Γενετική δομή και φυλογενετικές σχέσεις ειδών της οικογένειας Sphaeromatidae

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Γενετική δομή και φυλογενετικές σχέσεις ειδών της οικογένειας Sphaeromatidae ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ ΧΑΡΙΚΛΕΙΑ ΠΑΤΡΑ, 2010

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Γενετική δομή και φυλογενετικές σχέσεις ειδών της οικογένειας Sphaeromatidae ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ ΧΑΡΙΚΛΕΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, 2010

3 Στην αδερφή μου, που δεν εγκαταλείπει το στόχο της και μου αποδεικνύει ότι η προσπάθεια πάντα αξίζει

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης αποτελεί την ερευνητική μου εργασία, η οποία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής, του τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Βιολογικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος «Βιολογική Τεχνολογία». Η μελέτη διεξήχθη από το Σεπτέμβριο του 2008 ως τον Απρίλιο του 2010 υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γιώργου Κίλια. Τα άλλα δύο μέλη της επιτροπής που ανέλαβε το συντονισμό της εργασίας ήταν η Επίκουρη Καθηγήτρια κα. Έλενα Κλώσσα-Κίλια και ο Επίκουρος Καθηγητής κ. Σπύρος Σφενδουράκης. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Γιώργο Κίλια. Μέσω της διδασκαλίας του κατάφερε να εντείνει το ενδιαφέρον μου για την εξελικτική επιστήμη και να με κάνει να συνειδητοποιήσω ότι ήθελα να ασχοληθώ με αυτήν σε πειραματικό επίπεδο. Έχοντας έρθει από άλλη σχολή, είχα στο μυαλό μου ότι θα ήταν ρίσκο για εκείνον να με δεχτεί στο εργαστήριό του. Με δισταγμό λοιπόν, θυμάμαι, χτύπησα την πόρτα του γραφείου του και τον ρώτησα αν μπορώ να δουλέψω μαζί του. Προσπάθησα να του δείξω την αγάπη μου για το αντικείμενο και πιστεύω πως γρήγορα το κατάλαβε. Έτσι με εμπιστεύτηκε και αυτή ήταν η αρχή για τη συνεργασία μας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω και στην κα. Έλενα Κλώσσα-Κίλια, η οποία πάντα ήταν πρόθυμη να μου δώσει τη συμβουλή της και μοιραστεί μαζί μου τα «μυστικά» του εργαστηριακού πάγκου. Και οι δύο υπήρξαν υποστηρικτές και καθοδηγητές μου καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου εργασίας. Οι συζητήσεις μας και οι συμβουλές τους μου δίδαξαν πώς να σκέφτομαι σαν επιστήμονας, να μην επαναπαύομαι και να προσπαθώ πάντα για το καλύτερο. Ο μοναδικός τρόπος με τον οποίο καταφέρνουν να αποβάλλουν από το εργαστήριο την πίεση της καθημερινότητας, δημιουργώντας έτσι ένα χώρο στον οποίο μπορεί κανείς να δουλέψει με ηρεμία, καθώς και το ενδιαφέρον που δείχνουν για τον καθένα χωριστά, ήταν εκείνα που με έκαναν να αισθάνομαι ότι μπορώ να στηρίζομαι σε αυτούς για ότι χρειαστώ. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον κ. Σπύρο Σφενδουράκη, ο οποίος συμμετείχε στην επιλογή του θέματος της εργασίας και μου έδωσε τις κατευθύνσεις

5 εκείνες που ήταν απαραίτητες για την κατανόηση τόσο της θεωρίας της φυλογένεσης όσο και της προσέγγισής της μέσω των υπολογιστικών προγραμμάτων. Μέσα από τις προτάσεις και τις επισημάνσεις του συνέβαλλε στην τεκμηρίωση διαφόρων ζητημάτων. Θα ήταν παράληψή μου να μην αναφέρω πως ήταν εκείνος που με έκανε να αγαπήσω το πεδίο, αφού με προέτρεψε να κάνω δειγματοληψίες για την εργασία μου. Παρατηρώντας έτσι από κοντά το περιβάλλον στο οποίο διαβιούν οι υπό μελέτη οργανισμοί, θέλησα να μάθω περισσότερα για τον τρόπο με τον οποίο οι περιβαλλοντικές συνθήκες επηρεάζουν έναν πληθυσμό. Και τα τρία μέλη της επιτροπής μου λοιπόν, ο καθένας με τον τρόπο του, με ώθησαν να βάλω τα δυνατά μου για να φέρω εις πέρας την εργασία μου, αλλά και να αναπτύξω ένα διαφορετικό τρόπο σκέψης και αντίληψης των πραγμάτων. Ευχαριστώ, το συνάδελφο και φίλο Στέφανο Μαρτιμιανάκη, ο οποίος με βοήθησε αφάνταστα τόσο στα πρώτα μου «βήματα» στον εργαστηριακό χώρο όσο και αργότερα κατά τη διάρκεια της έρευνάς μου. Ήταν πάντα δίπλα μου όταν τον χρειαζόμουν, για να με στηρίξει και να με συμβουλεύσει, μέσα και έξω από το εργαστήριο. Δε θα ξεχάσω τις ατελείωτες συζητήσεις μας, μέσα από τις οποίες συνειδητοποίησα ότι τον θαυμάζω σαν επιστήμονα, αλλά και σαν άνθρωπο και θα ήμουν πολύ χαρούμενη αν καταφέρω στο μέλλον να φτάσω στο επίπεδο που είναι εκείνος σήμερα. Ευχαριστώ επίσης την πολύ καλή συνάδελφο Σπυριδούλα Κράιτσεκ για τις ευχάριστες και ξένοιαστες στιγμές που μοιραστήκαμε αυτό το διάστημα, καθώς και τη Χαρά Ντόβα για τη συμβολή της στο καλό κλίμα που επικράτησε στο εργαστήριο κατά το σύντομο διάστημα που συνυπάρξαμε στο χώρο του. Ευχαριστώ τη συνάδελφο, αλλά κυρίως φίλη, Μαρία Καμηλάρη με την οποία μοιράστηκα αυτή την εμπειρία. Μπορεί να γνωριζόμαστε σχετικά λίγο καιρό, όμως είναι από τους ανθρώπους που σε κερδίζουν αμέσως, λόγω της ευθύτητας του χαρακτήρα της και της ειλικρίνειάς της. Ευχαριστώ ακόμη τις πολύ καλές μου φίλες Αναστασία Καψάλη και Δώρα Σπανού, με τις οποίες δε συνδέομαι με δεσμούς αίματος, ωστόσο τις θεωρώ μέλη της οικογένειάς μου. Ήταν και είναι δίπλα μου, με στηρίζουν σε κάθε μου βήμα και μου συμπαραστέκονται σε όποια δυσκολία και αν αντιμετωπίσω. Στο σημείο αυτό θέλω να ευχαριστήσω το Δρ. Γιώργο Τρυφωνόπουλο για την ευχάριστη παρέα που κάναμε, την υποστήριξή του, τις πολύτιμες συμβουλές του και τη βοήθειά του κυρίως όσον αφορά τη χρήση των υπολογιστικών προγραμμάτων, καθώς

6 και τους φίλους μου Γιάννη, Ντίνο και Βαγγέλη, για τα γέλια και τις αμέτρητες στιγμές διασκέδασης που θα θυμάμαι για πάντα. Ευχαριστώ ακόμη, τα υπόλοιπα παιδιά που μετείχαν στο πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών για τις ευχάριστες στιγμές που μοιραστήκαμε και όλους εκείνους που συνέβαλαν στις δειγματοληψίες, γιατί χωρίς τη συμβολή τους αυτή δε θα μπορούσα να ολοκληρώσω την έρευνά μου. Κλείνοντας, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ανθρώπους στους οποίους οφείλω τα πάντα, τους γονείς μου Γιάννη και Ασημούλα, την αδερφή μου Βιβή και το θείο μου Βασίλη. Με στήριζαν και με στηρίζουν με κάθε δυνατό τρόπο, σε ό,τι και αν κάνω και είναι αυτοί που με βοηθούν πάντα στο να κάνω τα όνειρά μου πραγματικότητα. Χάρη σε εσάς μπορώ να ονειρεύομαι

7 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 1 ο Εισαγωγή 1.1 Πληθυσμιακή γενετική Γενετική ποικιλότητα Η πηγή της γενετικής ποικιλότητας Η αύξηση της ποικιλότητας Εξωτερικές πηγές ποικιλότητας Φυσική επιλογή Γονιδιακή ροή Γενετική παρέκκλιση Ειδογένεση Μελέτη των εξελικτικών σχέσεων των οργανισμών Μορφολογικοί ή μοριακοί χαρακτήρες; Πώς επιλέγω μοριακό δείκτη; Μοριακοί δείκτες και φυλογένεση Μιτοχονδριακό DNA Πυρηνικοί γενετικοί τόποι Δευτεροταγής δομή RNA Ισόποδα Γενικά Ανατομία Οικολογία και συμπεριφορά Ενδιαιτήματα Διατροφή Αναπαραγωγή και ανάπτυξη Βιογεωγραφική ιστορία

8 1.5.5 Οι φυλογενετικές σχέσεις των ισοπόδων Μελέτες στον ελλαδικό χώρο Η οικογένεια Sphaeromatidae Μελέτες του είδους Sphaeroma serratum (Fabricius, 1787) Σκοπός της εργασίας 45 Κεφάλαιο 2 ο Υλικά και Μέθοδοι 2.1 Συλλογή υλικού Απομόνωση ολικού DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η ιστορία της μεθόδου Χαρακτηριστικά της μεθόδου Τα συστατικά της PCR Τα στάδια της PCR Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Καθαρισμός των προϊόντων της PCR Αλληλούχιση των προϊόντων της PCR Ποιοτικός έλεγχος χρωματογραφημάτων Στοίχιση των αλληλουχιών Έλεγχος δεδομένων για ομοπλασία και κορεσμό Επιλογή μοντέλου εξέλιξης Ανεξάρτητη ή συνδυασμένη ανάλυση Μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης Neighbor Joining (NJ) Maximum Parsimony Bayesian Inference Στατιστικός έλεγχος αποτελεσμάτων

9 Κεφάλαιο 3 ο Αποτελέσματα 3.1 Ανεξάρτητη ανάλυση Γενετικός τόπος 16S Γενετικός τόπος COI Συμβατότητα αποτελεσμάτων ανεξάρτητης ανάλυσης Συνδυασμένη ανάλυση Ανάλυση Μοριακής Διακύμανσης 124 Κεφάλαιο 4 ο Συζήτηση 4.1 Πρότυπα γενετικής ποικιλότητας Διαειδικές νουκλεοτιδικές αποκλίσεις Ενδοειδικές νουκλεοτιδικές αποκλίσεις Φυλογενετικές σχέσεις Κρυπτικά είδη; Πρότυπα γεωγραφικής απομόνωσης Που οφείλεται η διαφοροποίηση; Τελικά συμπεράσματα 135 Κεφάλαιο 5 ο Περίληψη 137 Κεφάλαιο 6 ο Βιβλιογραφία

10 Κεφάλαιο 7 ο Παραρτήματα 2-1 Πρωτόκολλο απομόνωσης DNA Πρωτόκολλο απομόνωσης DNA (επώαση σε υδατόλουτρο) Πρωτόκολλα PCR Πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης Πρωτόκολλο καθαρισμού προϊόντων PCR Πίνακας Νουκλεοτιδικών αποκλίσεων (pairwise distance) των απλοτύπων για το γενετικό τόπο 16S (K2P) Πίνακας Νουκλεοτιδικών αποκλίσεων (pairwise distance) των απλοτύπων για το γενετικό τόπο COI (K2P) Πίνακας Νουκλεοτιδικών αποκλίσεων (pairwise distance) των απλοτύπων για τη συνδυασμένη ανάλυση (K2P)

11 Κεφάλαιο 1 ο Εισαγωγή

12 1.1 Πληθυσμιακή γενετική Η πληθυσμιακή γενετική είναι εκείνος ο κλάδος της γενετικής ο οποίος μελετά τη γενετική σύσταση των βιολογικών πληθυσμών, δηλαδή τους τύπους και τις συχνότητες των γονιδίων και των γενοτύπων που τους αντιπροσωπεύουν καθώς και τους μηχανισμούς (φυσική επιλογή, μεταλλάξεις, γενετική παρέκκλιση, γονιδιακή ροή) οι οποίοι μεταβάλλουν την γενετική δομή των πληθυσμών. Πρόκειται για έναν κλάδο ο οποίος είναι άρρηκτα συνδεδεμένος με την εξέλιξη και αποτελεί τη βάση για την γενετική βελτίωση των οργανισμών, ενώ όπως προδίδει το όνομά του, έχει μια προοπτική με κέντρο τον πληθυσμό, παρά το άτομο. Η πληθυσμιακή γενετική μπορεί να θεωρηθεί ως η λογική επέκταση των νόμων του Mendel πάνω σε πληθυσμούς. Οι βάσεις της τίθενται το 1908 όταν ο Βρετανός μαθηματικός Hardy και ο Γερμανός γιατρός Weinberg διατυπώνουν, ανεξάρτητα ο ένας απ' τον άλλον, την αρχή της σταθερότητας των γενοτυπικών συχνοτήτων σε μεγάλους, παμμεικτικούς πληθυσμούς. Σημαντικοί σταθμοί στην ιστορία της πληθυσμιακής γενετικής υπήρξαν και οι εργασίες του Βρετανού R.A. Fisher στη μαθηματική διερεύνηση της ομοιότητας μεταξύ συγγενών και του Αμερικανού S. Wright στην επίδραση των συστημάτων σύζευξης στη γενοτυπική σύνθεση των πληθυσμών. Σημαντικές είναι επίσης κάποιες εργασίες του Βρετανού J.B.S. Haldane σχετικά με την εφαρμογή στατιστικών αναλύσεων σε πραγματικά παραδείγματα φυσικής επιλογής. Το επίτευγμά τους λοιπόν, ήταν η ενοποίηση των αρχών της Μεντελιανής γενετικής με τη φυσική επιλογή της Δαρβινικής θεωρίας. Παρόλο που η συμβατότητα του Δαρβινισμού και της Μεντελιανής γενετικής θεωρείται στις μέρες μας δεδομένη, στις αρχές του 20 ου αιώνα κάτι τέτοιο φάνταζε πολύ δύσκολο. Πολλοί από τους πρώτους υποστηρικτές της θεωρίας του Mendel δε δέχονταν τη «σταδιακή» θεώρηση της εξέλιξης του Δαρβίνου, υποστηρίζοντας ότι οι νέες προσαρμογές προκύπτουν από μια και μόνο μετάλλαξη. Αντίθετα, πολλοί από τους πρώτους Δαρβινιστές δεν πίστευαν στη - 6 -

13 Μεντελιανή κληρονομικότητα, συχνά εξαιτίας της λανθασμένης αντίληψης ότι ήταν ασυμβίβαστη με τη διαδικασία εξελικτικής αλλαγής, όπως αυτή περιγράφηκε από το Δαρβίνο. Υπολογίζοντας έτσι, με μαθηματικό τρόπο τις επιπτώσεις της δράσης της επιλογής σε έναν πληθυσμό που υπόκειται στους κανόνες της Μεντελιανής κληρονομικότητας, οι Fisher, Haldane και Wright απέδειξαν ότι οι δύο θεωρίες δεν ήταν απλά συμβατές, αλλά και εξαιρετικοί «σύμμαχοι». Το γεγονός αυτό διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της Εξελικτικής ή Σύγχρονης Σύνθεσης και εξηγεί γιατί ο ρόλος της πληθυσμιακής γενετικής είναι κρίσιμος για τη θεωρία της εξέλιξης. 1.2 Γενετική ποικιλότητα Η πηγή της γενετικής ποικιλότητας Από τη στιγμή της σύλληψης της ιδέας της εξέλιξης, η μελέτη της έχει συνδεθεί στενά με τη μελέτη της κληρονομικότητας. Από τις σημαντικότερες αρχές της κληρονομικότητας είναι η αρχή της μονόδρομης ροής πληροφοριών από το γενότυπο στο φαινότυπο και η αρχή της διατήρησης της ταυτότητας των μονάδων της κληρονομικότητας από γενιά σε γενιά. Η κληρονομικότητα είναι μια συντηρητική δύναμη που παρέχει σταθερότητα στα βιολογικά συστήματα (Dobzhansky 1970). Οι μοριακοί μηχανισμοί, όμως, που υπόκεινται στην επίδραση του περιβάλλοντος δεν μπορούν να είναι τέλειοι. Λάθη που συμβαίνουν στη διαδικασία της αντιγραφής παράγουν τροποποιημένες αλληλουχίες DNA (μεταλλάξεις) οι οποίες είναι δυνατόν να μεταβιβαστούν στις επόμενες γενιές. Δεν είναι εύκολο να δοθεί ένας ορισμός για τη μετάλλαξη. Συχνά ορίζεται ως μια αλλαγή στην αλληλουχία των ζευγών των βάσεων ενός γονιδίου (Futuyma 1995). Κάποιες φορές όμως ο όρος χρησιμοποιείται με την ευρύτερη έννοια και για αλλαγές στον αριθμό και τη δομή των χρωμοσωμάτων, όπως είναι για παράδειγμα η πολυπλοειδία και οι - 7 -

14 χρωμοσωματικές αναδιατάξεις (π.χ. αναστροφή, μετατόπιση, έλλειμμα, διπλασιασμός) (Εικόνα 1-1). Εικόνα 1-1: Οι χρωμοσωματικές αναδιατάξεις Η αύξηση της ποικιλότητας Η γενετική ποικιλότητα δεν προκύπτει μόνο από τις μεταλλάξεις αλλά και από τον γενετικό ανασυνδυασμό (διασκελισμός). Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς υπάρχουν δύο διεργασίες ανασυνδυασμού του γενετικού υλικού. Ο διαχρωμοσωματικός ανασυνδυασμός, που γίνεται με βάση τον ελεύθερο συνδυασμό των χρωμοσωμάτων, κατά τον οποίο τα μειωτικά προϊόντα του ανασυνδυασμού αποτελούν το 50% του συνόλου των απογόνων. Ο ενδοχρωμοσωματικός ανασυνδυασμός, που γίνεται με βάση το συνδυασμό γονιδίων, συμβαίνει κατά τη μείωση ανάμεσα σε μη αδελφικά χρωματίδια και τα παραγόμενα μειωτικά προϊόντα του ανασυνδυασμού είναι λιγότερα από το 50% του συνόλου των απογόνων. Το ποσοστό τους, λοιπόν, κυμαίνεται από 0% έως 50%, κάτι που μπορεί να επηρεαστεί από πολλούς γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες (Τριανταφυλλίδης 2001)

15 1.2.3 Εξωτερικές πηγές ποικιλότητας Εκτός από τη γενετική ποικιλότητα που παράγεται μέσα σε έναν πληθυσμό από τη μετάλλαξη και τον ανασυνδυασμό, υπάρχουν και εξωτερικές πηγές ποικιλότητας, όπως είναι η φυσική επιλογή, η γονιδιακή ροή και η γενετική παρέκκλιση Φυσική επιλογή Η διαδικασία την οποία ο Κάρολος Δαρβίνος αποκάλεσε φυσική επιλογή αποτέλεσε επανάσταση στην ανθρώπινη σκέψη. Σύμφωνα με το Δαρβίνο, η εξέλιξη προχωρά κατά κύριο λόγο βάσει της δράσης της φυσικής επιλογής. Στην απλούστερή της μορφή, δηλώνει το γεγονός ότι αναπαραγόμενες μονάδες (αλληλόμορφα, γενότυποι, πληθυσμοί ή και είδη) που εμφανίζουν γενετικές διαφορές έχουν διαφορετικές πιθανότητες αντιπροσώπευσής τους στις επόμενες γενιές. Αν κάποια από τα χαρακτηριστικά τους έχουν μεγαλύτερη καταλληλότητα ως προς το περιβάλλον, βοηθούν δηλαδή την επιβίωση και την αναπαραγωγή, τότε τα χαρακτηριστικά αυτά θα έχουν αυξημένη αντιπροσώπευση στην επόμενη γενιά. Αν, μάλιστα, η συγκεκριμένη φυσική επιλογή συνεχιστεί για πολλές γενιές, τα χαρακτηριστικά αυτά θα αποτελέσουν ιδιαίτερο γνώρισμα του είδους. Η δράση της φυσικής επιλογής υπολογίζεται με βάση την αρμοστικότητα (fitness). Σύμφωνα με μια προσέγγιση, γίνεται αντιληπτή ως σχετική αρμοστικότητα και εκφράζει το ρυθμό με τον οποίο ένας γενότυπος αυξάνει την παρουσία του στον πληθυσμό, σε σχέση με το ρυθμό των άλλων γενοτύπων, ενώ δεν έχει να κάνει με τις φυσικές ή άλλες ιδιότητες του γενοτύπου (όπως μορφολογία, φυσιολογία). Ευκαιρίες για δράση της φυσικής επιλογής υπάρχουν όπου υπάρχουν φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ ατόμων, οι οποίες μεταφράζονται σε διαφορές βιωσιμότητας και γονιμότητας. Για να δράσει όμως η επιλογή, οι φαινοτυπικές αυτές διαφορές πρέπει να έχουν γενετική βάση (Εικόνα 1-2)

16 Διαφορές οι οποίες οφείλονται αποκλειστικά σε περιβαλλοντικές συνθήκες επίσης υπόκεινται στη φυσική επιλογή, αλλά η επιλογή αυτή δεν έχει αποτέλεσμα, αφού δεν αλλάζει την κατανομή των φαινοτύπων της επόμενης γενιάς. Εικόνα 1-2: Σχηματική απόδοση της δράσης της φυσικής επιλογής σε έναν πληθυσμό, όπου τα άτομα που φέρουν το σκούρο χρώμα ευνοούνται. Ι) Μέσω μετάλλαξης δημιουργούνται νέα αλληλόμορφα. ΙΙ) Τα άτομα που φέρουν τις δυσμενείς μεταλλάξεις απομακρύνονται από τον πληθυσμό. ΙΙΙ) Ακολουθεί αναπαραγωγή των ατόμων, ενώ ταυτόχρονα έχουμε και νέες μεταλλάξεις. IV) Τα άτομα που φέρουν τις ευνοϊκές μεταλλάξεις έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες να επιβιώσουν. V) Τα άτομα που επιβιώνουν συνεχίζουν να αναπαράγονται. Η φυσική επιλογή μπορεί να έχει διάφορες μορφές, οι οποίες εξαρτώνται από τις περιβαλλοντικές πιέσεις και τις επιδράσεις τους στις γονιδιακές συχνότητες των πληθυσμών. Αναλυτικότερα, έχουμε τις ακόλουθες μορφές επιλογής: Σταθεροποιούσα επιλογή (balancing selection). Οι μέσοι φαινότυποι έχουν μεγαλύτερη αρμοστικότητα, ενώ μειώνεται η συχνότητα των ακραίων φαινοτύπων. Κατευθύνουσα επιλογή (directional selection). Ένας εκ των ακραίων φαινοτύπων εμφανίζει μεγαλύτερη αρμοστικότητα

17 Διασπαστική επιλογή (disruptive selection). Οι ακραίοι φαινότυποι ευνοούνται εις βάρος των μεσαίων φαινοτύπων, οπότε αυξάνεται η διασπορά των γενοτύπων του πληθυσμού. Εκτός από τις τρεις παραπάνω μορφές επιλογής, υπάρχει μια ακόμη εξίσου σημαντική μορφή, η συχνοεξαρτώμενη επιλογή (frequency dependent selection). Η αρμοστικότητα ενός φαινοτύπου εξαρτάται από τη σχετική συχνότητά του μέσα στον πληθυσμό. Πιο συγκεκριμένα, στη θετική συχνοεξαρτώμενη επιλογή, η αρμοστικότητα ενός φαινοτύπου αυξάνει καθώς αυξάνει η συχνότητά του. Αυτό σημαίνει ότι τα νέα αλληλόμορφα δύσκολα μπορούν να εισβάλουν σε έναν πληθυσμό, γιατί για να ευδοκιμήσουν πρέπει να αυξήσουν τη συχνότητά τους. Στην αρνητική συχνοεξαρτώμενη επιλογή, η αρμοστικότητα ενός φαινοτύπου αυξάνει όσο αυτός εμφανίζεται σπανιότερα. Ένα παράδειγμα αποτελεί η αλληλεπίδραση με τον ανθρώπινο οργανισμό πολλών παθογόνων, όπως ο ιός της γρίπης. Εφόσον ένα συγκεκριμένο στέλεχος του ιού είναι συχνό σε έναν ανθρώπινο πληθυσμό, η πλειονότητα των ατόμων θα έχει αναπτύξει ανοσολογική απόκριση γι αυτό. Ένα σπάνιο, όμως, στέλεχος του ιού μπορεί να εξαπλωθεί γρήγορα σε όλα σχεδόν τα άτομα. Η ύπαρξη συνεπώς, της γενετικής ποικιλότητας είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη δράση της φυσικής επιλογής, της διεργασίας που «προσαρμόζει» τον πληθυσμό στο διαρκώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον του. Γι αυτό είναι σημαντικό να γνωρίζει κανείς εάν οι γενετικές διαφορές που χαρακτηρίζουν τα άτομα, τους πληθυσμούς και τα είδη, αντανακλούν το αποτέλεσμα της δράσης της επιλογής στο παρελθόν και εξακολουθούν ακόμη και τώρα να υπόκεινται στην επιλογή, ή εάν αποτελούν το προϊόν της αέναης διαδικασίας της μετάλλαξης και απώλειας της ποικιλότητας, λόγω του πεπερασμένου μεγέθους των φυσικών πληθυσμών Γονιδιακή ροή Η γονιδιακή ροή περιγράφει την είσοδο στη γενετική δεξαμενή ενός πληθυσμού, γονιδίων από έναν ή περισσότερους άλλους πληθυσμούς

18 Συνήθως οι πληθυσμοί αυτοί ανήκουν στο ίδιο είδος, σε μερικές περιπτώσεις, όμως, γίνεται υβριδισμός ανάμεσα σε διαφορετικά είδη, τα οποία δεν είναι πλήρως αναπαραγωγικά απομονωμένα. Η ποικιλότητα που προέρχεται από υβριδισμό συχνά υπερβαίνει την εσωτερική ποικιλότητα καθενός από τα γονικά είδη. Κάποιες φορές ο υβριδισμός είναι δυνατόν να δώσει γενετική ποικιλότητα επαρκή για προσαρμογή σε περιβάλλοντα που φυσιολογικά θα ήταν απρόσιτα για ένα είδος (Εικόνα 1-3). Εικόνα 1-3: Ο υβριδισμός μεταξύ ειδών μπορεί να συμβεί σε αρκετές ομάδες Καρκινοειδών του γένους Daphnia στη φύση. Συχνά οι υβριδικοί κλώνοι μπορούν να προσαρμόζονται τοπικά καλύτερα από τα γονικά τάξα ( Η γονιδιακή ροή λαμβάνει χώρα είτε με μετακίνηση ατόμων μεταξύ δύο πληθυσμών, όπως μέσω της μετανάστευσης, είτε με μεταφορά γαμετών. Αποτελεί συντηρητικό παράγοντα που αποτρέπει την απόκλιση μερικώς απομονωμένων πληθυσμών και συμβάλλει σημαντικά στη σταθερότητα των διαδεδομένων ειδών και τη στάση των πολυπληθών ειδών. Διαφέρει ανάλογα με τον πληθυσμό και το είδος και μειώνει τις διαφορές των γενετικών δεξαμενών. Ανάλογα, λοιπόν, με τη δομή των πληθυσμών στους οποίους αναφερόμαστε, διακρίνονται διάφορα μοντέλα γονιδιακής ροής (Εικόνα 1-4), όπως τα εξής:

19 Μοντέλο «ήπειρος νησί», στο οποίο το ενδιαφέρον έγκειται στη ροή από ένα μεγάλο πληθυσμό (ήπειρο) σε έναν άλλο πολύ μικρότερο (νησί). Μοντέλο «νησιών», στο οποίο η ροή γίνεται μεταξύ μικρών πληθυσμών κατά τυχαίο τρόπο. Μοντέλο «βηματισμού», στο οποίο οι πληθυσμοί είναι πολυάριθμοι, η γονιδιακή ροή όμως γίνεται μόνο μεταξύ γειτονικών πληθυσμών, μέσα στο χρονικό διάστημα μιας γενιάς. Μοντέλο «απομόνωσης λόγω απόστασης», στο οποίο η γονιδιακή ροή είναι συνάρτηση της απόστασης μεταξύ τοπικών πληθυσμών που συναποτελούν μια συνέχεια. Εικόνα 1-4: Σχηματική απόδοση μοντέλων γονιδιακής ροής. 1) Μοντέλο «ήπειρος νησί», 2) Μοντέλο των «νησιών», 3) Μοντέλο του «βηματισμού» (α-μονοδιάστατο, β-δισδιάστατο), 4) Μοντέλο της «απομόνωσης λόγω απόστασης» Γενετική παρέκκλιση Με τον όρο γενετική παρέκκλιση αναφερόμαστε στις τυχαίες αλλαγές στις συχνότητες των αλληλομόρφων, συνήθως λόγω της τυχαίας δειγματοληψίας από τη γενετική δεξαμενή κάποιου πληθυσμού κατά τη

20 μεταβίβαση από τη μια γενιά στην άλλη (Εικόνα 1-5). Πρόκειται για πολύ σημαντική εξελικτική διεργασία, η οποία οδηγεί σε αλλαγές των αλληλικών συχνοτήτων με το πέρασμα του χρόνου. Μπορεί να συμβάλει στην πλήρη εξάλειψη κάποιων αλληλομόρφων, με συνέπεια την ελάττωση της γενετικής ποικιλότητας. Σε αντίθεση με τη φυσική επιλογή, όπου η συχνότητα εμφάνισης των αλληλομόρφων εξαρτάται από την αναπαραγωγική τους επιτυχία, οι αλλαγές δεν καθοδηγούνται από την περιβαλλοντική ή την προσαρμοστική πίεση και μπορεί να αποδειχθούν ευεργετικές, ουδέτερες, ή καταστρεπτικές για την αναπαραγωγική επιτυχία. Εικόνα 1-5: Σχηματική απεικόνιση της τυχαίας δειγματοληψίας και της γενετικής παρέκκλισης. Ο αντίκτυπος της γενετικής παρέκκλισης είναι μεγαλύτερος στους μικρούς πληθυσμούς και μικρότερος στους μεγάλους πληθυσμούς. Παλαιότερα πίστευαν πως ο ρόλος της γενετικής παρέκκλισης ήταν ασήμαντος για την εξέλιξη, μέχρι την έκδοση του συγγράμματος «Ουδέτερη θεωρία της μοριακής εξέλιξης» του Motoo Kimura, ο οποίος πίστευε πως οι περισσότερες αλλαγές που σταθεροποιούνται στο γενετικό υλικό οφείλονται στη γενετική παρέκκλιση (Kimura 1985) Ειδογένεση Στη διαδικασία προσαρμογής των πληθυσμών στις μεταβολές του περιβάλλοντος, μπορεί να υπάρξουν αλλαγές στη γενετική τους δομή, με

21 αποτέλεσμα οι πληθυσμοί να εκδηλώνουν διαφορές στη μορφολογία και τη φυσιολογία τους. Όταν οι αλλαγές αυτές φτάσουν σε σημείο που δεν είναι δυνατή η γέννηση βιώσιμων και γόνιμων απογόνων (αναπαραγωγική απομόνωση), τότε μιλάμε για τη δημιουργία νέου είδους. Προϋπόθεση για την αλλαγή της γενετικής δομής των πληθυσμών είναι η απομόνωσή τους, η οποία μπορεί να είναι είτε γεωγραφική, είτε αναπαραγωγική. Φυσικές δομές, όπως βουνά, φαράγγια κ.ά., είναι πιθανό να λειτουργήσουν ως γεωγραφικά εμπόδια, τα οποία παρεμποδίζουν την ανταλλαγή γονιδίων ανάμεσα σε δύο πληθυσμούς. Έτσι, πληθυσμοί που ζουν χωριστά για μεγάλο χρονικό διάστημα μπορούν να αναπτύξουν, λόγω της προσαρμογής τους σε διαφορετικά περιβάλλοντα, αναπαραγωγική απομόνωση. Η αναπαραγωγική απομόνωση μπορεί να οφείλεται αφενός σε μηχανισμούς που δεν επιτρέπουν τη συνεύρεση δύο πληθυσμών, όπως για παράδειγμα η διαφορετική ανατομία των γεννητικών οργάνων τους, η διαφορετική αναπαραγωγική εποχή, ο διαφορετικός χώρος κατοικίας ή η διαφορετική προτίμηση για σύζευξη (προσυζευκτικοί), και αφετέρου σε μηχανισμούς που δεν επιτρέπουν τη βιωσιμότητα ή τη γονιμότητα των απογόνων (μετασυζευκτικοί). Σε μια απλή περίπτωση ειδογένεσης, η σειρά των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα μπορεί να έχει ως εξής: Δύο πληθυσμοί ενός είδους απομονώνονται, ώστε η αναπαραγωγή μεταξύ τους να είναι αδύνατη. Συνήθως η απομόνωση οφείλεται σε κάποιο γεωγραφικό εμπόδιο ή σε μεγάλες αποστάσεις. Η αναπαραγωγική απομόνωση μπορεί να προκύψει όμως και από άλλες αιτίες, όπως εποχικές, λειτουργικές ή συμπεριφοράς. Οι γονιδιακές δεξαμενές των δύο πληθυσμών δεν επικοινωνούν. Με το πέρασμα του χρόνου, οι μεταλλάξεις και η επιλογή κάνουν τους δύο πληθυσμούς γενετικά διαφορετικούς, ώστε να μην μπορούν πλέον να αποκτήσουν βιώσιμους και γόνιμους απογόνους

22 Στο σημείο αυτό η διαδικασία της ειδογένεσης έχει ολοκληρωθεί. Συνεπώς εκεί που υπήρχε ένα είδος, τώρα υπάρχουν δύο. Οι γενετικοί φραγμοί ή οι αναπαραγωγικοί μηχανισμοί μπορεί να προκύψουν με διάφορους τρόπους και, αντίστοιχα, η ειδογένεση να ταξινομηθεί σε διάφορες κατηγορίες (Εικόνα 1-6). Εικόνα 1-6: Σχηματική απόδοση των κατηγοριών της ειδογένεσης

23 Παραπάτρια ειδογένεση. Είναι ένας τύπος απόκλισης που δεν απαιτεί την πλήρη απομόνωση των πληθυσμών. Αν η επιλογή ευνοεί διαφορετικά αλληλόμορφα σε δύο παρακείμενους (ή όπως ονομάζονται παραπάτριους) πληθυσμούς, δημιουργείται μια διαβάθμιση στη συχνότητα των γονιδίων. Οι πληθυσμοί μπορούν να διαφοροποιηθούν σε αναπαραγωγικά απομονωμένα είδη, αν υπάρχει ισχυρή επιλογή για ένα ή περισσότερα γονίδια που ελέγχουν κάποια μορφή αναπαραγωγικής απομόνωσης. Αλλοπάτρια ειδογένεση. Προτάθηκε από τον Mayr έπειτα από μελέτες της γεωγραφικής ποικιλομορφίας που εμφάνιζαν διάφοροι πληθυσμοί. Είναι γνωστή και ως γεωγραφική ειδογένεση, και πρόκειται για το φαινόμενο κατά το οποίο οι βιολογικοί πληθυσμοί απομονώνονται φυσικά από έναν εξωτερικό φραγμό και αναπτύσσουν γενετική αναπαραγωγική απομόνωση. Καθ αυτό τον τρόπο ακόμα και αν ο φυσικός αυτός φραγμός κάποτε πάψει να υφίσταται, τα άτομα των πληθυσμών δεν μπορούν πλέον να διασταυρωθούν μεταξύ τους. Για τους εξελικτικούς βιολόγους η αλλοπάτρια ειδογένεση είναι ένας συνήθης τρόπος για τη δημιουργία νέων ειδών. Συμπάτρια ειδογένεση. Εάν δημιουργηθεί ένας βιολογικός μηχανισμός αναπαραγωγικής απομόνωσης μέσα σε ένα παμμικτικό πληθυσμό, χωρίς τοπικό διαχωρισμό των «εν τη γενέσει» ειδών, τότε μιλάμε για συμπάτρια ειδογένεση. Διακρίνεται σε στιγμιαία και προοδευτική. Στους πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, δεν είναι τόσο συνηθισμένη, αλλά μέσω αυτής, η γενετική απόκλιση (διαμέσου της αναπαραγωγικής απομόνωσης) διαφόρων πληθυσμών που προέρχονται από ένα γονικό είδος και κατοικούν στην ίδια γεωγραφική περιοχή, οδηγεί στη δημιουργία νέων ειδών. Πρόσφατο παράδειγμα αποτελεί η παρουσία νέων ειδών σαλαμάνδρας των σπηλαίων στην περιοχή του Tennessee (Niemiller et al. 2008). Στα βακτήρια, αντιθέτως, η ανάλογη διαδικασία είναι πιο συνηθισμένη και πραγματοποιείται μέσω οριζόντιας μεταβίβασης γονιδίων

24 Περιπάτρια ειδογένεση. Είναι μια κατηγορία ειδογένεσης κατά την οποία νέα είδη δημιουργούνται σε απομονωμένους περιφερειακούς πληθυσμούς. Μοιάζει με την παραπάτρια ειδογένεση στο γεγονός ότι οι πληθυσμοί δεν είναι πλήρως απομονωμένοι, όμως αντίθετα με την αλλοπάτρια, στην περιπάτρια ειδογένεση, ένας εκ των πληθυσμών είναι πολύ μικρότερος από τον άλλο. Αρχή του ιδρυτή. Στην πληθυσμιακή γενετική, η αρχή του ιδρυτή αφορά την απώλεια της γενετικής ποικιλότητας, η οποία λαμβάνει χώρα όταν ένας νέος πληθυσμός ιδρύεται από έναν πολύ μικρό αριθμό ατόμων ενός μεγαλύτερου πληθυσμού (Provine 2004). Πρόκειται, δηλαδή, για ιδιαίτερη περίπτωση γενετικής παρέκκλισης. Ως αποτέλεσμα της απώλειας της γενετικής ποικιλότητας, ο νέος πληθυσμός μπορεί να είναι ευδιάκριτα διαφορετικός, τόσο γενετικά όσο και φαινοτυπικά, από τον πληθυσμό από τον οποίο προέρχεται. Σε ακραίες περιπτώσεις, πολλαπλές επαναλήψεις ιδρυτικών φαινομένων μπορούν να οδηγήσουν σε ειδογένεση και ακολούθως στην εξέλιξη νέων ειδών. Τέλος, το φαινόμενο του ιδρυτή μπορεί να παρατηρηθεί και έπειτα από περιόδους πληθυσμιακής στενωπού, παρόλο που δεν πρόκειται ακριβώς για νέο πληθυσμό. 1.3 Μελέτη των εξελικτικών σχέσεων των οργανισμών Όταν αναφέρεται κανείς στη φυλογένεση, εννοεί τη μελέτη των εξελικτικών σχέσεων των οργανισμών, όπως αυτές διαμορφώνονται με το πέρασμα του χρόνου. Η εξελικτική διαδικασία προχωρά δημιουργώντας διακλαδώσεις, καθώς οι πληθυσμοί μεταβάλλονται στο χρόνο και μπορούν να διαχωρίζονται σε ξεχωριστούς κλάδους (ειδογένεση), να διασταυρώνονται, ή να εξαφανίζονται. Ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων είναι συνδεδεμένος με την ταξινόμηση των οργανισμών, αφού από την εποχή του Δαρβίνου ακόμη, στόχος των ταξινόμων είναι η ταξινόμηση να αντανακλά όσο πιο πιστά γίνεται τις φυλογενετικές σχέσεις των οργανισμών

25 1.3.1 Μορφολογικοί ή μοριακοί χαρακτήρες; Παλαιότερα η περιγραφή των σχέσεων μεταξύ των οργανισμών γινόταν με τη χρήση μεθόδων, οι οποίες στηρίζονταν σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, τη συγκριτική μορφολογία, τη φυσιολογία και άλλα. Οι μέθοδοι ανάλυσης των χαρακτήρων (που ονομάστηκαν κλαδιστικές μέθοδοι) βασίζονται εν γένει στις αρχές που περιγράφηκαν από το Γερμανό εντομολόγο Willi Hennig στο βιβλίο του Phylogenetic Systematics (1966). Εφόσον ήταν γνωστό ότι ο γενότυπος ενός ατόμου αντικατοπτρίζεται στο φαινότυπό του, οι μορφολογικοί χαρακτήρες ήταν εκείνοι που χρησιμοποιούνταν κατά κύριο λόγο στις κλαδιστικές μελέτες, γιατί έφεραν πληροφορίες που αντιστοιχούσαν σε μεγάλο μέρος του γενετικού υλικού. Επιπροσθέτως, ο φαινότυπος είναι εκείνος που υφίσταται τις πιέσεις της φυσικής επιλογής και εξελίσσεται ορατά. Ένα ακόμη πλεονέκτημα της χρήσης των μορφολογικών χαρακτήρων, είναι η δυνατότητα χρήσης μεγάλου δείγματος ατόμων στις αναλύσεις, μειώνοντας με τον τρόπο αυτόν την πιθανότητα στατιστικού σφάλματος, καθώς και η δυνατότητα επανάληψης των αναλύσεων με τη χρήση των ίδιων ατόμων, εφόσον είναι δυνατή η διατήρησή τους. Για τους παραπάνω λόγους, η χρήση της μορφολογίας βρισκόταν σε άνθιση μέχρι τη δεκαετία του 80. Οι αναλύσεις που στηρίζονται στη μορφολογία των ατόμων έχουν όμως και μειονεκτήματα, όπως για παράδειγμα το γεγονός ότι οι διαφορετικοί χαρακτήρες είναι, κάποιες φορές, δύσκολο να διακριθούν, συνεπώς πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η υποκειμενικότητα του ερευνητή. Επίσης, είναι δυνατό τα μορφολογικά χαρακτηριστικά να συγκλίνουν ή να εξελίσσονται παράλληλα, γεγονός που δυσχεραίνει τον εντοπισμό ομοπλασιών (Moore & Willmer 1997, Conway 2003), ενώ και τα πρότυπα της κληρονομικότητας των μορφολογικών χαρακτήρων δεν είναι πάντα σαφή. Υπάρχουν ακόμη, περιπτώσεις όπου το πλήθος των δεδομένων (διαθέσιμων χαρακτήρων) δεν επαρκεί για την καλή στήριξη των φυλογενετικών υποθέσεων

26 Μια λύση στα προβλήματα αυτά έδωσε η ανάπτυξη των μοριακών μεθόδων, οι οποίες βρίσκουν εφαρμογή σε όλους τους οργανισμούς και σε κάθε μόριο το οποίο φέρει κάποια πληροφορία για τον οργανισμό, από το DNA μέχρι τις πρωτεΐνες. Με την ανάπτυξη μοριακών τεχνικών, όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR), δόθηκε στους ερευνητές η δυνατότητα προσδιορισμού αλληλουχιών DNA σε μεγάλη κλίμακα, οπότε οι μοριακοί χαρακτήρες έγιναν αναπόσπαστο κομμάτι των φυλογενετικών αναλύσεων. Όταν, λοιπόν, οι επιστήμονες άρχισαν να χρησιμοποιούν τα μοριακά δεδομένα και κυρίως τις αλληλουχίες του DNA, θεωρούσαν πως το DNA παρέχει αποδείξεις οι οποίες επιτρέπουν τον προσδιορισμό της φυλογένεσης όλων των μορφών ζωής. Επιπλέον θεωρείτο ότι τα μοριακά δεδομένα ήταν ανώτερα από τα μορφολογικά, εφόσον χρησιμοποιώντας το DNA ουσιαστικά δουλεύουμε με γονίδια, τα οποία παρέχουν τις απαραίτητες αποδείξεις για τις σχέσεις μεταξύ των ατόμων. Ωστόσο, από την αρχή σχεδόν της χρήσης των μοριακών δεδομένων, ήταν γνωστό ότι οι μέθοδοι αυτές, όπως και οι μέθοδοι που χρησιμοποιούσαν μορφολογικά δεδομένα, είχαν τόσο πλεονεκτήματα όσο και μειονεκτήματα, τα οποία έχουν ως ακολούθως: Όταν μελετά κανείς το DNA, κοιτά απευθείας το γενετικό υλικό, το οποίο έχει κληρονομηθεί από τους προγόνους. Το DNA των σύγχρονων οργανισμών προέρχεται από τους προγονικούς οργανισμούς, οπότε το DNA πρέπει να αντανακλά τη γενεαλογία και να είναι αξιόπιστο για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων. Αντιθέτως, όταν κοιτά κανείς μια συγκεκριμένη δομή σε έναν οργανισμό, δεν μπορεί να είναι βέβαιος για τον τρόπο με τον οποίο έχει κληρονομηθεί. Είναι πιθανό η διαμόρφωση της δομής να οφείλεται σε άμεσες περιβαλλοντικές επιρροές και όχι στην κληρονομικότητα. Εφόσον λοιπόν, για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων είναι απαραίτητη η μελέτη των κληρονομούμενων χαρακτηριστικών, η μορφολογία καθίσταται λιγότερο αξιόπιστη για τις φυλογενετικές μελέτες

27 Ένα από τα προβλήματα των μορφολογικών μελετών είναι το γεγονός ότι οι υπό μελέτη οργανισμοί μπορεί να μοιάζουν εξαιρετικά μεταξύ τους στη μορφολογία, με αποτέλεσμα οι ομοιότητες αυτές να καθιστούν δυσκολότερη την εύρεση ενός αριθμού χαρακτήρων, ικανού για αξιόπιστη συστηματική ανάλυση (κάποιοι από τους χαρακτήρες που χρησιμοποιούνται μπορεί να οφείλονται σε ομοπλασία, για μεγαλύτερη βεβαιότητα για ύπαρξη ομολογίας χρειάζεται μεγαλύτερος αριθμός χαρακτήρων στις αναλύσεις) (Hillis & Wiens 2000). Αντιθέτως, οι αλληλουχίες του DNA αποδείχθηκε ότι είναι ευμετάβλητες ανάμεσα στα είδη και κατά συνέπεια είναι δυνατό να βρεθεί μεγάλος αριθμός χαρακτήρων (θέσεις ζευγών βάσεων) οι οποίοι φέρουν φυλογενετικά πληροφοριακή μεταβλητότητα. Το κόστος βέβαια είναι ένας σημαντικός παράγοντας σε κάθε μελέτη. Η μελέτη της μορφολογίας είναι πολύ πιο φθηνή από τη μελέτη των αλληλουχιών του DNA. Αυτό σημαίνει ότι με το ίδιο κόστος μπορούμε να μελετήσουμε περισσότερες δομές ενός οργανισμού, απ ό,τι γονίδια. Στην περίπτωση αυτή η μορφολογία υπερτερεί του DNA. Ωστόσο, η τεχνολογία του DNA γίνεται όλο και πιο φθηνή και γρήγορη με το πέρασμα του χρόνου, οπότε το πλεονέκτημα αυτό της μορφολογίας συνεχώς φθίνει. Όταν μελετά κανείς μορφολογία, μελετά διαφορετικές όψεις του σώματος που πιθανώς κωδικοποιούνται από πολλά διαφορετικά γονίδια. Όταν μελετά το DNA, συνήθως η τεχνολογία και τα χρήματα επαρκούν για τη μελέτη ενός γονιδίου, ή έστω ενός μικρού αριθμού γονιδίων. Ένα πιθανό πρόβλημα που μπορεί να προκύψει από τη μελέτη ενός μόνο γονιδίου είναι πως δε μπορούμε να γνωρίζουμε αν αλληλεπιδρά με άλλα γονίδια και ποια είναι αυτά, οπότε όποιους χαρακτήρες αναφέρουμε ως ξεχωριστούς, μπορεί να εξελίσσονται κατά συσχετιζόμενο τρόπο, πράγμα που καθιστά τη φυλογένεση λιγότερο αξιόπιστη. Εάν η μελέτη αφορά χαρακτηριστικά που κωδικοποιούνται από πολλά γονίδια, είναι λιγότερο πιθανό η εξέλιξή τους να συσχετίζεται. Στην περίπτωση αυτή οι

28 μορφολογικές μελέτες υπερτερούν, η διαφορά αυτή όμως με τις μοριακές μελέτες μειώνεται όσο μεγαλώνει ο αριθμός των υπό μελέτη γονιδίων. Όσον αφορά τα απολιθώματα, σε περιπτώσεις που δεν μπορεί να εξαχθεί DNA από τα δείγματα και, επιπλέον, όταν υπάρχει ένα καλό αρχείο καταγραφών, οι μορφολογικές μελέτες είναι εκείνες που έχουν το προβάδισμα. Με τον τρόπο αυτόν μπορούμε να βρούμε νέες εξωομάδες, οι οποίες θα σχετίζονται πιο στενά με τα μέλη της ομάδας και έτσι θα είναι πιο αξιόπιστες. Ο προσδιορισμός των χαρακτηριστικών που μοιάζουν μεταξύ τους και ίσως να είναι ομόλογα, μπορεί να είναι πρόβλημα τόσο για τα μορφολογικά όσο και για τα μοριακά δεδομένα. Για τα μορφολογικά δεδομένα, συνήθως δε γνωρίζουμε ποια γονίδια κωδικοποιούν συγκεκριμένες δομές, συνεπώς από την ομοιότητα και μόνο μπορεί να συμπεράνει κανείς ότι οι χαρακτήρες είναι ομόλογοι, ενώ στην πραγματικότητα κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια και θα έπρεπε να θεωρούνται διαφορετικοί. Αυτό μπορεί να κάνει τη φυλογένεση αναξιόπιστη. Στην εξέλιξη του DNA, ένα αρκετά σύνηθες συμβάν είναι ο διπλασιασμός των γονιδίων, οπότε αντί για ένα αντίγραφο του γονιδίου σε μια θέση στα χρωμοσώματα, υπάρχουν δύο αντίγραφα σε διαφορετικές θέσεις που εξελίσσονται παράλληλα. Εφόσον λοιπόν η μελέτη αφορά γονίδια, υπάρχει η πιθανότητα της τυχαίας σύγκρισης του αρχικού γονιδίου ενός είδους με τη διπλασιασμένη μορφή του, σε κάποιο άλλο είδος. Αυτά τα δύο γονίδια δεν είναι πραγματικά ομόλογα. Ένα ακόμη πρόβλημα που παρουσιάζεται στον καθορισμό της ομολογίας του DNA είναι η συχνή εμφάνιση μεταλλάξεων που προσθέτουν ή αφαιρούν ζεύγη βάσεων σε ένα γονίδιο. Το αποτέλεσμα είναι το διαφορετικό μήκος του ίδιου γονιδίου σε διαφορετικά είδη. Όταν συμβαίνει αυτό, είναι δύσκολη η σωστή στοίχιση των γονιδίων, ώστε να είναι βέβαιο ότι συγκρίνονται οι σωστές βάσεις μεταξύ των γονιδίων δύο ή περισσότερων ειδών. Συνεπώς, τόσο η μορφολογία όσο και το DNA, εμφανίζουν μειονεκτήματα στην

29 εύρεση των κατάλληλων χαρακτήρων για τον προσδιορισμό της ομολογίας. Η συγκλίνουσα εξέλιξη είναι ένα πρόβλημα για τις φυλογενετικές αναλύσεις με χρήση μορφολογικών δεδομένων, επειδή εξάγονται εσφαλμένα συμπεράσματα για τη συγγένεια των ειδών βάσει παρόμοιων χαρακτηριστικών. Για παράδειγμα, τα δελφίνια και τα ψάρια εμφανίζουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά, τα είδη όμως αυτά ξεκίνησαν από διαφορετικά σημεία και εξελίχθηκαν ανεξάρτητα μέσω της φυσικής επιλογής για τη βελτίωση της ικανότητας κολύμβησης. Πρόκειται δηλαδή για προσαρμογή στη ζωή μέσα στο νερό. Από την άλλη, μεγάλο μέρος του γενετικού υλικού μπορεί να είναι ουδέτερο στη δράση της φυσικής επιλογής, που σημαίνει ότι όλες οι διαφορετικές μορφές DNA σε έναν πληθυσμό έχουν την ίδια αρμοστικότητα και δεν εξελίσσονται μέσω της φυσικής επιλογής. Συνεπώς, για την περίπτωση αυτή, η φυσική επιλογή δεν μπορεί να προκαλέσει συγκλίνουσα εξέλιξη εφόσον δεν επηρεάζει το κομμάτι αυτό του DNA. Αυτό μπορεί να είναι ένα προνόμιο για τη μελέτη της φυλογένεσης βάσει του DNA. Δυστυχώς, όμως, τα μοριακά δεδομένα μπορεί να εμφανίσουν τυχαία συγκλίνουσα εξέλιξη, λόγω μεταλλάξεων υποκατάστασης ζευγών βάσεων, που είναι και τα σημεία τα οποία μελετώνται στις φυλογενετικές αναλύσεις βάσει μοριακών δεδομένων. Επειδή υπάρχουν μόνο τέσσερις διαφορετικές βάσεις, δεν αποκλείεται δύο διαφορετικά είδη να έχουν τυχαία την ίδια μετάλλαξη στο ίδιο σημείο, ενώ εξελίσσονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο. Το πρόβλημα, λοιπόν, της τυχαίας σύγκλισης παρατηρείται συχνά στις φυλογενετικές αναλύσεις βάσει του DNA. Ένα ακόμη πλεονέκτημα της χρήσης του DNA μπορεί να είναι ο ρυθμός εξέλιξης των γονιδίων. Είναι πιθανό το ίδιο γονίδιο σε διαφορετικά είδη να εξελίσσεται με τον ίδιο ρυθμό. Αυτό όμως δεν έχει τεκμηριωθεί απόλυτα. Οι καταλληλότερες λοιπόν, μελέτες όσον αφορά τη φυλογένεση βασίζονται σε συνδυασμό διαφορετικών ειδών δεδομένων. Είναι σαφές ότι οι μελέτες αυτές είναι πιο ολοκληρωμένες και είναι λιγότερο πιθανό να

30 περιέχουν σφάλματα όσον αφορά τα συμπεράσματα που εξάγονται, ιδιαίτερα δε εάν αυτά συμφωνούν ανάμεσα σε διαφορετικά είδη αναλύσεων (Bininda Emonds 2000). Δεν μπορούμε, όμως, να αμφισβητήσουμε τη συμβολή των μοριακών χαρακτήρων στη φυλογένεση και να επισκιάσουμε το σημαντικό ρόλο που έπαιξαν στη διαλεύκανση των φυλογενετικών σχέσεων ακόμα και μεταξύ ανώτερων ταξινομικών βαθμίδων, που παλαιότερα δεν ήταν δυνατό να γίνουν εύκολα γνωστές με τη βοήθεια των μορφολογικών χαρακτήρων, όπως για παράδειγμα η μοριακή ανάλυση σε επίπεδο φύλων του βασιλείου των ζώων με τη βοήθεια ριβοσωματικών και μιτοχονδριακών γονιδίων (Bourlat et al. 2008) και η μοριακή φυλογένεση εντός των Δευτεροστομίων με τη βοήθεια πρωτεϊνικών αλληλουχιών (Blair & Hedges 2005) Πώς επιλέγω μοριακό δείκτη; Η χρήση των μοριακών δεικτών είναι ευρέως διαδεδομένη μεταξύ των εξελικτικών βιολόγων και οι μέθοδοι ανάλυσης των γενετικών δεδομένων βελτιώνονται ταχύτατα, ωστόσο υπάρχει έλλειψη ενός οργανωμένου πλαισίου εργασίας με το οποίο να μπορούν να δουλέψουν οι επιστήμονες. Στοιχεία της μοριακής εξέλιξης συνοψίζονται για να εξηγήσουν την προέλευση της μεταβλητότητας στο επίπεδο του DNA, τα όριά της, καθώς και τις σχέσεις που συνδέουν τη γενετική διαφοροποίηση με τις βιολογικές παραμέτρους των υπό μελέτη οργανισμών (Chenuil 2006). Οι μοριακοί δείκτες καθορίζονται από δύο συνιστώσες: Την περιοχή του DNA που πρόκειται να «καλύψουν». Την τεχνική που χρησιμοποιείται για την εύρεση της διαφοροποίησης. Τα κριτήρια για την επιλογή του κατάλληλου μοριακού δείκτη χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: Το επίπεδο της διαφοροποίησης. Τη φύση της πληροφορίας, η οποία πρέπει να προσδιορίζεται σύμφωνα με το επιστημονικό ερώτημα

31 Κάποια πρακτικά κριτήρια, τα οποία έχουν να κάνουν κυρίως με τον εξοπλισμό του εκάστοτε εργαστηρίου και την εμπειρία του ερευνητή. Οι τρεις συχνότεροι τύποι μοριακών δεικτών, που χρησιμοποιήθηκαν από τους επιστήμονες είναι οι ακόλουθοι: Πολυμορφισμός μεγέθους περιοριστικού θραύσματος (RFLP) (Botstein et al. 1980). Πρόκειται για μοριακό δείκτη, ο οποίος βασίζεται στην παραγωγή διαφορετικού μήκους περιοριστικών θραυσμάτων μετά από πέψη του DNA με περιοριστικά ένζυμα. Τυχαίος πολλαπλασιασμός πολυμορφικού DNA (RAPD) (Williams et al. 1990). Πρόκειται για μοριακό δείκτη που βασίζεται στο διαφορικό πολλαπλασιασμό, με τη βοήθεια της PCR, τυχαίων αλληλουχιών ενός δείγματος DNA με εκκινητές που αποτελούνται από μικρές ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες (συνήθως 8-10 βάσεις). Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. Πρόκειται για σύστημα μοριακών δεικτών βασισμένο στη υπάρχουσα ποικιλότητα των πρωτεϊνών που επιτελούν ταυτόσημη λειτουργία αλλά διαφέρουν ως προς την ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Οι μέθοδοι αυτές χρησιμοποιούνταν κυρίως στις φυλογενετικές μελέτες επειδή ήταν πιο οικονομικές και γρήγορες απ ό,τι η αλληλούχιση του DNA. Με το πέρασμα όμως του χρόνου, τόσο το κόστος όσο και ο χρόνος που χρειάζεται για την αλληλούχιση του γενετικού υλικού, μειώθηκαν. Έτσι, η αλληλούχιση άρχισε να κερδίζει έδαφος στις φυλογενετικές μελέτες, αφού επρόκειτο για μια λεπτομερή και αναλυτική μέθοδο που μπορούσε να εκτιμήσει τις γενετικές αποστάσεις γονιδιακών τμημάτων ή γονιδίων των υπό μελέτη οργανισμών. Παρόλα αυτά, δεν μπορεί να πει κανείς με βεβαιότητα ότι υπάρχουν συγκεκριμένοι μοριακοί δείκτες οι οποίοι είναι κατάλληλοι για κάθε είδους φυλογενετική ανάλυση. Για να επιλεγεί ο πιο κατάλληλος μοριακός δείκτης πρέπει να έχει κάποιες ιδιότητες, όπως για παράδειγμα να: είναι διακριτός και ευρέως εξαπλωμένος, είναι εύκολος στην απομόνωση και την ανάλυση,

32 έχει απλή γενετική δομή, έχει ξεκάθαρο τρόπο κληρονόμησης, έχει γρήγορο ή αργό ρυθμό εξέλιξης, ανάλογα με τα είδη που μελετώνται, έχει ποιοτικούς χαρακτήρες από τους οποίους να μπορούν να εξαχθούν φυλογενετικά συμπεράσματα. 1.4 Μοριακοί δείκτες και φυλογένεση Μιτοχονδριακό DNA Από τους μοριακούς δείκτες που χρησιμοποιούνται ευρέως στις φυλογενετικές μελέτες είναι το μιτοχονδριακό DNA (mtdna). Πρόκειται για ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο μεγέθους ~16kb (στους περισσότερους πολυκύτταρους οργανισμούς), ενώ μπορεί να φτάσει και τις 80kb στους ζυμομύκητες και να ξεπεράσει τις 100kb στα φυτά. Στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα περιλαμβάνονται 37, συνήθως, γονίδια, από τα οποία 13 κωδικοποιούν πρωτεΐνες, 22 κωδικοποιούν trnas και 2 κωδικοποιούν rrnas (Εικόνα 1-7). Εικόνα 1-7: Η δομή του μιτοχονδριακού DNA, όπου φαίνονται αναλυτικά η διάταξη των γονιδίων, καθώς και τα μόρια που κωδικοποιούν. Η σειρά με την οποία εμφανίζονται τα γονίδια στο mtdna συνήθως είναι συγκεκριμένη. Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις όπου η διάταξη αυτή φαίνεται να αλλάζει (Chen & Zhao 2009)

33 Το mtdna εμφανίζεται σε μεγάλο αριθμό αντιγράφων στα κύτταρα, είναι πλήρως χαρακτηρισμένο, ενώ ο μητρικός, κυρίως, τρόπος κληρονομικότητας (Zhao et al. 2004) δεν αφήνει περιθώρια για ανασυνδυασμό, με ελάχιστες εξαιρέσεις (Rokas et al. 2003). Συνεπώς θεωρείται μια απλοειδής γενετική μονάδα. Επιπλέον, το ζωικό μιτοχονδριακό DNA εμφανίζει γρήγορο εξελικτικό ρυθμό. Εξελίσσεται έως και 10 φορές πιο γρήγορα από το μη επαναλαμβανόμενο πυρηνικό DNA, ενώ ο εξελικτικός ρυθμός είναι διαφορετικός ακόμα και ανάμεσα σε διαφορετικά τμήματα του mtdna. Ο γρήγορος εξελικτικός ρυθμός αποδίδεται σε μεταλλάξεις, οι οποίες συσσωρεύονται λόγω αδυναμίας επιδιόρθωσης των λαθών κατά την αντιγραφή (η γ-πολυμεράση δεν έχει την ικανότητα επιδιόρθωσης). Το ζωικό μιτοχονδριακό DNA δεν διαθέτει εσώνια, ενώ η απουσία ιστονών φαίνεται να το καθιστά ευάλωτο σε δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) και άλλους επιβλαβείς παράγοντες. Ωστόσο υπάρχουν έρευνες που υποδεικνύουν ότι ο σχηματισμός συμπλόκων του mtdna με κάποιες πρωτεΐνες, μπορεί να το προστατεύσει, για παράδειγμα, από τις ακτίνες Χ ή το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Gouliaeva et al. 2006). Υπάρχουν όμως και πρακτικά πλεονεκτήματα, όπως για παράδειγμα το γεγονός ότι δείγματα mtdna μπορούν να ληφθούν εύκολα, ενώ δεν είναι απαραίτητη μεγάλη ποσότητα ιστού. Τέλος, μπορεί εύκολα να μελετηθεί και να πολλαπλασιαστεί, καθώς έχουν σχεδιαστεί παγκόσμιοι εκκινητές για RCR. Το μικρό λοιπόν δραστικό μέγεθος του mtdna σε σχέση με τα πυρηνικά γονίδια και ο υψηλός ρυθμός νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, καθιστούν το mtdna πολύτιμο εργαλείο στη μελέτη φυλογενετικών σχέσεων σε διάφορα ταξινομικά επίπεδα, ανάλογα πάντα με το υπό μελέτη γονίδιο, ή συνδυασμό γονιδίων. Για παράδειγμα, τα δύο γονίδια που κωδικοποιούν για τα rrnas (12S και 16S) είναι πιο συντηρημένα, οπότε μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων σε υψηλά (φύλο, υποφύλο) και μεσαία (οικογένεια, γένος) ταξινομικά επίπεδα (Weisburg et al. 1991, Ballard et al. 1992). Εκτός όμως, από τις πληροφορίες που μπορεί να δώσει η αλληλούχιση των γονιδίων του μιτοχονδριακού DNA, η διάταξη των

34 μιτοχονδριακών γονιδίων είναι δυνατό να παρέχει πληροφορίες για τη «βαθιά» φυλογένεση (Boore et al. 1995). Αν εξαιρέσει κανείς την εκτεταμένη γονιδιακή μετατόπιση σε ορισμένα τάξα (Machida et al. 2002), η ταυτοποίηση συγκεκριμένης γονιδιακής διάταξης του μιτοχονδριακού γονιδιώματος οδήγησε στην ισχυρή στήριξη των μέχρι τώρα αβέβαιων ομαδοποιήσεων και την εύρεση νέων φυλογενετικών σχέσεων ανάμεσα σε διαφορετικά φύλα (Podsiadlowski et al. 2008). Τέλος, για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων σε κατώτερα ταξινομικά επίπεδα, έχουν χρησιμοποιηθεί γονίδια όπως αυτά που κωδικοποιούν το κυτόχρωμα b, την υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης, την περιοχή του βρόχου εκτόπισης και την υπομονάδα Ι της NADH αφυδρογονάσης Πυρηνικοί γενετικοί τόποι Οι μοριακές φυλογενετικές μελέτες στηρίζονται συνήθως στη χρήση μιτοχονδριακών γονιδίων (π.χ. Heise et al. 1995, Burns 1997). Η ευκολία στον πολλαπλασιασμό και οι σχετικά γρήγοροι εξελικτικοί ρυθμοί έκαναν το mtdna αναπόσπαστο κομμάτι της συστηματικής και της γενετικής πληθυσμών (Avise 1986, Simon et al. 2006). Παρόλα αυτά, επειδή το μιτοχονδριακό γονιδίωμα κληρονομείται ως μονάδα, τα γονίδια που φέρει δεν μπορούν να θεωρηθούν ανεξάρτητες πηγές φυλογενετικής πληροφορίας. Το πυρηνικό γονιδίωμα περιλαμβάνει περιοχές που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, RNA, ενώ φέρει και μη κωδικές περιοχές και προσφέρει μια πληθώρα ανεξάρτητων δεικτών, οι οποίοι εξελίσσονται με διαφορετικούς ρυθμούς. Ωστόσο, η χρήση των πυρηνικών γονιδίων στις φυλογενετικές αναλύσεις είναι πιο δύσκολη σε σχέση με τα μιτοχονδριακά. Οι μη κωδικές περιοχές, καθώς και οι βρόγχοι των rrna γονιδίων, εξελίσσονται γρηγορότερα, οπότε μπορούν πιθανώς να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των σχέσεων μεταξύ συγγενών ειδών (Dolman & Phillips 2004, Willows Munro et al. 2005). Οι περιοχές αυτές, όμως, έχουν την τάση να ποικίλλουν σε

35 μήκος δυσκολεύοντας πολύ τη στοίχιση των αλληλουχιών, ειδικά σε υψηλότερα ταξινομικά επίπεδα (Sequeira et al. 2006). Αντιθέτως, οι πυρηνικοί γενετικοί τόποι που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες μπορούν να στοιχιστούν πιο εύκολα, επειδή εμφανίζουν μικρότερη διακύμανση σε μέγεθος, ενώ κάθε τέτοια διακύμανση παρατηρείται σε αριθμό πολλαπλάσιο του τρία και οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες μεταφράζονται σε (πιο συντηρημένες) αμινοξικές αλληλουχίες που περιορίζουν και καθοδηγούν τη στοίχιση. Τα πλεονεκτήματα αυτά καθιστούν τους πυρηνικούς γενετικούς τόπους πολύ καλή εναλλακτική λύση για τις φυλογενετικές αναλύσεις, ειδικά σε ανώτερα επίπεδα φυλογένεσης. Ωστόσο, υπάρχουν και μειονεκτήματα στη χρήση των πυρηνικών γενετικών τόπων, όπως είναι για παράδειγμα η παρουσία εσωνίων και η δυσκολία στον εντοπισμό παράτροπων γονιδιακών αντιγράφων, που μπορεί να οδηγήσουν στην εσφαλμένη εξαγωγή συμπερασμάτων (Downie & Gullan 2004). Εξαιτίας αυτών των μειονεκτημάτων, στις φυλογενετικές μελέτες χρησιμοποιούνται συγκεκριμένοι γενετικοί τόποι, κυρίως μεμονωμένες περιοχές εξωνίων. Άλλοι γενετικοί τόποι που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μελέτες φυλογένεσης είναι οι μικροδορυφορικές αλληλουχίες. Πρόκειται για επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ενός μέχρι πέντε νουκλεοτιδίων που εντοπίζονται σε μεγάλο βαθμό στο γονιδίωμα των ευκαρυωτικών οργανισμών. Εμφανίζουν υψηλά επίπεδα πολυμορφισμού, χάρη στον υψηλό ρυθμό μεταλλάξεων. Η συμμετοχή τους σε μελέτες πληθυσμιακής γενετικής βοήθησαν στον καθορισμό της γενετικής δομής διαφορετικών ατόμων, συγκρίνοντας τις εξελικτικές σχέσεις και μελετώντας την πρόσφατη ιστορία σε επίπεδο πληθυσμών (Buburuzan et al. 2007). Τέλος, στις φυλογενετικές αναλύσεις χρησιμοποιούνται επίσης οι γενετικοί τόποι που κωδικοποιούν τη σύνθεση του rrna. Οι γενετικοί αυτοί τόποι βρίσκονται συγκεντρωμένοι σε γειτονικές περιοχές του γονιδιώματος και οργανώνονται σε μια ενιαία λειτουργική μονάδα. Κάθε τέτοια μονάδα περιλαμβάνει γονίδια τα οποία κωδικοποιούν τη μεγάλη (28S) και τη μικρή

36 (18S) υπομονάδα του ριβοσώματος, καθώς και το 5,8S rrna, τα οποία χωρίζονται από μη κωδικές περιοχές (ETS, ITS1, ITS2) (Εικόνα 1-8). Εικόνα 1-8: Σχηματική απόδοση των γενετικών τόπων που κωδικοποιούν το πυρηνικό rrna, καθώς και των μη κωδικών περιοχών. Στην εικόνα φαίνεται η διαδικασία της αντιγραφής για την παραγωγή των υπομονάδων 18s, 28s και 5,8s. ( Το κύριο πλεονέκτημα που καθιστά το πυρηνικό ριβοσωμικό DNA κατάλληλο φυλογενετικό δείκτη, είναι το μεγάλο μέγεθος της αλληλουχίας που υποδηλώνει το μεγάλο ποσό της φυλογενετικής πληροφορίας που φέρει. Επίσης δίνεται η δυνατότητα επιλογής μεταξύ των γενετικών αυτών τόπων για τις μελέτες, ανάλογα με τον εξελικτικό ρυθμό που παρουσιάζει ο καθένας από αυτούς (Olsen & Woese 1993) Δευτεροταγής δομή RNA Οι γενετικοί τόποι, όπως φαίνεται πιο πάνω, που κωδικοποιούν για λειτουργικά μόρια RNA, χρησιμοποιούνται συχνά στις φυλογενετικές μελέτες. Τα δέντρα που προκύπτουν από αυτές τις μελέτες, παρόλα αυτά, έρχονται σε

37 αντίθεση με άλλα μοριακά δεδομένα σε έρευνες βαθιάς φυλογένεσης. Εφόσον πολλοί από τους λειτουργικούς περιορισμούς των γονιδιακών προϊόντων (π.χ. των μορίων RNA) σχετίζονται με την τρισδιάστατη δομή, παρά με την αλληλουχία, οι συσσωρευμένες μεταλλάξεις στις γονιδιακές αλληλουχίες μπορούν να δημιουργήσουν «θόρυβο» στο φυλογενετικό σήμα για πολύ μεγάλες, εξελικτικά, χρονολογικές κλίμακες. Η ποικιλομορφία της δομής, ωστόσο, μπορεί να αποτελέσει κατάλληλο δείκτη για τη φυλογενετική συμπερασματολογία, ακόμη και κάτω από συνθήκες υψηλής γενετικής διαφοροποίησης (Fischer & Geard 2002). Με τη χρήση, λοιπόν, υπολογιστικών προγραμμάτων, τα οποία βασίζονται σε κατάλληλους αλγορίθμους, είναι δυνατή η πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής RNA (βάσει της χαμηλότερης τιμής ελεύθερης ενέργειας) (π.χ. Mathews et al. 2004) και η σύγκριση των δομών για την εξαγωγή φυλογενετικών συμπερασμάτων. Μέχρι σήμερα έχουν πραγματοποιηθεί πολλές τέτοιες μελέτες οι οποίες περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, και τις πυρηνικές ριβοσωμικές υπομονάδες 28S και 18S (Dixon & Hillis 1993, Ouvrard et al. 2000). 1.5 Ισόποδα Γενικά Τα ισόποδα αποτελούν τα πιο ποικίλα σε δομή και τα πλουσιότερα σε είδη Καρκινοειδή της υπέρταξης των Περακαρίδων. Πρόκειται για κοινούς κατοίκους όλων σχεδόν των οικοσυστημάτων. Η τάξη περιλαμβάνει περίπου είδη, τα οποία κατατάσσονται σε 10 υποτάξεις. Τα ισόποδα ποικίλλουν σε μέγεθος από 0,5mm έως 500mm (Bathynomus giganteus). Από φυλογενετικές αναλύσεις και το αρχείο των απολιθωμάτων, η τάξη χρονολογείται από το Λιθανθρακοφόρο (Παλαιοζωικό), δηλαδή περίπου 300 εκατομμύρια χρόνια πριν από σήμερα