancreas morphogenesis. Developmental Biology. Manuscript submitted. Αλαπαξαγσγή Δηθφλαο 33 απφ Alberts B, A. Johnson, J. Lewis, Μ. Raff, K. Roberts, and P. Walter Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science. 186

187 7 ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ I

188 ηηο Δηθφλεο 1-11 παξηζηάλεηαη ην ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν φπσο αλαγλσξίζηεθε ζηα νξζφινγα ησλ γνληδίσλ (Πίλαθαο 10) πηζαλψλ ζηφρσλ ηνπ NGN3. Οη Δηθφλεο 1-11 έρνπλ ην παξαθάησ θνηλφ ππφκλεκα πνπ έρεη ήδε πεξηγξαθεί: Δηθφλα 1: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ DCX ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν-βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. II

189 Δηθφλα 2: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FGD4 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. III

190 Δηθφλα 3: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ RGS4 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. IV

191 Δηθφλα 4: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ HUD ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. V

192 Δηθφλα 5: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ ALDH1B1 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. VI

193 Δηθφλα 6: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ BHLHB2 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. Όπνπ ζπλεληνπίδνληαη νξηζκέλα κφλν κέιε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, ε πεξηνρή δειψλεηαη κε πιαίζην. VII

194 Δηθφλα 7: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ CDC42 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. VIII

195 Δηθφλα 8: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ PARD3 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. Όπνπ ζπλεληνπίδνληαη νξηζκέλα κφλν κέιε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, ε πεξηνρή δειψλεηαη κε πιαίζην. IX

196 Δηθφλα 9: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ PARD6B ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. Όπνπ ζπλεληνπίδνληαη νξηζκέλα κφλν κέιε ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ, ε πεξηνρή δειψλεηαη κε πιαίζην. X

197 Δηθφλα 10:Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ VCL ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. XI

198 Δηθφλα 11: Οη πεξηνρέο φπνπ εληνπίδεηαη ην ζπληεξεκέλν ξπζκηζηηθφ ζηνηρείν ζηα νξζφινγα ηνπ γνληδίνπ FZD2 ππνδειψλνληαη κε θάζεηεο καχξεο γξακκέο. Γίπια ζε θάζε γνλίδην αλαθέξεηαη ν νξγαληζκφο ζηνλ νπνίν αλήθεη. Οη απνζηάζεηο απφ ην ζεκείν έλαξμεο ηεο κεηαγξαθήο (TSS-έληνλν άζπξν βέινο) νξίδνληαη κε ην δείθηε ζην πάλσ κέξνο ηεο εηθφλαο. Οη ζέζεηο πξφζδεζεο ησλ κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ απφ θάζε νηθνγέλεηα παξνπζηάδνληαη κε ηελ ζεηξά εκθάληζεο ηνπο κέζα ζηελ πεξηνρή ηνπ ξπζκηζηηθνχ ζηνηρείνπ κε ηα ζχκβνια πνπ επεμεγνχληαη ζην θάησ κέξνο ηεο εηθφλαο. XII